ES2336754A1 - Method for improving the expression of proteins in chloroplasts - Google Patents

Abstract

The invention relates to the field associated with protein-expressing transgenic plant technology. Specifically, the invention relates to a novel method for increasing the expression of proteins in plants, preferably cellulolytic enzymes, and, in particular, to the production of endoglucanases CeIY and CeIZ of Dickeya dadantii in tobacco chloroplasts by introducing genes into the plant chloroplast genome. The invention is suitable for use in any industrial process that requires the use of a large amount of enzymes such as, for example, in the conversion of cellulosic biomass to ethanol.

Description

Método para mejorar la expresión de proteínas en cloroplastos.Method to improve protein expression in chloroplasts

Sector técnico de la invenciónTechnical sector of the invention

La presente invención pertenece al campo de la tecnología de plantas transgénicas que expresan proteínas. Concretamente, se refiere a un nuevo método para incrementar la expresión de proteínas en plantas, preferentemente enzimas celulolíticas y más concretamente se centra en la producción de las endoglucanasas CelY y Cel1Z de Dickeya dadantii en los cloroplastos de tabaco mediante la integración de genes en el genoma del cloroplasto vegetal. La presente invención es útil en cualquier proceso industrial que necesite utilizar gran cantidad de enzimas como por ejemplo en la conversión de biomasa de celulosa en etanol.The present invention belongs to the field of technology of transgenic plants that express proteins. Specifically, it refers to a new method to increase the expression of proteins in plants, preferably cellulolytic enzymes and more specifically focuses on the production of the CelY and Cel1Z endoglucanases of Dickeya dadantii in tobacco chloroplasts by integrating genes into the genome of vegetable chloroplast. The present invention is useful in any industrial process that needs to use a large amount of enzymes such as in the conversion of cellulose biomass into ethanol.

Antecedentes de la invenciónBackground of the invention

Las plantas tienen un gran potencial para su utilización como biofactorías para obtener diversos productos de interés comercial. El potencial de las plantas radica en la posible reducción en los costes de producción y en la escalabilidad de la producción. La presente invención se refiere a la producción de enzimas en plantas genéticamente modificadas (PGMs) para uso industrial y se ha enfocado en la producción de una serie de celulasas, enzimas implicadas en la hidrólisis de biomasa celulósica, que tienen diversas aplicaciones en las industrias de combustibles, alimentación, producción animal, textil y papelera.Plants have great potential for their use as biofactories to obtain various products of commercial interest. The potential of the plants lies in the possible reduction in production costs and scalability of production. The present invention relates to the production of enzymes in genetically modified plants (PGMs) for use industrial and has focused on the production of a series of cellulases, enzymes involved in biomass hydrolysis cellulosic, which have various applications in the industries of fuels, food, animal production, textile and paper bin.

Un método para la expresión de enzimas, y en general de cualquier proteína, en plantas se basa en la integración de genes en el cloroplasto (Svav y col., 1991, Svav y Maliga, 1993). Se han descrito numerosos ejemplos de integración estable de genes en cloroplastos de tabaco con unos niveles de expresión génica muy elevada (Por ejemplo: McBride y col., 1995, Khan y Maliga, 1999, Kota y col., 1999, Staub y col., 2000, Kuroda y Maliga, 2001a y 2001b, Lutz y col., 2001, Ye GN y col., 2001). Estos ejemplos sugieren que esta tecnología tiene un potencial muy elevado para la producción de enzimas en plantas.A method for the expression of enzymes, and in general of any protein, in plants is based on integration of genes in the chloroplast (Svav et al., 1991, Svav and Maliga, 1993). Numerous examples of stable gene integration have been described in tobacco chloroplasts with very high levels of gene expression elevated (For example: McBride et al., 1995, Khan and Maliga, 1999, Kota et al., 1999, Staub et al., 2000, Kuroda and Maliga, 2001a and 2001b, Lutz et al., 2001, Ye GN et al., 2001). These examples suggest that this technology has a very high potential for Enzyme production in plants.

En los últimos años se han multiplicado los estudios orientados a analizar la viabilidad de la producción de enzimas en plantas utilizando diversas estrategias y con resultados muy diversos. El objetivo principal es el abaratamiento de la producción de enzimas para usos industriales.In recent years the studies aimed at analyzing the viability of the production of enzymes in plants using various strategies and with results very diverse The main objective is to reduce the cost of Enzyme production for industrial uses.

Las celulasas son un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de la celulosa, transformándola en glucosa. Fundamentalmente las celulasas se producen en hongos, bacterias y protozoos aunque también se encuentran en plantas y animales.Cellulases are a group of enzymes that catalyze the hydrolysis of cellulose, transforming it into glucose. Fundamentally cellulases are produced in fungi, bacteria and Protozoa although also found in plants and animals.

Otros nombres para denominar las celulasas son: endoglucanasas, endo-1,4-beta-glucanasa, CMCasa, carboximetil-celulasa, endo-1,4-beta-D-glucanasa, beta-1,4-glucanasa, beta-1,4-endoglucan hidrolasa, celudextrinasa, y avicelasa.Other names to name cellulases are: endoglucanases, endo-1,4-beta-glucanase,  CMCase, carboxymethyl cellulase, endo-1,4-beta-D-glucanase, beta-1,4-glucanase, beta-1,4-endoglucan hydrolase, Celudextrinase, and avicelase.

Uno de los ejemplos mejor estudiados es la producción de la endoglucanasa E1 de Acidothermus cellulolyticus en tabaco, Arabidopsis, maíz o patata. En el documento WO 00/05381 A2 se describe un constructo que se puede producir en las células de una planta y codifica una enzima capaz de degradar la celulosa. También se describe un método para alterar el contenido de celulosa en el tejido de una planta; dicho método comprende hacer crecer una planta cuyas células han sido transformadas con una construcción que presenta los siguientes componentes que operan en conjunto en la dirección 5' a 3' de transcripción: i) un promotor funcional en una célula de planta; ii) una secuencia de DNA que codifica la celulasa E1 de Acidthermus cellulolyticus; y iii) una región de terminación de la transcripción, bajo las condiciones en las que dicha enzima se expresa en las células de la planta, resultando que la celulosa de dicha planta se degrada parcialmente y, por tanto, disminuye su contenido. El método describe la expresión de la celulasa E1 en plastidos de plantas para la producción de enzimas que hidrolizan los polisacáridos, concretamente en cloroplastos. Así, utilizando técnicas de integración de genes en el genoma nuclear de las plantas se han obtenido plantas que acumulan en el apoplasto de tabaco la subunidad catalítica de E1 de forma que esta constituye hasta un 1,6% de la proteína soluble total (Ziegelhoffer y col., 2001). Es un nivel de acumulación aceptable pero insuficiente para algunas aplicaciones industriales y tiene el inconveniente de que, para alcanzar este nivel de expresión, se eliminó el dominio de unión a celulasas del gen E1, lo que puede reducir su utilidad en ciertas aplicaciones. En otros ejemplos (Ziegglehoffer y col. 2001, Jin y col. 2003) se obtuvieron PGMs en las que el producto del gen E1 se produce en el citoplasma y se acumula en el cloroplasto, pero no se obtuvieron niveles significativamente elevados de expresión. Ziegler y col., (2000) obtuvieron plantas de Arabidopsis thaliana que acumulan, en promedio, un 7,5% de endoglucanasa E1 pero esta especie vegetal no es un huésped apropiado para la producción de enzimas a gran escala, por la baja capacidad de producción de biomasa. También se han obtenido plantas de maíz que acumulan hasta un 2,1% de endoglucanasa E1 en maíz (Biswas y col., 2006) que tienen interés por tratarse de uno de los cultivos más extendidos y por tanto, una fuente importante de biomasa para la producción de enzimas o su transformación en combustibles. En general, los trabajos realizados con otros genes que codifican enzimas hidrolíticas integrados en el genoma nuclear de la planta no han proporcionado resultados alentadores (Ziegelhoffer 1999, Dai, 1999).One of the best studied examples is the production of endoglucanase E1 from Acidothermus cellulolyticus in tobacco, Arabidopsis , corn or potato. WO 00/05381 A2 describes a construct that can be produced in the cells of a plant and encodes an enzyme capable of degrading cellulose. A method for altering the cellulose content in a plant's tissue is also described; said method comprises growing a plant whose cells have been transformed with a construction that has the following components that operate together in the 5 'to 3' direction of transcription: i) a functional promoter in a plant cell; ii) a DNA sequence encoding Acidthermus cellulolyticus E1 cellulase; and iii) a transcription termination region, under the conditions under which said enzyme is expressed in the cells of the plant, resulting in that the cellulose of said plant is partially degraded and, therefore, decreases its content. The method describes the expression of cellulase E1 in plant plastids for the production of enzymes that hydrolyze the polysaccharides, specifically in chloroplasts. Thus, using gene integration techniques in the nuclear genome of plants, plants have been obtained that accumulate the catalytic subunit of E1 in the tobacco apoplast so that it constitutes up to 1.6% of the total soluble protein (Ziegelhoffer and col., 2001). It is an acceptable level of accumulation but insufficient for some industrial applications and has the disadvantage that, in order to reach this level of expression, the cellulase binding domain of the E1 gene was eliminated, which may reduce its usefulness in certain applications. In other examples (Ziegglehoffer et al. 2001, Jin et al. 2003) PGMs were obtained in which the product of the E1 gene is produced in the cytoplasm and accumulates in the chloroplast, but no significantly elevated levels of expression were obtained. Ziegler et al. (2000) obtained Arabidopsis thaliana plants that accumulate, on average, 7.5% of endoglucanase E1 but this plant species is not an appropriate host for large-scale enzyme production, due to the low capacity of biomass production Corn plants have also been obtained that accumulate up to 2.1% of endoglucanase E1 in corn (Biswas et al., 2006) that have an interest in being one of the most widespread crops and therefore, an important source of biomass for Enzyme production or its transformation into fuels. In general, work done with other genes that encode hydrolytic enzymes integrated into the nuclear genome of the plant have not provided encouraging results (Ziegelhoffer 1999, Dai, 1999).

El documento WO 01/16338 A2 se refiere a la producción de celulasas utilizando construcciones génicas cuya expresión da lugar a una proteína de fusión que comprende endoglucanasa E1 y un péptido transitorio. Dichas plantas producen celulasa por medio de la expresión de la construcción génica. El documento menciona que la celulasa producida se puede recoger y purificar pero no menciona la cantidad ni la actividad enzimática de la misma.WO 01/16338 A2 refers to the production of cellulases using gene constructs whose expression gives rise to a fusion protein that comprises E1 endoglucanase and a transient peptide. These plants produce cellulase through the expression of the gene construct. He document mentions that the cellulase produced can be collected and purify but does not mention the amount or the enzymatic activity of the same.

El documento de patente WO 03/012094 A1 describe un procedimiento para la producción de xilanasa termoestable en plantas (XynA de Thermospora fusca) que se basa en la expresión del gen en el cloroplasto de tabaco. En este trabajo se clonó el gen de la xilanasa bacteriana bajo el control del promotor de transcripción del RNA16S del arroz y la secuencia líder del gen psbA de arroz. Las secuencias de terminación de transcripción derivan del gen psbA o rbcL de arroz. Se describe que la xilanasa se acumula en plantas de tabaco y constituye aproximadamente un 11% de la proteína soluble, mencionándose que la xilanasa se recupera de un extracto que ha sido sometido a tratamiento térmico, desnaturalizando al menos parte de las proteínas del tejido pero manteniendo la xilanasa estable, recuperándose actividad enzimática significativa después de secar el material vegetal.WO 03/012094 A1 describes a process for the production of thermostable xylanase in plants ( Thermospora fusca XynA) which is based on the expression of the gene in tobacco chloroplast. In this work, the bacterial xylanase gene was cloned under the control of the rice RNA16S transcription promoter and the leader sequence of the rice psb A gene. Transcription termination sequences are derived from the psb A or rbc L gene of rice. It is described that xylanase accumulates in tobacco plants and constitutes approximately 11% of the soluble protein, mentioning that xylanase is recovered from an extract that has undergone heat treatment, denaturing at least part of the tissue proteins but maintaining stable xylanase, recovering significant enzymatic activity after drying the plant material.

Los vectores de integración en el cloroplasto, contienen segmentos de ADN derivados del cloroplasto que determinan el lugar de integración del gen de interés en el genoma del cloroplasto (cpADN) mediante recombinación homologa. Estas secuencias flanquean los genes de interés de manera que éstos quedan integrados en el cpADN tras la recombinación. Además del gen de interés, los vectores de transformación contienen un gen adicional necesario para la selección positiva de células que contienen cpADN recombinante. El más utilizado es el gen aadA, que proporciona resistencia a espectinomicina y estreptomicina (Svav y Maliga 1993). La expresión de genes exógenos requiere que éstos estén operativamente ligados a una serie de secuencias de ADN que funcionan como elementos de control de expresión en el cloroplasto. Dichos elementos incluyen, al menos, un promotor de transcripción que contiene elementos reconocidos por las ARN-polimerasas del cloroplasto (ya sean de origen nuclear o plastidial) que determinan el inicio de la transcripción, una secuencia líder del mRNA mensajero inmediatamente anterior a la secuencia codificante del gen de interés, un triplete de inicio de la traducción en fase de lectura con la secuencia codificante del gen de interés, un triplete de terminación de la traducción, y una región no codificante que contiene señales de terminación de la transcripción reconocidas en el cloroplasto. Los elementos de control de expresión génica más corrientemente utilizados derivan de secuencias génicas del propio cloroplasto (Svav y Maliga, 2003 y otros).The chloroplast integration vectors contain segments of DNA derived from the chloroplast that determine the place of integration of the gene of interest in the chloroplast genome (cpDNA) by homologous recombination. These sequences flank the genes of interest so that they are integrated into the cpDNA after recombination. In addition to the gene of interest, the transformation vectors contain an additional gene necessary for the positive selection of cells containing recombinant cpDNA. The most commonly used is the aad A gene, which provides resistance to spectinomycin and streptomycin (Svav and Maliga 1993). The expression of exogenous genes requires that these be operatively linked to a series of DNA sequences that function as expression control elements in the chloroplast. Such elements include at least one transcription promoter that contains elements recognized by the chloroplast RNA polymerases (whether of nuclear or plastidial origin) that determine the start of transcription, a messenger mRNA leader sequence immediately prior to the sequence. coding of the gene of interest, a translation initiation triplet in reading phase with the coding sequence of the gene of interest, a translation termination triplet, and a non-coding region containing transcription termination signals recognized in the chloroplast The most commonly used gene expression control elements derive from gene sequences of the chloroplast itself (Svav and Maliga, 2003 and others).

La acumulación de una enzima de interés en el cloroplasto depende de una serie de factores entre los que se incluyen los siguientes: i) transcripción eficiente del gen y estabilidad del ARN mensajero (ARNm), ii) inicio correcto y de la traducción en el triplete correspondiente iii) velocidad de elongación durante la traducción, iv) plegamiento adecuado de la proteína en el estroma del cloroplasto y v) estabilidad del producto en el estroma. Podemos agrupar estos factores en dos clases: factores que influyen en la expresión génica y factores que influyen en la actividad y estabilidad del producto.The accumulation of an enzyme of interest in the chloroplast depends on a number of factors among which They include the following: i) efficient gene transcription and stability of messenger RNA (mRNA), ii) correct onset and of the translation in the corresponding triplet iii) speed of elongation during translation, iv) proper folding of the Chloroplast stroma protein and v) product stability in the stroma. We can group these factors into two classes: factors that influence gene expression and factors that influence in the activity and stability of the product.

Factores que influyen en la expresión génica en el cloroplastoFactors that influence gene expression in the chloroplast

Los estudios de regulación de la expresión génica en cloroplastos de algas y plantas superiores indican que el factor más influyente en el control de la expresión de genes endógenos del cloroplasto es el inicio de la traducción (Choquet y Vollman 2002). Numerosos estudios indican que factores probablemente implicados en el inicio de la traducción determinan la eficiencia de la expresión de genes exógenos en el cloroplasto (Kuroda y Maliga, 2001a y 2001b). La expresión de un gen particular depende de que el contexto de inicio de la traducción sea favorable (Esposito y col., 2001). Este contexto está determinado en parte por la secuencia líder del ARNm y en parte por la propia secuencia codificante del gen de interés (Kuroda y Maliga, 2001b). Se ha observado que la secuencia líder del gen psbA de tabaco promueve la traducción eficiente de ARNm exógenos in vitro (Hirose & Sugiura, 1996) e in vivo, y da lugar a la expresión eficiente de una serie de genes integrados en el cpADN de tabaco (Staub y Maliga 1994, Eibl y col., 1999, Daniell y col., 1998, Kota y col., 1999, Daniell y col., 2001, De Cosa y col. 2001). Sin embargo, los niveles de expresión alcanzados son variables dependiendo del gen de interés y no siempre se observa expresión eficiente del gen introducido (Whitney y col., 2001).Studies of regulation of gene expression in algae and higher plant chloroplasts indicate that the most influential factor in controlling the expression of endogenous chloroplast genes is the beginning of translation (Choquet and Vollman 2002). Numerous studies indicate that factors probably involved in the initiation of translation determine the efficiency of the expression of exogenous genes in the chloroplast (Kuroda and Maliga, 2001a and 2001b). The expression of a particular gene depends on the favorable translation context (Esposito et al., 2001). This context is determined in part by the mRNA leader sequence and in part by the coding sequence of the gene of interest itself (Kuroda and Maliga, 2001b). It has been observed that the leader sequence of the tobacco psb A gene promotes efficient translation of exogenous mRNAs in vitro (Hirose & Sugiura, 1996) and in vivo , and results in the efficient expression of a series of genes integrated into the cpDNA of tobacco (Staub and Maliga 1994, Eibl et al., 1999, Daniell et al., 1998, Kota et al., 1999, Daniell et al., 2001, De Cosa et al. 2001). However, the expression levels achieved are variable depending on the gene of interest and efficient expression of the introduced gene is not always observed (Whitney et al., 2001).

Esta variabilidad observada está relacionada en parte con el hecho de que la secuencia inmediatamente posterior al triplete de iniciación es también un determinante de la expresión génica, lo que introduce un factor de incertidumbre en la expresión de cualquier gen en el cloroplasto (Kuroda y Maliga 2001b). En algunos casos se han desarrollado estrategias que permiten proporcionar un contexto de inicio de traducción que favorece la expresión génica. Estas se basan en la fusión del gen de interés a una corta secuencia codificante de manera que se produce una proteína quimérica que contiene un corto péptido añadido a la proteína de interés en su extremo aminoterminal. Estas secuencias añadidas proporcionarían un contexto que favorece la expresión génica. Para ello se han utilizado secuencias derivadas de genes del propio cloroplasto (Kuroda y Maliga, 2001b), de la proteína fluorescente verde (GFP) de la medusa (Ye, Staub y col., 2001) que se menciona a continuación, o simplemente una secuencia sintética que codifica un pentapéptido (Herz y col. 2005).This observed variability is related in part with the fact that the sequence immediately after the initiation triplet is also a determinant of expression gene, which introduces a factor of uncertainty in the expression of any gene in the chloroplast (Kuroda and Maliga 2001b). In some cases strategies have been developed that allow provide a translation start context that favors the gene expression. These are based on the fusion of the gene of interest to a short coding sequence so that a chimeric protein that contains a short peptide added to the protein of interest in its aminoterminal end. These sequences added would provide a context that favors expression gene. For this, sequences derived from genes of the Chloroplast itself (Kuroda and Maliga, 2001b), of the protein green fluorescent (GFP) of the jellyfish (Ye, Staub et al., 2001) that mentioned below, or simply a synthetic sequence encoding a pentapeptide (Herz et al. 2005).

La solicitud de patente internacional WO 01/04331 A2 (de ahora en adelante D1) y el correspondiente artículo de literatura no patente (Ye, Staub y col., 2001) describen secuencias de ácidos nucleicos útiles para promover la expresión de amplia variedad de genes, tanto eucarióticos como procarióticos. En particular, la invención se centra en la fusión traduccional de 14 aminoácidos derivados de la proteína fluorescente verde (GFP) (Seq Id No. 26) de medusa al dominio N-terminal de una proteína. A pesar de que el documento presenta la invención como útil para aumentar el nivel de expresión de cualquier enzima, en concreto, realiza la fusión traduccional de dicha secuencia de la GFP a la enzima EPSPS, dando lugar a altos niveles de expresión de dicha proteína; presenta una construcción que comprende la secuencia de DNA correspondiente a los 14 aminoácidos de la GFP (Seq Id No. 27) fusionada al dominio N-terminal del gen de la proteína C4. Dicha construcción es expresada en : plástidos. Los altos niveles de expresión obtenidos a través de la invención se refieren a niveles de más del 10% del total de la proteína soluble. La solicitud de patente reivindica la célula que comprenda al menos, aproximadamente el 12% de proteína de interés, del total de proteína soluble de la célula. La publicación correspondiente a la solicitud de patente, además de lo anterior, se refiere a la adaptación de los codones del gen CP4 a los codones del cloroplasto. Para ello, llevan a cabo una inspección de la secuencia nativa de CP4, observando que solamente presenta un 45% de codones preferidos por plástidos. Con el fin de comprobar el efecto del empleo de codones preferidos para la expresión en plástidos, construyen un gen CP4 sintético que presenta predominantemente (el 77%) codones preferidos por plástidos. Los resultados obtenidos demuestran que la optimización mediante el uso de codones plastídicos da lugar a un aumento de la acumulación de proteína de aproximadamente un 10% más (es decir, unas 50 veces más que sin la optimización de codones).WO international patent application 04/01331 A2 (hereafter D1) and the corresponding article of non-patent literature (Ye, Staub et al., 2001) describe nucleic acid sequences useful for promoting the expression of wide variety of genes, both eukaryotic and prokaryotic. In In particular, the invention focuses on the translational fusion of 14 amino acids derived from green fluorescent protein (GFP) (Seq Id No. 26) from jellyfish to the N-terminal domain of a protein. Although the document presents the invention as useful to increase the expression level of any enzyme, in specifically, it performs the translational fusion of said sequence of the GFP to the EPSPS enzyme, leading to high levels of expression of said protein; presents a construction that comprises the sequence of DNA corresponding to the 14 amino acids of the GFP (Seq Id No. 27) fused to the N-terminal domain of the gene of the C4 protein This construction is expressed in: plastids. The high levels of expression obtained through the invention are refer to levels of more than 10% of the total soluble protein. The patent application claims the cell that comprises at least, approximately 12% of protein of interest, of the total protein soluble cell. The publication corresponding to the request Patent, in addition to the above, refers to the adaptation of codons of the CP4 gene to the codons of the chloroplast. To do this, they carry carried out an inspection of the native sequence of CP4, observing that It only has 45% of codons preferred by plastids. With in order to check the effect of the use of preferred codons for plastid expression, build a synthetic CP4 gene that predominantly (77%) have codons preferred by plastids The results obtained show that the optimization through the use of plastic codons leads to an increase in protein accumulation of approximately 10% more (i.e. about 50 times more than without codon optimization).

El notable incremento de expresión de esta enzima se observó en el contexto de la secuencia líder G10L del bacteriófago T4 y no se ha analizado en el contexto de la secuencia líder de psbA. Esto es relevante ya que se ha demostrado que los efectos de mutaciones en las secuencias inmediatamente posteriores al triplete de inicio varían mucho dependiendo de la secuencia líder (Kuroda y Maliga 2001b).The marked increase in expression of this enzyme was observed in the context of the G10L leader sequence of bacteriophage T4 and has not been analyzed in the context of the leader sequence of psb A. This is relevant since it has been shown that the effects of mutations In the sequences immediately after the starting triplet, they vary greatly depending on the leader sequence (Kuroda and Maliga 2001b).

Hay pocos datos en la literatura científica sobre la influencia de la velocidad de elongación en la eficiencia de la expresión genética en el cloroplasto. La velocidad de elongación puede depender del sesgo de tripletes del gen que se pretende expresar, del contenido en pares GC del ADN y de la estructura secundaria del ARNm, que a su vez es un determinante de la estabilidad del mensajero (Stern y col., 1991). La expresión eficiente de genes exógenos en un organismo heterólogo puede requerir la adaptación de la secuencia primaria del gen al sesgo de tripletes característico del organismo hospedador y la alteración de elementos estructurales del ARNm. El sesgo en el uso de tripletes de un organismo es un indicador de la frecuencia relativa de los distintos tripletes que codifican un aminoácido o una señal de terminación. Se han observado diferencias significativas en el sesgo en el uso de tripletes entre distintos organismos, que están relacionados a su vez con la frecuencia de nucleótidos en el ADN (frecuencia de pares GC o AT en el ADN). En algunos casos se ha observado que la frecuencia relativa de tripletes "raros" es limitante en la eficiencia de la traducción, pero en otros casos no. Este efecto del sesgo de tripletes empleado puede estar relacionado con la frecuencia de los ARN de transferencia (ARNt) complementarios en el citoplasma (revisado por Gustafsson y col., 2004). En cloroplastos de tabaco se ha observado que la adaptación parcial del gen que codifica el fragmento C de la toxina colérica al contenido en GC característico del cloroplasto, favorece la expresión del gen: el producto del gen adaptado se acumuló entre 2 y 3 veces más que el del gen nativo (Tregoning y col., 2003). En otro ejemplo, un gen que codifica para una enzima que proporciona resistencia a un herbicida, se acumuló 2-3 veces más en cloroplastos que contenían una versión sintética adaptada que en los que contenían la versión nativa del mismo gen (Ye y col., 2001). La sobre-expresión de genes nativos de distintos orígenes (humanos, bacterianos etc.) en cloroplastos de tabaco sugiere que el sesgo de uso de tripletes no es un determinante importante para la expresión génica en éste sistema, pero la ausencia de expresión detectable de otros genes puede estar relacionada con factores tales como el contenido en pares GC y/o la estructura secundaria del ARNm, que pueden influir en la elongación de la proteína naciente durante la traducción.There is little data in the scientific literature on the influence of elongation speed on efficiency of the genetic expression in the chloroplast. The speed of elongation may depend on the triplet bias of the gene that is intends to express, of the GC pair content of the DNA and of the secondary structure of the mRNA, which in turn is a determinant of the stability of the messenger (Stern et al., 1991). The expression efficient exogenous genes in a heterologous organism can require the adaptation of the primary sequence of the gene to the bias of characteristic triplets of the host organism and the alteration of structural elements of mRNA. The bias in the use of triplets of an organism is an indicator of the relative frequency of different triplets that encode an amino acid or signal termination. Significant differences in bias have been observed. in the use of triplets between different organisms, which are related in turn to the frequency of nucleotides in DNA (frequency of GC or AT pairs in the DNA). In some cases it has observed that the relative frequency of "rare" triplets is limiting translation efficiency, but in other cases no. This effect of the triplet bias used may be related with the frequency of complementary transfer RNAs (tRNAs) in the cytoplasm (reviewed by Gustafsson et al., 2004). In tobacco chloroplasts have been observed that partial adaptation of the gene encoding the C fragment of the cholera toxin to the content In characteristic chloroplast GC, it favors gene expression: the product of the adapted gene accumulated between 2 and 3 times more than the of the native gene (Tregoning et al., 2003). In another example, a gene that encodes for an enzyme that provides resistance to a herbicide, it accumulated 2-3 times more in chloroplasts than they contained an adapted synthetic version that in those that contained the native version of the same gene (Ye et al., 2001). The over-expression of native genes of different origins (human, bacterial etc.) in tobacco chloroplasts suggests that triplet use bias is not a determinant important for gene expression in this system, but the absence of detectable expression of other genes may be related to factors such as GC pair content and / or the secondary structure of mRNA, which can influence elongation of the nascent protein during translation.

Estabilidad del productoProduct stability

Otro factor a tener en cuenta si se quiere obtener una acumulación eficiente de celulasas de uso industrial en cloroplastos de tabaco es la estabilidad del producto en el estroma del cloroplasto. La estabilidad depende de que la proteína naciente adopte una conformación estable y funcional, y depende de la sensibilidad y accesibilidad del producto a la maquinaria de degradación del cloroplasto. En la literatura científica se han descrito algunos procedimientos que pueden favorecer la acumulación de productos génicos en el cloroplasto influyendo en la estabilidad. En un primer ejemplo se observó que la acumulación de la somatotropina bovina en cloroplastos de tabaco aumenta considerablemente cuando se expresa como proteína de fusión de la ubiquitina (Staub y col., 1999), aunque el incremento observado puede estar relacionado tanto con la expresión génica como con la estabilidad del producto. Otros productos de fusión como los anteriormente mencionados (Ye, Staub y col., 2001) pueden tener también efectos combinados sobre la expresión y estabilidad del producto. El mejor ejemplo que demuestra la importancia de la estabilidad del producto es el de la acumulación de un insecticida en cloroplastos de tabaco (De Cosa y col., 2001). La elevada acumulación del producto en este caso concreto (se estimó en hasta un 45% de la proteína extraíble) se debe a la estabilización del insecticida gracias a la co-expresión de una chaperona que facilita el plegamiento del insecticida.Another factor to consider if you want obtain an efficient accumulation of industrial cellulases in Tobacco chloroplasts is the stability of the product in the stroma of chloroplast. Stability depends on the nascent protein adopt a stable and functional conformation, and it depends on the product sensitivity and accessibility to the machinery of degradation of chloroplast. In the scientific literature they have described some procedures that can favor the accumulation of gene products in the chloroplast influencing stability. In a first example it was observed that the accumulation of bovine somatotropin in tobacco chloroplasts increases considerably when expressed as a fusion protein of the ubiquitin (Staub et al., 1999), although the increase observed It may be related to both gene expression and product stability Other fusion products such as previously mentioned (Ye, Staub et al., 2001) may have also combined effects on the expression and stability of product. The best example that demonstrates the importance of product stability is the accumulation of an insecticide in tobacco chloroplasts (De Cosa et al., 2001). High product accumulation in this specific case (estimated at up to 45% of the extractable protein) is due to the stabilization of the insecticide thanks to the co-expression of a chaperone that facilitates the folding of the insecticide.

La traducción de genes exógenos integrados en el cloroplasto y operativamente ligados a las secuencias 5' y 3' no codificantes del gen psbA se induce fuertemente por la luz (Eibl y col 1999).The translation of exogenous genes integrated into the chloroplast and operatively linked to the 5 'and 3' non-coding sequences of the psb A gene is strongly induced by light (Eibl et al 1999).

En el artículo de Gil y col., 2006 (de ahora en adelante D2) se desarrolla un procedimiento de estabilización que se basa en la formación de estructuras complejas (polímeros de las enzimas individuales) y más estables que las estructuras simples. La formación de estructuras complejas reduce la accesibilidad del producto a la maquinaria de degradación del cloroplasto y, por tanto, la velocidad de degradación, permitiendo una mayor acumulación del producto expresado en el cloroplasto. El mencionado artículo presenta una estrategia para aumentar la expresión de antígenos en el citoplasma vegetal mediante su fusión a un fragmento de 41 aminoácidos que contiene el dominio de tetramerización (TD) del factor de transcripción humano p53 (Seq Id No. 35). Para ello se lleva a cabo la fusión traduccional de 21 aminoácidos derivados del dominio N-terminal de la proteína altamente inmunogénica 2L21, derivada de la proteína VP2 del parvovirus canino (CPV), al dominio de tetramerización (TD) del factor transcripcional p53, de 41 aminoácidos de longitud, demostrando que dicha construcción puede ser eficientemente expresada en plantas transgénicas. Esta fusión permite la obtención de tetrámeros de la proteína en cuestión alcanzando niveles por encima de los rendimientos habituales para péptidos obtenidos en plantas por transformación nuclear (0,01-0,4% del TSP). Estos resultados demostraron que la multimerización dirigida a través del dominio de tetramerización (TD) contribuye a la estabilización en el citoplasma y, consecuentemente, a la acumulación del péptido 2L21 en plantas transgénicas, sin alterar su antigenicidad e inmunogenicidad nativas. También muestran que el dominio de tetramerización de la p53 media la oligomerización del péptido 2L21, produciendo tetrámeros peptídicos estables acumulados en más del 1% de la proteína total extraída de las hojas transgénicas. La aplicación de la invención se centra en el campo de las vacunas.In the article by Gil et al., 2006 (from now on forward D2) a stabilization procedure is developed that based on the formation of complex structures (polymers of individual enzymes) and more stable than simple structures. The complex structure formation reduces the accessibility of product to the chloroplast degradation machinery and, by therefore, the degradation rate, allowing greater accumulation of the product expressed in the chloroplast. Said article presents a strategy to increase the expression of antigens in the plant cytoplasm by fusion to a fragment of 41 amino acids containing the tetramerization domain (TD) of the human transcription factor p53 (Seq Id No. 35). To do this carries out the translational fusion of 21 amino acids derived from N-terminal protein domain highly 2L21 immunogenic, derived from canine parvovirus VP2 protein (CPV), to the tetramerization domain (TD) of the transcriptional factor p53, 41 amino acids in length, showing that construction can be efficiently expressed in plants transgenic This fusion allows obtaining tetramers of the protein in question reaching levels above usual yields for peptides obtained in plants by nuclear transformation (0.01-0.4% of the TSP). These results showed that multimerization directed through the tetramerization domain (TD) contributes to stabilization in the cytoplasm and, consequently, to the accumulation of peptide 2L21 in transgenic plants, without altering their antigenicity and immunogenicity native They also show that the tetramerization domain of the p53 mediates the oligomerization of peptide 2L21, producing stable peptide tetramers accumulated in more than 1% of the Total protein extracted from the transgenic leaves. The application of The invention focuses on the field of vaccines.

Producción de celulasas de Dickeya dadantii Production of Dickeya dadantii cellulases

En el artículo de Zhou y col., (2000) se expone la importancia que la hidrólisis de la celulosa en azúcares solubles mediante sistemas microbianos supone en la producción de materias primas renovables para la producción de combustible y químicos. Este artículo se centra en examinar la efectividad de las endoglucanasas CelY y Cel1Z solas o en combinación usando carboximetilcelulosa y celulosa amorfa como sustratos. Así, se comprueba en ambos sustratos que se produce sinergismo al combinar ambas enzimas. El documento especifica que, aunque Cel1Z y CelY (muy útiles en la maceración de las paredes celulares de las plantas) son producidas por Erwinia chrysanthemi (Dickeya dadantii), Cel1Z representa aproximadamente el 95% de la actividad carboximetil celulasa.In the article by Zhou et al. (2000), the importance of cellulose hydrolysis in soluble sugars through microbial systems is explained in the production of renewable raw materials for the production of fuel and chemicals. This article focuses on examining the effectiveness of CelY and Cel1Z endoglucanases alone or in combination using carboxymethylcellulose and amorphous cellulose as substrates. Thus, it is proven in both substrates that synergism occurs when combining both enzymes. The document specifies that, although Cel1Z and CelY (very useful in macerating plant cell walls) are produced by Erwinia chrysanthemi (Dickeya dadantii ), Cel1Z represents approximately 95% of the carboxymethyl cellulase activity.

Para poder llevar a cabo dichos experimentos construyen plásmidos que expresan niveles altos de CelY en E. coli recombinante. Sorprendentemente, el 90% de la actividad CelY es excretada como producto extracelular mediante el sistema de secreción nativo de E. coli. Proceden a la amplificación por PCR de la región codificante (sin promotor) de CelY y posteriormente la clonan en el plásmido pCR2.1-TOPO, bajo el promotor lac. El remplazamiento del promotor nativo por el promotor lac incrementó la expresión de CelY aproximadamente 10 veces, pasando de 165 a 1800 IU/litro. Aproximadamente el 90% de la actividad CelY se encontró en el medio extracelular. Estudios anteriores de los mismo autores describen la expresión de Cel1Z por E. coli transformada con el plásmido pLOI1620 (es decir el plásmido en el que se ha clonado el gen Cel1Z junto con su promotor nativo).In order to carry out these experiments, they construct plasmids that express high levels of CelY in recombinant E. coli . Surprisingly, 90% of CelY activity is excreted as an extracellular product by the native E. coli secretion system. They proceed to the PCR amplification of the coding region (without promoter) of CelY and subsequently clone it into plasmid pCR2.1-TOPO, under the lac promoter. The replacement of the native promoter by the lac promoter increased CelY expression approximately 10 times, from 165 to 1800 IU / liter. Approximately 90% of CelY activity was found in the extracellular environment. Previous studies by the same authors describe the expression of Cel1Z by E. coli transformed with the plasmid pLOI1620 (ie the plasmid in which the Cel1Z gene has been cloned together with its native promoter).

Aunque este artículo muestra la importancia y el interés en la obtención de endoglucanasas para su aplicación industrial, lleva a cabo la obtención de dichas enzimas por un método que difiere del objeto de la presente invención, tanto en la metodología como en la cantidad obtenida.Although this article shows the importance and the interest in obtaining endoglucanases for application industrial, carries out the obtaining of said enzymes by a method that differs from the object of the present invention, both in the methodology as in the amount obtained.

Por lo tanto, todavía existe la necesidad de un método para incrementar la cantidad de proteínas/enzimas funcionales en plantas, concretamente de celulasas en cloroplastos, sin disminuir su actividad, de forma que se puedan utilizar en cantidades industriales.Therefore, there is still a need for a method to increase the amount of functional proteins / enzymes in plants, specifically of cellulases in chloroplasts, without decrease their activity, so that they can be used in Industrial quantities.

Objeto de la invenciónObject of the invention

La solución aportada por la presente invención se centra en la fusión traduccional de una versión modificada (con bajo contenido en pares GC) de los primeros 15 aminoácidos de la proteína fluorescente verde (GFP) (Seq Id No. 28, 29), así como la fusión del dominio de tetramerización de la proteína p53 (Seq Id No. 35, 36) (fusión que puede realizarse entre dominios funcionales o en el extremo C-terminal), a la secuencia de la proteína en cuestión cuya producción se desea incrementar. Con la construcción obtenida se transforman cloroplastos que expresaran la proteína de interés de forma incrementada y con una estabilidad mejorada de forma que en tejidos maduros el producto de interés puede ser la proteína extraíble más abundante, recuperándose dicha proteína en un rango entre el 25-30% del total de la proteína extraíble de la planta.The solution provided by the present invention it focuses on the translational fusion of a modified version (with low GC pair content) of the first 15 amino acids of the green fluorescent protein (GFP) (Seq Id No. 28, 29), as well as the fusion of the tetramerization domain of the p53 protein (Seq Id No. 35, 36) (fusion that can be performed between functional domains or in the C-terminal end), to the sequence of the protein in question whose production you want to increase. With the construction obtained chloroplasts are transformed that will express the protein of interest in an increased way and with stability improved so that in mature tissues the product of interest it can be the most abundant extractable protein, recovering said protein in a range between 25-30% of the total removable plant protein.

Como proteína de interés se entiende cualquier proteína de interés, preferentemente un enzima, de origen animal o vegetal, como pueden ser las enzimas implicadas en la hidrólisis de celulosa y otros componentes de la pared celular vegetal -endoglucansas, celobiohidrolasas, betaglucosidasas, endoxilanasas, arabinofuranosidasas etc-, y otras enzimas de uso industrial como pueden ser proteasas, fitasas, lipooxigenasas, lacasas, fitasas y otras.As a protein of interest, any protein of interest, preferably an enzyme, of animal origin or plant, such as enzymes involved in the hydrolysis of cellulose and other components of the plant cell wall -endoglucansas, cellobiohydrolases, betaglucosidases, endoxylanases, arabinofuranosidases etc-, and other enzymes for industrial use such as they can be proteases, phytases, lipoxygenases, laccases, phytases and others.

La presente invención se refiere a un método para incrementar la producción de proteínas funcionales, y más concretamente enzimas funcionales en cloroplastos. Concretamente de celulasas y más concretamente de las endoglucanasas CelY (Seq Id No. 30) y Cel1Z (Seq Id No. 48)para su uso industrial, ya que su productividad es el principal factor limitante en su utilización industrial debido a las grandes cantidades de enzima necesarias en su utilización.The present invention relates to a method for increasing the production of functional proteins, and more specifically functional enzymes in chloroplasts. Specifically of cellulases and more specifically of the endoglucanases CelY (Seq Id No. 30) and Cel1Z (Seq Id No. 48) for their industrial use, since their productivity is the main limiting factor in their industrial use due to the large amounts of enzyme needed in its use.

Para alcanzar el objeto de la invención consistente en aumentar la producción de celulasas se utiliza la combinación simultánea de dos estrategias:To achieve the object of the invention consisting of increasing the production of cellulases the Simultaneous combination of two strategies:

\bullet?

Estrategia que favorece la expresión de un producto génico: fusión traduccional de una versión modificada de la secuencia que codifica para los primeros 15 aminoácidos de la GFP (Seq Id No. 28).Strategy that favors expression of a gene product: translational fusion of a version modified sequence coding for the first 15 amino acids of the GFP (Seq Id No. 28).

\bullet?

Estrategia que favorece la estabilización del producto: fusión/sustitución del dominio de tetramerización de la p53 (Seq Id No. 35)(en el dominio C-terminal o en el brazo espaciador en el caso de proteínas con dominios estructurales-funcionales diferenciados).Strategy that favors product stabilization: fusion / substitution of the domain of tetramerization of p53 (Seq Id No. 35) (in the domain C-terminal or on the spacer arm in the case of proteins with structural-functional domains differentiated).

Considerando que el documento anteriormente mencionado como D1 describe la estrategia de llevar a cabo la fusión traduccional de los 14 primeros aminoácidos de la secuencia de la GFP (Seq Id No. 26) al dominio N-terminal de una proteína, consiguiendo niveles de expresión de dicha proteína en plantas (concretamente plantas de tabaco) del orden del 12% del total de la proteína soluble de la célula, y que en el documento D2, también mencionado anteriormente, se presenta la fusión de un fragmento de 41 aminoácidos (TD) (Seq Id No. 35) que contiene el dominio de tetramerización del factor de transcripción humano p53 a una secuencia de 21 aminoácidos de la proteína 2L21 derivada de VP2 del parvovirus canino, consiguiéndose de esta manera (en las plantas de A. thaliana transformadas con la construcción a la que la fusión da lugar) la obtención de tetrámeros de la proteína en cuestión (2L21), alcanzando niveles por encima de los rendimientos habituales para péptidos obtenidos en plantas por transformación nuclear (0,001-0,4% del TSP), parece que la combinación de ambas estrategias sea una solución obvia al problema planteado, Sin embargo, sorprendentemente se ha encontrado que la combinación de ambas estrategias, de la forma llevada a cabo en la presente invención, da lugar a un efecto sinérgico totalmente inesperado ya que se consigue un incremento de la producción de las proteínas, ejemplificado en la presente invención a través de celulasas, de aproximadamente un 25%-30% del TSP, sensiblemente superior al de la suma de los incrementos obtenidos como resultado de dichas estrategias aplicadas individualmente, siendo en D1 de un 12% del TSP y en D2 de un 1,2% del TSP, es decir, a través de la estrategia de la invención se consigue un incremento sinergístico en la producción de proteínas.Considering that the document mentioned above as D1 describes the strategy of carrying out the translational fusion of the first 14 amino acids of the GFP sequence (Seq Id No. 26) to the N-terminal domain of a protein, achieving expression levels of said protein in plants (specifically tobacco plants) of the order of 12% of the total soluble cell protein, and that in document D2, also mentioned above, the fusion of a fragment of 41 amino acids (TD) is presented ( Seq Id No. 35) which contains the tetramerization domain of the human transcription factor p53 to a 21 amino acid sequence of the 2L21 protein derived from VP2 of the canine parvovirus, thus being achieved (in A. thaliana plants transformed with the construction to which the fusion gives rise to) obtaining tetramers of the protein in question (2L21), reaching levels above the usual yields for peptides obtained In nuclear transformation plants (0.001-0.4% of the TSP), it seems that the combination of both strategies is an obvious solution to the problem posed, However, surprisingly it has been found that the combination of both strategies, in the way taken carried out in the present invention, gives rise to a totally unexpected synergistic effect since an increase in the production of the proteins, exemplified in the present invention through cellulases, of approximately 25% -30% of the TSP is achieved, substantially greater than the sum of the increases obtained as a result of said individually applied strategies, being in D1 of 12% of the TSP and in D2 of 1.2% of the TSP, that is, through the strategy of the invention, achieves a synergistic increase in protein production.

Por otro lado, el documento D2 no indica posibles efectos del dominio de tetramerización de la p53 (Seq Id No. 35) sobre cualquier funcionalidad de la proteína de interés diferente a su utilización como antígeno, ni otros posibles efectos de dicho dominio sobre la expresión de genes en el cloroplasto. Los resultados del documento D2, indican la estabilización de péptidos de pequeño tamaño, y por tanto, altamente susceptibles a la degradación proteolítica, pero sus resultados no son directamente extrapolares a la producción de proteínas de mayor tamaño y con dominios estructurales estables como las endoglucanasas CelY o Cel1Z.On the other hand, document D2 does not indicate possible effects of the tetramerization domain of p53 (Seq Id No. 35) on any functionality of the protein of interest other than its use as an antigen, or other possible effects of said domain on expression. of genes in the chloroplast. The results of document D2 indicate the stabilization of small peptides, and therefore, highly susceptible to proteolytic degradation, but their results are not directly extrapolar to the production of larger proteins and with stable structural domains such as CelY endoglucanases . or Cel1Z .

Así, adicionalmente, las proteínas/enzimas obtenidas en la presente invención presentan propiedades mejoradas de estabilidad del producto durante la reacción, indicando que se trata de productos nuevos, con propiedades diferenciadas respecto a las enzimas nativas.Thus, additionally, proteins / enzymes obtained in the present invention have improved properties of product stability during the reaction, indicating that it deals with new products, with differentiated properties with respect to native enzymes

Por lo tanto, de esta manera se consigue:Therefore, this way you get:

\bullet?

una actividad endoglucanasa mayor que la obtenida por únicamente la fusión traduccional de GFP o el gen nativo sin fusionar. Diferencia que se acentúa en la maduración de los tejidos. an endoglucanase activity greater than that obtained by only the translational fusion of GFP or the native gene without merging. Difference that is accentuated in the tissue maturation.

\bullet?

que la proteína extraíble de la planta más abundante corresponda al producto de interés, con una acumulación diferencial respecto a otra proteína muy abundante y estable en las plantas (Ribulosa carboxilasa, RUBISCO) o respecto a la misma proteína carente del dominio de tetramerización. Esta estabilización diferencial del producto de interés, frente a otras proteínas endógenas de la planta, observada mediante comparación de tejidos en distinto estado de maduración, es un fenómeno nuevo proporcionado por la presente invención y anteriormente no descrito. that the removable protein from the most abundant plant corresponds to the product of interest, with a differential accumulation compared to another very abundant protein and stable in plants (Ribulosa carboxylase, RUBISCO) or with respect to the same protein lacking the tetramerization domain. This differential stabilization of the product of interest, compared to others endogenous plant proteins, observed by comparing tissues in different stages of maturation, it is a new phenomenon provided by the present invention and not previously described

En las construcciones génicas a las que la implementación de estas estrategias da lugar, la secuencia de DNA quimérico de interés (secuencia del gen de interés simultáneamente fusionada a la versión modificada de la secuencia que codifica para los primeros 15 aminoácidos de la GFP (Seq Id No. 28) y al dominio de tetramerización de la p53, Seq Id No. 35) está operativamente ligado al promotor de transcripción (Seq Id No. 2), secuencia líder (Seq Id No. 3)y secuencia de terminación de transcripción derivados del gen psbA.In gene constructs to which the implementation of these strategies results in the DNA sequence chimeric of interest (sequence of the gene of interest simultaneously merged to the modified version of the sequence that codes for the first 15 amino acids of the GFP (Seq Id No. 28) and to the domain tetramerization of p53, Seq Id No. 35) is operatively linked to the transcription promoter (Seq Id No. 2), leader sequence (Seq Id No. 3) and transcription termination sequence derived from the psbA gene.

El método que constituye el objeto de la invención implica la transformación de las células de planta con las construcciones génicas mencionadas, el posterior crecimiento de las células y/o plantas y la recuperación de la proteína quimérica expresada en los cloroplastos.The method that constitutes the object of the invention involves the transformation of plant cells with the Gene constructions mentioned, the subsequent growth of cells and / or plants and the recovery of the chimeric protein expressed in chloroplasts.

Dicha metodología promueve la expresión (eficiencia de la traducción) así como la estabilización de los productos en la planta mediante la expresión de genes introducidos en un organismo genéticamente manipulado, concretamente la manipulación mediante introducción de genes en el genoma del cloroplasto vegetal.This methodology promotes expression (translation efficiency) as well as the stabilization of products in the plant by expressing introduced genes in a genetically manipulated organism, specifically the manipulation by introducing genes into the genome of vegetable chloroplast

Las plantas de la invención presentan un incremento en la acumulación en cloroplastos de la proteína en cuestión de hasta el 30% de la TSP, que es superior a la suma de los incrementos obtenidos a través de las estrategias de fusión individuales de dichas secuencias.The plants of the invention have a increased accumulation in protein chloroplasts in question of up to 30% of the TSP, which is greater than the sum of the increases obtained through merger strategies individual of these sequences.

Además estas plantas, que presentan la proteína de interés codificada por el DNA quimérico como producto mayoritario extraíble, presentan dicha acumulación en todas las hojas de la planta independientemente de su estado de maduración, siendo especialmente mayor la acumulación en hojas maduras, entre un 5 y un 10% mayor en términos relativos al contenido total de proteínas que en las hojas jóvenes.In addition these plants, which present the protein of interest encoded by the chimeric DNA as a majority product removable, have such accumulation in all the leaves of the plant regardless of its state of maturation, being especially greater accumulation in mature leaves, between a 5 and a 10% higher in terms of total protein content than In the young leaves.

Un objeto de la presente invención se refiere a la construcción nucleotídica caracterizada por comprenderAn object of the present invention relates to the nucleotide construction characterized by understanding

a.to.

Una secuencia de DNA quimérico que comprende una secuencia de DNA o proteína simultáneamente fusionada a dos fragmentos sintéticos de ADN codificante que consisten en i) una versión modificada de la secuencia que codifica para los primeros 15 aminoácidos de la GFP (Seq Id No. 28) y ii) la secuencia que codifica para el dominio de tetramerización de la p53 (Seq Id No. 35).A chimeric DNA sequence comprising a DNA sequence or protein simultaneously fused to two synthetic fragments of Coding DNA consisting of i) a modified version of the sequence encoding the first 15 amino acids of the GFP (Seq Id No. 28) and ii) the sequence that codes for the domain of tetramerization of p53 (Seq Id No. 35).

b.b.

precedida por un triplete de inicio de la traducción en fase de lectura,preceded by a starting triplet of reading translation

c.C.

clonada bajo el control de un promotor y secuencia líder funcionales en plastidios,cloned under the control of a promoter and leading functional sequence in plastids,

d.d.

un triplete de terminación de la traducción ya translation termination triplet and

e.and.

una región no codificante que contenga señales de terminación de la transcripción reconocidas en el cloroplasto.a non-coding region containing termination signals from the Transcription recognized in the chloroplast.

En una realización particular la proteína es un enzima, preferentemente una celulasa, más preferentemente una endoglucanasa y en concreto CelY y/o Cel1Z, o dichas proteínas carentes del péptido de secreción.In a particular embodiment the protein is a enzyme, preferably a cellulase, more preferably a endoglucanase and specifically CelY and / or Cel1Z, or said proteins lacking the secretion peptide.

En dicho objeto de invención, los fragmentos sintéticos de ADN codificante de la etapa a) presentan bajo contenido en pares GC, preferentemente el contenido en GC es del 40%.In said object of the invention, the fragments Synthetic DNA encoding stage a) present low GC pair content, preferably the GC content is 40%

En dicho objeto de invención, la secuencia que codifica para los primeros 15 aminoácidos de la GFP consiste en Seq Id No. 28, llevándose a cabo en el extremo N-terminal de la proteína o secuencia de DNA cuya expresión se desea incrementar, y la secuencia del dominio de tetramerización de la p53 consiste en Seq Id No. 35, realizándose la fusión dentro del brazo de separación, en sustitución del brazo de separación o en C-terminal, específicamente en el extremo C-terminal cuando el enzima a expresar no presenta dominios funcionales separados y en el brazo de separación o en sustitución del mismo cuando el enzima a expresar presenta dominios funcionales separados.In said object of the invention, the sequence that encodes for the first 15 amino acids of the GFP consists of Seq Id No. 28, taking place at the end N-terminal of the protein or DNA sequence whose expression is desired to increase, and the domain sequence of tetramerization of p53 consists of Seq Id No. 35, with the fusion within the separation arm, replacing the arm of separation or in C-terminal, specifically in the C-terminal end when the enzyme to express no presents separate functional domains and in the separation arm or replacing it when the enzyme to be expressed has separate functional domains.

En una realización particular el promotor (Seq Id No. 2) y secuencia líder (Seq Id No. 3) son los del gen psbA.In a particular embodiment the promoter (Seq Id No. 2) and leader sequence (Seq Id No. 3) are those of the psbA gene.

Otro objeto de invención se refiere al fragmento sintético de ADN codificante, caracterizado por consistir en una versión modificada de la secuencia que codifica para los primeros 15 aminoácidos de la GFP , específicamente (Seq Id No. 28).Another object of the invention relates to the fragment synthetic DNA coding, characterized by consisting of a modified version of the sequence coding for the first 15 amino acids of the GFP, specifically (Seq Id No. 28).

Otro objeto de invención se refiere al fragmento sintético de ADN codificante, caracterizado por consistir en el dominio de tetramerización de la p53, concretamente Seq Id No.35.Another object of the invention relates to the fragment synthetic DNA coding, characterized by consisting of the tetramerization domain of p53, specifically Seq Id No.35.

Otro objeto de invención se refiere al método para incrementar la expresión de proteínas en plantas, mediante la integración de genes en el genoma del cloroplasto vegetal caracterizado porque comprende las etapas de:Another object of the invention relates to the method to increase protein expression in plants, by gene integration in the genome of plant chloroplast characterized in that it comprises the stages of:

a.to.

Transformación de una célula y/o planta con la construcción nucleotídica según reivindicaciones 1 a 13.Transformation of a cell and / or plant with the nucleotide construction according to claims 1 to 13.

b.b.

Hacer crecer dichas células y/o plantas bajo condiciones en las que la secuencia de DNA obtenida en la etapa a) se transcriba.Do grow said cells and / or plants under conditions in which the DNA sequence obtained in step a) is transcribed.

c.C.

Si se desea, recuperar la proteína quimérica, codificada por la construcción nucleotídica de a), expresada.Whether want, recover the chimeric protein, encoded by the a) nucleotide construction, expressed.

En dicho método, las proteínas quiméricas cuya expresión se ha visto incrementada se mantienen funcionalmente activas y el incremento de la expresión génica es superior al obtenido a través de la suma de los incrementos obtenidos al fusionar los fragmentos sintéticos de ADN codificante (GFP y p53). En una realización particular, la acumulación de la proteína de interés expresada es del 25-30% del TPS. Específicamente, dicho incremento es al menos dos órdenes de magnitud superior que al expresar el producto génico nativo, dos veces mayor que al expresar el producto génico fusionado a GFP, y 10 veces mayor que al expresar el producto génico fusionado a p53.In said method, the chimeric proteins whose expression has been increased functionally maintained active and the increase in gene expression is greater than obtained through the sum of the increases obtained by fuse synthetic fragments of coding DNA (GFP and p53). In a particular embodiment, the accumulation of the protein of Expressed interest is 25-30% of the TPS. Specifically, said increase is at least two orders of magnitude greater than when expressing the native gene product, two times greater than when expressing the gene product fused to GFP, and 10 times greater than when expressing the gene product fused to p53.

Otro objeto de invención se refiere a la célula, específicamente una célula de planta caracterizada por comprender la construcción nucleotídida anteriormente definida. En una realización particular la célula ha sido obtenida a través del método de la invención.Another object of the invention relates to the cell, specifically a plant cell characterized by understanding the nucleotide construction defined above. In one embodiment particular the cell has been obtained through the method of invention.

En dicho objeto de invención la proteína quimérica expresada a partir de la secuencia de DNA quimérico de la construcción nucleotídica corresponde a un porcentaje entre el 25% y el 30% del total de proteína soluble comprendida en dicha célula.In said object of the invention the protein chimeric expressed from the chimeric DNA sequence of the Nucleotide construction corresponds to a percentage between 25% and 30% of the total soluble protein included in said cell.

Otro objeto de invención se refiere a la planta transgénica que comprende la construcción nucleotídica de la invención, específicamente la obtenida por el método de la invención.Another object of the invention relates to the plant transgenic comprising the nucleotide construction of the invention, specifically that obtained by the method of invention.

En dicho objeto de invención, la planta transgénica presenta como producto mayoritario extraíble la proteína de interés codificada por la secuencia de DNA quimérico de la construcción nucleotídica descrita, preferiblemente entre el 25% y el 30% del total de proteína soluble, produciéndose dicha acumulación en todas las hojas de la planta independientemente de su estado de maduración, siendo especialmente mayor la acumulación en hojas maduras, entre un 5 y un 10% mayor en términos relativos al contenido total de proteínas que en las hojas jóvenes.In said object of invention, the plant transgenic presents as a removable majority product the protein of interest encoded by the chimeric DNA sequence of the described nucleotide construction, preferably between 25% and 30% of the total soluble protein, producing said accumulation in all the leaves of the plant regardless of their maturation status, especially the accumulation in mature leaves, between 5 and 10% higher in terms relative to Total protein content than in young leaves.

Otro objeto de invención se refiere a la semilla producida por las plantas descritas.Another object of the invention relates to the seed produced by the plants described.

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Otro objeto de invención se refiere a la proteína quimérica obtenida por el método descrito. En una realización particular, dicha proteína quimérica es un enzima, preferentemente CelY quimérica (Seq Id No. 30) o Cel1Z quimérica (Seq Id No. 43).Another object of the invention relates to the chimeric protein obtained by the described method. In a particular embodiment, said chimeric protein is an enzyme, preferably chimeric CelY (Seq Id No. 30) or chimeric Cel1Z (Seq Id No. 43).

Otro objeto de invención se refiere al uso de las plantas descritas como biofactorías, para la producción masiva de enzimas de interés industrial, en la industria del biodiesel.Another object of the invention relates to the use of the plants described as biofactories, for mass production of enzymes of industrial interest, in the biodiesel industry.

Otro objeto de invención se refiere al uso del fragmento sintético que codifica para la p53 para la obtención de productos quiméricos de fusión en el cloroplasto cuya expresión es más estable respecto a variantes que carecen de este fragmento.Another object of the invention relates to the use of synthetic fragment that codes for p53 to obtain Chloric fusion products in chloroplast whose expression is more stable with respect to variants that lack this fragment.

Otro objeto de invención se refiere al uso del fragmento sintético derivado de GFP para, incrementar la expresión génica y acumulación del producto en el cloroplasto.Another object of the invention relates to the use of synthetic fragment derived from GFP to increase expression gene and accumulation of the product in the chloroplast.

Otro objeto de invención se refiere al método descrito, para la producción de proteínas quiméricas en plantas genéticamente modificadas (PGMs). Dichas proteínas se caracterizan por presentar propiedades mejoradas de estabilidad, y actividad sobre un sustrato insoluble respecto a la enzima nativa, En una realización particular, dicha proteína quimérica es CelY quimérica (Seq Id No. 42) o Cel1Z quimérica (Seq Id No. 56).En otra realización particular dichas enzimas quiméricas no requieren ser purificadas.Another object of the invention relates to the method described, for the production of chimeric proteins in plants genetically modified (PGMs). These proteins are characterized for presenting improved stability and activity properties on an insoluble substrate with respect to the native enzyme, in a particular embodiment, said chimeric protein is chimeric CelY (Seq Id No. 42) or Chimeric Cel1Z (Seq Id No. 56) .Other particular embodiment said chimeric enzymes do not need to be purified.

Otro objeto de invención se refiere al uso del método en las industriáis de combustibles, alimentación, producción animal, textil y papelera.Another object of the invention relates to the use of method in the fuel, food, production industries Animal, textile and wastebasket.

Otro objeto de invención se refiere al uso del método para la generación de bioetanol de segunda generación.Another object of the invention relates to the use of method for the generation of second generation bioethanol.

Otro objeto de invención se refiere al uso de las proteínas quiméricas Cely y/o Cel1Z para la conversión de celulosa en etanol.Another object of the invention relates to the use of Cely and / or Cel1Z chimeric proteins for the conversion of cellulose in ethanol.

Breve descripción de las figurasBrief description of the figures

Leyenda de las figuras: Con el fin de facilitar la lectura y entendimiento de las figuras 1, 5, 6, 9,10, 13 y 14 se ha empleado en ellas la misma tipografía y subrayado para distinguir las distintas regiones y/o dominios de las secuencias de las figuras. Legend of the figures : In order to facilitate the reading and understanding of figures 1, 5, 6, 9,10, 13 and 14, the same typeface and underlining have been used to distinguish the different regions and / or domains of The sequences of the figures.

Así, la distinta tipografía y subrayado empleada corresponde a:Thus, the different typeface and underline used corresponds to:

100100

Fig 1: Muestra secuencias de los vectores intermedios empleados, la secuencia completa del vector pPLAg (A1), y las secuencias parciales de pPLAg (A2), pPLAf (B) y pPLA (C), indicando en cada uno de ellos la parte de la secuencia que representa los elementos de control de la expresión. Así, en estas figuras se señala: promotor psbA (cursiva subrayado simple), Secuencia líder psbA (cursiva simple), Sitios de restricción (subrayado simple), Gen resistencia a Kanamicina (subrayado intercalando puntos y rayas simple), sitio de inicio de la traducción (sombreado gris), y las modificaciones introducidas en pPLAg y pPLAf. Las modificaciones corresponden a secuencia derivada GFP (negrita doble subrayado), secuencia derivada ferredoxina (negrita subrayado interrumpido).Fig 1: Shows vector sequences intermediates used, the complete sequence of the pPLAg vector (A1), and the partial sequences of pPLAg (A2), pPLAf (B) and pPLA (C), indicating in each of them the part of the sequence that represents the control elements of the expression. So, in these Figures are noted: psbA promoter (simple underline italic), Leader sequence psbA (simple italic), Restriction sites (simple underline), Kanamycin resistance gene (underlined interspersing dots and simple stripes), the start site of translation (gray shading), and the modifications introduced in pPLAg and pPLAf. The modifications correspond to derived sequence GFP (double underlined bold), ferredoxin derived sequence (bold underlined interrupted).

Fig 2: Oligonucleótidos empleados en las distintas fases del desarrollo. A Muestra los distintos oligonucleótidos utilizados para la construcción de pPLA, pPLAg y pPLAf, distinguiendo entre los empleados para A.1 amplificación de del promotor y secuencia líder del gen psbA, A.2 construcción del linker sintético de GFP y A.3 de la ferredoxina. B Muestra los oligonucleótidos empleados para llevar a cabo el análisis de integración de genes mediante PCR. C y D muestran los distintos oligoucleótidos empleados para las construcciones con CelY y Cel1Z respectivamente.Fig 2: Oligonucleotides used in the different stages of development. A Shows the different oligonucleotides used for the construction of pPLA, pPLAg and pPLAf, distinguishing between those used for A.1 amplification of the promoter and leader sequence of the psbA gene, A.2 construction of the GFP synthetic linker and A.3 of the ferredoxin B Shows the oligonucleotides used to perform the gene integration analysis by PCR. C and D show the different oligoucleotides used for the constructions with CelY and Cel1Z respectively.

Fig 3: Análisis de homoplasmia mediante RFLP (polimorfismo de fragmentos de restricción) en 1% de agarosa. En cada carril se cargó, aproximadamente, un microgramo de ADN genómico de plantas individuales digerido 3 horas con NcoI. Los fragmentos resultantes, se separaron mediante electroforesis en TBE-agarosa y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se hibridaron con una sonda de ADN marcado con biotina que híbrida con los segmentos de ADNcp adyacentes al sitio de integración de pAF. La sonda detecta un fragmento de 6425 pb en plantas normales, mientras que en plantas que integran pAF-CelY, se detectan dos fragmentos de 495 y 4857pb (debido a que se introduce una diana NcoI con el vector). Las plantas heteroplásmicas muestran un patrón que combina los tres fragmentos en proporciones variables.Fig 3: Homoplasmic analysis by RFLP (restriction fragment polymorphism) in 1% agarose. In each lane was loaded approximately one microgram of genomic DNA of individual plants digested 3 hours with NcoI. Fragments resulting, they were separated by electrophoresis in TBE-agarose and transferred to membranes of nitrocellulose The membranes hybridized with a DNA probe Biotin labeling that hybridizes with cDNA segments adjacent to the pAF integration site. The probe detects a 6425 bp fragment in normal plants, while in plants that integrate pAF-CelY, two fragments of 495 and 4857pb (because an NcoI target is introduced with the vector). Heteroplastic plants show a pattern that combines The three fragments in varying proportions.

Fig 4: Diferencias en la secuencia de la GFP utilizada en Ye y col.(2001) y en este trabajo. Las posiciones que difieren se representan en minúsculas. ATG (sombreado gris) Representa el codón de inicio de la traducción.Fig 4: Differences in the GFP sequence used in Ye et al. (2001) and in this work. The positions that differ are represented in lowercase. ATG (gray shading) Represents the translation start codon.

Fig 5: Secuencia del producto de PCR del gen CelY (999 nucleótidos) clonado en pGEM-T Easy. En dicha secuencia se destacan distintas zonas: codones de Inicio (ATG) y fin de traducción (ATT), inicio de transcipción (A) (sombreado gris), Secuencia del péptido de secreción de CelY (negrita subrayado simple) (nucleótidos 1-69), Secuencia de la enzima madura CelY (nucleótidos 70-996) (negrita). El resto, los primeros 7 nucleótidos y los últimos 100 representan regiones no codificantes que flanquean el marco de lectura abierto de CelY.Fig 5: PCR product sequence of the CelY gene (999 nucleotides) cloned in pGEM-T Easy. In this sequence, different areas stand out: Start (ATG) and end of translation (ATT) codons, transcription start (A) (gray shading), CelY secretion peptide sequence (bold underlined simple) (nucleotides 1-69 ), Sequence of the mature enzyme CelY (nucleotides 70-996) (bold). The rest, the first 7 nucleotides and the last 100 represent non-coding regions that flank the open reading frame of CelY .

Fig 6: Representa las distintas construcciones de CelY en plásmidos intermedios. A) pPLA-Yi, B) pPLA-Yg, C) pPLA-Yf, pPLA-Yt. En dichas construcciones se destaca: Promotor psbA (cursiva subrayado simple), Secuencia líder psbA (cursiva simple), Sitios de restricción (Subrayado simple), Codones de Inicio (ATG) y fin de traducción (ATT), inicio de transcipción (A)(sombreado gris), Secuencia del dominio catalítico CelY (primeros 27 nucleótidos y los últimos 23) (negrita), secuencia codificante GFP (aminoácidos 2-15) (negrita doble subrayado), secuencia codificante ferredoxina (aminoácidos29-48) (negrita subrayado interrumpido), secuencia codificante del dominio de tetramerización de p53 (negrita subrayado ondulado) separado de los últimos 23 aminoácidos del dominio catalítica de CelY por una secuencia espadadora (negrita, cursiva subrayado intercalando puntos y rayas) que contiene el hexanucleótido TCTAGA que corresponde a la diana de restricción XbaI utilizada en el ligamiento del dominio de tetrame-
rización.Fig 6: Represents the different constructions of CelY in intermediate plasmids. A) pPLA-Yi, B) pPLA-Yg, C) pPLA-Yf, pPLA-Yt. In these constructions, the following stand out: Promoter psbA (simple underlined italic), Leader sequence psbA (simple italic), Restriction sites (Simple underline), Start codons (ATG) and end of translation (ATT), transcription start (A) (gray shading), CelY catalytic domain sequence (first 27 nucleotides and last 23) (bold), GFP coding sequence (amino acids 2-15) (double underlined bold), ferredoxin coding sequence (amino acids29-48) (interrupted underlined bold ), a coding sequence of the tetramerization domain of p53 (wavy underlined bold) separated from the last 23 amino acids of the CelY catalytic domain by a spacer sequence (bold, italic underlined by inserting dots and dashes) containing the TCTAGA hexanucleotide corresponding to the target XbaI restriction used in tetrame domain binding
curling

Fig 7: Visulización de Yf, Yg e Yt en 10% de acrilamida. A) Se observa que las plantas que integran pAF-Yg, pAF-Yf, pero no las que integran pAF-Yi p pAF-Yt, muestran una banda protéica cuyo peso molecular es de unos 36KDa (que corresponde aproximadamente con el peso molecular deducible di producto del gen CelY) indicando que la expresión de estas construcciones es muy eficiente B) Caso de pAF-Yt, en el que se observa una banda específica de peso molecular aparente de 38 kDa, aunque no de forma tan evidente como en el caso anterior.Fig 7: Visulization of Yf, Yg and Yt in 10% acrylamide. A) It is observed that the plants that integrate pAF-Yg, pAF-Yf, but not those that integrate pAF-Yi p pAF-Yt, show a protein band whose molecular weight is about 36KDa (corresponding approximately to the deductible molecular weight di product of the CelY gene) indicating that the expression of these constructs is very efficient B) Case of pAF-Yt, in which a specific band of apparent molecular weight of 38 kDa is observed, although not as clearly as in the case previous.

Fig 8: Comparación de la acumulación de Yg e Ygt en hojas de distinta edad en A) geles con tinción azul de coomassie y B) zimograma. Las calles del zimograma (B) corresponden a las mismas que se han empleado en el gel (A). En el apartado A se observa que la proteína más intensamente teñida es la ribulosa carboxilasa del cloroplasto (RUBISCO) con un peso molecular aparente de 54 kDa. En hojas jóvenes de plantas Yg ó Ygt se detecta otra proteína muy abundante con un peso molecular aparente aproximado de 36 kDa (Yg, carriles 2 y 3) y 39 kDa, (Ygt, carriles 4 y 5) que corresponde al peso molecular esperable de las respectivas variantes quiméricas de CelY. El apartado B muestra que las bandas protéicas identificadas como proteínas Yg e Ygt tienen actividad endoglucanasa por lo que deben corresponder a los productos del gen CelY.Fig 8: Comparison of the accumulation of Yg and Ygt in leaves of different ages in A) gels with coomassie blue staining and B) zymogram. The streets of the zymogram (B) correspond to the streets that have been used in the gel (A). In section A it is observed that the most intensely stained protein is chloroplast ribulose carboxylase (RUBISCO) with an apparent molecular weight of 54 kDa. In young leaves of Yg or Ygt plants another very abundant protein is detected with an apparent molecular weight of approximately 36 kDa (Yg, lanes 2 and 3) and 39 kDa, (Ygt, lanes 4 and 5) corresponding to the expected molecular weight of the respective chimeric variants of CelY . Section B shows that the protein bands identified as Yg and Ygt proteins have endoglucanase activity so they must correspond to the products of the CelY gene.

Fig 9: Secuencia (A) y proteína madura (B) de Cel1Z y sus distintos dominios funcionales respectivamente. En dicha secuencia se destacan los siguientes dominios: Codones de Inicio (ATG) y fin de traducción (ATT), inicio de transcipción (A) (sombreado gris), Secuencia del péptido de secreción de CelZ (nucleótidos 4-129) (negrita, cursiva, subrayado simple), Dominio catalítico de CelZ (nucleótidos 130-996) (negrita, cursiva), Brazo de unión a celulosa de CelZ (nucleótidos 1100-1282) (negrita, cursiva, subrayado punteado).Fig 9: Sequence (A) and mature protein (B) of Cel1Z and its different functional domains respectively. In this sequence, the following domains stand out: Start (ATG) and end of translation (ATT) codons, transciption start (A) (gray shading), CelZ secretion peptide sequence (nucleotides 4-129) (bold, italic, simple underline), CelZ catalytic domain (nucleotides 130-996) (bold, italic), CelZ cellulose binding arm (nucleotides 1100-1282) (bold, italic, dotted underline).

Fig 10: Secuencia de DNA (A) y (B) secuencia deducida de aminoácidos de Endoglucanasa Z quimérica y sus distintos dominios funcionales respectivamente. Se destacan los siguientes dominios: Codones de Inicio (ATG) y fin de traducción (ATT), inicio de transcipción (A)(sombrado gris), Secuencia del péptido de secreción de CelZ (negrita, cursiva, subrayado simple), Dominio catalítico de CelZ (negrita, cursiva), dominio de tetramerización (negrita subrayado ondulado), Brazo de unión a celulosa de CelZ, dominio de unión a celulosa (negrita, cursiva, subrayado punteado), Sitios de restricción (Subrayado simple).Fig 10: DNA sequence (A) and (B) sequence Amino acid deduced from chimeric Endoglucanase Z and its various functional domains respectively. The following stand out domains: Start (ATG) and end of translation (ATT) codons, start of transciption (A) (gray shaded), Peptide sequence of CelZ secretion (bold, italic, simple underline), Domain CelZ catalytic (bold, italic), tetramerization domain (wavy underlined bold), CelZ cellulose binding arm, cellulose binding domain (bold, italic, dotted underline), Restriction sites (Simple underline).

Fig 11: Zimograma de extracto de plantas que expresan Zg y Zgt separados en un 8% acrilamida-SDS. Se observa, tanto en extractos de Zg como de Zgt varias bandas con actividad catalítica, algunas con una movilidad electroforética inferior al peso molecular esperable de la endoglucanasa Z. En el caso de Zgt, y no en Zg, se detectan bandas discretas de actividad endoglucanasa de alto peso molecular (indicadas con flechas blancas) que pueden corresponder a complejos multiméricos de Zgt estables durante la extracción y electroforesis.Fig 11: Zimogram of plant extract that they express Zg and Zgt separated by 8% acrylamide-SDS. It is observed, both in Zg and Zgt extracts several bands with catalytic activity, some with electrophoretic mobility less than the expected molecular weight of endoglucanase Z. In the In case of Zgt, and not in Zg, discrete bands of activity are detected high molecular weight endoglucanase (indicated with white arrows) which may correspond to stable multimeric Zgt complexes during extraction and electrophoresis.

Fig 12: Actividad endoglucanasa sobre celulosa. Esta gráfica comparan las cinéticas de reacción de las proteínas quiméricas Zg y Zgt a 37ºC. La reacción se cuantifica mediante la medición de azúcares reductores liberados por el método de Nelson-Somogyi. Los valores que se representan an cada corresponden al promedio de 3 reacciones independientes.Fig 12: Endoglucanase activity on cellulose. This graph compares the reaction kinetics of proteins chimeric Zg and Zgt at 37 ° C. The reaction is quantified by measurement of reducing sugars released by the method of Nelson-Somogyi. The values that are represented an each correspond to the average of 3 independent reactions.

Fig 13: Secuencia de nucleótidos de la Endoglucanas Ygt quimérica. En dicha secuencia se destaca: Secuencia codificante GFP (nucleótidos 1-48) (negrita doble subrayado), Codones de Inicio (ATG) y fin de traducción (ATT), inicio de transcipción (A) (sombrado gris), Secuencia del dominio catalítico CelY (nucleótidos 52-980) (negrita), Sitio de restricción (Subrayado simple), Secuencia codificante del dominio de tetramerización de p53 (nucleótidos 988-1107) (negrita subrayado ondulado).Fig 13: Nucleotide sequence of the Endoglucanas Ygt chimeric. In this sequence it stands out: Sequence GFP encoder (nucleotides 1-48) (double bold underlined), Start Codons (ATG) and end of translation (ATT), start of transciption (A) (gray shadow), Domain sequence Catalytic CelY (nucleotides 52-980) (bold), Restriction site (Simple underline), Coding sequence of the tetramerization domain of p53 (nucleotides 988-1107) (bold underlined wavy).

Fig 14: Secuencia de nucleótidos de la Endoglucanasa Zgt quimérica. En dicha secuencia se destaca: Codones de Inicio (ATG) y fin de traducción (ATT), inicio de transcipción (A) (sombreado gris), Secuencia codificante GFP (nucleótidos 1-48) (negrita doble subrayado), Secuencia del péptido de secreción de CelZ (negrita, cursiva, subrayado simple), Dominio catalítico de CelZ (nucleótidos 52-918) (negrita, cursiva), brazo de separación CelZ (nucleótidos 919-969) (negrita, cursiva subrayado intercalando puntos y rayas), dominio de tetramerización (nucleótidos 976-1095) (negrita subrayado ondulado), brazo de separación CelZ (nucleótidos 1096, 1146) (negrita, cursiva subrayado intercalando puntos y rayas), Brazo de unión a celulosa de CelZ (negrita, cursiva, subrayado punteado),Secuencia de restricción (Subrayado simple).Fig 14: Nucleotide sequence of the Chimeric Endoglucanase Zgt. In this sequence it stands out: Codons Start (ATG) and end of translation (ATT), start of transciption (A) (gray shading), GFP coding sequence (nucleotides 1-48) (double underline bold), Sequence of CelZ secretion peptide (bold, italic, simple underline), Catalytic domain of CelZ (nucleotides 52-918) (bold, italic), CelZ separation arm (nucleotides 919-969) (bold, italic underlined interspersing dots and dashes), tetramerization domain (nucleotides 976-1095) (bold underlined wavy), arm CelZ separation (nucleotides 1096, 1146) (bold, italic underlined interleaving dots and stripes), CelZ cellulose binding arm (bold, italic, dotted underline), Restriction sequence (Simple underline).

Descripción detallada de la invenciónDetailed description of the invention

La tecnología que se pretende patentar se refiere a la manipulación genética de plantas, concretamente la manipulación mediante introducción de genes en el genoma del cloroplasto vegetal. El desarrollo se ha realizado utilizando tabaco (Nicotiana tabacum var. Petit Havanna) como planta modelo.The technology that is intended to be patented refers to the genetic manipulation of plants, specifically manipulation by introducing genes into the genome of the plant chloroplast. The development has been carried out using tobacco ( Nicotiana tabacum var. Petit Havanna) as a model plant.

La presente invención describe la combinación de dos métodos para aumentar la producción de proteínas en el cloroplasto. La invención se refiere preferentemente a enzimas, mas preferentemente endoglucanasas llevando a cabo las realizaciones prácticas concretamente con CelY y Cel1Z.The present invention describes the combination of two methods for increasing the production of proteins in the chloroplast. The invention preferably relates to enzymes, more preferably endoglucanases by carrying out practical embodiments specifically with CelY and Cel1Z .

Uno de los métodos se basa en estrategias para aumentar la expresión de genes en el cloroplasto y el segundo se basa en estrategias que incrementan la estabilidad de las proteínas producidas en plantas. Si bien los métodos que se describen se aplican a la producción proteínas, preferentemente enzimas, y particularmente endoglucanasas, el método es aplicable para la producción de cualquier proteína que se mantiene funcionalmente activa.One of the methods is based on strategies for increase gene expression in the chloroplast and the second one based on strategies that increase protein stability produced in plants. While the methods described are apply proteins, preferably enzymes, and particularly endoglucanases, the method is applicable for production of any protein that is functionally maintained active

Para llevar a cabo la integración de los genes en el cloroplasto se utilizó un vector de integración en el cloroplasto denominado pAF que dirige la integración en el cloroplasto de tabaco entre los genes trnI y trnA (Fernandez-San Millán y col, 2008). Los genes de interés se clonan primero en un plásmido intermedio, denominado pPLA (Seq Id No. 1), de forma que quedan operativamente ligados al promotor (Seq Id No. 2) y la secuencia líder (Seq Id No. 3) del gen psbA de tabaco (Figura 1a). La secuencia correspondiente al promotor y líder de psbA representa los nucleótidos 1594-1780 del genoma del cloroplasto de tabaco (accesión Z00044). El vector pPLA (Seq Id No. 1) se construyó mediante amplificación por la reacción de la polimerasa en cadena (PCR) del fragmento 1594-1780 del cloroplasto utilizando como molde una preparación de ADN genómico de tabaco y los oligonucleótidos Ppsba-D (Seq Id No. 6) y Lpsba-R (Seq Id No. 7) (Figura 2). El producto de PCR se clonó en el plásmido pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se determinó su secuencia. En la figura se muestra la secuencia correspondiente al promotor de psbA y se marcan el sitio de inicio de la transcripción y el sitio de inicio de traducción que está incluido en una secuencia que representa la diana de restricción NcoI. Los elementos de control de expresión derivados de psbA promueven la expresión eficiente de genes exógenos in vivo (por ejemplo, De Cosa y col. 2001, Fernandez-San Millán y col. 2008) e in vitro (Hirose & Sugiura, 1996). El cassette constituido por gen de interés, el promotor y la secuencia líder de psbA subclona en el vector pAF, entre el gen aadA y el terminador de transcripción de psbA, formando una unidad transcripcional operativa.To carry out the integration of the genes in the chloroplast, an integration vector in the chloroplast called pAF was used, which directs the integration in the tobacco chloroplast between the trnI and trnA genes (Fernandez-San Millán et al, 2008). The genes of interest are first cloned into an intermediate plasmid, called pPLA (Seq Id No. 1), so that they are operably linked to the promoter (Seq Id No. 2) and the leader sequence (Seq Id No. 3) of the gene tobacco psbA (Figure 1a). The sequence corresponding to the promoter and leader of psbA represents nucleotides 1594-1780 of the genome of tobacco chloroplast (accession Z00044). The pPLA vector (Seq Id No. 1) was constructed by amplification by the polymerase chain reaction (PCR) of fragment 1594-1780 of the chloroplast using as a template a preparation of tobacco genomic DNA and the oligonucleotides Ppsba-D (Seq Id No. 6) and Lpsba-R (Seq Id No. 7) (Figure 2). The PCR product was cloned into plasmid pGEM-T Easy (Promega) following the manufacturer's instructions and its sequence was determined. In the figure the sequence corresponding to the psbA promoter is shown and the transcription start site and the translation start site that is included in a sequence representing the restriction target Nco I are marked . The expression control elements psbA derivatives promote efficient expression of exogenous genes in vivo (for example, De Cosa et al. 2001, Fernandez-San Millán et al. 2008) and in vitro (Hirose & Sugiura, 1996). The cassette consisting of the gene of interest, the promoter and the leader sequence of the subclone psbA in the pAF vector, between the aadA gene and the psbA transcription terminator, forming an operational transcriptional unit.

Los experimentos de integración de genes en el cloroplasto se realizan como se describe en Svab y Maliga, 1993. Se parte de una preparación de ADN del vector con el gen de interés y se cubre con ella una suspensión de partículas de oro de 0,6 mieras. Las partículas se disparan sobre hojas de plantas de tabaco cultivadas en condiciones de esterilidad. Las hojas sometidas a disparo con partículas de oro se cultivan en medio RMOP, en presencia de espectinomicina (500 mg/litro), y se seleccionan brotes verdes, resistentes a espectinomicina, que crecen entre 3 y 8 semanas después del disparo de genes. Los brotes que se obtienen en ésta primera ronda de selección suelen ser heteroplásmicos (contienen células con ADN cloroplástico recombinante junto a células con ADN cloroplástico sin modificar, Svab y Maliga, 1990 y 1993), y se someten a una segunda ronda de selección en medio RMOP con espectinomicina (500 mg/litro). Los brotes que se obtienen en la segunda ronda de selección se cultivan en medio de enraizamiento esterilizado y en presencia de espectinomicina a 500 mg/litro. El medio de enraizamiento es Murashigue-Skooge pH5.7 con 30% sacarosa) Una vez que se desarrolla la raíz, las plántulas cultivadas in vitro se pasan a tierra y se llevan a cabo los siguientes análisis: i) la integración del vector en el cloroplasto mediante la reacción de la polimerasa en cadena (PCR) sobre extractos de ADN de la planta, utilizando un oligonucleótido que anilla en el ADNcp pero no en el ADN del vector pAF junto a un segundo oligonucleótido que anilla en pAF pero no en el cpADN (Respectivamente oligonucleótidos Int-R (Seq Id No. 13) e Int-D (Seq Id No. 12), Figura 2). Sólo las plantas recombinantes que hayan integrado el vector dan resultado positivo en esta reacción. La condición de homoplasmia se analiza mediante ensayos de RFLP (polimorfismo de fragmentos de restricción) utilizando una sonda que híbrida con el cpADN próximo a la zona de inserción. Se digieren extractos de ADN de plantas problema con una diana de restricción apropiada que origina diferentes fragmentos en el cpADN nativo y en el recombinante (Figura 3). La expresión de endoglucanasas se ensaya mediante reacciones con extractos crudos de plantas homplásmicas, en presencia de carboximetil celulosa al 1% (CMC, sustrato específico de endoglucanasas) en tampón 50 mM NaOAc pH5,2. La actividad CMCasa se cuantifica mediante la medición de azúcares reductores liberados por el método de Nelson Somogyi. También se analiza la expresión de endoglucanasas mediante zimogramas. Los zimogramas consisten en visualización de la actividad endoglucanasa de proteínas previamente separadas electroforéticamente. Tras la separación, los geles se incuban en presencia de 1%CMC y se tiñe con rojo Congo, de manera que las bandas protéicas correspondientes a endoglucanasas se visualizan como zonas claras en un gel teñido de rojo.Chloroplast gene integration experiments are performed as described in Svab and Maliga, 1993. It is based on a DNA preparation of the vector with the gene of interest and covered with a suspension of gold particles of 0.6 you love The particles are fired on leaves of tobacco plants grown in sterile conditions. The leaves subjected to firing with gold particles are grown in RMOP medium, in the presence of spectinomycin (500 mg / liter), and green shoots, resistant to spectinomycin, are selected that grow between 3 and 8 weeks after gene firing. The outbreaks that are obtained in this first round of selection are usually heteroplastic (they contain cells with recombinant chloroplastic DNA next to cells with unmodified chloroplastic DNA, Svab and Maliga, 1990 and 1993), and are subjected to a second round of selection between RMOP with spectinomycin (500 mg / liter). The shoots obtained in the second round of selection are grown in sterilized rooting medium and in the presence of 500 mg / liter spectinomycin. The rooting medium is Murashigue-Skooge pH5.7 with 30% sucrose) Once the root is developed, in vitro grown seedlings are passed to the ground and the following analyzes are carried out: i) the integration of the vector into the Chloroplast by reacting polymerase chain (PCR) on plant DNA extracts, using an oligonucleotide that rings in the cDNA but not in the DNA of the pAF vector next to a second oligonucleotide that rings in pAF but not in the cpDNA (Respectively oligonucleotides Int-R (Seq Id No. 13) and Int-D (Seq Id No. 12), Figure 2). Only recombinant plants that have integrated the vector give a positive result in this reaction. The homoplasmic condition is analyzed by RFLP (restriction fragment polymorphism) assays using a probe that hybridizes with the cpDNA near the insertion zone. DNA extracts from problem plants are digested with an appropriate restriction target that originates different fragments in the native and recombinant cpDNA (Figure 3). Endoglucanase expression is assayed by reactions with crude extracts of homplasmic plants, in the presence of 1% carboxymethyl cellulose (CMC, specific endoglucanase substrate) in 50 mM NaOAc pH5.2 buffer. CMCase activity is quantified by measuring reducing sugars released by the Nelson Somogyi method. Endoglucanase expression is also analyzed by zymograms. Zymograms consist of visualization of the endoglucanase activity of previously electrophoretically separated proteins. After separation, the gels are incubated in the presence of 1% CMC and stained with Congo red, so that the protein bands corresponding to endoglucanases are visualized as clear areas in a gel stained red.

En los dos ejemplos que ilustran este trabajo, genes CelY y Cel1Z de Dickeya dadantii, se han clonado en el vector de la transformación (pAF) operativamente ligados al promotor (Seq Id No. 2), secuencia líder (Seq Id No. 3) y secuencia de terminación de la transcripción del gen psbA de tabaco. Otros vectores y promotores conocidos del estado de la técnica pueden ser empleados. Se han clonado versiones modificadas de los genes nativos, que carecen de la región que codifica el péptido de secreción (nucleótidos +4 a +69 del marco de lectura abierta de CelY y nucleótidos +4 a +130 de Cel1Z). La función del péptido de secreción en Dickeya dadantii es promover la secreción del producto al medio de cultivo en un proceso que incluye la eliminación proteolítica de dicho péptido y que da lugar al péptido maduro. Puesto que la acumulación en el estroma del cloroplasto no requiere ningún proceso de secreción, se clonaron solamente las secuencias correspondientes a los péptidos maduros a continuación del triplete de inicio de la traducción. Como control, se obtuvo una construcción que contiene el gen CelY nativo completo. Dicha construcción dio lugar a plantas seleccionadas mediante cultivo in vitro pero los brotes resultaron ser inviables en ausencia de una fuente de carbono añadida. Al pasar las plántulas de esta construcción particular a macetas, en ausencia de sacarosa añadida, amarillearon y se detuvo el crecimiento, probablemente por efectos de interferencia del péptido de secreción bacteriano con la fisiología del cloroplasto. Se ha descrito que los cloroplastos tienen sistemas de secreción homólogos a los sistemas bacterianos y este resultado sugiere que el péptido de secreción de CelY podría interferir con la fisiología normal del cloroplasto probablemente por la interacción con estos elementos comunes (Mori y Cline, 2001).In the two examples that illustrate this work, CelY and Cel1Z genes from Dickeya dadantii , have been cloned into the transformation vector (pAF) operatively linked to the promoter (Seq Id No. 2), leader sequence (Seq Id No. 3) and termination sequence of the transcription of the tobacco psbA gene. Other vectors and promoters known in the state of the art can be used. Modified versions of the native genes have been cloned, lacking the region encoding the secretion peptide (nucleotides +4 to +69 of the open reading frame of CelY and nucleotides +4 to +130 of Cel1Z ). The function of the secretion peptide in Dickeya dadantii is to promote the secretion of the product to the culture medium in a process that includes the proteolytic elimination of said peptide and which gives rise to the mature peptide. Since the accumulation in the stroma of the chloroplast does not require any secretion process, only the sequences corresponding to the mature peptides were cloned following the translation triplet. As a control, a construct containing the complete native CelY gene was obtained . This construction resulted in plants selected by in vitro culture but the shoots proved unfeasible in the absence of an added carbon source. When the seedlings of this particular construction were transferred to pots, in the absence of added sucrose, they yellowed and growth was stopped, probably due to interference effects of the bacterial secretion peptide with the physiology of the chloroplast. It has been described that chloroplasts have secretion systems homologous to bacterial systems and this result suggests that the CelY secretion peptide could interfere with the normal physiology of chloroplast probably due to the interaction with these common elements (Mori and Cline, 2001).

Se obtuvieron plantas recombinantes que contienen los genes CelY (Seq Id No. 30) o Cel1Z (Seq Id No. 43) nativos, sin péptido de secreción, integrados en el cloroplasto. La actividad endoglucanasa recuperable de estas plantas es muy baja (CelY) o indetectable (Cel1Z), indicando que la acumulación de producto funcional es muy reducida en ambos casos. La acumulación ineficiente de CelY y Cel1Z puede estar relacionada con una expresión (traducción) ineficiente, con la inestabilidad del producto expresado en el cloroplasto o con ambos factores. La acumulación eficiente de genes en el cloroplasto puede requerir, por tanto, el desarrollo de los métodos que se proponen para estimular la expresión genética e incrementar la estabilidad del producto.Recombinant plants were obtained containing the native CelY (Seq Id No. 30) or Cel1Z (Seq Id No. 43) genes, without secretion peptide, integrated into the chloroplast. The recoverable endoglucanase activity of these plants is very low ( CelY ) or undetectable ( Cel1Z ), indicating that the accumulation of functional product is very low in both cases. The inefficient accumulation of CelY and Cel1Z may be related to an inefficient expression (translation), the instability of the product expressed in the chloroplast or both factors. The efficient accumulation of genes in the chloroplast may therefore require the development of the methods proposed to stimulate genetic expression and increase product stability.

Para promover una acumulación más eficiente de CelY y Cel1Z, se analizó, en una primera aproximación, la posibilidad de promover la expresión eficiente de los genes alterando el contexto de inicio de la traducción. Para ello, se emplearon segmentos sintéticos de ADN codificante fusionados en el extremo aminoterminal de los genes nativos, de manera que se modifica el contexto inmediatamente posterior al tríplete de inicio de la traducción, de forma similar a como se ha descrito en Ye et al, 2001, Kuroda Y Maliga 1991b. En esta solicitud de patente se compara la utilización de dos fragmentos, comprobándose que la fusión simultánea de estos dos fragmentos derivados de GFP y p53 promueven una acumulación más eficiente de ambos enzimas, más eficiente aun que la suma de la acumulación producida por la fusión individual de cada una de las secuencias por separado. Ambos fragmentos tienen en común que su secuencia codificante tiene un contenido en pares GC relativamente bajo y un uso de tripletes similar al del cloroplasto de tabaco. El objetivo de ésta selección es proporcionar un contexto inmediatamente posterior al triplete de inicio de la traducción rico en pares AT, y por tanto, con una probabilidad reducida de que el ARN mensajero forme estructuras secundarias estables que interfieran con el inicio de la traducción. El primer fragmento utilizado representa los primeros 15 aminoácidos de la proteína fluorescente verde de la medusa (GFP) (Seq Id No. 28), y se asemeja al fragmento utilizado en Ye y col (2001) (Seq Id No. 26) con la diferencia de que el fragmento utilizado en la presente invención tiene una composición de pares CG (40%) similar a la del cloroplasto de tabaco (Figura 4). Éste fragmento, difiere del fragmento utilizado por Ye y col. 2001 en 15 posiciones sobre 45 nucleótidos totales, en el contenido en GC (40% frente a 62%), y en el primer aminoácido que codifica, que ha sido alterado (glicina por serina) para poder introducir una diana de restricción NcoI adecuada para el clonaje de CelY y Cel1Z (Figura 4). El segundo fragmento sintético que se propone, codifica un péptido derivado de la ferredoxina de tabaco, adaptado también al uso de tripletes y el contenido en pares GC del cloroplasto de tabaco (Figura 1). En este caso se pretende cambiar el contexto de inicio de traducción de las celulasas introduciendo un corto fragmento que podría ser eliminado por proteasas del cloroplasto (Richter y Lamppa 2003). Los dos fragmentos que se describen en esta invención son sintéticos. Se construyeron utilizando dos pares de oligonucleótidos fosforilados y complementarios entre sí. El par de oligonucleótidos fosforilados LGFP-D(Seq Id No. 8) y LGFP-R (Seq Id No. 9) y el par de oligonucleótidos LFd-D (Seq Id No. 10)y LFd-R (Seq Id No. 11) (Figura 2) se incubaron a una concentración de 50 pmoles/microlitro en 20 mM TrispH8.0, 1 mM EDTA durante 2 minutos a 100ºC y 30 minutos a 37ºC para favorecer su anillamiento. El anillamiento de cada pareja origina un fragmento de ADN de doble cadena con extremos cohesivos compatibles con los que deja la diana de restricción NcoI y fosforilados. Estos fragmentos se ligaron al plásmido pPLA (Seq Id No. 1) digerido con NcoI utilizando Rapid DNA Ligation Kit (Roche Cat nº 11635379001) obteniéndose los vectores intermedios pPLAg (Seq Id No. 4 y 57) y pPLAf (Seq Id No. 5) cuya secuencia se muestra en la Figura 1a y 1b.To promote a more efficient accumulation of CelY and Cel1Z , the possibility of promoting the efficient expression of genes by altering the context of translation initiation was analyzed in a first approximation. To do this, synthetic segments of coding DNA fused at the aminoterminal end of the native genes were used, so that the context immediately after the triplet of translation initiation is modified, similar to that described in Ye et al , 2001, Kuroda and Maliga 1991b. This patent application compares the use of two fragments, verifying that the simultaneous fusion of these two fragments derived from GFP and p53 promote a more efficient accumulation of both enzymes, more efficient even than the sum of the accumulation produced by the individual fusion of each of the sequences separately. Both fragments have in common that their coding sequence has a relatively low GC pair content and a triplet use similar to that of tobacco chloroplast. The purpose of this selection is to provide a context immediately following the translation triplet rich in AT pairs, and therefore, with a reduced probability that the messenger RNA forms stable secondary structures that interfere with the translation initiation. The first fragment used represents the first 15 amino acids of the jellyfish green fluorescent protein (GFP) (Seq Id No. 28), and resembles the fragment used in Ye et al (2001) (Seq Id No. 26) with the difference that the fragment used in the present invention has a CG pair composition (40%) similar to that of tobacco chloroplast (Figure 4). This fragment differs from the fragment used by Ye et al. 2001 in 15 positions on 45 total nucleotides, in the GC content (40% vs. 62%), and in the first amino acid it encodes, which has been altered (glycine by serine) to be able to introduce a suitable Nco I restriction target for the cloning of CelY and Cel1Z (Figure 4). The second proposed synthetic fragment encodes a peptide derived from tobacco ferredoxin, also adapted to the use of triplets and the GC pair content of tobacco chloroplast (Figure 1). In this case, it is intended to change the context of the translation start of cellulases by introducing a short fragment that could be removed by chloroplast proteases (Richter and Lamppa 2003). The two fragments described in this invention are synthetic. They were constructed using two pairs of phosphorylated and complementary oligonucleotides. The pair of phosphorylated oligonucleotides LGFP-D (Seq Id No. 8) and LGFP-R (Seq Id No. 9) and the pair of oligonucleotides LFd-D (Seq Id No. 10) and LFd-R (Seq Id No. 11) (Figure 2) were incubated at a concentration of 50 pmoles / microliter in 20 mM TrispH8.0, 1 mM EDTA for 2 minutes at 100 ° C and 30 minutes at 37 ° C to favor its banding. The banding of each pair causes a double stranded DNA fragment with cohesive ends compatible with those left by the restriction target Nco I and phosphorylated. These fragments were ligated to the plasmid pPLA (Seq Id No. 1) digested with NcoI using Rapid DNA Ligation Kit (Roche Cat No. 11635379001) obtaining the intermediate vectors pPLAg (Seq Id No. 4 and 57) and pPLAf (Seq Id No. 5 ) whose sequence is shown in Figure 1a and 1b.

Los extractos de plantas que integran en el cloroplasto éstas fusiones traduccionales tienen una actividad endoglucanasa hasta 100 veces superior a la de las plantas que contienen la versión nativa de CelY o Cel1Z dependiendo del fragmento y del gen. El fragmento derivado de la GFP (Seq Id No. 28) promueve la traducción de CelY y Cel1Z de forma 50-100 veces más eficiente respecto a las construcciones nativas y 2-3 veces más eficiente que el fragmento derivado de la ferredoxina en el contexto del promotor, líder y terminador de psbA de tabaco. En esta patente se propone la utilización de la secuencia que se describe (Figura 4) y que se diferencia de los trabajos de Ye y col. (2001) (Seq Id No. 26)en los que se utilizó un fragmento similar, en la secuencia (15 de 45 posiciones), contenido en pares GC, y en el contexto de la secuencia líder. Es importante destacar que, como demostraron Kuroda y Maliga, (2001b), el efecto en la eficiencia de la expresión de cambios en las secuencias inmediatamente posteriores al triplete de inicio varía dependiendo del tipo de secuencia líder. Según estos autores, la eficiencia de la expresión de genes operativamente ligados a secuencias que carecen de un elemento consenso de unión a ribosomas (denominado rbs, ribosome binding site), como es el caso de psbA, tiene una dependencia del contexto de secuencia inmediatamente posterior al triplete de inicio de traducción relativamente baja. Sin embargo, este trabajo demuestra que en el contexto de la secuencia líder de psbA, que carece de un rbs canónico, la secuencia inmediatamente posterior al triplete de inicio tiene gran importancia en la modulación de la expresión génica. El trabajo de Ye y colaboradores (2001) muestra, similarmente a la presente solicitud, un efecto notable de la fusión una secuencia que codifica los primeros 15 aminoácidos de la GFP sobre la expresión de la enzima EPSPS en el cloroplasto, pero en ese caso la fusión se realiza en el contexto de las secuencias líder rbcL y G10L, que contienen sitios canónicos de unión a ribosomas. La presente invención demuestra por primera vez un efecto superior y en un contexto de inicio de traducción que se regula de manera diferente (Staub & Maliga, 1994b, Yohn y Col. 1998) respecto a los que se describen en el trabajo anteriormente citado.The extracts of plants that integrate in the chloroplast these translational fusions have an endoglucanase activity up to 100 times higher than that of the plants that contain the native version of CelY or Cel1Z depending on the fragment and the gene. The fragment derived from GFP (Seq Id No. 28) promotes the translation of CelY and Cel1Z 50-100 times more efficiently with respect to native constructs and 2-3 times more efficient than the fragment derived from ferredoxin in context of the promoter, leader and terminator of tobacco psbA. This patent proposes the use of the sequence described (Figure 4) and which differs from the works of Ye et al. (2001) (Seq Id No. 26) in which a similar fragment was used, in the sequence (15 of 45 positions), contained in GC pairs, and in the context of the leader sequence. It is important to note that, as Kuroda and Maliga demonstrated, (2001b), the effect on the efficiency of the expression of changes in the sequences immediately after the start triplet varies depending on the type of leader sequence. According to these authors, the efficiency of the expression of genes operatively linked to sequences that lack a consensus ribosome binding element (called rbs, ribosome binding site ), as is the case with psbA, has a dependence on the sequence context immediately after to the translation triplet relatively low. However, this work demonstrates that in the context of the psbA leader sequence, which lacks a canonical rbs , the sequence immediately after the start triplet is of great importance in the modulation of gene expression. The work of Ye et al. (2001) shows, similarly to the present application, a remarkable effect of the fusion a sequence that encodes the first 15 amino acids of the GFP on the expression of the EPSPS enzyme in the chloroplast, but in that case the fusion is performed in the context of the rbcL and G10L leader sequences, which contain canonical ribosome binding sites. The present invention demonstrates for the first time a superior effect and in a context of translation initiation that is regulated differently (Staub & Maliga, 1994b, Yohn and Col. 1998) with respect to those described in the aforementioned work.

De gran importancia para esta invención es la observación de que la actividad endoglucanasa extraíble de plantas que integran CelY y Cel1Z decae con la edad de las hojas que se muestrean. En plantas que integran las versiones nativas de CelY o Cel1Z, sólo se detecta actividad endoglucanasa significativa en las hojas jóvenes y en las primeras hojas completamente expandidas. En plantas que contienen la fusión aminoterminal derivada de la GFP, la actividad extraíble de hojas maduras se reduce a la mitad respecto a las hojas expandidas más jóvenes. Se han observado fenómenos similares en otros casos de genes clonados bajo el promotor y líder de psbA (Molina y Col. 2004) que indican que este patrón de expresión es característico de genes integrados en el cloroplasto bajo el control de la secuencia líder de psbA. La estabilidad de los productos durante la maduración de las hojas es un factor limitante para la producción de enzimas de uso industrial en plantas.Of great importance for this invention is the observation that the extractable endoglucanase activity of plants that integrate CelY and Cel1Z decays with the age of the sampled leaves. In plants that integrate the native versions of CelY or Cel1Z , only significant endoglucanase activity is detected in the young leaves and in the first fully expanded leaves. In plants containing the aminoterminal fusion derived from GFP, the removable activity of mature leaves is reduced by half compared to the youngest expanded leaves. Similar phenomena have been observed in other cases of genes cloned under the promoter and leader of psbA (Molina and Col. 2004) that indicate that this expression pattern is characteristic of genes integrated in the chloroplast under the control of the leader sequence of psbA. The stability of the products during the ripening of the leaves is a limiting factor for the production of enzymes for industrial use in plants.

La presente invención describe la utilización de un elemento, el dominio de tetramerización de la proteína p53, en adelante denominado DTp53 (Seq Id No. 35), para favorecer la estabilidad de las enzimas producidas en plantas, de forma similar al empleo del mismo dominio para favorecer la acumulación de un antígeno en plantas tal como se describe en la patente D2. El dominio de tetramerización favorece la formación de estructuras multiméricas (dímeros y tetrámeros) por la interacción que se establece entre los dominios DTp53 de distintas subunidades. Dicha interacción da lugar a complejos muy estables cuya estructura se ha analizado detalladamente en el caso de la p53, y que dejan expuestos los diferentes dominios efectores de la proteína en posiciones espacialmente definidas
(Tidow y col. 2007).The present invention describes the use of an element, the tetramerization domain of the p53 protein, hereinafter referred to as DTp53 (Seq Id No. 35), to favor the stability of enzymes produced in plants, similar to the use of the same domain. to favor the accumulation of an antigen in plants as described in patent D2. The tetramerization domain favors the formation of multimeric structures (dimers and tetramers) by the interaction established between the DTp53 domains of different subunits. This interaction gives rise to very stable complexes whose structure has been analyzed in detail in the case of p53, and which expose the different effector domains of the protein in spatially defined positions
(Tidow et al. 2007).

Con el fin de evitar interferencias del dominio de tetramerización con la eficiencia de la traducción de CelY o Cel1Z, se diseñaron construcciones en las que DTp53 se fusiona a los genes de interés en regiones distales respecto al inicio de traducción. En el caso concreto de la celulasa CelY, el DTp53 se fusionó operativamente al extremo carboxiterminal del péptido nativo, ya que la inserción en otras regiones puede alterar el plegamiento adecuado del único dominio estructural de esta proteína. La formación de dímeros o tetrámeros dejaría expuesto el único dominio catalítico de CelY de forma análoga al dominio aminoterminal de la p53. En el caso de Cel1Z hay más posibilidades. El péptido maduro de Cel1Z, y el de muchas otras celulasas, está constituido por dominios estructurales y funcionales separados por cortos brazos peptídicos (brazo espaciador) que separan estos dominios y, probablemente, proporcionan una estructura flexible que reduce las interferencias esféricas entre los dominios funcionales (Brun y col. 1997). Cel1Z, al igual que muchas celulasas descritas, consta de un dominio catalítico grande (Seq Id No. 50), implicado en la actividad enzimática de interés, y un segundo dominio de menor tamaño, con afinidad por el sustrato, que se denomina dominio de unión a celulosa (Seq Id No. 47), y favorece el acceso del dominio catalítico al sustrato. Algunas celulasas tienen dominios estructurales adicionales. En el caso de Cel1Z, el dominio de tetramerización se fusionó en el brazo de separación (Seq Id No. 46) de manera que las hipotéticas estructuras multiméricas resultantes tienen una disposición espacial análoga a los diferentes dominios estructurales y funcionales de la p53: un dominio aminoterminal grande, que en el caso de Cel1Z corresponde al dominio catalítico (Seq Id No. 50), separado del dominio de unión a celulosa (Seq Id No. 52) por DTp53 (Seq Id No. 36) y el péptido de separación nativo (Seq Id No. 51). En el caso de que la proteína resultante formara complejos multiméricos, esperaríamos obtener estructuras análogas a la de la p53, probablemente sin interferencias estéricas entre los dominios funcionales.In order to avoid interference of the tetramerization domain with the translation efficiency of CelY or Cel1Z , constructions were designed in which DTp53 is fused to genes of interest in distal regions with respect to translation initiation. In the specific case of CelY cellulase, DTp53 was operatively fused to the carboxy terminal end of the native peptide, since insertion in other regions may alter the proper folding of the single structural domain of this protein. The formation of dimers or tetramers would expose the unique catalytic domain of CelY analogously to the aminoterminal domain of p53. In the case of Cel1Z there are more possibilities. The mature peptide of Cel1Z , and that of many other cellulases, consists of structural and functional domains separated by short peptide arms (spacer arm) that separate these domains and probably provide a flexible structure that reduces spherical interference between functional domains. (Brun et al. 1997). Cel1Z , like many cellulases described, consists of a large catalytic domain (Seq Id No. 50), involved in the enzymatic activity of interest, and a second domain of smaller size, with affinity for the substrate, which is called the domain of cellulose binding (Seq Id No. 47), and favors the access of the catalytic domain to the substrate. Some cellulases have additional structural domains. In the case of Cel1Z , the tetramerization domain was fused in the separation arm (Seq Id No. 46) so that the hypothetical resulting multimeric structures have a spatial arrangement analogous to the different structural and functional domains of p53: a domain aminoterminal large, which in the case of Cel1Z corresponds to the catalytic domain (Seq Id No. 50), separated from the cellulose binding domain (Seq Id No. 52) by DTp53 (Seq Id No. 36) and the native separation peptide (Seq Id No. 51). In the event that the resulting protein formed multimeric complexes, we would expect to obtain structures analogous to that of p53, probably without steric interference between functional domains.

En esta invención se demuestra que la fusión del dominio DTp53 afecta la estabilidad de los productos en plantas. En el caso concreto de la celulasa CelY nativa (sin fusión aminoterminal), la fusión carboxiterminal del dominio DTp53 afecta significativamente a la acumulación del producto en hojas expandidas jóvenes y viejas, pero las diferencias más significativas se observan al comparar hojas viejas. En el caso particular de CelY fusionada al fragmento derivado de la GFP, no se observan diferencias significativas en la expresión de CelY en hojas expandidas, sin embargo, la acumulación del producto y la actividad extraíble en hojas viejas es aproximadamente el doble en el caso de la variante fusionada a DTp53. Los resultados observados demuestran una estabilización diferencial de CelY-DTp53 en hojas viejas respecto a CelY no fusionada y otras proteínas del cloroplasto. La fusión carboxiterminal de DTp53 no afecta significativamente a la actividad específica de la endoglucanasa sobre CMC y favorece la obtención de mayor cantidad de producto en el conjunto de la planta, incluyendo hojas expandidas que van a entrar en senescencia. Así, queda demostrado que las plantas de la invención acumulan la proteína de interés como producto mayoritario, independientemente de su estado de maduración siendo especialmente mayor la acumulación en hojas maduras, entre un 5 y un 10% mayor en términos relativos al contenido total de proteínas que en las hojas jóvenes. Esta mejora en la estabilidad facilita la recuperación de producto y permite recolectar las hojas en un orden que no interfiere con el crecimiento del cultivo.This invention demonstrates that the fusion of the DTp53 domain affects the stability of products in plants. In the specific case of native CelY cellulase (without aminoterminal fusion), the carboxyterminal fusion of the DTp53 domain significantly affects the accumulation of the product in young and old expanded leaves, but the most significant differences are observed when comparing old leaves. In the particular case of CelY fused to the GFP-derived fragment, there are no significant differences in the expression of CelY in expanded leaves, however, the accumulation of the product and the extractable activity in old sheets is approximately double in the case of the variant fused to DTp53. The observed results demonstrate a differential stabilization of CelY- DTp53 in old leaves with respect to non-fused CelY and other chloroplast proteins. The carboxyterminal fusion of DTp53 does not significantly affect the specific activity of endoglucanase on CMC and favors obtaining a greater quantity of product in the whole plant, including expanded leaves that will enter senescence. Thus, it is shown that the plants of the invention accumulate the protein of interest as a majority product, regardless of their maturation status, especially the accumulation in mature leaves, between 5 and 10% higher in terms of total protein content. than in the young leaves. This improvement in stability facilitates product recovery and allows the leaves to be collected in an order that does not interfere with crop growth.

En el caso concreto de Cel1Z, la fusión del dominio DTp53 incrementa la extracción de endoglucanasas. El incremento es de un 300% en el caso de la Cel1Z nativa y de un 50% en el caso de Cel1Z fusionada al fragmento derivado de la GFP. Los zimogramas demuestran que Cel1Z sufre en el cloroplasto de tabaco proteolisis parcial y se observa que la fusión de DTp53 altera el patrón de proteolisis de la proteína. Sólo en el caso de Cel1Z fusionada a DTp53 se observan unas bandas de elevado peso molecular con actividad endoglucanasa que pueden corresponder a complejos multiméricos de Cel1Z. Los resultados sugieren que el brazo de separación de Cel1Z es un dominio susceptible de proteolisis en el cloroplasto y que el dominio de tetramerización protege parcialmente de la proteolisis y permite incrementar la actividad recuperable.In the specific case of Cel1Z , the fusion of the DTp53 domain increases the extraction of endoglucanases. The increase is 300% in the case of native Cel1Z and 50% in the case of Cel1Z fused to the fragment derived from the GFP. The zymograms show that Cel1Z undergoes partial proteolysis in the chloroplast of tobacco and it is observed that the fusion of DTp53 alters the proteolysis pattern of the protein. Only in the case of Cel1Z fused to DTp53 are high molecular weight bands with endoglucanase activity observed that may correspond to multimeric complexes of Cel1Z . The results suggest that the Cel1Z separation arm is a proteolysis domain susceptible to the chloroplast and that the tetramerization domain partially protects the proteolysis and increases recoverable activity.

Una consideración importante sobre esta innovación metodológica es que la producción de proteínas en plantas favorecida por la utilización del dominio de tetramerización de la p53 no sólo permite obtener mayor cantidad de producto y actividad (en el caso de las endoglucanasas, actividad endoglucanasa medida sobre un sustrato soluble), sino que da lugar a la obtención de un producto nuevo, proteína o enzima quimérica que presenta una estabilidad mejorada respecto a la proteína/enzima original.An important consideration of this methodological innovation is that the production of proteins in plants favored by the use of the tetramerization domain of p53 not only allows a greater amount of product and activity to be obtained (in the case of endoglucanases, endoglucanase activity measured on a substrate soluble), but results in obtaining a new product, protein or chimeric enzyme that has improved stability compared to the original protein / enzyme.

Así, la formación de estas estructuras multiméricas estables puede afectar a las siguientes propiedades de las enzimas:Thus, the formation of these structures stable multimerics can affect the following properties of enzymes:

1)one)

Afinidad por el substrato: en el caso de las enzimas celulósicas, que presentan dominios funcionales separados, la organización en tetrámeros altera la configuración espacial de los dominios de unión a celulosa incrementando la afinidad por el sustrato (celulosa en este caso).Affinity for the substrate: in the case of cellulosic enzymes, which have functional domains separated, the organization in tetramers alters the configuration spatial cellulose binding domains increasing the affinity for the substrate (cellulose in this case).

2)2)

Estabilidad del producto durante la reacción: aunque la formación de estas estructuras puede alterar la estabilidad en diferentes condiciones de ensayo (temperatura, pH etc.), la catálisis propiamente dicha no se ve afectada.Product stability during reaction: although the formation of these structures can alter the stability under different test conditions (temperature, pH etc.), the catalysis itself is not affected.

3)3)

Actividad sobre un sustrato insoluble puede estar afectada también por la agregación de subunidades catalíticas en un mismo complejo. Es el caso de algunos microorganismos celulolíticos -por ejemplo las bacterias de los rumiantes- que producen enzimas que se organizan en forma agregada.Activity on an insoluble substrate may also be affected by the aggregation of catalytic subunits in the same complex. This is the case of some cellulolytic microorganisms - for example, ruminant bacteria - that produce enzymes that are organized in aggregate form.

Así, el método propuesto por la invención permite la obtención de proteínas/enzimas quiméricos que, gracias a las estrategias de fusión simultánea de la versión modificada de los 15 primeros aminoácidos de la GFP, junto con la fusión del dominio de tetramerización de la p53, presentan propiedades mejoradas en cuanto a estabilidad del producto, y actividad sobre un sustrato insoluble.Thus, the method proposed by the invention allows the obtaining of chimeric proteins / enzymes that, thanks to the simultaneous merging strategies of the modified version of the 15 first amino acids of GFP, together with domain fusion tetramerization of p53, have improved properties in regarding product stability, and activity on a substrate insoluble.

Ejemplos Examples Ejemplo 1Example 1 Expresión en cloroplastos de la endoglucanasa codificada por el gen CelY de Dickeya dadantii Expression in endoglucanase chloroplasts encoded by the CelY gene of Dickeya dadantii

El gen CelY (Accesión nº M74044) de Dickeya dadantii codifica una endoglucanasa (E.C.3.2.1.4) de pequeño tamaño que hidroliza enlaces \beta(1-4) glucosa de la celulosa favoreciendo la des-polimerización de las largas cadenas de glucosa que constituyen este polímero de la pared celular de las plantas. Esta actividad es utilizable en el proceso industrial de conversión de la biomasa celulósica en bioetanol y en otros procesos de la industria textil o papelera que utilizan endoglucanasas.The CelY ( Accession No. M74044 ) gene of Dickeya dadantii encodes a small endoglucanase (EC 3.2.1.4 ) that hydrolyzes glucose (1-4) cellulose glucose bonds favoring the de-polymerization of the long glucose chains that constitute this polymer from the cell wall of plants. This activity is usable in the industrial process of converting cellulosic biomass into bioethanol and in other processes of the textile or paper industry that use endoglucanases.

Como fuente genética se utilizó un producto de ADN amplificado mediante la reacción en cadena de la polimerasa en el laboratorio del Dr. Pablo Rodríguez Palenzuela (E.T.S.I.Agrónomos, Universidad Politécnica de Madrid) quién amablemente proporcionó el mencionado producto. El producto de PCR fue clonado en un plásmido bacteriano y secuenciado (Figura 5). La secuencia resultó ser idéntica a la publicada (accesión M74044).As a genetic source, an amplified DNA product was used by polymerase chain reaction in the laboratory of Dr. Pablo Rodríguez Palenzuela (ETSIAgronomists, Polytechnic University of Madrid) who kindly provided the aforementioned product. The PCR product was cloned into a bacterial plasmid and sequenced (Figure 5). The sequence turned out to be identical to the one published (accession M74044 ).

A partir de este clon se obtuvieron 6 construcciones diferentes de CelY, operativamente ligadas al promotor (Seq Id No. 2) y secuencia líder (Seq Id No. 3) de psbA. Las seis construcciones se obtuvieron mediante el ligamiento de productos de PCR que representan el gen CelY completo, o una versión que carece del péptido de secreción, en las posiciones NcoI y XbaI del plásmido intermedio pPLA o las variantes pPLAg y pPLAf descritas en el anterior apartado.From this clone, 6 different CelY constructs were obtained, operatively linked to the promoter (Seq Id No. 2) and leader sequence (Seq Id No. 3) of psbA . The six constructs were obtained by linking PCR products representing the complete CelY gene, or a version lacking the secretion peptide, at the Nco I and Xba I positions of the intermediate plasmid pPLA or the pPLAg and pPLAf variants described in the previous section.

1.one.

pPLA-Yc: se amplificó, mediante PCR, (VENT_{R} DNA polimerasa, New England Biolabs, cat nº: M0254S) un fragmento de 1010 pares de bases (PCR Yc) utilizando los oligonucleótidos celY1D (Seq Id No. 14) y celYR (Seq Id No. 15) (Figura 2) que representa el gen CelY completo y flanqueado por las dianas NcoI y XbaI. El producto de PCR se purificó mediante electroforesis preparativa en agarosa y se extrajo del fragmento de agarosa con QIAquik Extraction Kit (QIAGEN, Cat: 28704). El fragmento purificado se digirió con NcoI y XbaI (New England Biolabs) y se ligó al plásmido pPLA, similarmente digerido, usando un "kit" comercial de ligamiento rápido (Rapid Ligation Kit, Roche Cat.). Se transformaron células DH5\alpha químicamente competentes y se seleccionaron colonias que contienen el plásmido ligado al fragmento de interés y cuya secuencia coincide con la original.pPLA- Yc : A 1010 base pair fragment ( PCR Yc ) was amplified by PCR (VENT_R DNA polymerase, New England Biolabs, cat #: M0254S) using the oligonucleotides celY1D (Seq Id No. 14) and celYR (Seq Id No. 15) (Figure 2) representing the complete CelY gene and flanked by targets Nco I and Xba I. The PCR product was purified by preparative agarose electrophoresis and extracted from the agarose fragment with QIAquik Extraction Kit (QIAGEN, Cat: 28704). The purified fragment was digested with Nco I and Xba I (New England Biolabs) and ligated to the similarly digested plasmid pPLA, using a commercial "rapid linkage kit" (Rapid Ligation Kit, Roche Cat.). Chemically competent DH5α cells were transformed and colonies containing the plasmid linked to the fragment of interest and whose sequence coincides with the original were selected.

2.2.

pPLA-Yi (Figura 6): se amplificó, mediante PCR, un fragmento de 956 pb (PCR-Yi) que representa los nucleótidos +70 a +999 del marco de lectura de CelY precedidos de un triplete de inicio de traducción y flanqueado por las dianas NcoI y XbaI. Este fragmento codifica una proteína equivalente a la celulasa CelY madura, sin péptido de secreción. Se utilizaron los oligonucleótidos celY2D (Seq Id No. 16) y celYR (Seq Id No. 17) y el fragmento de PCR se clonó en pPLA de forma similar a pPLA-Yc.pPLA- Yi (Figure 6): A 956 bp fragment ( PCR-Yi ) representing nucleotides +70 to +999 of the CelY reading frame preceded by a translation start triplet flanked by PCR was amplified by PCR Nco I and Xba I targets. This fragment encodes a protein equivalent to mature CelY cellulase, without secretion peptide. The oligonucleotides celY2D (Seq Id No. 16) and celYR (Seq Id No. 17) were used and the PCR fragment was cloned into pPLA similarly to pPLA-Yc.

3.3.

pPLA-Yg (Seq Id No. 38) (Figura 6): se obtuvo mediante el clonage de la PCR-Yi, mencionada en el anterior apartado, en el plásmido pPLAg (Seq Id No. 4) utilizando las mismas dianas de restricción. En esta construcción el extremo 5' del marco de lectura abierta del gen CelY, equivalente a la celulasa madura, está precedido de un fragmento de ADN, de 45 pares de bases, que codifica los 15 primeros aminoácidos de la GFP (Seq Id No. 28). Este fragmento determina el contexto de inicio de traducción (Figura 6). El marco de lectura abierta resultante codifica una proteína de fusión que representa los 15 primeros aminoácidos de la GFP (Seq Id No. 29) seguidos de un residuo de metionina y la celulasa CelY madura.pPLA- Yg (Seq Id No. 38) (Figure 6): was obtained by cloning the PCR-Yi, mentioned in the previous section, in the plasmid pPLAg (Seq Id No. 4) using the same restriction targets. In this construction the 5 'end of the open reading frame of the CelY gene, equivalent to mature cellulase, is preceded by a 45 base pair DNA fragment that encodes the first 15 amino acids of the GFP (Seq Id No. 28). This fragment determines the translation start context (Figure 6). The resulting open reading frame encodes a fusion protein that represents the first 15 amino acids of the GFP (Seq Id No. 29) followed by a methionine residue and mature CelY cellulase.

4.Four.

pPLA-Yf (Seq Id No. 39) (Figura 6) se obtuvo mediante el clonage de la PCR-Yi, en el plásmido pPLAf utilizando las mismas dianas de restricción. En esta construcción el extremo 5' del marco de lectura abierta del gen CelY que representa el péptido maduro (Seq Id No. 31), está precedido de un fragmento sintético de ADN, de 54 pares de bases, que codifica los aminoácidos 28-47 del péptido de tránsito de la ferredoxina de tabaco (Seq Id No. 33) y que determina el contexto de inicio de la traducción (Figura 1). El marco de lectura abierta resultante codifica una proteína de fusión que representa los aminoácidos 28-47 de la ferredoxina (Seq Id No. 34) seguidos de un residuo de metionina y la celulasa CelY madura.pPLA- Yf (Seq Id No. 39) (Figure 6) was obtained by cloning the PCR-Yi, in plasmid pPLAf using the same restriction targets. In this construction the 5 'end of the open reading frame of the CelY gene representing the mature peptide (Seq Id No. 31), is preceded by a 54-base pair synthetic DNA fragment encoding amino acids 28-47 of the tobacco ferredoxin transit peptide (Seq Id No. 33) and which determines the context of translation initiation (Figure 1). The resulting open reading frame encodes a fusion protein that represents amino acids 28-47 of ferredoxin (Seq Id No. 34) followed by a methionine residue and mature CelY cellulase.

5.5.

pPLA-Yt (Seq Id No. 40) (Figura 6) Se obtuvo en dos etapas de clonaje. Primero se amplificó, mediante PCR, un fragmento de CelY que representa la proteína CelY madura sin el triplete de parada original por eliminación del residuo 999 (timidina) del marco de lectura abierta de CelY. Se emplearon los oligonucleótidos celY2D (Seq Id No. 16) y celYTR (Seq Id No. 17). El producto de PCR se clonó en pPLA (Seq Id No. 1) digerido con NcoI y XbaI similarmente a las construcciones anteriores. En la segunda etapa se amplificó mediante PCR una secuencia que contiene el dominio de tetramerización de la p53 (amablemente provista por el Dr. José Angel Martínez-Escribano) utilizando dos oligonucleótidos TetraXX-D (Seq Id No. 19) y TetraXX-R (Seq Id No. 20), que amplifican un fragmento de 140 pb flanqueado por dianas XbaI en ambos extremos que contiene 120 pb que representan el dominio de tetramerización de la p53 humana (accesión P04637). El fragmento de PCR se clonó en el sitio XbaI situado en el extremo 3' del clon obtenido en la primera etapa y se seleccionaron las construcciones que insertaron el fragmento en el sentido apropiado. La construcción resultante contiene, bajo el promotor (Seq Id No. 2) y líder (Seq Id No. 3) de psbA, un marco de lectura que representa a la proteína CelY madura seguido de una corta secuencia espaciadora (5' TATCTAGAT 3') que codifica el triplete tyr-leu-asp y del dominio de tetramerización de la p53 (DTp53) (Seq Id No. 35).pPLA- Yt (Seq Id No. 40) (Figure 6) It was obtained in two stages of cloning. First, a CelY fragment representing the mature CelY protein was amplified by PCR without the original stop triplet by removal of residue 999 (thymidine) from the CelY open reading frame . The oligonucleotides celY2D (Seq Id No. 16) and celYTR (Seq Id No. 17) were used. The PCR product was cloned into pPLA (Seq Id No. 1) digested with NcoI and XbaI similar to the previous constructs. In the second stage, a sequence containing the tetramerization domain of p53 (kindly provided by Dr. José Angel Martínez-Escribano) was amplified by PCR using two TetraXX-D oligonucleotides (Seq Id No. 19) and TetraXX-R ( Seq Id No. 20), which amplify a 140 bp fragment flanked by Xba I targets at both ends containing 120 bp representing the tetramerization domain of human p53 (accession P04637). The PCR fragment was cloned into the Xba I site located at the 3 'end of the clone obtained in the first stage and the constructs that inserted the fragment in the appropriate direction were selected. The resulting construct contains, under the promoter (Seq Id No. 2) and leader (Seq Id No. 3) of psbA , a reading frame representing the mature CelY protein followed by a short spacer sequence (5 'TATCTAGAT 3' ) encoding the tyr-leu-asp triplet and the tetramerization domain of p53 (DTp53) (Seq Id No. 35).

6.6.

pPLA-Ygt (Seq Id No. 41): se obtuvo de forma similar a pPLA-Yt (Seq Id No. 40) con la diferencia de que los clonajes se realizaron en pPLAg (Seq Id No. 4). La construcción resultante contiene, bajo el promotor (Seq Id No. 2) y líder (Seq Id No. 3) de psbA, un marco de lectura que representa los 15 primeros aminoácidos de la GFP (Seq Id No. 28), la proteína CelY madura (Seq Id No. 31), un triplete espaciador tyr-leu-asp y el dominio de tetramerización de la p53 (DTp53) (Seq Id No. 35).pPLA- Ygt (Seq Id No. 41): was obtained in a similar way to pPLA-Yt (Seq Id No. 40) with the difference that cloning was performed in pPLAg (Seq Id No. 4). The resulting construct contains, under the promoter (Seq Id No. 2) and leader (Seq Id No. 3) of psbA , a reading frame representing the first 15 amino acids of the GFP (Seq Id No. 28), the protein Mature CelY (Seq Id No. 31), a tyr-leu-asp spacer triplet and the tetramerization domain of p53 (DTp53) (Seq Id No. 35).

En la Figura 6 se representan las secuencias de las variantes obtenidas. Para obtener las construcciones en el vector de integración pAF que se describe en Fernandez-San Millán y col. 2008). Para los clonajes en pAF, se obtuvo un fragmento de ADN correspondiente al promotor y líder de psbA operativamente ligado al marco de lectura abierto que incluye el gen CelY (Seq Id No. 31) mediante digestión de los plásmidos intermedios con KpnI y NotI. Estos fragmentos se clonaron, utilizando los métodos descritos anteriormente, en pAF similarmente digerido, obteniéndose los siguientes clones: pAF-Yc, pAF-Yi, pAF-Yf, pAF-Yg, pAF-Yt y pAF-Ygt. Se comprobó la secuencia del fragmento integrado mediante secuenciación parcial de los plásmidos resultantes.Figure 6 shows the sequences of the variants obtained. To obtain the constructions in the pAF integration vector described in Fernandez-San Millán et al. 2008). For clones in pAF, a DNA fragment corresponding to the promoter and leader of psbA operatively linked to the open reading frame that includes the CelY gene (Seq Id No. 31) was obtained by digestion of the intermediate plasmids with Kpn I and Not I These fragments were cloned, using the methods described above, in similarly digested pAF, obtaining the following clones: pAF-Yc, pAF-Yi, pAF-Yf, pAF-Yg, pAF-Yt and pAF-Ygt. The sequence of the integrated fragment was checked by partial sequencing of the resulting plasmids.

Integración en el cloroplasto de CelYIntegration in CelY Chloroplast

A partir de cultivos bacterianos de los clones pAF-Yc, pAF-Yi, pAF-Yf, pAF-Yg, pAF-Yt y pAF-Ygt se obtuvieron preparaciones de ADN plásmídico utilizando QIAprep Spin Miniprep Kit de QIAGEN (Cat: 27106). El ADN plásmídico de las preparaciones se cuantificó midiendo la densidad óptica a 260 nm. Se mezcló 1 \mug de cada preparación de ADN con 3 mg de partículas de oro (conservadas a 60 mg/ml en 50% glicerol a -20ºC) en un volumen de 60 \mul. A continuación se añadió un volumen de 2,5M CaCl2 y 0,4 volúmenes de espermidina 0,1M y la suspensión se incubó a 4ºC con agitación constante durante 20 minutos para cubrir las partículas de ADN. La suspensión se lavó 5 veces con 4 volúmenes de etanol absoluto en frío y se resuspendió en un volumen final de 30 \mul de etanol. Con estas preparaciones se dispararon hojas expandidas de tabaco (6-8 cm, Nicotiana tabacum var. Petit Havanna) cultivado en condiciones de esterilidad en medio Murashigue&Scooge (M&S) a pH5.7 con 30% sacarosa y 0,6% agar de plantas (PLANT AGAR, Duchefa, Cat:P1001). Se utilizaron 5 \mul de suspensión por cada hoja y el bombardeo de plantas se realizó siguiendo las instrucciones del aparato biolístico PDS1000/He de BIO-RAD. Se disparó el envés de las hojas de tabaco (4-5 por construcción) y éstas se cultivaron 48 h en medio RMOP con 0,6% MICRO AGAR (DUCHEFA Cat. M1002) a 27ºC en la oscuridad. A continuación se cortaron fragmentos de unos 0,5 cm de lado y se incubaron en RMOP, 0,6% agar, 500 mg/litro espectinomicina, con el envés en contacto con el medio, a 27ºC y 16 horas diarias de luz durante 4-8 semanas. En este periodo crecieron un número variable de brotes de color verde (entre 0 y 15) por cada hoja bombardeada. Cada brote se considera un clon. Se cortaron fragmentos de 0,5 cm de estos brotes y se sometieron a una segunda ronda de selección en RMOP-espectinomicina similar a la primera. Tras la segunda ronda de selección se obtuvieron numerosos brotes verdes que se pasaron a medio de enraizamiento (M&S pH5.7, 30% sacarosa, 0,6% agar) con espectinomicina a 500 mg/litro. Tras el enraizamiento, se pasaron a cultivo en tierra unos 5-10 brotes por clon.From bacterial cultures of the clones pAF-Yc, pAF-Yi, pAF-Yf, pAF-Yg, pAF-Yt and pAF-Ygt, plasmid DNA preparations were obtained using QIAprep Spin Miniprep Kit from QIAGEN (Cat: 27106). Plasmid DNA from the preparations was quantified by measuring the optical density at 260 nm. 1 µg of each DNA preparation was mixed with 3 mg of gold particles (stored at 60 mg / ml in 50% glycerol at -20 ° C) in a volume of 60 µl. A volume of 2.5M CaCl2 and 0.4 volumes of 0.1M spermidine were then added and the suspension was incubated at 4 ° C with constant stirring for 20 minutes to cover the DNA particles. The suspension was washed 5 times with 4 volumes of absolute cold ethanol and resuspended in a final volume of 30 µl of ethanol. With these preparations expanded tobacco leaves (6-8 cm, Nicotiana tabacum var. Petit Havanna) grown under sterile conditions were fired in Murashigue & Scooge (M&S) medium at pH5.7 with 30% sucrose and 0.6% plant agar ( PLANT AGAR, Duchefa, Cat: P1001). 5 µl of suspension were used for each leaf and the bombardment of plants was carried out following the instructions of the BIO-RAD PDS1000 / He biological apparatus. The underside of the tobacco leaves was fired (4-5 by construction) and they were grown 48 h in RMOP medium with 0.6% MICRO AGAR (DUCHEFA Cat. M1002) at 27 ° C in the dark. Next, fragments of about 0.5 cm were cut sideways and incubated in RMOP, 0.6% agar, 500 mg / liter spectinomycin, with the underside in contact with the medium, at 27 ° C and 16 hours a day of light for 4 -8 weeks. In this period a variable number of green shoots (between 0 and 15) grew for each bombed leaf. Each outbreak is considered a clone. 0.5 cm fragments of these shoots were cut and subjected to a second round of selection in RMOP-spectinomycin similar to the first. After the second round of selection, numerous green shoots were obtained that were passed to rooting medium (M&S pH5.7, 30% sucrose, 0.6% agar) with spectinomycin at 500 mg / liter. After rooting, about 5-10 shoots per clone were grown on land.

Análisis de integraciónIntegration analysis

Para analizar la integración del vector en el cloroplasto de tabaco se realizaron extractos de ADN a partir de fragmentos de hoja de 0,1 g de plantas de la primera generación cultivadas en tierra. El material vegetal se pasó a un eppendorf y se homogeneizó en fresco con un buril de plástico en presencia de 0,2 ml de tampón de extracción (1% CTAB, 50 mM Tris-HCl pH8.0, 0,7M NaCl, 10 mM EDTA, 0.5% PVP y 0.1% 2-Mercaptoetanol) y el homogeneizado se incubó 1 hora a 60ºC. El extracto se extrajo en 0,5 ml de cloroformo:isoamílico (24:1) mezclando con un vorteador y se separaron las fases mediante centrifugación (5 min a 10.000 rpm). La fase acuosa se pasó a tubos nuevos y se precipitó el ADN añadiendo un volumen de isopropanol e incubando 20 minutos a -20ºC. El ADN de la planta se recuperó mediante centrifugación (10 min a 14.000 rpm), se lavó con 1 ml de 70% etanol y se resuspendió en 20 \mul de agua estéril.To analyze the integration of the vector in the Tobacco chloroplast DNA extracts were made from 0.1 g leaf fragments of first generation plants cultivated on land. The plant material was passed to an eppendorf and it was homogenized fresh with a plastic buril in the presence of 0.2 ml extraction buffer (1% CTAB, 50 mM Tris-HCl pH8.0, 0.7M NaCl, 10mM EDTA, 0.5% PVP and 0.1% 2-Mercaptoethanol) and the homogenate was incubated 1 hour at 60 ° C. The extract was extracted in 0.5 ml of chloroform: isoamyl (24: 1) mixing with a vortexer and The phases were separated by centrifugation (5 min at 10,000 rpm). The aqueous phase was passed to new tubes and the DNA was precipitated by adding a volume of isopropanol and incubating 20 minutes at -20 ° C. The DNA of the plant was recovered by centrifugation (10 min at 14,000 rpm), washed with 1 ml of 70% ethanol and resuspended in 20 µl of water sterile.

Se analizó la integración del vector en la planta mediante PCR utilizando los oligonucleótidos Int-D (Seq Id No. 12) e Int-R (Seq Id No. 13) que anillan respectivamente con secuencias de pAF y del cpADN. Se obtuvieron productos de PCR de tamaño esperable en plantas que han integrado el vector. La integración y la homoplasmia se analizó también mediante análisis de polimorfismo de fragmentos de restricción que se basa en la digestión de ADN de la planta con una enzima de restricción apropiada, cuyo patrón de restricción es alterado por la integración del vector y la detección de los fragmentos mediante técnicas de hibridación molecular (Figura 3). También se analizó la presencia del gen CelY en las preparaciones de ADN de plantas mediante PCR con los oligonucleótidos celY2D (Seq Id No. 16) y celYR (Seq Id No. 15).The integration of the vector into the plant was analyzed by PCR using the oligonucleotides Int-D (Seq Id No. 12) and Int-R (Seq Id No. 13) that respectively ring with pAF and cpDNA sequences. PCR products of expected size were obtained in plants that have integrated the vector. Integration and homoplasmia were also analyzed by restriction fragment polymorphism analysis that is based on the digestion of plant DNA with an appropriate restriction enzyme, whose restriction pattern is altered by vector integration and the detection of fragments by molecular hybridization techniques (Figure 3). The presence of the CelY gene in plant DNA preparations was also analyzed by PCR with the oligonucleotides celY2D (Seq Id No. 16) and celYR (Seq Id No. 15).

Todas las construcciones utilizadas dieron lugar a varios clones (brotes de primera ronda) a partir de los que se obtuvieron, tras la segunda ronda de selección plantas homoplásmicas. En general, el 50% de las plantas obtenidas tras dos rondas de selección resultaron ser homoplásmicas. Las plántulas obtenidas con la construcción pAF-Yc no son viables en cultivo en tierra. No crecen, amarillean y entran en senescencia. Deducimos que el péptido de secreción de CelY interfiere con la fisiología del cloroplasto.All the constructions used gave rise to several clones (first round shoots) from which they were obtained, after the second round of homoplasmic plant selection. Overall, 50% of the plants obtained after two rounds of selection turned out to be homoplasmic. Seedlings obtained with the pAF-Yc construct are not viable in soil cultivation. They do not grow, yellow and enter senescence. We conclude that the peptide interferes with secretion CELY physiology chloroplast.

Análisis de expresión génica de CelY CelY gene expression analysis

En el caso de CelY, los análisis de expresión se hicieron mediante ensayos de actividad enzimática recuperable de extractos crudos de planta y, en algunos casos, mediante análisis cuantitativo de proteínas separadas mediante electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE). El análisis de actividad proporciona información directa sobre la utilidad industrial del producto y sobre la actividad específica de las enzimas quiméricas.In the case of CelY , the expression analyzes were made by assays of recoverable enzymatic activity of raw plant extracts and, in some cases, by quantitative analysis of proteins separated by denaturing electrophoresis in polyacrylamide gels (SDS-PAGE). The activity analysis provides direct information on the industrial utility of the product and on the specific activity of the chimeric enzymes.

Actividad endoglucanasa extraíble de plantas que integran CelY en el cloroplastoRemovable endoglucanase activity of plants that integrate CelY into the chloroplast

En un primer ejemplo, se comparó la actividad endoglucanasa de extractos crudos de proteínas obtenidos a partir de la primera generación de plantas homoplásmicas. Se utilizaron plantas que han desarrollado al menos 6 hojas durante el cultivo en tierra. Se tomaron muestras de hoja consistentes en discos de hoja tomados con sacabocados de 8 mm de diámetro. En este particular ejemplo, se analizó cada planta por separado tomando muestras de 8 discos (unos 80 mg en promedio) procedentes de las varias hojas expandidas de cada planta. Las muestras se homogeneizaron en fresco, en tampón de extracción (0,1 M TrisClH pH6.8, 0,5M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% 2-mercaptoetanol), utilizando buriles de plástico que se adaptan a la forma del eppendorf. La relación peso:volumen de los extractos es de 1:5 (80 mg en 0,4 ml tampón). Tras la homogeinización, las proteínas se solubilizaron mezclando 3 veces con un vorteador, durante 30 segundos, a máxima velocidad. Los extractos se centrifugaron durante 3 minutos a 12.000 rpms para separar el residuo vegetal. Se emplean diluciones seriadas del sobrenadante para medir la actividad endoglucanasa sobre carboximetilcelulosa (CMC). Las reacciones se montaron en un volumen de 0,5 ml de 1% CMC, 50 mM NaOAc pH5.2 y 2 mM MgCl2 durante 1 hora a 50ºC. La actividad se midió cuantificando los azucares reductores liberados por el método de Somogyi Nelson (colorante DNS). Se añadieron a cada reacción 0,3 ml de reactivo DNS (Somogyi Nelson Dye), 1,2 ml de agua y se incubaron 10 minutos a 100ºC. Se midió la absorbancia de la solución a 540 nm frente a un blanco incubado con tampón. Los azúcares reductores liberados se calcularon frente a una curva patrón de glucosa. Se calcularon los micromoles liberados en 60 minutos y se obtuvieron valores en Unidades Internacionales (micromoles/minuto) relativos al peso fresco de hoja equivalente utilizado en la reacción. De cada extracto se ensayaron diluciones apropiadas y, para la cuantificación se utilizó la dilución que proporciona un valor próximo a 0,3 micromoles para seleccionar el rango lineal de la reacción. Se cuantificaron los azúcares presentes en el extracto, ya que pueden interferir con la medición cuando se ensayan diluciones de 1:20 o inferiores. En su caso, se restó el promedio de azúcares reductores que se detectan en el mismo extracto incubado similarmente en ausencia de CMC.In a first example, the activity was compared endoglucanase of crude protein extracts obtained from the first generation of homoplasmic plants. They were used plants that have developed at least 6 leaves during cultivation in land. Leaf samples consisting of leaf discs were taken taken with punch of 8 mm in diameter. In this particular For example, each plant was analyzed separately taking samples of 8 discs (about 80 mg on average) from the various sheets expanded from each plant. The samples were homogenized fresh, in extraction buffer (0.1 M TrisClH pH6.8, 0.5M NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% 2-mercaptoethanol), using burles from plastic that adapt to the shape of the eppendorf. The relationship Weight: volume of extracts is 1: 5 (80 mg in 0.4 ml buffer). After homogeinization, the proteins were solubilized by mixing 3 times with a vortexer, for 30 seconds, at maximum speed. The extracts were centrifuged for 3 minutes at 12,000 rpms to separate the vegetable residue. Serial dilutions of the supernatant to measure endoglucanase activity on carboxymethyl cellulose (CMC). The reactions were mounted in one volume 0.5 ml of 1% CMC, 50 mM NaOAc pH5.2 and 2 mM MgCl2 for 1 hour at 50 ° C Activity was measured by quantifying reducing sugars released by the method of Somogyi Nelson (DNS dye). Be 0.3 ml of DNS reagent (Somogyi Nelson added to each reaction Dye), 1.2 ml of water and incubated 10 minutes at 100 ° C. The absorbance of the solution at 540 nm against a blank incubated with tampon. Reduced sugars released were calculated against a glucose standard curve. Micromoles released in 60 minutes and values were obtained in International Units (micromoles / minute) relative to the equivalent fresh leaf weight used in the reaction. Dilutions were tested for each extract appropriate and, for quantification the dilution used was provides a value close to 0.3 micromoles to select the linear range of the reaction. The sugars present were quantified in the extract, since they can interfere with the measurement when test dilutions of 1:20 or less. In his case, the average reducing sugars detected in the same extract similarly incubated in the absence of CMC.

Los resultados de actividad obtenidos con extractos de PGMs de primera generación se resumen en la Tabla 1 e indican que: i) no se detecta actividad endoglucanasa significativa en plantas normales ya que no se detectan diferencias significativas entre los micromoles medidos en presencia y en ausencia de CMC. ii) Los extractos de plantas transformadas con pAF-Yi (CelY nativa) tienen una actividad promedio de 0,3 IU/g de tejido fresco. Esto sugiere que el gen CelY nativo se expresa en el cloroplasto bajo el control del promotor y líder psbA aunque se recuperan niveles relativamente reducidos de actividad endoglucanasa. iii) En el contexto de inicio de traducción que proporcionan las secuencias sintéticas derivadas de la GFP (pAF-Yg) y de la ferredoxina (pAF-Yf), el gen CelY se expresa con mayor eficiencia ya que se recupera una actividad endoglucanasa 80 veces y 12 veces superior, respectivamente, respecto a las plantas que contienen la versión nativa de CelY y iv) la fusión carboxiterminal del dominio de tetramerización de la p53 promueve una recuperación de una actividad 2 veces superior, tanto en el contexto de CelY nativa como en el contexto de CelY fusionada al fragmento derivado de la GFP. Por tanto, los efectos observados sobre la actividad enzimática recuperable, alterando el contexto de inicio de la traducción (fusiones aminoterminales de la GFP o ferredoxina), o al fusionar el dominio de tetramerización en el extremo carboxiterminal de CelY son aditivos, en concreto, los efectos sobre actividad enzimática recuperable son sinergístico en el caso de GFP y p53. Los resultados también indican que la fusiones que propone esta solicitud de patente, no afectan a la actividad catalítica de CelY.The results of activity obtained with extracts of first-generation PGMs are summarized in Table 1 and indicate that: i) no significant endoglucanase activity is detected in normal plants since no significant differences are detected between the micromoles measured in the presence and absence of CMC ii) Extracts of plants transformed with pAF-Yi (native CelY ) have an average activity of 0.3 IU / g of fresh tissue. This suggests that the native CelY gene is expressed in the chloroplast under the control of the psbA promoter and leader although relatively reduced levels of endoglucanase activity are recovered. iii) In the context of translation initiation provided by the synthetic sequences derived from GFP (pAF-Yg) and ferredoxin (pAF-Yf), the CelY gene is expressed more efficiently since an endoglucanase activity is recovered 80 times and 12 times higher, respectively, with respect to the plants that contain the native version of CelY and iv) the carboxyterminal fusion of the tetramerization domain of p53 promotes a recovery of an activity 2 times higher, both in the context of native CelY and in the context of CelY merged to the fragment derived from the GFP. Therefore, the observed effects on the recoverable enzymatic activity, altering the context of translation initiation (aminoterminal fusions of GFP or ferredoxin), or by fusing the tetramerization domain at the carboxyterminal end of CelY are additive, in particular, the Effects on recoverable enzyme activity are synergistic in the case of GFP and p53. The results also indicate that the mergers proposed by this patent application do not affect the catalytic activity of CelY .

TABLA 1TABLE 1

1one

En este ejemplo particular se analizó también la expresión de CelY mediante separación electroforética de proteínas de los extractos y tinción con azul de Coomassie. A partir de plantas de primera generación que han integrado pAF-Yi, pAF-Yf, pAF-Yg y pAF-Yt se obtuvieron extractos en condiciones desnaturalizantes (en presencia de 2% SDS y calentando el extracto a 100ºC), se cargaron en geles desnaturalizantes de poliacrilamida al 12% y se tiñeron con azul de Coomassie. En plantas que integran pAF-Yg, pAF-Yf, pero no en plantas que integran pAF-Yi p pAF-Yt se observó una banda protéica cuyo peso molecular es el esperable (unos 36 kDa) para las correspondientes proteínas recombinantes (Figura 7a) indicando que la expresión de estas construcciones es muy eficiente. En el caso de pAF-Yt, la visualización de una banda específica no es tan evidente pero se detecta en un gel del 10% Acrilamida-SDS (Figura 7b), y su peso molecular aparente es de unos 38 kDa. Estos resultados demuestran que las dos estrategias que se presentan en esta solicitud de patente promueven una expresión y/o acumulación más eficiente de CelY en el cloroplasto de tabaco, más eficiente aun que la suma de la expresión promovida mediante el empleo de las dos estrategias por separado.In this particular example, CelY expression was also analyzed by electrophoretic separation of proteins from the extracts and staining with Coomassie blue. From first generation plants that have integrated pAF-Yi, pAF-Yf, pAF-Yg and pAF-Yt, extracts were obtained under denaturing conditions (in the presence of 2% SDS and heating the extract at 100 ° C), they were loaded into gels denaturing 12% polyacrylamide and stained with Coomassie blue. In plants that integrate pAF-Yg, pAF-Yf, but not in plants that integrate pAF-Yi p pAF-Yt a protein band whose molecular weight is expected (about 36 kDa) was observed for the corresponding recombinant proteins (Figure 7a) indicating that the expression of these constructions is very efficient. In the case of pAF-Yt, the visualization of a specific band is not as obvious but is detected in a 10% Acrylamide-SDS gel (Figure 7b), and its apparent molecular weight is about 38 kDa. These results demonstrate that the two strategies presented in this patent application promote a more efficient expression and / or accumulation of CelY in tobacco chloroplast, even more efficient than the sum of the expression promoted through the use of the two strategies by separated.

Estabilidad de la proteína y acumulación de CelY en plantasProtein stability and accumulation of CelY in plants

Los diferentes tipos de modificaciones introducidas en el gen CelY, cuya utilidad se contempla en la presente solicitud, tienen efectos sinergísticos sobre la productividad de la endoglucanasa CelY planta, lo que sugiere que su modo de acción sobre la expresión y estabilidad es diferente. Con el fin de analizar la estabilidad del producto en plantas se realizaron ensayos de actividad CMCasa con extractos de hojas de tabaco en distintos estados de desarrollo. Para ello, se tomaron muestras de las dos hojas expandidas más próximas al ápice (hojas "jóvenes") y de las dos hojas expandidas no senescentes más alejadas (hojas "maduras") del ápice en plantas de tabaco con 10-12 hojas. Se tomaron muestras procedentes de plantas transformadas con las construcciones pAF-Yi, pAF-Yt, pAF-Yg y pAF-Ygt. En este experimento cada muestra contiene 8 discos de hoja procedentes de las dos primeras o de las dos últimas hojas de 4 plantas distintas (4 discos por hoja). La extracción y medición de la actividad endoglucanasa se realizó como en el ejemplo anterior. Se ensayaron distintas diluciones de cada muestra por triplicado y se seleccionó la más apropiada para la cuantificación de azúcares reductores liberados. Los promedios de actividad medida se sumarizan en la tabla 2.The different types of modifications introduced in the CelY gene, whose usefulness is contemplated in the present application, have synergistic effects on the productivity of the plant endoglucanase CelY , which suggests that its mode of action on expression and stability is different. In order to analyze the stability of the product in plants, CMCase activity tests were carried out with tobacco leaf extracts in different stages of development. For this, samples were taken of the two expanded leaves closest to the apex ("young" leaves) and the two expanded non-senescent expanded leaves ("mature" leaves) of the apex in tobacco plants with 10-12 leaves. Samples from plants transformed with the constructions pAF-Yi, pAF-Yt, pAF-Yg and pAF-Ygt were taken. In this experiment, each sample contains 8 leaf discs from the first two or the last two leaves of 4 different plants (4 discs per sheet). The extraction and measurement of endoglucanase activity was performed as in the previous example. Different dilutions of each sample were tested in triplicate and the most appropriate was selected for the quantification of released reducing sugars. The measured activity averages are summarized in Table 2.

Los resultados obtenidos presentados en dicha tabla muestran que las diferencias de actividad observadas entre variantes de CelY son más acusadas en hojas maduras. La acumulación de las variantes fusionadas al dominio de tetramerización es mucho mayor en las hojas viejas. Se deduce que el efecto sinergístico de las dos modificaciones introducidas se debe a que las fusiones aminoterminales favorecen la expresión en hojas jóvenes y la fusión carboxiterminal del dominio de tetramerización favorece la estabilidad del producto durante la maduración. Las plantas que expresan CelY nativa pierden toda la actividad a medida que la hoja madura. Estos resultados están en concordancia con otras observaciones que sugieren que el promotor de psbA es especialmente activo en las hojas jóvenes (Molina y col, 2004).The results obtained presented in this table show that the differences in activity observed between CelY variants are more pronounced in mature leaves. The accumulation of the fused variants to the tetramerization domain is much greater in the old leaves. It follows that the synergistic effect of the two modifications introduced is due to the fact that aminoterminal fusions favor the expression in young leaves and the carboxy-terminal fusion of the tetramerization domain favors the stability of the product during maturation. Plants that express native CelY lose all activity as the leaf matures. These results are in accordance with other observations that suggest that the psbA promoter is especially active in young leaves (Molina et al, 2004).

TABLA 2TABLE 2

22

En un tercer ejemplo se analizó la estabilización de CelY mediada por la fusión con el dominio DTp53 con mayor detalle, comparando la expresión de Yg e Ygt, ya que la elevada expresión de CelY en estas plantas permite un análisis cuantitativo de la expresión. En este experimento particular se tomaron muestras de hoja "joven" (la primera hoja expandida de unos 15 cm) de 5 plantas normales, 5 plantas "Yg" y 5 plantas "Ygt" y se compararon con muestras de hoja "madura" de las mismas plantas. Cada muestra consiste en 10 discos de hoja (2 discos por hoja). Las muestras se homogeneizaron en 5 volúmenes (0,5 mi) de tampón de extracción (0,1M Tris pH6,8, 0,5M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% 2 mercapto etanol). Se cuantificó el contenido en proteínas de los extractos por el método de Bradford (BIO-RAD PROTEIN ASSAY Cat: 500-0006) comparando frente a un estándar de BSA (albúmina sérica bovina). Se analizó el contenido en proteínas de los extractos mediante electroforesis en un gel desnaturalizante y tinción con azul de Coomassie. Se identificaron las proteínas de los extractos con actividad endoglucanasa mediante un zimograma de las proteínas separadas electroforéticamente y se analizó la actividad endoglucanasa de los extractos mediante ensayo de diluciones apropiadas sobre CMC como se describe en los ejemplos anteriores. Para la separación electroforética de proteínas, se diluyó una parte del extracto en proporción 1:5 en tampón desnaturalizante (0,1M TrisCIH pH6.8, 0,2% SDS, 20%glicerol, 0,1% azul de bromofenol) y las muestras se cargaron -sin calentar- en 2 geles idénticos de 10% acrilamida y 0,1% SDS. Uno de los geles se tiñó con azul de Coomassie y se fotografió con una cámara digital sobre un transiluminador de luz fluorescente (Figura 8a). El segundo gel se procesó para el zimograma de la siguiente manera: se lavó 3 veces 200 ml de 1% Tritón X-100 para eliminar el SDS, se equilibró en 50 mM NaOAc pH 5,2 durante 1 hora a 4ºC para favorecer la renaturalización de las proteínas, se incubó durante 1 hora en 1% CMC 50 mM NaOAc a 37ºC, se tiñó con 1% Rojo Congo (que se une a CMC) durante 20 min a Tª ambiente, y se destiñó con varios lavados en 0,5M NaCl. El resultado es un gel de color rojo con zonas desteñidas correspondientes a proteínas con actividad endoglucanasa que fue fotografiado con una cámara digital sobre un transiluminador de luz fluorescente (Figura 8b). La cuantificación de proteínas (Tabla 3) indica que las muestras de hoja "joven" tienen un contenido en proteínas mayor (alrededor de 1 mg/ml) que las hojas maduras (0,6 mg/ml). Esa diferencia se manifiesta en el gel teñido con azul de Coomassie en el que se cargaron volúmenes equivalentes de extracto, no de proteína (Fig. 8a). En hojas jóvenes de planta normal (carril 1) la proteína más intensamente teñida es la ribulosa carboxilasa del cloroplasto (RUBISCO) con un peso molecular aparente de 54 kDa. En hojas jóvenes de plantas Yg ó Ygt se detecta otra proteína muy abundante con un peso molecular aparente aproximado de 36 kDa (Yg, carriles 2 y 3) y 39 kDa, (Ygt, carriles 4 y 5) que corresponde al peso molecular esperable de las respectivas variantes quiméricas de CelY. Ambas proteínas se tiñen con intensidad similar a RUBISCO. Se observa que la cantidad de CelY extraíble de las primeras hojas expandidas es muy similar en el caso de Yg e Ygt, en concordancia con una actividad endoglucanasa observada de 53,6 y 52,0 IUs/gramo de peso fresco respectivamente en esas hojas. En hojas maduras, por el contrario, se observa una acumulación diferencial de Ygt respecto a Yg o RUBISCO. Las hojas maduras que expresan Ygt (carriles 8 y 9) acumulan, aproximadamente, el doble de producto que las hojas maduras que expresan Yg (carriles 6 y 7). El zimograma (Figura 8b) muestra que las bandas protéicas identificadas como proteínas Yg e Ygt tienen actividad endoglucanasa por lo que deben corresponder a los productos del gen CelY. Este experimento indica que el dominio de tetramerización DTp53 no altera significativamente la expresión en hojas jóvenes. La fusión a DTp53 afecta principalmente a la acumulación del gen CelY durante la maduración de las hojas, lo que sugiere una estabilización de la proteína CelY. Esta acumulación diferencial se refleja en la actividad endoglucanasa extraíble de hojas maduras, tanto en términos de actividad por gramo de tejido fresco como en términos de actividad en relación a la proteína total extraída (Tabla 3). En hojas que expresan Ygt la actividad endoglucanasa observada es de 18,3 IU de CMCasa por miligramo de proteína extraída, mientras que en plantas que expresan Yg es de 8,9 IU de CMCasa por miligramo de proteína.In a third example, the stabilization of CelY mediated by fusion with the DTp53 domain was analyzed in greater detail, comparing the expression of Yg and Ygt, since the high expression of CelY in these plants allows a quantitative analysis of the expression. In this particular experiment, "young" leaf samples (the first expanded leaf of about 15 cm) were taken from 5 normal plants, 5 "Yg" plants and 5 "Ygt" plants and compared with "mature" leaf samples from the same plants. Each sample consists of 10 leaf discs (2 discs per sheet). The samples were homogenized in 5 volumes (0.5 ml) of extraction buffer (0.1M Tris pH6.8, 0.5M NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% 2 mercapto ethanol). The protein content of the extracts was quantified by the Bradford method (BIO-RAD PROTEIN ASSAY Cat: 500-0006) by comparing against a standard of BSA (bovine serum albumin). The protein content of the extracts was analyzed by electrophoresis in a denaturing gel and Coomassie blue staining. The proteins of the extracts with endoglucanase activity were identified by a zymogram of the electrophoretically separated proteins and the endoglucanase activity of the extracts was analyzed by assay of appropriate dilutions on CMC as described in the previous examples. For electrophoretic protein separation, a portion of the extract was diluted in a 1: 5 ratio in denaturing buffer (0.1M TrisCIH pH6.8, 0.2% SDS, 20% glycerol, 0.1% bromophenol blue) and the Samples were loaded - without heating - in 2 identical gels of 10% acrylamide and 0.1% SDS. One of the gels was stained with Coomassie blue and photographed with a digital camera on a fluorescent light transilluminator (Figure 8a). The second gel was processed for the zymogram as follows: 200 ml of 1% Triton X-100 was washed 3 times to remove the SDS, equilibrated in 50 mM NaOAc pH 5.2 for 1 hour at 4 ° C to promote renaturation of the proteins, it was incubated for 1 hour in 1% CMC 50 mM NaOAc at 37 ° C, stained with 1% Congo Red (which joins CMC) for 20 min at room temperature, and stained with several washes in 0.5M NaCl The result is a red gel with faded areas corresponding to proteins with endoglucanase activity that was photographed with a digital camera on a fluorescent light transilluminator (Figure 8b). Protein quantification (Table 3) indicates that "young" leaf samples have a higher protein content (about 1 mg / ml) than mature leaves (0.6 mg / ml). This difference is manifested in the Coomassie blue stained gel in which equivalent volumes of extract, not protein, were loaded (Fig. 8a). In young leaves of normal plant (lane 1) the most intensely stained protein is chloroplast ribulose carboxylase (RUBISCO) with an apparent molecular weight of 54 kDa. In young leaves of Yg or Ygt plants another very abundant protein is detected with an apparent molecular weight of approximately 36 kDa (Yg, lanes 2 and 3) and 39 kDa, (Ygt, lanes 4 and 5) corresponding to the expected molecular weight of the respective chimeric variants of CelY . Both proteins stain with intensity similar to RUBISCO. It is observed that the amount of CelY extractable from the first expanded leaves is very similar in the case of Yg and Ygt, in accordance with an observed endoglucanase activity of 53.6 and 52.0 IUs / gram of fresh weight respectively in those leaves. In mature leaves, on the contrary, a differential accumulation of Ygt with respect to Yg or RUBISCO is observed. Mature leaves that express Ygt (lanes 8 and 9) accumulate approximately twice the product of mature leaves that express Yg (lanes 6 and 7). The zymogram (Figure 8b) shows that the protein bands identified as Yg and Ygt proteins have endoglucanase activity so they must correspond to the products of the CelY gene. This experiment indicates that the tetramerization domain DTp53 does not significantly alter expression in young leaves. Fusion to DTp53 mainly affects the accumulation of the CelY gene during the maturation of the leaves, suggesting a stabilization of the CelY protein. This differential accumulation is reflected in the extractable endoglucanase activity of mature leaves, both in terms of activity per gram of fresh tissue and in terms of activity in relation to the total protein extracted (Table 3). In leaves expressing Ygt the observed endoglucanase activity is 18.3 IU of CMCase per milligram of extracted protein, while in plants expressing Yg it is 8.9 IU of CMCase per milligram of protein.

TABLA 3TABLE 3

33

Ejemplo 2Example 2 Expresión en cloroplastos de la endoglucanasa codificada por el gen Cel1Z de Dickeya dadantii Expression in chloroplasts of the endoglucanase encoded by the gene Cel1Z Dickeya dadantii Obtención y clonaje de Cel1Z en el vector de transformación pAFObtaining and cloning Cel1Z in the pAF transformation vector

En este ejemplo particular, el gen Cel1Z (Seq Id No. 43) fue clonado y aislado de forma similar a como se describe en el caso de CelY a partir de un producto de PCR amablemente cedido por el Profesor Pablo Rodríguez Palenzuela. El producto fue clonado en el vector pGEM-Teasy (Promega, Cat nº: A3610) y se obtuvo la secuencia completa del fragmento (Figura 9). La secuencia (Seq Id No. 43) resultó ser casi idéntica a la secuencia publicada de la endoglucanasa Z de Erwinia chrysanthemi (Ahora Dickeya dadantii, Accesión Y00540). Se encontraron 2 diferencias. La secuencia obtenida tiene una delección de un residuo de adenina (A) en la posición +1096 y una adición de un residuo de adenina en la posición +1162 del marco de lectura abierta de Cel1Z. Creemos que las diferencias observadas se deben a artefactos en el clon secuenciado en Y00540 ya que la secuencia deducible de aminoácidos a partir de Y00540 difiere de la secuencia publicada de la proteína Cel1Z (P07103). Por el contrario, la secuencia de aminoácidos deducible del clon utilizado en este trabajo es idéntica a la de P07103.In this particular example, the Cel1Z gene (Seq Id No. 43) was cloned and isolated in a similar way as described in the case of CelY from a PCR product kindly provided by Professor Pablo Rodríguez Palenzuela. The product was cloned into the pGEM-Teasy vector (Promega, Cat #: A3610) and the complete sequence of the fragment was obtained (Figure 9). The sequence (Seq Id No. 43) turned out to be almost identical to the published sequence of the endoglucanase Z of Erwinia chrysanthemi (Now Dickeya dadantii , Accession Y00540 ). 2 differences were found. The sequence obtained has a deletion of an adenine residue (A) at the +1096 position and an addition of an adenine residue at the +1162 position of the open reading frame of Cel1Z . We believe that the differences observed are due to artifacts in the clone sequenced in Y00540 since the deductible sequence of amino acids from Y00540 differs from the published sequence of the Cel1Z protein (P07103). In contrast, the deductible amino acid sequence of the clone used in this work is identical to that of P07103.

A partir de este clon, se amplificó, mediante la reacción de la polimerasa en cadena (PCR), un fragmento que representa los nucleótidos 130-1282 correspondientes a la endoglucanasa Z madura precedida del triplete ATG de inicio de traducción. Para ello, se utilizaron los oligonucleótidos Cel1Z-D2 (Seq Id No. 21) y Cel1Z-R2 (Seq Id No. 22) (Figura 2) que añaden dianas BspHI y XbaI flanqueando, respectivamente, los extremos 5' y 3' del marco de lectura abierto de la endoglucanasa Z. El producto de PCR fue clonado en los plásmidos pPLA (Seq Id No. 1), pPLAg (Seq Id No. 4) y pPLAf (Seq Id No. 5) previamente descritos (Figura 1), digeridos con NcoI y XbaI de forma similar a como se describe en el ejemplo 1, ya que los extremos cohesivos que generan BspHI y NcoI son compatibles entre sí. De esta manera se obtuvieron los clones pPLA-Zi, pPLA-Zg y pPLA-Zf, que de forma similar a pPLA-Yi, pPLA-Yg y pPLA-Yf, difieren en el contexto de secuencia inmediatamente posterior al triplete de inicio de la traducción determinado por la secuencia líder de psbA: i) en el caso particular de pPLA-Zi, la secuencia inmediatamente posterior al triplete de inicio de la traducción representa la secuencia nativa de la endoglucanasa Z madura (Seq Id No. 48), ii) en el caso particular de pPLA-Zg, el contexto de secuencia inmediatamente posterior al triplete de inicio de traducción corresponde a una fragmento sintético que codifica los primeros 15 aminoácidos de la GFP descrita (Seq Id No. 29) en el anterior ejemplo (Figura 1) y iii) en el caso particular de pPLAZf, el contexto de secuencia inmediatamente posterior al triplete de inicio de traducción corresponde a un fragmento sintético que codifica los aminoácidos 28-47 de la ferredoxina de tabaco (Seq Id No. 33) (Figura 1). El objeto de estas construcciones es analizar los efectos de las secuencias inmediatamente posteriores al triplete ATG en la expresión de genes bajo el control del promotor y secuencia líder de psbA.From this clone, a fragment representing nucleotides 130-1282 corresponding to mature endoglucanase Z preceded by the translation initiation ATG triplet was amplified by the polymerase chain reaction (PCR). For this, the oligonucleotides Cel1Z-D2 (Seq Id No. 21) and Cel1Z-R2 (Seq Id No. 22) (Figure 2) were added which add BspH I and Xba I targets flanking, respectively, the 5 'and 3 ends 'of the open reading frame of endoglucanase Z. The PCR product was cloned into plasmids pPLA (Seq Id No. 1), pPLAg (Seq Id No. 4) and pPLAf (Seq Id No. 5) previously described (Figure 1), digested with Nco I and Xba I in a manner similar to that described in example 1, since the cohesive ends that generate Bsp HI and Nco I are compatible with each other. In this way the clones pPLA-Zi, pPLA-Zg and pPLA-Zf were obtained, which in a similar way to pPLA-Yi, pPLA-Yg and pPLA-Yf, differ in the sequence context immediately after the triplet starting the translation determined by the leader sequence of psbA : i) in the particular case of pPLA-Zi, the sequence immediately after the translation triplet represents the native sequence of mature endoglucanase Z (Seq Id No. 48), ii) In the particular case of pPLA-Zg, the sequence context immediately after the translation start triplet corresponds to a synthetic fragment encoding the first 15 amino acids of the GFP described (Seq Id No. 29) in the previous example (Figure 1 ) and iii) in the particular case of pPLAZf, the sequence context immediately after the translation initiation triplet corresponds to a synthetic fragment encoding amino acids 28-47 of tobacco ferredoxin (Seq Id No. 33) (Figure 1 ). The purpose of these constructs is to analyze the effects of the sequences immediately following the ATG triplet on the expression of genes under the control of the promoter and leader sequence of psbA .

Adicionalmente, se construyó una versión quimérica de la endoglucanasa Z fusionada al dominio de tetramerización DTp53 (Seq Id No. 53) con el objetivo de analizar sus efectos sobre la estabilidad de proteína. La endoglucanasa Z, a diferencia de CelY es una proteína de estructura modular con dominios estructurales-funcionales diferenciados (Figura 9). La proteína madura consta de un dominio aminoterminal con función catalítica (aminoácidos 1-289, Seq Id No. 50) seguido de un brazo de separación (aminoácidos 290-323 Seq Id No. 51) y un dominio con afinidad por celulosa (aminoácidos 324-383, Seq Id No. 52) (Brun y Col, 1997). En principio, el dominio DTp53 se puede fusionar en el extremo aminoterminal, en el extremo carboxiterminal, o en el brazo de separación. La fusión al extremo aminoterminal se descartó porque puede interferir con la expresión del gen. La fusión de DTp53 en el brazo de separación de la endoglucanasa Z mimetiza la estructura de la p53, que consta de un dominio aminoterminal grande y de un dominio aminoterminal de menor tamaño separados por el dominio de tetramerización (Tidow y Col. 2007). En el caso de que la proteína quimérica formara dímeros o tetrámeros equivalentes a la p53, el complejo resultante tendría una estructura que expone 2 dominios de unión a celulosa espacialmente próximos entre sí, pudiendo afectar a la afinidad del complejo por la celulosa. Esta estructura tiene gran interés ya que la afinidad por celulosa es un factor importante en la actividad de las celulasas. Esta organización de dominios es conceptualmente similar a la de los complejos multiprotéicos que forman algunas bacterias celulolíticas como Clostridium cellulovorans, que constan de subunidades catalíticas que se unen a través de un dominio "de anclaje" (dockering domain) a un "andamio" protéico (scaffold) que contiene múltiples dominios con afinidad por celulosa (Murashima y Col. 2002). Por este motivo se ha seleccionado la fusión de DTp53 (Seq Id No. 35) dentro del brazo de separación (Seq Id No. 51), o en sustitución del brazo de separación, si bien no se descarta la utilidad de fusiones carboxiterminales de DTp53 como en el ejemplo 1.Additionally, a chimeric version of endoglucanase Z fused to the tetramerization domain DTp53 (Seq Id No. 53) was constructed in order to analyze its effects on protein stability. Endoglucanase Z, unlike CelY is a modular structure protein with differentiated structural-functional domains (Figure 9). The mature protein consists of an aminoterminal domain with catalytic function (amino acids 1-289, Seq Id No. 50) followed by a separation arm (amino acids 290-323 Seq Id No. 51) and a cellulose affinity domain (amino acids 324 -383, Seq Id No. 52) (Brun et al, 1997). In principle, the DTp53 domain can be fused at the aminoterminal end, at the carboxy terminal end, or at the separation arm. The aminoterminal end fusion was ruled out because it can interfere with gene expression. The fusion of DTp53 in the separation arm of endoglucanase Z mimics the structure of p53, which consists of a large aminoterminal domain and a smaller aminoterminal domain separated by the tetramerization domain (Tidow et al. 2007). In the event that the chimeric protein formed dimers or tetramers equivalent to p53, the resulting complex would have a structure that exposes 2 cellulose binding domains spatially close to each other, and may affect the affinity of the complex for cellulose. This structure is of great interest since cellulose affinity is an important factor in cellulase activity. This organization of domains is conceptually similar to that of the multiprheoretic complexes that form some cellulolytic bacteria such as Clostridium cellulovorans , which consist of catalytic subunits that bind through an "anchoring" domain to a "scaffolding" ( scaffold) that contains multiple domains with cellulose affinity (Murashima and Col. 2002). For this reason, the fusion of DTp53 (Seq Id No. 35) within the separation arm (Seq Id No. 51), or in replacement of the separation arm, has been selected, although the usefulness of DTp53 carboxyterminal fusions is not ruled out. as in example 1.

La fusión del dominio de tetramerización DTp53 (Seq Id No. 35) a la endoglucanasa Z (Seq Id No. 48) se realizó en tres etapas. En una primera etapa se amplificó el dominio catalítico de Cel1Z utilizando los oligonucleótidos Cel1Z-D2 (Seq Id No. 20) y CelZL-R (Seq Id No. 22). El producto de PCR, que representa los nucleótidos a 130-1047 del gen flanqueados por dianas BspHI y XbaI, fue clonado en pPLA (Seq Id No. 1) y pPLAg (Seq Id No. 4) de forma similar al fragmento anterior. De esta manera se obtuvieron los clones pPLA-Zcat y pPLA-Zgcat. En una segunda etapa se ligó el dominio DTp53 (Seq Id No. 35) al dominio de unión a celulosa (Seq Id No. 47) mediante PCR combinada. Este método consiste en la amplificación, por separado, de dos fragmentos de ADN que solapan parcialmente. Uno de los fragmentos de PCR (199 pb) representa el dominio DTp53 amplificado con los oligonucleótidos TXXL-D (Seq Id No. 23) y TXXL-R (Seq Id No. 24) (Figura 2) flanqueado por una diana de restricción XbaI en su extremo 5' y por una secuencia de 12 nucleótidos en su extremo 3' complementarios a los nt 1048-1059 del gen Cel1Z (Figura 9). El segundo fragmento de PCR representa los nucleótidos 1048-1285 de Cel1Z que codifican parte del brazo de separación (Seq Id No. 46) y el dominio de unión a celulosa (Seq Id No. 47), amplificados con los oligonucleótidos TCBD (Seq Id No. 25) y Cel1Z-R2 (Seq Id No. 21) (Figura 2). Este fragmento contiene, en su extremo 5', un segmento de 12 nucleótidos que representan los últimos 4 tripletes de DTp53. Los productos de PCR, que solapan en 24 pb, se purificaron de geles de agarosa y se combinaron como molde en una corta reacción de amplificación de 5 ciclos, que genera un producto que representa la fusión de ambos fragmentos por el anillamiento de sus regiones solapantes. Este producto, flanqueado por dianas XbaI, se reamplificó por PCR con VENT polimerasa (New England Biolabs) utilizando los oligonucleótidos TXXL-D (Seq Id No. 23) y Cel1Z-R2 (Seq Id No. 21) que anillan en ambos extremos y se clonó en pGEM-T Easy siguiendo las instrucciones del fabricante (Promega Cat nº A3610). Se analizó la secuencia del clon resultante comprobando la correcta fusión de los fragmentos. A partir de una preparación de ADN de este plásmido se purificó el fragmento XbaI que representa DTp53 fusionado al dominio de unión a celulosa y se ligó a los plásmidos pPLA-Zcat y pPLA-Zgcat similarmente digeridos obteniéndose pPLA-Zt y pPLA-Zgt que contienen genes quiméricos que representan la endoglucanasa Z madura de Dickeya dadantii fusionada al dominio DTp53 en el brazo de separación, cuya secuencia fue analizada (Figura 10).The fusion of the tetramerization domain DTp53 (Seq Id No. 35) to endoglucanase Z (Seq Id No. 48) was performed in three stages. In a first stage, the catalytic domain of Cel1Z was amplified using the oligonucleotides Cel1Z-D2 (Seq Id No. 20) and CelZL-R (Seq Id No. 22). The PCR product, which represents nucleotides at 130-1047 of the gene flanked by BspHI and XbaI targets, was cloned into pPLA (Seq Id No. 1) and pPLAg (Seq Id No. 4) similar to the previous fragment. In this way the clones pPLA-Zcat and pPLA-Zgcat were obtained. In a second stage the DTp53 domain (Seq Id No. 35) was linked to the cellulose binding domain (Seq Id No. 47) by combined PCR. This method consists in the amplification, separately, of two partially overlapping DNA fragments. One of the PCR fragments (199 bp) represents the DTp53 domain amplified with the oligonucleotides TXXL-D (Seq Id No. 23) and TXXL-R (Seq Id No. 24) (Figure 2) flanked by an Xba restriction target I at its 5 'end and by a sequence of 12 nucleotides at its 3' end complementary to nt 1048-1059 of the Cel1Z gene (Figure 9). The second PCR fragment represents nucleotides 1048-1285 of Cel1Z that encode part of the separation arm (Seq Id No. 46) and the cellulose binding domain (Seq Id No. 47), amplified with the TCBD oligonucleotides (Seq Id No. 25) and Cel1Z-R2 (Seq Id No. 21) (Figure 2). This fragment contains, at its 5 'end, a segment of 12 nucleotides representing the last 4 triplets of DTp53. The PCR products, which overlap in 24 bp, were purified from agarose gels and combined as a template in a short 5-cycle amplification reaction, which generates a product that represents the fusion of both fragments by the overlapping of their overlapping regions. . This product, flanked by Xba I targets, was reamplified by PCR with VENT polymerase (New England Biolabs) using the oligonucleotides TXXL-D (Seq Id No. 23) and Cel1Z-R2 (Seq Id No. 21) which ring at both ends and was cloned into pGEM-T Easy following the manufacturer's instructions (Promega Cat No. A3610). The sequence of the resulting clone was analyzed by checking the correct fusion of the fragments. From a DNA preparation of this plasmid, the XbaI fragment representing DTp53 fused to the cellulose binding domain was purified and ligated to similarly digested plasmids pPLA-Zcat and pPLA-Zgcat to obtain pPLA-Zt and pPLA-Zgt containing chimeric genes representing the mature endoglucanase Z of Dickeya dadantii fused to the DTp53 domain in the separation arm, whose sequence was analyzed (Figure 10).

Los genes quiméricos Zi, Zf, Zg, Zt y Zgt operativamente ligados al promotor (Seq Id No. 2) y secuencia líder (Seq Id No. 3) de psbA se clonaron en el vector de integración pAF (Fernández-San Millán y Col. 2008) de forma análoga al ejemplo 1, obteniéndose los plásmidos pAF-Zi, pAF-Zf, pAF-Zg, pAF-Zt y pAF-Zgt(Seq Id No. 55).The chimeric Zi, Zf, Zg, Zt and Zgt genes operatively linked to the promoter (Seq Id No. 2) and leader sequence (Seq Id No. 3) of psbA were cloned into the pAF integration vector (Fernández-San Millán y Col 2008) analogously to example 1, obtaining plasmids pAF-Zi, pAF-Zf, pAF-Zg, pAF-Zt and pAF-Zgt (Seq Id No. 55).

Obtención de plantas de tabaco que integran variantes de Cel1Z en el cloroplasto de tabacoObtaining tobacco plants that integrate Cel1Z variants in the tobacco chloroplast

Se obtuvieron plantas de tabaco que integran Zi, Zf, Zg, Zt y Zgt (Seq Id No. 55) con la metodología que se describe en el ejemplo 1. El análisis de integración y homoplasmia de las plantas se realizó como se describe en dicho ejemplo.Tobacco plants that integrate Zi were obtained, Zf, Zg, Zt and Zgt (Seq Id No. 55) with the methodology described in example 1. The analysis of integration and homoplasmia of Plants were performed as described in that example.

Expresión y acumulación de Cel1Z en tabacoExpression and accumulation of Cel1Z in tobacco

La expresión y acumulación de las variantes de endoglucanasa Z se analizó mediante mediciones de actividad endoglucanasa a partir de extractos crudos de plantas homoplásmicas que integran las distintas variantes. Los extractos se obtuvieron como se describe en el ejemplo 1, a partir de muestras de 80 mg de tejido fresco y los ensayos de actividad endoglucanasa sobre CMC se realizaron también como se describe en el dicho ejemplo. En éste ejemplo particular, el ensayo de diluciones seriadas de extractos de planta se observó que el rango linear de actividad endoglucanasa Z es mucho más amplio que en el caso de CelY. Esto permitió realizar un análisis comparativo de la actividad endoglucanasa utilizando la misma cantidad de extracto en todos los casos. En este ejemplo particular se ensayaron muestras de plantas homoplásmicas de primera generación en estado de 8-10 hojas. Los resultados obtenidos se resumen en
tabla 4:The expression and accumulation of endoglucanase Z variants was analyzed by measurements of endoglucanase activity from crude extracts of homoplasmic plants that integrate the different variants. The extracts were obtained as described in example 1, from 80 mg samples of fresh tissue and endoglucanase activity tests on CMC were also performed as described in said example. In this particular example, the test of serial dilutions of plant extracts found that the linear range of endoglucanase Z activity is much broader than in the case of CelY . This allowed for a comparative analysis of endoglucanase activity using the same amount of extract in all cases. In this particular example, samples of first-generation homoplasmic plants were tested in a state of 8-10 leaves. The results obtained are summarized in
table 4:

TABLA 4TABLE 4

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A diferencia de CelY, no se observó actividad significativa en plantas que integran el gen Cel1Z nativo (Seq Id No. 48) (Zi). Similarmente a lo observado con CelY, las fusiones aminoterminales de dos fragmentos sintéticos con baja proporción de pares CG favorecieron la expresión de Cel1Z clonado bajo el promotor (Seq Id No. 2) y secuencia líder (Seq Id No. 3) de psbA. Como en el ejemplo 1, la secuencia derivada de la GFP (Zg) estimuló la expresión de la endoglucanasa en mayor cuantía que la secuencia derivada de la ferredoxina (Zf). Se observó además que la fusión del dominio de tetramerización, en el brazo de separación de la endoglucanasa Z (Zt) también favorece la acumulación de la endoglucanasa similarmente al ejemplo 1. Por último, y similarmente al ejemplo anteriormente descrito, se observó que la utilización de las dos estrategias que se describen en la presente patente tiene efectos sinergísticos. Estos resultados sugieren, que, como en el ejemplo anterior, la fusión aminoterminal del péptido sintético que codifica la GFP estimula la expresión (traducción) de la endoglucanasa Z de forma similar al efecto observado sobre CelY, y que el dominio de tetramerización actúa favoreciendo la estabilidad de la endoglucanasa.Unlike CelY , no significant activity was observed in plants that integrate the native Cel1Z gene (Seq Id No. 48) (Zi). Similar to what was observed with CelY, the aminoterminal fusions of two synthetic fragments with low proportion of CG pairs favored the expression of Cel1Z cloned under the promoter (Seq Id No. 2) and leader sequence (Seq Id No. 3) of psbA . As in Example 1, the sequence derived from GFP (Zg) stimulated endoglucanase expression to a greater extent than the sequence derived from ferredoxin (Zf). It was also observed that the fusion of the tetramerization domain, in the separation arm of the endoglucanase Z (Zt) also favors the accumulation of the endoglucanase similar to example 1. Finally, and similar to the example described above, it was observed that the use of the two strategies described in this patent has synergistic effects. These results suggest that, as in the previous example, the aminoterminal fusion of the synthetic peptide encoding GFP stimulates the expression (translation) of endoglucanase Z in a similar way to the effect observed on CelY , and that the tetramerization domain acts favoring the endoglucanase stability.

Además, los resultados sugieren que ninguna de las modificaciones introducidas afectan la actividad catalítica sobre carboximetilcelulosa.In addition, the results suggest that none of the modifications introduced affect the catalytic activity on carboxymethyl cellulose.

Expresión de la endoglucanasa Z: estabilidad de la proteínaEndoglucanase Z expression: protein stability

Con el fin de analizar de forma más detallada los efectos de las modificaciones que se proponen en la presente solicitud en la expresión y/o actividad de la endoglucanasa Z, se llevaron a cabo análisis comparativos entre plantas de segunda generación que integran Zg y Zgt (Seq Id No. 56), analizando, mediante zimogramas, el tamaño de las proteínas presentes en los extractos con actividad endoglucanasa. En este experimento particular se tomaron muestras independientes de 50 mg (5 discos de hoja) de tres plantas por cada tratamiento más una planta normal. Se cuantificó el contenido en proteínas por el método de Bradford como se describe en el ejemplo 1. Se analizó la actividad extraída de cada planta y se obtuvo un promedio de las tres plantas de cada tratamiento.In order to analyze in more detail the effects of the modifications proposed herein request in the expression and / or activity of endoglucanase Z, is carried out comparative analyzes between second plants generation that integrate Zg and Zgt (Seq Id No. 56), analyzing, by zymograms, the size of the proteins present in the extracts with endoglucanase activity. In this experiment individual samples were taken 50 mg (5 disks of leaf) of three plants for each treatment plus a normal plant. Be quantified protein content by the Bradford method as described in example 1. The activity extracted from each plant and an average of the three plants of each was obtained treatment.

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En este experimento, la actividad extraída de plantas que integran endoglucanasa Z fusionada a DTp53 fue un 25% superior en términos relativos al peso fresco extraído y un 60% en términos relativos a la proteína extraída. Las mismas muestras, extraídas en presencia de inhibidores de proteasas de plantas, se sometieron a separación electroforética en un gel desnaturalizante de acrilamida al 8%. Para evitar su desnaturalización irreversible, las muestras no se calentaron previamente a la carga en el gel. El gel fue procesado similarmente al zimograma que se detalla en el ejemplo 1 y se visualizaron las proteínas de los extractos con actividad electroforética (Figura 10). En este caso el patrón de endoglucanasas es mucho más complejo que en el caso del ejemplo 1. Se observan, tanto en extractos de Zg como de Zgt (Seq Id No. 56) varias bandas con actividad catalítica, algunas con una movilidad electroforética inferior al peso molecular esperable de la endoglucanasa Z. El resultado indica que se produce proteolisis extensiva de la endoglucanasa Z en el cloroplasto de tabaco y que el patrón resultante es alterado por la fusión de DTp53 en el brazo de separación. Además, en el caso de Zgt, y no en Zg, se detectan bandas discretas de actividad endoglucanasa de alto peso molecular (indicadas con flechas blancas en la Figura 10). Estas pueden corresponder a complejos multiméricos de Zgt estables durante la extracción y electroforesis. Los datos de actividad y los zimogramas indican que la fusión de DTp53 no evita la proteolisis de CelZ en el cloroplasto pero incrementan la estabilidad, probablemente, por la formación de estructuras complejas. Se ha descrito que los brazos que separan dominios de celulasas son susceptibles a la acción de proteasas en ausencia de glicosilación (Langsford y col. 1987). Estos resultados muestran que en el cloroplasto, carente de maquinaria de glicosilación, los brazos de separación de celulasas pueden ser una diana de proteasas por lo que es importante desarrollar estrategias que reduzcan la accesibilidad de estos segmentos separadores a las proteasas.In this experiment, the activity extracted from plants that integrate endoglucanase Z fused to DTp53 was 25% higher in terms of the fresh weight extracted and 60% in terms related to the extracted protein. The same samples, extracted in the presence of plant protease inhibitors, it subjected to electrophoretic separation in a denaturing gel of 8% acrylamide. To avoid irreversible denaturation, the samples were not heated prior to loading on the gel. He gel was processed similarly to the zymogram detailed in the Example 1 and the proteins in the extracts were visualized with electrophoretic activity (Figure 10). In this case the pattern of Endoglucanases is much more complex than in the case of Example 1. They are observed, both in Zg and Zgt extracts (Seq Id No. 56) several bands with catalytic activity, some with mobility electrophoretic less than the expected molecular weight of the endoglucanase Z. The result indicates that proteolysis occurs extensive of endoglucanase Z in tobacco chloroplast and that the resulting pattern is altered by the fusion of DTp53 in the arm of separation. In addition, in the case of Zgt, and not in Zg, they are detected discrete bands of high molecular weight endoglucanase activity (indicated with white arrows in Figure 10). These can correspond to stable multimeric Zgt complexes during extraction and electrophoresis. Activity data and zymograms indicate that the fusion of DTp53 does not prevent the proteolysis of CelZ in the chloroplast but increase stability, probably by complex structure formation. It has been described that the arms that separate cellulase domains are susceptible to the action of proteases in the absence of glycosylation (Langsford et al. 1987). These results show that in the chloroplast, lacking glycosylation machinery, cellulase separation arms they can be a protease target so it is important develop strategies that reduce the accessibility of these separating segments to proteases.

Actividad de las variantes de endoglucanasa Z sobre sustratos insolublesActivity of endoglucanase Z variants on substrates insoluble

El sustrato natural e industrial de las celulasas es de naturaleza insoluble y semicristalina. La construcción de enzimas quiméricas que forman estructuras complejas (dímeros o tetrámeros) puede afectar la actividad sobre esta clase de sustratos. En un ensayo preliminar se analizó la actividad de la endoglucanasa Z sobre celulosa microcristalina (avicel). Por un lado, la formación de estructuras multiméricas puede reducir la actividad específica de la proteína, pero esta hipotética reducción puede ser compensada por una mayor estabilidad del producto en la reacción y por una mayor afinidad por el sustrato ya que los complejos multiméricos tienen también varias copias del dominio de unión a celulosa.The natural and industrial substrate of Cellulases are insoluble and semi-crystalline in nature. The construction of chimeric enzymes that form complex structures (dimers or tetramers) may affect activity on this class of substrates. In a preliminary trial the activity of the endoglucanase Z on microcrystalline cellulose (avicel). For On the other hand, the formation of multimeric structures can reduce the specific protein activity, but this hypothetical reduction It can be compensated for greater product stability in the reaction and for a greater affinity for the substrate since the multimeric complexes also have several copies of the domain of cellulose binding.

Se analizó la actividad sobre 2%-avicel de dos extractos procedentes de plantas Zgt y Zt. Los extractos se obtuvieron a partir de 2 gramos de material vegetal (hojas expandidas) homogeneizados en fresco en un mortero de cerámica en 10 ml de 100 mM Tris pH6.8, 0,5M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% 2-mercaptoetanol. Las reacciones se incubaron durante 8h en 10 ml de 2% avicel, 50 mM pH 5.2 y 1 mM MgCl2, en un agitador orbital a 37ºC con agitación a 200 r.p.m. Cada reacción contiene 1 ml de extracto y se realizaron 3 réplicas por cada tratamiento. Se tomaron muestras de 1 ml a 1, 2, 3, 6 y 8 horas del inicio de reacción para comparar la cinética de reacción de las proteínas quiméricas. Se determinaron los azúcares reductores liberados por el método de Nelson Somogyi y se cuantificaron los micromoles liberados por mililitro:Activity on 2% was analyzed - two-poultry extracts from plants Zgt and Zt. The extracts are obtained from 2 grams of plant material (leaves expanded) homogenized fresh in a ceramic mortar in 10 100 mM Tris pH6.8 ml, 0.5M NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% 2-mercaptoethanol. The reactions were incubated. for 8 h in 10 ml of 2% poultry, 50 mM pH 5.2 and 1 mM MgCl2, in a orbital shaker at 37 ° C with shaking at 200 r.p.m. Every reaction It contains 1 ml of extract and 3 replicates were made for each treatment. Samples of 1 ml were taken at 1, 2, 3, 6 and 8 hours after reaction onset to compare the reaction kinetics of the chimeric proteins Reducing sugars were determined released by the Nelson Somogyi method and the micromoles released per milliliter:

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Los datos se representan gráficamente en la figura 12.The data is plotted in the figure 12.

Se determinó la actividad de los mismos extractos sobre CMC como se describe en el ejemplo 1. La actividad de Zg y Zgt sobre CMC fue de 8,2 y 13,6 IU/gramo de tejido fresco respectivamente. Los datos muestran que en una hora de reacción, la diferencia de actividad de extractos de Zg ó Zgt sobre avicel es mucho menor que sobre CMC lo que indica que la actividad específica de Zgt sobre sustratos sólidos es menor que la de Zg. En concreto, sobre CMC, la diferencia de actividad observada es de un 60-70%, mientras que sobre avicel, en una hora, la diferencia a favor de Zgt se reduce a un 20%. Sin embargo, en el transcurso de la reacción se observa un mayor incremento de azúcares reductores con extractos Zgt de manera que a las 8 horas la diferencia de actividad de los extractos aumenta hasta un 40%. Este resultado indica que si bien la actividad específica de extractos Zgt sobre sustratos sólidos es menor que los de Zg, la forma multimérica es más estable en reacciones largas y mantiene mejor la actividad. Esta mayor estabilidad de las formas multiméricas se asemeja a las diferencias observadas entre preparaciones de celulasas fúngicas de Trichoderma reesei (monoméricas) y preparaciones celulasas de bacterias del rumen de los bóvidos (Chlostridium cellulovorans) que forman complejos multiméricos de celulasas. La actividad de las celulasas de Chlostridium se mantiene mejor en el tiempo que las de Trichoderma (Lynd y col. 2002).The activity of the same extracts on CMC was determined as described in example 1. The activity of Zg and Zgt on CMC was 8.2 and 13.6 IU / gram of fresh tissue respectively. The data show that in one hour of reaction, the difference in activity of Zg or Zgt extracts on poultry is much smaller than on CMC, which indicates that the specific activity of Zgt on solid substrates is less than that of Zg. Specifically, on CMC, the difference in activity observed is 60-70%, while on poultry, in one hour, the difference in favor of Zgt is reduced to 20%. However, in the course of the reaction a greater increase in reducing sugars with Zgt extracts is observed so that at 8 hours the difference in activity of the extracts increases up to 40%. This result indicates that while the specific activity of Zgt extracts on solid substrates is lower than those of Zg, the multimeric form is more stable in long reactions and better maintains the activity. This greater stability of the multimeric forms resembles the differences observed between fungal cellulase preparations of Trichoderma reesei (monomeric) and cellulase preparations of bovine rumen bacteria ( Chlostridium cellulovorans ) that form multimeric cellulase complexes. The activity of Chlostridium cellulases is better maintained over time than those of Trichoderma (Lynd et al. 2002).

Estos datos demuestran que las nuevas proteínas recombinantes tienen diferentes propiedades y con nuevas posibilidades para su uso industrial.These data show that the new proteins recombinants have different properties and with new possibilities for industrial use.

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<110> PLANT BIOPRODUCTS S.L<110> PLANT BIOPRODUCTS S.L

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<120> METODO PARA MEJORAR LA EXPRESIÓN DE PROTEINAS EN CLOROPLASTOS<120> METHOD TO IMPROVE THE EXPRESSION OF CHLOROPLAST PROTEINS

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<130> METODO PARA MEJORAR LA EXPRESIÓN DE PROTEINAS EN CLOROPLASTOS<130> METHOD TO IMPROVE THE EXPRESSION OF CHLOROPLAST PROTEINS

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<160> 57<160> 57

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<170> PatentIn versión 3.3<170> PatentIn version 3.3

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<210> 1<210> 1

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<211> 192<211> 192

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

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<223> Plásmido intermedio (secuencia parcial) pPLA<223> Intermediate plasmid (sequence partial) pPLA

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<400> 1<400> 1

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232. 3

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<210> 2<210> 2

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<211> 103<211> 103

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

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<223> Promotor del gen psbA<223> psbA gene promoter

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<400> 2<400> 2

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2424

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<210> 3<210> 3

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<211> 89<211> 89

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

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<223> Secuencia líder del gen psbA<223> PSBA gene leader sequence

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<400> 3<400> 3

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2525

2626

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<210> 4<210> 4

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<211> 236<211> 236

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

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<223> plásmido intermedio (secuencia parcial) pPLAg<223> intermediate plasmid (sequence partial) pPLAg

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<400> 4<400> 4

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2727

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<210> 5<210> 5

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<211> 245<211> 245

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

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<223> Plásmido intermedio (secuencia parcial) pPLAf<223> Intermediate plasmid (sequence partial) pPLAf

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<400> 5<400> 5

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2828

2929

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<210> 6<210> 6

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<211> 28<211> 28

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

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<223> Oligonucleótido Ppsba-D<223> Oligonucleotide Ppsba-D

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<400> 6<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcgaattcgt agagaagtcc gtattttt

\hfill

28

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gcgaattcgt agagaagtcc gtattttt

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28

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<210> 7<210> 7

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<211> 31<211> 31

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

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<223> Oligonucleótido LpsbA-R<223> Oligonucleotide LpsbA-R

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<400> 7<400> 7

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gcctctagac gccatggtaa aatcttggtt t

\hfill

31

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gcctctagac gccatggtaa aatcttggtt t

 \ hfill 

31

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<210> 8<210> 8

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<211> 59<211> 59

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Linker GFP- LGFP-D<223> GFP Linker- LGFP-D

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<400> 8<400> 8

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\hskip-.1em\dddseqskip

catgagtaaa ggtgaagaac tttttactgg agtagttcct attcgtgcca tggttcagc

\hfill

59

 \ hskip-.1em \ dddseqskip 

catgagtaaa ggtgaagaac tttttactgg agtagttcct attcgtgcca tggttcagc

 \ hfill 

59

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<210> 9<210> 9

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<211> 59<211> 59

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

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<223> Linker GFP- GFP-R<223> GFP Linker- GFP-R

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<400> 9<400> 9

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggccgctgaa ccatggcacg aataggaact actccagtaa aaagttcttc acctttact

\hfill

59

 \ hskip-.1em \ dddseqskip 

ggccgctgaa ccatggcacg aataggaact actccagtaa aaagttcttc acctttact

 \ hfill 

59

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<210> 10<210> 10

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<211> 68<211> 68

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

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<223> Linker Ferredoxina LFd-D<223> Ferredoxin Linker LFd-D

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<400> 10<400> 10

3030

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<210> 11<210> 11

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<211> 68<211> 68

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Linker Ferredoxina LFd-R<223> Ferredoxin Linker LFd-R

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<400> 11<400> 11

3131

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<210> 12<210> 12

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<211> 25<211> 25

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

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<223> Oligonucleótido Int-D<223> Oligonucleotide Int-D

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<400> 12<400> 12

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccgcgttgtt tcatcaagcc ttacg

\hfill

25

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ccgcgttgtt tcatcaagcc ttacg

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

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<223> Oligonucleótido Int-R<223> Oligonucleotide Int-R

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<400> 13<400> 13

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aaaacccgtc ctcagttcgg attgc

\hfill

25

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aaaacccgtc ctcagttcgg attgc

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25

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

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<223> Oligonucleótido celYlD<223> celYlD oligonucleotide

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcccatggga aagccaatgt ggcgttgtt

\hfill

29

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gcccatggga aagccaatgt ggcgttgtt

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29

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

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<223> Oligonucleótido celYR<223> celYR oligonucleotide

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<400> 15<400> 15

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\hskip-.1em\dddseqskip

gctctagatt atttaccgcg cgccaacatc a

\hfill

31

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gctctagatt atttaccgcg cgccaacatc a

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31

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<210> 16<210> 16

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

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<223> Oligonucleótido celY2D<223> celY2D oligonucleotide

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<400> 16<400> 16

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcccatggcg aacggctggg aaatctataa a

\hfill

31

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gcccatggcg aacggctggg aaatctataa a

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31

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<211> 31<211> 31

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

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<223> Oligonucleótido celYTR<223> celYTR oligonucleotide

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<400> 17<400> 17

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcatctagat atttaccgcg cgccaacatc a

\hfill

31

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gcatctagat atttaccgcg cgccaacatc a

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31

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<210> 18<210> 18

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<211> 32<211> 32

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

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<223> Oligonucleótido TetraXX-D<223> Oligonucleotide TetraXX-D

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<400> 18<400> 18

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggtctagata aaccactgga tggagaatat tt

\hfill

32

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ggtctagata aaccactgga tggagaatat tt

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32

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<210> 19<210> 19

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<211> 38<211> 38

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

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<223> Oligonucleótido CelY TetraXX-R<223> CelY oligonucleotide TetraXX-R

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<400> 19<400> 19

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgtctagatt agctagcccc tggctccttc ccagcctg

\hfill

38

 \ hskip-.1em \ dddseqskip 

cgtctagatt agctagcccc tggctccttc ccagcctg

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38

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<210> 20<210> 20

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<211> 38<211> 38

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

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<223> Oligonucleótido Cel1Z-D2<223> Oligonucleotide Cel1Z-D2

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<400> 20<400> 20

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\hskip-.1em\dddseqskip

gctacgatca tgagcgttga accgttatcc gttaacgg

\hfill

38

 \ hskip-.1em \ dddseqskip 

gctacgatca tgagcgttga accgttatcc gttaacgg

 \ hfill 

38

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<210> 21<210> 21

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<211> 33<211> 33

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<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Oligonucleótido Cel1Z-R2<223> Oligonucleotide Cel1Z-R2

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<400> 21<400> 21

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgtctagatc aattagttac agctaccaac ctg

\hfill

33

 \ hskip-.1em \ dddseqskip 

cgtctagatc aattagttac agctaccaac ctg

 \ hfill 

33

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<210> 22<210> 22

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<211> 26<211> 26

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Oligonucleótido CelZL-R<223> Oligonucleotide CelZL-R

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<400> 22<400> 22

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgtctagagg tggtatcggt tgacgg

\hfill

26

 \ hskip-.1em \ dddseqskip 

cgtctagagg tggtatcggt tgacgg

 \ hfill 

26

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<210> 23<210> 23

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<211> 26<211> 26

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

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<223> Oligonucleótido TXXL-D<223> Oligonucleotide TXXL-D

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<400> 23<400> 23

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgtctagaaa accactggat ggagaa

\hfill

26

 \ hskip-.1em \ dddseqskip 

cgtctagaaa accactggat ggagaa

 \ hfill 

26

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<210> 24<210> 24

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<211> 31<211> 31

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> oligonucleótido TXXL-R<223> oligonucleotide TXXL-R

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<400> 24<400> 24

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggtggtgtca gtccctggct ccttcccagc c

\hfill

31

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ggtggtgtca gtccctggct ccttcccagc c

 \ hfill 

31

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<210> 25<210> 25

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<211> 31<211> 31

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

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<223> Oligonucleótido TCBD<223> TCBD oligonucleotide

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<400> 25<400> 25

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\hskip-.1em\dddseqskip

gaaggagcca gggactgaca ccaccgttga c

\hfill

31

 \ hskip-.1em \ dddseqskip 

gaaggagcca gggactgaca ccaccgttga c

 \ hfill 

31

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<210> 26<210> 26

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<211> 50<211> 50

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Fragmento que codifica GFP empleada en Ye y col (2001)<223> Fragment encoding GFP used in Ye et al (2001)

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<400> 26<400> 26

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccatgggcaa gggcgaggaa ctgttcactg gcgtggtccc aatcctggtg

\hfill

50

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ccatgggcaa gggcgaggaa ctgttcactg gcgtggtccc aatcctggtg

 \ hfill 

fifty

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<210> 27<210> 27

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<211> 16<211> 16

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Fragmento de péptido sintético de GFP empleada por Ye y col (2001)<223> Fragment of synthetic peptide of GFP used by Ye et al (2001)

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<400> 27<400> 27

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310310

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<210> 28<210> 28

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<211> 50<211> 50

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<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Fragmento que codifica de GFP en el presente trabajo<223> Fragment encoding GFP in the present work

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<400> 28<400> 28

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccatgagtaa aggtgaagaa ctttttactg gagtagttcc tattcgtgcc

\hfill

50

 \ hskip-.1em \ dddseqskip 

ccatgagtaa aggtgaagaa ctttttactg gagtagttcc tattcgtgcc

 \ hfill 

fifty

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<210> 29<210> 29

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<211> 16<211> 16

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Artificial<213> Artificial

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Fragmento de péptido sintético de GFP en el presente trabajo<223> Fragment of synthetic peptide of GFP in the present work

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<400> 29<400> 29

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3232

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<210> 30<210> 30

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<211> 1177<211> 1177

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> producto de PCR del gen CelY clonado en pGEM-T Easy<223> PCR product of the cloned CelY gene in pGEM-T Easy

         \newpage\ newpage
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<400> 30<400> 30

3333

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<210> 31<210> 31

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<211> 927<211> 927

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Dominio catalítico de la enzima celY (nucleótidos 70-996)<223> Catalytic domain of celY enzyme (nucleotides 70-996)

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<400> 31<400> 31

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

343. 4

         \newpage\ newpage
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<210> 32<210> 32

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<211> 69<211> 69

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Secuencia del péptido de secreción del gen CelY (nucleótidos 1-69)<223> Secretion Peptide Sequence of the CelY gene (nucleotides 1-69)

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<400> 32<400> 32

3535

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<210> 33<210> 33

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<211> 51<211> 51

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<213> Artificial<213> Artificial

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Secuencia que codifica para el péptido de Ferredoxina<223> Sequence coding for the Ferredoxin peptide

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<400> 33<400> 33

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\hskip-.1em\dddseqskip

aatgttcaag ccttatttgg tctaaaatct gaacgaggtg gacgtataac t

\hfill

51

 \ hskip-.1em \ dddseqskip 

aatgttcaag ccttatttgg tctaaaatct gaacgaggtg gacgtataac t

 \ hfill 

51

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

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<210> 34<210> 34

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<211> 17<211> 17

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<212> PRT<212> PRT

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<213> Artificial<213> Artificial

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Péptido de ferredoxina aminoácidos 29-48<223> Ferredoxin amino acid peptide 29-48

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<400> 34<400> 34

3636

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<210> 35<210> 35

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<211> 120<211> 120

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

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<223> Secuencia que codifica para el dominio de tetramerización p53<223> Sequence coding for the p53 tetramerization domain

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<400> 35<400> 35

3737

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<210> 36<210> 36

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<211> 42<211> 42

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Péptido del dominio de tetramerización p53<223> Domain Peptide p53 tetramerization

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<400> 36<400> 36

3838

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<210> 37<210> 37

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<211> 1194<211> 1194

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

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<223> Plásmido intermedio pPLA-Yi<223> Intermediate plasmid pPLA-Yi

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<400> 37<400> 37

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3939

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<210> 38<210> 38

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<211> 1176<211> 1176

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Plásmido Intermedio pPLA-Yg<223> Intermediate Plasmid pPLA-Yg

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<400> 38<400> 38

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4040

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<210> 39<210> 39

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<211> 1185<211> 1185

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Plásmido intermedio pPLA-Yf<223> Intermediate plasmid pPLA-Yf

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<400> 39<400> 39

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4242

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<210> 40<210> 40

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<211> 1262<211> 1262

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Plásmido Intermedio pPLA-Yt<223> Intermediate Plasmid pPLA-Yt

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<400> 40<400> 40

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

4343

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<210> 41<210> 41

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<211> 1116<211> 1116

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Plásmido Ygt<223> Ygt plasmid

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<400> 41<400> 41

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

4444

45Four. Five

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<210> 42<210> 42

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<211> 371<211> 371

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Proteína Quimérica Ygt<223> Ygt Chimeric Protein

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<400> 42<400> 42

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4646

4747

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<210> 43<210> 43

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<211> 1285<211> 1285

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Secuencia del gen que codifica la enzima Cel1Z nativa<223> Sequence of the gene encoding the native Cel1Z enzyme

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<400> 43<400> 43

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4848

4949

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<210> 44<210> 44

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<211> 129<211> 129

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Secuencia que codifica el péptido de secreción Cel1Z (aminoácidos 4-129)<223> Sequence encoding the peptide of Cel1Z secretion (amino acids 4-129)

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<400> 44<400> 44

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50fifty

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<210> 45<210> 45

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<211> 867<211> 867

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Secuencia que codifica el dominio catalítico de Cel1Z (nucleótidos 130-996)<223> Sequence encoding the domain Cel1Z catalytic (nucleotides 130-996)

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<400> 45<400> 45

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5151

5252

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<210> 46<210> 46

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<211> 102<211> 102

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Secuencia que codifica el brazo de separación de Cel1Z (nucleótidos 997-1099)<223> Sequence encoding the arm of Cel1Z separation (nucleotides 997-1099)

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<400> 46<400> 46

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5353

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<210> 47<210> 47

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<211> 184<211> 184

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Secuencia que codifica el dominio de unión a celulosa de Cel1Z (nucleótidos 1100-1282)<223> Sequence encoding the domain of cellulose binding of Cel1Z (nucleotides 1100-1282)

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<400> 47<400> 47

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5454

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<210> 48<210> 48

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<211> 426<211> 426

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Artificial<213> Artificial

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<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Péptido nativo Cel1Z<223> Cel1Z native peptide

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<400> 48<400> 48

5555

5656

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<210> 49<210> 49

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<211> 43<211> 43

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<212> PRT<212> PRT

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<213> Artificial<213> Artificial

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> péptido de secreción Cel1Z<223> Cel1Z secretion peptide

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<400> 49<400> 49

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

5757

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<210> 50<210> 50

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<211> 289<211> 289

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<212> PRT<212> PRT

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<213> Artificial<213> Artificial

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Péptido del dominio catalítico Cel1Z<223> Catalytic Domain Peptide Cel1Z

         \newpage\ newpage
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<400> 50<400> 50

5858

5959

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<210> 51<210> 51

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<211> 34<211> 34

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<212> PRT<212> PRT

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<213> Artificial<213> Artificial

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> péptido del brazo de separación Cel1Z<223> separation arm peptide Cel1Z

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<400> 51<400> 51

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

6060

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<210> 52<210> 52

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<211> 60<211> 60

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<212> PRT<212> PRT

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<213> Artificial<213> Artificial

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Péptido del dominio de unión a celulosa de Cel1Z<223> Peptide binding domain a Cel1Z cellulose

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<400> 52<400> 52

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

6161

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<210> 53<210> 53

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<211> 1294<211> 1294

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<213> Artificial<213> Artificial

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Endoglucanasa Z quimérica (Zt) fusionada al dominio de tetramerización y sin péptido de secreción.<223> Chimeric Endoglucanase Z (Zt) fused to the tetramerization domain and without peptide of secretion.

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<400> 53<400> 53

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

6262

6363

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<210> 54<210> 54

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<211> 468<211> 468

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<212> PRT<212> PRT

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<213> Artificial<213> Artificial

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Zt secuencia deducida de aminoácidos<223> Zt sequence deduced from amino acids

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<400> 54<400> 54

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

6464

6565

6666

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<210> 55<210> 55

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<211> 1333<211> 1333

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<213> Artificial<213> Artificial

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Plásmido Zgt<223> Zgt plasmid

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<400> 55<400> 55

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

6767

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<210> 56<210> 56

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<211> 442<211> 442

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<212> PRT<212> PRT

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<213> Artificial<213> Artificial

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Proteína Quimérica Zgt<223> Zgt Chimeric Protein

         \newpage\ newpage
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<400> 56<400> 56

6868

6969

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<210> 57<210> 57

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<211> 3290<211> 3290

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<213> Artificial<213> Artificial

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Plásmido intermedio (secuencia completa) pPLAg<223> Intermediate plasmid (sequence complete) pPLAg

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<400> 57<400> 57

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

7070

7171

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<210> 58<210> 58

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<211> 816<211> 816

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<213> Artificial<213> Artificial

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Gen de resistencia a la Kanabicina<223> Gene of resistance to Kanabicin

         \newpage\ newpage
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<400> 58<400> 58

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

7272

Claims (48)

1. Construcción nucleotídica caracterizada por comprender1. Nucleotide construction characterized by understanding

a.to.

Una secuencia de DNA quimérico que comprende una secuencia de DNA o proteína simultáneamente fusionada a dos fragmentos sintéticos de ADN codificante que consisten en i) una versión modificada de la secuencia que codifica para los primeros 15 aminoácidos de la GFP y ii) la secuencia que codifica para el dominio de tetramerización de la p53.A chimeric DNA sequence comprising a DNA sequence or protein simultaneously fused to two synthetic fragments of Coding DNA consisting of i) a modified version of the sequence encoding the first 15 amino acids of the GFP and ii) the sequence encoding the tetramerization domain of p53.

b.b.

precedida por un triplete de inicio de la traducción en fase de lectura,preceded by a starting triplet of reading translation

c.C.

clonada bajo el control de un promotor y secuencia líder funcionales en plastidios,cloned under the control of a promoter and leading functional sequence in plastids,

d.d.

un triplete de terminación de la traducción ya translation termination triplet and

e.and.

una región no codificante que contenga señales de terminación de la transcripción reconocidas en el cloroplasto.a non-coding region containing termination signals from the Transcription recognized in the chloroplast.

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

2. Construcción nucleotídica según reivindicación 1 caracterizada porque dicha proteína es una enzima.2. Nucleotide construction according to claim 1 characterized in that said protein is an enzyme. 3. Construcción nucleotídica según reivindicación 2 caracterizada porque dicha enzima es una celulasa.3. Nucleotide construction according to claim 2 characterized in that said enzyme is a cellulase. 4. Construcción nucleotídica según reivindicación 3 caracterizada porque dicha celulasa es una endoglucanasa.4. Nucleotide construction according to claim 3 characterized in that said cellulase is an endoglucanase. 5. Construcción nucleotídica según reivindicación 4 caracterizada porque dichas enzimas son CelY y/o Cel1Z.5. Nucleotide construction according to claim 4 characterized in that said enzymes are CelY and / or Cel1Z. 6. Construcción nucleotídica según reivindicación 5 caracterizada porque CelY y Cel1Z carecen del dominio que codifica para el péptido de secreción de las mismas.6. Nucleotide construction according to claim 5 characterized in that CelY and Cel1Z lack the domain that codes for the secretion peptide thereof. 7. Construcción nucleotídica según reivindicaciones anteriores caracterizada porque los fragmentos sintéticos de ADN codificante de la etapa a) presentan bajo contenido en pares GC.7. Nucleotide construction according to previous claims characterized in that the synthetic DNA fragments encoding stage a) have low GC pair content. 8. Construcción nucleotídica según reivindicación 7 caracterizada porque dicho contenido en GC es del 40%.8. Nucleotide construction according to claim 7 characterized in that said GC content is 40%. 9. Construcción nucleotídica según reivindicaciones anteriores caracterizada porque la secuencia que codifica para la versión modificada de los primeros 15 aminoácidos de la GFP consiste en Seq Id No. 28.9. Nucleotide construction according to previous claims characterized in that the sequence coding for the modified version of the first 15 amino acids of the GFP consists of Seq Id No. 28. 10. Construcción nucleotídica según reivindicaciones anteriores caracterizada porque dicha fusión se lleva a cabo en el extremo N-terminal de la proteína o secuencia de DNA cuya expresión se desea incrementar.10. Nucleotide construction according to previous claims characterized in that said fusion is carried out at the N-terminal end of the protein or DNA sequence whose expression is to be increased. 11. Construcción nucleotídica según reivindicaciones anteriores caracterizada porque la secuencia del dominio de tetramerización de la p53 consiste en Seq Id No. 35.11. Nucleotide construction according to previous claims characterized in that the sequence of the tetramerization domain of p53 consists of Seq Id No. 35. 12. Construcción nucleotídica según reivindicaciones anteriores caracterizada porque la fusión del dominio de tetramerización de la p53 se realiza dentro del brazo de separación, en sustitución del brazo de separación o en el extremo C-terminal.12. Nucleotide construction according to previous claims characterized in that the fusion of the tetramerization domain of p53 is carried out within the separation arm, replacing the separation arm or at the C-terminal end. 13. Construcción nucleotídica según reivindicación 12 caracterizada porque dicha fusión se realiza en el extremo C-terminal cuando el enzima a expresar no presenta dominios funcionales separados y en el brazo de separación o en sustitución del mismo cuando el enzima a expresar presenta dominios funcionales separados.13. Nucleotide construction according to claim 12 characterized in that said fusion is carried out at the C-terminal end when the enzyme to be expressed does not have separate functional domains and in the separation arm or in replacement thereof when the enzyme to be expressed has separate functional domains. 14. Construcción nucleotídica según reivindicaciones anteriores caracterizada porque el promotor y secuencia líder son los del gen psbA.14. Nucleotide construction according to previous claims characterized in that the promoter and leader sequence are those of the psbA gene. 15. Fragmento sintético de ADN codificante de la construcción nucleotídica de la reivindicación 1, caracterizado por consistir en una versión modificada de la secuencia que codifica para los primeros 15 aminoácidos de la GFP.15. Synthetic DNA fragment encoding the nucleotide construct of claim 1, characterized in that it consists of a modified version of the sequence encoding the first 15 amino acids of the GFP. 16. Fragmento sintético de ADN codificante según reivindicación 15 caracterizado por consistir en Seq Id No. 28.16. Synthetic fragment of coding DNA according to claim 15 characterized in that it consists of Seq Id No. 28. 17. Fragmento sintético de ADN codificante, caracterizado por consistir en el dominio de tetramerización de la p53.17. Synthetic fragment of coding DNA, characterized in that it consists of the tetramerization domain of p53. 18. Fragmento sintético de ADN codificante según reivindicación 17 caracterizado por consistir en Seq Id No. 35.18. Synthetic fragment of coding DNA according to claim 17 characterized in that it consists of Seq Id No. 35. 19. Método para incrementar la expresión de proteínas en plantas, mediante la integración de genes en el genoma del cloroplasto vegetal caracterizado porque comprende las siguientes etapas:19. Method for increasing protein expression in plants, by integrating genes into the genome of the plant chloroplast characterized in that it comprises the following stages:

a.to.

Transformación de una célula y/o planta con la construcción nucleotídica según reivindicaciones 1 a 13.Transformation of a cell and / or plant with the nucleotide construction according to claims 1 to 13.

b.b.

Hacer crecer dichas células y/o plantas bajo condiciones en las que la secuencia de DNA obtenida en la etapa a) se transcriba.Do grow said cells and / or plants under conditions in which the DNA sequence obtained in step a) is transcribed.

c.C.

Si se desea, recuperar la proteína quimérica, codificada por la construcción nucleotídica de a), expresada.Whether want, recover the chimeric protein, encoded by the a) nucleotide construction, expressed.

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

20. Método según reivindicación 19 caracterizado porque las proteínas quiméricas cuya expresión se ha visto incrementada se mantienen funcionalmente activas.20. Method according to claim 19 characterized in that the chimeric proteins whose expression has been increased remain functionally active. 21. Método según reivindicaciones 19-20 caracterizado porque el incremento de la expresión génica es superior al obtenido a través de la suma de los incrementos obtenidos al fusionar los fragmentos sintéticos de ADN codificante según reivindicaciones 15-16 o 17-18.21. Method according to claims 19-20 characterized in that the increase in gene expression is greater than that obtained through the sum of the increments obtained by fusing the synthetic fragments of coding DNA according to claims 15-16 or 17-18. 22. Método según reivindicaciones 20-21 caracterizado porque el incremento de la expresión génica es al menos dos órdenes de magnitud mayor que al expresar el producto génico solo, 2 veces mayor que al expresar el producto génico fusionado a GFP y 10 veces mayor que al expresar el producto génico fusionado a p53.22. Method according to claims 20-21 characterized in that the increase in gene expression is at least two orders of magnitude greater than when expressing the gene product alone, 2 times greater than when expressing the gene product fused to GFP and 10 times greater than at Express the gene product fused to p53. 23. Célula caracterizada por comprender la construcción nucleotídida según cualquiera de las reivindicaciones
1-14.23. Cell characterized by comprising the nucleotide construction according to any of the claims
1-14. 24. Célula según reivindicación 23 caracterizada por ser una célula de planta.24. Cell according to claim 23 characterized by being a plant cell. 25. Célula según reivindicación 24 caracterizada porque la proteína quimérica expresada a partir de la secuencia de DNA quimérico de la construcción nucleotídica según reivindicaciones 1-13, corresponde a un porcentaje entre el 25-30% del total de proteína soluble extraíble (TSP).25. Cell according to claim 24 characterized in that the chimeric protein expressed from the chimeric DNA sequence of the nucleotide construct according to claims 1-13, corresponds to a percentage between 25-30% of the total soluble extractable protein (TSP). 26. Planta transgénica caracterizada por comprender la construcción nucleotídica según reivindicaciones 1-14.26. Transgenic plant characterized by comprising the nucleotide construction according to claims 1-14. 27. Planta transgénica según reivindicación 26 caracterizada por presentar como producto mayoritario extraíble la proteína de interés codificada por la secuencia de DNA quimérico de la construcción nucleotídica según reivindicaciones 1-14.27. A transgenic plant according to claim 26, characterized in that the protein of interest encoded by the chimeric DNA sequence of the nucleotide construction according to claims 1-14 is a removable majority product. 28. Planta transgénica según reivindicación 27 caracterizada porque la proteína quimérica expresada a partir de la secuencia de DNA quimérico constituye entre el 25-30% del total de proteína soluble extraíble (TSP).28. Transgenic plant according to claim 27 characterized in that the chimeric protein expressed from the chimeric DNA sequence constitutes between 25-30% of the total soluble extractable protein (TSP). 29. Planta transgénica según reivindicaciones 26-28 caracterizada porque la acumulación de la proteína de interés codificada por la secuencia de DNA quimérico como producto mayoritario extraíble se produce en todas las hojas de la planta independientemente de su estado de maduración.29. Transgenic plant according to claims 26-28, characterized in that the accumulation of the protein of interest encoded by the chimeric DNA sequence as a removable major product occurs in all the leaves of the plant regardless of their maturation state. 30. Planta transgénica según reivindicación 29 caracterizada porque dicha acumulación es entre un 5% y un 10% mayor en las hojas maduras que en las hojas jóvenes, en términos relativos a la proteína extraíble total.30. Transgenic plant according to claim 29 characterized in that said accumulation is between 5% and 10% higher in mature leaves than in young leaves, in terms relative to the total extractable protein. 31. Semilla de planta caracterizada por ser producida por las plantas según reivindicaciones 26-30.31. Plant seed characterized by being produced by the plants according to claims 26-30. 32. Proteína quimérica obtenida por el método según reivindicaciones 19-22.32. Chimeric protein obtained by the method according to claims 19-22. 33. Proteína quimérica según reivindicación 32 caracterizada por ser un enzima.33. Chimeric protein according to claim 32 characterized in that it is an enzyme. 34. Proteína quimérica según reivindicación 33 caracterizada por ser CelY quimérica Seq Id No. 42.34. Chimeric protein according to claim 33 characterized in that it is chimeric CelY Seq Id No. 42. 35. Proteína quimérica según reivindicación 33 caracterizada por ser Cel1Z quimérica Seq Id No. 56.35. Chimeric protein according to claim 33 characterized in that it is chimeric Cel1Z Seq Id No. 56. 36. Uso de las plantas según reivindicaciones anteriores como biofactorías.36. Use of the plants according to claims previous as bio-factories. 37. Uso de las plantas según reivindicaciones anteriores para la producción masiva de enzimas de interés industrial.37. Use of the plants according to claims above for the mass production of enzymes of interest industrial. 38. Uso de las plantas según reivindicaciones anteriores en la industria del biodiesel.38. Use of the plants according to claims previous in the biodiesel industry. 39. Uso del fragmento sintético según reivindicación 15 para la obtención de productos quiméricos de fusión en el cloroplasto cuya expresión es más estable respecto a variantes que carecen de este fragmento.39. Use of the synthetic fragment according to claim 15 for obtaining chimeric products of fusion in the chloroplast whose expression is more stable with respect to variants that lack this fragment. 40. Uso del fragmento sintético según reivindicaciones 17 y 18 para incrementar la expresión génica y acumulación del producto en el cloroplasto.40. Use of the synthetic fragment according to claims 17 and 18 to increase gene expression and accumulation of the product in the chloroplast. 41. Uso del método según reivindicaciones 19-22 para la producción de proteínas quiméricas en plantas genéticamente modificadas (PGMs).41. Use of the method according to claims 19-22 for the production of chimeric proteins in genetically modified plants (PGMs). 42. Uso del método según reivindicación 41 caracterizado porque la proteína quimérica es CelY quimérica (Seq Id No. 42).42. Use of the method according to claim 41 characterized in that the chimeric protein is chimeric CelY (Seq Id No. 42). 43. Uso del método según reivindicación 41 caracterizado porque la proteína quimérica es CelZ quimérica (Seq Id No. 56).43. Use of the method according to claim 41 characterized in that the chimeric protein is chimeric CelZ (Seq Id No. 56). 44. Uso del método según reivindicaciones 41-43 caracterizado porque dichas proteínas quiméricas presentan propiedades mejoradas de estabilidad del producto durante la reacción y actividad sobre sustrato insoluble respecto a la enzima nativa.44. Use of the method according to claims 41-43 characterized in that said chimeric proteins have improved product stability properties during the reaction and activity on insoluble substrate with respect to the native enzyme. 45. Uso del método según reivindicaciones 19-22 para la producción de enzimas quiméricas que no requieren ser purificadas.45. Use of the method according to claims 19-22 for the production of chimeric enzymes that They do not need to be purified. 46. Uso del método según reivindicaciones 41-45 en las industrias de combustibles, alimentación, producción animal, textil y papelera.46. Use of the method according to claims 41-45 in the fuel industries, food, animal production, textile and paper. 47. Uso del método según reivindicaciones 41-45 para la generación de bioetanol de segunda generación.47. Use of the method according to claims 41-45 for the generation of second bioethanol generation. 48. Uso de las proteínas quiméricas según reivindicaciones 34 y/o 35 para la conversión de celulosa en etanol.48. Use of chimeric proteins according to claims 34 and / or 35 for the conversion of cellulose into ethanol.