ES2332124T3 - Metodo para la produccion a gran escala del dominio kringle 2 mas serina proteasa (k2s) de plasminogeno en procariotas. - Google Patents
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Abstract
Método para la producción de un dominio kringle 2 más proteasa de serina (K2S), activo y correctamente plegado, del activador de plasminógeno tisular o una variante funcional de éste en el sobrenadante de células procarióticas, caracterizado porque la célula procariótica contiene y expresa un vector que comprende un ADN que codifica el péptido señal de la proteína de la membrana externa A (OmpA), que está fusionada secuencia abajo a un ADN que codifica un péptido corto, caracterizado por la secuencia de aminoácidos SEGNSD (SEQ ID NO:3), que por sí misma está fusionada secuencia abajo a un ADN que codifica el dominio kringle 2 más proteasa de serina del activador de plasminógeno tisular humano o un derivado funcional de éste.
Description
Método para la producción a gran escala del
dominio kringle 2 más serina proteasa (K2S) de plasminógeno en
procariotas.
El invento se refiere al sector de la producción
de proteínas en células procarióticas.
El invento se refiere a métodos para la
producción de un dominio kringle 2 más proteasa de serina (K2S) del
activador de plasminógeno tisular (tPA) derivado de un ADN
recombinante en células procarióticas, en el que dicha K2S se
segrega extracelularmente como una proteína activa y correctamente
plegada, y la célula procariótica contiene y expresa un vector que
comprende el ADN que codifica dicha proteína heteróloga, unido
operativamente al ADN que codifica el péptido de señal OmpA.
Los sistemas de expresión procarióticos para
proteínas heterólogas se usan corrientemente para proteínas que no
requieren pautas de glicosilación en mamíferos, puesto que
proporcionan una manera barata de producir grandes cantidades de
dicha proteína. La formación de una proteína agregada en alto grado
o de cuerpos de inclusión se puede encontrar corrientemente en la
expresión con alto nivel de muchas proteínas heterólogas en E.
coli. Una manera de producir proteínas consiste en pasar por
cuerpos de inclusión que se desarrollan en el citoplasma. Los
componentes de las paredes celulares y membranas exteriores de las
células procarióticas, que se usan para la producción (p. ej.,
E. coli), contaminan usualmente al material lisado celular
que contiene la proteína heteróloga, cuando dichos cuerpos de
inclusión se preparan por centrifugación a baja velocidad. El
componente exterior de membrana se puede eliminar por extracción
selectiva con detergentes y bajas concentraciones o bien de urea o
de guanidina\cdotHCl.
Un ejemplo de una de tales proteínas heterólogas
es un derivado de tPA.
Un activador de plasminógeno tisular (tPA) es un
polipéptido que contiene 527 residuos de aminoácidos (27) con una
masa molecular de 72 kDa. La molécula está dividida en cinco
dominios estructurales. De modo aproximado, la región terminal de N
es un dominio de dedo (finger) cerrado en bucle, que es seguido por
un dominio de factor de crecimiento. Dos dominios similares,
Kringle 1 y Kringle 2, siguen a continuación. Los dominios de dedo
y Kringle 2 se fijan específicamente a los coágulos de fibrina
acelerando con ello la activación por la proteína tPA del
plasminógeno fijado. Secuencia abajo del Kringle 2 está situada la
proteasa de serina con su sitio catalítico situado en el extremo
terminal de C. La proteasa de serina es responsable de convertir el
plasminógeno en plasmina, una reacción que resulta importante en la
homeostasis de la formación de fibrina y la disolución de coágulos.
El correcto plegamiento del tPA requiere el correcto emparejamiento
de 17 puentes de disulfuro en la molécula (1).
En el aspecto clínico, un tPA es un agente
trombolítico selecto para el tratamiento de un infarto de miocardio
agudo. Tiene la ventaja de no causar efectos colaterales en la
formación de hemorragias sistémicas y el agotamiento de fibrinógeno
(7). Células de melanoma de Bowes se usaron en primer término como
una fuente en la producción de tPA para finalidades terapéuticas
(12). Puesto que se requiere para uso clínico un proceso compatible
con la producción eficiente de una proteína purificada en alto
grado con buen rendimiento, la construcción de un tPA recombinante
(r-tPA) de plena longitud progresó hasta llegar a
células de mamíferos. Células de ovario de hámster chino (CHO)
fueron transfectadas con el gen de tPA con el fin de sintetizar el
r-tPA (8, 22). El producto recombinante, producido
por un sistema de fermentación de material de mamíferos, se
cosechaba a partir del medio de cultivo. Atraídos por la
simplicidad y rentabilidad de la producción, se investigaron cierto
número de esfuerzos en la producción de r-tPA a
partir de bacterias, especialmente a partir de Escherichia
coli (10, 13, 30). Observando el bajo rendimiento y la formación
de cuerpos de inclusión, que daban como resultado un plegamiento
defectuoso y una enzima inactiva, se han propuesto numerosas
estrategias para solventar estos problemas. El criterio principal
consiste en sintetizar la molécula más pequeña que es todavía activa
en vez de un tPA de plena longitud.
Se consideraron varias variantes mutantes por
deleción, inclusive la de Kringle 2 más proteasa de serina (K2S).
Sin embargo, la actividad enzimática de la K2S recombinante
(r-K2S) se obtuvo solamente cuando se consiguieron
procesos de plegamiento renovado de cuerpos de inclusión purificados
procedentes del compartimiento citoplásmico (16, 29). Con el fin de
evitar los complicados procesos de plegamiento renovado y el
suministro de proteínas periplásmicas, se explotaron sistemas
especiales de expresión de bacterias (6, 31). A pesar de la
expresión periplásmica del un tPA, la expresión excesiva condujo a
agregados inactivos, incluso en la condición oxidante de grado
relativamente alto en el periplasma.
En la técnica anterior, existen unas pocas
descripciones de métodos para la preparación de una K2S recombinante
en E. coli. Sin embargo, no existe ninguna descripción de un
método que conduzca a un método barato para la producción a gran
escala de una K2S biológicamente activa.
Obukowicz y colaboradores (25) expresaron y
purificaron una r-K2S procedente del espacio
periplásmico. La evidente desventaja de este método la constituía
una operación suplementaria de extracción periplásmica, que no es
apropiada para una producción a gran escala.
\newpage
Saito y colaboradores (29) describen la
expresión citoplásmica de una r-K2S. Los autores
usaron unos procesos de renaturalización in vivo para la
r-K2S expresada, que era purificada a partir del
espacio citoplásmico de E. coli como cuerpo de inclusión.
Boehringer Mannheim usa un similar y complicado proceso de
desnaturalización y plegamiento renovado, que implica las
operaciones de digestión de células, solubilización en condiciones
desnaturalizantes y reductoras y reactivación en condiciones
oxidantes en la presencia de GSH/GSSG, que no es rentable y requiere
una mutación de la secuencia de aminoácidos (24).
En 1991, Waldenström y colaboradores (34)
construyeron un vector (pEZZK2P) para la secreción del dominio de
Kringle 2 más proteasa de serina a un material sobrenadante de
cultivo de E. coli. Se usó hidroxilamina para eliminar el
péptido de fusión ZZ desde la fracción purificada de
IgG-Sepharose. El agente de disociación,
hidroxilamina, requería una modificación de los sitios de
disociación del Kringle 2 más proteasa de serina (Asn^{177}
\rightarrow Ser y Asn^{184} \rightarrow Gln) para protegerlos
de esta manera con respecto de la digestión por hidroxilamina. Sin
embargo, la resultante molécula de K2S no nativa y no plegada
apropiadamente, no es idónea para finalidades terapéuticas. La
desacostumbrada secuencia puede incluso activar al sistema
inmunitario humano. Hua y colaboradores (37) muestran la secreción
de sw un polipéptido de fusión OmpA-K_{2} en el
periplasma de E. coli.
El problema que subyace en el presente invento
fue por consiguiente proporcionar un método aplicable comercialmente
para la producción a gran escala de K2S, en el que dicha proteína se
segrega en su forma biológicamente activa dentro del material
sobrenadante de cultivo.
Este problema se resolvió dentro del alcance de
las reivindicaciones y de la memoria descriptiva del presente
invento.
El uso del singular o plural en las
reivindicaciones o en la memoria descriptiva no se pretende de
ninguna manera que sea limitativo e incluye también la otra
forma.
El invento se refiere a un método para la
producción de K2S derivada de un ADN recombinante en células
procarióticas, en el que dicha proteína heteróloga se segrega
extracelularmente como una proteína activa y correctamente plegada,
cuyo método está caracterizado porque la célula procariótica
contiene y expresa un vector que comprende el ADN que codifica
dicha proteína heteróloga en unión operativa con el ADN que codifica
el péptido de señal OmpA.
Sorprendentemente, el uso del péptido de señal
OmpA, en combinación con los aminoácidos terminales de N, SEGNSD
(SEQ ID NO: 3), traslada (transloca) a las proteínas que se derivan
de un ADN recombinante, hacia la superficie exterior y facilita la
liberación de la molécula funcional y activa dentro del medio de
cultivo, en un grado mayor que cualquier otro método en la técnica
anterior. Antes de cruzar la membrana exterior, la proteína que se
deriva de un ADN recombinante se pliega correctamente de acuerdo con
el método del presente invento. El péptido de señal se separa por
disociación para producir una molécula madura. Sorprendentemente, la
eficiencia de la eliminación de este péptido de señal es muy alta y
conduce a un plegamiento correcto de la proteína que se deriva de
un ADN recombinante. Este método, dado como ejemplo para el dominio
de Kringle 2 más proteasa de serina (K2S) de la proteína de
activador de plasminógeno tisular en el Ejemplo 1 se describe
también para la expresión de varias/os diferentes proteínas y
polipéptidos que no requieren una glicosilación de un material de
mamíferos en células hospedantes procarióticas.
El método de acuerdo con el invento tiene
ventajas con respecto a los métodos conocidos en la especialidad -
no solamente porque se trata de un método barato de producción
debido a la célula hospedante procariótica usada, sino que,
sorprendentemente, se segrega una molécula correctamente plegada al
material sobrenadante.
Una persona experta puede obtener con facilidad
la secuencia de ADN de una K2S y que haya de ser expresada por el
método de acuerdo con el invento a partir de bases de datos
apropiadas, y clonarla para ser usada en el método de acuerdo con el
invento.
Dicho péptido de señal OmpA interactúa con la
SecE y es suministrado a través de la membrana interior mediante
energía generada por la SecA, que se fija a los componentes Sec
(SecE-SecY). La SecY forma un poro de secreción
para enviar la proteína que se deriva de un ADN recombinante de
acuerdo con el invento. El espacio existente entre la membrana
exterior y la membrana interior de bacterias
Gram-negativas, es decir el periplasma, tiene una
condición de oxidación más alta en comparación con el espacio
citoplásmico. Esto sustenta la formación de enlaces de disulfuro y
el plegamiento apropiado de K2S en el periplasma para producir una
molécula activa. De acuerdo con el presente invento, el péptido de
señal será separado por disociación para producir una molécula
madura. El complejo de secretina de GspD y lipoproteína de GspS en
la membrana exterior sirve como canal de puerta para segregar la
proteína que se deriva de un ADN recombinante de acuerdo con el
invento hacia el medio extracelular. Este proceso de secreción
requiere energía, que se genera en el citoplasma por la proteína que
fija nucleótidos, GspE, y luego se transfiere a la proteína de
membrana interior (Gsp G-J, F y
K-N). La GspC transfiere la energía a la GspD
formando un enlazador cruzado entre un conjunto de proteínas de
membrana interior (Gsp G-J, F y
K-N) y la GspD. Antes de cruzar con éxito la
membrana exterior, la proteína recombinante se pliega
correctamente.
\newpage
El hecho de estar unido operativamente de
acuerdo con el invento significa que el ADN que codifica K2S que
comprende el ácido nucleico que codifica SEGNSD en su porción
terminal de N se clona directamente secuencia abajo del ADN de OmpA
dentro del vector a fin de conseguir la expresión de la proteína de
fusión del OmpA y la proteína heteróloga y dirigir la secreción en
el exterior de la célula hospedante procariótica. Típicamente, se
segrega la mayoría de la K2S, y luego se puede purificar por métodos
apropiados tales como precipitación con sulfato de amonio. El
invento incluye también el uso de inductores tales como IPTG, o IPTG
en combinación con glicerol, el mejoramiento de la condición de
incubación y del período de cosecha para hacer máxima la cantidad de
proteína activa.
Los autores del invento han encontrado
sorprendentemente que el péptido de señal OmpA unido operativamente
a los aminoácidos caracterizados por la secuencia SEGNSD (SEQ ID NO:
3) conduce a la secreción de la proteína heteróloga dentro del medio
en vez de a la acumulación en el espacio periplásmico.
Dicho ADN que codifica el péptido de señal OmpA
se fusiona a un péptido corto caracterizado por la secuencia de
aminoácidos SEGNSD (SEQ ID NO: 3) o la secuencia de ácido nucleico
de codificación TCTGAGGGAAACAGTGAC (SEQ ID NO: 5), y situado en la
porción terminal de N de K2S. Así, dicha proteína de fusión consiste
en OmpA-SEGNSD-K2S.
Por lo tanto, en un método preferido de acuerdo
con el invento, dicha célula procariótica contiene y expresa un
vector que comprende el ADN que codifica dicha K2S, unido
operativamente al ADN que codifica el péptido de señal OmpA que
está unido operativamente a la molécula de ácido nucleico definida
por la secuencia TCTGAGGGAAACAGTGAC (SEQ ID NO: 5).
El método de acuerdo con el invento comprende
células hospedantes procarióticas tales como, pero sin limitarse a,
Escherichia coli (E. coli), Bacillus subtilis, Streptomyces,
Pseudomonas, p. ej. Pseudomonas putida, Proteus
mirabilis, o Staphylococcus, p. ej. Staphylococcus
carnosus. Preferiblemente, dichas células hospedantes de
acuerdo con el invento son bacterias
Gram-negativas.
Preferiblemente, un método de acuerdo con el
invento está caracterizado también porque la célula procariótica es
E. coli. Cepas apropiadas incluyen, pero no se limitan a,
XL-1 Blue, BL21(DE3), JM109, series de DH,
TOP10 y HB101.
Preferiblemente, un método de acuerdo con el
invento está caracterizado también porque se llevan a cabo las
siguientes operaciones:
a) el ADN que codifica K2S se amplifica por una
PCR (reacción en cadena de polimerasa);
b) el producto de PCR se purifica;
c) dicho producto de PCR se introduce dentro de
un vector que comprende el ADN que codifica el péptido de señal OmpA
y el ADN que codifica la gpIII de una manera tal que dicho producto
de PCR se une operativamente secuencia arriba con el ADN que
codifica la secuencia de señal de OmpA y se une secuencia abajo con
el ADN que codifica la gpIII de dicho vector;
d) se introduce un codón de detención entre
dicha proteína heteróloga y dicha gpIII;
e) dicho vector se expresa por la célula
procariótica;
f) la proteína heteróloga se purifica.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la operación a) de acuerdo con el invento
es importante la elección o el diseño de los cebadores para clonar
el ADN en la situación y la dirección correctas del vector de
expresión (véase el Ejemplo 1). Por lo tanto, se describen los
cebadores que se ejemplifican en el Ejemplo 1 y en la Figura 4. Por
la gpIII de la operación c) se entiende la proteína de gen III que
está presente principalmente en vectores fagémidos. El codón de
detención se introduce para evitar la transcripción de la gpIII,
conduciendo de esta manera finalmente a la secreción de K2S. Se
puede emplear cualquier método apropiado para la introducción del
codón de detención, tal como una mutagénesis dirigida a un sitio
(p. ej., Weiner MP, Costa GL (1994) PCR Methods Appl 4(3):
páginas 131-136; Weiner MP, Costa GL, Schoettlin W,
Cline J, Mathur E, Bauer JC (1994) Gene
151(1-2):119-123; véase
también el Ejemplo 1).
Se puede usar cualquier vector en el método de
acuerdo con el invento, pero preferiblemente dicho vector es un
vector fagémido (véase más adelante).
La región no traducida puede contener un
elemento regulador, tal como p. ej. una unidad de iniciación de la
transcripción (promotor) o un intensificador. Dicho promotor puede
ser, por ejemplo, un promotor constitutivo, inducible o de
desarrollo controlado. Preferiblemente, sin descartar a otros
promotores conocidos, se usan los promotores constitutivos del
Cytomegalovirus (CMV) humano y del virus de sarcoma de Rous (RSV),
así como los promotores del virus 40 de Simio (SV40) y del Herpes
simple. Los promotores inducibles de acuerdo con el invento
comprenden promotores resistentes a antibióticos, promotores de
choque térmico, el "promotor del virus de tumor mamario"
inducible por hormonas y el promotor de metalotioneína. Los
promotores preferidos incluyen el promotor de T3, el promotor de T7,
el Lac/ara1 y el Ltet0-1.
Más preferiblemente, un método de acuerdo con el
invento está caracterizado también porque el ADN que codifica la
proteína heteróloga es precedido por un promotor lac y/o por un
sitio de fijación a ribosomas tal como la secuencia de
Shine-Dalgarno (véase también el Ejemplo).
Vectores apropiados de acuerdo con el invento
incluyen, pero no se limitan a, vectores de virus tales como p. ej.
los de virus de Vaccinia, Semliki-Forest y
Adenovirus, vectores de fagémidos y similares. Se prefieren los
vectores que se pueden utilizar ventajosamente en E. coli,
pero también en cualquier otro hospedante procariótico tal como
pPROTet.E, pPROLar.A, miembros de la familia pBAD, de la familia
pSE, de la familia pQE y pCAL.
Otra realización preferida del invento se
refiere al vector pComb3HSS que contiene un ADN de acuerdo con el
invento, en el que la expresión de la proteína gpIII es suprimida o
inhibida por deleción de la molécula de ADN que codifica dicha
proteína gpIII o por un codón de detención entre el gen que codifica
un polipéptido que contiene la proteína heteróloga y el gen de la
proteína III.
Proteínas de tPA pueden incluir uno/a, varios/as
o la totalidad de los/las siguientes dominios o subunidades o
variantes de ellos/as:
1. dominio de dedo (4-50)
2. dominio de factor de crecimiento
(50-87)
3. dominio de Kringle 1
(87-176)
4. dominio de Kringle 2
(176-262)
5. dominio de proteasa
(276-527)
\vskip1.000000\baselineskip
La numeración y la denominación de los dominios
son conformes al número de acceso en el Genbank (Banco Genético) GI
137119, o a Nature 301 (5897), 214-221 (1983).
Un método de acuerdo con el invento se
caracteriza porque se produce el dominio de Kringle 2 (4.) más
proteasa de serina (5.) K2S del activador de plasminógeno tisular
humano o una variante funcional de éste.
Más preferiblemente, un método de acuerdo con el
invento está caracterizado también porque el vector es un vector
fagémido que comprende el ADN y codifica el péptido de señal OmpA y
el ADN que codifica la gpIII.
Se pretende que el siguiente ejemplo ayude a
comprender el invento y no deberá ser considerado de ninguna de las
maneras como que limite al alcance del invento.
\vskip1.000000\baselineskip
Diseño del cebador. Con el fin de amplificar una
parte específica del gen de un tPA, se sintetizaron un par de
cebadores SK2/174 [5' GAGGAGGAGGTGGCCCAGGCGGCCT
CTGAGGGAAACAGTGAC 3'] y ASSP [5'
GAGGAGGAGCTGGCCGGCCTGGCCCGGTCGCATGTTGTCACG 3'] (Life
Technologies, Grand Island, NY). Estos cebadores se diseñaron
basándose en el gen de un tPA humano recuperado a partir de bases
de datos del NCBI (g137119). Éstos se sintetizaron con sitios de
clonación en un extremo para SfiI (subrayados) de tal manera que el
cuadro de lectura procedente de la ATG del gen de gpIII en el vector
fagémido, pComb3HSS, mantendrá a lo largo de la secuencia
introducida.
Otro conjunto de cebadores para una mutagénesis
dirigida a un sitio se diseñó para reanillarlo junto a la secuencia
situada entre el gen de K2S y el gen III en
pComb3H-K2S. Las secuencias de cebadores con bases
de mutación (subrayadas) para generar un nuevo codón de detención
fueron MSTPA [5' ACATGCGACCGTGACAGGCCGGCCAG 3'] y MASTPA [5'
CTGGCCGGCCTGTCACGGTCGCATGT 3'] .
Amplificación del gen de K2S por PCR. Un
microgramo (1 \mug) de los cebadores SK2/174 y ASSP juntamente
con 50 ng del molde de p51-3 (obtenido del Dr.
Hiroshi Sasaki, Fujisawa Pharmaceutical, Japón) se suspendieron en
100 \mul de una mezcla para PCR. Se añadió finalmente a la
solución una cantidad de 2,5 U de polimerasa de Taq (Roche
Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). La condición de
amplificación valorada se inició con un comienzo de salto a 85ºC
durante 4 min, seguido por una desnaturalización a 95ºC durante 50 s
(segundos), un reanillamiento a 42ºC durante 50 s, y una
prolongación a 72ºC durante 1,5 min. Se realizaron repetidamente
treinta y cinco rondas. La mezcla se incubó adicionalmente a 72ºC
durante 10 min. El producto amplificado de 1.110 pb (pares de
bases) se purificó subsiguientemente mediante el Estuche de
purificación para PCR QIAquick (QIAGEN, Hilden, Alemania). El
carácter correcto del producto purificado se confirmó mediante
enzimas de restricción.
Construcción del fagémido que expresa la K2S. El
producto purificado de PCR de la K2S y el fagémido
pComb3HSS (proporcionado amablemente por el Dr. Carlos F. Barbas, Scripps Institute, EE.UU.) se digirieron con Sfi I (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) para preparar sitios de clonación cohesivos específicos. Cuatro microgramos (4 \mug) del producto purificado de PCR se digirieron con 60 U de Sfi I a 50ºC durante 18 h. Para el pComb3HSS, 20 \mug de vectores fagémidos se trataron con 100 U de Sfi I. Los productos digeridos del producto purificado de PCR de la K2S y pComb3HSS (~3300 pb) se purificaron subsiguientemente en un gel mediante el Estuche de Extracción en Gel QIAquick (QIAGEN, Hilden, Alemania). 5 U de ligasa de T4 (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) se introdujeron en la mezcla de 0,7 \mug de pComb3HSS digerido con Sfi I y purificado y de 0,9 \mug del producto de PCR digerido con Sfi I y purificado. La tanda de reacción de ligación se incubó a 30ºC durante 18 h. El fagémido construido de nuevas se denominó pComb3H-K2S.
pComb3HSS (proporcionado amablemente por el Dr. Carlos F. Barbas, Scripps Institute, EE.UU.) se digirieron con Sfi I (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) para preparar sitios de clonación cohesivos específicos. Cuatro microgramos (4 \mug) del producto purificado de PCR se digirieron con 60 U de Sfi I a 50ºC durante 18 h. Para el pComb3HSS, 20 \mug de vectores fagémidos se trataron con 100 U de Sfi I. Los productos digeridos del producto purificado de PCR de la K2S y pComb3HSS (~3300 pb) se purificaron subsiguientemente en un gel mediante el Estuche de Extracción en Gel QIAquick (QIAGEN, Hilden, Alemania). 5 U de ligasa de T4 (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) se introdujeron en la mezcla de 0,7 \mug de pComb3HSS digerido con Sfi I y purificado y de 0,9 \mug del producto de PCR digerido con Sfi I y purificado. La tanda de reacción de ligación se incubó a 30ºC durante 18 h. El fagémido construido de nuevas se denominó pComb3H-K2S.
Transformación de XL-1 Blue.
Doscientos microlitros (200 \mul) de E. coli
HL-1 Blue competente para CaCl_{2} (Stratagene,
La Jolla, CA) se transformaron con 70 ng de un producto ligado o
mutado. Las células transformadas fueron propagadas diseminándolas
sobre un agar LB que contenía 100 \mug/ml de ampicilina y 10
\mug/ml de tetraciclina (Sigma, Saint Louis, MO). Después de
haber cultivado a 37ºC durante 18 h, se seleccionaron varias
colonias resistentes a los antibióticos, para minipreparaciones de
plásmidos usando el método de lisis en condiciones alcalinas. Cada
plásmido purificado se sometió a un análisis en los sitios de
restricción para SfiI. Un transformante que albergaba un plásmido
con el o los sitio(s) correcto(s) de restricción por
SfiI se propagó subsiguientemente durante 18 h a 37ºC en 100 ml de
un caldo LB con 100 \mug/ml de ampicilina y 10 \mug/ml de
tetraciclina. Una maxipreparación de plásmidos se realizó usando el
estuche QIAGEN Plasmid Maxi Kit (QIAGEN, Hilden, Alemania). El
plásmido purificado se volvió a examinar en cuanto a la existencia
de sitios específicos de restricción por Sfi I y se amplificó por el
Estuche de Secuenciación en Ciclos de Terminadores de Polimerasa de
ADN AmpliTaq (The Perkin-Elmer Corporation, Forster
City, CA).
Mutagénesis dirigida a un sitio de
pComb3H-K2S. 10 ng de un molde de
pComb3H-K2S se mezclaron con 125 ng de los
cebadores MSTPA y MASTPA. Se añadieron a la mezcla 2,5 U de
polimerasa de ADN PfuTurbo (Stratagene, La Jolla, CA) para la
amplificación en ciclos. La reacción comenzó con una ronda a 95ºC
durante 30 s. Luego ésta fue seguida por 16 rondas que consistían
en 95ºC durante 30 s, 55ºC durante 1 min y 68ºC durante 9 min. El
tubo de reacción se colocó subsiguientemente sobre hielo durante 2
min. Con el fin de destruir las hebras del molde, se añadieron 10 U
de la enzima de restricción DpnI (Stratagene, La Jolla, CA) a la
reacción de amplificación, y se incubó durante 1 h a 37ºC. Este
producto sintetizado (MpComb3H-K2S) se usó
ulteriormente para transformar a E. coli XL-1
Blue.
Preparación de K2S recombinante para su
presentación a fagos. Después de que el pComb3H-K2S
se transformase dentro de XL-1 Blue, se realizó la
técnica de presentación a fagos. Un clon de XL-1
Blue transformada por pComb3H-K2S se propagó en 10
ml de un caldo super que contenía 100 \mug/ml de ampicilina y 10
\mug/ml de tetraciclina a 37ºC hasta que se alcanzase la densidad
óptica D.O. [a 600 nm] de 1,5. El cultivo de bacterias se propagó
subsiguientemente en 100 ml del mismo medio y se cultivó durante 2
h. Se usó una cantidad de 10^{12} pfu del fago cooperante VCSM13
(Stratagene, La Jolla, CA) para infectar a la XL-1
Blue transformada. Después de incubación durante 3 h se añadió al
cultivo kanamicina en una concentración final de 70 \mug/ml. El
cultivo se dejó en agitación (a 200 rpm) durante 18 h a 37ºC. Luego
se cosecharon los bacteriófagos que albergaban K2S en gpIII
(K2S-\Phi) añadiendo 4% p/v (peso/volumen) de PEG
de PM 8.000 (Sigma, Saint Louis, MO) y 3% p/v de NaCl. Finalmente,
el fago cosechado se volvió a suspender en 2 ml de PBS de pH 7,4. El
número de fagos se determinó infectando la XL-1
Blue. Las unidades de formación de colonias por mililitro (cfu/ml)
se calcularon como se ha descrito anteriormente (21).
Expresión de K2S recombinante en matraces con
sacudimiento. La XL-1 Blue transformada con
MpComb3H-K2S se cultivó en 100 ml de caldo super
(3% p/v de triptona, 2% p/v de extracto de levadura y 1% p/v de
MOPS) a un pH de 7,0 en la presencia de ampicilina (100 \mug/ml)
a 37ºC hasta que se alcanzase una D.O. [a 600 nm] de 0,8.
Subsiguientemente, la síntesis de proteínas se indujo por 1 mM de
IPTG (Promega, Madison, WI). Las bacterias se cultivaron
adicionalmente con sacudimiento (a 200 rpm) durante 6 h a 30ºC. El
material sobrenadante de cultivo se recogió y precipitó con sulfato
de amonio saturado al 55% (32). El material precipitado se
reconstituyó con PBS, de pH 7,2, y se dializó en la misma solución
tamponadora a 4ºC durante 18 h. Proteínas periplásmicas procedentes
de células bacterianas se extrajeron usando un choque con cloroformo
como antes se ha descrito por Ames y colaboradores (2).
Cuantificación de K2S recombinante por análisis
inmunológico. Con el fin de detectar la r-K2S, la
fase sólida se revistió con un dominio anti-kringle
2 monoclonal (16/B) (proporcionado generosamente por el Dr. Ute
Zacharias, Instituto Central de Biología Molecular,
Berlín-Buch, Alemania). Se realizaron procesos
clásicos de lavado y bloqueo por ELISA. Se añadieron 50 \mul de
10^{11} cfu/ml de K2S-\Phi o
r-K2S secretorio dentro de cada pocillo revestido
con anti-kringle 2. La detección de antígenos y
anticuerpos se llevo a cabo de la siguiente manera. O bien una HRP
conjugada con anti-M13 de cordero (Pharmacia
Biotech, Uppsala, Suecia) o una HRP conjugada con
anti-tPA de cordero (Cedarlane, Ontario, Canadá), se
añadió a cada pocillo de reacción después de la operación de
lavado. El substrato TMB fue sometido a cada pocillo y la reacción
se hizo cesar finalmente con una solución de H_{2}SO_{4}
después de incubar durante 30 min. El patrón tPA 86/670 de melanoma
(National Institute for Biological Standards and Control,
Hertfordshine, Reino Unido) se usó como testigo positivo.
Análisis de actividad amidolítica. Un estuche de
ensayo para la detección de la actividad amidolítica de un tPA se
adquirió de Chromogenix (Molndal, Suecia). La mezcla de substratos
que contenía plasminógeno y S-2251 se usó para
determinar la actividad enzimática de la proteasa de serina. La
dilución de 10^{-2} de cada muestra precipitada con amonio se
analizó con y sin fragmentos de fibrinógeno humano, estimuladores.
El proceso de análisis estaba de acuerdo con el manual de tPA
COASET.
SDS-PAGE y transferencia
inmunológica. El producto de precipitado dializado procedente del
material sobrenadante de cultivo se concentró adicionalmente 10
veces con Centricon 10 (AMICON, Beverly, MA). La muestra concentrada
se sometió a separación de proteínas por SDS-PAGE,
15% de gel para resolución, en el tampón de reducción seguido por
transferencia por electroforesis a nitrocelulosa. Luego, la
nitrocelulosa se bloqueó con leche desnatada al 4% durante 2 h. Con
el fin de detectar la r-K2S, se aplicó a la
nitrocelulosa una dilución apropiada de HRP de cordero conjugada
con anti-tPA. La banda reactiva inmunológicamente se
visualizó por un sensible sistema de detección, el Estuche Amplified
Opti-4CN (BIORAD, Hercules, CA).
Electroforesis en gel de
poli(acril-amida) de un plasminógeno
copolimerizado. Un gel de poli(acrilamida) para resolución
al 11% se copolimerizó con un plasminógeno y gelatina tal como se ha
descrito anteriormente por Heussen y colaboradores (14). El gel de
apilamiento se preparó como una concentración al 4% sin plasminógeno
ni gelatina. La electroforesis se realizó a 4ºC con una intensidad
de corriente constante de 8 mA. El SDS residual en la plancha de
gel se retiró después de suave sacudimiento a la temperatura
ambiente durante 1 h en Triton X-100 al 2,5%. Luego
la plancha de gel se incubó en glicina-NaOH 0,1 M a
pH 8,3 durante 5 h a 37ºC. Finalmente, la plancha de gel se tiñó y
destiñó por un sistema patrón de tinción con Coomassie brilliant
Blue (R-250). El lugar donde estaba situado el
péptido que albergaba la actividad enzimática no fue teñido por el
colorante en contraste con el fondo pintado de azul.
\vskip1.000000\baselineskip
Construcción del vector portador del gen de K2S.
A partir del vector p51-3 se amplificó la porción
Kringle 2 más proteasa de serina de un tPA (Ser^{174} en el
dominio de Kringle 2 hasta Pro^{527} en la proteasa de serina)
usando los cebadores SK2/174 y ASSP. El producto de 1.110 pb
amplificado se demostró por electroforesis en gel de agarosa
(Figura 1, pista 2) y se introdujo en el fagémido pComb3HSS por
sitios dobles de disociación con Sfi I en los extremos 5' y 3' en
el cuadro de lectura correcto. Por lo tanto, se generó un nuevo
vector, pComb3H-K2S, que albergaba a la K2S. En
este vector, la K2S está flanqueada secuencia arriba por la
secuencia de señal de OmpA y secuencia abajo por la gp3. La
inserción correcta de la K2S se comprobó tanto mediante un análisis
por restricción con Sfi I (Figura 2, pista 3) como por análisis por
PCR (demostración de una única banda a 1.110 pb), y por
secuenciación del ADN. El diagrama esquemático del mapa de
pComb3H-K2S se presenta en la Figura 3.
r-K2S presentada a fagos. El
fago filamentoso VCSM13 se usó para infectar a la
XL-1 Blue transformada con
pComb3H-K2S, X[K2S]. El VCSM13 se propagó e
incorporó en la proteína de fusión K2S-gp3 durante
los procesos de empaquetamiento de virus. El fago recombinante
(K2S-\Phi) cosechado dio una concentración de 5,4
x 10^{11} cfu/ml determinada volviendo a infectar a la
XL-1 Blue con fagos precipitados por PEG. Estas
partículas de fagos recombinantes se comprobaron en cuanto a la
expresión de r-K2S por un ELISA en emparedado. La
proteína K2S heteróloga fijada a un fago se reconoció por el
anticuerpo monoclonal anti-kringle 2 (16/B) usando
un sistema de detección de anticuerpos de HRP de cordero conjugados
con anti-tPA. La absorbencia de este análisis fue
de 1,12 \pm 0,03 (Tabla 1). La cantidad de K2S detectable en
10^{12} partículas de fagos es igual a 336 ng de proteína en
relación con el tPA de melanoma patrón. Con el fin de corroborar que
la proteína de fusión K2S-gp3 estaba asociada con
partículas de fagos, el anticuerpo de HRP de cordero conjugado con
anti-tPA se reemplazó por el anticuerpo de HRP de
cordero conjugado con anti-M13. Esta reacción
inmunológica exhibió una absorbencia de 1,89 \pm 0,07 (Tabla 1).
En contraste, si el anticuerpo para captura era el anticuerpo de
cordero anti-M13, se observó una cantidad
extremadamente baja de K2S con la HRP conjugada con el anticuerpo
de cordero anti-tPA; la absorbencia fue solamente de
0,17 \pm 0,01 (Tabla 1). Esto sugirió que solamente una minoría
de las partículas de fagos purificados eran portadoras de la
proteína de fusión K2S-gp3. Se usó como un testigo
negativo el VCSM13 preparado a partir de la XL-1
Blue no transformada.
Construcción de MpComb3H-K2S. Se
generó un codón de detención entre K2S y gp3 en el
pComb3H-K2S con la ayuda de los cebadores
mutagénicos (MSTPA y MASTPA) (Figura 4). Con el fin de enriquecer al
MpComb3H-K2S sintetizado de nuevas y mutado, la
mezcla de amplificación en ciclo se digirió a fondo con DpnI a fin
de degradar al antiguo molde de pComb3H-K2S
metilado en dique (la DpnI prefiere al ADN metilado en dique).
Después de haber transformado a la XL-1 Blue con el
MpComb3H-K2S, se seleccionó para estudio ulterior un
transformante XM[K2S]. Como consecuencia del reemplazo de
pares de bases, se perdió un sitio de disociación con SfiI próximo
al extremo 3' del gen de K2S después de la mutagénesis dirigida a
un sitio. Se observó en 4.319 pb una versión lineal del
MpComb3H-K2S disociado con SfiI sin la aparición de
un fragmento insertado del gen de K2S (Figura 5, pista 3). Por lo
tanto, el gen de K2S codificado por MpComb3H-K2S fue
expresado en una forma sin fusión con gp3 en XM[K2S].
Expresión y purificación de K2S. La expresión de
K2S en XM[K2S] se indujo mediante IPTG. La
r-K2S era detectable usando un ELISA tanto en el
espacio periplásmico como en el material sobrenadante de cultivo. La
cantidad de la proteína heteróloga en cada preparación se determinó
usando un ELISA en emparedado y se puso en relación con el tPA
patrón. A partir de 100 ml del cultivo bacteriano en un matraz con
sacudimiento con una D.O. [a 600 nm] de 50, la fracción
periplásmica proporcionó 1,38 \mug de r-K2S
(aproximadamente 32%) mientras que se obtuvieron 2,96 \mug de
r-K2S (aproximadamente 68%) en el material
sobrenadante de cultivo precipitado con amonio. Se usó un ELISA en
emparedado para comprobar el fago precipitado por PEG procedente del
XM[K2S] infectado con VCSM13. No se detectó
r-K2S capturada por el anticuerpo monoclonal
anti-kringle 2 mediante la HRP conjugada con
anti-M13, indicando que la K2S no es presentada en
las partículas de fago si falta la gp3.
Medición de la actividad amidolítica. Si el
dominio de proteasa de serina está presente en la muestra, el
plasminógeno será convertido en plasmina. La plasmina producida
digerirá adicionalmente el substrato S-2251 para
dar un producto coloreado,
p-nitro-anilina, que tiene una
absorbencia máxima a 405 nm. La actividad específica del producto
recombinante está en concordancia con la absorbencia. La actividad
enzimática dependiente del fibrinógeno que tiene cada muestra, es
decir K2S-\Phi, r-K2S periplásmico
o r-K2S de material sobrenadante de cultivo, se
evaluó y comparó. Tanto la K2S-\Phi como la
r-KRS periplásmica ilustraron una actividad
enzimática notablemente baja, que estaba por debajo de la
sensibilidad del ensayo (0,25 UI/ml). La r-K2S en el
material sobrenadante de cultivo dio la actividad enzimática
dependiente de fibrinógeno de 7 UI/ml. Así, a partir de 100 ml de
un cultivo se obtuvo un total de 700 UI (Unidades Internacionales)
de actividad enzimática. Sin fibrinógeno no se observó ninguna
actividad enzimática de la r-K2S purificada a partir
del material sobrenadante de cultivo, mientras que el tPA de
melanoma patrón mostró una cierta actividad.
Demostración de la proteína recombinante por
transferencia inmunológica. La K2S parcialmente purificada
procedente del material sobrenadante de cultivo de XM[K2S]
reveló una masa molecular de 39 kDa usando anticuerpos de cordero
anti-tPA (Figura 6). El testigo negativo, un
material sobrenadante de cultivo parcialmente purificado de la
XL-1 Blue no transformada, no contenía una banda
reactiva que tuviese un tamaño similar.
Localización de la enzima activa mediante PAGE.
El plasminógeno se ha copolimerizado e inmovilizado con gelatina en
el gel de poli(acrilamida) antes de la electroforesis. Se
analizaron los materiales sobrenadantes de cultivo, precipitados
con sulfato de amonio, de XL-1 Blue,
XL-1 Blue transformada con pComb3HSS y
XM[K2S] (Figura 7). Todas las muestras se sometieron a
tratamiento en una condición no reductora para conservar la
conformación y la actividad correctas del dominio de proteasa de
serina. Se observaron regiones transparentes de plasminógeno
digerido con proteasa de serina solamente en los materiales
sobrenadantes de cultivo, precipitados con sulfato de amonio de
XM[K2S], en las posiciones de 34 y 37 kDa. Las otras muestras
no dieron zonas de aclaramiento. La pista testigo positivo del tPA
de melanoma patrón también demostró actividad enzimática en las
posiciones de 66 y 72 kDa.
\vskip1.000000\baselineskip
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producto activo y supera las limitaciones de la expresión
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\newpage
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kringle-2 domain of tissue plasminogen activator in
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\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1. Validación del producto de
amplificación por PCR del gen de K2S a partir del vector
p51-3 por uso de los cebadores SK2/174 y ASSP. La
pista 1 muestra un marcador de 1 kb (Roche Molecular Biochemicals,
Indianapolis, IN). La pista 2 se cargó con 1 \mul de un producto
amplificado. Se representa una única banda a 1.110 pb. La
electroforesis se realizó sobre un gel de agarosa al 1%.
Figura 2. Identificación del gen insertado de
K2S a 1.110 pb (*) después de que se hubo demostrado en la pista 3
la existencia de pComb3H-K2S digerido con Sfi I. La
pista 1 muestra un marcador de 1 kb. La pista 2 se cargó con
pComb3H-K2S sin cortar. La electroforesis se realizó
en un gel de agarosa al 1%.
Figura 3. Esquema del
pComb3H-K2S que muestra dos sitios de clonación con
Sfi I en los que se había insertado el gen de K2S. Se describen
también la secuencia de señal (OmpA), el sitio de fijación a
ribosomas (RIBS), el promotor lac y el gen de gpIII.
Figura 4. Diagrama esquemático del sitio de
mutación en la unión entre los genes de K2S y de gpIII en el
pComb3H-K2S. El sitio de reanillamiento del
pComb3H-K2S está unido con un conjunto de cebadores
de mutación (MSTPA y MASTPA) que contienen oligonucleosidos
modificados (subrayados). Después de haber realizado la
amplificación en ciclo, el sitio 1 para Sfi I (en negrita) es
modificado y se pierde en la hebra sintetizada de
nuevas.
nuevas.
Figura 5. Caracterización del
MpComb3H-K2S sintetizado de nuevas por la enzima de
restricción Sfi I. Se observa en la pista 3 una única banda de 4.319
pb que se refiere a un único sitio de disociación de
MpComb3H-K2S. No se puede visualizar ninguna banda
de K2S insertada a 1.110 pb. La pista 1 muestra un marcador de 1 kb.
La pista 2 se cargó con MpComb3H-K2S sin cortar. La
electroforesis se realizó en un gel de agarosa al 1%.
Figura 6. Identificación de una banda reactiva
inmunológica con un material sobrenadante de cultivo de una proteína
que se deriva de un ADN recombinante purificada a partir de E.
coli XM[K2S] con HRP de cordero conjugado con
anti-tPA. La pista 1 se cargó con 40 ng de un tPA de
melanoma patrón (86/670), que mostró la banda reactiva a 70 kDa. Los
materiales sobrenadantes de cultivo parcialmente purificados y
concentrados procedentes de XL-1 Blue y
XM[K2S] no transformados se aplicaron a las pistas 2 y 3
respectivamente. La banda reactiva distinguible se demostró
particularmente en la pista 3 a 39 kDa.
\newpage
Figura 7. Determinación del peso molecular de
una r-KRS extracelular que alberga un dominio de
proteasa de serina activa mediante electroforesis en gel de
poli(acrilamida) de un plasminógeno copolimerizado. La pista
1 contenía los patrones de peso molecular indicados (x 10^{-3}),
SDS-6H (Sigma, Saint Louis, MO). Se cargaron 50
\mug del material sobrenadante de cultivo precipitado con sulfato
de amonio saturado al 55% de XL-1 Blue, de
XL-1 Blue transformada con pComb3HSS y de
XM[K2S], en las pistas 2, 3 y 4 respectivamente. La pista 5
contenía 50 mUI de tPA de melanoma patrón (86/670). Las zonas
transparentes de plasminógeno digerido en gel de
poli(acrilamida) son visibles solamente en la pista 4 con
unos pesos moleculares de 34 y 37 kDa (B) y en la pista 5 con unos
pesos moleculares de 66 y 72 kDa (A).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 8. Estructura A
Molécula de K2S nativa de los aminoácidos
174-527 sin modificación (SEQ ID NO: 10).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 9. Estructura B-0
Molécula de K2S nativa de los aminoácidos
197-527 sin modificación (SEQ ID NO: 11).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 10. Estructura B-1
Molécula de K2S de los aminoácidos
193-527, en que a la estructura B-0
de la Figura 9 se le añadieron los aminoácidos SEGN en la porción
terminal de N (SEQ ID NO: 12).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 11. Estructura B-2
Molécula de K2S de los aminoácidos
193-527, como en la Figura 10, en que el Cys en 261
se había cambiado por Ser (SEQ ID NO: 13).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 12. Estructura B-3
Molécula de K2S de los aminoácidos
197-527, en que a la estructura B-0
de la Figura 9 se le añadieron los aminoácidos SEGNSD en la porción
terminal de N (SEQ ID NO: 14).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 13. Estructura B-4
Molécula de K2S de los aminoácidos
191-527, como en la Figura 12, en que el Cys en 261
se había cambiado por Ser (SEQ ID NO: 15).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 14. Estructura C
Molécula de K2S nativa de los aminoácidos
220-527 sin modificación. Esta molécula se puede
modificar adicionalmente de una manera similar a como se describe
para la estructura B en las Figuras 10-13 (SEQ ID
NO: 16).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 15. Estructura D
Molécula de K2S nativa de los aminoácidos
260-527 sin modificación. Esta molécula se puede
modificar adicionalmente de una manera similar a como se describe
para la estructura B en las Figuras 10-13 (SEQ ID
NO: 17).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 16. Molécula de tPA (SEQ ID NO: 18).
<110> Boehringer Ingelheim International
GMBH
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Métodos para la producción a gran
escala de proteínas en procariotas
\vskip0.400000\baselineskip
<130> protocolo de secuencias caso 1
1169
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB 0027782.2
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
14-11-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1 (SEQ ID NO:1)
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2 (SEQ ID NO:2)
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la secuencia
artificial: parte N-terminal de la molécula K2S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3 (SEQ ID NO:3)
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la secuencia
artificial: parte N-terminal de la molécula K2S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4 (SEQ ID NO:4)
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la secuencia
artificial: secuencia codificadora de la parte
N-terminal de la molécula K2S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctgagggaa ac
\hfill12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5 (SEQ ID NO:5)
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la secuencia
artificial: secuencia codificadora de la parte
N-terminal de la molécula K2S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctgagggaa acagtgac
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6 (SEQ ID NO:6)
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la secuencia
artificial: secuencia de oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaggaggagg tggcccaggc ggcctctgag ggaaacagtg ac
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7 (SEQ ID NO:7)
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la secuencia
artificial: secuencia de oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaggaggagc tggccggcct ggcccggtcg catgttgtca cg
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8 (SEQ ID NO:8)
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la secuencia
artificial: secuencia de oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacatgcgacc gtgacaggcc ggccag
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9 (SEQ ID NO:9)
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la secuencia
artificial: secuencia de oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggccggcc tgtcacggtc gcatgt
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10 (SEQ ID NO:10)
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 354
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la secuencia
artificial: parte de la molécula K2S recombinante
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11 (SEQ ID NO:11)
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 331
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la secuencia
artificial: parte de la molécula K2S recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12 (SEQ ID NO:12)
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 339
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la secuencia
artificial: parte de la molécula K2S recombinante (modificada)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13 (SEQ ID NO:13)
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 335
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la secuencia
artificial: parte de la molécula K2S recombinante (modificada)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14 (SEQ ID NO:14)
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 343
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la secuencia
artificial: parte de la molécula K2S recombinante (modificada)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15 (SEQ ID NO:15)
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 343
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la secuencia
artificial: parte de la molécula K2S recombinante (modificada)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16 (SEQ ID NO:16)
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 308
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la secuencia
artificial: parte de la molécula K2S recombinante (modificada)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17 (SEQ ID NO:17)
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 268
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la secuencia
artificial: parte de la molécula K2S recombinante (modificada)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18 (SEQ ID NO:18)
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 527
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens (tPA)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (7)
1. Método para la producción de un dominio
kringle 2 más proteasa de serina (K2S), activo y correctamente
plegado, del activador de plasminógeno tisular o una variante
funcional de éste en el sobrenadante de células procarióticas,
caracterizado porque la célula procariótica contiene y
expresa un vector que comprende un ADN que codifica el péptido señal
de la proteína de la membrana externa A (OmpA), que está fusionada
secuencia abajo a un ADN que codifica un péptido corto,
caracterizado por la secuencia de aminoácidos SEGNSD (SEQ ID
NO:3), que por sí misma está fusionada secuencia abajo a un ADN que
codifica el dominio kringle 2 más proteasa de serina del activador
de plasminógeno tisular humano o un derivado funcional de éste.
2. Método de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque la célula procariótica es E.
coli.
3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 ó
2, caracterizado porque se llevan a cabo las siguientes
operaciones:
a) el ADN que codifica el dominio kringle 2 más
proteasa de serina se amplifica por una PCR;
b) el producto de la PCR se purifica;
c) dicho producto de PCR se introduce en un
vector que comprende el ADN que codifica el péptido de señal OmpA y
el ADN que codifica la gpIII de una manera tal que dicho producto de
PCR está unido operativamente secuencia arriba con el ADN que
codifica la secuencia de señal OmpA y está unido secuencia abajo con
el ADN que codifica la gpIII de dicho vector;
d) se introduce un codón de detención entre
dicho dominio kringle 2 más proteasa de serina y la gpIII;
e) dicho vector se expresa por la célula
procariótica;
f) la proteína dominio kringle 2 más proteasa de
serina se purifica.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Método de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el vector es un
vector fagémido que comprende el ADN que codifica el péptido de
señal OmpA y el ADN que codifica la gpIII.
5. Método de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el vector es el
fagémido pComb3HSS.
6. Método de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la secuencia de
ADN del OmpA comprende la siguiente secuencia:
ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCCCAGGCGGCC
(SEQ ID NO:1).
(SEQ ID NO:1).
\vskip1.000000\baselineskip
7. Método de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el ADN que
codifica el péptido señal de la proteína de la membrana externa A
(OmpA), que por sí misma está fusionada secuencia abajo a un ADN que
codifica un péptido corto caracterizado por la secuencia de
aminoácidos SEGNSD (SEQ ID NO:3), que por sí misma está fusionada
secuencia abajo a un ADN que codifica el dominio kringle 2 más
proteasa de serina del activador de plasminógeno tisular humano o
una variante funcional de éste, está precedido por un promotor lac
y/o por un sitio de fijación a ribosomas.
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