ES2332042T3 - Hidrogel biorreabsorbible reticulado a base de albumina. - Google Patents

Abstract

Hidrogel físicamente reticulado, hidrófilo, hinchable en agua y lentamente disociable en medio acuoso, que consiste en proteínas sanguíneas de albúmina asociadas en forma de gel en medio básico.

Description

Hidrogel biorreabsorbible reticulado a base de albúmina.

La presente invención se refiere a un gel hidrófilo, disociable en medio acuoso, un procedimiento para la preparación de este hidrogel, así como una membrana de separación biorreabsorbible utilizable especialmente en cirugía y más en particular con el fin de minimizar y/o de impedir la formación de adherencias posquirúrgicas.

La formación de adherencias postoperatoria es muy frecuente durante cirugías cardiacas, abdominales o pélvicas. Estas adherencias pueden degenerar en patologías obstructivas en función de su extensión y de su gravedad. Durante cirugías abdominales, la formación de adhesiones puede comprometer, por ejemplo, la movilidad de los órganos e inducir dolores crónicos en el paciente. Las adhesiones son responsables del 49 al 74% de las obstrucciones del intestino delgado, del 10 al 15% de los casos de infertilidad y del 20 al 50% de los dolores pélvicos crónicos en la mujer. Además, durante una reoperación, la presencia de adhesiones puede aumentar de manera significativa la complejidad y la duración de la cirugía, así como las complicaciones postoperatorias. Las mismas conclusiones se aplican también para las cirugías cardiacas, pulmonares o torácicas. La presencia de adhesiones es un factor que influye también tanto en el riesgo operatorio (mortalidad y morbilidad) como en los costes del tratamiento.

La formación de adherencias aparece durante el procedimiento de reparación natural de tejidos sanos y están constituidas por uniones fibrosas entre los órganos objeto de la cirugía o incluso entre una membrana separadora como el peritoneo o el pericardio y los órganos subyacentes. A modo de ejemplo, cuando el peritoneo resulta dañado durante una cirugía, se acumula fibrina en la superficie de este último. Estas bandas de fibrina actúan como un pegamento e inducen una adhesión entre el órgano y la membrana. En las condiciones ideales, después de la reparación del sitio, la fibrina presente en el sitio de los daños mesoteliales será destruida por plasmina. La plasmina procede de la acción del activador tisular del plasminógeno (células mesoteliales) en el plasminógeno sanguíneo. La fibrinólisis y cascada de coagulación se ponen en acción en esta patología. También se observa un reclutamiento de fibroblastos y su proliferación así como la presencia de células inflamatorias, paralelamente al depósito de colágeno. Es posible que en la formación de las adhesiones esté implicado un mecanismo de angiogénesis bajo el control de las células endoteliales.

Una de las estrategias innovadoras actualmente propuesta para limitar la formación de adhesiones, sin interferir por otra parte en el mecanismo natural de reparación, consiste en insertar entre la membrana dañada y los órganos subyacentes, una hoja, secada o no, de polímero sintético o natural, reticulado químicamente o no. La hoja seca en contacto con los tejidos se hidrata y experimenta una erosión por un mecanismo lento de disolución o por hidrólisis. Este procedimiento conduce a la reabsorción completa de la hoja en las semanas siguientes a su implantación. La formación de las adherencias que comienza desde el final de la operación llega a su fin aproximadamente 7 días más tarde. Así pues, si en el curso de la primera semana se coloca una barrera física por ejemplo entre el pericardio y el epicardio, o incluso entre el peritoneo y los órganos del sistema gastrointestinal, o incluso entre la pleura y el pulmón, el número de sitios de adhesión debería reducirse ahí al mínimo. Con la desaparición de la barrera, deberían observarse adhesiones unidas por una sola de sus extremidades. Esta barrera o separador debe poseer cualidades de biodegradabilidad, de maleabilidad, de biocompatibilidad, de ser no abrasiva y fácil de sintetizar.

El término hidrogel se refiere por definición a un material polimérico natural o artificial que tiene la propiedad de retener varias veces su peso en agua, lo que le confiere una semejanza en términos de hidratación con los tejidos vivos. Así, parece que los hidrogeles pueden desempeñar el papel de barrera, es decir, de hojas separadoras.

La mayoría de las películas poliméricas hidratadas se obtienen por reticulación química de polímeros hidrófilos naturales o sintéticos en presencia de agentes bifuncionales o por polimerización de monómeros, lo que les confieren una estabilidad estructural elevada y en consecuencia una baja biodegradabilidad. Estas películas son útiles en uso externo como apósito cutáneo y para la liberación controlada de medicamento. In vivo, sus usos y aplicaciones son limitados porque se degradan muy lentamente, cuando lo hacen. Existe así una necesidad en el campo médico de películas de hidrogel hidratadas biodegradables que podrían usarse in vivo durante cirugías con el fin de disminuir las adherencias e incluso para permitir la liberación controlada de medicamentos in situ. Existen varios tipos de películas poliméricas secas con fines de liberación controlada de medicamentos y que se desagregan por disolución. Estas películas secas no pueden implantarse en ciertas partes del cuerpo humano, ya que son sólidas, no flexibles y abrasivas y requieren un lugar de implantación sin restricción mecánica, al contrario de un hidrogel hidratado que por su naturaleza es flexible y no abrasivo. La película de hidrogel hidratada y biodegradable puede colocarse en todas las partes del cuerpo, incluso las sometidas a una tensión mecánica como las articulaciones, el corazón y la cavidad peritoneal. A continuación de su degradación, no debería encontrarse ninguna otra traza del hidrogel en el sitio de implantación, eliminando todo riesgo ligado a la bioacumulación del polímero.

La mayoría de las películas poliméricas hidratadas se obtienen por reticulación química de polímeros hidrófilos naturales o sintéticos en presencia de agentes bifuncionales o por polimerización de monómeros, lo que les confieren una estabilidad estructural elevada y en consecuencia una baja biodegradabilidad. Así, para usos in vivo, las películas de hidrogel deben degradarse en un tiempo suficientemente corto, es decir, en un tiempo inferior al tiempo requerido para la formación de una cápsula fibrosa que procede de la reacción inflamatoria celular del hospedador en el implante. Se habla aquí de un tiempo de degradación de una veintena de días a unas semanas.

Se han usado membranas amnióticas humanas irradiadas (Young y col., Fertil. Steril., 55:624-628,1991) con un cierto éxito en el conejo modelo durante cirugías pélvicas. Sin embargo, problemas éticos y de aprovisionamiento han limitado su desarrollo. Se han evaluado dos hidrogeles en el modelo de rata (West y Hubbell, Biomaterials, 16: 1153-1156, 1995), el primero fotopolimerizado in situ y hecho de poli(etilenglicol)-co-ácido láctico diacrílico y el segundo reticulado físicamente y hecho de poli(etilenglicol)-co-poli(propilenglicol) y Poloxámero 407. Se ha observado una disminución de adherencias del 75 y del 38%, respectivamente; los tiempos de biodegradación respectivos eran de 4 días para el primero y de 2 días para el segundo. Más recientemente, una membrana de hidrogel obtenida por pulverización de dos líquidos que contenían poli(etilenglicol) en el sitio quirúrgico pélvico en el cerdo ha permitido una reducción significativa del 60% del número y de la intensidad de las adhesiones. El revestimiento de hidrogel se ha reabsorbido en 5 días (Ferland y col., Hum. Reprod., 16: 2718,2723, 2001).

Los hidrogeles de ácido hialurónico reticulado han dado una reducción significativa de las adhesiones y de las readhesiones abdominales en el conejo, sin embargo no se ha expuesto la degradabilidad del polímero (Osada y col., J. Int. Med. Res., 27:233-241, 1999). Durante un estudio clínico, hojas de ácido hialurónico y de carboximetilcelulosa han permitido una disminución del 51% de la incidencia de las adherencias y del 87% de la gravedad de estas adherencias (Becker y col., J. Am. Coll. Surg., 183: 297-306, 1996) después de una cirugía abdominal.

Para las cirugías cardiacas, las primeras membranas para limitar la formación de adhesiones epicardio-pericardio se han hecho de poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) reforzadas con poli(tereftalato de etileno) (Walker y col., Asaio J. 38:M550-554, 1992). Estas membranas de hidrogel bastante rígidas no eran biodegradables y estaban sujetas a calcificación después de 9 meses de implantación en el perro. Las membranas de poli(hidroxibutirato) han dado buenos resultados en el cordero, sin embargo eran reabsorbidas muy lentamente por los macrófagos después de más de 30 meses (Malm y col., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 104:600-607, 1992). Experiencias similares en el perro, que usaban membranas reabsorbibles a base de poli(etilenglicol) y de ácido poli(láctico), han demostrado una disminución de las adherencias, sin embargo su biodegradabilidad era muy rápida y la reabsorción era completa al cabo de unos días (Okuyama y col., Ann. Thorac. Surg. 68:913-918, 1999). Se han usado con éxito membranas reabsorbibles de colágeno elastina (Fierez y col., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 117:185,1999) para limitar el número de adhesiones durante cirugía cardiaca en el ser humano. Más recientemente, se han usado hojas de N-O carboximetil-quitosano con los mismos fines, pero en el conejo, y han permitido una reducción muy significativa del número de adhesiones, sin embargo no se expone la biodegradabilidad de estas hojas (Krause y col., J. Invest. Surg., 14:93-97,
2001).

El objeto de la presente invención consiste en suministrar un nuevo tipo de hidrogel destinado a formar una membrana de separación biodegradable, dirigida a remediar los inconvenientes de las películas poliméricas conocidas, y que presenta una excelente biocompatibilidad, una buena degradabilidad in vivo, características viscoelásticas que facilitan su manipulación y una ausencia de efecto abrasivo.

Un primer objeto de esta invención dirigido al fin citado anteriormente es así un hidrogel físicamente reticulado, hidrófilo, hinchable en agua y lentamente disociable en medio acuoso, que consiste en proteínas sanguíneas de albúmina asociadas en forma de gel en medio básico.

Un segundo objeto de la invención consiste en una membrana de separación biorreabsorbible que está formada por una película del hidrogel mencionado anteriormente.

Un tercer objeto de la invención es un procedimiento para la preparación del hidrogel mencionado anteriormente, que consiste en mezclar una solución acuosa de albúmina proteica con una base, y después en dejar reposar la mezcla hasta la polimerización de las macromoléculas de albúmina.

Finalmente, la invención tiene igualmente por objeto el uso de la membrana de separación en cirugía veterinaria y humana, así como la administración controlada de una sustancia terapéuticamente activa.

Las proteínas sanguíneas de albúmina pueden estar aisladas del plasma o de los sueros de origen animal (buey, conejo, cerdo, etc.) o humano.

La albúmina de origen humano puede obtenerse de un banco de sangre o por ingeniería genética, o bien ser de naturaleza autóloga. En este último caso, parece que la aceptabilidad por el paciente será claramente mejor frente al implante, por la composición autóloga de la membrana.

En lo que se refiere al procedimiento de preparación del hidrogel según la invención, se caracteriza preferentemente porque la solución acuosa de albúmina está comprendida entre el 10 y el 20% (peso/vol.), porque la base es NaOH 5 N y porque la relación entre NaOH y la solución de albúmina es del 0,5 al 2,0% (peso/vol.), y porque la duración de la polimerización está comprendida entre aproximadamente 1 h y 8 h. Preferentemente también, todas las etapas del procedimiento según la invención se efectúan en condiciones estériles.

En cuanto a la membrana de separación biodegradable según la invención, puede usarse ventajosamente por un cirujano o por un veterinario para reducir la formación de adherencias durante cirugías torácicas, pélvicas, abdominales, cardiacas u otras.

El hidrogel que forma la membrana de separación biodegradable puede contener igualmente una sustancia terapéuticamente activa, o bien un sistema de liberación controlada de medicamento que tenga una forma fisiológicamente aceptable, que convenga para una administración oral, rectal, vaginal o en forma de un implante quirúrgico.

Finalmente, la membrana de separación puede modificarse asimismo en superficie por la adición covalente de cadenas de monoetoxipoli(etilenglicol) de masas moleculares diversas o incluso por incubación en una solución de poli(etilenglicol) con el fin de modificar sus características de biocompatibilidad y de degradabilidad.

Teniendo en cuenta lo anterior, el nuevo hidrogel según la invención posee cualidades biomédicas en particular interesantes, como son su capacidad de estar en forma de un película delgada de dimensiones ajustables, su alto contenido en agua, propiedades mecánicas que permiten su fácil manipulación, el hecho de que no sea translúcido lo que facilita su colocación, y su carácter biodegradable in situ en medio fisiológico.

La presente invención se ilustrará a continuación por medio de los ejemplos siguientes:

Ejemplo 1 Síntesis del hidrogel de albúmina sérica reabsorbible

A modo de ejemplo, se añade una albúmina sérica comercial como, y de manera no restrictiva, la del conejo o el buey, cuando se disuelve en agua destilada a una concentración que varía entre el 10 y el 20% (peso/volumen) y una base, por ejemplo una solución acuosa de 5,0 N de NaOH, con el fin de obtener un porcentaje final de la base que se sitúa entre el 1,5 y el 0,6% (p/v); esta albúmina se gelificará después de un periodo de espera a la temperatura de la pieza que puede ir de aproximadamente 1 hora hasta ocho horas. Esta gelificación de la albúmina suministra un gel que es hidratado, maleable, translúcido y que revela ser un hidrogel cuyo contenido en agua se eleva hasta el 97% (consúltese la Tabla 1). La textura de los hidrogeles obtenidos por variación de la cantidad de la base y de la albúmina varía de muy viscoelástica a vítrea, manteniéndose en todo caso flexibles e hidratados. El pH del hidrogel puede ajustarse al pH fisiológico o a otro pH por simple incubación de una hora en la solución fisiológica deseada. Durante este periodo de incubación y de equilibrado, la solución tampón salina se cambiará dos veces. Para obtener un hidrogel de dimensión buscada y de espesor deseado, la solución de albúmina añadida en fresco de la cantidad necesaria de la solución de base puede hacerse correr entre dos placas de vidrio apropiadas, que están separadas por barras de separación de espesor deseado (0,75 a 2,0 mm) y que aseguran además la estanqueidad buscada para el montaje. Para este fin puede usarse un montaje del tipo del usado para preparar geles de poliacrilamida para electroforesis.

TABLA 1 Condiciones de síntesis del hidrogel a base de albúmina sérica y características de los hidrogeles obtenidos

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Ejemplo 2 Hidrogel autólogo humano o animal

Según el protocolo descrito anteriormente, la albúmina animal es sustituida por albúmina humana aislada de la sangre del paciente o del animal que se destina a recibir el hidrogel quirúrgicamente. El volumen de sangre que se extraerá será función de la dimensión y del número de hidrogeles para sintetizar. Para ello, la albúmina se aísla a partir de un volumen de sangre extraída nueva según el procedimiento de Hao (Hao, Vox. Sang. 36:313-320, 1979), dado aquí sólo a modo de ejemplo. Todas las etapas se efectúan a una temperatura que se sitúa entre -5 y 0ºC. Sucintamente, este procedimiento consiste en una dilución de un volumen de plasma sanguíneo por dos volúmenes de una solución acuosa de NaCl 0,15 M, y el pH se ajusta a 5,6 por la adición de una cantidad de una solución de acetato de sodio 0,8 M a pH 4,0. Una vez enfriada la mezcla, se añade una solución acuosa de etanol al 95% v/v lentamente con agitación hasta la obtención de una concentración final de etanol del 42% (v/v). Después se mantiene la agitación durante una hora y se centrifuga la solución a 12.000 g/1 h. A continuación se ajusta el pH del sobrenadante a 4,8 con la solución de tampón acetato. A continuación se agita la solución durante 1 h y se deja sin agitación durante 3 h. A continuación se centrifuga la solución a 12.000 g/1 h. A continuación se recupera el precipitado y contiene la albúmina. La albúmina se disuelve en un volumen de agua, y se evalúa la cantidad de proteína mediante ensayo de ácido bicinconínico (BCA, Pierce, EE.UU.). La albúmina se diluye con agua estéril a la concentración final deseada (entre el 15 y el 20% p/v), y después se filtra en una membrana de porosidad de 0,01 micrómetros con el fin de esterilizarla.

El hidrogel se obtiene según se describe anteriormente. Además, todas las manipulaciones se efectúan de maneras en que el hidrogel obtenido sea estéril.

Ejemplo 3 Implantación de un hidrogel en posición pericardio-epicardio en el conejo para la prevención de adherencias postoperatorias

Con el fin de evaluar la protección conferida por el hidrogel contra las adherencias que proceden de una cirugía cardiaca y para evaluar la velocidad de reabsorción in vivo del hidrogel, estos últimos se implantarán en la cavidad cardiaca del conejo.

Para hacerlo se preparan hidrogeles de una dimensión de 25 x 20 x 1 mm mezclando 150 mg de albúmina de conejo (Sigma, EE.UU.) por ml de solución al 0,9% de NaCl a la que se añaden 50 ml de NaOH 5,0 N y una gota de azul de metileno al 1% para colorear el hidrogel. Se ha añadido anteriormente un hilo de Ethicon 910 (J&J, EE.UU.) entre las placas de vidrio para permitir al cirujano fijar bien el hidrogel en el interior del pericardio. Después de la síntesis, los hidrogeles se lavan varias veces y se conservan en NaCl al 0,9%. Todas las soluciones se filtran en filtro Millipore de 0,2 micrómetros y todas las manipulaciones se efectúan en condiciones estériles.

Los conejos se anestesian con isoflurano (1,5%) después de premedicación con 0,5 mg de atropina, 0,5 mg/kg de midazolam y 6 mg/kg de azaperona. Después de relajación muscular con 0,2 mg/kg de pancuronio a través de la vía yugular derecha, los animales se intuban y se ventilan mecánicamente. Se administra una dosis de 10 mg/kg de fentanilo al comienzo de cirugía, y después se repite con 0,05 mg cada 30 minutos. El conejo se coloca en decúbito dorsal. Después de rasurado y desinfección del tórax se realizan una esternotomía medial y una disección de los diversos planos para acabar en el pericardio que está abierto. Inmediatamente, se vuelve a cerrar el pericardio con una sutura continua de Vicryl/0 (conejo controlado) o bien, hay colocación de hidrogel de albúmina de conejo, fijación por puntos en la pared interna del pericardio y cierre. Se realiza una hemostasia y el cierre del esternón, del tejido subcutáneo y de la piel. Se desinfecta la cicatriz y se despierta al animal.

Los animales se sacrifican en 1-2-3-4-5-7-8 semanas, y se extrae la sección hidrogel/pericardio para análisis histológico. La evaluación histológica consiste en cortes del tejido de interés fijado previamente en una solución de formaldehído neutro al 10%, seguido de una coloración de hematoxilina-eosina. Después de la evaluación microscópica, el grado de fibrosis y de inflamación se clasificará según una escala de 0 para ausencia de fibrosis y de 4 cuando hay presencia de células granulomatosas, de proliferación celular, etc.

Esta serie de experiencias ha demostrado que al cabo de 8 semanas, el hidrogel se ha reabsorbido completamente, que no se encuentra ninguna actividad inflamatoria en el sitio de implantación y que sólo se observan residuos de adhesiones no significativos aquí o allá.

Los resultados preliminares del estudio in vivo, practicado en el conejo, confirman así los caracteres de biocompatibilidad, biodegradabilidad y limitan el grado de fibrosis postoperatoria. Efectivamente, no ha habido reacción de rechazo en la implantación del gel (biocompatibilidad), el material se disuelve en el espacio de 3 a 4 semanas (biodegradabilidad) y finalmente, el fenómeno de protección, que limita, es decir elimina, la fibrosis postoperatoria, el carácter más importante, se ha respetado hasta aquí.

Ejemplo 4 Implantación subcutánea de un hidrogel en el conejo para la liberación controlada de medicamentos y la prevención de adherencias postoperatorias

Se han sintetizado hidrogeles de igual composición que antes con una dimensión final de 12,5 x 10 x 1,5 mm. Después de haberlos lavado en medio fisiológico al 0,9% de NaCl, los hidrogeles se incuban durante 3 horas bien en una solución de ibuprofeno al 0,5% en NaCl al 0,9%, en una solución del 2% de poli(etilenglicol) de masa molecular de 4.000 Da o simplemente en una solución del 0,9% de NaCl. A continuación, se implantan los diferentes hidrogeles en subcutáneo en posición dorsal en el conejo.

Después de 1-2-3-4-5-7-8 semanas, los conejos se han sacrificado y se han efectuado cortes histológicos en el nivel de los sitios de implantación para evaluar las adherencias, la inflamación y la presencia de residuos de hidrogel. Se han realizado las observaciones siguientes, es decir, que los resultados preliminares confirman los caracteres de biocompatibilidad, biodegradabilidad y un menor grado de fibrosis postoperatoria en presencia de principios activos cuyos hidrogeles se han embebido.

Ejemplo 5 Velocidad de disolución del hidrogel in vitro

Se han preparado hidrogeles de diferentes composiciones en términos de cantidad de albúmina y de base y se han lavado en un tampón fisiológico. Se han incubado por separado en una solución de tampón fisiológico a 37ºC para evaluar el tiempo requerido para las disoluciones completas, es decir, para determinar el tiempo necesario para su reabsorción por disolución.

A las 8 semanas, se ha observado que los geles se han deslechado, han perdido su consistencia inicial y su resistencia mecánica; por este hecho, se constata que la biodegradación es eficaz in vitro después de 8 semanas, lo que confirma el interés de la presente invención.

Claims (9)

1. Hidrogel físicamente reticulado, hidrófilo, hinchable en agua y lentamente disociable en medio acuoso, que consiste en proteínas sanguíneas de albúmina asociadas en forma de gel en medio básico.

2. Hidrogel según la reivindicación 1, caracterizado porque las proteínas sanguíneas de albúmina están aisladas de plasma o de suero de origen animal o humano.

3. Hidrogel según la reivindicación 2, caracterizado porque la albúmina de origen humano proviene de un banco de sangre, es de naturaleza autóloga o se obtiene por ingeniería genética.

4. Membrana de separación biorreabsorbible, caracterizada porque está formada por una película del hidrogel según una de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Membrana de separación según la reivindicación 4, caracterizada porque el hidrogel que constituye dicha membrana contiene una sustancia terapéuticamente activa.

6. Membrana de separación según la reivindicación 4, caracterizada porque está modificada en superficie, por la adición de cadenas de monometoxi-poli(etilenglicol) fijadas por enlaces covalentes.

7. Membrana de separación según la reivindicación 4, caracterizada porque el hidrogel que forma dicha membrana contiene un sistema de liberación controlada de medicamento que tiene una forma fisiológicamente aceptable.

8. Procedimiento de preparación de un hidrogel según la reivindicación 1, que consiste en mezclar una solución acuosa de albúmina proteica con una base y después en dejar reposar la mezcla hasta la polimerización de las monomoléculas de albúmina.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque la solución acuosa de albúmina está comprendida entre el 10 y el 20% (peso/vol.), porque la base es NaOH 5 N y la relación entre el NaOH y la solución de albúmina es del 0,5 al 2,0% (peso/vol.), y porque la duración de la polimerización está comprendida entre aproximadamente 1 h y 8 h.