ES2333952T3 - Anticuerpo para el factor de crecimiento humano de tipo insulinico. - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo o uno de sus fragmentos de anticuerpo, que se une específicamente a IGF-I humano e IGF-II humano para inhibir la función de control de la proliferación, diferenciación y/o apoptosis de células epiteliales tanto de IGF-I humano como de IGF-II humano y puede inhibir tanto IGF-I humano como IGF-II humano equivalentemente, y la actividad de unión del anticuerpo es una constante de unión de 5 x 10 9 M -1 o más medida con un biosensor BIACORE, donde las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada (V H) del anticuerpo o uno de sus fragmentos de anticuerpo comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por los SEQ ID NO: 5, 6 y 7, respectivamente, y las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo o uno de sus fragmentos de anticuerpo comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por los SEQ ID NO: 8, 9 y 10, respectivamente.
Description
Anticuerpo para el factor de crecimiento humano
de tipo insulínico.
La presente invención se refiere a un anticuerpo
para el factor de crecimiento de tipo insulínico (referido en
adelante como IGF) y a un fragmento de anticuerpo derivado del
anticuerpo. La presente invención se refiere adicionalmente a un
ADN que codifica dicho anticuerpo y dicho fragmento de anticuerpo.
La presente invención se refiere a un vector recombinante que
comprende dicho ADN y a un transformante obtenido introduciendo
dicho vector recombinante en una célula anfitriona. La presente
invención se refiere adicionalmente a métodos para producir dicho
anticuerpo y fragmento de anticuerpo utilizando dicho transformante,
y a los usos diagnósticos, preventivos y terapéuticos de dicho
anticuerpo y fragmento de anticuerpo.
El IGF es un factor que juega un papel muy
importante en el control de la proliferación, diferenciación y
muerte celular (apoptosis) de células epiteliales de la mama, la
próstata, el pulmón, el colon y órganos similares, y su acción se
lleva a cabo por medio de un receptor IGF (referido en adelante como
IGF-R) existente sobre la superficie celular
(Endocrine Reviews, 16, 3-34, 1995). Asimismo, se
sabe que existe una proteína denominada proteína de unión a IGF
(referida en adelante como IGFBP) y que regula la actividad de IGF
promoviéndola o inhibiéndola (Endocrine Reviews, 16,
3-34, 1995).
En cuanto al IGF, existen dos tipos,
IGF-I e IGF-II, y cada uno de ellos
comprende un polipéptido de cadena sencilla y tiene una homología
de aproximadamente 40% con una proinsulina precursora de la insulina
a nivel de aminoácidos (Advances in Cancer Research, 68,
183-223, 1996). En cuanto al IGF-R
existen tres tipos de receptores de insulina, receptor
IGF-I (en adelante referido como
IGF-IR) y receptor IGF-II (en
adelante referido como IGF-IIR). Cada receptor de
insulina e IGF-R pertenece a la familia de
receptores de tipo tirosina quinasa y existe sobre la membrana
celular en forma de un heterotetrámero \alpha_{2}\beta_{2},
después de formar el enlace S-S de una subunidad
\alpha de 135 kDa y una subunidad \beta de 95 kDa formadas a
partir de un precursor de cadena sencilla como resultado de su
digestión con una proteasa (Endocrine Reviews, 16,
143-163, 1995, Breast Cancer Research &
Treatment, 47, 235-253, 1998). El receptor de
insulina y el IGF-IR tienen una homología de
aproximadamente 60%, y la insulina y el IGF-IR, y el
IGF y el receptor de insulina, se unen entre sí aunque débilmente y
actúan (Journal of Biological Chemistry, 263,
11486-11492, 1988, Journal of Biological Chemistry,
268, 7393-7400, 1993). Se ha demostrado la
existencia de un receptor híbrido que comprende la subunidad
\alpha\beta del receptor de insulina y la subunidad
\alpha\beta de IGF-IR, y se considera que el
receptor híbrido tiene una afinidad de unión mayor por
IGF-I que por la insulina y actúa como
IGF-IR, pero su papel intravital no está claro
(Endocrine Reviews, 16, 3-34, 1995, Endocrine
Reviews, 16, 143-163, 1995). El
IGF-IIR tiene una estructura de cadena sencilla, y
existen tres regiones de unión al ligando en su región
extracelular. Una de las regiones de unión al ligando es una región
de unión a IGF-II, y las otras dos son regiones que
se unen a proteínas que contienen
manosa-6-fosfato [renina,
proliferina, tiroglobulina, factor de crecimiento transformante
endógeno \beta (TGF-\beta) y similares]
(Endocrine Reviews, 16, 3-34, 1995). Se ha
informado de que el TGF-\beta endógeno es activado
por su unión a IGF-IIR (Breast Cancer &
Treatment, 52, 175-184, 1998, Hormone &
Metabolic Research, 31, 242-246, 1999). El
IGF-IIR no tiene actividad tirosina quinasa y se
une solamente a IGF-II de entre los IGF. Puesto que
IGF-II es degradado por su unión a
IGF-IIR, se considera que IGF-IIR
actúa como antagonista de IGF-II (Breast Cancer
Research & Treatment, 52, 175-184, 1998).
Hasta ahora se conocen diez tipos de IGFBP
(IGFBP-1 a IGFBP-10), y de ellos
seis tipos (IGFBP-1 a IGFBP-6)
tienen una elevada afinidad de unión por IGF (Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America, 94,
12981-12986, 1997). IGFBP-1 a
IGFBP-6 tienen una elevada homología de 40 a 60% a
nivel de aminoácidos. Se ha revelado que IGFBP regula la función de
IGF al experimentar diferentes modificaciones
post-traduccionales tales como degradación y
fosforilación y ejerciendo de ese modo influencia sobre la
transferencia de IGF, la inhibición de la degradación y la unión al
receptor (International Journal of Biochemistry & Cell Biology,
28, 619-637, 1996, Endocrine Reviews, 18,
801-831, 1997). IGFBP-1,
IGFBP-2, IGFBP-3 y
IGFBP-5 tienen un caso de promoción de la acción de
IGF y un caso de inhibición de la misma, y las acciones de
IGFBP-2, IGFBP-3 e
IGFBP-5 sobre IGF están reguladas por la degradación
de IGFBP, y la acción de IGFBP-1 por la
fosforilación de IGFBP-1, respectivamente
(Endocrine Reviews, 16, 3-34,1995, International
Journal of Biochemistry & cell Biology, 28,
619-637, 1996, Endocrinology & Metabolism
Clinics of North America, 25, 591-614, 1996).
Además, la afinidad de unión de IGFBP-1,
IGFBP-2, IGFBP-3 y
IGFBP-5 por IGF se reduce cuando se unen a un
receptor específico existente sobre la membrana celular. Como
resultado, se disocian IGFBP e IGF para formar IGF libre (Endocrine
Reviews, 16, 3-34, 1995, International Journal of
Biochemistry & Cell Biology, 28, 619-637, 1996,
Endocrinology & Metabolism Clinics of North America, 25,
591-614, 1996). Por otra parte,
IGFBP-4 e IGFBP-6 tienen actividad
inhibidora de la acción de IGF (Endocrine Reviews, 16,
3-34, 1995, Endocrinology & Metabolism Clinics
of North America, 25, 591-614, 1996). En el ámbito
intravital, 90% o más del IGF en sangre se une a
IGFBP-3 y una subunidad lábil al ácido, y existe en
forma de un complejo de elevado peso molecular de aproximadamente
150 kDa, inhibiendo de ese modo la degradación de IGF y su drenaje a
la región extra-vascular (Journal of Biological
Chemistry, 264, 11843-11848, 1989).
\newpage
Tanto IGF-I como
IGF-II muestran una potente actividad que promueve
la proliferación para un gran número de células cancerosas
(sarcoma, leucemia, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de
pulmón, cáncer de colon, cáncer gástrico, cáncer esofágico, cáncer
hepático, cáncer pancreático, carcinoma renal, cáncer de glándula
tiroides, cáncer de cerebro, cáncer ovárico, cáncer uterino)
(British Journal of Cancer, 65, 311-320, 1992,
Anticancer Research, 11, 1591-1595, 1991, Annals of
Internal Medicine, 122, 54-59, 1995, Oncology, 54,
502-507, 1997, Endocrinology, 137,
1764-1774, 1996, European Journal of Haematology,
62, 191-198, 1999), y se ha identificado una
expresión en exceso de IGF en un gran número de células cancerosas
(British Journal of Cancer, 65, 311-320, 1992).
Asimismo, se ha informado de que las cantidades de expresión de
IGF-II e IGF-IR son mayores en
células cancerosas metastásicas superiores que en células cancerosas
metastásicas inferiores (International Journal of Cancer, 65,
812-820, 1996). Se ha revelado que tales funciones
de IGF aparecen principalmente por medio de IGF-IR
(Endocrinology, 136, 4298-4303, 1995, Oncogene, 28,
6071-6077, 1999), pero IGF-II
también actúa por medio del receptor de insulina en células de
cáncer de mama (Oncogene, 18, 2471-2479, 1999).
Se ha informado de que, en el caso de los
ratones transgénicos que expresan en exceso IGF-I en
células epiteliales de próstata, aproximadamente 50% de ellos
desarrollan cáncer de próstata al cabo de aproximadamente 6 meses
(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America, 97, 3455-3460, 2000). También,
se ha demostrado que la expresión de IGF-I e
IGF-IR aumenta por la adquisición de la capacidad de
proliferación independiente de andrógenos en un ratón modelo de
transplante de células de cáncer de próstata humano (Cancer
Research, 61, 6276-6280, 2001).
El IGF también está implicado en la
proliferación de células cancerosas que reaccionan mutuamente con
otros factores. Se ha informado de que la actividad de
IGF-I es incrementada y la expresión de
IGF-I y IGF-IR es inducida por
estrógenos en células de cáncer de mama (Endocrinology, 136,
1296-1302, 1995, Journal of Biological Chemistry,
265, 21172-21178, 1990, Journal of Steroid
Biochemistry & Molecular Biology, 41, 537-540,
1992, British Journal of Cancer, 75, 251-257,
1997). Además, se sabe que el estrógeno inhibe la producción de
IGFBP, reduce la expresión de IGF-IIR, e incrementa
la expresión de enzima de degradación de IGFBP en células de cáncer
de mama (Biochemical & Biophysical Research Communications, 193,
467-473, 1993, Molecular Endocrinology, 5,
815-822, 1991).
Por el contrario, también se ha informado de que
IGF-I incrementa la expresión del receptor de
estrógeno (Endocrinology, 127, 2679-2686, 1990,
Journal of Cellular Biochemistry, 52, 196-205,
1993), y de que IGF-I e IGF-II
incrementan la actividad de la estrona sulfatasa que hidroliza el
sulfato de estrona a estrona, en células de cáncer de mama
(International Journal of Molecular Medicine, 4,
175-178, 1999).
Además, IGF actúa en cooperación con un factor
de crecimiento de células epiteliales (factor de crecimiento
epidérmico; referido en adelante como EGF). En células de cáncer
cervical, el EGF aumenta la expresión de IGF-II, e
IGF aumenta la actividad de crecimiento de EGF (Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America, 92,
11970-11974, 1995, Cancer Research, 56,
1761-1765, 1996). También se sabe que EGF aumenta
la cantidad de IGF libre inhibiendo la expresión de
IGFBP-3 y de ese modo tiene un efecto sinérgico
sobre la actividad de crecimiento celular (Cancer Research, 54,
3160-3166, 1994).
Se sabe que la función de numerosos factores que
tienen actividad anti-proliferación celular es
ejercida por inhibición de la actividad de IGF promotora de la
proliferación. La función de TGF-\beta y ácido
retinoico para inhibir la proliferación de células de cáncer de
mama es ejercida por la inhibición de la función de IGF como
resultado de la inducción de la expresión de IGFBP-3
(Journal of Biological Chemistry, 270, 13589-13592,
1995, Cancer Research, 56, 1545-1550, 1996,
Endocrinology, 136, 1219-1226, 1995). Además, la
vitamina D y sus derivados sintéticos inhiben la función de IGF de
promoción de la proliferación de células de cáncer de mama y
células de cáncer de próstata, y la acción se basa en el incremento
de la expresión de IGFBP y la inhibición de la expresión de
IGF-IR e IGF-II (Journal of the
National Cancer Institute, 89, 652-656, 1997,
Journal of Molecular Endocrinology, 20, 157-162,
1998, Journal of Endocrinology, 154, 495-504, 1997,
International Journal of Oncology, 13, 137-143,
1998).
Se ha informado de que los productos del gen
supresor de tumores también tienen influencia en la función de IGF.
Por ejemplo, en células de sarcoma y similares, la proteína p53 de
tipo salvaje induce la expresión de IGFBP-3 e
inhibe la expresión de IGF-II e
IGF-IR (Nature, 377, 646-649, 1995,
Cancer Research, 56, 1367-1373, 1996, DNA & Cell
Biology, 17, 125-131, 1998, Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America, 93,
8318-8323, 1996, Endocrinology, 139,
1101-1107, 1998). En células de cáncer de mama, por
el contrario, se sabe que la proteína p53 es fosforilada por la
función de IGF-I y es transportada desde el núcleo
al citoplasma, perdiendo de ese modo la función de la proteína p53
(International Journal of Cancer, 55, 453-458,
1993). Además de estas, se ha informado de que la expresión de
IGF-R es inhibida por un producto del gen supresor
de tumor de Wilm WT1 (Journal of Biological Chemistry, 269,
12577-12582, 1994, Endocrinology, 140,
4713-4724, 1999), y de que es inhibida la expresión
de un inhibidor del crecimiento derivado de mama (MDGI) por
IGF-I (International Journal of Oncology, 13,
577-582, 1998).
La relación entre el estilo de vida tal como la
ingesta de energía y la oncogénesis ha llamado la atención desde
hace mucho tiempo, y se ha revelado ahora parcialmente basándose en
diferentes ensayos con animales que la ingesta de energía y la
expresión de IGF, además de la oncogénesis, tienen una relación
íntima. En ratas transplantadas de cáncer de próstata, la
proliferación del cáncer es inhibida y la apoptosis es inducida
cuando se restringe la ingesta de energía. Este efecto se
corresponde con la reducción de la concentración de
IGF-I en sangre (Journal of the National Cancer
Institute, 91, 512-523, 1999). Se ha informado de
resultados similares sobre ratones transplantados de cáncer de
mama, y puesto que la función inhibidora de la proliferación no es
observable mediante la administración de IGF-I, se
sugiere que el IGF-I está jugando un papel principal
en la inhibición de la proliferación del cáncer mediante
restricción de la ingesta de energía (Cancer Research, 57,
4667-4672, 1997).
La relevancia del IGF en el cáncer ha sido
examinada también mediante estudios clínicos y epidemiológicos. Se
ha informado de que la concentración de IGF-I en
plasma sanguíneo y suero es elevada en pacientes con cáncer de mama
en comparación con personas sanas (European Journal of Cancer, 29A,
492-497, 1993, Tumori, 80, 212-215,
1994), y la cantidad de IGF-IR en tejido de cáncer
de mama es 10 veces superior que en el tejido normal (Cancer
Research, 53, 3736-3740, 1993). Asimismo, puesto que
se encontró una pérdida de heterocigosidad en el gen
IGF-IIR en aproximadamente 30% de los pacientes con
cáncer de mama, se sugirió que el gen IGF-IIR tiene
una función como gen supresor del cáncer (Breast Cancer Research
& Treatment, 47, 269-281, 1998). Se ha
informado de que las concentraciones de IGF-II,
IGFBP-2 e IGFBP-3 en suero son
elevadas en pacientes con cáncer de colon en comparación con las de
personas sanas (International Journal of Cancer, 57,
491-497, 1994). Además, se ha demostrado que las
concentraciones de IGF-II e IGFBP-2
son elevadas en pacientes de adenoma de colon que se sabe que
progresa a cáncer de colon, pero estas concentraciones se reducen
mediante la extirpación del adenoma (Journal of Clinical
Endocrinology & Metabolism, 85, 3402-3408,
2000). Se ha informado sobre la expresión en exceso de
IGF-II en tejidos de cáncer gástrico (European
Journal of Cancer, 37, 2257-2263, 2001). Se ha
informado de que, en pacientes con cáncer endometrial después de la
menopausia, la concentración de IGF-I en suero es
elevada y la concentración de IGFBP-1 es baja en
comparición con la de personas sanas. Por otra parte, no se
encontró diferencia con respecto a la concentración de
IGFBP-3 (Endocrine Journal, 44,
419-424, 1997). Se ha informado de que, en pacientes
con cáncer de próstata, las concentraciones de IGF-I
e IGFBP-2 son elevadas y la concentración de
IGFBP-3 es baja en suero (British Journal of Cancer,
76, 1115 -1118, 1997, Urology, 54, 603-606, 1999,
Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 76,
1031-1035, 1993, Journal of Clinical Endocrinology
& Metabolism, 77, 229-233, 1993), y la
producción de IGF-II, IGFBP-2,
IGFBP-4 e IGFBP-5 se acelera y la
producción de IGFBP-3 se inhibe en el tejido
canceroso (Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 81,
3774-3782, 1996, Journal of Clinical Endocrinology
& Metabolism, 81, 411 -420, 1996, Journal of Clinical
Endocrinology & Metabolism, 81, 3783-3792,
1996). Se han observado cambios similares en la expresión de
IGF-I e IGFBP también en suero y tejidos cancerosos
de pacientes con cáncer de ovario (Journal of Clinical
Endocrinology & Metabolism, 78, 271-276, 1994,
Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 82,
2308-2313, 1997, British Journal of Cancer, 73,
1069-1073, 1996).
Se ha revelado basándose en estudios
epidemiológicos, que existe relevancia entre el IGF y el IGFBP, y el
riesgo de morbididad del cáncer. Se ha informado de que el elevado
riesgo de morbididad y la elevada concentración de
IGF-I en sangre y la baja concentración de
IGFBP-3 en sangre muestran una correlación positiva
en los cánceres sólidos tales como el cáncer de mama, cáncer de
colon, cáncer de recto, cáncer de próstata y cáncer de pulmón, que
el elevado riesgo de morbididad y la baja concentración de
IGFBP-3 muestran una correlación positiva en la
leucemia infantil, y que el elevado riesgo de morbididad y la
elevada proporción de concentración de IGF-I e
IGFBP-3
(IGF-I/IGFBP-3) muestran una
correlación positiva en el cáncer de mama (Lancet, 351,
1393-1396, 1998, Science, 279,
563-566, 1998, Journal of the National Cancer
Institute, 91, 620-625, 1999, Journal of the
National Cancer Institute, 91, 151-156, 1999,
International Journal of Cancer, 62, 266-270, 1995,
Epidemiology, 9, 570-573, 1998, Breast Cancer
Research & Treatment, 47, 111-120, 1998,
International Journal of Cancer, 83, 15-17, 1999,
International Journal of Cancer, 80, 494-4 9 6,
1999, Britisth Journal of Cancer, 76, 1115-1118,
1997).
También existen informes sobre la relevancia del
IGF para la prognosis del cáncer. En el caso del cáncer de mama, se
ha informado de que la expresión de IGF-IR se
incrementa en un tejido positivo para el receptor de estrógeno o el
receptor de progesterona (Cancer Research, 52,
1036-1039, 1992). Asimismo, existen casos que
informan de que la prognosis se vuelve mala por la expresión de
IGF-IR (Cancer Research, 57,
3079-3083, 1997, Cancer, 58,
1159-1164, 1998). También se ha referido que la
expresión del receptor de estrógeno y la expresión de
IGFBP-3 en el tejido tienen una correlación inversa
(Cancer Research, 52, 5100-5103, 1992, Journal of
Cellular Biochemistry, 52, 196-205, 1993).
Asimismo, se ha encontrado una promoción anómala
de la función de IGF en complicaciones diabéticas tales como la
retinopatía diabética y la nefropatía diabética (Science, 276,
1706-1709, 1997, American Journal of Physiology,
274, F1045-F1053, 1998).
Además, se ha informado de que se observa la
expresión local de IGF-I en membrana sinovial
reumática y también de que el IGF-I está implicado
en la formación del estado mórbido de la artritis reumatoide
(Arthritis & Rheumatism, 32, 66-71, 1989,
Journal of Rheumatology, 22, 275-281, 1995, Journal
of Clinical Endocrinology & Metabolism, 81,
150-155, 1996, Arthritis & Rheumatism, 39,
1556-1565, 1996).
Como se ha descrito antes, las proteínas de la
familia del IGF (IGF, IGF-R, IGFBP) incluyendo
IGF-I e IGF-II están adoptando
papeles importantes en la oncogénesis y la proliferación del cáncer
y también en las complicaciones diabéticas y la artritis
reumatoide. Estos hechos sugieren una posibilidad de repercutir en
la diagnosis, la prevención y el tratamiento de los cánceres, las
complicaciones diabéticas, la artritis reumatoide y similares
utilizando proteínas de la familia de IGF como diana.
En realidad, se ha informado sobre efectos
antitumorales mediante la inhibición de las funciones de IGF
(Biochimica et Biophysica Acta, 1332, F105-F126,
1997), por ejemplo se admite que la tumorigenicidad y la capacidad
metastásica de células de cáncer de mama humano altamente
metastásico en ratones son reducidas y que se prolonga el tiempo de
supervivencia expresando ARN antisentido para IGF-IR
(Cancer Gene Therapy, 7, 384-395, 2000), y de un
informe de que la proliferación de células de rabdomiosarcoma humano
y células de cáncer de mama humano transplantadas a ratones es
inhibida por un anticuerpo
anti-IGF-IR (Cancer Research, 54,
5531-5534, 1994, Journal of Clinical Investigation,
84, 1418-1423, 1989, Breast Cancer Research &
Treatment, 22, 101-106, 1992). Por otra parte, se
ha demostrado que el anticuerpo
anti-IGF-IR inhibe el implante de
células de cáncer de mama humano que muestran crecimiento
independiente de estrógenos transplantadas a ratones, pero no inhibe
el implante de células de cáncer de mama humano que muestran
crecimiento dependiente de estrógenos o proliferación de las
células de cáncer de mama humano implantadas, indicando que no se
puede obtener un efecto antitumoral suficiente mediante la
inhibición de la función de IGF-IR solamente (Breast
Cancer Research & Treatment, 22, 101-106,
1992).
Ya se conocen numerosos anticuerpos como
anticuerpos para IGF (referido en adelante como anticuerpo
anti-hIGF). Como anticuerpo típico para
IGF-I humano (referido en adelante como anticuerpo
anti-hIGF-I), se ha informado sobre
sm1.2 (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America, 81, 2389-2392, 1984). Se ha
revelado que sm1.2 presenta un 40% de reactividad cruzada con
hIGF-II, puede detectar 100 ng de
hIGF-I mediante transferencia western a una
concentración de 1 a 2 \mug/ml, e inhibe la proliferación de una
línea celular de fibroblasto de ratón BALB/c3T3 por 20 ng/ml de
hIGF-I a una concentración de 10 a 30 \mug/ml
(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America, 81, 2389- 2392, 1984, Journal of Clinical
Investigation, 99, 2961-2970, 1997).
Val^{59}-SmC121 es otro
anticuerpo anti-hIGF-I, y se ha
informado de que dicho anticuerpo no reacciona con insulina humana
ni con hIGF-II, reconoce un péptido que contiene en
las posiciones 10^{a} a 12^{a}
Leu-Val-Asp de
hIGF-I, y muestra 1 ng/ml de sensibilidad de
detección de hIGF-I mediante radioinmunoanálisis
utilizando hIGF-I-I^{125}
(Journal of Endocrinology, 125, 327-335, 1990).
Manes et al., Endocrinology, Baltimore,
MD, US Vol. 138(3), págs. 905-915, describen
anticuerpos monoclonales que reconocen tanto IGF-I
como IGF-II humanos y tienen una constante de unión
en el intervalo de 0,08 a 0,1x10^{9} M^{-1}.
Se ha informado de que un anticuerpo
anti-hIGF-I 41/81 tiene un 3% de
reactividad cruzada con hIGF-II, y muestra 1 ng/ml
de sensibilidad de detección de hIGF-I mediante
radioinmunoanálisis utilizando
hIGF-I-I^{125} (FEBS Letters,
149, 109-112, 1982).
Se ha informado de que un anticuerpo
anti-hIGF-I 35I17 tiene
aproximadamente 0,5% de reactividad cruzada con
hIGF-II, puede detectar 1 \mug de
hIGF-I mediante transferencia western a una
concentración de 1 \mug/ml, inhibe completamente la proliferación
de una línea celular de fibroblasto de ratón BALB/c3T3 por medio de
hIGF-I a una concentración de 12 \mug/ml o más,
inhibe la auto-fosforilación de
hIGF-IR en 1 \mug/ml de hIGF-I a
una concentración de 30 \mug/ml, y muestra 0,1 nM de sensibilidad
de detección de hIGF-I mediante un
radioinmunoanálisis utilizando hIGF-I^{125}
(Hybridoma, 16, 513-518, 1997).
Se ha informado de que un anticuerpo
anti-hIGF-I BPL-M23
muestra una actividad de unión de 10,5 x 10^{9} M^{-1} para
hIGF-I, por otra parte, muestra una reactividad
cruzada respectiva de 0,8% y 0,0001% con hIGF-II e
insulina humana, muestra reactividad con IGF de cabra, cerdo, oveja,
bóvidos y conejo pero no reacciona con el IGF de rata y ratón, e
inhibe la formación de grasa en adipocito de rata por
hIGF-I (Journal of Molecular Endocrinology, 2,
201-206, 1989).
Se ha informado de que los anticuerpos
anti-hIGF-I 7A1, 1B3, 4C1 y 5A7
reconocen diferentes epítopos de los dominios C y D de
hIGF-I, y muestran una reactividad cruzada
respectiva de 6,6%, 0,83%, 12% y 1,2% con hIGF-II
(Hybridoma, 12, 737-744, 1993).
Se ha informado de que 3D1/2/1 reacciona con el
IGF-I humano y de cobaya pero no reacciona con el
IGF-I de conejo, rata y ratón, y muestra una
reactividad cruzada del 7% con hIGF-II (Journal of
Clinical and Metabolism, 54, 474-476, 1982).
Como anticuerpo típico para
IGF-II humano (referido en adelante como anticuerpo
anti-hIGF-II), se ha informado
sobre S1F2. Se ha descubierto que S1F2 presenta una reactividad
cruzada de aproximadamente 10% con hIGF-I, puede
detectar de 10 a 100 ng de hIGF-II mediante
transferencia western a una concentración de 1 \mug/ml, e inhibe
la función promotora de la síntesis de ADN de los fibroblastos
humanos en 100 ng/ml de hIGF-II a una concentración
de 100 \mug/ml (Diabetes Research and Clinical Practice, 7,
S21-S27, 1989, Endocrinology, 124,
870-877, 1989).
Se ha informado de que los anticuerpos
anti-hIGF-II 2H11, 2B11, ID5 e ID9
reaccionan con hIGF-II pero no reaccionan con
hIGF-I, y pueden determinar 1 ng/ml de
hIGF-II mediante inmunoanálisis enzimático
competitivo (referido en adelante como ELISA) (solicitud Japonesa
no examinada publicada Núm. 252987/93).
Además, se sabe que cuando un anticuerpo de un
animal no humano, por ejemplo un anticuerpo de ratón, es
administrado a un ser humano, el anticuerpo de ratón administrado
es reconocido como anticuerpo foráneo, lo que induce en el cuerpo
humano un anticuerpo humano contra el anticuerpo de ratón
(anticuerpo humano anti-ratón: referido en adelante
como HAMA). Se sabe que el HAMA que reacciona con el anticuerpo de
ratón administrado provoca efectos secundarios (Journal of Clinical
Oncology, 2, 881-891, 1984; Blood, 65,
1349-1363, 1985; Journal of the National Cancer
Institute, 80, 932-936, 1988; Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America, 82,
1242-1246, 1985), promueve la desaparición del
organismo del anticuerpo de ratón administrado (Journal of Nuclear
Medicine, 26, 1011-1023, 1985; Blood, 65,
1349-1363, 1985; Journal of the National Cancer
Institute, 80, 937-942, 1988) y reduce el efecto
terapéutico del anticuerpo de ratón (Journal of Immunology, 135,
1530-1535, 1985; Cancer Research, 46,
6489-6493, 1986).
Con el fin de resolver estos problemas, se han
realizado intentos para convertir los anticuerpos de animales no
humanos en anticuerpos humanizados tales como anticuerpos quiméricos
humanos y anticuerpos injertados con regiones determinantes de la
complementariedad (referidas en adelante como CDR) utilizando
técnicas de recombinación de genes. El anticuerpo quimérico humano
es un anticuerpo en el que la región variable (en adelante referida
como región V) del anticuerpo es de un animal no humano y la región
constante (en adelante referida como región C) es de un anticuerpo
humano (Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America, 81, 6851-6855, 1984), y
el anticuerpo injertado con CDR humana es un anticuerpo donde la
secuencia de aminoácidos de la CDR de la región V de un anticuerpos
de un animal no humano es injertada en una posición apropiada de un
anticuerpo humano (Nature, 321, 522-525, 1986). En
comparación con los anticuerpos de animales no humanos tales como
un anticuerpo de ratón, estos anticuerpos humanizados son más
ventajosos en aplicaciones clínicas a seres humanos. Por ejemplo,
con respecto a la inmunogenicidad y la estabilidad en la sangre, se
ha referido que la vida media en sangre de un anticuerpo quimérico
humano se prolongaba aproximadamente 6 veces en comparación con un
anticuerpo de ratón cuando se administraban a un ser humano
(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America, 86, 4220-4224, 1989). En cuanto a
un anticuerpo injertado con CDR humana, se ha informado de que su
inmunogenicidad se reducía y su vida media en la sangre se
prolongaba en comparación con un anticuerpo de ratón en un estudio
en el que se utilizaban monos (Cancer Research, 56,
1118-1125, 1996; Immunology, 85,
668-674, 1995). De este modo, se espera que los
anticuerpos humanizados tengan menos efectos secundarios en
comparación con los anticuerpos de animales no humanos, y sus
efectos terapéuticos se mantengan durante un largo período de
tiempo. Adicionalmente, los anticuerpos humanizados se preparan
utilizando técnicas de recombinación de genes, y se pueden preparar
como diferentes formas de moléculas. Por ejemplo, cuando se utiliza
una región C de la subclase \gamma-1 como cadena
pesada (referida en adelante como cadena H) de un anticuerpo
humano, se puede preparar un anticuerpo humanizado que es estable
en sangre y tiene actividades efectoras elevadas tales como
citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo y similares
(Cancer Research, 56, 1118-1125, 1996). Un
anticuerpo humanizado que tiene actividad efectora elevada es
notablemente útil cuando se desea la destrucción de dianas tales
como el cáncer. Por otra parte, en caso de que solamente se
requiera una función neutralizadora de la diana, o en caso de que
haya la posibilidad de ocasionar un efecto secundario debido a la
destrucción de una diana por una actividad efectora, se utiliza
adecuadamente una subclase \gamma4 como región C de la cadena H de
un anticuerpo humano, debido a que la subclase \gamma4 tiene
generalmente una actividad efectora baja (Journal of Experimental
Medicine, 166, 1351-1361, 1987; Journal of
Experimental Medicine, 168, 127-142, 1988), y se
pueden evitar los efectos secundarios, y se puede esperar una
prolongación adicional de la vida media en sangre en comparación con
un anticuerpo de ratón (Immunology, 85, 668-674,
1995). Además, con los recientes avances en el diseño de proteínas
y la ingeniería genética, se ha hecho posible preparar fragmentos de
anticuerpo que tienen un peso molecular más pequeño tales como Fab,
Fab', F(ab')_{2}, scFv (Science, 242,
423-426, 1988), dsFv (Molecular Immunology, 32,
249-258, 1995) y péptidos que contienen CDR (Journal
of Biological Chemistry, 271, 2966-2971, 1996) de
anticuerpos incluyendo anticuerpos humanizados. Puesto que estos
fragmentos de anticuerpo tienen un peso molecular más pequeño en
comparación con las moléculas de anticuerpo completas, tienen unas
propiedades de transferencia superiores a los tejidos diana (Cancer
Research, 52, 3402-3408, 1992).
Basándose en lo anterior, las proteínas de la
familia de IGF que tienen papeles importantes en la oncogénesis y
la proliferación del cáncer y también en las complicaciones
diabéticas y en la artritis reumatoide están controlando estas
enfermedades a través de una compleja maraña de factores de
crecimiento incluyendo la insulina, el IGF-I y el
IGF-II, receptores incluyendo el receptor de
insulina, el IGF-IR y el IGF-IIR y
la IGFBP. Por consiguiente, resulta difícil suprimir estas
enfermedades completamente inhibiendo una parte de estas
interacciones. Aunque existen muchos informes sobre anticuerpos que
reconocen IGF-I y/o IGF-II que se
consideran útiles como medicamentos, no existen informes sobre
anticuerpos que puedan inhibir simultáneamente las funciones de
IGF-I e IGF-II uniéndose
fuertemente a IGF-I e IGF-II.
Además, en cuanto a los anticuerpos que se van a
utilizar para la aplicación clínica a seres humanos, son más
deseables los anticuerpos humanizados que los anticuerpos de un
animal no humano tales como los anticuerpos de ratón. Sin embargo,
no existen informes sobre la preparación de anticuerpos
recombinantes tales como los anticuerpos humanizados como un
anticuerpo anti-hIGF, ni tampoco sobre sus
fragmentos de anticuerpo.
Se sabe que el crecimiento celular mediado por
la familia de hIGF funciona en diferentes clases de células
cancerosas, y se espera que la inhibición de la transducción de la
señal mediada por hIGF, en caso de que sea alcanzable, sea eficaz
para tratar enfermedades tales como la proliferación y la metástasis
de los tumores sólidos, las complicaciones diabéticas y la artritis
reumatoide en seres humanos.
Un objeto de la presente invención es obtener
una sustancia que inhiba el crecimiento celular por medio de IGF
bloqueando la transducción de la señal mediada por la familia del
hIGF, y adicionalmente proporcionar los métodos de aplicación de
dicha sustancia.
La presente invención se refiere a un anticuerpo
o uno de sus fragmentos de anticuerpo, que se une específicamente a
IGF-I e IGF-II para inhibir las
funciones del IGF-I humano y del
IGF-II humano y tiene una actividad de unión con
una constante de unión de 5 x 10^{9} M^{-1} o más medida con un
biosensor BIACORE caracterizado adicionalmente en las
reivindicaciones.
El anticuerpo o uno de sus fragmentos de
anticuerpo puede ser, preferiblemente, un anticuerpo de un animal
no humano o un anticuerpo recombinante. Preferiblemente, el
anticuerpo recombinante se selecciona del grupo que consiste en un
anticuerpo quimérico humano, un anticuerpo injertado con CDR humana
y un anticuerpo humano. Más preferiblemente en el anticuerpo o uno
de sus fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la invención, la VH
del anticuerpo de un animal no humano comprende la secuencia de
aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 2, y/o la VL del
anticuerpo de un animal no humano.
Las realizaciones adicionales son:
(1) El anticuerpo o uno de sus fragmentos de
anticuerpo de acuerdo con la invención, donde el anticuerpo de un
animal no humano es producido por un hibridoma KM1468 (FERM
BP-7978).
(2) El anticuerpo o uno de sus fragmentos de
anticuerpo de acuerdo con la invención, donde la VH del anticuerpo
quimérico humano comprende la secuencia de aminoácidos representada
por el SEQ ID NO: 2, y/o la VL del anticuerpo quimérico humano
comprende la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO:
4.
(3) El anticuerpo o uno de sus fragmentos de
anticuerpo de acuerdo con la invención, donde el anticuerpo
quimérico humano comprende VH y/o VL del anticuerpo producido por
KM1468 (FERM BP-7978).
(4) El anticuerpo o uno de sus fragmentos de
anticuerpo de acuerdo con la invención, donde el anticuerpo
quimérico humano comprende una región constante de un anticuerpo
humano.
(5) El anticuerpo o uno de sus fragmentos de
anticuerpo de acuerdo con la invención, donde la región constante
de un anticuerpo humano comprende la región constante de un
anticuerpo humano de clase IgG1 y/o de clase \kappa.
(6) El anticuerpo o uno de sus fragmentos de
anticuerpo de acuerdo con la invención, donde el anticuerpo
quimérico humano es producido por un transformante KM3002 (FERM
BP-7996).
(7) El anticuerpo o uno de sus fragmentos de
anticuerpo de acuerdo con la invención, donde la CDR1, CDR2 y CDR3
de VH del anticuerpo injertado con CDR humana comprende las
secuencias de aminoácidos representadas por los SEQ ID NOS: 5, 6 y
7 respectivamente, y/o la CDR1, CDR2 y CDR3 de VL del anticuerpo
injertado con CDR humana comprende las secuencias de aminoácidos de
los SEQ ID NOS: 8, 9 y 10 respectivamente.
(8) El anticuerpo o uno de sus fragmentos de
anticuerpo de acuerdo con el apartado (7) anterior, donde el
anticuerpo injertado con CDR humana comprende la CDR de VH del
anticuerpo producido por KM1468 (FERM BP-7978) y/o
la CDR de VL del anticuerpo producido por KM1468 (FERM
BP-7978).
(9) El anticuerpo o uno de sus fragmentos de
anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los apartados (7) y (8)
anteriores, donde el anticuerpo injertado con CDR humana comprende
una región constante de un anticuerpo humano.
(10) El anticuerpo o uno de sus fragmentos de
anticuerpo de acuerdo con el apartado (9) anterior, donde la región
constante de un anticuerpo humano comprende la región constante de
un anticuerpo humano de clase IgG1 y/o
clase \kappa.
clase \kappa.
(11) El fragmento de anticuerpo de acuerdo con
la invención, donde el fragmento de anticuerpo se selecciona del
grupo que consiste en Fab, Fab', F(ab')_{2}, anticuerpo de
cadena sencilla (scFv), región V dimerizada (fragmento bivalente),
región V estabilizada con disulfuro (dsFv) y péptido que contiene
CDR.
(12) Un ADN que codifica el anticuerpo o uno de
sus fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la invención.
(13) Un vector recombinante que contiene el ADN
de acuerdo con el apartado (12) anterior.
(14) Un transformante que se obtiene
introduciendo el vector recombinante de acuerdo con el apartado (13)
anterior en una célula anfitriona.
(15) Un método para producir un anticuerpo o uno
de sus fragmentos de anticuerpo, que comprende cultivar el
transformante de acuerdo con el apartado (14) anterior en un medio
para producir y acumular el anticuerpo o uno de sus fragmentos de
anticuerpo de acuerdo con la invención en un cultivo, y recuperar el
anticuerpo o uno de sus fragmentos de anticuerpo del cultivo.
(16) Un medicamento que comprende al menos uno
del anticuerpo y uno de sus fragmentos de anticuerpo de acuerdo con
la invención como ingrediente activo.
(17) Un agente terapéutico contra una enfermedad
relacionada con IGF humano o una enfermedad cuyo estado mórbido
progresa por la promoción anómala de la producción de IGF humano,
que comprende al menos uno del anticuerpo y uno de sus fragmentos
de anticuerpo de acuerdo con la invención como ingrediente
activo.
(18) Un agente diagnóstico para una enfermedad
relacionada con IGF humano o una enfermedad cuyo estado mórbido
progresa por la promoción anómala de la producción de IGF humano,
que comprende al menos uno del anticuerpo y uno de sus fragmentos
de anticuerpo de acuerdo con la invención.
El anticuerpo se puede unir tanto a
hIGF-I como a hIGF-II
equivalentemente. La unión equivalente se puede representar como el
valor relativo numerando la actividad de unión del anticuerpo a
hIGF-I o hIGF-II. La actividad de
unión equivalente significa que cuando la actividad de unión del
anticuerpo para hIGF-I se define como 1, la
actividad de unión para hIGF-II es de 0,1 a 10,
preferiblemente 0,2 a 5, más preferiblemente de 0,5 a 2, muy
preferiblemente 1. Los ejemplos del índice de la actividad de unión
incluyen una constante de unión (en adelante referida también como
K_{A}) medida por un método biosensor que utiliza el principio de
resonancia de plasmón superficial o similar (en adelante referido
como biosensor BIACORE).
Los ejemplos del anticuerpo de la presente
invención incluyen un anticuerpo que reconoce un epítopo existente
hIGF-I y hIGF-II de tipo natural y
un anticuerpo que reconoce la estructura tridimensional de
hIGF-I y hIGF-II de tipo natural.
Los ejemplos incluyen adicionalmente un anticuerpo que muestra
reactividad cruzada con el IGF de un organismo no humano.
Con respecto a la función de
hIGF-I y hIGF-II, ésta puede ser
cualquier función en la que estén implicados hIGF-I
y hIGF-II, tal como el control de la proliferación,
diferenciación o apoptosis de células epiteliales de mama,
próstata, pulmones, colon y similares.
Los ejemplos del anticuerpo
anti-hIGF de la presente invención incluyen un
anticuerpo de un animal no humano, un anticuerpo recombinante y uno
de sus fragmentos de anticuerpo.
Los ejemplos del anticuerpo de un animal no
humano incluyen un anticuerpo policlonal y un anticuerpo monoclonal,
es preferible un anticuerpo monoclonal.
El anticuerpo monoclonal de un animal no humano
de acuerdo con la presente invención puede ser obtenido inmunizando
un animal no humano con hIGF, preparando hibridomas a partir de una
célula productora de anticuerpo del animal inmunizado y una célula
de mieloma, seleccionando un hibridoma monoclonal, cultivando el
hibridoma monoclonal y purificándolo después del sobrenadante de
cultivo. En cuanto al animal no humano, se puede utilizar cualquiera
de ratón, rata, hámster, conejo y similar con la condición de que
los hibridomas puedan ser preparados a partir de ellos.
Los ejemplos específicos del anticuerpo
monoclonal de un animal no humano de acuerdo con la presente
invención incluyen el anticuerpo de rata KM1468 que es producido
por un hibridoma KM1468 (FERM BP-7978).
Los ejemplos del anticuerpo recombinante de la
presente invención incluyen un anticuerpo humanizado, un anticuerpo
humano y similares.
Los ejemplos del anticuerpo humanizado incluyen
un anticuerpo quimérico humano, un anticuerpo injertado con CDR
humana y similares.
El anticuerpo quimérico humano es un anticuerpo
que comprende la VH y la VL de un anticuerpo de un animal no humano
y la CH y la CL de un anticuerpo humano.
El anticuerpo quimérico humano de la presente
invención puede ser producido preparando los ADNc que codifican la
VH y la VL de un hibridoma capaz de producir un anticuerpo
monoclonal que tiene la capacidad de inhibir las funciones del
IGF-I humano y el IGF-II humano
uniéndose específicamente a IGF-I humano e
IGF-II humano y tiene una actividad de unión con
una constante de unión de 5 x 10^{9} M^{-1} o más medida con un
biosensor BIACORE, construyendo un vector de expresión del
anticuerpo quimérico humano insertando respectivamente los ADNc en
un vector de expresión para su uso en células animales que tienen
genes que codifican CH y CL de un anticuerpo humano, y expresándolo
después mediante la introducción del vector en una célula
animal.
La CH del anticuerpo quimérico humano puede ser
cualquier región con la condición de que pertenezca a la
inmunoglobulina humana (referida en adelante como hIg), pero
preferiblemente de clase hIgG, y se puede utilizar cualquiera de
las subclases hIgG1, hIgG2, hIgG3 y hIgG4 pertenecientes a la clase
hIgG. Asimismo, la CL del anticuerpo quimérico humano puede ser
cualquier región con la condición de que pertenezca a la hIg, y se
pueden utilizar las de clase \kappa o las de clase \lambda.
Los ejemplos del anticuerpo quimérico humano que
se une a hIGF-I y hIGF-II de acuerdo
con la presente invención (en adelante será referido como
anticuerpo quimérico anti-hIGF) incluyen un
anticuerpo quimérico anti-hIGF que contiene las
CDR1, CDR2 y CDR3 de VH del anticuerpo, comprendiendo
respectivamente las secuencias de aminoácidos representadas por los
SEQ ID NOS: 5, 6 y 7 y/o las CDR1, CDR2 y CDR3 de VL, comprendiendo
respectivamente las secuencias de aminoácidos representadas por los
SEQ ID NOS: 8, 9 y 10, un anticuerpo quimérico
anti-hIGF que contiene VH y/o VL del anticuerpo
monoclonal producido por el hibridoma KM1468, un anticuerpo
quimérico anti-hIGF en el cual la VH del anticuerpo
contiene las posiciones 1^{a} a 118^{a} de la secuencia de
aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 2 y/o la VL contiene las
posiciones 1^{a} a 107^{a} de la secuencia de aminoácidos
representada por el SEQ ID NO: 4, y un anticuerpo quimérico
anti-hIGF en el que la VH del anticuerpo comprende
la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 2, la CH
del anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de la
subclase hIgG1, la VL del anticuerpo comprende la secuencia de
aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 4 y la CL del anticuerpo
humano comprende una secuencia de aminoácidos de clase \kappa, y
específicamente, se menciona el anticuerpo quimérico
anti-hIGF KM3002 producido por un transformante
KM3002 (FERM BP-7996).
El anticuerpo injertado con CDR humana es un
anticuerpo en el que las secuencias de aminoácidos de las CDR de VH
y VL de un anticuerpo de un animal no humano están injertadas en una
posición apropiada de VH y VL de un anticuerpo humano.
El anticuerpo injertado con CDR humana de la
presente invención puede ser producido construyendo los ADNc que
codifican las regiones V preparadas injertando secuencias de
aminoácidos de CDR de VH y VL de un anticuerpo de un animal no
humano, que tiene la capacidad de inhibir las funciones de
IGF-I humano y de IGF-II humano
uniéndose específicamente a IGF-I humano e
IGF-II humano y tiene una actividad de unión con una
constante de unión de 5 x 10^{9} M^{-1} o más medida con un
biosensor BIACORE, a la FR de VH y VL de un anticuerpo humano
opcional, construyendo un vector de expresión del anticuerpo
injertado con una CDR humana insertando respectivamente los ADNc en
un vector de expresión para su uso en células animales que tienen un
gen que codifica CH y CL de un anticuerpo humano, y expresándolo
después mediante la introducción del vector en una célula
animal.
La CH del anticuerpo injertado con CDR humana
puede ser cualquier región con la condición de que pertenezca a la
clase hIg, pero preferiblemente a la clase hIgG, y se puede utilizar
una cualquiera de las subclases hIgG1, hIgG2, hIgG3 y hIgG4
pertenecientes a la clase hIgG. Asimismo, la CL del anticuerpo
injertado con CDR humana puede ser cualquier región con la
condición de que pertenezca a la clase hIg, y se pueden utilizar
aquellas de clase \kappa o de
clase \lambda.
clase \lambda.
Los ejemplos del anticuerpo injertado con CDR
humana que se une a hIGF-I y hIGF-II
de acuerdo con la presente invención (referido en adelante como
anticuerpo injertado con CDR anti-hIGF) incluyen un
anticuerpo injertado con CDR anti hIGF que contiene una CDR1, CDR2
y CDR3 de VH de anticuerpo, comprendiendo respectivamente las
secuencias de aminoácidos representadas por los SEQ ID NOS: 5, 6 y 7
y/o las CDR1, CDR2 y CDR3 de VL, comprendiendo respectivamente las
secuencias de aminoácidos representadas por los SEQ ID NOS: 8, 9 y
10, un anticuerpo injertado con CDR anti-hIGF que
contiene una CDR de VH y/o una CDR de VL del anticuerpo monoclonal
producido por el hibridoma KM1468, un anticuerpo injertado con CDR
anti-hIGF en el que la VH del anticuerpo contiene
las posiciones 1^{a} a 118^{a} de la secuencia de aminoácidos
representada por el SEQ ID NO: 15 y/o la VL contiene las posiciones
1^{a} a 107^{a} de la secuencia de aminoácidos representada por
el SEQ ID NO: 16, y un anticuerpo injertado con CDR
anti-hIGF en el que la VH del anticuerpo comprende
la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 15, la
CH del anticuerpo humano comprende una secuencia de aminoácidos de
subclase hIgG1, la VL del anticuerpo comprende la secuencia de
aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 16 y la CL del anticuerpo
comprende una secuencia de aminoácidos de clase \kappa.
Aunque el anticuerpo humano generalmente
representa un anticuerpo que existe naturalmente en el organismo
humano, también incluye los anticuerpos obtenidos de una genoteca de
fagos con anticuerpos humanos y un animal transgénico productor de
anticuerpo humanos preparado basándose en los recientes avances de
la ingeniería genética, el diseño de células y las técnicas de
diseño de embriones.
Con respecto al anticuerpo existente en el
cuerpo humano, por ejemplo, se puede cultivar un linfocito capaz de
producir dicho anticuerpo aislando un linfocito periférico humano,
inmortalizándolo mediante infección con virus EB o similar y
clonándolo después, y dicho anticuerpo puede ser purificado del
sobrenadante de cultivo.
La genoteca de fagos con anticuerpos humanos es
una genoteca en la cual fragmentos de anticuerpo Fab, scFv y
similares son expresados sobre la superficie del fago insertando un
gen de anticuerpo preparado a partir de células B humanas en un gen
del fago. El fago que expresa fragmentos de anticuerpo que tienen
una actividad de unión al antígeno deseada sobre la superficie
puede ser recuperado de dicha genoteca utilizando la actividad de
unión a un sustrato con antígeno inmovilizado como índice. Dichos
fragmentos de anticuerpo pueden ser convertidos adicionalmente en
una molécula de anticuerpo humano que comprende dos cadenas H
completas y dos cadenas L completas mediante técnicas de ingeniería
genética.
El animal transgénico productor de anticuerpo
humano representa un animal en el cual un gen del anticuerpo humano
es integrado en sus células. Por ejemplo, se puede preparar un ratón
transgénico productor de anticuerpo humano introduciendo un gen del
anticuerpo humano en una célula ES de ratón, transplantando dicha
célula ES a un embrión temprano de un ratón y desarrollándolo
después. Con respecto al método para preparar un anticuerpo humano
a partir de un animal transgénico productor de anticuerpo humano, se
puede producir el anticuerpo humano y acumularlo en un sobrenadante
de cultivo cultivando un hibridoma productor de anticuerpo humano
obtenido mediante un método de preparación de hibridoma llevado a
cabo generalmente en animales no humanos.
En cuanto a los fragmentos de anticuerpo de la
presente invención, se pueden ilustrar Fab, Fab',
F(ab')_{2}, scFv, fragmentos bivalentes, dsFv, péptido que
contiene CDR y similares.
Entre los fragmentos obtenidos tratando una IgG
con una proteasa papaína (digerida en el resto aminoácido 224º de
la cadena H), Fab es un fragmento de anticuerpo con un peso
molecular de aproximadamente 50.000 que tiene actividad de unión a
un antígeno en el que aproximadamente la mitad del lado N terminal
de la cadena H y toda la cadena L están unidos a través de un
enlace disulfuro.
El Fab de la presente invención puede ser
preparado tratando un anticuerpo que se une a hIGF-I
y hIGF-II con una proteasa papaína.
Alternativamente, se puede producir Fab insertando un ADN que
codifica el Fab de dicho anticuerpo en un vector de expresión para
procariotas o en un vector de expresión para eucariotas y
expresándolo mediante la introducción de dicho vector en un
procariota o un eucariota.
Entre los fragmentos obtenidos tratando una IgG
con una proteasa pepsina (digerida en el resto aminoácido 234º de
la cadena H), F(ab')_{2} es un fragmento de anticuerpo con
un peso molecular de aproximadamente 100.000 que tiene actividad de
unión a un antígeno, que es ligeramente más largo que un producto en
el cual los fragmentos Fab están unidos por medio de un enlace
disulfuro de la región bisagra.
El F(ab')_{2} de la presente invención
se puede preparar tratando un anticuerpo que se une a
hIGF-I y hIGF-II con una proteasa
pepsina. Alternativamente, se puede preparar llevando a cabo un
enlace tioéter o un enlace disulfuro de los fragmentos Fab'
descritos más abajo.
Fab' es un fragmento de anticuerpo con un peso
molecular de aproximadamente 50.000 que tiene actividad de unión a
un antígeno obtenido digiriendo el enlace disulfuro de la región
bisagra del F(ab')_{2} anteriormente mencionado.
El Fab' de la presente invención se puede
obtener tratando el F(ab')_{2} de la presente invención que
se une a hIGF-I y hIGF-II con el
agente reductor ditiotreitol. Alternativamente, se puede producir
Fab' insertando un ADN que codifica el fragmento Fab' de dicho
anticuerpo en un vector de expresión para procariotas o un vector
de expresión para eucariotas y expresándolo mediante la introducción
de dicho vector en un procariota o un eucariota.
El scFv es un fragmento de anticuerpo que tiene
actividad de unión a un antígeno, que es un polipéptido
VH-P-VL o
VL-P-VH preparado conectando una VH
y una VL utilizando un conector peptídico apropiado (referido en
adelante como P).
El scFv de la presente invención puede ser
obtenido preparando los ADNc que codifican VH y VL del anticuerpo
de la presente invención que se une a hIGF-I y
hIGF-II, construyendo de ese modo un ADN que
codifica un scFv, insertando dicho ADN en un vector de expresión
para procariotas o un vector de expresión para eucariotas y
expresándolo mediante la introducción de dicho vector de expresión
en un procariota o un eucariota.
Un fragmento bivalente es un fragmento de
anticuerpo en el que scFv es dimerizado y que tiene actividades de
unión a un antígeno divalente. Las actividades de unión a un
antígeno divalente pueden ser iguales, o una de ellas puede ser
utilizada como actividad de unión a un antígeno diferente.
El fragmento bivalente de la presente invención
puede ser obtenido preparando los ADNc que codifican VH y VL del
anticuerpo de la presente invención que se une a
hIGF-I y hIGF-II, construyendo un
ADN que codifica scFv de tal manera que la longitud de la secuencia
de aminoácidos de P se convierte en 8 restos o menos, insertando
dicho ADN en un vector de expresión para procariotas o un vector de
expresión para eucariotas y expresándolo mediante la introducción
de dicho vector de expresión en un procariota o un eucariota.
El dsFv es un producto en el que los
polipéptidos preparados remplazando un resto aminoácido de VL y uno
de VL por restos cisteína están unidos por un enlace disulfuro
entre dichos restos cisteína. Los restos aminoácido que se van a
remplazar por restos cisteína se pueden seleccionar basándose en la
estimación de la estructura tridimensional del anticuerpo de
acuerdo con el método mostrado por Reiter et al. (Protein
Engineering, 7, 697-704, 1994).
El dsFv de la presente invención se puede
obtener preparando ADNc que codifican VH y VL del anticuerpo de la
presente invención que se une a hIGF-I y
hIGF-II, construyendo un ADN que codifica dsFv,
insertando dicho ADN en un vector de expresión para procariotas o
un vector de expresión para eucariotas y expresándolo mediante la
introducción de dicho vector de expresión en un procariota o un
eucariota.
Un péptido que contiene CDR comprende al menos
una o más de las CDR de VH o VL. Los péptidos que contienen varias
CDR se pueden conectar directamente o por medio de un conector
peptídico apropiado.
El péptido que contiene CDR de la presente
invención se puede obtener construyendo un ADN que codifica las CDR
de VH y VL del anticuerpo de la invención que se une a
hIGF-I y hIGF-II, insertando dicho
ADN en un vector de expresión para procariotas o un vector de
expresión para eucariotas y expresándolo mediante la introducción
de dicho vector de expresión en un procariota o eucariota.
\newpage
El péptido que contiene CDR también puede ser
producido mediante métodos de síntesis química tales como el método
con Fmoc (método con fluorenilmetoxicarbonilo) y el método con tBoc
(método con t-butiloxicarbonilo).
Los derivados de anticuerpo preparados uniendo
un radioisótopo, un fármaco de bajo peso molecular, un fármaco de
elevado peso molecular, una proteína y similares, químicamente o
mediante técnicas de ingeniería genética, al anticuerpo de la
invención que se une a hIGF-I y
hIGF-II y sus fragmentos de anticuerpo están
incluidos en el anticuerpo de la presente invención.
Los derivados del anticuerpo de la presente
invención pueden ser producidos uniendo un radioisótopo, un fármaco
de bajo peso molecular, un fármaco de elevado peso molecular, una
proteína y similares al lado N terminal o al lado C terminal de la
cadena H o la cadena L del anticuerpo de la presente invención que
se une a hIGF-I y hIGF-II y sus
fragmentos de anticuerpo, un grupo sustituyente o cadena lateral
apropiados del anticuerpo y fragmentos de anticuerpo o una cadena
de azúcar del anticuerpo o fragmentos de anticuerpo, mediante
técnicas químicas (Introduction to Antibody Engineering, escrito
por O. Kanemitsu, publicado por Chijin Shokan, 1994).
También se pueden producir conectando un ADN que
codifica el anticuerpo de la presente invención que se une a
hIGF-I y hIGF-II o uno de sus
fragmentos de anticuerpo y un ADN que codifica una proteína que se
va a unir e insertándolos en un vector de expresión, y expresándolo
mediante la introducción de dicho vector de expresión en una célula
anfitriona apropiada.
En cuanto al radioisótopo, se pueden ilustrar
I^{131}, I^{125} y similares, y se pueden conectar al anticuerpo
por ejemplo mediante el método de la cloramina T.
Los ejemplos del fármaco de bajo peso molecular
incluyen agentes antitumorales tales como agentes alquilantes
incluyendo mostaza nitrogenada, ciclofosfamida y similares,
antagonistas metabólicos incluyendo 5-fluorouracilo,
metotrexato y similares, antibióticos incluyendo daunomicina,
bleomicina, mitomicina C, daunorrubicina, doxorrubicina y
similares, alcaloides vegetales incluyendo vincristina, vinblastina,
vindesina y similares, y agentes hormonales incluyendo tamoxifeno,
dexametasona y similares (Clinical Tumor Science, editado por Japan
Clinical Tumor Research Association, publicado por Gan to Kagaku
Ryoho-sha, 1996), o agentes
anti-inflamatorios tales como agentes esteroides
incluyendo hidrocortisona, prednisona y similares, agentes no
esteroideos incluyendo aspirina, indometacina y similares,
inmunomoduladores incluyendo aurotiomalato, penicilamina y
similares, inmunosupresores incluyendo ciclofosfamida, azatioprina
y similares, antiinflamatorios tales como antihistamínicos
incluyendo maleato de clorfeniramina, clemastina y similares
(Inflammation and Anti-inflammation Therapy,
publicado por Ishiyaku Shuppan, 1982). Por ejemplo, como método
para conectar daunomicina y un anticuerpo, se puede ilustrar un
método en el que los grupos amino de la daunomicina y el anticuerpo
se conectan vía glutaraldehído y un método en el que el grupo amino
de la daunomicina y el grupo carboxilo del anticuerpo se conectan
por medio de una carbodiimida soluble en agua.
Los ejemplos del fármaco de elevado peso
molecular incluyen polietilenglicol (referido en adelante como PEG),
albúmina, dextrano, polioxietileno, copolímero de estireno y ácido
maleico, polivinilpirrolidona, copolímero de pirano,
hidroxipropilmetacrilamida y similares. Conectando estos compuesto
de elevado peso molecular a anticuerpos y fragmentos de
anticuerpos, se pueden esperar diferentes efectos, por ejemplo, (1)
mejora de la estabilidad de diferentes factores químicos, físicos o
biológicos, (2) prolongación significativa de la vida media en
sangre, (3) desaparición de la inmunogenicidad y supresión de la
producción de anticuerpo (Bioconjugate Medicaments, publicado por
Hirokawa Shoten, 1993). Por ejemplo, como método para conectar PEG a
un anticuerpo, se puede ilustrar un método en el que se permite que
reaccione con un agente modificador de PEG (Bioconjugate
Medicaments, publicado por Hirokawa Shoten, 1993). Los ejemplos del
agente modificador de PEG incluyen un agente para modificar el
grupo \varepsilon-amino de la lisina (solicitud
japonesa publicada no examinada Núm. 178926/86), un agente para
modificar el grupo carboxilo del ácido aspártico y el ácido
glutámico (solicitud Japonesa publicada no examinada Núm.
23587/81), un agente para modificar el grupo guanidino de la
arginina (solicitud Japonesa publicada no examinada Núm. 117920/90)
y similares.
Los ejemplos de la proteína incluyen citoquinas
que activan células inmunocompetentes tales como interleuquina 2
humana (referida en adelante como hIL-2), factor
estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos
humano (referido en adelante como hGM-CSF), factor
estimulador de colonias de macrófagos humano (referido en adelante
como hM-CSF), interleuquina 12 humana (referida en
adelante como hIL-12) y similares. Además, también
se pueden utilizar toxinas que tienen la actividad de dañar
directamente las células cancerosas tales como la ricina y la
toxina de la difteria. Por ejemplo, en el caso de un anticuerpo de
fusión con una proteína, el anticuerpo de fusión puede ser
producido conectando un ADNc que codifica una proteína con otro ADNc
que codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, construyendo
de ese modo un ADN que codifica un anticuerpo de fusión, insertando
dicho ADN en un vector de expresión para procariota o un vector de
expresión para eucariota y expresándolo mediante la introducción de
dicho vector de expresión en un procariota o un eucariota.
Con respecto al anticuerpo de la presente
invención para hIGF-I y hIGF-II y
sus fragmentos de anticuerpo, se puede evaluar su actividad de
unión a hIGF-I y hIGF-II y su
actividad para inhibir las funciones de hIGF-I y
hIGF-II midiendo ELISA (Antibodies: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Capítulo 14, 1988;
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press
Limited, 1996), K_{A} medida con un biosensor BIACORE (Journal of
Immunological Methods, 145, 229-240, 1991),
actividad inhibidora para la proliferación celular mediante
hIGF-I y hIGF-II (Cancer Research,
48, 4083-4092, 1988) y similares.
En cuanto a las enfermedades en las cuales está
implicado el hIGF de la presente invención y las enfermedades en
las cuales sus estados mórbidos progresan por la promoción anómala
de la producción de hIGF, se incluye cualquier enfermedad con la
condición de que sea una enfermedad en la cual su estado mórbido
progrese por la proliferación celular anómala causada por hIGF, con
independencia de que la enfermedad sea leve o grave, y los ejemplos
específicos incluyen cáncer, complicaciones diabéticas, artritis
reumatoide y similares.
A continuación se describe un método de
preparación de un anticuerpo y una evaluación de la actividad de un
anticuerpo o uno de sus fragmentos de anticuerpo que se unen
específicamente a IGF-I humano e
IGF-II humano, tienen la capacidad de inhibir las
funciones de IGF-I humano e IGF-II
humano y tienen una actividad de unión con una constante de unión
de 5 x 10^{9} M^{-1} o más medida con un biosensor BIACORE.
Se obtiene una proteína hIGF recombinante
introduciendo un vector de expresión que contiene un ADNc que
codifica hIGF en Escherichia coli, una levadura, una célula
de insecto, una célula animal o similar y expresando allí la
proteína. Alternativamente, también se puede utilizar un péptido
sintético que tiene una secuencia parcial de hIGF como
antígeno.
En cuanto al péptido parcial para el antígeno,
se selecciona una secuencia parcial de proteína de aproximadamente
5 a 30 restos. Para obtener un anticuerpo que reconoce dicha
proteína en un estado que tiene una estructura natural no
desnaturalizada, es necesario seleccionar, como péptido antigénico,
una secuencia parcial que exista sobre la superficie de la proteína
en una vista de la estructura tridimensional. Se puede suponer el
radical existente sobre la superficie de la proteína en una vista
de la estructura tridimensional estimando una secuencia parcial que
es altamente hidrófila utilizando un soporte lógico para el análisis
de secuencias de proteínas asequible comercialmente tal como
Genetyx Mac. Esto es, esto se debe generalmente a que se encuentra
presente una región hidrófila en la parte interna de la proteína en
una vista de la estructura tridimensional en muchos casos, a la vez
que se encuentra presente una región altamente hidrófila sobre la
superficie de la proteína. Además, el extremo N y el extremo C de
una proteína están presentes sobre la superficie de la proteína en
muchos casos. Sin embargo, el péptido parcial seleccionado de esta
manera no siempre se utiliza como antígeno que establece el
anticuerpo deseado.
Se añade cisteína a un extremo del péptido
parcial para el entrecruzamiento con una proteína. Cuando se
selecciona una secuencia interna de la proteína, el extremo N del
péptido se acetila y el extremo C se somete a amidación según se
requiera.
Se puede sintetizar el péptido parcial mediante
métodos de síntesis peptídica en fase líquida y en fase sólida
generales, un método en el que se combinan estos opcionalmente o un
método de acuerdo con ellos (The Peptides, Analysis, Synthesis,
Biology, Vol. 1, 1979; Vol. 2, 1980; Vol. 3, 1981, Academic Press;
Basics and Experimentations of Peptide Synthesis, Maruzen, 1985;
Development of Medicaments, segunda serie, Vol. 14, Peptide
Synthesis, Hirokawa Shoten, 1991; International Journal of Peptide
& Protein Research, 35, 161-214, 1990).
Además, también se puede utilizar un
sintetizador peptídico automático. La síntesis de un péptido por un
sintetizador peptídico se puede llevar a cabo en un sintetizador
peptídico asequible comercialmente tal como un sintetizador
peptídico fabricado por Shimadzu, un sintetizador peptídico
fabricado por Applied Biosystems, Inc. (referido en adelante como
ABI), un sintetizador peptídico fabricado por Advanced ChemTech Inc.
(referido en adelante como ACT) o similar, de acuerdo con cada
programa de síntesis utilizando
N\alpha-Fmoc-aminoácidos,
Na-Boc-aminoácidos o similares
cuyas cadenas laterales están apropiadamente protegidas.
Los aminoácidos protegidos que se van a utilizar
como material y las resinas portadoras pueden ser adquiridos de
ABI, Shimadzu, Kokusan Kagaku, Nova Biochem, Watanabe Kagaku, ACT,
Peptide Research Laboratory; etc. Además, los aminoácidos
protegidos que se van a utilizar como material, los ácidos orgánicos
protegidos y las aminas orgánicas protegidas puede ser sintetizados
mediante métodos de síntesis referidos o de acuerdo con ellos (The
Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1, 1979; Vol. 2, 1980;
Vol. 3, 1981, Academic Press; Basics and Experimentations of
Peptide Synthesis, Maruzen, 1985; Development of Medicaments,
segunda serie, Vol. 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten, 1991;
International Journal of Peptide & Protein Research, 35,
161-214, 1990).
Se puede utilizar uno cualquiera de un ratón,
rata, hámster, conejo y similar como animal a emplear en la
inmunización, con la condición de que se pueda preparar a partir de
él un hibridoma. Más abajo se describe un ejemplo que utiliza ratón
y rata.
Se inmunizan ratones y ratas de 3 a 20 semanas
de edad con el antígeno preparado en el apartado 1(1)
anterior, y las células productoras de anticuerpo se recogen del
bazo, los nódulos linfáticos o la sangre periférica de los
animales. La inmunización se lleva a cabo varias veces administrando
el antígeno junto con un coadyuvante apropiado a los animales
subcutáneamente, intravenosamente o intraperitonealmente. Los
ejemplos del coadyuvante que se pueden citar incluyen coadyuvante
completo de Freund y gel de hidróxido de aluminio más vacuna
pertussis. Asimismo, se puede preparar un producto conjugado con
proteína portadora tal como seralbúmina bovina (referida en
adelante como BSA) y hemocianina de lapa ojo de cerradura (referida
en adelante como KLH) y utilizarlos como inmunógeno. De tres a
siete días después de cada administración de antígeno, se toma una
muestra de sangre del plexo venoso del fondo del ojo o de la vena
de la cola de cada animal inmunizado, se somete a ensayo la muestra
en cuanto a si es reactiva con el hIGF utilizado como antígeno
mediante ELISA o similar, y se utiliza un ratón o rata cuyo suero
muestra un título de anticuerpo suficiente como fuente de suministro
de células productoras de anticuerpo. En el 3^{er} o 7º día
después de la administración final del antígeno, se extirpa el bazo
o similar del ratón o rata inmunizado de acuerdo con un método
conocido (Antibodies-A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, 1988), y las células productoras de
anticuerpo se fusionan con células de mieloma.
En cuanto a las células de mieloma, se puede
utilizar cualquier célula de mieloma que pueda proliferar in
vitro, tales como las líneas celulares de mieloma derivadas de
ratón resistentes a 8-azaguanina
P3-X63Ag8-U1
(P3-U1) (European Journal of Immunology, 6,
511-519, 1976), SP2/O-Ag14
(SP-2) (Nature, 276, 269-270, 1978),
P3-X63-Ag8653 (653) (Journal of
Immunology, 123, 1548-1550, 1979) o
P3-X63-Ag8 (X63) (Nature, 256,
495-497, 1975). Con respecto al cultivo y
sub-cultivo de estas cepas celulares, se preparan 2
x 10^{7} o más de las células hasta el momento de la fusión
celular de acuerdo con un método conocido
(Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, 1988).
Las células productoras de anticuerpo y las
células de mieloma obtenidas antes se lavan, se mezclan con medio
de agregación celular tal como polietilenglicol 1000 (referido en
adelante como PEG-1000) para llevar a cabo la
fusión de las células y después se suspenden en un medio. Se
utilizan medio de Eagle modificado (referido en adelante como MEM),
solución salina tamponada con fosfato (referida en adelante como
PBS) o similar para el lavado de las células. Asimismo, con el fin
de obtener selectivamente una célula fusionada de interés, se
utiliza como medio en el cual se van a suspender las células
fusionadas medio HAT {medio normal [un medio preparado añadiendo
glutamina 1,5 mM, 2-mercaptoetanol 50 \muM, 10
\mug/ml de gentamicina y suero de ternera fetal al 10% (referido
en adelante como FCS) a medio RPMI-1640] con un
suplemento adicional de hipoxantina 0,1 mM, timidina 15 \muM y
aminopterina 0,4 \muM}.
Después de cultivar, se toma una porción del
sobrenadante de cultivo, y se selecciona mediante ELISA una muestra
que reacciona con la proteína antigénica pero no reacciona con las
proteínas no antigénicas. A continuación, se lleva a cabo la
clonación de células individuales mediante el método de dilución
limitante, y se selecciona una célula que muestra un título de
anticuerpo establemente elevado mediante ELISA como hibridoma
productor de anticuerpo monoclonal.
La selección de un hibridoma que produce un
anticuerpo monoclonal anti-hIGF se lleva a cabo de
acuerdo con un método conocido (Antibodies-A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) mediante un
ELISA descrito a continuación. Estos métodos posibilitan la
medición de la actividad de unión de los anticuerpos contenidos en
los sobrenadantes de cultivo de los transformantes que producen un
anticuerpo quimérico anti-hIGF, un anticuerpo
injertado con CDR anti-hIGF o uno de sus fragmentos
de anticuerpo que se describirán más adelante, o de todos los
anticuerpos purificados.
Se inmoviliza un antígeno sobre la placa de
ELISA de 96 pocillos y se deja reaccionar con un sobrenadante de
cultivo de un hibridoma o un anticuerpo purificado como anticuerpo
primario.
Después de la reacción con el anticuerpo
primario, la placa se lava y a esto se le añade un anticuerpo
secundario. En cuanto al anticuerpo secundario, se utiliza un
anticuerpo capaz de reconocer el anticuerpo primario y marcado con
biotina, una enzima, una sustancia quimioluminiscente, un
radiosiótopo o similar. Específicamente, se utiliza un anticuerpo
capaz de reconocer un anticuerpo de ratón como anticuerpo secundario
cuando se ha utilizado un ratón en la preparación del hibridoma, o
se utiliza un anticuerpo capaz de reconocer un anticuerpo de rata
como anticuerpo secundario cuando se ha utilizado una rata en la
preparación del hibridoma.
Después de la reacción, se lleva a cabo una
reacción en respuesta al agente de marcaje del anticuerpo
secundario, y se detecta una muestra que reacciona específicamente
con el antígeno como hibridoma productor de anticuerpo
monoclonal.
Se pueden citar el hibridoma KM1468 y similares
como ejemplos específicos de dicho hibridoma. El hibridoma KM1468
fue depositado el 26 de Marzo de 2002 como FERM
BP-7978 en el Depósito Internacional de Organismos
de Patentes, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial
Avanzadas (código postal 305-8566; Central 6,
1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki,
Japón).
Las células de hibridoma productoras de
anticuerpo monoclonal anti-hIGF obtenidas en el
apartado 1(4) se inyectan intraperitonealmente en ratones de
8 a 10 semanas de edad o ratones carentes de sistema inmunitario que
se tratan con pristano
(2,6,10,14-tetrametilpentadecano) mediante su
administración intraperitoneal y se crían durante 2 semanas, a una
dosis de 5 x 10^{6} a 2 x 10^{7} células por animal. El
hibridoma se convierte en ascitis tumoral en 10 a 21 días. Se
recoge el fluido ascítico de los ratones o de los ratones carentes
de sistema inmunitario y se centrifuga, y luego se recupera la
fracción de IgG o IgM mediante precipitación por adición de sal con
sulfato de amonio saturado al 40-50% o mediante el
método de precipitación por adición de ácido caprílico, o
utilizando una columna de DEAE-Sefarosa, una columna
con proteína A, una columna Cellulofine GSL 2000 (Seikagaku Corp.)
o similar para dar un anticuerpo monoclonal purificado.
La determinación de la subclase de anticuerpo
monoclonal purificado se puede llevar a cabo utilizando un kit de
tipificación de anticuerpos monoclonales de ratón, un kit de
tipificación de anticuerpos monoclonales de rata o similar. La
concentración de proteína se puede calcular mediante el método de
Lowry o a partir de la absorbancia a 280 nm.
La subclase del anticuerpo es un isotipo de una
clase, y se pueden citar IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 en el caso del
ratón, e IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 en el caso del ser humano.
Se puede medir la actividad de unión de un
sobrenadante de cultivo o un anticuerpo monoclonal
anti-hIGF purificado mediante el ELISA de unión
descrito antes en el apartado 1(5), mediante ELISA
competitivo, mediante un biosensor BIACORE y similares.
El ELISA de unión es un método en el que se mide
la actividad de unión de un antígeno y un anticuerpo inmovilizando
un antígeno sobre una placa de ELISA de 96 pocillos, dejándolo
reaccionar con un anticuerpo primario, permitiendo que un
anticuerpo secundario marcado capaz de reconocer el anticuerpo
primario reaccione con él, y detectando después la marca. Los
ejemplos del antígeno que se va a inmovilizar incluyen, proteínas
purificadas de hIGF-I y hIGF-II,
péptidos que tienen sus secuencias parciales y similares. Los
ejemplos del anticuerpo primario incluyen sustancias que se van a
medir tales como sobrenadantes de cultivo de hibridomas, y
anticuerpos purificados. Los ejemplos del anticuerpo secundario
incluyen anticuerpos que pueden reconocer el anticuerpo primario y
se marcan con biotina, una enzima, una sustancia quimioluminiscente,
un radioisótopo o similar. Específicamente, se puede ilustrar un
anticuerpo de ratón anti-inmunoglobulina de rata
marcado con peroxidasa de rábano picante (referido en adelante como
rIg) y similares.
El ELISA competitivo es un método en el que se
inmoviliza hIGF-I o hIGF-II de
antemano sobre una placa ELISA, se añaden simultáneamente un
anticuerpo como sustancia que se va a medir y hIGF-I
o hIGF-II y se dejan reaccionar, y se mide la
reactividad de otro o el mismo antígeno añadido a la solución de
reacción para inhibir la reacción del antígeno inmovilizado sobre
la placa con el anticuerpo que se va a medir basándose en los
cambios en la cantidad de anticuerpo primario que se une a la
placa. Los cambios en la cantidad de unión del anticuerpo son
detectados por el anticuerpo secundario para el anticuerpo.
Asimismo, se puede analizar la reactividad con un hIGF de tipo
natural y un epítopo antigénico mediante ELISA competitivo
utilizando el hIGF de tipo natural y un péptido parcial de hIGF. Se
puede examinar si el anticuerpo está reconociendo o no la estructura
tridimensional de hIGF mediante un análisis estructural
convencional. En cuanto a los análisis estructurales, se pueden
ilustrar, por ejemplo, el análisis cristalográfico con rayos X, el
análisis de resonancia magnética nuclear y similares.
De acuerdo con la medición con un biosensor
BIACORE, se detecta una cantidad muy pequeña de cambio en la masa
generada sobre la superficie de una punta del sensor acompañado de
la asociación y disociación entre dos moléculas como una señal de
SPR mediante un fenómeno óptico. A partir de la constante de
asociación (referida en adelante como Kas) y la constante de
disociación (referida en adelante como Kdis) obtenidas de la
medición mediante este método, se calcula una constante de unión
(referida en adelante como K_{A}) de K_{A} = Kas/Kdis. K_{A}
es expresada por una unidad de M^{-1}. La medición con un
biosensor BIOCORE se puede llevar a cabo en condiciones de medición
óptimas de acuerdo con las instrucciones adjuntas. Con respecto a
las condiciones de medición óptimas, es deseable que la cantidad de
ligando que se va a inmovilizar sobre la punta del sensor esté en
el intervalo entre el valor mínimo calculado por la fórmula 1 y el
valor máximo calculado por la fórmula 2. Asimismo, es deseable que
la cantidad de unión del analito sea igual o más pequeña que la
cantidad de unión máxima calculada por la fórmula 3. En las
fórmulas 1, 2 y 3, ligando representa una molécula que va a ser
inmovilizada sobre la punta del sensor, analito representa una
molécula que se va a añadir por medio de un sistema de canales, y S
representa el número de sitios de unión al ligando. UR es la
abreviatura de unidad de resonancia que indica la cantidad de masa
cambiada por área unitaria de la superficie de la punta del sensor,
donde 1 UR = 1 pg/mm^{2}. De acuerdo con la medición con un
biosensor BIACORE, se puede llevar a cabo el análisis de la
constante de unión basándose en el modo de unión de cada proteína
ajustando la velocidad de flujo y las condiciones de lavado de
manera que se pueda mantener la máxima
cantidad de unión.
cantidad de unión.
\newpage
Fórmula
1
Cantidad mínima
inmovilizada (UR) = 200 x 1/S x (peso molecular del ligando/peso
molecular del
analito)
\vskip1.000000\baselineskip
Cantidad máxima
inmovilizada (UR) = 1000 x 1/S x (peso molecular del ligando/peso
molecular del
analito)
\vskip1.000000\baselineskip
Cantidad máxima de unión = peso
molecular del analito x cantidad de ligando inmovilizado
(UR)/peso
molecular del ligando x S
molecular del ligando x S
\vskip1.000000\baselineskip
Además, se puede medir la actividad de unión del
anticuerpo de la presente invención para inhibir las funciones de
hIGF examinando la influencia del anticuerpo sobre el crecimiento
in vivo o in vitro de una cepa celular que muestra
crecimiento dependiente de hIGF.
La influencia sobre el crecimiento de una cepa
celular que muestra crecimiento dependiente de hIGF representa la
influencia del anticuerpo de la presente invención o uno de sus
fragmentos de anticuerpo sobre el crecimiento celular in
vitro de una cepa celular que muestra crecimiento dependiente de
hIGF, en presencia de hIGF, o sobre el crecimiento celular in
vivo de una cepa celular que muestra crecimiento dependiente de
hIGF, que es transplantada a un animal tal como un ratón.
En cuanto al crecimiento celular in vitro
de una cepa celular que muestra crecimiento dependiente de hIGF en
presencia de hIGF, se puede ilustrar el crecimiento celular cuando
se cultiva una célula utilizando un medio preparado añadiendo hIGF
a un medio basal sin hIGF o similar. En cuanto al medio basal sin
hIGF, se puede ilustrar el medio TF/BSA [un medio preparado
añadiendo 10 \mug/ml de transferrina humana (fabricada por Gibco
BRL) y 200 \mug/ml de BSA a
D-MEM/F-12 (fabricado por Gibco
BRL)] y similares. Respecto al método de medición del crecimiento
celular, éste se puede medir utilizando un reactivo de crecimiento
celular WST-1 (fabricado por Roche).
Con respecto al crecimiento celular in
vivo de una cepa celular que muestra crecimiento dependiente de
hIGF, se puede ilustrar el crecimiento de una célula en el organismo
animal cuando la célula es transplantada a un animal tal como un
ratón. Con respecto al método para medir el crecimiento celular, por
ejemplo, cuando la célula se desarrolla en el organismo de un ratón
en forma de una masa tumoral, es posible medir el volumen de la
masa tumoral y utilizar el valor como un índice del crecimiento
celular.
En cuanto a la cepa celular que muestra un
crecimiento dependiente de hIGF, se pueden ilustrar una línea
celular de cáncer de mama humano MCF7 (ATCC
HTB-22), una línea celular de cáncer de colon humano
HT-29 (ATCC HTB-38), una línea
celular de osteosarcoma humano MG63 (ATCC CRL-1427)
y similares. Además, también se puede ilustrar un transformante en
el que se ha introducido un gen hIGF-I.
Los ejemplos del transformante con un gen
hIGF-I introducido incluyen una cepa celular en la
cual se ha introducido un gen hIGF-I clonado de
manera que la cantidad expresada de hIGF-I aumente
en comparación con el caso en el que no se ha introducido el gen
hIGF-I. Los ejemplos específicos incluyen un
transformante que se prepara introduciendo el gen
hIGF-I en una célula A549 de una cepa celular de
cáncer de pulmón humano, (ATCC CCL-185). Con
respecto al gen hIGF-I, se puede clonar la secuencia
descrita en una referencia (Molecular Endocrinology, 4,
1914-1920, 1990) mediante un método tal como la
PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
En cuanto al vector para la expresión del
anticuerpo humanizado, éste puede ser cualquier vector de expresión
para su uso en células animales en el cual se integra un gen que
codifica CH y/o CL de un anticuerpo humano. El vector para la
expresión del anticuerpo humanizado se puede construir clonando
respectivamente los genes que codifican la CH y la CL de un
anticuerpo humano en un vector de expresión para su uso en células
animales.
La región C de un anticuerpo humano puede ser
una CH y una CL de un anticuerpo humano opcional, y sus ejemplos
incluyen una región C de una cadena H de un anticuerpo humano de
subclase IgG1 (referida en adelante como hC\gamma1), una región C
de una cadena L de un anticuerpo humano de clase \kappa (referida
en adelante como hC\kappa) y similares. En cuanto a los genes que
codifican CH y CL de un anticuerpo humano, se puede utilizar un ADN
cromosómico que comprende exones e intrones, y también se pueden
utilizar ADNc.
En cuanto al vector de expresión para su uso en
células animales, se puede utilizar cualquier vector con la
condición de que pueda integrar y expresar un gen que codifique la
región C de un anticuerpo humano. Por ejemplo, se pueden ilustrar
pAGE107 (Cytotechnology, 3, 133-140, 1990), pAGE103
(Journal of Biochemistry, 101, 1307-1310, 1987),
pHSG274 (Gene, 27, 223-232, 1984), pKCR (Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States of
America, 78, 1527-1531, 1981),
pSG1\betad2-4 (Cytotechnology, 4,
173-180, 1990) y similares. En cuanto al promotor e
intensificador que se van a utilizar en el vector de expresión para
su uso en células animales, se pueden ilustrar el promotor temprano
y el intensificador de SV40 (Journal of Biochemistry, 101,
1307-1310, 1987), el promotor y el intensificador de
la LTR del virus de la leucemia de ratón de Moloney (Biochemical
& Biophysical Research Communications, 149,
960-968, 1987), el promotor (Cell, 41,
479-487, 1985) y el intensificador (Cell, 33,
717-728, 1983) de la cadena H de la inmunoglobulina
y similares.
En cuanto al vector para la expresión de
anticuerpos humanizados, se puede utilizar un tipo en el que la
cadena H y la cadena L del anticuerpo están presentes en diferentes
vectores o un tipo en el que están presentes en el mismo vector
(referido en adelante como tipo tándem), es preferible un vector de
tipo tándem para la expresión del anticuerpo humanizado en vista de
la facilidad de construcción de un vector de expresión del
anticuerpo humanizado, la facilidad de introducción en células
animales y la facilidad de equiparar la cantidad de la cadena H y
la cadena L del anticuerpo expresadas en un animal (Journal of
Immunological Methods, 167, 271-278, 1994). Los
ejemplos del vector de tipo tándem para la expresión de anticuerpo
humanizado incluyen pKANTEX93 (documento WO 97/10354), pEE18
(Hybridoma, 17, 559-567, 1998) y similares.
El vector construido para la expresión del
anticuerpo humanizado se puede utilizar para la expresión de
anticuerpos quiméricos humanos y anticuerpos injertados con CDR
humana en células animales.
Los ADNc que codifican la VH y VL de un
anticuerpo de un animal no humano, tal como un anticuerpo de ratón,
por ejemplo, se obtienen de la siguiente manera.
Se extrae ARNm de un hibridoma que produce un
anticuerpo de ratón o similar, y después se sintetizan los ADNc.
Los ADNc sintetizados se clonan en un vector tal como un fago, un
plásmido o similar para preparar una genoteca de ADNc. Se aíslan
respectivamente un fago recombinante o un plásmido recombinante que
tiene un ADNc que codifica VH o un fago recombinante o un plásmido
recombinante que codifica VL a partir de dicha genoteca utilizando
un radical para la región C o un radical para la región V de un
anticuerpo de ratón como sonda. Se determinan las secuencias de
nucleótidos completas para la VH y la VL pretendidas del anticuerpo
de ratón del fago recombinante o el plásmido recombinante, y se
deducen las secuencias de aminoácidos completas de VH y VL a partir
de la secuencia de nucleótidos.
En cuanto al animal no humano, se pueden
utilizar cualquiera de los animales capaces de producir un
hibridoma, tales como un ratón, una rata, un hámster, un conejo y
similares.
Se puede ilustrar un método con tiocianato de
guanidina-trifluoroacetato de cesio (Methods in
Enzymology, 154, 3-28, 1987) como método para
preparar ARN total a partir de un hibridoma, y un método con una
columna de celulosa con oligo(dT) inmovilizado (Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press Nueva
York, 1989) como método para preparar ARNm a partir de ARN total.
Asimismo, como kit para preparar el ARNm a partir de un hibridoma,
se puede ilustrar el Kit de Aislamiento de ARNm Fast Track
(fabricado por Invitrogen), el Kit de Purificación de ARNm Quick
Prep (fabricado por Amersham Pharmacia) y similares.
Los ejemplos de los métodos para sintetizar ADNc
y preparar una genoteca de ADNc incluyen métodos convencionales
(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab.
Press Nueva York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology,
Suplemento 1-34), o métodos que utilizan kits
disponibles en el mercado tales como Super Script® Plasmid System
para la Síntesis de ADNc y Clonación de Plásmidos (fabricado por
GIBCO BRL), el Kit de Síntesis de ADNc-ZAP
(fabricado por Stratagene) y el Kit de Síntesis de ADNc TimeSaver
(fabricado por Amersham-Pharmacia).
Al preparar una genoteca de ADNc, como vector
que se va a utilizar para la integración del ADNc sintetizado
empleando el ARNm extraído de un hibridoma como molde, se puede
utilizar cualquier vector capaz de integrar dicho ADNc. Los
ejemplos incluyen fagos y plásmidos tales como ZAP Express
(Strategies, 5, 58-61, 1992), pBluescript II SK(+)
(Nucleic Acids Research, 17, 9494, 1989), \lambdaZAP II (fabricado
por Stratagene), \lambdagt10 y \lambdagt11 (DNA Cloning: A
practical Approach, I, 49, 1985), Lambda BlueMid (fabricado por
Clontech), \lambdaExCell y pT7T318U (fabricado por
Amersham-Pharmacia), pcD2 (Molecular & Cellular
Biology, 3, 280-289, 1983) y pUC18 (Gene, 33,
103-119, 1985).
En cuanto a la Escherichia coli en la
cual se introduce una genoteca de ADNc construida por un vector de
fago o plásmido, se puede utilizar cualquier cepa con la condición
de que dicha genoteca de ADNc pueda ser introducida, expresada y
mantenida. Los ejemplos incluyen XL1-Blue MRF'
(Journal of Biotechnology, 23, 271-289, 1992), C600
(Genetics, 59, 177-190, 1968), Y1088 y Y1090
(Science, 222, 778-782, 1983), NM522 (Journal of
Molecular Biology, 166, 1-19, 1983), K802 (Journal
of Molecular Biology, 16, 118-133, 1966) y JM105
(Gene, 38, 275-276, 1985).
En cuanto al método para seleccionar un clon de
ADNc que codifica una VH y una VL de un anticuerpo de un animal no
humano de una genoteca de ADNc, éste se puede seleccionar mediante
un método de hibridación de colonias o un método de hibridación en
placa (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Lab. Press Nueva York, 1989) que utiliza sondas marcadas con un
radioisótopo, una sustancia fluorescente o una enzima. Además,
también se puede preparar un ADNc que codifica una VH y una VL
llevando a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (referida en
adelante como método de PCR; Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Lab. Press Nueva York, 1989; Current Protocols
in Molecular Biology, Suplemento 1-34) preparando
cebadores y utilizando un ADNc sintetizado a partir de ARNm, como
molde.
La secuencia de nucleótidos de dicho ADNc se
puede determinar digiriendo el ADNc seleccionado mediante el método
anterior con enzimas de restricción apropiadas, clonando los
productos digeridos en un vector plasmídico tal como pBluescript
SK(-) (fabricado por Stratagene), y llevando a cabo después una
reacción tal como el método de análisis de la secuencia de
nucleótidos utilizado convencionalmente, por ejemplo, el método
didesoxi (Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America, 74, 5463-5467, 1977) y
analizando los resultados utilizando un analizador de la secuencia
de nucleótidos automático tal como un analizador de la secuencia de
nucleótidos automático ABI PRISM 377 (fabricado por Applied
Biosystems) o similar.
Deduciendo la secuencia de aminoácidos completa
de VH y VL a partir de la secuencia de nucleótidos determinada y
comparando el resultado con las secuencias de aminoácidos completas
de VH y VL de anticuerpos conocidos (Sequences of Proteins of
Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991),
se puede verificar si el ADNc obtenido de este modo codifica o no
la secuencia de aminoácidos de VH y VL del anticuerpo que contiene
la secuencia de la señal de secreción. Con respecto a la secuencia
de aminoácidos completa de VH y VL del anticuerpo que contiene la
señal de secreción, se puede deducir la longitud de la secuencia de
la señal de secreción y la secuencia N terminal y se pueden aclarar
los subgrupos a los cuales pertenecen mediante comparación con las
secuencias de aminoácidos completas de VH y VL de anticuerpos
conocidos (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US
Dept. Health and Human Services, 1991). Además, también se puede
encontrar la secuencia de aminoácidos de cada CDR de VH y VL
comparando con las secuencias de aminoácidos de VH y VL de
anticuerpos conocidos (Sequences of Proteins of Immunological
Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991).
Asimismo, se puede examinar la novedad de las
secuencias llevando a cabo una recuperación de la homología de la
secuencia tal como el método BLAST (Journal of Molecular Biology,
215, 403-410, 1990) en una base de datos opcional,
por ejemplo, SWISS-PROT, PIR-Protein
o similar, utilizando la secuencia de aminoácidos completa de VH y
VL.
Se puede construir un vector de expresión del
anticuerpo quimérico humano clonando los ADNc que codifican la VH y
la VL de un anticuerpo de un animal no humano aguas arriba del gen
que codifica CH y CL de un anticuerpo humano en el vector para la
expresión del anticuerpo humanizado descrito en el apartado
2(1) anterior. Por ejemplo, se puede construir un vector de
expresión del anticuerpo quimérico humano ligando respectivamente
los ADNc que codifican VH y VL de un anticuerpo de un animal no
humano a un ADN sintético que comprende las secuencias de
nucleótidos del lado terminal 3' de VH y VL de un anticuerpo de un
animal no humano y las secuencias de nucleótidos del lado terminal
5' de CH y CL de un anticuerpo humano y también tiene secuencias de
reconocimiento para enzimas de restricción apropiadas en ambos
extremos, y clonándolos respectivamente aguas arriba del gen que
codifica CH y CL de un anticuerpo humano en el vector para la
expresión del anticuerpo humanizado descrito en el apartado
2(1) anterior de tal manera que sean expresados en las formas
apropiadas. Además, se puede construir un vector de expresión de
anticuerpo quimérico amplificando los ADNc que codifican VH y VL de
un anticuerpo de un animal no humano mediante el método de PCR
utilizando plásmidos que contienen ADNc que codifican la VH y la VL
como moldes y utilizando cebadores que tienen secuencias de
reconocimiento de enzimas de restricción apropiadas en los extremos
5', clonándolos respectivamente aguas arriba del gen que codifica CH
y CL de un anticuerpo humano en el vector para la expresión del
anticuerpo humanizado descrito en el apartado 2(1) anterior
de tal manera que sean expresados en las formas adecuadas.
Los ADNc que codifican VH y VL de un anticuerpo
injertado con CDR humana se pueden construir de la siguiente
manera. En primer lugar, se seleccionan las secuencias de
aminoácidos FR de VH y VL de un anticuerpo humano para injertar las
secuencias de aminoácidos de CDR pretendidas de VH y VL de un
anticuerpo no humano. Como secuencias de aminoácidos FR de VH y VL
de un anticuerpo humano, se puede utilizar cualquier secuencia con
la condición de que derive de un anticuerpo humano. Los ejemplos
incluyen las secuencias de aminoácidos FR de VH y VL de anticuerpos
humanos registrados en bases de datos tales como Protein Data Bank y
secuencias de aminoácidos consenso de FR VH y VL de subgrupos de
anticuerpos humanos (Sequences of Proteins of Immunological
Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991) y similares,
pero con el fin de preparar un anticuerpo injertado con CDR humana
que tenga suficiente actividad, es deseable seleccionar secuencias
de aminoácidos que tengan una homología tal alta como sea posible
(al menos 60% o más) con las secuencias de aminoácidos de FR
pretendidas de VH y VL de un anticuerpo de un animal no humano. A
continuación, se diseñan secuencias de aminoácidos de VH y VL de un
anticuerpo injertado con CDR humana injertando las secuencias de
aminoácidos de CDR pretendidas de VH y VL de un anticuerpo de un
animal no humano en las secuencias de aminoácidos FR de VH y VL
seleccionadas de este modo de un anticuerpo humano. Las secuencias
de aminoácidos diseñadas se convierten en secuencias de nucleótidos
considerando la frecuencia de codones encontrada en las secuencias
de nucleótidos de los genes del anticuerpo (Sequences of Proteins of
Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991).
Basándose en las secuencias de nucleótidos diseñadas de este modo,
se sintetizan varios fragmentos de ADN sintético que tienen una
longitud de aproximadamente 100 bases, y se lleva a cabo la PCR
utilizándolos. En este caso, es preferible diseñar seis ADN
sintetizados para cada VH y VL a la vista de la eficacia de la PCR
y de la longitud del ADN que se va a sintetizar.
Además, los ADN se pueden clonar fácilmente en
el vector para la expresión del anticuerpo humanizado construido en
el apartado 2(1) anterior introduciendo secuencias de
reconocimiento para enzimas de restricción apropiadas en ambos
extremos 5' del ADN sintético. Después de la PCR, los productos
amplificados se clonan en plásmidos tales como pBluescript SK(-)
(fabricado por Stratagene) y se determinan sus secuencias de
nucleótidos mediante el método descrito en el apartado 2(2)
anterior para obtener plásmidos que tengan secuencias de nucleótidos
que codifiquen las secuencias de aminoácidos pretendidas de VH y VL
del anticuerpo injertado con CDR humana.
Se sabe que la actividad de unión al antígeno de
un anticuerpo injertado con CDR humana se reduce en comparación con
el caso del anticuerpo original de un animal no humano, cuando
solamente se injertan las CDR deseadas de VH y VL de un anticuerpo
de un animal no humano en las FR de VH y VL de un anticuerpo humano
(BIO/TECHNOLOGY, 9, 266-271, 1991). A causa de
esto, se considera que algunos restos aminoácido no solo de las CDR
si no también de las FR están implicados en la actividad de unión
al antígeno directamente o indirectamente en la VH o la VL del
anticuerpo original de un animal no humano, tienen que ver en la
actividad de unión al antígeno, y se considera que estos restos
aminoácido cambian a otros restos aminoácido de las FR de VH y VL
del anticuerpo humano de acuerdo con el injerto de las CDR. Con el
propósito de resolver este problema, en el caso de un anticuerpo
injertado con CDR humana, se han realizado intentos para identificar
ciertos restos aminoácido de las secuencias de aminoácidos de las
FR de VH y VL del anticuerpo humano, que están directamente
implicados en la unión con el antígeno o que están indirectamente
implicados en la unión con el antígeno interaccionando con restos
aminoácido de la CDR o manteniendo la estructura tridimensional del
anticuerpo, y para incrementar la actividad de unión al antígeno
una vez reducido modificándolos a restos aminoácido que se
encuentran en el anticuerpo original de un animal no humano
(BIO/TECHNOLOGY, 9, 266-271,
1991). Al preparar un anticuerpo injertado con CDR humana, el punto
más importante consiste en identificar eficazmente tales restos
aminoácido de FR implicados en la actividad de unión al antígeno, y
para este fin se han llevado a cabo la construcción y el análisis
de la estructura tridimensional de los anticuerpos mediante análisis
cristalográfico de rayos X (Journal of Molecular Biology, 112,
535-542, 1977), modelado por ordenador (Protein
Engineering, 7, 1501-1507, 1994) o similar. La
información de la estructura tridimensional de estos anticuerpos ha
producido mucha información útil para la preparación de anticuerpos
injertados con CDR humana, pero por otra parte, todavía no se ha
establecido un método para preparar un anticuerpo injertado con CDR
humana que sea aplicable a cada anticuerpo, y en la actualidad es
necesario llevar a cabo varios esfuerzos de prueba y error, por
ejemplo preparando cuerpos modificados de cada anticuerpo y
examinando su correlación con las respectivas actividades de unión
al antígeno.
La modificación de los restos aminoácido de FR
de VH y VL de un anticuerpo humano se puede lograr llevando a cabo
un método de PCR descrito en el apartado 2(4) anterior
utilizando ADN sintéticos para la mutagénesis. La secuencia de
nucleótidos del producto amplificado mediante PCR se determina
mediante el método descrito en el apartado 2(2) anterior
para confirmar que se logra la modificación deseada.
Se puede construir un vector de expresión del
anticuerpo injertado con CDR humana clonando los ADNc que codifican
VH y VL del anticuerpo injertado con CDR humana construido en los
apartados 2(4) y (5) anteriores aguas arriba de los genes
que codifican CH y Cl del anticuerpo humano contenido en el vector
para la expresión del anticuerpo humanizado descrito en el apartado
2(1) anterior.
Por ejemplo, introduciendo secuencias de
reconocimiento para enzimas de restricción apropiadas en ambos
extremos 5' del ADN sintético que se utiliza para construir la VH y
la VL de un anticuerpo injertado con CDR humana en los apartados
2(4) y (5) anteriores, se pueden clonar aguas arriba de los
genes que codifican CH y Cl de un anticuerpo humano contenido en el
vector para la expresión del anticuerpo humanizado descrito en el
apartado 2(1) anterior de tal manera que se expresen en las
formas adecuadas.
Con el fin de evaluar eficazmente la actividad
de unión al antígeno de muchos tipos de anticuerpos humanizados
preparados, se puede llevar a cabo la expresión transitoria de los
anticuerpos humanizados utilizando los vectores de expresión del
anticuerpo humanizado descritos en los apartados 2(3) y (6)
anteriores o utilizando vectores de expresión mutados. Como célula
anfitriona en la cual se introduce el vector de expresión, se puede
utilizar cualquier célula con la condición de que sea una célula
anfitriona que pueda expresar el anticuerpo humanizado, y
generalmente se utiliza una células COS-7 de una
cepa celular derivada de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (Methods in
Nucleic Acids Research, CRC Press, 283, 1991) teniendo en cuenta su
gran cantidad de expresión. Los ejemplos del método para introducir
el vector de expresión en la célula COS-7 incluyen
el método del DEAE-dextrano (Methods in Nucleic
Acids Research, CRC Press, 283, 1991), el método de lipofección
(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America, 84, 7413-7417, 1987) y
similares.
Tras la introducción del vector de expresión, se
pueden medir la cantidad de expresión y la actividad de unión al
antígeno del anticuerpo humanizado en el sobrenadante de cultivo
mediante ELISA (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Capítulo 14, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and
Practice, Academic Press Limited, 1996) y similares.
Se puede obtener un transformante capaz de
expresar establemente un anticuerpo humanizado introduciendo el
vector de expresión del anticuerpo humanizado descrito en los
apartados 2(3) o (6) anteriores en una célula anfitriona
apropiada.
En cuanto al método para introducir el vector de
expresión en una célula anfitriona, se pueden ilustrar el método de
electroporación (Cytotechnology, 3, 133-140, 1990) y
similares.
En cuanto a la célula anfitriona en la cual se
introduce el vector de expresión del anticuerpo humanizado, se
puede utilizar cualquier célula con la condición de que sea una
célula anfitriona que pueda expresar el anticuerpo humanizado, y
los ejemplos incluyen células SP2/O-Ag14 de ratón
(ATCC CRL 1581), células P3X63-Ag8.653 de ratón
(ATCC CRL 1580), células CHO carentes del gen de la dihidrofolato
reductasa (referidas en adelante como dhfr) (Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America,
77, 4 216-4220, 1980), células
YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 de rata (ATCC CRL 1662, referidas en adelante
como células YB2/0) y similares.
Después de la introducción del vector de
expresión, el transformante obtenido se cultiva utilizando un medio
para células animales que contiene fármacos tales como G418 sulfato
(referido en adelante como G418) de acuerdo con el método descrito
en la solicitud Japonesa publicada no examinada Núm. 257891/90, y se
puede seleccionar un transformante que expresa establemente el
anticuerpo humanizado. Los ejemplos del medio para células animales
incluyen medio RPMI 1640 (fabricado por Nissui Pharmaceutical),
medio GIT (fabricado por Nihon Seiyaku), medio
EX-CELL 302 (fabricado por JRH), IMDM (fabricado por
GIBCO BRL) e Hibridoma-SFM (fabricado por GIBCO
BRL), o medios preparados añadiendo diferentes aditivos tales como
FCS a estos medios. El transformante obtenido se cultiva en un
medio, y se puede expresar el anticuerpo humanizado y acumularlo en
el sobrenadante de cultivo. La cantidad de expresión y la actividad
de unión al antígeno del anticuerpo humanizado en el sobrenadante
de cultivo se puede medir mediante ELISA. Además, se puede
incrementar la cantidad de expresión del anticuerpo humanizado por
el transformante utilizando un sistema de amplificación de
dhfr o similar de acuerdo con el método descrito en la
solicitud Japonesa publicada no examinada Núm. 257891/90.
El anticuerpo humanizado se puede purificar del
sobrenadante de cultivo de las células transformantes utilizando
una columna con proteína A (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, Capítulo 8, 1988; Monoclonal Antibodies:
Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996). Además,
también se pueden utilizar métodos de purificación empleados
generalmente para la purificación de proteínas. Por ejemplo, se
puede llevar a cabo la purificación empleando una combinación de
filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico,
ultrafiltración y similares. Se puede medir el peso molecular de la
cadena H, la cadena L o la molécula de anticuerpo completa del
anticuerpo humanizado purificado mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida (referida en adelante como PAGE: Nature, 227,
680-685, 1970), mediante el método de transferencia
western (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Capítulo 12, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles
and Practice, Academic Press Limited, 1996) y similares.
Se puede medir la actividad de unión del
anticuerpo humanizado anti-IGF en un sobrenadante de
cultivo o de un anticuerpo anti-hIGF purificado
para hIGF mediante ELISA, biosensor BIACORE o similar mostrados en
el apartado 1(7) anterior. Además, se puede medir la
actividad del anticuerpo de la presente invención para inhibir las
funciones de hIGF examinando la influencia del anticuerpo sobre el
crecimiento in vivo o in vitro de cepas celulares que
muestran crecimiento dependiente de hIGF, como se muestra en el
apartado 1(7) anterior.
Se pueden preparar fragmentos de anticuerpo a
partir de los anticuerpos anti-hIGF descritos en los
apartados 1 y 2 anteriores mediante técnicas de ingeniería genética
o basándose en técnicas de química de proteínas.
En cuanto a las técnicas de ingeniería genética,
se mencionan un método en el que se construye un gen que codifica
el fragmento de anticuerpo de interés, y se llevan a cabo la
expresión y la purificación utilizando un anfitrión apropiado tal
como una célula animal, una célula vegetal, un célula de insecto, y
Escherichia coli.
En cuanto a las técnicas de química de
proteínas, se mencionan métodos que incluyen digestión específica
del sitio utilizando proteasa tal como pepsina y papaína y
purificación.
En cuanto a los fragmentos de anticuerpo, se
pueden ilustrar Fab, F(ab')_{2}, Fab', scFv, fragmentos
bivalentes, dsFv, un péptido que contiene CDR y similares.
De acuerdo con una técnica de química de
proteínas, se puede preparar Fab tratando IgG con una proteasa
papaína. Después del tratamiento con papaína, cuando el anticuerpo
original es de la subclase IgG que tiene capacidad de unión a
proteína A, se puede recuperar Fab uniforme separándolo de las
moléculas de IgG y de los fragmentos Fc haciéndolo pasar a través
de una columna con proteína A (Monoclonal Antibodies: Principles and
Practice, tercera edición, 1995). En el caso de un anticuerpo de la
subclase IgG que no tiene capacidad de unión a proteína A, se puede
recuperar Fab mediante cromatografía de intercambio iónico en una
fracción eluida con una baja concentración de sal (Monoclonal
Antibodies: Principles and Practice, tercera edición, 1995). Además,
también se puede preparar Fab mediante técnicas de ingeniería
genética utilizando Escherichia coli en la mayoría de los
casos o utilizando una célula de insecto, una célula animal o
similar. Por ejemplo, se puede preparar un vector de expresión de
Fab clonando el ADN que codifica la región V de un anticuerpo
obtenido en los apartados 2(2), 2(4) o 2(5)
anteriores en un vector para la expresión de Fab. En cuanto al
vector para la expresión de Fab, se puede utilizar cualquier vector
con la condición de que pueda llevar a cabo la integración y la
expresión de un ADN de Fab. Por ejemplo, se pueden ilustrar pIT106
(Science, 240, 1041-1043, 1988) y similares. Se
puede producir y acumular Fab en un cuerpo de inclusión o un espacio
periplásmico introduciendo el vector de expresión de Fab en una
Escherichia coli apropiada. Se puede obtener Fab activo a
partir del cuerpo de inclusión mediante un método de replegamiento
utilizado comúnmente para proteínas, y cuando éste es expresado en
el espacio periplásmico, el Fab activo se escapa al sobrenadante de
cultivo. Se puede purificar el Fab uniforme después del
replegamiento o a partir del sobrenadante de cultivo utilizando una
columna con un antígeno inmovilizado (Antibody Engineering, A
Practical Guide, W.H. Freeman and Company, 1992).
De acuerdo con las técnicas de la química de
proteínas, se puede preparar F(ab')_{2} tratando IgG con
una proteasa pepsina. Después del tratamiento con pepsina, éste se
puede recuperar como F(ab')_{2} uniforme llevando a cabo
un procedimiento de purificación similar al caso del Fab (Monoclonal
Antibodies: Principles and Practice, tercera edición, Academic
Press, 1995). Además, también se puede preparar F(ab')_{2}
mediante el método descrito en el siguiente apartado 3(3) en
el que se trata Fab' con maleimida tal como o-PDM y
bismaleimidohexano para realizar un enlace tioéter, o mediante un
método en el que se trata con DTNB [ácido
5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico)]
para realizar un enlace S-S (Antibody Engineering,
A Practical Approach, IRL PRESS, 1996).
Se puede obtener Fab' tratando el
F(ab')_{2} descrito antes en el apartado 3(2) con un
agente reductor tal como ditiotreitol. Asimismo, se puede preparar
Fab' mediante técnicas de ingeniería genética utilizando
Escherichia coli en la mayoría de los casos o utilizando una
célula de insecto, una célula animal o similar. Por ejemplo, se
puede preparar un vector de expresión de Fab' clonando el ADN que
codifica la región V de un anticuerpo obtenido en los apartados
2(2), 2(4) o 2(5) anteriores en un vector para
la expresión de Fab'. En cuanto al vector para la expresión de
Fab', se puede utilizar cualquier vector con la condición de que
pueda llevar a cabo la integración y la expresión de un ADN para el
uso de Fab'. Por ejemplo, se pueden ilustrar pAK19 (BIO/TECHNOLOGY,
10, 163-167, 1992) y similares. Se puede producir y
acumular Fab' en un cuerpo de inclusión o un espacio periplásmico
introduciendo el vector de expresión de Fab' en una Escherichia
coli apropiada. Se puede obtener un Fab' activo a partir del
cuerpo de inclusión mediante el método de replegamiento utilizado
comúnmente para proteínas, y cuando es expresado en el espacio
periplásmico, se puede recuperar extracelularmente desorganizando
las células mediante un tratamiento tal como digestión parcial son
lisozima, choque osmótico y ultrasonicación. Se puede purificar el
Fab' uniforme después del replegamiento o a partir de la suspensión
de células desorganizadas utilizando una columna de proteína G o
similar (Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS,
1996).
De acuerdo con las técnicas de ingeniería
genética, se puede preparar scFv utilizando un fago o Escherichia
coli, o una célula de insecto, una célula animal o similar. Por
ejemplo, se puede preparar un vector de expresión para scFv
clonando los ADN que codifican la región V del anticuerpo descrito
en los apartados 2(2), 2(4) o 2(5) anteriores
en un vector para la expresión de scFv. En cuanto al vector para la
expresión de scFv, se puede utilizar cualquier vector con la
condición de que pueda llevar a cabo la integración y la expresión
de un ADN de scFv. Por ejemplo, se pueden ilustrar pCANTAB5E
(fabricado por Amersham-Pharmacia), pHFA (Human
Antibodies & Hybridomas, 5, 48-56, 1994) y
similares. Introduciendo el vector de expresión de scFv en una
Escherichia coli apropiada e infectando las células con un
fago coadyuvante, se puede obtener un fago que expresa scFv sobre
la superficie en una forma fusionada con la proteína de la
superficie del fago. Asimismo, se puede producir y acumular scFv en
el cuerpo de inclusión o en el espacio periplásmico de
Escherichia coli en la que se ha introducido el vector de
expresión de scFv. Se puede obtener scFv activo a partir del cuerpo
de inclusión mediante un método de replegamiento utilizado
comúnmente para proteínas, y cuando se expresa en el espacio
periplásmico, puede ser recuperado extracelularmente desorganizando
las células mediante un tratamiento tal como digestión parcial con
lisozima, choque osmótico y ultrasonicación. Se puede purificar
scFv uniforme después del replegamiento o a partir de la suspensión
de células desorganizadas utilizando una cromatografía de
intercambio catiónico o similar (Antibody Engineering, A Practical
Approach, IRL PRESS, 1996).
Mediante técnicas de ingeniería genética, se
pueden preparar fragmentos bivalentes utilizando Escherichia
coli en la mayoría de los casos o utilizando una célula de
insecto, una célula animal o similar. Por ejemplo, se puede
preparar un vector de expresión de un fragmento bivalente preparando
los ADN que codifican VH y VL del anticuerpo descrito en los
apartados 2(2), 2(4) o 2(5) anteriores unidos
entre sí de tal manera que el número de restos aminoácido
codificados por el conector sea de 8 restos o menos, y clonándolo en
un vector para la expresión de un fragmento bivalente. En cuanto al
vector para la expresión del fragmento bivalente, se puede utilizar
cualquier vector con la condición de que pueda llevar a cabo la
integración y la expresión de un ADN del fragmento bivalente. Por
ejemplo, se pueden ilustrar pCANTAB5E (fabricado por
Amersham-Pharmacia), pHFA (Human Antibodies
Hybridomas, 5, 48, 1994) y similares. Se puede producir y acumular
un fragmento bivalente en el cuerpo de inclusión o en el espacio
periplásmico de Escherichia coli en la que se ha introducido
el vector de expresión del fragmento bivalente. Se puede obtener un
fragmento bivalente activo a partir del cuerpo de inclusión
mediante un método de replegamiento utilizado comúnmente para
proteínas, y cuando es expresado en el espacio periplásmico, se
puede recuperar extracelularmente desorganizando las células
mediante un tratamiento tal como digestión parcial con lisozima,
choque osmótico y ultrasonicación. Se puede purificar un fragmento
bivalente uniforme después del replegamiento o a partir de la
suspensión de las células desorganizadas utilizando una
cromatografía de intercambio catiónico o similar (Antibody
Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996).
De acuerdo con las técnicas de ingeniería
genética, se puede preparar dsFv utilizando Escherichia coli
en la mayoría de los casos, o utilizando una célula de insecto, una
célula animal o similar. En primer lugar, se preparan ADN en los
cuales un resto aminoácido codificado es remplazado por cisteína
introduciendo una mutación en las posiciones apropiadas de los ADN
que codifican la VH y la VL del anticuerpo descrito en los
apartados 2(2), 2(4) o 2(5) anteriores. Se
pueden preparar vectores de expresión de VH y VL clonando cada uno
de los ADN así preparados en un vector para la expresión de dsFv. En
cuanto al vector para la expresión de dsFv, se puede utilizar
cualquier vector con la condición de que pueda llevar a cabo la
integración y la expresión de un ADN de dsFv. Por ejemplo, se
pueden ilustrar pULI9 (Protein Engineering, 7,
697-704, 1994) y similares. Introduciendo los
vectores de expresión de VH y VL en una Escherichia coli
apropiada, se pueden producir y acumular éstas en el cuerpo de
inclusión o el espacio periplásmico. Al obtener la VH y la VL del
cuerpo de inclusión o del espacio periplásmico y mezclarlas, se
puede obtener un dsFv activo mediante un método de replegamiento
utilizado comúnmente para proteínas. Después del replegamiento, éste
se puede purificar adicionalmente mediante cromatografía de
intercambio iónico, filtración en gel y similares (Protein
Engineering, 7, 697-704, 1994).
Se puede preparar un péptido que contiene una
CDR mediante un método de síntesis química tal como el método Fmoc
y el método tBoc. Se puede preparar un vector de expresión del
péptido con CDR preparando un ADN que codifique un péptido que
contenga CDR, y clonando el ADN preparado de este modo en un vector
apropiado para la expresión. En cuanto al vector para la expresión,
se puede utilizar cualquier vector con la condición de que pueda
llevar a cabo la integración y la expresión de un ADN que codifique
un péptido que contenga CDR. Por ejemplo, se pueden ilustrar pLEX
(fabricado por Invitrogen), pAX4a+ (fabricado por Invitrogen) y
similares. Introduciendo el vector de expresión en una
Escherichia coli apropiada, se puede producir y acumular el
péptido en el cuerpo de inclusión o el espacio periplásmico.
Obteniendo el péptido con CDR del cuerpo de inclusión o el espacio
periplásmico, éste se puede purificar mediante cromatografía de
intercambio iónico, filtración en gel y similares (Protein
Engineering, 7, 697-704, 1994).
Se puede medir la actividad de unión de los
fragmentos de anticuerpo para hIGF purificados mediante ELISA,
biosensor BIACORE y similares mostrados en el apartado 1(7)
anterior. Además, se puede medir la actividad del anticuerpo de la
invención para inhibir las funciones de hIGF examinando la
influencia del anticuerpo sobre el crecimiento in vivo o
in vitro de las cepas celulares que muestran crecimiento
dependiente de hIGF, como se muestra en el apartado 1(7)
anterior.
La presente invención hace referencia a métodos
para detectar y determinar inmunológicamente hIGF utilizando el
anticuerpo de la presente invención. Por consiguiente, el anticuerpo
de la presente invención se puede utilizar para la diagnosis de
enfermedades mediadas por hIGF y enfermedades que muestran un
progreso patológico debido a la producción anormalmente acelerada
de hIGF, que se describirán más adelante.
\newpage
Con respecto al método para detectar o
determinar inmunológicamente hIGF utilizando el anticuerpo de la
presente invención, se pueden ilustrar la técnica de anticuerpo
fluorescente, ELISA, radioinmunoanálisis (referido en adelante como
RIA), métodos de tinción inmunohistoquímica tales como el método de
tinción inmunológica de tejidos y el método de tinción de
inmunocitos (método ABC, método CSA y similares), ELISA sándwich
(Monoclonal Antibody Experimentation Manual, Kodansha Scientific,
1987; Second Series Biochemistry Experimentation Course 5,
Immunobiochemistry studies, Tokyo Kagaku Dojin, 1986) y
similares.
La técnica del anticuerpo fluorescente es un
método en el que el anticuerpo de la presente invención se deja
reaccionar con una célula o un tejido aislados y adicionalmente se
deja reaccionar con un anticuerpo anti-Ig o un
fragmento de anticuerpo marcado con una sustancia fluorescente tal
como isotiocianato de fluoresceína (referido en adelante como FITC)
y después se mide el colorante fluorescente utilizando un citómetro
de flujo.
El método de RIA es un método en el que el
anticuerpo de la presente invención se deja reaccionar con una
célula o una solución desorganizada de la misma, un tejido o una
solución desorganizada del mismo, un sobrenadante de un cultivo
celular, suero, efusión pleural, ascitis, fluido oftálmico o similar
y adicionalmente se deja reaccionar con un anticuerpo
anti-Ig o un fragmento de anticuerpo tratado con un
marcador radioisotópico y después el isótopo se mide utilizando un
contador de centelleo o similar.
El método de tinción de inmunocitos o el método
de tinción inmunológica del tejidos es un método en el que el
anticuerpo de la presente invención se deja reaccionar con una
célula o tejido aislados y adicionalmente se deja reaccionar con un
anticuerpo anti-Ig o un fragmento de anticuerpo
tratado con un material fluorescente tal como FITC y una marca
enzimática tal como peroxidasa y biotina y después se observa la
muestra con el microscopio.
El ELISA sándwich es un método en el que uno de
los dos anticuerpos de la presente invención que tiene diferentes
sitios de reconocimiento del antígeno se inmoviliza primero en una
placa ELISA, el otro anticuerpo se marca con una sustancia
fluorescente tal como FITC o una enzima tal como peroxidasa y
biotina, se deja que la placa con el anticuerpo inmovilizado
reaccione con una célula aislada o una solución desorganizada de la
misma, un tejido o una solución desorganizada del mismo, un
sobrenadante de un cultivo de tejido celular, suero, efusión
pleural, ascitis, fluido oftálmico o similar, y después se deja que
el anticuerpo marcado reaccione con ello y se lleva a cabo una
reacción correspondiente a cada marca.
Puesto que el anticuerpo
anti-hIGF de la presente invención y sus fragmentos
de anticuerpo se unen específicamente a hIGF-I y
hIGF-II e inhiben sus funciones, se considera que
son útiles para diagnosticar y tratar las enfermedades mediadas por
hIGF y las enfermedades que muestran un progreso patológico debido a
una producción de hIGF promovida anormalmente. Además la mayor
parte del anticuerpo humanizado deriva de una secuencia de
aminoácidos de un anticuerpo humano en comparación con un
anticuerpo de un animal no humano, no muestra inmunogenicidad en el
organismo humano, y es posible su administración repetida y se
espera una persistencia a largo plazo de su efecto.
En cuanto al método para diagnosticar
enfermedades mediadas por hIGF y enfermedades que muestran un
progreso patológico debido a una producción de hIGF promovida
anormalmente, se puede ilustrar el método descrito en el apartado 4
anterior en el que se detecta inmunológicamente el hIGF existente en
una muestra biológica de una persona que va a ser sometida a ensayo
tal como una célula, tejido y suero.
El anticuerpo anti-hIGF de la
presente invención o uno de sus fragmentos de anticuerpo pueden ser
administrados tal cual, pero es deseable en general proporcionarlo
en forma de una preparación farmacéutica producida mediante un
método opcional bien conocido en el campo técnico de la fabricación
de fármacos, mezclándolo con uno o más portadores
farmacológicamente aceptables.
En cuanto a la ruta de administración, es
aconsejable utilizar la ruta más eficaz para el tratamiento. Sus
ejemplos pueden incluir la administración oral y las
administraciones parenterales tales como las administraciones
intraoral, intratraqueal, intrarrectal, subcutánea, intramuscular,
intraarticular e intravenosa. En el caso de las preparaciones de
anticuerpo o péptido, son preferibles las administraciones
intraarticular e intravenosa.
Los ejemplos de la forma de administración
incluyen pulverizaciones, cápsulas, comprimidos, gránulos, jarabes,
emulsiones, supositorios, inyecciones, pomadas, cintas y
similares.
Los ejemplos de las preparaciones apropiadas
para la administración oral incluyen emulsiones, jarabes, cápsulas,
comprimidos, polvos, gránulos y similares.
Las preparaciones líquidas tales como emulsiones
y jarabes pueden ser producidas utilizando, como aditivos, agua,
sacáridos tales como sacarosa, sorbitol y fructosa, glicoles tales
como polietilenglicol y propilenglicol, aceites tales como aceite
de sésamo, aceite de oliva y aceite de soja, antisépticos tales como
ésteres de ácido p-hidroxibenzoico, y aromas tales
como aroma de fresa y menta.
\newpage
Se pueden producir cápsulas, comprimidos,
polvos, gránulos y similares utilizando, como aditivos, excipientes
tales como lactosa, glucosa, sacarosa y manitol, agentes
disgregantes tales como almidón y alginato de sodio, lubricantes
tales como estearato de magnesio y talco, aglutinantes tales como
poli(alcohol vinílico), hidroxipropilcelulosa y gelatina,
tensioactivos tales como ésteres de ácido graso, y plastificadores
tales como glicerina.
Los ejemplos de las preparaciones apropiadas
para la administración parenteral incluyen inyectables,
supositorios, pulverizaciones y similares.
Los inyectables se preparan utilizando un
portador que comprende una solución salina, una solución de glucosa
o una mezcla de ambas, y similares.
Los supositorios se preparan utilizando un
portador tal como manteca de cacao, grasa hidrogenada o ácido
carboxílico.
Las pulverizaciones se preparan utilizando el
anticuerpo o el péptido tal cual o combinado con un portador que
facilite la dispersión y la absorción del anticuerpo o el péptido en
forma de partículas finas sin estimular la boca y la membrana
mucosa de las vías respiratorias del receptor.
Los ejemplos específicos del portador incluyen
lactosa, glicerina y similares. Las preparaciones tales como
aerosoles y polvo seco se pueden formar dependiendo de las
propiedades del anticuerpo o el péptido y el portador utilizados.
Estas preparaciones parenterales pueden comprender los ingredientes
enumerados como aditivos en las preparaciones orales.
La dosis o el número de administraciones varían
con los efectos terapéuticos deseados, el método de administración,
el período terapéutico, la edad, el peso corporal y similares. Esta
es normalmente de 10 \mug/kg a 10 mg/kg por día por adulto.
La Fig. 1 muestra la reactividad del anticuerpo
monoclonal de rata anti-hIGF específico para
hIGF-I (ELISA de unión).
La Fig. 2 muestra la reactividad del anticuerpo
monoclonal de rata anti-hIGF para
hIGF-I que tiene una estructura tridimensional
natural en un sistema líquido (ELISA competitivo).
La Fig. 3 muestra la actividad de diferentes
péptidos para inhibir la unión del anticuerpo monoclonal de rata
anti-hIGF KM1468 a hIGF-I. La
abscisa muestra la concentración de los respectivos péptidos
(\mug/ml), y la ordenada muestra la actividad de unión (%). Los
diferentes péptidos utilizados se muestran en el dibujo.
La Fig. 4 muestra las actividades de
hIGF-I, hIGF-II e insulina humana
para inhibir la unión del anticuerpo anti-hIGF
KM1468 a hIGF-I y hIGF-II. A muestra
la inhibición por los respectivos factores tras la unión de KM1468
a hIGF-I, y B tras la unión de KM1468 a
hIGF-II. La abscisa muestra la concentración de los
respectivos factores (\mug/ml), y la ordenada muestra la
actividad de unión (%) donde el valor sin adición se define como el
100%. \blacksquare muestra la reactividad cuando se añadía
hIGF-I, y \Delta muestra la reactividad cuando se
añadía hIGF-II y \Delta muestra la reactividad
cuando se añadía insulina humana.
La Fig. 5 muestra la influencia del anticuerpo
anti-hIGF KM1468, sm1.2 y S1F2 sobre el crecimiento
de una cepa de células de cáncer de mama humano MCF7 por hIGF e
insulina humana. A muestra la actividad de crecimiento celular por
los respectivos factores. La abscisa muestra la concentración de los
respectivos factores (\mug/ml), y la ordenada muestra el
crecimiento (DO450). \medcirc muestra la actividad de
hIGF-I, \blacksquare muestra la actividad de
hIGF-II y \Box muestra la actividad de la insulina
humana. B, C y D muestran la influencia de los respectivos
anticuerpos sobre la actividad de crecimiento por
hIGF-I, y por hIGF-II y por insulina
humana, respectivamente. La abscisa muestra la concentración de
anticuerpo (\mug/ml), y la ordenada muestra el crecimiento
(DO450). La línea discontinua fina muestra el crecimiento sin
adición de anticuerpos, y la línea discontinua muestra el
crecimiento sin adición de los respectivos factores, \medcirc
muestra la actividad de KM1468, \Box muestra la actividad de
sm1.2 y \blacksquare muestra la actividad de S1F2.
La Fig. 6 muestra influencia del anticuerpo
anti-hIGF KM1468, sm1.2 y S1F2 sobre el crecimiento
de una cepa de células de cáncer de colon humano
HT-29 por hIGF e insulina humana. A muestra la
actividad de crecimiento celular por los respectivos factores. La
abscisa muestra la concentración de los respectivos factores
(ng/ml), y la ordenada muestra el crecimiento (DO450). \medcirc
muestra la actividad de HIGF-I, \medbullet muestra
la actividad de hIGF-II y \Box muestra la
actividad de la insulina humana. B, C y D muestran la influencia de
los respectivos anticuerpos sobre la actividad de crecimiento por
hIGF-I, por hIGF-II, y por insulina
humana, respectivamente. La abscisa muestra la concentración de
anticuerpo (\mug/ml), y la ordenada muestra el crecimiento
(DO450). La línea discontinua fina muestra el crecimiento sin
adición de anticuerpos, y la línea discontinua muestra el
crecimiento sin adición de los respectivos factores. \medcirc
muestra la actividad de KM1468, el cuadrado vacío muestra la
actividad de sm1.2 y \medbullet muestra la actividad de S1F2.
La Fig. 7 muestra la influencia del anticuerpo
anti-hIGF KM1468, sm1.2 y S1F2 sobre el crecimiento
de una cepa de células de osteosarcoma humano MG63 por hIGF e
insulina humana. A muestra la actividad de crecimiento celular por
los respectivos factores. La abscisa muestra la concentración de los
respectivos factores (ng/ml), y la ordenada muestra el crecimiento
(DO450). \blacksquare muestra la actividad de
hIGF-I, \medbullet muestra la actividad de
hIGF-II y \Box muestra la actividad de la insulina
humana. B, C y D muestran la influencia de los respectivos
anticuerpos sobre la actividad de crecimiento por
hIGF-I, por hIGF-II y por insulina
humana, respectivamente. La abscisa muestra la concentración de
anticuerpo (\mug/ml), y la ordenada muestra el crecimiento
(DO450). La línea discontinua fina muestra el crecimiento sin
adición de anticuerpos, y la línea discontinua muestra el
crecimiento sin adición de los respectivos factores. \medcirc
muestra la actividad de KM1468, \Box muestra la actividad de
sm1.2 y \blacksquare muestra la actividad de S1F2.
La Fig. 8 es un gráfico que muestra las etapas
de construcción de los plásmidos
pBS(II)SK(-)/hIGF-I y
pKANTEX93/hIGF-I.
La Fig. 9 es un dibujo que muestra la expresión
de hIGF-I en una célula A549/hIGF-I.
A muestra la inhibición por una proteína hIGF-I
recombinante. La abscisa muestra la concentración de la proteína
hIGF-I recombinante añadida, y la ordenada muestra
el desarrollo de color (DO415). B muestra el hIGF-I
contenido en los sobrenadantes de cultivo de células A549 y células
A549/hIGF-I. En blanco se muestra la célula A549 y
con trama se muestra la célula A549/hIGF-I.
La Fig. 10 muestra el efecto inhibidor del
crecimiento celular de KM1468 sobre las células que expresan
hIGF-I. La línea quebrada muestra el crecimiento de
las células A549/hIGF-I en ausencia de anticuerpo
anti-hIGF KM1468, y la línea continua muestra el
crecimiento de las células A549 en ausencia de anticuerpo
anti-hIGF KM1468. \blacksquare muestra el
crecimiento de las células A549/hIGF-I en presencia
de anticuerpo anti-hIGF KM1468, y \medcirc
muestra el crecimiento de las células A549 en presencia de
anticuerpo anti-hIGF KM1468.
La Fig. 11 es un gráfico que muestra el efecto
inhibidor del crecimiento independiente del anclaje de KM1468. En
el dibujo, la columna en blanco muestra el número de colonias
formadas de células A549, la columna con trama muestra el número de
células A549/hIGF-I formadas, y la columna terminada
en negro muestra el número de células A549/hIGF-I
formadas en presencia de anticuerpo anti-hIGF
KM1468.
La Fig. 12 es un gráfico que muestra el efecto
antitumoral del anticuerpo anti-hIGF KM1468. La
abscisa muestra el número de días transcurridos después el
transplante del tumor, y la ordenada muestra el volumen del tumor.
Entre los ratones transplantados con células A549, \medbullet
muestra el efecto en ausencia de anticuerpo
anti-hIGF KM1468, y \blacksquare muestra el
efecto en presencia de anticuerpo anti-hIGF KM1468.
Entre los ratones transplantados con células
A549/hIGF-I, + muestra el efecto en ausencia de
anticuerpo anti-hIGF KM1468, y + muestra el efecto
en presencia de anticuerpo anti-hIGF KM1468.
La Fig. 13 es un dibujo que muestra las etapas
de construcción de los plásmidos pKM1468VH y pKM1468VL.
La Fig. 14 es un dibujo que muestra las etapas
de construcción del plásmido pKANTEX1468Chi.
La Fig. 15 muestra el patrón de electroforesis
SDS-PAGE (utilizando un gradiente en gel de 4 a 15%)
de anticuerpo quimérico anti-hIGF purificado
KM3002. El lado izquierdo es el patrón de electroforesis en
condiciones no reductoras, y el lado derecho es el patrón de
electroforesis en condiciones reductoras. La calle M muestra
marcadores de elevado peso molecular en condiciones no reductoras o
marcadores de bajo peso molecular en condiciones reductoras, y la
calle 1 muestra el patrón de electroforesis de KM3002.
La Fig. 16 muestra la reacción del anticuerpo de
rata anti-hIGF KM1468 y el anticuerpo quimérico
anti-hIGF KM3002 sobre hIGF-I. La
abscisa muestra la concentración de anticuerpo (\mug/ml), y la
ordenada muestra la actividad de unión (DO415). \blacksquare
muestra la reactividad de KM1468, y \medbullet muestra la
reactividad de KM3002.
La Fig. 17 muestra la influencia del anticuerpo
anti-hIGF KM1468, sm1.2, S1F2 y el anticuerpo
quimérico anti-hIGF KM3002 sobre el crecimiento de
una cepa de células de cáncer de colon humano HT-29
por hIGF. A y B muestran la influencia de los respectivos
anticuerpos sobre la actividad de crecimiento por
hIGF-I y por hIGF-II,
respectivamente. La abscisa muestra la concentración de anticuerpo
(\mug/ml), y la ordenada muestra el crecimiento (DO450). La línea
discontinua fina muestra el crecimiento en ausencia de anticuerpos,
y la línea discontinua muestra el crecimiento en ausencia de los
respectivos factores. \blacksquare muestra la actividad de KM1468,
\medbullet muestra la actividad de KM3002, \Delta muestra la
actividad de sm1.2 y \ding{115} muestra la actividad de S1F2.
La presente invención se describirá más abajo
mediante la referencia a ejemplos, pero la presente invención no
está limitada a estos.
Se conjugó un hIGF-I
recombinante (fabricado por R & D) con BSA metilada (fabricada
por SIGMA) con el fin de incrementar su inmunogenicidad, y se
utilizó como inmunógeno. Esto es, la BSA metilada disuelta en agua
re-destilada se mezcló a una razón de BSA
metilada:hIGF-I = 1:4 (razón en peso) a 4ºC y se
agitó durante 10 segundos utilizando un mezclador Vortex. Después
de eso, esto se mezcló con coadyuvante completo de Freund o
coadyuvante incompleto de Freund a una razón en volumen de 1:1
utilizando una jeringa equipada con agujas conectoras y se utilizó
como inmunógeno (referido en adelante como coadyuvante BSA
metilada-hIGF-I).
El coadyuvante de BSA
metilada-hIGF-I preparado como se ha
descrito antes utilizando coadyuvante completo de Freund
(equivalente a 100 \mug de hIGF-I) se administró a
una rata SD de 5 semanas de edad, y se le administró el inmunógeno
preparado de la misma manera utilizando coadyuvante incompleto de
Freund empezando 2 semanas después una vez a la semana 4 veces en
total.
Se recogió una muestra de sangre del plexo
venoso del fondo del ojo, se examinó el título de anticuerpo del
suero mediante el ELISA de unión mostrado en el apartado 1(4)
anterior, y se extirpó el bazo de una rata cuyo suero mostró un
título de anticuerpo suficiente 3 días después de la inmunización
final.
Se cortó el bazo en pedazos en medio MEM
(fabricado por Nissui Pharmaceutical), no unido utilizando un par
de fórceps y se centrifugó (1.200 rpm, 5 minutos), y después se
descartó el sobrenadante, el producto precipitado resultante se
trató con tampón Tris-cloruro de amonio (pH 7,65)
durante 1 a 2 minutos para eliminar los eritrocitos, y las células
restantes se lavaron tres veces con MEM y se sometieron a fusión
celular.
Se cultivó una cepa de células de mieloma de
ratón resistente a 8-azaguanina
P3-U1 utilizando un medio normal, y se prepararon 2
x 10^{7} o más de las células para la fusión celular.
Las células de bazo de rata obtenidas en el
Ejemplo 1(1) y las células de mieloma obtenidas en el
apartado (2) se mezclaron a una razón de 10:1 y se centrifugaron
(1.200 rpm, 5 minutos), el sobrenadante se descartó, y después,
mientras se agitaba a 37ºC, se añadieron las células precipitadas a
un medio de fusión (una mezcla compuesta por 2 g de
PEG-1000, 2 ml de MEM y 0,7 ml de dimetilsulfóxido)
en una cantidad de 0,2 a 10 ml por 1,0 x 10^{2} células de bazo
de rata, 1 a 2 ml de MEM varias veces a intervalos de 1 a 2 minutos
y después se añadió a esto adicionalmente una porción de MEM para
ajustar el volumen total a 50 ml. Después de la centrifugación (900
rpm, 5 minutos), se descartó el sobrenadante, y las células
resultantes se soltaron suavemente y se suspendieron en 100 ml de
medio HAT {un medio preparado suplementando el medio normal [un
medio preparado añadiendo glutamina 1,5 mM,
2-mercaptoetanol 50 \muM, 10 \mug/ml de
gentamicina y suero de ternera fetal al 10% (referido en adelante
como FCS) al medio RPMI-1640] con hipoxantina 0,1
mM, timidina 15 \muM y aminopterina 0,4 \muM}.
Esta suspensión se dispensó en porciones de 100
\mul/pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos y se incubó
en una incubadora con CO_{2} al 5% a 37ºC durante un período de 7
a 14 días. Se seleccionaron los pocillos en los que los
sobrenadantes de cultivo reaccionaban con
BSA-hIGF-I metilado pero no
reaccionaban con BSA-BSA metilado de control
negativo [un producto conjugado preparado llevando a cabo la misma
reacción del Ejemplo 1(1) anterior utilizando BSA] mediante
ELISA de unión como se describe en el Ejemplo 1(4), y los
hibridomas productores de anticuerpo monoclonal de rata
anti-hIGF-I se establecieron
llevando a cabo una clonación de una sola célula dos veces
cambiando el medio por medio HT (un medio preparado separando la
aminopterina del medio HAT) y medio normal.
Como resultado, se obtuvieron 6 clones de
hibridoma KM1468, KM1469, KM1470, KM1471, KM1472 y KM1473 que tenían
las reactividad mostrada en la Fig. 1. Cuando la subclase del
anticuerpo producido por cada hibridoma se examinaba mediante ELISA
utilizando un kit de tipaje de subclases, la subclase de cada
anticuerpo fue IgG2b.
Se utilizaron
BSA-hIGF-I metilado preparado en el
Ejemplo 1(1) y BSA-BSA metilado como control
negativo como antígenos a inmovilizar sobre la placa de ELISA. Se
dispensó cada uno de los antígenos en porciones de 50
\mul/pocillo en forma de una concentración de BSA de 10 \mug/ml
en una placa de ELISA de 96 pocillos (fabricada por Greiner) y se
dejó estar durante la noche a 4ºC para llevar a cabo su
inmovilización. Después de lavar con PBS, se añadió PBS que
contenía BSA al 1% (referido en adelante como
BSA-PBS) en porciones de 100 \mul/pocillo y se
dejó reaccionar a la temperatura ambiente durante 1 hora para llevar
a cabo el bloqueo de los grupos activos restantes. Después de
descartar BSA-PBS, se dispensó antisuero de rata
inmunizada, sobrenadante de cultivo de cada hibridoma productor de
anticuerpo monoclonal anti-hIGF-I o
anticuerpo monoclonal de rata
anti-hIGF-I purificado en porciones
de 50 \mul/pocillo y se dejó estar a la temperatura ambiente
durante 2 horas. Después de la reacción, cada pocillo se lavó con
PBS que contenía Tween 20 al 0,05% (referido en adelante como
Tween-PBS), y después se añadió anticuerpo
anti-Ig de rata de conejo marcado con peroxidasa
diluido 4.000 veces (fabricado por DAKO) como anticuerpo secundario
en porciones de 50 \mul/pocillo y se dejó reaccionar a la
temperatura ambiente durante 1 hora. Tras la reacción y posterior
lavado con Tween-PBS, se añadió una solución de
sustrato ABTS [una solución preparada disolviendo 0,55 g de sal de
amonio de ácido
2,2'-azinobis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfónico)
en 1 litro de tampón citrato 0,1 M (pH 4,2), y añadiendo
adicionalmente a esto 1 \mul/ml de peróxido de hidrógeno justo
antes de su uso] en porciones de 50 \mul/pocillo para llevar a
cabo el desarrollo de color, y después se midió la absorbancia a
415 nm (referida en adelante como DO415) utilizando un lector de
placa Emax (fabricado por Molecular Devices).
Cada uno de los clones de hibridoma obtenidos en
el Ejemplo 1(3) se inyectó intraperitonealmente en ratones
carentes de sistema inmunitario Balb/c hembra de 88 semanas de edad
que habían sido tratados con pristano, a una dosis de 5 a 20 x
10^{6} células por animal. Después de 10 a 21 días, se recogió el
fluido ascítico (1 a 8 ml/animal) de los ratones en los cuales el
hibridoma cambiaba a ascitis tumoral y después se centrifugó (3.000
rpm, 5 minutos) para separar la materia sólida. Después de eso, se
purificó la fracción de IgG mediante el método de precipitación con
ácido caprílico (Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, 1988) y se utilizó como anticuerpo monoclonal
purificado.
\vskip1.000000\baselineskip
Se examinó la reactividad de los anticuerpos
monoclonales de rata anti-hIGF seleccionados en el
Ejemplo 1(3) con hIGF-I que mantiene la
estructura tridimensional natural en un sistema en fase líquida
mediante un ELISA competitivo mostrado más abajo.
Se dispensó cada una de las diluciones seriadas
a la quinta de hIGF-I partiendo de 20 \mug/ml en
porciones de 50 \mul/pocillo en la placa mostrada en el Ejemplo
1(4) en la que se había inmovilizado
BSA-hIGF-I metilado preparado en el
Ejemplo 1(1), y después se dispensó cada una de las
soluciones preparadas diluyendo los anticuerpos monoclonales
purificados de los anticuerpos monoclonales de rata
anti-hIGF-I (KM1468: 6,0 \mug/ml,
KM1470: 1,0 \mug/ml, KM1471: 0,16 \mug/ml, KM1472: 7,0
\mug/ml, KM1473: 1,2 \mug/ml) en porciones de 50 \mul/pocillo,
se mezclaron y se dejaron reaccionar a la temperatura ambiente
durante 2 horas. Tras la reacción y el posterior lavado con
Tween-PBS, se añadió anticuerpo
anti-Ig de rata de conejo marcado con peroxidasa
diluido 4.000 veces (fabricado por DAKO) en porciones de 50
\mul/pocillo y se dejó que reaccionara a la temperatura ambiente
durante 1 hora. Tras la reacción y posterior lavado con
Tween-PBS, la solución sustrato de ABTS [una
solución preparada disolviendo 0,55 g de sal de amonio de ácido of
2,2'-azinobis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfonico)
en 1 litro de tampón citrato 0,1 M (pH 4,2), y añadiendo a esto
adicionalmente 1 \mul/ml de peróxido de hidrógeno justo antes de
su uso] en porciones de 50 \mul/pocillo para llevar a cabo el
desarrollo de color, y después se midió la DO415 utilizando un
lector de placa Emax (fabricado por Molecular Devices).
Como se muestra en la Fig. 2, cada uno de los
anticuerpos monoclonales de rata
anti-hIGF-I mostró reactividad con
la estructura tridimensional natural de hIGF-I en
fase líquida. Además, en el caso de KM1468 que mostró la
sensibilidad más elevada, éste fue capaz de detectar el
hIGF-I que tenía la estructura tridimensional
natural contenida en el sistema en fase líquida, hasta una
concentración de 16 ng/ml.
En el Ejemplo 2(1) se sugirió la
posibilidad de que el anticuerpo anti-hIGF KM1468
reconozca la estructura tridimensional de hIGF-I.
Sin embargo, puesto que también existe la posibilidad de que KM1468
reconozca la secuencia de aminoácidos primaria, se analizó su
reactividad con los péptidos parciales de
hIGF-I.
Se sintetizaron péptidos parciales de
hIGF-I de acuerdo con el método descrito en el
documento WO 01/64754. Los péptidos sintetizados fueron péptidos
correspondientes a una secuencia de las posiciones 1^{a} a
18^{a} de hIGF-I (SEQ ID NO: 17, referido en
adelante como p1-18), sus posiciones 14^{a} a
30^{a} (SEQ ID NO: 18, referido en adelante como
p14-30), sus posiciones 24^{a} a 35^{a} (SEQ ID
NO: 19, referido en adelante como p24-35), sus
posiciones 29^{a} a 41^{a} (SEQ ID NO: 20, referido en adelante
como p29-41), sus posiciones 36^{a} a 47^{a}
(SEQ ID NO: 21, referido en adelante como p36-47),
sus posiciones 41^{a} a 56^{a} (SEQ ID NO: 22, referido en
adelante como p41-56), sus posiciones 52^{a} a
70^{a} (SEQ ID NO: 23, referido en adelante como
p52-70), sus posiciones 53^{a} a 61^{a} (SEQ ID
NO: 24, referido en adelante como p53-61) y sus
posiciones 61^{a} a 70^{a} (SEQ ID NO: 25, referido en adelante
como p61-70), y se diseñaron de manera que
cubrieran toda la longitud de hIGF-I. Con respecto a
la Cys existente en la parte interna de estos péptidos, se
sintetizaron las secuencias en las cuales ésta era reemplazada por
Ser o Ala. Además, con respecto a la secuencia correspondiente a
las posiciones 41^{a} a 56^{a}, también se sintetizó una
secuencia que tenía Cys en su interior (SEQ ID NO: 26, referido en
adelante como p41-56C).
Se llevó a cabo el análisis del sitio de
reconocimiento del antígeno del anticuerpo anti-hIGF
KM1468 utilizando los diferentes péptidos sintetizados en el
apartado (2-1) anterior mediante un ELISA
competitivo mostrado más
abajo.
abajo.
Se prepararon placas sobre las cuales se
inmovilizaron los antígenos como se muestra en el Ejemplo
1(4), el anticuerpo anti-hIGF KM1468 diluido
a 4,0 \mug/ml se dispensó en ellas en porciones de 50
\mul/pocillo, y después se dispensaron soluciones de diluciones
seriadas 1:3 de cada péptido preparado comenzando por 50 \mug/ml,
solas o en diferentes combinaciones, o de hIGF-I en
porciones de 50 \mul/pocillo, se mezclaron y se dejaron
reaccionar a la temperatura ambiente durante 1 hora. Tras la
reacción y el posterior lavado con Tween-PBS, se
añadió anticuerpo anti-Ig de rata de conejo marcado
con peroxidasa diluido 4.000 veces (fabricado por DAKO) como
anticuerpo secundario en porciones de 50 \mul/pocillo y se dejó
que reaccionaran a la temperatura ambiente durante 1 hora. Tras la
reacción y el posterior lavado con Tween-PBS, se
añadió la solución sustrato de ABTS [una solución preparada
disolviendo 0,55 g de sal de amonio de ácido
2,2'-azinobis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfonico)
en 1 litro de tampón citrato 0,1 M (pH 4,2), y adicionalmente se
añadió a esto 1 \mul/ml de peróxido de hidrógeno justo antes de
su uso] en porciones de 50 \mul/pocillo para llevar a cabo el
desarrollo de color, y después se midió la DO415 utilizando un
lector de placa Emax (fabricado por Molecular Devices). Los
resultados se expresan por medio de valores relativos (%) donde la
DO415 cuando se añade un anticuerpo solo se define como 100.
Como se muestra en la Fig. 3, la unión del
anticuerpo anti-hIGF KM1468 a hIGF-I
era inhibida por hIGF-I de una manera dependiente
de la concentración, pero la actividad inhibidora no se observó en
estos péptidos con independencia de que se utilizaran solos o
combinados. Los resultados anteriores sugieren fuertemente que
KM1468 no solo reconoce una secuencia primaria de aminoácidos de
hIGF-I si no que reconoce la estructura
tridimensional de hIGF-I.
Se examinó la reactividad cruzada del anticuerpo
anti-hIGF KM1468 purificado con
hIGF-II e insulina humana mediante un ELISA
competitivo mostrado más abajo. Como antígenos, se utilizaron
hIGF-I (fabricado por Pepro Tech),
hIGF-II (fabricado por Pepro Tech) e insulina humana
(fabricada por Wako Pure Chemical Industries).
El antígeno
BSA-hIGF-I metilado preparado en el
Ejemplo 1(1) o un antígeno
BSA-hIGF-II metilado preparado de
la misma manera que en el Ejemplo 1(1) se inmovilizaron sobre
una placa de acuerdo con el método mostrado en el Ejemplo
1(4), a una concentración de 0,1 \mug/ml en el caso del
antígeno BSA-hIGF-I metilado, o a
una concentración de 1,0 \mug/ml en el caso del antígeno
BSA-hIGF-II metilado, se dispensó en
ellos KM1468 diluido a 0,6 \mug/ml en porciones de 25
\mul/pocillo, y después se dispensaron diluciones seriadas 1:4 de
hIGF-I, hIGF-II o insulina humana
preparadas partiendo de 20 \mug/ml en porciones de 25
\mul/pocillo, se mezclaron y se dejaron reaccionar a la
temperatura ambiente durante 1 hora. Tras la reacción y el posterior
lavado con Tween-PBS, se añadió anticuerpo
anti-Ig de rata de conejo marcado con peroxidasa
diluido 1.000 veces (fabricado por DAKO) en porciones de 50
\mul/pocillo como anticuerpo secundario en el caso del anticuerpo
anti-hIGF KM1468. Tras la reacción y el posterior
lavado con Tween-PBS, se añadió la solución sustrato
ABTS [una solución preparada disolviendo 0,55 g de sal de amonio de
ácido
2,2'-azinobis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfonico)
en 1 litro de tampón citrato 0,1 M (pH 4,2), y añadiendo
adicionalmente a esto 1 \mul/ml de peróxido de hidrógeno
inmediatamente antes de su uso] en porciones de 50 \mul/pocillo
para llevar a cabo el desarrollo de color, y después se midió la
DO415 utilizando un lector de placa Emax (fabricado por Molecular
Devices). Los resultados se representan mediante valores relativos
(%) donde la DO415 cuando se añade anticuerpo solo se define como
100.
Los resultados se muestran en la Fig. 4. Como se
muestra en la Fig. 4A, la unión del anticuerpo
anti-hIGF KM1468 a hIGF-I era
fuertemente inhibida por hIGF-I y
hIGF-II. De la misma manera, como se muestra en la
Fig. 4B, la unión del anticuerpo anti-hIGF KM1468 a
hIGF-II era fuertemente inhibida por
hIGF-I y hIGF-II. Además, estas
inhibiciones por hIGF-I y hIGF-II
tenían el mismo grado. Esto es, se demuestra que el anticuerpo
anti-hIGF KM1468 puede reaccionar tanto con
hIGF-I como con hIGF-II casi con la
misma fuerza. Por otra parte, la unión del anticuerpo
anti-hIGF KM1468 a hIGF-I o
hIGF-II no resultaba inhibida por la insulina
humana.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la comparación de la reactividad
de KM1468 y dos anticuerpos anti-hIGF asequibles
comercialmente con antígenos de la siguiente manera. En cuanto a
los anticuerpos, se utilizaron el anticuerpo
anti-hIGF KM1468, sm1.2 como anticuerpo
anti-hIGF-I asequible comercialmente
(fabricado por Upstate Biotechnology) y S1F2 como anticuerpo
anti-hIGF-II asequible
comercialmente (fabricado por Upstate Biotechnology). Como
antígenos, se utilizaron hIGF-I (fabricado por
Pepro Tech), hIGF-II (fabricado por Pepro Tech) e
insulina humana (fabricada por Wako Pure Chemical Industries).
Con el fin de analizar la actividad de unión del
anticuerpo anti-hIGF KM1468 a un antígeno
hIGF-I o hIGF-II, se midieron las
fuerzas de unión del anticuerpo anti-hIGF KM1468, un
anticuerpo anti-hIGF-I sm1.2
disponible en el mercado y un anticuerpo
anti-hIGF-II S1F2 disponible en el
mercado a hIGF-I y hIGF-II de la
siguiente manera utilizando el biosensor Biacore 2000 (fabricado
por BIACORE) que utiliza la resonancia de plasmón superficial. Se
utilizó HBS-EP (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM,
Tween 20 al 0,005%, pH 7,4) (fabricado por BIACORE) para la
dilución de analitos y como tampón de reacción.
Utilizando un acoplamiento de aminas (fabricado
por BIACORE) en una punta del sensor CM-5 (fabricado
por BIACORE), se inmovilizó hIGF-I a 36,0
pg/mm^{2}, o se inmovilizó hIGF-II a 41,7
pg/mm^{2}, a esto se añadieron tres anticuerpos diluidos seis
etapas mediante dilución 1:2 partiendo de 20 \mug/ml como analitos
a una velocidad de flujo de 20 \mul/minuto durante 2 minutos, y
después se observó la disociación de los analitos durante 5
minutos. La reacción se llevó a cabo a 25ºC. Se calcularon la
constante de la velocidad de asociación Kas y la constante de
disociación Kdis a partir de las curvas de reacción de unión a las
respectivas concentraciones, y se calculó la constante de unión
K_{A} (M^{-1}) de cada uno de estos anticuerpos. La constante de
unión K_{A} se calcula por medio de K_{A} = Kas/Kdis.
Los resultados se muestran en la Tabla 1. El
valor K_{A} del anticuerpo anti-hIGF KM1468 para
hIGF-I fue de 7,86 x 10^{9} M^{-1}, y su valor
K_{A} para hIGF-II fue 8,63 x 10^{9} M^{-1}.
Puesto que la razón de la K_{A} de KM1468 para
hIGF-I y hIGF-II era casi de 1:1,
esto demostró que KM1468 se podía unir fuertemente tanto a
hIGF-I como a hIGF-II con una fuerza
casi equivalente. Por otra parte, el valor de K_{A} del anticuerpo
monoclonal anti-hIGF-I sm1.2
disponible en el mercado para hIGF-I fue de 1,86 x
10^{8} M^{-1}, y su valor de K_{A} para
hIGF-II fue de 7,35 x 10^{7} M^{-1}. Los valores
de K_{A} del anticuerpo anti-hIGF KM1468 para
hIGF-I y hIGF-II fueron
aproximadamente 42 veces superiores para hIGF-I y
aproximadamente 120 superiores para hIGF-II, en
comparación con el valor de K_{A} del anticuerpo
anti-hIGF-I sm1.2 disponible en el
mercado. Asimismo, el valor de K_{A} del anticuerpo
anti-hIGF-II S1F2 disponible en el
mercado para hIGF-I fue de 4,62 x 10^{8}
M^{-1}, y su valor de K_{A} para hIGF-II fue de
2,4 x 10^{9} M^{-1}. Los valores de K_{A} del anticuerpo
anti-hIGF KM1468 para hIGF-I y
hIGF-II fueron aproximadamente 18 veces superiores
para hIGF-I y aproximadamente 3,6 veces superiores
para hIGF-II, en comparación con el valor de K_{A}
del anticuerpo anti-hIGF-II S1F2
disponible en el mercado. Esto es, se demostró que el anticuerpo
anti-hIGF KM1468 tiene una actividad de unión
fuerte para cada uno de hIGF-I y
hIGF-II, en comparación con el anticuerpo
anti-hIGF-I sm1.2 disponible en el
mercado y el anticuerpo anti-hIGF-II
S1F2 disponible en el mercado.
Se prepararon una línea de células de cáncer de
mama humano MCF7 (ATCC HTB-22), una línea de células
de cáncer de colon humano HT-29 (ATCC
HTB-38) o una línea de células de osteosarcoma
humano MG-63 (ATCC CRL-1427) en
medio TF/BSA [un medio preparado añadiendo a 10 \mug/ml de
transferrina humana (fabricada por Gibco BRL) y 200 \mug/ml de
BSA a D-MEM/F-12 (fabricado por
Gibco BRL)] a una densidad de 0,5 a 1 x 10^{5} células/ml y se
dispensaron en porciones de 100 \mul/pocillo en una placa de
cultivo de 96 pocillos. Con posterioridad, se añadieron a esto cada
uno de los factores hIGF-I (fabricado por Pepro
Tech), hIGF-II (fabricado por Pepro Tech) e
insulina humana (fabricada por Wako Pure Chemical Industries)
diluido a una concentración con medio TF/BSA en porciones de 50
\mul/pocillo, y cada uno de los anticuerpos se diluyó a una
concentración con el medio TF/BSA en porciones de 50
\mul/pocillo, y se cultivó a 37ºC durante 5 días en una incubadora
con CO_{2} al 5%. Después del cultivo, se dispensó un reactivo de
proliferación celular WST-1 (fabricado por Roche)
en porciones de 20 \mul/pocillo, las células se cultivaron
adicionalmente a 37ºC durante 2,5 a 4 horas en una incubadora con
CO_{2} al 5%, y después se midió la absorbancia a DO450 nm
(referida en adelante como DO450) utilizando un lector de placa
Emax (fabricado por Molecular Devices).
Las curvas de crecimiento de la línea de células
de cáncer de mama humano MCF7 por los respectivos factores se
muestran en la Fig. 5A. Además, los crecimientos en presencia de los
respectivos anticuerpos se muestran en la Fig. 5B en presencia de
40 ng/ml de hIGF-I, en la Fig. 5C en presencia de
100 ng/ml de hIGF-II y en la Fig. 5D en presencia
de 100 ng/ml de insulina humana. Como se muestra en la Fig. 5, el
anticuerpo anti-hIGF KM1468 inhibía fuertemente el
crecimiento celular por hIGF-I y
hIGF-II, y la actividad inhibidora del crecimiento
era superior a la del anticuerpo
anti-hIGF-I sm1.2 disponible en el
mercado y a la del anticuerpo
anti-hIGF-II S1F2 disponible en el
mercado. Por otra parte, ninguno de los anticuerpos ejerció
influencia sobre el crecimiento por insulina humana. Los resultados
anteriores se corresponden bien con las especificidades de unión de
los respectivos anticuerpos observadas mediante el ELISA
competitivo del Ejemplo 3(1) y (2), y demostraron claramente
que las funciones de hIGF-I y
hIGF-II son inhibidas por la unión de cada
anticuerpo.
Las curvas de crecimiento de la línea de células
de cáncer de colon humano HT-29 por los respectivos
factores se muestran en la Fig. 6A. Además, se muestran los
crecimientos en presencia de los respectivos anticuerpos en la Fig.
6B en presencia de 10 ng/ml de hIGF-I, en la Fig. 6C
en presencia de 10 ng/ml de hIGF-II y en la Fig. 6D
en presencia de 20 ng/ml de insulina humana.
Como se muestra en la Fig. 6, el anticuerpo
anti-hIGF KM1468 inhibía fuertemente el crecimiento
celular por hIGF-I y hIGF-II casi
en el mismo grado, y la actividad inhibidora del crecimiento era
superior a la del anticuerpo
anti-hIGF-I sm1.2 disponible en el
mercado y a la del anticuerpo
anti-hIGF-II S1F2 disponible en el
mercado. Por otra parte, ninguno de los anticuerpos ejercía
influencia sobre el crecimiento por insulina humana. Los resultados
anteriores se corresponden bien con las especificidades de unión de
los respectivos anticuerpos observadas por el ELISA competitivo del
Ejemplo 3(1) y (2), y mostraban claramente que las funciones
de hIGF-I y hIGF-II eran inhibidas
por la unión de cada anticuerpo. Además, cuando se añadía KM1468 al
cultivo de células HT-29 en presencia de adición de
hIGF-I mostrada en la Fig. 6B, y cuando se añadía
KM1468 o S1F2 al cultivo de células HT-29 en
presencia de hIGF-II mostrada en la Fig. 6C, se
inhibía el crecimiento de las células en comparación con el
crecimiento celular en ausencia de los respectivos anticuerpos y los
respectivos factores de crecimiento mostrados por líneas
discontinuas. Esto es, las células HT-29 crecen
produciendo hIGF-I o hIGF-II por sí
mismas, y el anticuerpo anti-hIGF puede inhibir el
efecto de proliferación de las células por el factor de crecimiento
producido por la propia célula.
En la Fig. 7A se muestran curvas de crecimiento
de la cepa de células de osteosarcoma humano MG-63
por los respectivos factores. Además, en la Fig. 7B se muestran los
crecimientos en presencia de adición de los respectivos anticuerpos
en presencia de 20 ng/ml de hIGF-I, en la Fig. 7C en
presencia de 20 ng/ml de hIGF-II y en la Fig. 7D en
presencia de 20 ng/ml de insulina humana. Como se muestra en la Fig.
7, el anticuerpo anti-hIGF KM1468 inhibía
fuertemente el crecimiento celular por hIGF-I y
hIGF-II casi en el mismo grado, y la actividad
inhibidora del crecimiento era superior a la del anticuerpo
anti-hIGF-I sm1.2 disponible en el
mercado y a la del anticuerpo
anti-hIGF-II S1F2 disponible en el
mercado. Por otra parte, ninguno de los anticuerpos ejerció
influencia sobre el crecimiento por insulina humana. Los resultados
anteriores se correspondían bien con las especificidades de unión
de los respectivos anticuerpos observadas por el ELISA competitivo
del Ejemplo 3(1) y (2), y demostraron claramente que las
funciones de hIGF-I y hIGF-II son
inhibidas por la unión de cada anticuerpo.
Se observó la actividad inhibidora del
crecimiento celular dependiente de
hIGF-I-o hIGF-II en
el caso de los tres tipos de células anteriores en uno cualquiera
del anticuerpo anti-hIGF KM1468, el anticuerpo
anti-hIGF-I sm1.2 disponible en el
mercado y el anticuerpo anti-hIGF-II
S1F2 disponible en el mercado. En el caso de la actividad de
crecimiento dependiente de hIGF-I, esta actividad
inhibidora del crecimiento celular fue la más alta en el anticuerpo
anti-hIGF KM1468, seguida del anticuerpo
anti-hIGF-I sm1.2 y del anticuerpo
anti-hIGF-II S1F2. Asimismo, en el
caso de la actividad de crecimiento dependiente de
hIGF-II, esta actividad inhibidora del crecimiento
celular fue las más alta en el anticuerpo anti-hIGF
KM1468, seguida del anticuerpo
anti-hIGF-II S1F2 y del anticuerpo
anti-hIGF-I sm1.2. Este resultado
coincide bien con el resultado de las fuerzas de unión obtenido
utilizando la resonancia de plasmón superficial del Ejemplo
3(1), y mostró claramente que el anticuerpo
anti-hIGF KM1468 es superior a los anticuerpos
disponibles en el mercado en su actividad de unión tanto a
hIGF-I como a hIGF-II y en su efecto
inhibidor del crecimiento celular dependiente de
hIGF-I o de hIGF-II.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó un transformante en el que se había
transferido el gen hIGF-I a una línea de células de
cáncer de pulmón humano A549 (ATCC CCL-185) de la
siguiente manera.
Se preparó una porción de 45,6 \mug de ARN
total a partir de 1 x 10^{7} células de una cepa de células de
cáncer de pulmón humano PC-9 (British Journal of
Cancer, 39, 15, 1976) utilizando un kit para la preparación de ARN
RNeasy (fabricado por QIAGEN) de acuerdo con las instrucciones
adjuntas. Utilizando una porción de 5 \mug del ARN total
preparado, se sintetizó ADNc utilizando Superscript II (fabricado
por GIBCO-BRL) de acuerdo con las instrucciones
adjuntas.
Utilizando el ADNc sintetizado como molde, se
clonó el gen hIGF-I mediante PCR. Como cebadores
para la amplificación del gen HIGF-I, se diseñaron
los ADN sintéticos que tenían respectivamente las secuencias de
nucleótidos mostradas en los SEQ ID NO: 27 y 28. Cada uno de los
ADN sintéticos contiene una secuencia de reconocimiento de enzimas
de restricción en su extremo 5' para clonarlo en los plásmidos
pBluescript II SK(-) (fabricado por Stratagene) pKANTEX93
(documento WO 97/10354). Específicamente, se añadieron 20 ng del
ADNc sintetizado a partir de la línea de células de cáncer de
pulmón PC-9, obtenida antes, a una solución tampón
que contenía 50 \mul de Tampón Núm. 1 KOD(+) anclado a ADN
polimerasa KOD(+) (fabricado por TOYOBO), dNTP 0,2 mM, cloruro de
magnesio 2 mM y 1 \muM de ADN sintéticos respectivamente que
tenían las secuencias de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NO: 27
y 28, y utilizando un ciclador térmico de ADN GeneAmp PCR System
9600 (fabricado por PERKIN ELMER), la mezcla se calentó a 94ºC
durante 1 minuto, y después, añadiendo 2,5 unidades de ADN
Polimerasa KOD (fabricada por TOYOBO), se repitió un ciclo de 30
segundos a 94ºC, 30 segundos a 62ºC y 30 segundos a 72ºC 30 ciclos.
Se digirió una porción de 50 \mul de cada solución de reacción con
las enzimas de restricción EcoRI (fabricada por Takara
Shuzo) y SalI (fabricada por Takara Shuzo) y después se
sometió a electroforesis en gel de agarosa, y se recuperó un
producto de la PCR de un gen que codificaba hIGF-I
de aproximadamente 0,5 kb utilizando el Kit de Extracción en Gel
QIAquick (fabricado por QIAGEN).
A continuación, se prepararon 0,1 \mug de ADN
obtenido digiriendo el plásmido pBluescript II SK(-) (fabricado por
Stratagene) con las enzimas de restricción EcoRI y
SalI y desforforilando después los extremos con Fosfatasa
Alcalina de Intestino de Ternera (fabricado por Takara Shuzo,
referido en adelante como CIAP) y 0,1 \mug de cada producto de
PCR obtenido antes en 7,5 \mul añadiendo agua estéril y después se
dejaron reaccionar a 16ºC durante la noche añadiendo 7,5 \mul de
Ligation High (fabricado por TOYOBO). Utilizando la solución de ADN
plasmídico recombinante obtenida de esta manera, se transformó una
cepa de Escherichia coli DH5\alpha (fabricada por TOYOBO).
Cada ADN plasmídico fue preparado a partir del transformante, que
se sometió a reacción utilizando BigDye Terminator Cycle Sequencing
FS Ready Reaction Kit (fabricado por Applied Biosystems) de acuerdo
con las instrucciones adjuntas, y se determinó su secuencia de
nucleótidos utilizando un analizador automático de la secuencia de
nucleótidos ABI PRISM 377 (fabricado por Applied Biosystems). Como
resultado, se obtuvo el plásmido de interés
pBS(II)SK(-)/hIGF-I que tenía una
secuencia génica que codificaba hIGF-I mostrada en
la Fig. 8.
A continuación, se construyó el fragmento
enzimático de restricción (EcoRI-KpnI) del pBS
(II)SK(-)/hIGF-I obtenido antes que
codificaba hIGF-I ligado con el fragmento
EcoRI-KpnI de pKANTEX93, y un plásmido
pKANTEX93/hIGF-I mostrado en la Fig. 8. Se determinó
la secuencia de nucleótidos del plásmido
pKANTEX93/hIGF-I de la misma manera descrita antes
utilizando el analizador automático de secuencias de nucleótidos ABI
PRISM 377. Como resultado, se obtuvo el plásmido de interés
pKANTEX93/hIGF-I que contenía un gen que codificaba
hIGF-I.
Se preparó una célula que expresaba
hIGF-I de la siguiente manera introduciendo el
plásmido pKANTEX93/hIGF-I obtenido en el Ejemplo
4(1-1) en una célula animal.
Se digirió el plásmido
pKANTEX93/hIGF-I con una enzima de restricción
AatII (fabricada por TOYOBO) para linealizar, y se introdujo
una porción de 8 \mug del mismo en 4 x 10^{6} células de una
línea de células de cáncer de pulmón humano A549 (ATCC
CCL-185) mediante el método de electroporación
(Cytotechnology, 3, 133 -140, 1990), y después se suspendieron las
células en 15 ml de medio RPMI [medio RPMI 1640 (fabricado por
Invitrogen) que contenía FCS al 10% y 50 \mug/ml de gentamicina
(fabricada por Nakalai Tesque)] y se transfirió a un matraz T75
(fabricado por Sumilon). Después de 24 horas de cultivo a 37ºC en
una incubadora con CO_{2} al 5%, se añadió a este G418 a una
concentración de 0,2 mg/ml y adicionalmente se cultivó durante 1 a 2
semanas. Se obtuvo un transformante A549/hIGF-I que
tenía resistencia a G418 (referido en adelante como
A549/hIGF-I).
Se llevó a cabo el siguiente ensayo con el fin
de verificar si el gen hIGF-I introducido es
expresado en las células A549/hIGF-I preparadas en
el Ejemplo 4(1-2, y si dichas células son
productoras de hIGF-I.
Se cultivaron las células
A549/hIGF-I o las células A549 en medio RPMI, y
después se recuperó el sobrenadante de cultivo para medir la
cantidad de hIGF-I contenida en el sobrenadante de
cultivo mediante el método ELISA como sigue.
Se preparó la placa con BSA
metilado-hIGF-I inmovilizado
mostrada en el Ejemplo 1(4), una solución de
hIGF-I preparada mediante dilución seriada 1:5
partiendo de 2 \mug/ml como muestra positiva, o un sobrenadante
de cultivo de células A549/hIGF-I o A549, se
dispensó en porciones de 25 \mul/pocillo, y después se dispensó
anticuerpo purificado del anticuerpo anti-hIGF
KM1468 diluido a 0,6 \mug/ml, se mezcló y se dejó reaccionar a la
temperatura ambiente durante 2 horas. Tras la reacción y el
posterior lavado con Tween-PBS, se dispensó
anticuerpo anti-Ig de rata de conejo marcado con
peroxidasa diluido 1.000 veces (fabricado por DAKO) en porciones de
50 \mul/pocillo y se dejó reaccionar a la temperatura ambiente
durante 1 hora. Tras la reacción y posterior lavado con
Tween-PBS, se dispensó
anti-IgG-de rata-HRP
diluida 1.000 veces (fabricada por DAKO) en porciones de 50
\mul/pocillo y se dejó reaccionar a la temperatura ambiente
durante 1 hora. Tras la reacción y posterior lavado 5 veces con
Tween-PBS, se añadió una solución sustrato de ABTS
[una solución preparada disolviendo 0,55 g de sal de amonio de
ácido
2,2'-azinobis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfonico)
en 1 litro de tampón citrato 0,1 M (pH 4,2), y añadiendo
adicionalmente a esto 1 \mul/ml de peróxido de hidrógeno justo
antes de su uso] en porciones de 50 \mul/pocillo para llevar a
cabo el desarrollo de color, y después se midió la DO415 utilizando
un lector de placa Emax.
Los resultados se muestran en la Fig. 9. Como se
muestra en la Fig. 9A, en comparación con el sobrenadante de
cultivo de las células A549 en las que no se había introducido el
gen hIGF-I, la actividad de unión se reducía
característicamente en el sobrenadante de cultivo de las células
A549/hIGF-I en las cuales se había introducido el
gen hIGF-I, demostrando de este modo que las células
A549/hIGF-I expresan hIGF-I.
Se examinó si KM1468 podía inhibir o no el
crecimiento celular dependiente de hIGF-I producido
por la propia célula (referido en adelante como crecimiento celular
autocrino) utilizando las células A549/hIGF-I en las
que se había introducido el gen hIGF-I preparadas
en el Ejemplo 4(1-2).
Las células A549/hIGF-I o las
células A549 se cultivaron utilizando medio RPMI 1640 (fabricado por
Invitrogen) que contenía FCS al 10% y 50 \mug/ml de gentamicina
(fabricada por Nakalai Tesque) (referido en adelante como medio
RPMI), y después se suspendieron respectivamente en medio DMEM/F12
(-FCS,-Rojo Fenol) (fabricado por Invitrogen) que contenía 10
\mug/ml de transferrina humana (fabricada por GIBCO) y 200
\mug/ml de BSA (fabricada por Invitrogen) (referido en adelante
como medio sin suero) a una densidad celular de 2 x 10^{5}
células/ml.
Se dispensó la suspensión celular de las células
A549/hIGF-I o A549 en porciones de 100
\mul/pocillo en una placa de 96 pocillos (fabricada por Sumilon),
se añadió el anticuerpo anti-hIGF KM1468 diluido
seriadamente con el medio sin suero mediante una dilución 1:5
partiendo de 200 \mug/ml en porciones de 100 \mul/pocillo a
cada pocillo, y después se cultivaron las células a 37ºC durante 5
días en una incubadora con CO_{2} al 5%. Después del cultivo, se
dispensó un reactivo de proliferación celular WST-1
(fabricado por Roche) en porciones de 20 \mul/pocillo, las
células se cultivaron adicionalmente a 37ºC durante 4 horas en la
incubadora con CO_{2} al 5%, y después se midió la absorbancia a
una DO450 nm (referida en adelante como DO450) utilizando un lector
de placa Emax (fabricado por Molecular Devices).
Los resultados se muestran en la Fig. 10. La
abscisa muestra la concentración del anticuerpo
anti-hIGF KM1468 en cada pocillo en el momento del
cultivo. El crecimiento de las células A549/hIGF-I
en ausencia de anticuerpo anti-hIGF KM1468 mostrado
por líneas quebradas aumentaba evidentemente en comparación con el
crecimiento de las células A549 mostrado por una línea continua que
no produce hIGF-I. Esto muestra un crecimiento
autocrino en el que las células A549/hIGF-I
promueven el crecimiento de las propias células
A549/hIGF-I por su hIGF-I.
Semejante crecimiento autocrino mostrado en la Fig. 10 era inhibido
de una manera dependiente de la dosis cuando se añadía el
anticuerpo KM1468 en el momento de cultivar las células
A549/hIGF-I. Por otra parte, el anticuerpo KM1468
no ejercía influencia sobe el crecimiento de las células A549. Esto
es, se demostró que el anticuerpo anti-hIGF KM1468
puede inhibir el crecimiento celular autocrino por
hIGF-I producido por la propia célula.
Después de una alteración maligna las células
tienen la capacidad de realizar un crecimiento independiente del
anclaje en el que pueden crecer con independencia de su condición
suspendida sin implante celular, como por ejemplo en un agar
blando. La capacidad para llevar a cabo el crecimiento independiente
del anclaje está muy íntimamente relacionada con la tumorigenicidad
de las células, y se considera que hIGF-I tiene que
ver con ella. Se examinó si KM1468 podía inhibir el crecimiento
independiente del anclaje de una célula de la siguiente manera
utilizando las células A549/hIGF-I preparadas en el
Ejemplo 4(1-2).
Se dispensó medio RPMI que contenía agar noble
al 0,3% templado (fabricado por Difco) (referido en adelante como
medio agar-RPMI) en porciones de 1 ml/pocillo en una
placa de 12 pocillos (fabricada por Costar), y permitiendo que el
medio reposara a la temperatura ambiente durante varios minutos para
llevar a cabo la gelificación. Después de cultivar las células
A549/hIGF-I o las células A549 utilizando medio
RPMI, se suspendieron las células resultantes en medio
agar-RPMI templado a una densidad celular de 1 x
10^{3} células/ml.
Cada pocillo se revistió con la suspensión
celular de células A549/hIGF-I o células A549 en una
cantidad de 1 ml/pocillo. Después de dejar estar a la temperatura
ambiente durante varios minutos para llevar a cabo la gelificación,
las células se cultivaron a 37ºC durante 4 horas en una incubadora
con CO_{2} al 5%. Después del cultivo, se contó el número de
colonias formadas en cada pocillo al microscopio.
Los resultados se muestran en la Fig. 11. Como
se muestra en la Fig. 11, el crecimiento celular independiente del
anclaje de las células A549/hIGF-I productoras de
hIGF-1 aumentó en comparación con el crecimiento
celular independiente del anclaje de las células A549. Además,
cuando se añadieron 10 \mug/ml del anticuerpo
anti-hIGF KM1468 durante el cultivo de las células
A549/hIGF-I en agar blando, el crecimiento celular
independiente del anclaje era completamente inhibido por la adición
de KM1468. Esto es, se demostró que hIGF-I estaba
implicado en el crecimiento celular independiente del anclaje, y
que el crecimiento celular independiente del anclaje dependiente de
hIGF es inhibido por el anticuerpo anti-hIGF
KM1468.
Utilizando las células
A549/hIGF-I preparadas en el Ejemplo 4
(1-2) se examinó el efecto inhibidor del crecimiento
tumoral del anticuerpo anti-hIGF KM1468 en la
formación de tumores in vivo en la que hIGF-I
juega un papel de la siguiente manera.
Se cultivaron las células
A549/hIGF-I o las células A549 utilizando el medio
RPMI y después se suspendieron respectivamente en PBS a una
densidad celular de 1 x 10^{8} células/ml.
Una porción de 100 \mul de la suspensión
celular de células A549/hIGF-I o células A549 se
transplantó subcutáneamente a la región torácica derecha de cada
ratón carente de sistema inmunitario Balb/c Ajc-1 nu
(hembra) de 6 semanas de edad. El número de células transplantadas
por ratón llega a 1 x 10^{7} células. Empezando inmediatamente
después del trasplante, se administraron 500 \mug por ratón del
anticuerpo anti-hIGF KM1468 a través de la vena de
la cola dos veces por semana, 8 veces en total. Como control
negativo, se administró simultáneamente PBS en el mismo ratón con
el tumor transplantado. Cinco días después del transplante celular,
se midió el volumen del tumor. Se calculó el volumen del tumor
(mm^{3}) a partir de la longitud, la anchura y la altura del
tumor utilizando una fórmula de longitud x anchura x altura x
0,5236.
Los resultados se muestran en la Fig. 12. Cuando
el crecimiento del tumor subcutáneo en el ratón transplantado con
células A549 que no producen hIGF-I se comparaba con
el del ratón transplantado con las células
A549/hIGF-I que producen hIGF-I, el
crecimiento del tumor se incrementaba en el caso del tumor
subcutáneo del ratón transplantado con las células
A549/hIGF-I. Además, en el ratón transplantado con
las células A549/hIGF-I, el crecimiento del tumor
subcutáneo era significativamente inhibido cuando se administraba el
anticuerpo anti-hIGF KM1468. Este resultado muestra
característicamente que el anticuerpo anti-hIGF
KM1468 inhibe el crecimiento del tumor también in vivo
debido a la inhibición de hIGF-I.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó una porción de 27 \mug de ARNm
derivado de KM1468 a partir de 5 x 10^{7} células de hibridoma
KM1468 productor de un anticuerpo anti-hIGF KM1468
(FERM BP 7978) utilizando un kit de preparación de ARNm Fast Track
mRNA Isolation Kit (fabricado por Invitrogen) de acuerdo con las
instrucciones adjuntas.
Se sintetizó un ADNc que tenía una secuencia
adaptadora EcoRI-NotI en ambos extremos a partir de 5
\mug del ARNm de KM1468 preparado en el Ejemplo
5(1-1) utilizando el Kit de Síntesis de ADNc
TimeSaver (fabricado por Amersham Pharmacia) de acuerdo con las
instrucciones adjuntas. Se disolvió la cantidad total de ADNc
sintetizado en 2,0 \mul de agua estéril y después se fraccionó
mediante electroforesis en gel de agarosa, y se recuperaron un
fragmento de ADNc de aproximadamente 1,5 kb correspondiente a la
cadena H de un anticuerpo de clase IgG y un fragmento de ADNc de
aproximadamente 1,0 kb correspondiente a la cadena L de una clase
\kappa en una cantidad de aproximadamente 1,0 \mug
respectivamente utilizando el Kit de Extracción en Gel QIAquick
(fabricado por QIAGEN). A continuación, utilizando \lambdaZAPII
Predigested ECORI/CIAP-Treated Vector Kit (fabricado
por Stratagene), se ligaron 0,1 \mug del fragmento de ADNc de
aproximadamente 1,5 kb y 0,1 \mug del fragmento de ADNc de
aproximadamente 1,0 kb a 1 \mug de vector \lambdaZAPII cuyos
extremos habían sido desfoforilados con Fosfatasa Alcalina de
Intestino de ternera tras la digestión con una enzima de restricción
EcoRI anexada al kit, de acuerdo con las instrucciones
adjuntas. Tras la ligación, se empaquetaron 2,5 \mul de cada
solución de reacción en fago \lambda utilizando Gigapack III Gold
Packaging Extracts (fabricado por Stratagene) de acuerdo con las
instrucciones adjuntas para obtener de ese modo 5,0 x 10^{4}
clones de fago como genoteca de ADNc de la cadena H de KM1468, y
4,0 x 10^{4} clones de fago como genoteca de ADNc de cadena L. A
continuación, se inmovilizó cada fago sobre un filtro de membrana
de nailon Hybond-N^{+} (fabricado por Amersham
Pharmacia) de acuerdo con un método convencional (Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press Nueva
York, 1989).
Se detectaron los filtros de membrana de nailon
de la genoteca de ADNc de la cadena H y la genoteca de ADNc de la
cadena L de KM1468 preparadas en el Ejemplo 5 (1-2)
utilizando un ADNc de la región C de un anticuerpo de ratón [la
cadena H es un fragmento de un ADNc de C\gamma2b de ratón (Nature,
283, 786-789, 1980), y la cadena L es un fragmento
de ADNc de C\kappa de ratón (Cell, 22, 197-207,
1980)] como sonda utilizando ECL Direct Nucleic Acid Labeling and
Detection Systems (fabricado por Amersham Pharmacia) de acuerdo con
las instrucciones adjuntas, y ese obtuvieron 10 fagos fuertemente
hibridados con la sonda para la cadena H y la cadena L. A
continuación, se convirtió cada clon de fago en plásmido mediante un
método de escisión in vivo de acuerdo con las instrucciones
de \lambdaZAPII Predigested EcoRI/CIAP-Treated
Vector Kit (fabricado por Stratagene). Se determinó la secuencia de
nucleótidos del ADNc contenido en el plásmido obtenido llevando a
cabo la reacción utilizando BigDye Terminator Cycle Sequencing FS
Ready Reaction Kit (fabricado por Applied Biosystems) de acuerdo
con las instrucciones adjuntas, y utilizando un analizador
automático de secuencias de nucleótidos ABI PRISM 377 (fabricado
por Applied Biosystems). Como resultado, se obtuvieron un plásmido
pKM1468H5-2 que contenía toda la longitud del ADNc
de la cadena H funcional y un plásmido pKM1468L5-1
que contenía toda la longitud del ADNc de la cadena L, en el que
estaba presente la secuencia ATG considerada el codón de iniciación
en el extremo 5' del respectivo ADNc.
Las secuencias de nucleótidos completas de VH de
KM1468 contenida en el plásmido pKM1468H5-2 se
muestra en el SEQ ID NO: 1 y las secuencias de aminoácidos
completas de VH de KM1468 deducidas de allí se muestran en el SEQ
ID NO: 2, y la secuencia de nucleótidos completa de VL de KM1468
contenida en el plásmido pKM1468L5-1 se muestra en
el SEQ ID NO: 3 y la secuencia de aminoácidos completa de VL de
KM1468 deducida de allí se muestra en SEQ ID NO: 4,
respectivamente. En relación con esto, existe un gran número de
secuencias de nucleótidos correspondientes respectivamente a las
secuencias de aminoácidos mostradas por los SEQ ID NOS: 2 y 4,
distintas de aquellas mostradas por los SEQ ID NOS: 1 y 3, y todas
ellas están incluidas en el alcance de la presente invención.
Basándose en la comparación con los datos de secuencias conocidas de
anticuerpos (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US
Dept. Health and Human Services, 1991) y o la comparación con los
resultados del análisis de las secuencias de aminoácidos N
terminales de VH y VL del anticuerpo anti-hIGF
anticuerpo KM1468 purificado utilizando un secuenciador de
proteínas PPSQ-10 (fabricado por Shimadzu), se
reveló que el ADNc respectivo aislado es un ADNc completo que
contiene una secuencia señal de secreción que codifica la cadena H
o la cadena L del anticuerpo anti-hIGF KM1468, y una
secuencia desde las posiciones-19^{a}
a-1^{a} de la secuencia de aminoácidos mostrada
por el SEQ ID NO: 2 es la secuencia señal de secreción de VH, y una
secuencia desde las posiciones-22^{a}
a-1^{a} de la secuencia de aminoácidos mostrada
por el SEQ ID NO: 4 es la secuencia señal de secreción de VL.
A continuación, se examinó la novedad de las
secuencias de aminoácidos de VH y VL del anticuerpo
anti-hIGF KM1468. Utilizando GCG Package (versión
10.0, fabricado por Genetics Computer Group) como sistema analizador
de la secuencia, se investigaron las bases de datos de secuencias
de aminoácidos de proteínas existentes [SWISS-PROT
(Release 39.0), PIR-Protein (Release 65.0)] mediante
el método BLAST (Journal of Molecular Biology, 215,
403-410, 1990). Como resultado, no se encontraron
secuencias que coincidieran completamente tanto para VH como para
VL, y se confirmó que VH y VL del anticuerpo
anti-hIGF KM1468 son secuencias de aminoácidos
novedosas.
Además, se identificaron las CDR de VH y VL del
anticuerpo anti-hIGF KM1468 comparando las
secuencias de aminoácidos de anticuerpos conocidos. Las secuencias
de aminoácidos de CDR1, 2 y 3 de la VH de KM1468 se muestran en los
SEQ ID NO: 5, 6 y 7, y las secuencias de aminoácidos de CDR1, 2 y 3
de la VL en los SEQ ID NO: 8, 9 y 10, respectivamente.
Se construyó un vector de expresión de
anticuerpo quimérico anti-hIGF-I
derivado del anticuerpo anti-hIGF KM1468 de la
siguiente manera utilizando el vector para la expresión del
anticuerpo humanizado pKANTEX93 descrito en el documento WO
97/10354 que puede expresar anticuerpos IgG1 humanos, de clase
\kappa y los plásmidos obtenidos en el Ejemplo
5(1-3) que contenían los ADNc para la cadena
H y la cadena L de KM1468.
En primer lugar, con el fin de insertar los ADNc
para VH y VL en el vector de expresión pKANTEX93 de manera que las
secuencias de aminoácidos no cambiaran, se reconstruyeron los ADNc
para VH y VL de KM1468. En cuanto a los cebadores, se diseñaron ADN
sintéticos respectivamente que tenían las secuencias de nucleótidos
de los SEQ ID NO: 11 y 12 para el ADNc de VH, y los ADNc sintéticos
que tenían respectivamente las secuencias de nucleótidos de los SEQ
ID NO: 13 y 14 para el ADNc de VL. Cada uno de los ADN sintéticos
contiene una secuencia de reconocimiento para enzimas de
restricción en el extremo 5' para su clonación en pKANTEX93.
Específicamente, se añadieron 20 ng del plásmido
pKM1468H5-2 obtenido en el Ejemplo
5(1-3) a una solución tampón que contenía 50
\mul de Tampón Núm. 1 para PCR anclado a ADN Polimerasa KOD
(fabricado por TOYOBO), dNTP 0,2 mM, cloruro de magnesio 1 mM y 0,5
\muM de ADN sintéticos que tenían las secuencias de nucleótidos
mostradas en los SEQ ID NO: 11 y 12, y utilizando un ciclador
térmico de ADN GeneAmp PCR System 9600 (fabricado por PERKIN
ELMER), la mezcla se calentó a 94ºC durante 3 minutos, a lo que se
añadieron 2,5 unidades de ADN Polimerasa KOD (fabricada por
TOYOBO), y se repitió un ciclo de 15 segundos a 98ºC, 2 segundos a
65ºC y 30 segundos a 74ºC 25 ciclos. De la misma manera, se llevó a
cabo otra PCR mediante el mismo método descrito antes, añadiendo 20
ng del plásmido pKM1468L5-1 obtenido en el Ejemplo
5(1-3) a una solución tampón que contenía 50
\mul de Tampón Núm. 1 para PCR anclado a ADN Polimerasa KOD
(fabricado por TOYOBO), dNTP 0,2 mM, cloruro de magnesio 1 mM y 0,5
\muM de los fragmentos de ADN sintético que tenían las secuencias
de nucleótidos mostradas en los SEQ ID NO: 13 y 14. Una porción de
10 \mul de cada solución de reacción se sometió a electroforesis
en gel de agarosa, y después se recuperó un producto de PCR de
aproximadamente 0,5 kb para VH o un producto de PCR de
aproximadamente 0,43 kb para VL utilizando un Kit de Extracción en
Gel QIAquick (fabricado por QIAGEN).
A continuación, se prepararon 0,1 \mug de ADN
obtenido digiriendo el plásmido pBluescript II SK(-) (fabricado por
Stratagene) con la enzima de restricción SmaI (fabricada por
Takara Shuzo) y desfosforilando después los extremos con Fosfatasa
Alcalina de Intestino de Ternera (referida en adelante como CIAP;
fabricada por Takara Shuzo) y 0,1 \mug de cada producto de PCR
obtenido antes en 7,5 \mul añadiendo agua estéril y después se
dejaron reaccionar a 22ºC durante la noche después de añadir 7,5
\mul de la solución I del Kit de Ligación de ADN TaKaRa Ver. 2
(fabricado por Takara Shuzo) y 0,3 \mul de la enzima de
restricción SmaI (fabricada por Takara Shuzo). Utilizando la
solución de ADN del plásmido recombinante obtenida de esta manera,
se transformó una cepa de Escherichia coli DH5\alpha
(fabricada por TOYOBO). Cada ADN plasmídico fue preparado a partir
del transformante, se determinó su secuencia de nucleótidos llevando
a cabo la reacción utilizando BigDye Terminator Cycle Sequencing FS
Ready Reaction Kit (fabricado por Applied Biosystems) de acuerdo con
las instrucciones adjuntas y utilizando un analizador automático de
la secuencia de nucleótidos ABI PRISM 377 (fabricado por Applied
Biosystems). De esta manera, se obtuvieron los plásmidos pKM1468VH y
pKM1468VL que tenían las secuencias de nucleótidos de interés
mostradas en la Fig. 13.
A continuación, se construyó un plásmido
pKANTEX1468H mostrado en la Fig. 14 insertando el fragmento cortado
con las enzimas de restricción (NotI-ApaI) que
contenía el ADNc de VH de pKM1468VH obtenido antes en el sitio
NotI-ApaI del vector pKANTEX93 para la expresión del
anticuerpo humanizado. Asimismo, se construyó un plásmido
pKANTEX1468Chi mostrado en la Fig. 14 insertando el fragmento
cortado con las enzimas de restricción (EcoRI-BsiWI)
que contenía el ADNc de VL de pKM1468VL obtenido antes en el sitio
EcoRI-BsiWI del plásmido pKANTEX1468H. Utilizando el
plásmido pKANTEX1468Chi, se determinaron las secuencias de
nucleótidos de las moléculas de ADNc de VH y VL llevando a cabo la
reacción utilizando BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready
Reaction Kit (fabricado por Applied Biosystems) de acuerdo con las
instrucciones adjuntas y utilizando el analizador automático de
secuencias de nucleótidos ABI PRISM 377 (fabricado por Applied
Biosystems), y como resultado se confirmó que se habían obtenido
los plásmidos clonados con los ADNc de VH y VL de interés.
Utilizando el vector de expresión del anticuerpo
quimérico anti-hIGF pKANTEX1468Chi obtenido en el
Ejemplo 5(2-1), se llevó a cabo la expresión
del anticuerpo quimérico anti-hIGF en una célula
animal de la siguiente manera.
Se digirió el plásmido pKANTEX1468Chi con una
enzima de restricción AatII (fabricada por TOYOBO) para
linealizarlo, se introdujo una porción de 10 \mug del mismo en 4 x
10^{6} células de una línea celular de mieloma de rata YB2/0
(ATCC CRL 1581) mediante el método de electroporación
(Cytotechnology, 3, 133-140, 1990), y después se
suspendieron las células en 40 ml de medio H-SFM (5)
[medio H-SFM (fabricado por Gibco BRL) que contenía
FCS al 5%] y se dispensaron en porciones de 200 \mul/pocillo en
una placa de cultivo de 96 pocillos (fabricada por Sumitomo
Bakelite). Después de 24 horas de cultivo a 37ºC en una incubadora
con CO_{2} al 5%, se añadió G418 a esto a una concentración de
0,5 mg/ml y adicionalmente se cultivó durante 1 a 2 semanas. Los
sobrenadantes de cultivo se recuperaron de los pocillos en los que
se habían formado colonias de transformantes que mostraban
resistencia a G418 y que se habían vuelto confluentes, y se midió la
concentración del anticuerpo quimérico anti-hIGF en
los sobrenadantes mediante un ELISA de unión mostrado en el Ejemplo
6(1).
Respecto a cada uno de los transformantes de los
pocillos en los que se encontró expresión del anticuerpo quimérico
anti-hIGF en los sobrenadantes de cultivo, con el
fin de incrementar la expresión antigénica utilizando un sistema de
amplificación del gen dhfr, se suspendió cada uno de los
transformantes a una densidad de 1 a 2 x 10^{5} células/ml en
H-SFM(5) que contenía 0,5 mg/ml de G418 y 50
nM de metotrexato (referido en adelante como MTX, fabricado por
SIGMA) que es un inhibidor de un producto génico de dhfr
dihidrofolato reductasa (referida en adelante como DHFR), y la
suspensión se dispensó en porciones de 1 ml en una placa de cultivo
de 24 pocillos (fabricada por Greiner). Cultivando a 37ºC durante 1
a 2 semanas en una incubadora con CO_{2} al 5%, se indujeron
transformantes que mostraban resistencia a MTX 50 mM. Cuando los
transformantes llegaron a la confluencia en los pocillos, se midió
la concentración del anticuerpo quimérico anti-hIGF
en los sobrenadantes de cultivo mediante el ELISA de unión mostrado
en el Ejemplo 6(1). Los transformantes de los pocillos en
los cuales se encontró expresión del anticuerpo quimérico
anti-hIGF en los sobrenadantes de cultivo se
cultivaron después en un medio que contenía MTX 100 nM mediante el
mismo método descrito antes, y los transformantes obtenidos de la
misma manera se cultivaron adicionalmente en un medio que contenía
200 nM para obtener finalmente un transformante que puede crecer en
H-SFM(5) que contiene 0,5 mg/ml de G418 y
200 nM de MTX y puede expresar sumamente el anticuerpo quimérico
anti-hIGF. Sometiendo el transformante obtenido de
este modo a clonación de una sola célula mediante el método de
dilución limitante dos veces, se obtuvo un transformante que tenía
la expresión más alta del anticuerpo quimérico
anti-hIGF. Como transformante que produce el
anticuerpo quimérico anti-hIGF derivado de KM1468,
se puede citar KM3002. El transformante KM3002 se depositó el 2 de
Abril de 2002, como FERM BP-7996, en el Depósito
Internacional de Organismos de Patentes, Instituto Nacional de
Ciencia Industrial y Tecnología Avanzada (código postal
305-8566; Central 6,
1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki,
Japón).
El transformante KM3002 obtenido en el Ejemplo
5(3) que expresa el anticuerpo quimérico
anti-hIGF se suspendió en H-SFM que
contenía 0,5 mg/ml de G418, 200 nM de MTX y 5% de GF21 de Daigo
(fabricado por Wako Pure Chemical Industries) a una densidad de 1 a
2 x 10^{5} células/ml, y se dispensó en porciones de 100 ml en
matraces de 175 cm^{2} (fabricado por Greiner). Las células se
cultivaron a 37ºC durante 5 a 7 días en una incubadora con CO_{2}
al 5%, y el sobrenadante de cultivo se recuperó cuando llegaron a la
confluencia. Purificando el anticuerpo quimérico
anti-hIGF KM3002 a partir de aproximadamente 1 litro
del sobrenadante de cultivo utilizando una columna
Prosep-A (fabricada por Bioprocessing) de acuerdo
con las instrucciones adjuntas, se obtuvieron aproximadamente 10,2
mg de proteína purificada. Se sometieron aproximadamente 4 \mug
del anticuerpo quimérico anti-hIGF obtenido a
electroforesis de acuerdo con un método conocido (Nature, 227,
680-685, 1970) para examinar su peso molecular y su
grado de purificación. Los resultados se muestran en la Fig. 15. A
partir del anticuerpo quimérico anti-hIGF
purificado KM3002, se observó una banda correspondiente a un peso
molecular de aproximadamente 150 kilodaltons (referido en adelante
como Kd) en condiciones no reductoras, y se obtuvieron dos bandas
correspondientes a aproximadamente 50 Kd y aproximadamente 25 Kd en
condiciones reductoras. Estos pesos moleculares coincidían con los
informes de que el anticuerpo de clase IgG tiene un peso molecular
de aproximadamente 150 Kd en condiciones no reductoras, y se
degrada a una cadena H que tiene un peso molecular de
aproximadamente 50 Kd y una cadena L que tiene un peso molecular de
aproximadamente 25 Kd en condiciones reductoras debido al corte del
enlace S-S intramolecular (Antibodies: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Capítulo 14, 1988;
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press
Limited, 1996), confirmando de este modo que el anticuerpo
quimérico anti-hIGF KM3002 es expresado como
molécula de anticuerpo que tiene una estructura apropiada. Además,
como resultado del análisis de las secuencias de aminoácidos N
terminales de la cadena H y la cadena L del anticuerpo quimérico
anti-hIGF purificado KM3002 utilizando un
secuenciador de proteínas PPSQ-10 (fabricado por
Shimadzu), se confirmó que estas coincidían con las secuencias de
aminoácidos N terminales de la cadena H y la cadena L del anticuerpo
anti-hIGF KM1468.
\vskip1.000000\baselineskip
Se examinó la reactividad del anticuerpo de rata
anti-hIGF KM1468 y el anticuerpo quimérico
anti-hIGF KM3002 purificado en el Ejemplo
5(2-3) con hIGF-I mediante el
ELISA mostrado en el Ejemplo 1(4). En este caso, sin
embargo, la concentración de
BSA-hIGF-I metilado inmovilizado
sobre la placa de ELISA se cambió a 0,5 \mug/ml, y se utilizó
anticuerpo anti-Ig de rata de conejo marcado con
peroxidasa diluido 4.000 veces (fabricado por DAKO) como anticuerpo
secundario en el caso del anticuerpo de rata, anticuerpo
anti-IgG1 humana de ratón marcado con peroxidasa
diluido 1.000 veces (fabricado por Southern Biotechnology) en el
caso del anticuerpo quimérico. Como se muestra en la Fig. 16, el
anticuerpo quimérico anti-hIGF KM3002 mostraba
actividad de unión dependiente de la concentración de anticuerpo
para hIGF-I. Además, se sugirió que su actividad es
equivalente al anticuerpo de rata anti-hIGF KM1468,
aunque es difícil compararlos directamente debido a los anticuerpos
secundarios diferentes.
Se examinó la influencia del anticuerpo de rata
anti-hIGF KM1468, el anticuerpo quimérico
anti-hIGF KM3002 purificado en el Ejemplo
5(2-3), un anticuerpo
anti-hIGF-I disponible en el mercado
sm1.2 (fabricado por Upstate Biotechnology) y un anticuerpo
anti-hIGF-II disponible en el
mercado S1F2 (fabricado por Upstate Biotechnology) sobre el
crecimiento celular dependiente de hIGF mediante el mismo método del
Ejemplo 3(4). Se utilizó una línea de células de cáncer de
colon HT-29 (ATCC HTB-38) como línea
de células de cáncer humano.
El crecimiento de las células con la adición de
los respectivos anticuerpos se muestran en la Fig. 17A en presencia
de 2 ng/ml de hIGF-I, y en la Fig. 17B en presencia
de 10 ng/ml de hIGF-II. Como se muestra en la Fig.
17, de un modo similar al caso de KM1468, KM3002 inhibía fuertemente
el crecimiento celular por hIGF-I y
hIGF-II, y la actividad era mayor que las del
anticuerpo anti-hIGF-I disponible en
el mercado sm1.2 y el anticuerpo
anti-hIGF-II disponible en el
mercado S1F2. Además, el anticuerpo anti-hIGF KM1468
que tenía la misma región variable del anticuerpo quimérico KM3002
mostraba casi la misma actividad inhibidora del crecimiento. Los
resultados anteriores demuestran el anticuerpo quimérico
anti-hIGF KM3002 derivado de KM1468 mantiene una
actividad de unión al antígeno y una especificidad de unión
equivalentes a las del anticuerpo de rata KM1468 original después
de la quimerización.
\vskip1.000000\baselineskip
En primer lugar, se diseñó la secuencia de
aminoácidos de VH del anticuerpo injertado con CDR
anti-hIGF como sigue. Se seleccionó una secuencia
de aminoácidos FR de VH de un anticuerpo humano para injertar la
secuencia de aminoácidos de CDR de VH del anticuerpo
anti-hIGF KM1468 identificado en el Ejemplo
5(1-4. Cuando se buscaba un FR de anticuerpo
humano que tenía la homología más alta con la FR de VH del
anticuerpo anti-hIGF KM1468 de una base de datos
oficial, CAM (Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America, 77, 3239-3243, 1980)
mostraba la homología más alta (81,6%). Por consiguiente, se diseñó
la VH del anticuerpo injertado con CDR anti-hIGF
basándose en la FR de CAM. En la FR de CAM, había cuatro posiciones
en las que la secuencia de aminoácidos no se determina unívocamente
(posición 13^{a}, posición 74^{a}, posición 77^{a} y posición
90^{a}), y se reconocían restos aminoácido que no son comunes en
las secuencias de anticuerpos humanos en la 3^{a} posición y en
la 40^{a} posición. Con el fin de reducir la inmunogenicidad, se
cambiaron estos restos aminoácido a restos aminoácido que se
encuentran en los anticuerpos humanos con una alta frecuencia
(Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health
and Human Services, 1991). Injertando la secuencia de aminoácidos
de CDR de VH del anticuerpo anti-hIGF KM1468 en una
posición apropiada de la secuencia de aminoácidos de FR derivada de
CAM diseñada, se diseñó la secuencia de aminoácidos de VH HV.0 del
anticuerpo injertado con CDR anti-hIGF descrita en
el SEQ ID NO: 15.
A continuación, se diseñó la secuencia de
aminoácidos de la VL del anticuerpo injertado con CDR
anti-hIGF como sigue. Se seleccionó una secuencia
de aminoácidos de FR de VL de un anticuerpo humano para injertar la
secuencia de aminoácidos de CDR de VL del anticuerpo
anti-hIGF KM1468 identificado en el Ejemplo
5(1-4). Cabat et al. han clasificado
diferentes regiones VL conocidas de anticuerpos humanos en 4
subgrupos basándose en la homología de sus secuencias de
aminoácidos (HSG I a IV), y han informado sobre las secuencias
consenso para los respectivos grupos (Sequences of Proteins of
Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991).
Puesto que existe la posibilidad de que estas secuencias consenso
tengan una baja inmunogenicidad en seres humanos, se decidió
diseñar la secuencia de aminoácidos de VL de un anticuerpo injertado
con CDR anti-hIGF basado en estas secuencias
consenso. Con el fin de preparar un anticuerpo injertado con CDR
anti-hIGF que tenga una actividad superior, entre
las secuencias de aminoácidos de FR de las secuencias consenso de
cuatro subgrupos de VL de anticuerpos humanos, se seleccionó una
secuencia de aminoácidos de FR que tuviera la homología más alta
con la secuencia de aminoácidos de FR de VL de KM1468. Los
resultados de la búsqueda de homología se muestran en la Tabla 2.
Como se muestra en la Tabla 2, la secuencia de aminoácidos de Fr de
la región VL de KM1468 mostraba la homología más elevada con el
subgrupo IV.
Basándose en los resultados anteriores, se
diseñó la secuencia de aminoácidos de VL LV.0 del anticuerpo
injertado con CDR anti-hIGF mostrada en el SEQ ID
NO: 16 injertando la secuencia de aminoácidos de CDR de VL del
anticuerpo anti-hIGF KM1468 en una posición
apropiada de la secuencia de aminoácidos de FR de la secuencia
consenso del subgrupo IV del anticuerpo humano VL.
La secuencia de aminoácidos de VH HV.0 y la
secuencia de aminoácidos de VL LV.0 del anticuerpo injertado con
CDR anti-hIGF son secuencias en las cuales solamente
las secuencias de aminoácidos de CDR del anticuerpo
anti-hIGF KM1468 fueron injertadas en las
secuencias de aminoácidos de FR seleccionadas de un anticuerpo
humano. Generalmente, en el caso de los anticuerpos injertados con
CDR humana, sus actividades se reducen en muchos casos cuando las
secuencias de aminoácidos de CDR de un anticuerpo de un animal no
humano son injertadas solas. Con el fin de evitar este problema,
entre los restos aminoácido de FR diferentes entre un anticuerpo
humano y un anticuerpo de un animal no humano, se injertan ciertos
restos aminoácido que se considera que ejercen influencia sobre la
actividad junto con las secuencias de aminoácidos de CDR. Por
consiguiente, se llevó a cabo un examen de la identificación de los
restos aminoácido de FR que se considera que ejercen influencia
sobre la actividad. En primer lugar, se construyó una estructura
tridimensional de una región V de un anticuerpo (HV0LV0) que
comprende la secuencia de aminoácidos de VH HV.0 y la secuencia de
aminoácidos de VL LV.0 del anticuerpo injertado con CDR
anti-hIGF diseñado antes utilizando técnicas de
modelado por ordenador. Se utilizó un sistema de coordenadas de la
estructura tridimensional empleando un soporte lógico AbM (fabricado
por Oxford Molecular), y se presentó la estructura tridimensional
utilizando el soporte lógico Pro-Explore (fabricado
por Oxford Molecular) o RasMo1 (fabricado por Glaxo), de acuerdo
con las respectivas instrucciones adjuntas. Asimismo, se construyó
un modelo por ordenador de la estructura tridimensional de la
región V del anticuerpo anti-hIGF KM1468 de la misma
manera. Además, se construyó de la misma manera un modelo de
estructura tridimensional que comprende secuencias de aminoácidos
en las que se cambiaron los restos aminoácido de las secuencias de
aminoácidos de FR de VH y VL de HV0LV0, que eran diferentes de los
del anticuerpo anti-hIGF KM1468, por orden a restos
situados en las correspondientes posiciones del anticuerpo
anti-hIGF KM1468, y se compararon las estructuras
tridimensionales de la región V del anticuerpo
anti-hIGF KM1468, HV0LV0 y de HV0LV0 modificado.
Como resultado, como restos que se consideraba que ejercían
influencia sobre la actividad del anticuerpo cambiando la estructura
tridimensional de la región de unión al antígeno, entre los restos
aminoácido de Fr de HV0LV0, se seleccionaron la Gln de la 1^{a}
posición, la Asn de la 77^{a} posición, la Asn de la 84^{a}
posición, la Val de la 93^{a} posición, la Ala de la 97^{a}
posición y la Arg de la 98^{a} posición con respecto a HV.0, y el
Asp de la 1^{a} posición, el Asp de la 9^{a} posición, la Ser
de la 10^{a} posición, la Leu de la 11^{a} posición, la Asn de
la 22^{a} posición, la Tyr de la 35^{a} posición, la Pro de la
39^{a} posición, la Pro de la 42^{a} posición, la Leu de la
45^{a} posición, la Leu de la 46^{a} posición, el Asp de la
69^{a} posición, la Phe de la 70^{a} posición, la Thr de la
71^{a} posición, la Val de la 82^{a} posición y la Val de la
84^{a} posición con respecto a LV.0. Entre estos restos aminoácido
seleccionados, al menos uno o más de los mismos se cambiaron a
restos aminoácido encontrados en el anticuerpo de rata KM1468 para
diseñar de ese modo VH y VL del anticuerpo injertado con CDR humana
que tenía diferentes modificaciones.
Se construyó un ADNc que codifica la secuencia
de aminoácidos de VH del anticuerpo injertado con CDR
anti-hIGF HV.0 diseñado en el Ejemplo 7
(1-1) utilizando una PCR de la siguiente manera.
En primer lugar, se conectó la secuencia de
aminoácidos diseñada con la secuencia señal de secreción de la
cadena H del anticuerpo anti-hIGF KM1468 mostrada en
el SEQ ID NO: 2 para elaborar la secuencia de aminoácidos del
anticuerpo completa. A continuación, se convirtió dicha secuencia de
aminoácidos en codones génicos. Cuando estaban presentes dos o más
codones génicos para un resto aminoácido, se determinó el
correspondiente codón génico teniendo en cuenta el uso codónico
encontrado en las secuencias de nucleótidos de los genes de
anticuerpos (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US
Dept. Health and Human Services, 1991). Conectando los codones
génicos determinados, se diseñó la secuencia de nucleótidos de un
ADNc que codificaba la secuencia de aminoácidos de la región V del
anticuerpo completo, y se añadieron las secuencias de nucleótidos
para la unión de los cebadores para la amplificación por PCR
(incluyen una secuencia de reconocimiento para una enzima de
restricción para la clonación en un vector para la expresión del
anticuerpo humanizado) al extremo 5' y al extremo 3'. La secuencia
de nucleótidos diseñada de este modo se dividió en un total de seis
fragmentos, comprendiendo cada uno aproximadamente 100 bases,
partiendo del lado terminal 5' (de tal manera que las secuencias de
nucleótidos contiguas tengan una secuencia solapante de
aproximadamente 20 bases en los extremos), y se sintetizaron los
oligonucleótidos sintéticos basándose en ellos en un orden alterno
de cadena efectora y cadena antisentido (fabricado por
GENSET).
GENSET).
Se añadió cada uno de los oligonucleótidos a 50
\mul de la solución de reacción a una concentración final de 0,1
\muM, y se llevó a cabo la PCR utilizando 0,5 \muM de cebador RV
de M13 (fabricado por Takara Shuzo), 0,5 \muM de cebador M4 de
M13 (fabricado por Takara Shuzo) y 1 unidad de polimerasa KOD
(fabricada por TOYOBO) de acuerdo con las instrucciones adjuntas a
la polimerasa KOD. Con respecto a las condiciones de reacción en
este caso, la reacción se llevó a cabo de acuerdo con las
condiciones descritas en las instrucciones (30 ciclos de un ciclo
que comprendía 94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 30 segundos y
74ºC durante 60 segundos). La solución de reacción se sometió a
precipitación con etanol, el producto precipitado se disolvió en
agua estéril, que se sometió a un tratamiento con enzimas de
restricción apropiadas y después se conectó a un plásmido
pBluescript II SK(-) (fabricado por Stratagene). Utilizando la
solución de ADN plasmídico recombinante obtenida de esta manera, se
transformó una cepa de Escherichia coli DH5\alpha y se
prepararon las muestras de ADN plasmídico a partir de los
transformantes resultantes. Se analizaron las secuencias de
nucleótidos de las muestras de ADN plasmídico obtenido utilizando
BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (fabricado
por Applied Biosystems), y se confirmó que se había obtenido un
plásmido que tenía la secuencia de nucleótidos de interés.
A continuación, se modificaron los restos
aminoácido de FR diseñados en el Ejemplo
6(1-1) preparando oligonucleótidos
sintéticos que tenían mutaciones y llevando a cabo la PCR mencionada
antes, o llevando a cabo la PCR utilizando un ADN plasmídico que
contenía ADNc que codificaba la HV.0 preparada antes como molde y un
ADN sintético que tenía una mutación como cebador y aislando el
fragmento amplificado. La modificación se llevó a cabo de tal
manera que los codones génicos de los restos aminoácido después de
la modificación fueran los codones génicos encontrados en el
anticuerpo de rata KM1468.
Se construyó un ADNc que codificaba la secuencia
de aminoácidos de VL del anticuerpo injertado con CDR
anti-hIGF LV.0 diseñada en el Ejemplo 7
(1-1) utilizando la PCR de la siguiente manera.
En primer lugar, se conectó la secuencia de
aminoácidos diseñada a la secuencia señal de secreción de la cadena
L del anticuerpo anti-hIGF KM1468 mostrada en el SEQ
ID NO: 4 para elaborar la secuencia de aminoácidos de anticuerpo
completa. A continuación, se convirtió dicha secuencia de
aminoácidos en codones génicos. Cuando estaban presentes dos o más
codones génicos para un resto aminoácido, se determinó el codón
génico correspondiente teniendo en cuenta el uso codónico
encontrado en las secuencias de nucleótidos de los genes de
anticuerpos (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US
Dept. Health and Human Services, 1991). Conectando los codones
génicos determinados, se diseñó la secuencia de nucleótidos de un
ADNc que codificaba la secuencia de aminoácidos de la región V del
anticuerpo completo, y se añadieron las secuencias de nucleótidos
para la unión de los cebadores para la amplificación por PCR
(incluyendo una secuencia de reconocimiento para enzimas de
restricción para la clonación en un vector para su uso en la
expresión del anticuerpo humanizado) al extremo 5' y al extremo 3'.
La secuencia de nucleótidos diseñada de este modo se dividió en un
total de seis fragmentos, comprendiendo cada uno aproximadamente
100 bases, partiendo de lado 5' terminal (de tal manera que las
secuencias de nucleótidos contiguas tuvieran una secuencia
solapante de aproximadamente 20 bases en los extremos), y se
sintetizaron los oligonucleótidos sintéticos basándose en ellas en
un orden alterno de cadena efectora y cadena antisentido
(fabricados por GENSET).
Se añadió cada oligonucleótido a 50 \mul de la
solución de reacción a una concentración final de 0,1 \muM, y se
llevó a cabo la PCR utilizando 0,5 \muM de cebador RV de M13
(fabricado por Takara Shuzo), 0,5 \muM de cebador M4 de M13
(fabricado por Takara Shuzo) y 1 unidad de polimerasa KOD (fabricada
por TOYOBO) de acuerdo con las instrucciones adjuntas a la
polimerasa KOD. Con respecto a las condiciones de reacción, la
reacción se llevó a cabo de acuerdo con las condiciones descritas
en las instrucciones (30 ciclos de un ciclo que comprendía 94ºC
durante 30 segundos, 50ºC durante 30 segundos 74ºC durante 60
segundos). La solución de reacción se sometió a precipitación con
etanol, el producto precipitado se disolvió en agua estéril, se
sometió a tratamiento con enzimas de restricción apropiadas y
después se conectó al plásmido pBluescript II SK(-) (fabricado por
Stratagene). Utilizando la solución de ADN plasmídico recombinante
obtenida de esta manera, se transformó la cepa de Escherichia
coli DH5\alpha y se prepararon muestras de ADN plasmídico a
partir de los transformantes resultantes. Las secuencias
nucleotídicas de las muestras de ADN plasmídico se analizaron
utilizando BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit
(fabricado por Applied Biosystems), y se confirmó que se había
obtenido un plásmido que tenía la secuencia de nucleótidos de
interés.
A continuación, se modificaron los restos
aminoácido de FR diseñados en el Ejemplo 6 (1-1)
preparando un oligonucleótido sintético que tenía mutaciones y
llevando a cabo la PCR mencionada antes, o llevando a cabo la PCR
utilizando un ADN plasmídico que contenía ADNc que codificaba la
LV.0 preparada antes como molde y un ADN sintético que tenía una
mutación como cebador, y aislando el fragmento amplificado. La
modificación se llevó a cabo de tal manera que los codones génicos
de los restos aminoácido después de la modificación fueran los
codones génicos encontrados en el anticuerpo
anti-hIGF KM1468.
Se construyeron diferentes vectores de expresión
de anticuerpos injertados con CDR anti-hIGF
insertando los ADNc que codificaban HV.0 y LV.0 obtenidos en el
Ejemplo 7 (1-2) y en el Ejemplo 7
(1-3) y los ADNc que codificaban sus productos
modificados en una posición apropiada del vector pKANTEX93 para la
expresión del anticuerpo humanizado descrito en el documento WO
97/10354.
Se llevaron a cabo la expresión estable del
anticuerpo injertado con CDR anti-hIGF utilizando
una célula animal y la purificación del anticuerpo del sobrenadante
de cultivo de acuerdo con el método mencionado anteriormente
descrito en el Ejemplo 5(3).
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un anticuerpo que se una específicamente a
IGF-I humano e IGF-II humano para
inhibir las funciones de IGF-I humano e
IGF-II humano y tenga una actividad de unión con
una constante de unión de 5 x 10^{9} M^{-1} o más medida con un
biosensor BIACORE. Otro objeto de la invención es proporcionar un
fármaco diagnóstico, un fármaco preventivo y un fármaco terapéutico
para una enfermedad mediada por IGF humano o una enfermedad en la
que su estado mórbido progresa por la aceleración anómala de
producción de IGF humano, utilizando dicho anticuerpo.
<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> anticuerpo contra el factor de
crecimiento de tipo insulínico humano
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<130> 11482W01
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<150> JP2002-129046
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<151>
2002-04-30
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<160> 28
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
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<210> 1
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<211> 411
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(411)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 1
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 137
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Rattus norvegicus
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<400> 2
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 387
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(387)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 9
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: ADN sintético
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaaagaattc gcggccgctc tccc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
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<211> 49
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: ADN sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaaagtcgac gggcccttgg tggaggctga agagacagtg accagagtg
\hfill49
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<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: ADN sintético
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 13
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaaagaattc tccaaacttc aagtacacaa tgg
\hfill33
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<210> 14
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<211> 35
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: ADN sintético
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 14
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaaagtcgac cgtacgtttc agttccagct tggtc
\hfill35
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: ADN sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatgaattca gaagcaatgg gaaaaatcag cagtc
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: ADN sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcattgtcgac gcatgtcact cttcactcct ca
\hfill32
Claims (24)
1. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos de
anticuerpo, que se une específicamente a IGF-I
humano e IGF-II humano para inhibir la función de
control de la proliferación, diferenciación y/o apoptosis de células
epiteliales tanto de IGF-I humano como de
IGF-II humano y puede inhibir tanto
IGF-I humano como IGF-II humano
equivalentemente, y la actividad de unión del anticuerpo es una
constante de unión de 5 x 10^{9} M^{-1} o más medida con un
biosensor BIACORE, donde las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable
de la cadena pesada (V_{H}) del anticuerpo o uno de sus
fragmentos de anticuerpo comprenden las secuencias de aminoácidos
representadas por los SEQ ID NO: 5, 6 y 7, respectivamente, y las
CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera
(V_{L}) del anticuerpo o uno de sus fragmentos de anticuerpo
comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por los SEQ
ID NO: 8, 9 y 10, respectivamente.
2. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de
anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, donde el anticuerpo
es un anticuerpo de un animal no humano o un anticuerpo
recombinante.
3. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de
anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2, donde el anticuerpo
recombinante se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo
quimérico humano, un anticuerpo injertado con CDR humana y un
anticuerpo humano.
4. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos de
anticuerpo, que se une específicamente a IGF-I
humano e IGF-II humano para inhibir la función de
control de la proliferación, diferenciación y/o apoptosis de células
epiteliales tanto de IGF-I humano como de
IGF-II humano y puede unirse a IGF-I
humano y a IGF-II humano equivalentemente, y la
actividad de unión del anticuerpo es una constante de unión de 5 x
10^{9} M^{-1} o más medida con un biosensor BIACORE, donde la
VH del anticuerpo de un animal no humano comprende la secuencia de
aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 2, y la VL del
anticuerpo de un animal no humano comprende la secuencia de
aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 4.
5. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de
anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 4, donde el anticuerpo
de un animal no humano es producido por un hibridoma FERM
BP-7978.
6. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de
anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3, donde la VH del
anticuerpo quimérico humano comprende la secuencia de aminoácidos
representada por el SEQ ID NO: 2, y la VL del anticuerpo quimérico
humano comprende la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ
ID NO: 4.
7. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de
anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3 o 6, donde el
anticuerpo quimérico humano comprende VH y VL del anticuerpo
producido por FERM BP-7978.
8. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de
anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3,
6 y 7, donde el anticuerpo quimérico humano comprende una región
constante de un anticuerpo humano.
9. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de
anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 8, donde la región
constante de un anticuerpo humano comprende la región constante de
un anticuerpo humano de clase IgG1 y/o de clase k.
10. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de
anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3
y 6 a 9, donde el anticuerpo quimérico humano es producido por FERM
BP-7996.
11. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de
anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2, donde el anticuerpo
injertado con una CDR humana comprende una región constante de un
anticuerpo humano.
12. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de
anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 11, donde la región
constante de un anticuerpo humano comprende la región constante de
un anticuerpo humano de clase IgG1 y/o de clase k.
13. El fragmento de anticuerpo de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde el fragmento
de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en Fab, Fab',
F(ab')^{2}, anticuerpo de cadena sencilla (scFv), región V
dimerizada (fragmento bivalente), región V estabilizada por
disulfuro (dsFv) y péptido que contiene CDR.
14. Un ADN que codifica el anticuerpo o uno de
sus fragmentos de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13.
15. Un vector recombinante que contiene el ADN
de acuerdo con la reivindicación 14.
16. Un transformante que se obtiene
introduciendo el vector recombinante de acuerdo con la
reivindicación 15 en una célula anfitriona.
\newpage
17. Un método para producir un anticuerpo o uno
de sus fragmentos de anticuerpo, que comprende cultivar el
transformante de acuerdo con la reivindicación 16 en un medio para
producir y acumular el anticuerpo o uno de sus fragmentos de
anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
13 en un cultivo, y recuperar el anticuerpo o uno de sus fragmentos
de anticuerpo del cultivo.
18. Una composición farmacéutica que comprende
al menos uno de un anticuerpo y uno de sus fragmentos de anticuerpo
de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 como
ingrediente activo.
19. El uso de al menos uno de un anticuerpo y
uno de sus fragmentos de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 13 como ingrediente activo para la
preparación de una composición farmacéutica para tratar cánceres
sólidos, diabetes o artritis reumatoide.
20. Una composición diagnóstica que comprende al
menos uno de un anticuerpo y uno de sus fragmentos de anticuerpo de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
21. El uso de al menos uno de un anticuerpo y
uno de sus fragmentos de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 13 para la preparación de una
composición diagnóstica para diagnosticar cánceres sólidos,
diabetes o artritis reumatoide.
22. Un método in vitro para la diagnosis
de enfermedades mediadas por IGF-I e
IGF-II humano, que comprende detectar o determinar
inmunológicamente IGF-I e IGF-II
humano en la muestra utilizando al menos uno de un anticuerpo y uno
de sus fragmentos de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13.
23. El método in vitro de acuerdo con la
reivindicación 22, donde la muestra se selecciona del grupo que
consiste en una célula aislada o una solución desorganizada de la
misma, un tejido o una solución desorganizada del mismo, un
sobrenadante de un cultivo celular, suero, efusión pleural, ascitis
y fluido oftálmico.
24. Una composición farmacéutica que comprende
un anticuerpo o uno de sus fragmentos de anticuerpo de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para tratar cánceres
sólidos, diabetes o artritis reumatoide.
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