ES2331150T3 - Metodos para identificar agonistas indirectos de igf-1. - Google Patents
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Abstract
Un método para identificar agonistas indirectos del IGF-1 que comprende las etapas de: (a) la determinación de la capacidad de N,N-bis-(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina para inhibir la unión de IGFBP-1 o -3 a IGF-1, y la comparación de dicha capacidad con la capacidad de un agonista indirecto del IGF-1 candidato para inhibir así la unión; y (b) la determinación de si el agonista indirecto candidato inhibe tal unión al menos igual de bien que la N,Nbis-(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina.
Description
Métodos para identificar agonistas indirectos de
IGF-1.
Esta invención está dirigida a una forma
cristalina del factor de crecimiento similar a insulina 1
(IGF-1) humano y, más particularmente, a un cristal
del IGF-1 humano, a un método de cristalización del
mismo y a sus estructuras obtenidas mediante difracción de rayos X.
La invención se refiere a métodos para identificar nuevas moléculas
agonistas del IGF-1 basadas en datos biofísicos y
bioquímicos que sugieren que una única molécula de detergente que
entra en contacto con residuos que se sabe que son importantes para
las interacciones con la proteína de unión a IGF-1
(IGFBP), se une específicamente a IGF-1 y bloquea la
unión de IGFBP-1 e IGFBP-3.
Existe gran cantidad de literatura sobre las
acciones y actividades de los IGFs (IGF-1,
IGF-2 y las variantes del IGF). El
IGF-1 humano es una proteína sérica de 70
aminoácidos y 7649 daltons con un pI de 8,4 (Rinderknecht y Humbel,
Proc. Natl. Acad. Sci USA, 73: 2365 (1976); Rinderknecht y Humbel,
J. Biol. Chem., 253: 2769 (1978)) que pertenece a la familia de las
somatomedinas con actividades biológicas similares a las de la
insulina y mitogénicas que modulan la acción de la hormona de
crecimiento (GH) (Van Wyk y col., Recent Prog. Horm. Res., 30: 259
(1974); Binoux, Ann. Endocrinol., 41: 157 (1980); Clemmons y Van
Wyk, Handbook Exp. Pharmacol., 57: 161 (1981); Baxter, Adv. Clin.
Chem., 25: 49 (1986); Patente de EE.UU. Nº 4.988.675; WO 91/03253;
WO 93/23071). Los IGFs comparten un nivel elevado de identidad de
secuencias con la insulina, siendo un 49% aproximadamente idénticos
a la misma. A diferencia de la insulina, sin embargo, que es
sintetizada como una proteína precursora que contiene un segmento
de 33 aminoácidos conocido como péptido C (que es escindido para dar
lugar a un dímero unido covalentemente de las cadenas A y B
restantes), los IGFs son polipéptidos sencillos (ver la Figura
1).
En el embrión en desarrollo, la ausencia de
IGF-1 da lugar a un retraso grave del crecimiento
que continua después del nacimiento (Baker y col., Cell, 75:
73-82 (1993); Powell-Braxton y col.,
Genes & Development, 7: 2609-2617 (1993); Liu y
col., Cell, 75: 59-72 (1993); Liu y col., Molecular
Endocrinol., 12: 1452-1462 (1998)). Aunque la mayor
parte (más de un 75%) del IGF-1 sérico es producida
por el hígado en respuesta a la hormona de crecimiento, se ha
demostrado que este IGF-1 derivado del hígado no es
necesario para el crecimiento corporal postnatal en ratones
(Sjogren y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:
7088-7092 (1999)). En su lugar, es el
IGF-1 no hepático, producido localmente, que actúa
de manera paracrina/autocrina, el que parece ser responsable de la
mayor parte de los efectos estimulantes del crecimiento postnatal
del IGF-1 (Schlechter y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 83: 7932-7934 (1986); Isaksson y col.,
Science, 216: 1237-1239 (1982)). Consistente con
sus efectos estimulantes del crecimiento, el IGF-1
es un potente mitógeno que regula diversas funciones celulares
tales como la progresión del ciclo celular, la apoptosis y la
diferenciación celular (Le-Roith, Endocrinology,
141: 1287-1288 (2000)).
Los IGFs han sido implicados en una variedad de
funciones celulares y procesos de enfermedad, incluyendo la
progresión del ciclo celular, la proliferación, la diferenciación y
efectos similares a los de la insulina en la diabetes resistente a
insulina. Por tanto, se ha sugerido el IGF como herramienta
terapéutica en una variedad de enfermedades y lesiones (para una
revisión, ver Lowe, Scientific American (Marzo/Abril 1996), p.62).
Debido a este rango de actividades, el IGF-1 ha sido
ensayado en mamíferos para usos tan ampliamente dispares como
cicatrización de heridas, tratamiento de enfermedades renales,
tratamiento de la diabetes, reversión de estados catabólicos
generales de todo el organismo tales como el desgaste relativo al
SIDA, el tratamiento de condiciones cardíacas tales como la
insuficiencia cardíaca congestiva y el tratamiento de enfermedades
neurológicas (Guler y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:
4889-4893 (1988); Schalch y col., J. Clin. Metab.,
77: 1563-1568 (1993); Froesch y col., Horm. Res.,
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human insulin-like growth factor 1
(rhIGF-1) in type II diabetes mellitus", en:
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Clin. Invest., 95: 619-627 (1995); Bondy, Ann.
Intern. Med., 120: 593-601 (1994); Hammerman y
Miller, Am. J. Physiol., 265: F1-F14 (1993);
Hammerman y Miller, J. Am. Soc. Nephrol., 5: 1-11
(1994) y Barinaga y col., Science, 264: 772-774
(1994)).
En la literatura de patentes abundan también
descripciones de varios usos del IGF-1, o de
compuestos que incrementan la concentración activa del
IGF-1, para tratar mamíferos, especialmente
pacientes humanos, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N^{os}
5.714.460; 5.273.961; 5.466.670; 5.126.324; 5.187.151; 5.202.119;
5.374.620; 5.106.832; 4.988.675; 5.106.832; 5.068.224; 5.093.317;
5.569.648 y 4.876.242; WO 92/11865; WO 96/01124; WO 91/03253; WO
93/25219; WO 93/08826 y WO 94/16722.
El sistema de IGF está también compuesto por
receptores unidos a la membrana para IGF-1,
IGF-2 e insulina. El receptor de IGF de tipo 1
(IGF-1R) está estrechamente relacionado con el
receptor de la insulina en cuanto a estructura y comparte algunas
de sus rutas de señalización (Jones y Clemmons, Endocr. Rev., 16:
3-34 (1995)). El receptor de IGF-2
es un receptor de aclaramiento que parece no transmitir ninguna
señal intracelular (Jones y Clemmons, supra). Como
IGF-1 e IGF-2 se unen al
IGF-1R con una afinidad mucho mayor que al receptor
de insulina, es muy probable que la mayor parte de los efectos de
IGF-1 e IGF-2 estén mediados por
IGF-1R (Humbel, Eur. J. Biochem., 190:
445-462 (1990); Ballard y col., "Does
IGF-1 ever act through the insulin receptor?",
en Baxter y col. (Eds.), The Insulin-Like Growth
Factors and Their Regulatory Proteins, (Amsterdam: Elsevier, 1994),
pp. 131-138).
El IGF-1R es un heterotetrámero
\alpha^{2}\beta^{2} de subunidades \alpha y \beta unidas
por disulfuro. Los dímeros \alpha\beta están unidos ellos
mismos a la superficie celular mediante disulfuro para formar un
heterotetrámero covalente. Igual que en el complejo
insulina/receptor de insulina, el IGF-1 se une al
IGF-1R con una estequiometría de 1:2 (De Meyts,
Diabetologia, 37: S135-S148 (1994)), con un sitio de
alta afinidad (K_{d} 0,4 nM aproximadamente) y un sitio de baja
afinidad (K_{d} 6 nM aproximadamente) (Tollefsen y Thompson, J.
Biol. Chem., 263: 16267-16273 (1988)). Se ha
determinado la estructura cristalina mediante rayos X de los tres
primeros dominios del IGF-1R (Garrett y col.,
Nature, 394: 395-399 (1998)). Contiene tres dominios
distintos (L1, rico en Cys, L2). Las mutaciones que afectan a la
unión de IGF-1 están localizadas en la superficie
cóncava del receptor.
El IGF-1R es un factor clave en
el crecimiento y el desarrollo celular normal (Isaksson y col.,
Endocrine Reviews, 8: 426-438 (1987); Daughaday y
Rotwein, Endocrine Rev., 10: 68-91 (1989)). Cada vez
más pruebas sugieren, sin embargo, que la generación de señales por
el IGF-1R desempeña también una función crítica en
el crecimiento de células tumorales, en la transformación celular y
en la tumorigénesis (Baserga, Cancer Res., 55:
249-252 (1995)). Ejemplos clave incluyen la pérdida
del fenotipo metastásico de células de carcinoma murino por el
tratamiento con ARN antisentido para el IGF-1R (Long
y col., Cancer Res., 55: 1006-1009 (1995)) y la
inhibición in vitro de la motilidad de células de melanoma
humano (Stracke y col., J. Biol. Chem., 264:
21554-21559 (1989)) y del crecimiento de células de
cáncer de mama humano por la adición de anticuerpos hacia
IGF-1R (Rohlik y col., Biochem. Biophys. Res.
Commun., 149: 276-281 (1987)).
Los IGFs son potentes mitógenos de células de
cáncer de mama sobre la base de la observación de que el
IGF-1 incrementaba la proliferación de células de
cáncer de mama in vitro (Cullen y col., Cancer Res., 50:
48-53 (1990)). Los cánceres de mama expresan
IGF-2 e IGF-1R, proporcionando todos
los efectores requeridos para un paradigma de proliferación basado
en el bucle autocrino (Quinn y col., J. Biol. Chem., 271:
11477-11483 (1996); Steller y col., Cancer Res.,
56: 1761-1765 (1996)). Como el cáncer de mama es una
enfermedad maligna común que afecta aproximadamente a una de cada
ocho mujeres y es una causa importante de las muertes por cáncer de
las mujeres norteamericanas (LeRoith y col., Ann. Int. Med., 122:
54-59 (1995)), se requieren nuevas terapias de
intervención racionales. El IGF-1 puede suprimir la
apoptosis y, por tanto, las células que carecen de
IGF-1Rs o que tienen rutas de señalización de
IGF-1R comprometidas, pueden dar lugar a células
tumorales que mueren selectivamente mediante apoptosis (Long y
col., Cancer Res., 55: 1006-1009 (1995)). Además, se
ha probado recientemente que alteraciones en la generación de
señales por el IGF en el contexto de otros estados de enfermedad,
tales como la diabetes, pueden ser responsables de la exacerbación
de las complicaciones de la retinopatía (Smith y col., Science,
276: 1706-1709 (1997)) y nefropatía (Homely y col.,
Am. J. Physiol., 274: F1045-F1053 (1998)).
El IGF-1 in vivo se
encuentra principalmente formando complejos con una familia de al
menos seis proteínas séricas conocidas como IGFBPs (Jones y
Clemmons, supra; Bach y Rechler, Diabetes Reviews, 3:
38-61 (1995)), que modulan el acceso de los IGFs al
IGF-1R. regulan también las concentraciones de
IGF-1 e IGF-2 en la circulación y a
nivel del IGF-1R tisular (Clemmons y col., Anal. NY
Acad. Sci. USA, 692: 10-21 (1993)). Las IGFBPs se
unen a IGF-1 e IGF-2 con afinidades
y especificidades variadas (Jones y Clemmons, supra; Bach y
Rechler, supra). Por ejemplo, IGFBP-3 se una
a IGF-1 e IGF-2 con una afinidad
similar, mientras que IGFBP-2 e
IGFBP-6 se unen a IGF-2 con una
afinidad mucho mayor que con la que se unen a IGF-1
(Bach y Rechler, supra; Oh y col., Endocrinology, 132:
1337-1344 (1993)). La proteína transportadora
principal es IGFBP-3. Actualmente no se sabe nada
acerca de la estequiometría de la unión en estos complejos de
IGF-1 y sus IGFBPs, debido al tamaño heterogéneo de
los complejos causado por la glicosilación.
El IGF-1 existe de forma natural
en los fluidos corporales humanos, por ejemplo en la sangre y en el
fluido cerebroespinal humano. Aunque el IGF-1 es
producido en muchos tejidos, se cree que la mayoría del
IGF-1 circulante es sintetizado en el hígado. Se
cree que las IGFBPs modulan la actividad biológica del
IGF-1 (Jones y Clemmons, supra), estando
implicada la IGFBP-1 (Lee y col., Proc. Soc. Exp.
Biol. & Med., 204: 4-29 (1993)) como la
proteína de unión principal involucrada en el metabolismo de la
glucosa (Baxter, "Physiological roles of IGF binding
proteins", en: Spencer (Ed.), Modern Concepts of
Insulin-Like Growth Factors (Elsevier: New York,
1991), pp. 371-380). La producción de
IGFBP-1 por el hígado está regulada por el estado
nutricional, suprimiendo directamente la insulina su producción
(Suikkari y col., J. Clin. Endocrinol. Metab., 66:
266-272 (1988)).
Se conoce poco la función in vivo de
IGFBP-1. Se ha demostrado que la administración de
IGFBP-1 humana purificada a ratas produce un
incremento agudo, pero pequeño, de la glucosa sanguínea (Lewitt y
col., Endocrinology, 129: 2254-2256 (1991)). La
regulación de IGFBP-1 se conoce algo mejor. Se ha
propuesto (Lewitt y Baxter, Mol. Cell Endocrinology, 79:
147-152 (1991)) que cuando aumenta la glucosa
sanguínea y se secreta insulina, se suprime la
IGFBP-1, permitiendo un incremento lento de los
niveles de IGF-1 "libre" que podría ayudar a la
acción de la insulina sobre el transporte de glucosa. Tal escenario
sitúa la función de la IGFBP-1 como un regulador
directo de la glucosa sanguínea.
En la mayoría de los casos, la adición de IGFBP
exógena suaviza los efectos del IGF-1. Por ejemplo,
el efecto estimulante del crecimiento que tiene el estradiol sobre
las células de cáncer de mama humano MCF-7 está
asociado con un ARNm de la IGFBP-3 disminuido y una
acumulación disminuida de la proteína, mientras que el antiestrógeno
ICI 182780 produce inhibición del crecimiento y niveles
incrementados del ARNm de IGFBP-3 y de la proteína
(Huynh y col., J. Biol. Chem., 271: 1016-1021
(1996); Oh y col., Prog. Growth Factor Res., 6:
503-512 (1995)). Se ha descrito también que la
inhibición in vitro de la proliferación de células de cáncer
de mama por el ácido retinoico puede implicar una secreción
alterada de IGFBP por las células tumorales o niveles circulantes
de IGF-1 disminuidos in vivo (LeRoith y col.,
Ann. Int. Med., 122: 54-59 (1995); Oh y col.,
supra). Opuesto a este hallazgo, el tratamiento de células
MCF-7 con el antiestrógeno tamoxifeno disminuye la
generación de señales por el IGF-1R de una manera
que no está relacionada con la producción disminuida de IGFBP (Lee
y col., J. Endocrinol., 152, 39 (1997)). Un apoyo adicional de los
efectos antiproliferativos generales de las IGFBPs es el
sorprendente hallazgo de que IGFBP-3 es un gen diana
del supresor tumoral p53 (Buckbinder y col., Nature, 377:
646-649 (1995)). Esto sugiere que la actividad
supresora de p53 está mediada, en parte, por la producción de
IGFBP-3 y el bloqueo consiguiente de la acción del
IGF (Buckbinder y col., supra). Estos resultados indican que
las IGFBPs pueden bloquear la proliferación celular mediante la
modulación de procesos paracrinos/autocrinos regulados por
IGF-1/IGF-2. Un corolario para estas
observaciones es el hallazgo de que el antígeno específico de la
próstata (PSA) es una proteasa de IGFBP-3, la cual,
tras su activación, incrementa la sensibilidad de las células
tumorales a las acciones de
IGF-1/IGF-2 debido a la inactivación
proteolítica de la IGFBP-3 (Cohen y col., J.
Endocr., 142: 407-415 (1994)). Las IGFBPs forman
complejos con IGF-1/IGF-2 e
interfieren con el acceso de
IGF-1/IGF-2 a los
IGF-1Rs (Clemmons y col., Anal. NY Acad. Sci. USA,
692: 10-21 (1993)). IGFBP-1, -2 y -3
inhiben el crecimiento celular después de la adición a células in
vitro (Lee y col., J. Endocrinol., 152, 39 (1997); Feyen y
col., J. Biol. Chem., 266: 19469-19474 (1991)).
Además, se ha demostrado que IGFBP-1 (McGuire y
col., J. Natl. Cancer Inst., 84: 1335-1341 (1992);
Figueroa y col., J. Cell Physiol., 157: 229-236
(1993)), IGFBP-3 (Oh y col. (1995), supra;
Pratt y Pollak, Biophys. Res. Commun., 198: 292-297
(1994)) e IGFBP-2 inhiben todas ellas la
proliferación de células de cáncer de mama inducida por
IGF-1 o por estrógeno a concentraciones nanomolares
in vitro. Estos hallazgos apoyan la idea de que las IGFBPs
son potentes antagonistas de la acción de IGF. Hay evidencias
también de un efecto directo de la IGFBP-3 sobre
las células a través de su propio receptor en la superficie celular,
independiente de las interacciones con IGF (Oh y col., J. Biol.
Chem., 268: 14964-14971 (1993); Valentinis y col.,
Mol. Endocrinol., 9: 361-367 (1995)). Tomados en
conjunto, estos hallazgos subrayan la importancia de IGF e
IGF-1R como dianas para uso terapéutico.
Los IGFs tienen influencias mitogénicas y
antiapoptóticas sobre células epiteliales de próstata normales y
transformadas (Hsing y col., Cancer Research, 56: 5146 (1996); Culig
y col., Cancer Research, 54: 5474 (1994); Cohen y col., Hormone and
Metabolic Research, 26: 81 (1994); Iwamura y col., Prostate, 22: 243
(1993); Cohen y col., J. Clin. Endocrin. & Metabol., 73: 401
(1991); Rajah y col., J. Biol. Chem., 272: 12181 (1997)). La mayor
parte del IGF-1 circulante se origina en el hígado,
pero la bioactividad del IGF en los tejidos está relacionada no
sólo con los niveles de IGFs e IGFBPs circulantes, sino también con
la producción local de IGFs, IGFBPs y proteasas de IGFBP (Jones y
Clemmons, Endocrine Reviews, 16: 3 (1995)). La variabilidad persona
a persona de los niveles circulantes de IGF-1 e
IGFBP-3 (la principal IGFBP circulante (Jones y
Clemmons, supra)) es considerable (Juul y col., J. Clin.
Endocrinol. & Metabol., 78: 744 (1994); Juul y col., J. Clin.
Endocrinol. & Metabol., 80: 2534 (1995)), y la heterogeneidad de
los niveles séricos de IGF-1 parece reflejar la
heterogeneidad de la bioactividad del IGF tisular. Pueden utilizarse
marcadores relativos a los componentes del eje de IGF como marcador
de riesgo para el cáncer de próstata, igual que se utiliza de la
misma manera el PSA (WO 99/38011).
A diferencia de la mayoría de los demás factores
de crecimiento, los IGFs están presentes en la circulación a
elevadas concentraciones, pero únicamente una pequeña fracción de
los IGFs no está unida a proteínas. Por ejemplo, es conocido de
manera general que en humanos o en roedores, menos de un 1% de los
IGFs de la sangre está en forma "libre" o no unida (Juul y
col., Clin. Endocrinol., 44: 515-523 (1996); Hizuka
y col., Growth Regulation, 1: 51-55 (1991);
Hasegawa y col., J. Clin. Endocrinol. Metab., 80:
3284-3286 (1995)). Una abrumadora mayoría de los
IGFs de la sangre circula como parte de un complejo ternario
asociado no covalentemente compuesto por IGF-1 o
IGF-2, IGFBP-3 y una proteína grande
denominada la subunidad lábil al ácido (ALS). El complejo ternario
de un IGF, IGFBP-3 y ALS tiene un peso molecular de
150.000 daltons aproximadamente, y se ha sugerido que la función de
este complejo en la circulación puede ser el servir como reservorio
y tampón para IGF-1 e IGF-2,
impidiendo cambios rápidos del IGF-1 o
IGF-2 libre.
Se han realizado muchos trabajos para
identificar las regiones de IGF-1 e
IGF-2 que se unen a las IGFBPs (Bayne y col., J.
Biol. Chem., 265: 15648-15652 (1990); Dubaquie y
Lowman, Biochemistry, 38: 6386-6396 (1999) y las
Patentes de EE.UU. N^{os} 5.077.276; 5.164.370 y 5.470.828). Por
ejemplo, se ha descubierto que la región N-terminal
de IGF-1 e IGF-2 es crítica para
unirse a las IGFBPs (Patentes de EE.UU. N^{os} 5.077.276;
5.164.370 y 5.470.828). Así, la variante del IGF-1
natural, denominada
des(1-3)IGF-1, se une
poco a las IGFBPs.
Se ha dedicado una cantidad similar de
investigación a la identificación de las regiones de
IGF-1 e IGF-2 que se unen al
IGF-1R (Bayne y col., supra; Oh y col.,
Endocrinology (1993), supra). Se ha encontrado que los
residuos de tirosina en las posiciones 24, 31 y 60 del
IGF-1 son cruciales para la unión del
IGF-1 al IGF-1R (Bayne y col.,
supra). Moléculas mutantes de IGF-1 en las
que uno o más de estos residuos de tirosina están sustituidos,
mostraron una unión a IGF-1R progresivamente
reducida. Bayne y col., supra, investigaron también si tales
mutantes de IGF-1 podían unirse a
IGF-1R y a las IGFBPs. Encontraron que se utilizan
residuos de IGF-1 e IGF-2 para
unirse a las IGFBPs bastante diferentes de los utilizados para
unirse al IGF-1R. Es posible por tanto producir
variantes de IGF que presenten una unión reducida a las IGFBPs pero
que, debido a que se unen bien a IGF-1R, muestren
una actividad mantenida en ensayos de actividad in vitro.
Se describió también una variante de IGF que se
une a las IGFBPs pero no a los receptores de IGF y que muestra por
tanto una actividad reducida en ensayos de actividad in vitro
(Bar y col., Endocrinology, 127: 3243-3245 (1990)).
En esta variante, denominada
(1-27,gly^{4},38-70)-hIGF-1,
los residuos 28-37 de la región C del
IGF-1 humano están sustituidos por un puente de
glicina de cuatro residuos.
Se han descrito otras variantes truncadas del
IGF-1. Por ejemplo, en la literatura de patentes, WO
96/3326 describe una variante truncada que tiene los residuos
1-69 del IGF-1 auténtico. EP 742.228
describe superagonistas de IGF-1 de dos cadenas,
que son derivados del IGF-1 de una sola cadena
existente en la naturaleza, con una región C reducida. Los análogos
de IGF-1 tienen la fórmula: BC^{n},A, en la cual B
es la región B del IGF-1 o de un análogo funcional
del mismo, C es la región C del IGF-1 o de un
análogo funcional del mismo, n es el número de aminoácidos de la
región C y es de 6 aproximadamente a 12 aproximadamente, y A es la
región A del IGF-1 o de un análogo funcional del
mismo.
Adicionalmente, Cascieri y col., Biochemistry,
27: 3229-3233 (1988) describen cuatro mutantes del
IGF-1, tres de los cuales tienen afinidad reducida
por el IGF-1R. Estos mutantes son:
(Phe^{23},Phe^{24},Tyr^{25})IGF-1 (que
es equipotente al IGF-1 humano en su afinidad por
los receptores de IGF de Tipo 1 y 2 y por los receptores de
insulina), (Leu^{24})IGF-1 y
(Ser^{24})IGF-1 (que tienen una afinidad
menor que el IGF-1 por el IGF-1R de
placenta humana, por el receptor de insulina placentario y por el
IGF-1R de células de rata y ratón), y
desoctapéptido (Leu^{24})IGF-1 (en el cual
la pérdida de la aromaticidad en la posición 24 está combinada con
la eliminación de la región D carboxilo-terminal del
hIGF-1, que tiene menor afinidad que
(Leu^{24})IGF-1 por el
IGF-1R y mayor afinidad por el receptor de
insulina). Estos cuatro mutantes tienen afinidades normales por las
proteínas de unión séricas humanas.
Bayne y col., J. Biol. Chem., 263:
6233-6239 (1988) describen cuatro análogos
estructurales del IGF-1 humano: un mutante de la
cadena B en el que los primeros 16 aminoácidos del
IGF-1 fueron sustituidos por los 17 primeros
aminoácidos de la cadena B de la insulina,
(Gln^{3},Ala^{4})IGF-1,
(Tyr^{15},Leu^{16})IGF-1 y
(Gln^{3},Ala^{4},Tyr^{15},Leu^{16})IGF-1.
Estos estudios identifican algunas de las regiones del
IGF-1 que son responsables del mantenimiento de la
unión de alta afinidad con la proteína de unión sérica y el receptor
de IGF de Tipo 2.
En otro estudio, Bayne y col., J. Biol. Chem.,
264: 11004-11008 (1988) describen tres análogos
estructurales del IGF-1:
(1-62)IGF-1, que carece de la
región D de 8 aminoácidos carboxilo-terminal del
IGF-1;
(1-27,Gly^{4},38-70)IGF-1,
en el que los residuos 28-37 de la región C del
IGF-1 están sustituidos por un puente de glicina de
cuatro residuos; y
(1-27,Gly^{4},38-62)IGF-1,
con una sustitución de glicina en la región C y una deleción en la
región D. Peterkofsky y col., Endocrinology, 128:
1769-1779 (1991) describen datos utilizando el
mutante Gly^{4} de Bayne y col., supra (Vol. 264).
Cascieri y col., J. Biol. Chem., 264:
2199-2202 (1989) describen tres análogos de
IGF-1 en los cuales residuos específicos de la
región A del IGF-1 están sustituidos por los
residuos correspondientes de la cadena A de la insulina. Los
análogos son:
- (Ile^{41},Glu^{45},Gln^{46},Thr^{49},Ser^{50},Ile^{51},Ser^{53},Tyr^{55},Gln^{56})IGF-1, un mutante de la cadena A en el que el residuo 41 ha sido cambiado de treonina a isoleucina y los residuos 42-56 de la región A han sido sustituidos;
- (Thr^{49},Ser^{50},Ile^{51})IGF-1; y (Tyr^{55},Gln^{56})IGF-1.
\vskip1.000000\baselineskip
Clemmons y col., J. Biol. Chem., 265:
12210-12216 (1990) describen la utilización de
análogos de IGF-1 que tienen una afinidad de unión
reducida por IGF-1R o por las proteínas de unión,
para estudiar la especificidad de ligando de la
IGFBP-1 y la función de la IGFBP-1
en la modulación de la actividad biológica del
IGF-1.
WO 94/04569 describe una molécula de unión
específica, distinta de una IGFBP natural, que es capaz de unirse
al IGF-1 y que puede incrementar la actividad
biológica del IGF-1.
Se han descrito recientemente péptidos que se
unen a la IGFBP-1, bloquean la unión de
IGF-1 a esta proteína de unión y, de este modo,
liberan actividad "IGF libre" de mezclas de
IGF-1 e IGFBP-1 (Lowman y col.,
Biochemistry, 37: 8870-8878 (1998); WO 98/45427
publicada el 15 de Octubre de 1998; Lowman y col., International
Pediatric Nephrology Association, Fifth Symposium on Growth and
Development in Children with Chronic Renal Failure (New York, 13 de
Marzo de 1999)). Se describe también la molécula natural
des(1-3)IGF-1, que
muestra una afinidad reducida selectivamente por algunas de las
proteínas de unión del IGF, además de una afinidad mantenida por el
receptor de IGF (Patentes de EE.UU. N^{os} 5.077.276; 5.164.370;
5.470.828).
El aprovechamiento de la interacción entre IGF e
IGFBP en cribado, prevención o tratamiento de enfermedades ha
estado limitado, sin embargo, debido a una falta de antagonistas
específicos. Hasta la fecha, se conoce solamente la existencia de
una publicación que describe la aplicación de un antagonista de
IGF-1/IGF-2 como auxiliar
terapéutico potencial en el tratamiento del cáncer (Pietrzkowski y
col., Cancer Res., 52: 6447-6451 (1992)). En ese
informe, se sintetizó un péptido correspondiente a la región D del
IGF-1 para ser utilizado como antagonista de
IGF-1/2. Este péptido presentaba una actividad
inhibidora cuestionable frente a IGF-1. La base de
la inhibición observada no está clara, ya que la región D no
desempeña una función significativa en la unión al
IGF-1R sino más bien, en la unión del
IGF-1 al receptor de insulina (Cooke y col.,
Biochem., 30: 5484-5491 (1991); Bayne y col.,
supra (Vol. 264); Yee y col., Cell Growth and Different., 5:
73-77 (1994)).
WO 00/23469 describe las porciones de los
péptidos de IGFBP y de IGF que son responsables de la unión
IGF-IGFBP, esto es, un dominio de unión a IGF
aislado de una IGFBP o una modificación del mismo que se une a IGF
con al menos la misma afinidad de unión aproximadamente que la
IGFBP de longitud completa. La publicación de patente describe
también un antagonista de IGF que reduce la unión de IGF a un
receptor de IGF y/o se une a un dominio de unión de la IGFBP.
Adicionalmente, EP 639981 describe composiciones
farmacéuticas que contienen péptidos cortos que funcionan como
antagonistas del receptor de IGF-1. Los péptidos
utilizados en las composiciones farmacéuticas constan de menos de
25 aminoácidos, contienen al menos una porción de la región C o D de
IGF-1 e inhiben la autofosforilación de los
receptores de IGF-1 inducida por
IGF-1.
Los polipéptidos, incluyendo las moléculas de
IGF, tienen una estructura tridimensional determinada por la
secuencia de aminoácidos primaria y el entorno que circunda al
polipéptido. Esta estructura tridimensional establece la actividad,
la estabilidad, la afinidad de unión, la especificidad de unión y
otros atributos bioquímicos del polipéptido. Por tanto, el
conocimiento de la estructura tridimensional de una proteína puede
proporcionar mucha orientación para diseñar agentes que remeden,
inhiban o mejoren su actividad biológica en formas solubles o
unidas a la membrana.
La estructura tridimensional de un polipéptido
puede ser determinada de varias formas. Muchos de los métodos más
precisos emplean cristalografía de rayos X (Van Holde, Physical
Biochemistry (Prentice Hall: N.J., 1971), pp.
221-239). Esta técnica se basa en la capacidad de
las retículas cristalinas para producir la difracción de rayos X o
de otras formas de radiación. Los experimentos de difracción
adecuados para determinar la estructura tridimensional de
macromoléculas requieren típicamente cristales de alta calidad.
Desafortunadamente, no ha habido tales cristales disponibles para
IGF-1 ni tampoco para otras muchas proteínas de
interés. Se han descrito cristales, por ejemplo, para
M-CSF (EP 668.914B1), para el ligando de CD40 (WO
97/00895) y para un fragmento Fab de BC2 (WO 99/01476).
La cristalización de la insulina es un campo
intensamente investigado, con respecto al trabajo sobre análisis
estructural (Adams y col., Nature, 224: 491 (1969)) y a aplicaciones
farmacéuticas. Ejemplos de suspensiones de cristales de insulina
que se utilizan terapéuticamente incluyen suspensiones de cristales
de zinc-insulina romboédricos que son estables en
presencia de un 0,8-2,5% de zinc (sobre la base del
peso de la insulina) a un valor de pH neutro y que presentan una
acción retardada, y cristales de insulina protamina isofano, que
son utilizados en productos de acción retardada en forma de pequeñas
varillas. Se conocen además otras cuantas modificaciones de
cristales de insulina, pero éstas han sido de interés hasta ahora
solamente para el análisis de la estructura mediante rayos X. De
este modo, se han obtenido cristales ortorrómbicos y monoclínicos
sin zinc bajo condiciones de pH ácido (Einstein y Low, Acta
Crystallogr., 15: 32-34 (1962)). Se han obtenido en
el punto isoeléctrico dodecaedros rómbicos más pequeños, que han de
ser clasificados en el grupo espacial cúbico, también en ausencia
de zinc. Finalmente, se ha obtenido una forma de cristal monoclínico
de insulina por encima del punto isoeléctrico en presencia de zinc
y en presencia de fenol o de derivados de fenol. Estos cristales
crecen hasta un tamaño considerable (hasta 3 mm) en unos pocos días
y tienen aristas afiladas. Y lo que es más interesante, estos
cristales han sido encontrados únicamente sobre superficies vítreas
y no sobre la superficie libre de la solución. Suspensiones de
cristales y otras formas cristalinas de preparaciones de insulina y
de análogos de insulina están descritas, por ejemplo, en patentes
representativas tales como las Patentes de EE.UU. N^{os}
4.959.351; 5.840.680; 5.834.422; 6.127.334; 5,952.297; 5,650.486;
5.898.028; 5.898.067; 5.948.751; 5.747.642; 5.597.893; 5.547.930;
5,534.488; 5.504.188; 5.461.031 y 5.028.587.
Se conocen en la técnica varios métodos para
preparar proteínas y polipéptidos cristalinos (McPherson y col.,
"Preparation and Analysis of Protein Crystals", McPherson
(Robert E. Krieger, Publishing Company, Malabar, Fl, 1989); Weber,
Advances in Protein Chemistry, 41: 1-36 (1991);
Patentes de EE.UU. N^{os} 4.672.108 y 4.833.233). Aunque existen
múltiples métodos para cristalizar polipéptidos, ningún conjunto
individual de condiciones proporciona una esperanza razonable de
éxito, especialmente cuando los cristales deben ser adecuados para
estudios de difracción de rayos X. Se requiere un esfuerzo
significativo para obtener cristales de tamaño y resolución
suficientes para proporcionar una información precisa referente a la
estructura. Por ejemplo, una vez que se ha obtenido una proteína de
pureza suficiente, debe ser cristalizada con un tamaño y con una
claridad que sean útiles para difracción de rayos X y la resolución
posterior de la estructura. Además, aunque puede conocerse la
secuencia de aminoácidos de una proteína diana, esta información
sobre la secuencia no permite predecir de manera precisa la
estructura cristalina de la proteína. La información sobre la
secuencia tampoco permite conocer las interacciones estructurales,
conformacionales y químicas entre un ligando tal como IGFBP y su
proteína diana. Por tanto, aunque las estructuras cristalinas pueden
proporcionar gran cantidad de información valiosa en el campo del
diseño y descubrimiento de fármacos, cristales de ciertos compuestos
biológicamente relevantes tales como IGF-1 no están
fácilmente disponibles para los expertos en la técnica.
Cristales
de IGF-1 de alta calidad, que produzcan difracción, ayudarían a la determinación de su estructura tridimensional.
de IGF-1 de alta calidad, que produzcan difracción, ayudarían a la determinación de su estructura tridimensional.
La producción de antagonistas específicos de
IGF-1 ha estado limitada, al menos en parte, debido
a las dificultades para estudiar la estructura de IGF y de las
IGFBPs. Debido a la incapacidad para obtener cristales de
IGF-1 adecuados para estudios de difracción, por
ejemplo, una extrapolación de la estructura del
IGF-1 basada en la estructura cristalina de la
insulina porcina era el mapa de carreteras estructural más
importante disponible para el IGF-1 (Blundell y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 180-184
(1978)). Ver también Blundell y col., Fed. Proc., 42:
2592-2597 (1983), que describe estructuras
terciarias, unión a receptores y la antigenicidad de IGFs. Sobre la
base de estudios de IGF-1 modificado químicamente y
mutado, se han identificado varios residuos comunes entre el
IGF-1 y la insulina como parte del sitio de contacto
de IGF-1R-receptor de insulina, en
particular, los residuos aromáticos en las posiciones
23-25.
Utilizando RMN y dinámica molecular restringida,
se ha descrito recientemente la estructura en solución del
IGF-1 (Cooke y col., supra). Se demostró que
la estructura minimizada resultante se ajustaba mejor a los
hallazgos experimentales sobre el IGF-1 modificado,
así como a las extrapolaciones realizadas a partir de los estudios
de estructura-actividad de la insulina. Además, De
Wolf y col., Protein Sci., 5: 2193-2202 (1996)
describen la estructura en solución de un
mini-IGF-1. Sato y col., Int. J.
Pept. Protein Res., 41: 433-440 (1993) describen la
estructura tridimensional de IGF-1 determinada
mediante 1H-RMN y geometría de distancias. Laajoki
y col., J. Biol. Chem., 275: 10009-10015 (2000)
describen la estructura en solución y la dinámica del esqueleto de
largo-[Arg(3)]IGF-1. Ver también Laajoki y
col., FEBS Lett., 420: 97-102 (1997). El pequeño
número de modelos de RMN disponibles para IGF-1 no
están muy bien definidos, ya que existen grandes RMSDs entre los
átomos del esqueleto de los segmentos helicoidales. El mejor modelo
de RMN es el del IGF-2 en el que se muestran tres
hélices alfa. Ver Torres y col., J. Mol. Biol., 248:
385-401 (1995), que describe la estructura en
solución del IGF-2 humano y su relación con las
interacciones con el receptor y las proteínas de unión. En todas
las estructuras, las regiones C y D están muy poco definidas.
Además de proporcionar información estructural,
los polipéptidos cristalinos proporcionan otras ventajas. Por
ejemplo, el propio proceso de cristalización purifica además el
polipéptido y satisface uno de los criterios clásicos de la
homogeneidad. De hecho, la cristalización proporciona frecuentemente
una calidad de purificación incomparable, eliminando impurezas que
no son eliminadas por otros métodos de purificación tales como HPLC,
diálisis, cromatografía en columna convencional, etc. Además, los
polipéptidos cristalinos son a menudo estables a temperatura
ambiente y están libres de contaminación con proteasas y otras
degradaciones asociadas con el almacenamiento en solución. Los
polipéptidos cristalinos pueden ser también útiles como
preparaciones farmacéuticas. Finalmente, las técnicas de
cristalización carecen generalmente en su mayoría de problemas tales
como la desnaturalización asociada con otros métodos de
estabilización (por ejemplo, liofilización). Por tanto, existe una
necesidad significativa de la preparación de composiciones de
IGF-1 en forma cristalina y de la determinación de
su estructura tridimensional. La presente invención satisface esta
y otras necesidades. Una vez que se ha llevado a cabo la
cristalización, los datos cristalográficos proporcionan una
información estructural útil que puede ayudar al diseño de péptidos
que pueden servir como agonistas o antagonistas. Además, al
estructura cristalina proporciona información útil para la creación
de mapas del dominio de unión al receptor, el cual podría ser
posteriormente remedado por una molécula no peptídica pequeña que
puede servir como antagonista o agonista. Además, los hallazgos
relacionados con la inhibición por detergentes de la unión de IGFBP
a IGF-1 pueden ser utilizados para identificar
nuevos agonistas del IGF-1.
Por consiguiente, la invención es según está
reivindicada. IGF-1 ha sido cristalizado y se ha
determinado su estructura utilizando difracción anómala de
múltiples longitudes de onda (MAD) a una resolución de 1,8
angstroms, aprovechando la dispersión anómala de un solo ión bromuro
y de seis de los siete átomos de azufre del IGF-1.
La región C del IGF-1, que está ordenada en la
estructura cristalina, forma un giro beta de tipo II y media una
interacción de empaquetado del cristal a través de un radical
divalente cristalográfico. El estado en solución del
IGF-1 fue caracterizado mediante ultracentrifugación
analítica, y los resultados indican que el IGF-1
existe principalmente como un monómero a pH neutro, con sólo una
ligera tendencia a dimerizarse a concentraciones milimolares. Una
molécula de detergente,
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
(desoxi CHAPS grande), media un contacto de empaquetado del cristal
entre moléculas de simetría relacionada. Experimentos en solución
confirman que el complejo
IGF-1:N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
se forma en solución, y que la unión del detergente bloquea de
forma medible la unión de IGFBP.
Por consiguiente, se describe un cristal formado
por IGF-1 que produce difracción de la radiación de
rayos X para producir un patrón de difracción que representa la
estructura tridimensional del IGF-1.
Preferiblemente, este cristal tiene aproximadamente las constantes
celulares siguientes: a = 31,831 \ring{A}, b =
71,055 \ring{A}, c = 65,995 \ring{A} y un grupo espacial
de C222. También preferiblemente, el IGF-1 contiene
una región A, B, C y D y forma un dímero en el cristal, y es
preferido adicionalmente el cristal que contiene un sitio de unión
al receptor en la interfase dimérica.
Además, se describe una composición que contiene
el cristal anterior. Preferiblemente, en esta composición el
IGF-1 es biológicamente activo cuando es
resolubilizado. Se describe además un método para el tratamiento de
un mamífero que padezca un trastorno de agonistas, preferiblemente
un paciente humano, comprendiendo dicho método la administración a
dicho mamífero de una cantidad eficaz de la composición
resolubilizada anterior. Se describe también un método para
cristalizar IGF-1 que comprende las etapas de:
- (a)
- la mezcla de una solución acuosa que contiene IGF-1 con una solución reservorio que contiene un precipitante para formar un volumen mixto; y
- (b)
- la cristalización del volumen mixto. Se describe también IGF-1 cristalino producido mediante el método anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente, se describe un método para
determinar una estructura tridimensional del IGF-1
que comprende:
- (a)
- la cristalización del IGF-1;
- (b)
- la irradiación del IGF-1 cristalino para obtener un patrón de difracción característico del IGF-1 cristalino y
- (c)
- la transformación del patrón de difracción en la estructura tridimensional del IGF-1.
\vskip1.000000\baselineskip
Además, se describe un medio de almacenamiento
de datos legible por un aparato que comprende un material de
almacenamiento de datos codificado con datos legibles por un aparato
que, cuando es leído por un aparato apropiado, muestra una
representación tridimensional de un cristal de una molécula que
comprende IGF-1.
En aspectos adicionales, se describe un cristal
de IGF-1 con las coordenadas estructurales mostrada
en el Apéndice 1.
Adicionalmente, la invención proporciona un
método de utilización de una estructura tridimensional de
IGF-1 derivada de un cristal de
IGF-1, donde la estructura tridimensional de
IGF-1 incluye una región de unión al receptor de
IGF-1, comprendiendo el método la identificación de
compuestos que tienen estructuras que interaccionan con la región
de unión al receptor de la estructura tridimensional de
IGF-1 y funcionan como agonistas o antagonistas de
IGF-1. Preferiblemente, en tal método la estructura
tridimensional de IGF-1 incluye coordenadas de
carbonos alfa que son sustancialmente las mismas que las de la
información estructural presentada en el Apéndice 1.
En otro aspecto, se describe un método para
identificar agonistas o antagonistas del IGF-1 que
comprende las etapas de
- (a)
- la cristalización de IGF-1 para formar cristales de IGF-1, conteniendo los cristales de IGF-1 un grupo de residuos de aminoácidos que definen una región de unión al receptor de IGF-1;
- (b)
- la irradiación de los cristales de IGF-1 de la etapa (a) para obtener un patrón de difracción de los cristales de IGF-1;
- (c)
- la determinación de una estructura tridimensional de IGF-1 a partir del patrón de difracción, incluyendo la estructura una región de unión al receptor de IGF-1; y
- (d)
- la identificación de un agonista o antagonista de IGF-1 con una estructura tridimensional que duplique funcionalmente residuos accesibles a un solvente, esenciales para la unión al receptor de IGF, que presenten la estructura tridimensional de la región de unión al receptor de IGF-1, teniendo dicho agonista o antagonista de IGF-1 una capacidad alterada de transmisión de señales para las células sensibles a IGF-1, en comparación con IGF-1.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferiblemente, en este método los residuos
accesibles al solvente no participan en la formación de la interfase
de IGF-1.
De acuerdo con ciertos aspectos adicionales, se
describe un método para diseñar un compuesto, tal como un
peptidomimético, que remede la estructura superficial tridimensional
del IGF-1 que comprende las etapas de
- (a)
- la determinación de la estructura tridimensional del IGF-1 y
- (b)
- el diseño de un compuesto que remede la estructura superficial tridimensional del IGF-1.
\vskip1.000000\baselineskip
Además, se describe un método para identificar
un peptidomimético que se una a IGF-1 y bloquee la
unión de una IGFBP o de un receptor que se una a
IGF-1, que comprende las etapas de:
- (a)
- la búsqueda en una base de datos de estructuras moleculares con los parámetros estructurales o las coordenadas estructurales que se proporcionan en el Apéndice 1; y
- (b)
- la selección de una molécula de la base de datos que remede los parámetros estructurales o las coordenadas estructurales del IGF-1.
\newpage
Se describe también un método para determinar al
menos una porción de la estructura tridimensional de un complejo
molecular, conteniendo dicho complejo IGF-1, y
comprendiendo dicho método las etapas de:
- (a)
- la determinación de las coordenadas estructurales de un cristal de IGF-1;
- (b)
- el cálculo de fases a partir de las coordenadas estructurales;
- (c)
- el cálculo de un mapa de densidad electrónica a partir de las fases obtenidas en la etapa (b); y
- (d)
- la determinación de la estructura de al menos una porción del complejo sobre la base de dicho mapa de densidad electrónica.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferiblemente, las coordenadas estructurales
utilizadas en la etapa (a) son sustancialmente las mismas que las
descritas en el Apéndice 1 o describen sustancialmente el mismo
cristal que las coordenadas del Apéndice 1.
Se describe también un método para evaluar la
capacidad de una entidad química para asociarse con
IGF-1 o con un complejo del mismo, comprendiendo el
método las etapas de:
- (a)
- la utilización de un medio computacional o experimental para llevar a cabo una operación de ajuste entre la entidad química y el IGF-1 o el complejo del mismo, obteniendo de este modo datos relacionados con la asociación; y
- (b)
- el análisis de los datos obtenidos en la etapa (a) para determinar las características de la asociación entre la entidad química y el IGF-1 o el complejo del mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se describe también una entidad química
identificada mediante el método anterior que interfiere con la
asociación in vivo o in vitro entre el
IGF-1 y su receptor o entre el IGF-1
y al menos una de sus proteínas de unión, o que se asocia con un
sitio de unión en el IGF-1.
Se describe también un derivado con un átomo
pesado de una forma cristalizada del IGF-1.
Además, se describe un método para evaluar
computacionalmente o experimentalmente una entidad química con el
fin de obtener información sobre su asociación con uno o más sitios
de unión del IGF-1, utilizando un cristal de
IGF-1 que tiene las coordenadas estructurales
descritas en el Apéndice 1.
Cualquier análogo peptídico y otras entidades
químicas identificadas utilizando los métodos anteriores son útiles
en los métodos terapéuticos descritos en la presente y como
composiciones farmacéuticas.
La invención proporciona un método para
identificar agonistas indirectos del IGF-1, que
comprende las etapas de:
- (a)
- la comparación de la capacidad de la N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina para inhibir la unión de IGFBP-1 o IGFBP-3 a IGF-1 con la capacidad de un agonista indirecto del IGF-1 candidato para inhibir así la unión; y
- (b)
- la determinación de si el agonista candidato inhibe tal unión al menos tan bien como lo hace la N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, la comparación se
lleva a cabo mediante un ensayo de competición entre la
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
y el agonista candidato. En una realización más preferida, la
inhibición de la unión es medida preincubando
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
o el agonista candidato con IGF-1 expresado en
partículas de bacteriófago y midiendo la unión residual de
IGF-1 a IGFBP-1 o
IGFBP-3 en un ensayo de ELISA en placas.
Además, se describe un método para identificar
agonistas indirectos del IGF-1 que comprende la
cocristalización de un agonista indirecto del IGF-1
candidato con IGF-1 para formar una estructura
cocristalina y la determinación de si el agonista candidato se une
a uno o a los dos parches en IGF-1, donde un parche
tiene los residuos de aminoácidos Glu 3, Thr 4, Leu 5, Asp 12, Ala
13, Phe 16, Val 17, Cys 47, Ser 51, Cys 52, Asp 53, Leu 54 y Leu
57, y el segundo parche tiene los residuos de aminoácidos Val 11,
Gln 15, Phe 23, Phe 25, Asn 26, Val 44, Phe 49 y Arg 55, y donde la
unión tiene lugar si hay al menos un contacto entre cada uno de los
residuos de aminoácidos enumerados de un parche dado y el agonista
candidato que sea menor o igual a 6 angstroms en la estructura
cocristalina. En las realizaciones preferidas, el agonista candidato
inhibe la unión de IGFBP-1 o -3 al
IGF-1 al menos igual de bien que la
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina.
Más preferido es el método en el que se mide la inhibición de la
unión utilizando un ensayo de competición entre la
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
y el agonista candidato. El más preferido es el método en el que se
mide la inhibición de la unión mediante la preincubación de
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
o del agonista candidato con IGF-1 expresado en
partículas de bacteriófago y la medida de la unión residual de
IGF-1 a IGFBP-1 o
IGFBP-3 en un ensayo de ELISA en placa.
Se proporciona también en la presente un método
para tratar un trastorno de agonistas de IGF-1 en un
mamífero, que comprende la administración al mamífero de una
cantidad eficaz de
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina.
Se proporciona además en la presente un complejo
cocristalino de IGF-1 y
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina.
La Figura 1 alinea las secuencias de
IGF-1 (SEC ID Nº:1), IGF-2 (SEC ID
Nº:2) e insulina (SEC ID Nº:3). Las cadenas A, B y C de la insulina
(y las secuencias de IGF-1 e IGF-2
correspondientes a las mismas) están mostradas, respectivamente, en
texto en negrita, subrayado y en cursiva. Los tres residuos
aromáticos están mostrados por contorneado del texto. Se ha
demostrado que los residuos marcados con una (!) son importantes
para la unión al receptor de IGF-1. Se ha
demostrado que los residuos marcados con un "*" son importantes
para la unión a IGFBP-1 e IGFBP-3.
Los residuos carboxiterminales que contienen la región D de
IGF-1 e IGF-2 están representados
en letra normal.
La Figura 2 es un diagrama de cintas del
IGF-1 que muestra el plegamiento del esqueleto. En
la representación gráfica de Ramachandran, el 97,7% es el más
favorecido y el 2,3% es permitido.
La Figura 3 es un diagrama de cintas del
IGF-1 (estructura de la izquierda) y de la insulina
(estructura de la derecha).
La Figura 4 es un diagrama de cintas del
IGF-1 que muestra que el detergente utilizado en la
solución reservorio,
(N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina),
se une en una pequeña hendidura hidrofílica en la base de la hélice
B. El detergente está representado por estructuras de color gris más
claro que las estructuras del IGF-1.
La Figura 5 es un diagrama de cintas del
IGF-1 como un dímero, estando mostrado el detergente
en color gris más claro.
La Figura 6 es un diagrama de cintas del
IGF-1 como un dímero, que muestra que los residuos
importantes para la unión al receptor (indicados por estructuras de
anillo en la porción central de la figura) se agrupan en la
interfase dimérica. El detergente está mostrado en gris más claro en
las porciones externas de la figura.
Las Figuras 7A y 7B son diagramas de cintas del
IGF-1 que demuestran, igual que la Fig. 4, que el
detergente utilizado en la solución reservorio
(N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina),
mostrado en forma de bastón, se une en una pequeña hendidura
hidrofílica en la base de la hélice B. En la Fig. 7A el grupo cabeza
del detergente está insertado en la hendidura tapizada por los
residuos Leu 5, Phe 16, Val 17, Leu 54 y Leu 57. Las diferentes
tonalidades de gris están de acuerdo con los resultados de
mutagénesis mediante el barrido de alanina de Dubaquie y Lowman,
supra, indicando las regiones de Phe 16, Val 17 y Leu 5 una
reducción de 5-10 veces, la región de Glu 3 una
reducción de 10-100 veces y las regiones de Pro 63 y
Pro 63' una reducción >100 veces de la afinidad por
IGFBP-1. La parte negra en el extremo derecho
corresponde a la molécula de IGF-1 de simetría
relacionada que forma el dímero cristalográfico. El círculo próximo
a Leu 54 indica el átomo C10 del detergente, que difiere de otro
detergente (sulfonato de
3-((3-colamidopropil)dimetilamonio)-1-propano;
o CHAPS) en que tiene un grupo hidroxilo en esta posición. La Fig.
7B muestra la vista desde la superficie opuesta del detergente y
representa las interacciones de la molécula de detergente con una
molécula de IGF-1 de simetría relacionada. Igual
que en la Fig. 7A, los diferentes tonos de gris están de acuerdo con
los resultados de la mutagénesis mediante barrido de alanina de
Dubaquie y Lowman, supra, indicando el grupo próximo a Gln
15 una reducción de 5-10 veces, las moléculas de
gris medio del extremo izquierdo, las moléculas de la región de Leu
10, y la región de gris medio del extremo derecho indicando una
reducción de 10-100 veces y las regiones negras en
Phe 49 y Gly 7 indicando una reducción >100 veces de la afinidad
por IGFBP-1. Las regiones negras a la derecha de la
molécula de detergente corresponden a la molécula de
IGF-1 de simetría relacionada que forma el dímero
cristalográfico. El círculo próximo a Gln 15 indica el átomo C10 del
detergente,
según se indicó anteriormente para la Fig. 7A. Esta figura fue preparada utilizando INSIGHT (MSI, San Diego, CA).
según se indicó anteriormente para la Fig. 7A. Esta figura fue preparada utilizando INSIGHT (MSI, San Diego, CA).
La Figura 8 muestra una gráfica resultante de un
estudio de unión de competición detergente/IGFBP. En este
experimento se utilizó
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
como inhibidor competitivo de la unión de IGF-1 a
IGFBP-1 inmovilizada (cuadrados rellenos) o a
IGFBP-3 (círculos sin rellenar). Como control
positivo se utilizó IGFBP-1 soluble como inhibidor
competitivo de la unión de IGF-1 a
IGFBP-1 inmovilizada (triángulos rellenos). Cada
punto de datos representa la media de dos experimentos
independientes.
La Figura 9A muestra un análisis de mínimos
cuadrados no lineal de los datos del equilibrio de sedimentación
para IGF-1 en solución. Los datos recogidos a
velocidades de rotor de 30.000 rpm (triángulos sin rellenar) y
35.000 rpm (cuadrados sin rellenar) fueron ajustados como un modelo
de autoasociación monómero-dímero ideal. Las líneas
continuas son los ajustes de los datos. La Figura 9B muestra los
valores residuales representados gráficamente para ambas
velocidades del rotor después de justificar los datos mediante el
procedimiento de ajuste. Están distribuidos aleatoriamente
alrededor de cero, indicando que el modelo de
monómero-dímero es correcto para esta
interacción.
La Figura 10A muestra un diagrama de cintas
determinado mediante RMN de un complejo de IGF-1 y
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina,
y la Figura 10B muestra un diagrama de cintas determinado mediante
RMN de un complejo de IGF-1 unido a un péptido
antagonista de IGF-1 derivado de un fago, denominado
IGF-F1-1.
Según se utiliza en la presente,
"IGF-1" se refiere al factor de crecimiento
similar a insulina de tipo 1 humano, a no ser que se indique de
otro modo, y tiene la secuencia del IGF-1 maduro
nativo humano sin una metionina N-terminal según
está descrito, por ejemplo, por EP 230.869 publicada el 5 de Agosto
de 1987; EP 128.733 publicada el 19 de Diciembre de 1984 o por EP
288.451 publicada el 26 de Octubre de 1988.
Una "IGFBP" o una "proteína de unión a
IGF" se refiere a una proteína o a un polipéptido asociado
normalmente con, o unido a, o formando un complejo con,
IGF-1, sea o no circulatoria (esto es, esté en el
suero o en un tejido). Esta definición incluye
IGFBP-1, IGFBP-2,
IGFBP-3, IGFBP-4,
IGFBP-5, IGFBP-6, Mac
25(IGFBP-7) y el factor estimulante de
prostaciclina (PSF) o la molécula específica de células endoteliales
(ESM-1), así como otras proteínas que tienen una
elevada homología con IGFBPs. Mac 25 está descrita en, por ejemplo,
Swisshelm y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:
4472-4476 (1995) y Oh y col., J. Biol. Chem., 271:
30322-30325 (1996). PSF está descrito en Yamauchi y
col., Biochemical Journal, 303: 591-598 (1994).
ESM-1 está descrita en Lassalle y col., J. Biol.
Chem., 271: 20458-20464 (1996). Para otras IGFBPs
identificadas, ver, por ejemplo, EP 375.438 publicada el 27 de
Junio de 1990; EP 369.943 publicada el 23 de Mayo de 1990; la
Patente de EE.UU. Nº 5.258.287; WO 89/09268 publicada el 5 de
Octubre de 1989; Wood y col., Molecular Endocrinology, 2:
1176-1185 (1988); Brinkman y col., The EMBO J., 7:
2417-1423 (1988); Lee y col., Mol. Endocrinol., 2:
404-411 (1988); Brewer y col., BBRC, 152:
1289-1297 (1988); EP 294.021 publicada el 7 de
Diciembre de 1988; Baxter y col., BBRC, 147:
408-415 (1987); Leung y col., Nature, 330:
537-543 (1987); Martin y col., J. Biol. Chem., 261:
8754-8760 (1986); Baxter y col., Comp. Biochem.
Physiol., 91B: 229-235 (1988); WO 89/08667 publicada
el 21 de Septiembre de 1989; WO 89/09792 publicada el 19 de Octubre
de 1989 y Binkert y col., EMBO J., 8: 2497-2502
(1989). IGFBP-1 e IGFBP-3 se unen a
residuos diferentes
del IGF-1.
del IGF-1.
Según se utiliza en la presente, "receptor del
IGF-1 humano" o únicamente "receptor del
IGF-1", se refiere a cualquier receptor de
IGF-1 encontrado en humanos e incluye los receptores
de IGF de Tipo 1 y de Tipo 2 en humanos a los que se une el
IGF-1 humano, tales como el IGF-1R
placentario, etc.
Un "agonista indirecto del
IGF-1" es una molécula que libera
IGF-1 in situ de IGFBP-3 o
IGFBP-1, de tal manera que el IGF-1
liberado es activo e interacciona con su receptor.
Los "péptidos" son moléculas que tienen al
menos dos aminoácidos e incluyen polipéptidos con al menos 60
aminoácidos aproximadamente. Preferiblemente, los péptidos tienen
de 10 aproximadamente a 60 aminoácidos aproximadamente, más
preferiblemente 10-25 aproximadamente y muy
preferiblemente 12-25 aminoácidos aproximadamente.
La definición incluye péptidos lineales y cíclicos, derivados
peptídicos, sus sales o isómeros ópticos.
Según se utiliza en la presente, un
"mamífero" para fines de tratamiento se refiere a cualquier
animal clasificado como mamífero incluyendo humanos, animales
domésticos y de granja, animales de zoo, para deportes o mascotas
tales como perros, caballos, gatos, ovejas, cerdos, vacas, etc. El
mamífero preferido en la presente es un humano. El término "no
adulto" se refiere a mamíferos que están en edad perinatal (tales
como bebés de bajo peso en el nacimiento) hasta la edad de la
pubertad, siendo estos últimos aquéllos que no han alcanzado todavía
el potencial de crecimiento completo.
Según se utiliza en la presente, el término
"tratamiento" se refiere a un tratamiento terapéutico y a
medidas profilácticas o preventivas. Aquéllos con necesidad de
tratamiento incluyen a aquéllos que tienen ya la enfermedad así
como a los que son susceptibles de tener la enfermedad o de ser
diagnosticados de la enfermedad, o a aquéllos en los que ha de
prevenirse la enfermedad.
Un "trastorno" es cualquier condición que
se beneficiaría del tratamiento con un agonista del
IGF-1 ("trastorno de agonista") o con un
antagonista del IGF-1 ("trastorno de
antagonista"). Este término incluye trastornos o enfermedades
crónicas y agudas, incluyendo aquéllas condiciones patológicas que
predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. El trastorno a
tratar puede ser cualquier combinación de dos o más de los
trastornos de agonista o antagonista enumerados posteriormente.
Ejemplos no limitantes de trastornos de
antagonista incluyen tumores benignos y malignos, leucemias y
enfermedades malignas linfoides, trastornos neuronales, gliales,
astrocíticos, hipotalámicos y otros trastornos glandulares,
macrofágicos, epiteliales, estromales y blastocélicos, y trastornos
inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos, complicaciones
diabéticas tales como retinopatías o neuropatías diabéticas,
degeneración macular relacionada con la edad, cirugía oftálmica tal
como la extracción de cataratas, un transplante de córnea, cirugía
de filtración y queratoplastia del glaucoma, cirugía para corregir
la refracción, esto es queratotomía radial, también en agujeros
maculares y degeneración de la esclerótica, lágrimas retinales,
vitreorretinopatía, trastornos varios, trastornos de cataratas de
la córnea tales como las secuelas de la queratotomía radial, ojo
seco, conjuntivitis vírica, conjuntivitis ulcerosa, heridas tales
como heridas epiteliales de la córnea, síndrome de Sjogren,
trastornos de la retina tales como edema macular y retinal,
cicatrización con visión limitada, isquemia retinal y retinopatía
vítrea proliferativa.
Más preferiblemente, tales trastornos de
antagonista incluyen complicaciones diabéticas exacerbadas por
IGF-1, lesiones isquémicas y enfermedades asociadas
con una proliferación celular indeseable tales como cáncer,
restenosis y asma. Si el trastorno es una complicación diabética
exacerbada por IGF-1, tal complicación puede incluir
retinopatía diabética o nefropatía diabética. La eficacia del
tratamiento puede ser evidenciada por una reducción de las
manifestaciones o síntomas clínicos incluyendo, por ejemplo, un
aclaramiento renal mejorado, una visión mejorada o una reducción de
la cantidad de IGF-1 disponible para unirse a un
receptor de IGF-1. Si el trastorno es una lesión
isquémica, puede incluir derrame cerebral, isquemia miocárdica y
lesión isquémica de los riñones.
Ejemplos de trastornos de agonista para los
fines de la presente incluyen cualquier condición que se
beneficiaría del tratamiento con un IGF-1
incluyendo, pero sin limitarse a, por ejemplo, enfermedades
pulmonares, trastornos hiperglucémicos como los expuestos
posteriormente, trastornos renales tales como insuficiencia renal
aguda y crónica, fallo renal crónico terminal, glomerulonefritis,
nefritis intersticial, pielonefritis, glomeruloesclerosis, por
ejemplo Kimmelstiel-Wilson en pacientes diabéticos e
insuficiencia renal después de un transplante de riñón, obesidad,
insuficiencia de GH, síndrome de Turner, síndrome de Laron, baja
estatura, síntomas indeseables asociados con el envejecimiento
tales como obesidad y proporciones incrementadas de masa grasa
respecto a masa magra, trastornos inmunológicos tales como
inmunodeficiencias, incluyendo recuentos disminuidos de CD4 e
inmunotolerancia disminuida, o daño tisular inducido por
quimioterapia, transplante de médula ósea, enfermedades o
insuficiencias de la estructura o función cardíaca tales como
disfunciones cardíacas e insuficiencia cardíaca congestiva,
trastornos neuronales, neurológicos o neuromusculares, por ejemplo
neuropatía periférica, esclerosis múltiple, distrofia muscular o
distrofia miotónica y estados catabólicos asociados con el desgaste
causado por cualquier condición, incluyendo por ejemplo trauma o
heridas, o infección tal como mediante una bacteria o un virus
humano tal como VIH, heridas, trastornos de la piel, estructuras y
funciones del intestino que necesitan restauración, etcétera. Los
trastornos de agonista preferidos que son un objetivo para el
tratamiento de la presente son la diabetes y la obesidad,
disfunciones cardíacas, el desgaste relacionado con el SIDA,
trastornos renales, trastornos neurológicos, trastornos del
crecimiento de todo el organismo y trastornos inmunológicos.
Según se utiliza en la presente, el término
"trastornos hiperglucémicos" se refiere a todas las formas de
diabetes y trastornos resultantes de la resistencia a insulina,
tales como las diabetes de Tipo I y de Tipo II, así como a la
resistencia a insulina grave, la hiperinsulinemia y la
hiperlipidemia, por ejemplo sujetos obesos, y a las diabetes
resistentes a la insulina tales como el Síndrome de Mendenhall, el
Síndrome de Wemer, el leprechaunismo, la diabetes lipoatrófica y
otras lipoatrofias. El trastorno hiperglucémico preferido es la
diabetes, especialmente la diabetes de Tipo I y de Tipo II. El
término "diabetes" se refiere en sí mismo a una enfermedad
progresiva del metabolismo de los carbohidratos que implica una
producción o una utilización inadecuadas de la insulina y que se
caracteriza por hiperglucemia y glucosuria.
IGF-1 "biológicamente
activo" se refiere a IGF-1 que presenta una
propiedad biológica asociada convencionalmente con un agonista o un
antagonista del IGF-1, tal como una propiedad que
permitiría el tratamiento de una o más de las enfermedades
enumeradas anteriormente.
El término "cantidad eficaz" se refiere a
una cantidad de IGF-1 o de un peptidomimético o de
otro compuesto, incluyendo entidades químicas, que es eficaz para
tratar una enfermedad o un trastorno en un mamífero. En el caso del
cáncer, por ejemplo, la cantidad eficaz del péptido puede reducir el
número de células cancerosas; puede reducir el tamaño del tumor;
inhibir (esto es, enlentecer hasta cierto punto y preferiblemente
detener) la infiltración de células cancerosas en los órganos
periféricos; inhibir (esto es, enlentecer hasta al menos cierto
grado y preferiblemente detener) las metástasis tumorales; inhibir,
hasta cierto grado, el crecimiento tumoral; estimular la apoptosis
y/o aliviar hasta cierto grado uno o más de los síntomas asociados
con la enfermedad.
Un "precipitante" es un agente de una
solución reservorio que precipita IGF-1 cuando se
mezcla con una solución acuosa de IGF-1 y se deja
equilibrar para formar cristales de IGF-1. Ejemplos
incluyen agentes caotrópicos tales como sulfato de amonio,
polietilén glicoles (de una amplia variedad de pesos moleculares que
varían desde, por ejemplo, 2000 a 20.000 aproximadamente), citrato
de sodio, cacodilato de sodio o una mezcla de los mismos.
Una "solución reservorio" es una solución
de un precipitante y cualquier otro ingrediente necesario para
proporcionar cristales de IGF-1, por ejemplo un
detergente tal como C_{12}E_{9} (monododecil éter de nonaetilén
glicol, monolauril éter de nonaetilén glicol, éter de
polioxietileno (9)), C_{12}E_{8} (monododecil éter de octaetilén
glicol, monolauril éter de octaetilén glicol, lauril éter de
polioxietileno (8)), dodecil
beta-D-maltopiranósido, éster de
sacarosa del ácido laúrico,
ciclohexil-pentil-beta-D-maltósido,
octilfenol éter de nonaetilén glicol, bromuro de
cetiltrimetilamonio,
decil-beta-D-maltopiranósido,
óxido de laurildimetilamina,
ciclohexil-pentil-beta-D-maltósido,
n-dodecilsulfobetaína,
3-(dodecildimetilamonio)propano-1-sulfonato,
nonil-beta-D-glucopiranósido,
octil-beta-D-tioglucopiranósido,
OSG, beta-óxido de N,N-dimetildecilamina,
metil-6-O-(N-heptilcarbamoil)-alfa-D-glicopiranósido,
monocaproilato de sacarosa,
heptil-beta-D-tioglucopiranósido,
octil-beta-D-glucopiranósido,
ciclohexil-propil-beta-D-maltósido,
ciclohexilbutanoil-N-hidroxietilglucamida,
n-decilsulfobetaína,
3-(decildimetilamonio)propano-1-sulfonato,
octanoil-N-metilglucamida,
hexil-beta-D-glucopiranósido
y
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina.
Preferiblemente, el detergente es
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina.
"Recristalización" se refiere al
procedimiento, una vez que los cristales iniciales han crecido y se
ha determinado que no son muy grandes o que son útiles, de adición
de una sustancia a los cristales, tal como metil pentanodiol, que
tiene el efecto de disolver los cristales pero no de diluir mucho
nada más en la mezcla de cristalización. Posteriormente, a lo largo
del transcurso de varios días, a medida que la gotita de
cristalización se reequilibra con su solución reservorio, los
cristales vuelven a crecer, pero esta vez mucho más grandes y mucho
mejor ordenados.
El término "en asociación con" se refiere a
una condición de proximidad entre IGF-1 y una
entidad química, o porciones de la misma. La asociación puede ser
no covalente, en la cual la yuxtaposición está favorecida
energéticamente por la formación de enlaces de hidrógeno, la
interacción de van der Waals o la interacción electrostática, o
bien puede ser una asociación covalente.
El término "sitio de unión" se refiere a
cualquiera o a todos los sitios en los que una entidad química se
une o asocia a IGF-1.
El término "coordenadas estructurales" se
refiere a las coordenadas derivadas de ecuaciones matemáticas
relacionadas con los patrones obtenidos en la difracción de un haz
monocromático de rayos X por los átomos (centros de dispersión) de
una molécula en forma cristalina. Los datos de difracción pueden ser
utilizados para calcular un mapa de densidad electrónica de las
unidades de repetición del cristal. Los expertos en la técnica
comprenderán que los datos obtenidos dependen del sistema
particular utilizado y, por tanto, coordenadas diferentes pueden de
hecho describir el mismo cristal si tales coordenadas definen
sustancialmente la misma relación que la descrita en la presente.
Un mapa de densidad electrónica puede ser utilizado para establecer
las posiciones de los átomos individuales en la celda unidad del
cristal.
Los expertos en la técnica comprenden que un
conjunto de coordenadas estructurales determinadas mediante
cristalografía de rayos X no se presenta sin error estándar. El
Apéndice 1 muestra las coordenadas atómicas del
IGF-1. Para los fines de esta invención, cualquier
conjunto de coordenadas estructurales de IGF-1 que
tenga una raíz de la desviación cuadrática media de átomos del
esqueleto de proteínas equivalentes menor de 2 \ring{A}
aproximadamente cuando se superponen - -utilizando los
átomos del esqueleto - - sobre las coordenadas
estructurales del Apéndice 1, serán consideradas idénticas.
Preferiblemente, la desviación es menor de 1 \ring{A}
aproximadamente y más preferiblemente menor de 0,5 \ring{A}
aproximadamente.
El término "derivatización de átomos
pesados" se refiere a un método para producir una forma
modificada químicamente de un IGF-1 cristalizado.
En la práctica, un cristal es impregnado con una solución que
contiene sales de átomos de metales pesados, o compuestos
organometálicos, por ejemplo cloruro de plomo, tiomalato de oro,
timerosal o acetato de uranilo, que pueden difundir a través del
cristal y unirse a la superficie de la proteína. La posición
del(los) átomo(s) de metal(es) pesado(s)
unido(s) puede ser determinada mediante análisis de
difracción de rayos X del cristal impregnado. Esta información
puede ser utilizada para generar la información de fases utilizada
para construir la estructura tridimensional de la molécula.
El término "celda unidad" se refiere a un
bloque modelado básico. El volumen completo de un cristal puede ser
construido mediante el ensamblaje regular de tales bloques. Cada
celda unidad comprende una representación completa de la unidad del
patrón, cuya repetición constituye el cristal.
El término "grupo espacial" se refiere a la
disposición de los elementos de simetría de un cristal.
El término "sustitución molecular" se
refiere a un método que implica la creación de un modelo estructural
preliminar de un cristal cuyas coordenadas estructurales se
desconocen, mediante la orientación y la colocación de una molécula
cuyas coordenadas estructurales son conocidas, por ejemplo las
coordenadas de IGF-1 del Apéndice 1, dentro de la
celda unidad del cristal desconocido, con el fin de explicar lo
mejor posible el patrón de difracción observado del cristal
desconocido. Las fases pueden ser posteriormente calculadas a partir
de este modelo y combinadas con las amplitudes observadas para dar
una síntesis de Fourier aproximada de la estructura cuyas
coordenadas se desconocen. Ésta a su vez puede ser sometida a
cualquiera de las varias formas de refinamiento para proporcionar
una estructura final precisa del cristal desconocido. (Ver, por
ejemplo, Lattman, E., "Use of the Rotation and Translation
Functions", Methods in Enzymology, 115: 55-77
(1985); Rossman, ed., "The Molecular Replacement Method", Int.
Sci. Rev. Ser. Nº 13 (Gordon y Breach: New York, 1972)). Utilizando
las coordenadas estructurales del IGF-1
proporcionadas por esta invención, puede utilizarse sustitución
molecular para determinar las coordenadas estructurales de un
co-complejo cristalino, de un ligando desconocido,
de un mutante o un homólogo, o de una forma cristalina diferente
del IGF-1. Adicionalmente, el cristal reivindicado y
sus coordenadas pueden ser utilizados para determinar las
coordenadas estructurales de una entidad química que se asocie con
el IGF-1.
El término "entidad química" o
"compuesto", según se utiliza en la presente, significa
cualquier molécula, complejo molecular, compuesto, peptidomimético
o fragmento de los mismos, que no sea IGF-1.
Preferiblemente, es una molécula con una elevada biodisponibilidad
oral, tal como una molécula química orgánica o un péptido.
La siguiente descripción detallada de la
invención incluye la estructura cristalina de IGF-1,
métodos para producir un cristal de IGF-1 y métodos
para utilizar un cristal de IGF-1 y sus coordenadas
estructurales.
La descripción describe cristales de
IGF-1 así como la estructura del
IGF-1 determinada a partir de los mismos.
Específicamente, se describen cristales de IGF-1 que
tienen aproximadamente las dimensiones siguientes: a =
31,831 \ring{A}, b = 71,055 \ring{A}, c = 65,995
\ring{A}, \alpha=\beta=\gamma= 90,000º. Tiene una simetría,
o grupo espacial, de C222_{1}. La estructura de cintas del mismo
está mostrada en la Figura 2 y tiene tres hélices, correspondiendo
la región B N-terminal a los residuos
3-28, la región C a los residuos
29-34, un tramo de residuos mal ordenados desde el
residuo 35 al 40, y la región A de los residuos
42-62. La región D (residuos 63-70)
está esencialmente desordenada. Las Figuras 4 y 7 muestran que el
detergente utilizado en la cristalización se une en una pequeña
hendidura hidrofóbica en la base de la hélice B de la estructura.
El IGF-1 puede formar un dímero en el cristal, según
se muestra en la Fig. 5, en el cual las dos colas están situadas en
la interfase del dímero. El área de la superficie enmascarada es de
689 \ring{A}^{2}/monómero, que es de 1378 \ring{A}^{2} en
total. Los residuos importantes para la unión al
IGF-1R se agrupan en la interfase dimérica, según
se muestra en la Figura 6.
Las características del cristal de
IGF-1 reivindicado se describen adicionalmente en el
Ejemplo de la presente y las coordenadas estructurales del mismo
están proporcionadas en el Apéndice 1.
La invención describe métodos para preparar
formas cristalinas de IGF-1 proporcionando
primeramente una solución acuosa que contiene
IGF-1. Una solución reservorio conteniendo un
precipitante es mezclada posteriormente con un volumen de la
solución de IGF-1 y el volumen mixto resultante es
posteriormente cristalizado. En una etapa preferida, los cristales
son disueltos y recristalizados de nuevo. Un ejemplo de un reactivo
que puede ser utilizado para la recristalización es metil
pentanodiol, que es el preferido. Los cristales son típicamente
disueltos con este reactivo en una pequeña cantidad para minimizar
los efectos de la dilución de los demás reactivos y se deja que
vuelvan a crecer durante un periodo de tiempo. En una etapa
opcional, el IGF-1 cristalino es aislado del
volumen mixto. Preferiblemente, el IGF-1 es obtenido
de una célula procariótica, más preferiblemente de una célula
bacteriana, muy preferiblemente de E. coli. Preferiblemente,
es secretado al periplasma y preparado según está descrito en la
Patente de EE.UU. Nº 5.723.310.
La concentración de IGF-1 en la
solución acuosa puede variar, pero es preferiblemente de 1 a 50
mg/ml aproximadamente, más preferiblemente de 5 a 15 mg/ml
aproximadamente. De manera similar, los precipitantes utilizados en
la invención pueden variar, y pueden ser seleccionados de entre
cualquier precipitante conocido en la técnica. Preferiblemente, el
precipitante es seleccionado del grupo que consta de citrato de
sodio, sulfato de amonio, polietilén glicol, cacodilato de sodio, o
una mezcla de los mismos. Más preferiblemente, el precipitante es
polietilén glicol tamponado con citrato de sodio o cacodilato de
sodio. Puede utilizarse cualquier concentración de precipitante en
la solución reservorio; sin embargo, se prefiere que la
concentración sea del 20 al 25% aproximadamente si es polietilén
glicol y de 1 a 10 M si es citrato de sodio, sulfato de amonio o
cacodilato de sodio. Preferiblemente, la solución reservorio
contiene además un detergente. Preferiblemente, el detergente está
presente en una cantidad de 10 a 50 mM aproximadamente. También
preferiblemente el detergente es
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina.
El pH de la solución re-
servorio puede también variar, preferiblemente entre 4 y 10 aproximadamente, muy preferiblemente alrededor de 6,5.
servorio puede también variar, preferiblemente entre 4 y 10 aproximadamente, muy preferiblemente alrededor de 6,5.
Una persona con experiencia en la técnica
comprenderá que cada uno de estos parámetros puede ser variado sin
una experimentación excesiva y se seguirán obteniendo cristales
aceptables. En la práctica, una vez que se han determinado los
agentes precipitantes apropiados, los tampones apropiados u otras
variables experimentales para cualquier método de crecimiento dado,
puede utilizarse cualquiera de estos métodos o cualquier otro método
para crecer los cristales reivindicados. Una persona experta en la
técnica puede determinar las variables dependiendo de las
necesidades particulares de cada uno.
Pueden utilizarse varios métodos de
cristalización, incluyendo cristalización por difusión de vapor,
cristalización discontinua, cristalización por puente líquido o
cristalización por diálisis. Se prefiere la cristalización por
difusión de vapor. Ver, por ejemplo, McPherson y col., Preparation
and Analysis of Protein Crystals, Glick, ed. (John Wiley & Co.,
1982), pp.82-159; Jancarik y col., J. Appl.
Crystallogr., 24: 409-411 (1991).
En la cristalización por difusión de vapor, un
pequeño volumen (esto es, unos pocos mililitros) de la solución de
proteína es mezclado con una solución que contiene un precipitante.
Este volumen mixto es suspendido sobre un pocillo que contiene una
pequeña cantidad, esto es 1 ml aproximadamente, de precipitante. La
difusión de vapor desde la gota hacia el pocillo tendrá como
resultado la formación de un cristal en la gota.
El método de cristalización mediante diálisis
utiliza una membrana de exclusión por tamaño semipermeable que
retiene la proteína pero permite que moléculas pequeñas (esto es,
tampones y precipitantes) difundan hacia dentro y hacia fuera. En
la diálisis, más que concentrar la proteína y el precipitante por
evaporación, se permite al precipitante difundir lentamente a
través de la membrana y reducir la solubilidad de la proteína
mientras que se mantiene la concentración de proteína fija.
Los métodos discontinuos implican generalmente
la adición lenta de un precipitante a una solución acuosa de
proteína hasta que la solución se enturbia; en este punto el
recipiente puede ser cerrado y se deja sin tocar durante un periodo
de tiempo hasta que tiene lugar la cristalización.
Por tanto, los solicitantes tienen la intención
de que estén incluidos cualquiera de, y todos, los métodos de
cristalización. Una persona experta en la técnica puede elegir
cualquiera de tales métodos y variar los parámetros de tal manera
que el método elegido tenga como resultado los cristales
deseados.
El método de cristalización más preferido
implica el método en el cual el IGF-1, después de su
aislamiento de la célula y la formulación en, por ejemplo, tampón
acetato, citrato o succinato, según está descrito en, por ejemplo,
la Patente de EE.UU. Nº 5.681.814 y WO 99/51272, es opcionalmente
desalado si es necesario a un pH de 4-5
aproximadamente, preferiblemente de 4,5 aproximadamente, para formar
una solución acuosa. Posteriormente, una gotita de la solución
acuosa es mezcla con polietilén glicol al 24% aproximadamente
tamponado a pH 6,5 aproximadamente con citrato de sodio 0,1 M
aproximadamente o con cacodilato de sodio 0,1 M aproximadamente y
con 1 \mul aproximadamente de
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
1,4 mM aproximadamente como detergente. Esta solución es
equilibrada posteriormente mediante cristalización por difusión de
vapor con 1 ml aproximadamente de polietilén glicol al 24%
aproximadamente tamponado a pH 6,5 aproximadamente con citrato de
sodio 0,1 M aproximadamente o con cacodilato de sodio 0,1 M
aproximadamente hasta que se forman las gotitas de cristalización,
normalmente de 4 a 5 días aproximadamente. Posteriormente, se añaden
a las gotitas de cristalización 2 \mul aproximadamente de metil
pentanodiol al 100% aproximadamente para disolver los cristales
durante una noche y formar de este modo nuevos cristales,
normalmente en una semana.
La estructura cristalina fue determinada
mediante dispersión anómala combinada de un ión azufre intrínseco y
de un ión bromuro fortuito según se discute con detalle en el
Ejemplo posterior.
El IGF-1 cristalino de la
presente puede ser utilizado para varios fines. Por ejemplo, el
propio proceso de cristalización purifica adicionalmente el
IGF-1 hasta la homogeneidad. Por tanto, uno de tales
fines es proporcionar un IGF-1 altamente purificado
que puede ser utilizado como estándar o control en un ensayo de
diagnóstico, por ejemplo como marcador de peso molecular, o como
control en un ensayo de ELISA, en un radioensayo o en un ensayo de
radiorreceptores. Además, el IGF-1 cristalino es
estable a temperatura ambiente, puede ser liofilizado fácilmente y
es menos apto para degradarse que composiciones menos puras.
En otra utilización de la presente, cristales de
IGF-1 de un tamaño y calidad que permitan la
realización de estudios de difracción de rayos X permiten a los
expertos en la técnica llevar a cabo estudios relacionados con las
propiedades de unión del IGF-1, así como con las
propiedades de unión de las IGFBPs, los receptores de
IGF-1 y las ALS que se asocian con el
IGF-1.
Además, la información estructural derivada de
la estructura cristalina de un péptido puede ser utilizada para la
identificación de entidades químicas, por ejemplo de pequeñas
moléculas orgánicas y bioorgánicas tales como peptidomiméticos y
moléculas orgánicas sintéticas que se unen a IGF-1 y
preferiblemente bloquean o impiden un proceso o acontecimiento
mediado por, o asociado con IGF-1, o que actúan como
agonistas del IGF-1. Un abordaje ejemplar de tal
diseño de compuestos basado en la estructura está descrito en
Structure Based Drug Design, Pandi Veerapandian, ed. (Marcell
Dekker: New York 1997).
A manera de ejemplo, habiendo determinado la
estructura tridimensional del IGF-1, el técnico
experto construye un modelo del IGF-1 tal como los
representados en las Figuras 2 y 5. Como cada átomo de un péptido o
polipéptido puede ser representado como una esfera con el radio de
van der Waals apropiado, puede construirse un mapa detallado de la
superficie del IGF-1 plegado. La superficie que
resulta es conocida como superficie de van der Waals. La
"superficie accesible al solvente" es la superficie que es
accesible a una sonda química, una molécula de agua en la presente,
y es construida haciendo rodar una molécula de agua del radio
apropiado sobre la parte externa del péptido manteniendo contacto
con la superficie de van der Waals. Aquellas partes de la
superficie de van der Waals que contactan con la superficie de la
molécula de agua definen una superficie continua conocida como
"superficie accesible al solvente". (Creighton, Thomas E.,
Proteins: structure and molecular properties, 2ª ed. (W.H. Freeman
and Company, 1984), pp. 227-229).
Tales entidades químicas que presentan una
superficie accesible al solvente que remeda la superficie accesible
al solvente del IGF-1 pueden ser construidas por los
expertos en la técnica. A manera de ejemplo, el técnico experto
puede buscar en bases de datos de estructuras tridimensionales de
compuestos para identificar aquellos compuestos que dispongan
grupos funcionales apropiados en un orden estructural tridimensional
similar, construir posteriormente bibliotecas de química
combinatoria alrededor de tales entidades químicas para identificar
aquéllas que tengan una alta afinidad.
Un procedimiento facilitado por esta invención
es la utilización de las coordenadas estructurales del
IGF-1 para diseñar entidades químicas que se unan
a, o se asocien con, IGF-1 y alteren las propiedades
físicas de las entidades químicas de diferentes formas. Por tanto,
propiedades tales como, por ejemplo, solubilidad, afinidad,
especificidad, potencia, tasas de todo o nada u otras
características de la unión, pueden ser todas ellas alteradas y/o
maximizadas.
Pueden diseñarse entidades químicas deseadas
sondando un cristal de IGF-1 con una biblioteca de
entidades diferentes con el fin de determinar los sitios óptimos
para la interacción entre entidades químicas candidato e
IGF-1. Por ejemplo, los datos de difracción de rayos
X de alta resolución recogidos a partir de cristales saturados con
solvente permiten la determinación del lugar en el que se adhiere
cada tipo de molécula de solvente. Moléculas pequeñas que se unen
estrechamente a esos sitios pueden ser posteriormente diseñadas y
sintetizadas y analizadas para determinar la actividad deseada. Una
vez que se ha obtenido la actividad deseada, las moléculas pueden
ser alteradas adicionalmente para maximizar las propiedades
deseables.
Se contempla también el cribado computacional de
bases de datos de moléculas pequeñas o el diseño de entidades
químicas que se unan totalmente o en parte al IGF-1.
Pueden ser también utilizadas para resolver la estructura
cristalina de mutantes, co-complejos o la forma
cristalina de cualquier molécula homóloga a, o capaz de asociarse
con, al menos una porción del IGF-1.
Un método que puede ser empleado para este fin
es la sustitución molecular. Una estructura cristalina desconocida,
que puede ser cualquier estructura desconocida tal como, por
ejemplo, otra forma cristalina del IGF-1, un
mutante o péptido del IGF-1 o un
co-complejo con IGF-1, o cualquier
otro cristal desconocido de una entidad química que se asocie con
IGF-1 que sea de interés, puede ser determinada
utilizando las coordenadas estructurales presentadas en el Apéndice
1. Los co-complejos con IGF-1 pueden
incluir, pero no se limitan a,
IGF-1-IGFBP-3,
IGF-1-IGFBP-3-ALS,
IGF-1-receptor,
IGF-1-péptido o
IGF-1-molécula pequeña. Este método
proporcionará una forma estructural precisa del cristal desconocido
mucho más rápidamente y eficazmente que si se intenta determinar
tal información sin la descripción de la presente.
La información obtenida puede ser por tanto
utilizada para obtener inhibidores o agonistas del
IGF-1 máximamente eficaces. El diseño de entidades
químicas que inhiban o sean agonistas del IGF-1
implica generalmente la consideración de al menos dos factores. En
primer lugar, la entidad química debe ser capaz de asociarse
físicamente o estructuralmente con el IGF-1. La
asociación puede ser cualquier asociación física, estructural o
química tal como, por ejemplo, la formación de enlaces covalentes o
no covalentes o interacciones de van der Walls, hidrofóbicas o
electrostáticas.
En segundo lugar, la entidad química debe ser
capaz de asumir una conformación que permita a la misma asociarse
con el IGF-1. Aunque no todas las porciones de la
entidad química participarán necesariamente en la asociación con
IGF-1, las porciones no participantes pueden sin
embargo influir sobre la conformación global de la molécula. Esto a
su vez puede tener un impacto significativo sobre la deseabilidad de
la entidad química. Tales requisitos conformacionales incluyen la
estructura tridimensional global y la orientación de la entidad
química en relación con todo o con una porción del sitio de
unión.
El efecto inhibidor o de unión potencial de una
entidad química sobre IGF-1 puede ser analizado
antes de su síntesis y análisis real mediante la utilización de
técnicas de modelado mediante ordenador. Si la estructura teórica
de una entidad química dada sugiere una interacción y una asociación
insuficientes entre la misma y el IGF-1, se obvia
la necesidad de sintetizar y analizar la entidad química. Sin
embargo, si el modelado por ordenador indica una potente
interacción, la molécula puede ser entonces sintetizada y analizada
para determinar su capacidad para unirse al IGF-1.
De este modo, puede evitarse la síntesis cara y larga de compuestos
que no sean operativos.
Un compuesto inhibidor u otro compuesto que se
una al IGF-1 puede ser evaluado y diseñado
computacionalmente por medio de una serie de etapas en las cuales
las entidades químicas o fragmentos son cribados y seleccionados
por su capacidad para asociarse con los sitios de unión individuales
del IGF-1.
Por tanto, una persona experta en la técnica
puede utilizar uno de varios métodos para someter a cribado
entidades químicas o fragmentos por su capacidad para asociarse con
IGF-1. Este proceso puede comenzar por la inspección
visual de, por ejemplo, el sitio de unión en una pantalla de
ordenador sobre la base de las coordenadas del
IGF-1 presentadas en el Apéndice 1. Los fragmentos o
las entidades químicas seleccionados pueden ser luego colocados en
una variedad de orientaciones, o "acoplados", en un bolsillo de
unión individual del IGF-1. El acoplamiento puede
ser realizado utilizando un programa de ordenador tal como Quanta y
Sybyl, seguido por minimización de la energía y dinámica molecular
con campos de fuerza estándar de mecánica molecular tales como
CHARMM y AMBER.
Programas de ordenador especializados pueden ser
de utilidad para seleccionar fragmentos o entidades químicas
interesantes. Estos programas incluyen, por ejemplo, GRID,
disponible en la Oxford University, Oxford, R.U.; MCSS o CATALYST,
disponibles en Molecular Simulations, Burlington, MA; AUTODOCK,
disponible en Scripps Research Institute, La Jolla, CA; DOCK,
disponible en la University of California, San Francisco, CA y
XSITE, disponible en la University College of London, R.U.
Una vez que se han seleccionado entidades
químicas o fragmentos adecuados, pueden ser ensamblados para dar
lugar a un inhibidor o a un agonista. El ensamblaje puede ser
mediante inspección visual de la relación de los fragmentos entre
sí sobre la imagen tridimensional mostrada en una pantalla de
ordenador, en relación con las coordenadas estructurales descritas
en la presente.
Alternativamente, pueden diseñarse las entidades
químicas deseadas de novo, experimentalmente, utilizando un
sitio de unión vacío u opcionalmente incluyendo una porción de una
molécula con la actividad deseada. Así, por ejemplo, pueden
utilizarse técnicas de selección en fase sólida en las que
IGF-1 o un fragmento del mismo, o entidades
químicas candidato para ser evaluadas, son fijados a una fase
sólida, identificando de este modo potenciales agentes que se unen
para un estudio posterior.
Básicamente, puede emplearse cualquier técnica
de modelado molecular de acuerdo con la invención; estas técnicas
son conocidas o están fácilmente disponibles para los expertos en la
técnica. Se comprenderá que los métodos y composiciones descritos
en la presente pueden ser utilizados para identificar, diseñar o
caracterizar no sólo entidades que se asocien o se unan a
IGF-1, sino también, alternativamente, para
identificar, diseñar o caracterizar entidades que, igual que el
IGF-1, se unirán al receptor, alterando de este modo
la interacción IGF-1-receptor. La
descripción tiene la intención de incluir estos métodos y
composiciones en general.
Una vez que un compuesto ha sido diseñado o
seleccionado mediante los métodos anteriores, la eficacia con la
cual ese compuesto puede unirse al IGF-1 puede ser
analizada y modificada para obtener la(s)
característica(s) deseada(s) máxima(s)
utilizando evaluación computacional o experimental. Varios
parámetros pueden ser maximizados dependiendo del resultado
deseado. Éstos incluyen, pero no se limitan a, especificidad,
afinidad, tasas de todo o nada, hidrofobicidad, solubilidad y otras
características fácilmente identificables por el técnico
experto.
Adicionalmente, la invención es útil para la
producción de fármacos de molécula pequeña candidatos. De este
modo, las estructuras cristalinas reivindicadas pueden ser
utilizadas también para obtener información sobre las estructuras
cristalinas de complejos del IGF-1 e inhibidores de
molécula pequeña. Por ejemplo, si el inhibidor de molécula pequeña
es cocristalizado con IGF-1, la estructura
cristalina del complejo puede ser posteriormente resuelta mediante
sustitución molecular utilizando las coordenadas conocidas del
IGF-1 para el cálculo de fases. Tal información es
útil, por ejemplo, para determinar la naturaleza de la interacción
entre el IGF-1 y el inhibidor de molécula pequeña,
y por tanto puede sugerir modificaciones que mejorarían las
características de unión tales como la afinidad, la especificidad y
la cinética.
La invención de la presente es también útil para
proporcionar un método de identificación de agonistas indirectos
del IGF-1 basado en las propiedades inhibidoras de
la
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
con respecto a las IGFBPs. Este método comprende las etapas de:
comparación de la capacidad de la
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
para inhibir la unión de IGFBP-1 o -3 al
IGF-1 con la capacidad de un agonista indirecto del
IGF-1 candidato para inhibir tal unión; y la
determinación de si el agonista indirecto del IGF-1
candidato puede inhibir tal unión al menos igual de bien que la
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
puede inhibir la unión.
Preferiblemente, la comparación se lleva a cabo
mediante un ensayo de competición entre la
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
y el agonista indirecto del IGF-1 candidato,
utilizando la CI_{50} con el fin de medir la capacidad para
inhibir la unión de IGFBP. En una realización más preferida, la
inhibición de la unión es medida preincubando
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
o la molécula del agonista candidato con IGF-1
expresado en partículas de bacteriófago y midiendo la unión
residual de IGF-1 a IGFBP-1 o a
IGFBP-3 en un ensayo en placas tal como un
ELISA.
Además, se describe un método para identificar
agonistas indirectos del IGF-1 que comprende la
cocristalización del agonista candidato con IGF-1
para formar una estructura cocristalina y la determinación de si la
molécula del agonista candidato se une a uno o a los dos parches
sobre el IGF-1. El primer parche contiene los
residuos de aminoácidos Glu 3, Thr 4, Leu 5, Asp 12, Ala 13, Phe
16, Val 17, Cys 47, Ser 51, Cys 52, Asp 53, Leu 54 y Leu 57, y el
segundo parche contiene los residuos de aminoácidos Val 11, Gln 15,
Phe 23, Phe 25, Asn 26, Val 44, Phe 49 y Arg 55. Para los fines de
la presente, unión significa que existe al menos un contacto entre
cada uno de los residuos de aminoácidos enumerados de un parche dado
y la molécula del agonista candidato que es menor o igual que 6
angstroms en la estructura cocristalina. Tal molécula de agonista
candidato tendrá la propiedad de inhibir la unión de
IGFBP-1 o IGFBP-3 al
IGF-1. La molécula de tal agonista candidato
preferida inhibirá la unión de IGFBP-1 o -3 al
IGF-1 al menos igual de bien que la
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina.
Es más preferido el método en el que la inhibición de la unión es
medida utilizando un ensayo de competición entre la
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
y la molécula del agonista candidato. El método más preferido de
todos es aquél en el que la inhibición de la unión es medida
preincubando la
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
o la molécula del agonista candidato con IGF-1
expresado en partículas de bacteriófago y midiendo la unión
residual del IGF-1 a IGFBP-1 o a
IGFBP-3 en un ensayo de ELISA en placas.
El detergente
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
de la presente puede ser utilizado como molde para realizar el
diseño de fármacos de molécula pequeña que produzcan el mismo efecto
que el detergente (que compitan con el IGF-1 por la
unión a IGFBP y alteren posteriormente la interacción de la IGFBP
con IGF-1 para liberar IGF-1 in
situ, de tal manera que sea activo e interaccione con el
receptor. Al contrario que los demás detergentes ensayados en los
Ejemplos posteriores, la
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
carece de un átomo de oxígeno en la posición C10. Esta región del
detergente está en estrecho contacto con los átomos de la cadena
lateral de los residuos Leu 5, Leu 54 y Leu 57 del
IGF-1. Moléculas con este mismo tipo de
conformación funcionarían como agonistas indirectos del
IGF-1.
El agonista indirecto así identificado puede ser
utilizado en un método para tratar un trastorno de agonista en el
que una cantidad eficaz del agonista indirecto del
IGF-1 es administrada a un mamífero con tal
trastorno. Por tanto, tal agonista puede ser utilizado
terapéuticamente en una preparación farmacéutica, por ejemplo en
ensayos clínicos, o comercializado para los trastornos de agonista
definidos en la presente. De este modo, la formulación del agonista
indirecto de la presente puede ser utilizada para tratar cualquier
condición que se beneficiaría del tratamiento con
IGF-1 incluyendo, por ejemplo, diabetes, trastornos
renales crónicos y agudos tales como la insuficiencia renal
crónica, necrosis, etc., obesidad, hiperinsulinemia, insuficiencia
de GH, síndrome de Turner, estatura baja, los síntomas indeseables
asociados con el envejecimiento tales como el incremento de la
proporción masa magra respecto a grasa, inmunodeficiencias
incluyendo el recuento incrementado de CD4 y la tolerancia inmune
incrementada, estados catabólicos asociados con el desgaste, etc.,
el enanismo de Laron, la resistencia a insulina, etcétera.
Para uso terapéutico, la composición del
agonista indirecto de la presente puede ser administrada
directamente al mamífero mediante cualquier técnica adecuada
incluyendo oralmente, parenteralmente, intranasalmente o
intrapulmonarmente, y puede ser administrada localmente o
sistémicamente. La vía de administración específica dependerá de,
por ejemplo, la historia médica del paciente, incluyendo cualquier
efecto colateral o reducido percibido o anticipado utilizando
IGF-1, y del trastorno a tratar. Ejemplos de
administración parenteral incluyen la administración subcutánea,
intramuscular, intravenosa, intraarterial e intraperitoneal. Muy
preferiblemente, la administración es por infusión continua
(utilizando, por ejemplo, minibombas tales como bombas osmóticas), o
mediante inyección (utilizando, por ejemplo, medios intravenosos o
subcutáneos). La administración puede ser también como un único
bolus o mediante una formulación de depósito de liberación lenta.
Muy preferiblemente, el agonista directo es administrado oralmente
o mediante infusión o inyección a una frecuencia de,
preferiblemente, la mitad, una vez, dos veces o tres veces al día,
muy preferiblemente diariamente.
La composición del agonista para ser utilizada
en terapia será formulada y dosificada de una forma consistente con
la buena práctica médica, teniendo en consideración la condición
clínica del paciente individual (especialmente los efectos
colaterales del tratamiento con el agonista), el lugar de
administración de la composición del agonista, el método de
administración, la pauta de administración y otros factores
conocidos por los médicos clínicos. La "cantidad eficaz" del
agonista para los fines de la presente es por tanto determinada
mediante tales consideraciones y debe ser una cantidad que trate el
trastorno en cuestión.
Como una propuesta general, la cantidad total
farmacéuticamente eficaz del agonista administrada parenteralmente
por dosis estará en el rango de 1 \mug/kg/día aproximadamente
hasta 100 mg/kg/día aproximadamente, preferiblemente de 10
\mug/kg/día hasta 10 mg/kg/día aproximadamente. Si es administrado
continuamente, el agonista es administrado generalmente en dosis de
1 \mug/kg/hora aproximadamente hasta 100 \mug/kg/hora
aproximadamente, ya sea mediante 1-4 inyecciones
por día aproximadamente o mediante infusiones subcutáneas continuas
utilizando, por ejemplo, una minibomba o una bomba de infusión
portátil. Puede emplearse también una solución en una bolsa
intravenosa. El factor clave en la selección de una dosis apropiada
es el resultado obtenido medido mediante criterios que son
considerados apropiados por el médico asistente. Si el agonista es
administrado junto con insulina, esta última es utilizada en
menores cantidades que si fuera utilizada sola, reduciéndola hasta
cantidades que por sí mismas tienen poco efecto sobre la glucosa
sanguínea, esto es en cantidades de entre 0,1 UI/kg/24 horas
aproximadamente y 0,5 UI/kg/24 horas aproximadamente.
Para la administración parenteral, en una
realización, el agonista es formulado generalmente mezclando el
mismo con el grado de pureza deseado en una forma inyectable de
dosificación unidad (solución, suspensión o emulsión), con un
vehículo farmacéuticamente aceptable, esto es uno que no sea tóxico
para los receptores a las dosificaciones y concentraciones
empleadas y que sea compatible con otros ingredientes de la
formulación. Por ejemplo, la formulación preferiblemente no incluye
agentes oxidantes y otros compuestos que se sabe que son nocivos
para los polipéptidos.
Generalmente, la formulación es preparada
poniendo en contacto el agonista uniformemente e íntimamente con un
vehículo líquido o con un vehículo sólido finamente dividido o con
ambos. Preferiblemente, el vehículo es un vehículo parenteral, más
preferiblemente una solución que sea isotónica con la sangre del
receptor. Ejemplos de tales vehículos transportadores incluyen
agua, solución salina, solución de Ringer y solución de dextrosa.
Vehículos no acuosos tales como aceites fijados y oleato de etilo
son también útiles en la presente, al igual que los liposomas.
El vehículo contiene idóneamente pequeñas
cantidades de aditivos tales como sustancias que incrementan la
isotonicidad y la estabilidad química. Tales materiales no son
tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas
e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, succinato, ácido
acético y otros ácidos orgánicos o sus sales; antioxidantes tales
como ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de
diez residuos aproximadamente), por ejemplo poliarginina o
tripéptidos; proteínas tales como seroalbúmina, gelatina o
inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como
polivinilpirrolidona; glicina; aminoácidos tales como ácido
glutámico, ácido aspártico o arginina; monosacáridos, disacáridos y
otros carbohidratos incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa,
manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de
azúcares tales como manitol o sorbitol; contraiones tales como
sodio; surfactantes no iónicos tales como polisorbatos, poloxámeros
o PEG; y/o sales neutras, por ejemplo, NaCl, KCl, MgCl_{2},
CaCl_{2}, etc.
El agonista es típicamente formulado
individualmente en tales vehículos a una concentración de 0,1 mg/ml
a 100 mg/ml aproximadamente, preferiblemente de 1 a 10 mg/ml, a un
pH de 4,5 a 8 aproximadamente. La formulación final, si es un
líquido, es almacenada preferiblemente a una temperatura de
2-8ºC aproximadamente hasta cuatro semanas
aproximadamente. Alternativamente, la formulación puede ser
liofilizada y suministrada como un polvo para ser reconstituido con
agua para inyección que es almacenada según se describió para la
formulación líquida.
El agonista que va ser utilizado para
administración terapéutica debe ser estéril. La esterilidad es
fácilmente conseguida mediante filtración a través de membranas de
filtración estériles (por ejemplo, membranas de 0,2 micras). Las
composiciones del agonista terapéutico son colocadas generalmente en
un recipiente que tiene una entrada de acceso estéril, por ejemplo
en una bolsa o vial de solución intravenosa que tiene un tapón
perforable por una aguja de inyección hipodérmica.
El agonista será normalmente almacenado en
recipientes de dosis unidad o multidosis, por ejemplo en ampollas o
viales cerrados herméticamente, como una solución acuosa o como una
formulación liofilizada para ser reconstituida.
La invención se comprenderá mucho mejor mediante
referencia a los ejemplos siguientes. Los mismos no deben ser
considerados, sin embargo, como limitantes del ámbito de la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo IGF-1 humano
recombinante (rhIGF-1) según está descrito en los
Ejemplos de la Patente de EE.UU. Nº 5.723.310, utilizando una
combinación de polímero/sal para la especie formadora de fases y se
formuló según está descrito en los Ejemplos de la Patente de EE.UU.
Nº 5.681.814 (acetato, NaCl, polisorbato 20 y alcohol bencílico) y
se colocó en un vial conteniendo 7 ml de 10 mg/ml de
rhIGF-1. Fue desalado en NaCl 0,15 M, NaOAc 20 mM,
pH 4,5, y diluido hasta una concentración final de 10 mg/ml. Una
gotita de 4 \mul de la solución de IGF-1 fue
mezclada con 5 \mul de la solución reservorio (polietilén glicol
3350 al 24% tamponado a pH 6,5 con cacodilato de sodio 0,1 M) y 1
\mul de
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
14 mM, que se obtiene en un kit de reactivos CRYSTAL SCREEN^{TM}
utilizado para cribados de condiciones de cristalización y que está
disponible en Hampton Research, Laguna Nigel, CA. Esta solución se
dejó equilibrar mediante difusión de vapor (Jancarik y col.,
supra) con 1 ml de solución reservorio. Así, una gota de la
mezcla fue suspendida bajo un cubreobjetos de plástico sobre la
solución reservorio. Pequeños cristales con una morfología delgada,
similar a una placa, aparecieron en 4-5 días. En
este punto, se añadieron a la gotita de cristalización 2 \mul de
metil pentanodiol (MPD) al 100% (hasta una concentración final del
20%) y los cristales se disolvieron durante una noche. En una
semana, reaparecieron los cristales y crecieron hasta dimensiones
finales de 0,2 mm X 0,1 mm X 0,05 mm con aristas notablemente más
afiladas. Estos cristales fueron utilizados para todos los análisis
posteriores.
Los expertos en la técnica apreciarán que las
condiciones de cristalización anteriormente mencionadas pueden
variarse. Variando las condiciones de cristalización pueden
obtenerse otras formas cristalinas del IGF-1. Tales
variaciones pueden ser utilizadas solas o en combinación e incluyen,
por ejemplo, la variación de las concentraciones de proteína
finales entre 5 y 35 mg/ml aproximadamente; la variación de la
proporción de IGF-1 respecto al precipitante, la
variación de las concentraciones del precipitante de entre el 20 y
el 30% aproximadamente para polietilén glicol, la variación de los
rangos de pH entre 5,5 y 7,5 aproximadamente, la variación de la
concentración o del tipo de detergente, la variación de la
temperatura entre -5 y 30ºC aproximadamente y la cristalización del
IGF-1 por el método discontinuo, de puente líquido o
de diálisis utilizando las condiciones anteriores o variaciones de
las mismas. Ver McPherson y col. (1982), supra.
Un cristal individual fue transferido desde el
líquido madre a una solución crioprotectora que constaba de
polietilén glicol 3350 al 25% (p/v), MPD al 30%, cacodilato de sodio
0,2 M pH 6,5,
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
2,8 mM y NaBr 1 M. La difracción fue a 1,8 \ring{A}. Después de
30 segundos en esta solución, los cristales fueron enfriados
instantáneamente sumergiendo la solución en nitrógeno líquido. La
técnica de congelar los cristales inmortaliza esencialmente los
mismos y produce un conjunto de datos de mucha mayor calidad. Todas
las manipulaciones posteriores y la recogida de datos de rayos X se
realizaron a 100º Kelvin.
Se recogió un conjunto de datos de MAD a 4
longitudes de onda en una línea de haz 9-2 en el
Stanford Synchroton Radiation Laboratory, fijándose el orden de los
datos según sigue: pico del Br (\lambda1), remoto de baja energía
(\lambda2), inflexión del Br (\lambda3) y remoto de alta energía
(\lambda4). Los puntos del pico y la inflexión del Br fueron
estimados a partir de barridos de fluorescencia del cristal, y se
eligió que el remoto de baja energía fuera de 1,54 angstroms, para
maximizar la pequeña señal anómala del azufre a esta longitud de
onda a la vez que se minimizaban los efectos de la absorción. No se
utilizó geometría del haz inverso. La reducción de datos se llevó a
cabo utilizando Denzo y Scalepack (Otwinowski y Minor, Methods in
Enzymology, 276: 307-326 (1997)). Con el fin de
determinar los factores de escala y B más precisos posibles,
los datos para las cuatro longitudes de onda fueron inicialmente
escalados juntos, asumiendo que no había señal anómala. Los
factores de escala y B determinados a partir de este proceso
de escalado fueron posteriormente aplicados a cada uno de los
cuatro conjuntos de datos.
Los cristales pertenecen al grupo espacial
C222_{1} con las constantes de celda unidad a = 31,83
\ring{A}, b = 71,06 \ring{A}, c = 66,00
\ring{A} y \alpha=\beta=\gamma= 90,000º. La unidad
asimétrica de los cristales contenía un monómero de
IGF-1 unido a una única molécula de detergente,
dando lugar a un coeficiente de Matthew de 2,4 \ring{A}^{3}/Da,
o un 48,1% de solvente. El contenido de solvente de los cristales
era del 55% aproximadamente.
Los intentos iniciales para determinar la
estructura del IGF-1 mediante sustitución molecular,
utilizando los modelos disponibles de RMN del IGF-1
o la estructura cristalina de la insulina, no tuvieron éxito. Por
esta razón, la estructura fue determinada de novo mediante
dispersión anómala a múltiples longitudes de onda (MAD) del Br
(Dauter y col., Acta Crystallogr., D56: 232-237
(2000)).
Las coordenadas del único bromuro unido fueron
determinadas mediante inspección manual de los mapas de Patterson
de la diferencia anómala y dispersiva. La ambigüedad de lados fue
resuelta mediante refinamiento de las fases utilizando el programa
SHARP (De La Fortelle y Bricogne, Methods in Enzymology, 276:
472-494 (1997)) de Global Phasing Limited, 43
Newton Road, Cambridge CB2 2AL, INGLATERRA, seguido por el examen de
mapas de Fourier de las diferencias anómalas calculados utilizando
las diferencias de Bijvoet de \lambda2. Un grupo de seis picos
para un lado de las coordenadas del Br era consistente con la
estructura del disulfuro de la insulina (código PDB: IZNI). Estos
seis picos corresponden a los seis átomos de S_{\gamma} de Cys del
IGF-1; un séptimo azufre (S\delta de Met 59) no
fue nunca detectado en los mapas de Fourier de diferencias anómalas,
debido presumiblemente a su factor de temperatura más elevado (36,7
\ring{A}^{2}). En este punto, las seis posiciones del
S_{\gamma} de Cys fueron incluidas en el refinamiento de fases,
utilizándose como referencia el conjunto de datos de \lambda1. A
lo largo del refinamiento de fases, la f'' del Br fue refinada para
el conjunto de datos de \lambda1, f' y f'' fueron refinadas para
\lambda3 y ambas fueron mantenidas fijas para los conjuntos de
datos de \lambda2 y \lambda4; los valores de f'' y f' para el
azufre se mantuvieron fijados en los valores teóricos para cada
longitud de onda. La pequeña señal anómala procedente de los átomos
de azufre tuvo un efecto modesto sobre la estadística de las fases,
pero los mapas de densidad electrónica resultantes mostraron una
conectividad mejorada, especialmente en las regiones peores
ordenadas del IGF-1.
La modificación de la densidad (achatamiento del
solvente y creación de mapas histogramas) fue realizada utilizando
DM (Collaborative Computational Project Número 4, Acta Crystallogr.,
D50: 760-763 (1994); Cowtan, Joint CCP4 and
ESF-EACBM Newsletter on Protein Crystallography, 31:
34-38 (1994)) y los mapas de densidad electrónica
resultantes eran de alta calidad. Un 50% aproximadamente de la
estructura, correspondiente a las tres regiones helicoidales del
IGF-1, fue construido directamente en los mapas de
densidad electrónica experimentales utilizando los programas O
(Jones y col., Acta Crystallogr., A47: 110-119
(1991)) y QUANTA (versión 97.0, MSI, San Diego, CA). Varios ciclos
de combinación de fases utilizando Sigmaa (Collaborative
Computational Project Número 4, supra; Read, Acta
Crystallogr., A42: 140-149 (1986)) permitieron
modelar el resto de la molécula. El refinamiento posicional atómico
y del factor B restringido utilizó la función diana de máxima
probabilidad del CNX (Brünger y col., Acta Crystallogr., D54:
905-921 (1998) y MSI, San Diego, CA), acoplada con
una corrección del solvente puro de tipo "máscara" y el
escalado del factor B total anisotrópico.
El modelo final contiene los residuos
3-34 y 41-64 del
IGF-1, una molécula de
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina,
un Br y 50 moléculas de agua. El modelo fue refinado frente al
conjunto de datos de \lambda3, ya que la estadística de los datos
demostró que este grupo de datos era de mayor calidad que los demás.
Todos los datos de una resolución de 20 a 1,8 angstroms fueron
incluidos en el refinamiento, sin aplicar un corte sigma. Las
asignaciones de estructura secundaria fueron realizadas con el
programa PROMOTIF (Hutchinson y Thornton, Protein Science, 5:
212-220 (1996)).
Mientras que las posiciones bien ordenadas del
IGF-1 eran esencialmente idénticas utilizando los
dos conjuntos de fases, las regiones más flexibles de la molécula
mostraron una conectividad enormemente mejorada tras la inclusión
de los azufres en la determinación de fases. Los mapas
experimentales de densidad electrónica que mostraban la región del
giro del IGF-1 inmediatamente después de la primera
hélice (residuos 19, 20 y 21) indican que la utilización de las
fases combinadas de Br y S tenía como resultado un mapa mucho mejor
conectado que la utilización únicamente de las fases de Br solas.
En este punto, mediante la utilización de las fases de Br + S, pudo
trazarse un 50% aproximadamente de la molécula directamente en los
mapas experimentales.
Después de varios ciclos de construcción de
modelos y de combinación de fases, el modelo final, mostrado en la
Figura 2, contiene los residuos 3-34 y
41-64 del IGF-1, una única molécula
de detergente unida y 46 moléculas de agua. El factor R para 1,8
\ring{A} es del 23,7% y el factor R libre es del 26,9%, con una
buena estereoquímica. La región B N-terminal
corresponde a los residuos 3-28, la región C a los
residuos 29-34, un tramo de residuos mal ordenados
desde el residuo 35 al 40 y la región A del 42 al 62. La región D
(63-70) está esencialmente desordenada.
La estructura del IGF-1 es
similar a la de la insulina (ver la Figura 3), con una Raíz de la
Desviación Cuadrática Media (RMSD) de 3 \ring{A} sobre los átomos
del esqueleto que están conservados entre las dos moléculas. La
mayoría de estas desviaciones tienen lugar en las regiones flexibles
y, cuando se consideran únicamente las regiones helicoidales, la
RMSD entre los átomos de carbono alfa es de 0,47 \ring{A}
aproximadamente. La principal diferencia es la extensión de la
región C, para la que no hay equivalente en la insulina madura,
lejos del cuerpo de la molécula. Este bucle contiene muchos de los
residuos que se sabe que son importantes para la unión al
receptor.
Un extenso estudio de mutagénesis por barrido de
alanina del IGF-1 ha mostrado qué residuos son
importantes para la unión a IGFBP-1 e
IGFBP-3 (Dubaquie y Lowman, supra). Los
residuos que se unen a IGFBP-3 son similares a los
que se unen a IGFBP-1, aunque se cree que
IGFBP-3 depende más de interacciones con el
esqueleto y es afectada menos gravemente por las mutaciones de
alanina. No hay ninguna mancha dramática en el lugar en el que los
residuos importantes para la unión de IGFBP-1 e
IGFBP-3 se agrupan, y mutaciones que disminuyen la
unión están dispersas por toda la molécula. Parece haber un ligero
agrupamiento de sitios en el extremo N, siendo muchos de estos
sitios intrínsecamente hidrofóbicos.
Según se muestra en las Figuras 4 y 7, la
molécula de detergente se une en una pequeña hendidura hidrofóbica
en la base de la hélice B. Hay varios contactos directos de cadenas
laterales de los residuos 5, 7 y 10 con el detergente. A pesar del
solapamiento del sitio de unión del detergente con una porción del
epítopo que se une a
IGFBP-1/IGFBP-3, los resultados
preliminares sugieren, sin limitarse a ninguna teoría, que el
detergente no inhibe la unión de estas proteínas al
IGF-1. La cara opuesta del detergente está
produciendo un contacto de simetría con la cara opuesta del
IGF-1.
Según se muestra en la Figura 5, hay solamente
un contacto de empaquetado del cristal grande entre moléculas de
IGF-1 con simetría relacionada, el cual tiene como
resultado un homodímero simétrico. El área de la superficie
enmascarada es de 1378 \ring{A}^{2}, que está en el rango de las
interfases proteína-proteína fisiológicamente
relevantes.
La Figura 6 muestra que los residuos que se sabe
que son importantes para la unión al receptor se agrupan en esta
interfase dimérica. Se muestran Tyr 24, Thr 29, Tyr 31 y Tyr 60. La
mutación de estos residuos tiene como resultado una pérdida de
afinidad por el receptor de 6-20X para las
mutaciones individuales, o una pérdida de la afinidad de
240->1200X para las mutaciones dobles. Se muestran también Phe 23
y Phe 25, que son intercambiables con Phe 24 y Tyr 26 de la
insulina, sin pérdida de afinidad.
El IGF-1 está compuesto
principalmente por tres segmentos helicoidales correspondientes a la
hélice B (residuos 7-18 del IGF-1)
y a las dos hélices A (residuos 43-47 y
54-58 del IGF-1) de la insulina. El
núcleo central hidrofóbico es esencialmente idéntico al descrito
para las estructuras de RMN del IGF-1, incluyendo
los tres enlaces disulfuro entre Cys 6 y Cys 48, Cys 18 y Cys 61 y
Cys 47 y Cys 52, según se indicó en las referencias anteriores. Los
residuos 3 a 6 no forman ninguna estructura secundaria regular y por
tanto la estructura descrita en la presente puede ser clasificada
como muy similar a la forma T de la insulina (Derewenda y col.,
Nature, 338: 594-596 (1989)); en efecto, cuando se
superponen IGF-1 y la forma T de la insulina sobre
las posiciones C\alpha de sus segmentos helicoidales respectivos
(residuos 8-19, 42-49 y
54-61 del IGF-1; residuos
B9-B20, A1-A8 y
A13-A20 de la insulina) la RMSD es solamente de 0,93
angstroms. Igual que la insulina, los residuos
18-21 en el extremo de la hélice B forman un giro
\beta de tipo II', que redirige el esqueleto desde la hélice B
hacia una región extendida. Los residuos 24-27
forman un giro \beta de tipo VIII para acomodarse a la región C,
que se extiende lejos del núcleo central del IGF-1,
e interacciona con una molécula de simetría relacionada. Los
residuos 30-33 forman un giro beta de tipo II bien
definido, mostrando destacadamente Tyr 31 en la posición i+1. Los
residuos 35-40 no han sido modelados, ya que la
densidad electrónica en esta región es débil y está desconectada.
Solamente los dos primeros residuos de la región D (residuos 63 y
64) están ordenados en la estructura.
La región C del IGF-1 media una
interacción de empaquetado de cristales simétricos doble a través
del eje a de la celda unidad. Esta interacción enmascara 689
\ring{A}^{2} de área de superficie accesible al solvente de
cada molécula de IGF-1, o un total de 1378
\ring{A}^{2}, y es la interfase más grande en el cristal. Se
forman un total de 28 contactos intermoleculares de 3,6 \ring{A}
de distancia o menos a través de esta interfase, formando la
siguiente interacción de empaquetado de cristales más extensa
solamente nueve contactos. El núcleo central de la interfase está
dominado por Tyr 24 y Pro 28 de cada monómero, que enmascaran 39
\ring{A}^{2} y 57 \ring{A}^{2} de áreas de superficies
accesibles al solvente, respectivamente. El anillo aromático de Tyr
31, que está en el extremo del bucle en el punto más alejado del
núcleo central de IGF-1 se empaqueta frente a los
anillos fenólicos de Phe 23 y Phe 25 de la molécula con simetría
relacionada. Además de estas interacciones hidrofóbicas, están
presentes dos enlaces de hidrógeno de la cadena principal (Tyr 31
N-Phe 23 O; Ser 34 N-Asp 20 O) en la
superficie dimérica. Residuos de la región D (62-64)
son también secuestrados parcialmente por la formación de dímeros.
Debido a estas interacciones, la mayor parte de la región C del
cristal está bien ordenada, proporcionando la primera vista de alta
resolución de la conformación de este bucle biológicamente
importante.
Aunque se sometieron a selección en ensayos de
cristalización 72 compuestos detergentes, incluyendo los detergentes
similares sulfonato de
3-((3-colaminopropil)dimetilamonio)-1-propano
(CHAPS) y ácido
3-((3-colamidopropil)dimetilamonio)-2-hidroxipropanosulfónico
(CHAPSO), solamente
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
produjo cristales. Una única molécula de
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
interacciona con residuos, formando una pequeña hendidura
hidrofóbica sobre una superficie del IGF-1 (Leu 5,
Phe 16, Val 17, Leu 54 y Leu 57) (Fig. 7A). La preferencia por
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
es explicada, sin limitarse a ninguna teoría, por la ausencia de un
átomo de oxígeno en la posición C10 de la molécula de detergente.
Esta región del detergente está en estrecho contacto con los átomos
de las cadenas laterales de los residuos Leu 5, Leu 54 y Leu 57 del
IGF-1. La cara opuesta del detergente media un
contacto de simetría con los residuos Val 11, Leu 14 y Gln 15 de
una molécula de IGF-1 de simetría relacionada. Y lo
que es más intrigante, esta cara de la
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
contacta también con el borde de la interfase dimérica, con
estrechos contactos con Phe 23 y Phe 25 de la misma molécula de
IGF-1, así como con Tyr 31 y Gly 32 de la pareja
dimérica (Fig. 7B). Un análisis más detallado indica que el
detergente se une a dos parches de bolsillos de unión del
IGF-1. Un parche tiene los residuos de aminoácidos
Glu 3, Thr 4, Leu 5, Asp 12, Ala 13, Phe 16, Val 17, Cys 47, Ser
51, Cys 52, Asp 53, Leu 54 y Leu 57, y el segundo parche tiene los
residuos de aminoácidos Val 11, Gln 15, Phe 23, Phe 25, Asn 26, Val
44, Phe 49 y Arg 55. La unión es definida por tener al menos un
contacto entre cada residuo de aminoácido enumerado y la molécula de
agonista candidato que sea menor o igual a 6 angstroms.
La región C de la estructura cristalina del
IGF-1 se extiende hacia fuera desde el núcleo
central de la molécula, formando los residuos 30-33
un giro beta de tipo II canónico, y formando el resto de la región C
un dímero cristalográfico con una molécula de simetría relacionada.
Tyr 31 ha sido implicado como determinante crítico para la unión al
IGF-1R, y su posición en el extremo de esta
extensión lo sitúa en una posición ideal para interaccionar con una
molécula del receptor. Aunque esta región del IGF-1
no está bien definida por los datos de RMN, es probable que la
conformación de la región C en el cristal refleje la conformación en
solución. Hay evidencia de un giro inverso en el extremo del bucle
y de una bisagra que se dobla en los extremos del bucle de
IGF-2 (Torres y col., supra). Por tanto,
aunque las fuerzas de empaquetado de los cristales ayudan
indudablemente a estabilizar la orientación de este bucle, su
conformación es consistente con la estructura en solución del
IGF-2 estrechamente relacionado.
El tamaño de la interfase formada por el dímero
cristalográfico está dentro del rango del área de la superficie
enmascarada en complejos biológicos conocidos (Janin y Chothia, J.
Biol. Chem., 264: 16027-16030 (1990)). Además, esta
interacción excluye parcialmente del solvente a varios de los
residuos que se sabe que son importantes para la unión al
IGF-1R, incluyendo Phe 23 (un 69% enmascarado), Tyr
24 (un 64%), Phe 25 (un 29%) y Tyr 31 (un 38%). Otros grupos han
informado también de interacciones homodiméricas de
IGF-1 e IGF-2. Laajoki y col.
(2000), supra, describen que a una concentración de 1 mM, una
forma manipulada de IGF-1
(Largo-[Arg^{3}]IGF-1) se reparte en un
20% aproximadamente de dímero/un 80% de monómero, una proporción que
está bastante de acuerdo con el cálculo de una K_{d} de 3,6 mM.
En su estudio de RMN del IGF-2, Torres y col.,
supra, informaron que los protones amida de los residuos de
la región C se intercambiaban lentamente con el solvente, sugiriendo
que IGF-2 forma un homodímero en solución. Sin
embargo, a pesar de la cantidad significativa del área de la
superficie que está enmascarada después de la formación de dímeros
en el cristal, la afinidad del IGF-1 por sí mismo
es muy débil. Además, la estequiometría de unión conocida de una
molécula de IGF-1 por dímero de receptor (De Meyts,
supra) hace difícil racionalizar el significado biológico de
la dimerización del IGF-1. En conclusión, el dímero
de IGF-1 en esta forma de cristal resulta de la alta
concentración de IGF-1 en el experimento de
cristalización, y no representa una forma fisiológicamente relevante
de la molécula.
La muy baja calidad de los datos
espectroscópicos de RMN obtenidos para IGF-1 a pH
casi neutro, ha sido atribuida a una combinación de autoasociación
y movilidad interna que da lugar a una gran variación de la anchura
de la línea de resonancia (Cooke y col., supra). Como
resultado, los espectros NOESY adquiridos sobre
IGF-1 contienen muchos picos anchos, solapados, y
pocas correlaciones precisas bien resueltas. Los espectros NOESY
recogidos de IGF-1 en presencia de un exceso de
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
tienen un aspecto similar. Por tanto, la unión del detergente no es
suficiente para eliminar la agregación o la flexibilidad inherente
del IGF-1 y no facilita la caracterización de la
conformación de la proteína en solución. Esto contrasta con las
observaciones en el estado cristalino donde la adición del
detergente da lugar a un dímero cristalográfico bien empaquetado
que difracciona con alta resolución. Jansson y col., J. Biol. Chem.,
273: 24701-24707 (1998) observaron que la falta de
asignaciones de la RMN en la región inmediatamente circundante a Cys
6, que incluye Leu 5 y Gly 7, era indicativa de que el disulfuro
Cys 6-Cys 48 estaba experimentando un intercambio
intermedio entre una configuración cis y una configuración trans.
El hecho de que el detergente se una a una cara de la hélice B
inmediatamente opuesta a este disulfuro sugiere, sin limitarse a
ninguna teoría, que puede servir para estabilizar esta región de la
molécula mediante un empaquetado más completo de la hendidura
hidrofóbica. En efecto, en la estructura cristalina de la presente,
el Cys 6-Cys 48 está claramente en la conformación
trans y no hay evidencia de conformaciones múltiples.
La estructura cristalina del
IGF-1 ha sido determinada utilizando dispersión
anómala procedente de los átomos de azufre intrínsecos y de un ión
Br unido en un sitio de unión de haluro fortuito. La estructura es
muy similar a la de la insulina, estando la única diferencia
importante en la región C, que sobresale del cuerpo de la proteína
y media una interacción homodimérica. El nivel del área de la
superficie enmascarada es consistente con el hecho de que a pH
neutro el IGF-1 experimenta una autoasociación de
manera dependiente de la concentración. Además, varios residuos que
son importantes para la unión al receptor se encuentran en esta
interfase dimérica, sugiriendo, sin limitarse a ninguna teoría, que
los efectos sobre la unión al receptor por mutación de estos
residuos pueden ser el resultado de una ruptura del dímero, más que
de un contacto directo con la superficie del receptor.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron medidas de difusión derivadas de
RMN para estimar la K_{d} para la interacción entre
IGF-1 y
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina.
Se prepararon muestras en tampón fosfato 50 mM en D_{2}O, pH 6,5
(lectura del medidor sin corregir) y contenían:
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
1,0 mM + IGF-1 0,5 mM;
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
0,5 mM + IGF-1 0,25 mM;
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
0,25 mM + IGF-1 0,125 mM; o
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
únicamente (1,0, 0,5 ó 0,25 mM). Todos los espectros fueron
adquiridos a 40ºC en un espectrómetro AVANCE 500^{TM} de Bruker
(Bruker Analytik GmbH) equipado con una sonda de triple resonancia,
con un gradiente de triple eje de 5 mm. Las medidas de difusión se
realizaron con un método de par de pulsos bipolares con \delta = 5
ms, \tau = 2 ms y \Delta = 25 ó 40 ms para la
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
sola o para la
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
+ IGF-1, respectivamente (Wu y col., J. Magn.
Reson., Ser. A 115: 260-264 (1995)). Los espectros
fueron recogidos con 128 a 1024 corrientes transitorias a medida
que se incrementó la potencia del gradiente z desde 0,009 hasta
0,45 T\cdotm^{-1} en 18 incrementos iguales; las medidas se
realizaron al menos dos veces en cada muestra. Los espectros fueron
procesados y se extrajeron las alturas de los picos con el programa
FELIX (v98.0, MSI, San Diego). Las constantes de difusión, la
proporción de detergente unido y la K_{d} resultante fueron
extraídas según está descrito por Fejzo y col., Chemistry &
Biology, 6: 755-769 (1999). Se recogieron también
espectros de muestras que contenían sulfonato de
3-((3-colamidopropil)dimetilamonio)-1-propano
1,0 mM, un detergente anfotérico utilizado para la solubilización
de membranas, y sulfonato de
3-((3-colamidopropil)dimetilamonio)-1-propano
1,0 mM + IGF-1 0,5 mM. Se recogieron espectros
NOESY bidimensionales (Jeener y col., J. Chem. Phys., 71:
4546-4553 (1979)) en una muestra de
IGF-1 0,5 mM en presencia o ausencia de
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
1,0 mM con un tiempo de mezclado de 100 ms.
Células de E. coli
(XL1-Blue, Stratagene) recién transformadas con el
vector fágico pIGF-g3 que presenta el
IGF-1 humano según está descrito en Dubaquie y
Lowman, supra, fueron cultivadas durante una noche en 5 ml
de medio 2YT (Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY, 1989)). Las partículas de fago que presentaban
IGF-1 fueron tituladas frente a
IGFBP-1 e IGFBP-3 con el fin de
obtener una dilución de 500-1000 veces para la
preincubación con diluciones seriadas de los detergentes y los
estándares de proteínas de unión durante 35 minutos. Inmunoplacas de
micropocillos de poliestireno transparente con una superficie de
MAXISORP^{TM} (Nunc, Dinamarca), fueron revestidas con la
proteína IGFBP-1 o IGFBP-3 durante
una noche a 4ºC (50 \mul a 3 \mug/ml en tampón carbonato 50 mM,
pH 9,6), bloqueadas con TWEEN® 20 al 0,5% (monolaurato de
polioxietilén sorbitán) (Atlas Chemical Co.) y PBS y lavadas ocho
veces con PBS, TWEEN® 20 al 0,05% (monolaurato de polioxietilén
sorbitán). Las muestras fueron añadidas a las placas durante 30
minutos. Las placas fueron lavadas ocho veces con PBS, TWEEN® 20 al
0,05% (monolaurato de polioxietilén sorbitán), incubadas con 50
\mul de conjugado peroxidasa de rábano picante/anticuerpo
anti-M13 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway,
NJ) 1:10.000 en PBS, BSA 0,5%, durante 30 minutos y posteriormente
lavadas ocho veces con PBS, TWEEN® 20 al 0,05% (monolaurato de
polioxietilén sorbitán) y dos veces con PBS. Las placas fueron
reveladas utilizando el sustrato tetrametilbencidina (Kirkegaard and
Perry, Gaithersburg, MD), paradas con H_{3}PO_{4} 1,0 y leídas
espectrofotométricamente a 450 nm.
La autoasociación de IGF-1 fue
determinada mediante análisis del equilibrio de sedimentación. Los
experimentos fueron llevados a cabo a 20ºC en una ultracentrífuga
analítica OPTIMA^{TM} XL-A/XL-I
(Beckman Coulter, Inc.). Las muestras fueron preparadas en tampón
citrato 0,1 M, pH 6,5, NaCl 75 mM con una concentración de carga
desde 1 mM a 0,01 mM. Los gradientes de concentración fueron medidos
a velocidades del rotor de 25000 y 30000 rpm a 280 nm o a 285 nm
utilizando un sistema óptico de absorción de barrido. Se verificó la
consecución de un estado de equilibrio comparando barridos
sucesivos después de 16 horas aproximadamente. El volumen específico
parcial del IGF-1 fue calculado a partir de su
composición de aminoácidos. Los datos fueron ajustados como un
modelo de una única especie ideal o como un modelo de autoasociación
dimérica ideal utilizando un programa de ajuste de mínimos
cuadrados no lineal, NONLIN (Johnson y col., Biophys. J., 36:
578-588 (1981)). Las constantes de asociación
fueron determinadas a partir de los valores de mejor ajuste del
modelo, proporcionados por la regresión de mínimos cuadrados no
lineal.
Resultados:
La afinidad del IGF-1 por el
sulfonato de
3-((3-colamidopropil)dimetilamonio)-1-propano
y por la
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
fue determinada utilizando métodos de RMN en solución. Los cambios
del desplazamiento químico observados durante una titulación de
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
en una solución de IGF-1 0,5 mM sugerían que la
afinidad era submilimolar y no era fácilmente medible a partir de
tales datos. En lugar de ello, se realizaron medidas de difusión en
muestras a concentraciones variables de IGF-1 que
contenían 2 equivalentes molares de detergente y también en varias
muestras de detergente solo (la concentración del detergente era
siempre menor que la concentración micelar crítica de 1,4 mM para
la
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
y 14 mM para el sulfonato de
3-((3-colamidopropil)dimetilamonio)-1-propano).
La disminución de la constante de difusión del detergente en
presencia de la proteína puede ser utilizada para calcular la
proporción de detergente unida a la proteína (Fejzo y col.,
supra). Como la concentración total de detergente y de
proteína es conocida, puede determinarse un valor de la constante
de disociación. A las tres concentraciones de proteína estudiadas
(0,5 mM, 0,25 mM y 0,125 mM), se obtuvieron valores de K_{d} de
220, 440 y 430 \muM, respectivamente. Esta técnica ha sido
aplicada rutinariamente a moléculas pequeñas (varios cientos de
Daltons de peso molecular o menores) que se unen a proteínas
grandes. En este caso particular, el ligando es relativamente grande
(862 Da) y la proteína es relativamente pequeña (7648 Da); por
tanto, la disminución diferencial de la constante de difusión tras
la unión es pequeña. Esto aumenta la incertidumbre con la cual puede
medirse la constante de disociación. Dado esto, los datos descritos
anteriormente sugieren que la K_{d} para la interacción entre
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
e IGF-1 es de 300 \pm 150 \muM. Un análisis
similar de los datos de la difusión del sulfonato de
3-((3-colamidopropil)dimetilamonio)-1-propano
sugiere que la K_{d} en este caso es mayor de 3 mM.
Con el fin de examinar el epítopo de unión de la
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
en el IGF-1, el detergente fue preincubado con
IGF-1 expresado en partículas de bacteriófago, y se
midió el nivel de unión residual a IGFBP-1 y a
IGFBP-3 en un ensayo en placas (ELISA). Como
control, se ensayó también la molécula de sulfonato de
3-((3-colamidopropil)dimetilamonio)-1-propano.
Según se muestra en la Figura 8, la
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
inhibía completamente la unión del IGF-1 en el fago
a IGFBP-1 e IGFBP-3 con valores de
la CI_{50} de 740 \pm 260 \muM y 231 \pm 29 \muM,
respectivamente. Sin embargo, estos números debe ser interpretados
de forma conservadora, ya que la concentración micelar crítica de la
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
(1,4 mM) presenta un límite superior en la curva de la Figura 8. En
contraste con el efecto de la
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina,
el detergente estrechamente relacionado sulfonato de
3-((3-colamidopropil)dimetilamonio)-1-propano
no mostró ninguna inhibición de la unión a ninguna de las
concentraciones analizadas hasta 1 mM. A pesar de las limitaciones
del experimento, los valores de la CI_{50} obtenidos para la
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
concuerdan bien con la estimación anterior de la K_{d} para la
interacción
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina-IGF-1.
Los datos del equilibrio de sedimentación
muestran que IGF-1 experimenta autoasociación en
solución. El peso molecular medio aumentaba al aumentar la
concentración de proteína desde 0,01 mM a 1 mM. El peso molecular
medio a la concentración más elevada estudiada (1 mM) es alrededor
de un 37% mayor que el peso molecular del monómero (10,4 KDa a 1 mM
frente a un peso molecular del monómero de 7,6 KDa). A
concentraciones inferiores a 0,05 mM, no se observó autoasociación
e IGF-1 existe únicamente como monómero en solución
a pH neutro. Si se asume que las especies de peso molecular más
elevado son dímeros de IGF-1, los datos de
sedimentación pueden ser ajustados como un modelo de
monómero-dímero con una K_{d} de 3,6 \pm 1,0 mM
(Figura 9).
Varios estudios han identificado residuos en
IGF-1 que son importantes para la unión a IGFBP
(Clemmons y col., Endocrinology, 131: 890-895
(1992); Dubaquie y Lowman, supra; Jansson y col.,
supra; Oh y col. (1993), supra; Lowman y col. (1998),
supra; y Dubaquie y col., Endocrinology, 142:
165-173 (2001)). Dubaquie y Lowman, supra,
identificaron dos parches distintos en IGF-1 que
interaccionan con IGFBP-1 e IGFBP-3.
El Parche 1 consta de Glu 7, Leu 10, Val 11, Leu 14, Phe 25, Ile 43
y Val 44, mientras que el Parche 2 consta de Glu 3, Thr 4, Leu 5,
Phe 16, Val 17 y Leu 54. En la estructura cristalina del
IGF-1, estos dos parches están implicados en los
contactos de empaquetado de los cristales mediados por detergente.
(Específicamente, el Parche 1 de la estructura cristalina de
IGF-1 consta de los residuos de aminoácidos Glu 3,
Thr 4, Leu 5, Asp 12, Ala 13, Phe 16, Val 17, Cys 47, Ser 51, Cys
52, Asp 53, Leu 54 y Leu 57, y el Parche 2 de la estructura
cristalina del IGF-1 consta de los residuos de
aminoácidos Val 11, Gln 15, Phe 23, Phe 25, Asn 26, Val 44, Phe 49
y Arg 55, en los que tiene lugar la unión si hay al menos un
contacto entre cada residuo de aminoácido enumerado y la molécula
de agonista candidato que sea menor o igual que 6 angstroms).
El solapamiento del sitio de unión del
detergente con las superficies de interacción de las IGFBP es
totalmente consistente con la observación de la presente de que la
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
bloquea la unión de IGFBP-1 e
IGFBP-3. En contraste, la
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
no inhibe la generación de señales mediada por el
IGF-1R en un ensayo de activación de receptores
basado en células. Estos resultados son consistentes con estudios
previos que demostraron diferentes epítopos de unión en el
IGF-1 para las interacciones con el receptor y las
IGFBP (Bayne y col., supra, (Vol. 264); Bayne y col.,
supra, (Vol. 265); Cascieri y col., supra). La
identificación de la
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
como inhibidor de las interacciones con IGFBP, permite la capacidad
para desarrollar fármacos o peptidomiméticos de molécula pequeña
que rompan el complejo IGF-1/IGFBP in vivo,
liberando de este modo IGF-1 activo para los
receptores del conjunto sistémico, inactivo. Tales fármacos incluyen
la terapia biodisponible oralmente para enfermedades metabólicas
tales como la diabetes.
Recientemente, Zeslawski y col. (EMBO J., 20:
3638-3644 (2001)) publicaron la estructura
cristalina del IGF-1 en un complejo con el dominio
N-terminal de la IGFBP-5. La
estructura de ese complejo es totalmente consistente con el modelo
de inhibición por un detergente de la unión de IGFBP presentado en
la presente, y descrito también por Vajdos y col., Biochemistry,
40: 11022-11029 (2001). La determinación mediante
RMN de un complejo de IGF-1 unido a un péptido
antagonista de IGF-1 derivado de un fago denominado
IGF-F1-1 (RNCFESVAALRRCMYG (SEC ID
Nº:4)), en comparación con otras estructuras cristalinas de
IGF-1, muestra que, sin limitarse a ninguna teoría,
una porción de la cadena A (hélice III) es móvil en solución y
adopta conformaciones ligeramente diferentes cuando se une a
diferentes ligandos (detergente, péptido, proteína de unión).
El complejo entre el péptido
IGF-F1-1 e IGF-1 fue
determinado a partir de los datos de espectroscopía de RMN
recogidos a 600 y 800 MHz. Se preparó IGF-1 marcado
uniformemente con ^{13}C y ^{15}N utilizando el esquema
descrito por Reilly y Fairbrother, J. Biomol. NMR, 4:
459-462 (1994) y se purificó de acuerdo con el
protocolo de Vajdos y col., supra. Un ligero exceso molar de
IGF-F1-1 no marcado fue mezclado con
una solución 1,5 mM de ^{13}C/^{15}N IGF-1 y se
asignaron resonancias de RMN de ^{1}H, ^{13}C y ^{15}N a
partir de experimentos de RMN de resonancia doble y triple, según
está descrito por Cavanagh y col., Protein NMR Spectroscopy,
Principles and Practice (Academic Press: New York, 1996). Las
restricciones de distancia en IGF-1 fueron
identificadas a partir de los espectros NOESY HSQC editados para
^{13}C y de los espectros NOESY HSQC editados para ^{15}N
(Cavanagh y col., supra).
Las restricciones intermoleculares entre
IGF-1 y el péptido fueron obtenidas a partir de un
espectro HSQC-NOESY de ^{13}C editado para
_{\omega}2, filtrado para _{\omega}1 (Lee y col., FEBS Lett.,
350: 87-90 (1994)). Las restricciones de distancia
intrapéptido fueron obtenidas a partir de un espectro NOESY
2-D filtrado para ^{13}C. Además, se obtuvieron
las restricciones de ángulos diedros \Phi a partir de un espectro
HNHA (Cavanagh y col., supra) y las restricciones
\chi^{1} derivaban de espectros HNHB y TOCSY con corto tiempo
de mezclado (Clore y col., J. Biomolec. RMN, 1:
13-22 (1991)). Se obtuvieron restricciones \Phi,
\psi adicionales a partir de un análisis de los desplazamientos
químicos de H^{\alpha}, N, C^{\alpha}, C^{\beta} y CO
utilizando el programa TALOS (Cornilescu y col., J. Biomol. NMR, 13:
289-302 (1999)).
En total, se utilizaron 899 restricciones de
distancia (779 intra-IGF-1, 33
intrapéptido; 87 intermoleculares), 16 restricciones de enlaces de
hidrógeno en la hélice I y 138 restricciones de ángulos diedros (71
\Phi; 44 \psi 23 \chi^{1}) para generar un conjunto de
estructuras utilizando un protocolo de dinámica de ángulo de
torsión con el programa de ordenador CNX (Accelrys Inc., San Diego).
La estructura del IGF-1 estaba bien definida para
la región B (residuos 2-25) y para la región A
(residuos 41-63) con una RMSD media de la
estructura media para los átomos pesados del esqueleto de 0,32 \pm
0,06 \ring{A}. La región C (26-40) y la región D
(62-70) no estaban bien definidas por los datos
disponibles. Las 20 estructuras con la energía de violación de la
restricción más baja tenían una buena estereoquímica del esqueleto
(el 80% de los residuos en la región más favorecida del espacio
\Phi/\psi con ninguno en las regiones no permitidas) y contenían
pocas violaciones de las restricciones experimentales (violación de
la restricción de distancia máxima media 0,09 \pm 0,02
\ring{A}). IGF-F1-1 adopta una
conformación muy similar a la determinada para el propio péptido en
solución. La conformación de IGF-1 contiene tres
hélices (residuos 7-18, 43-49 y
54-60) y es similar a la observada a una resolución
menor en previos estudios de RMN de IGF-1 sin
acomplejar (ver, por ejemplo, Cooke y col., supra; Sato y
col., supra; y Laajoki y col., supra).
La Fig. 10 muestra la comparación para los
complejos con el detergente y el péptido del fago. Específicamente,
la Fig. 10A muestra un diagrama de cintas de un complejo de
IGF-1 y
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
y la Fig. 10B muestra un complejo de IGF-1 unido al
péptido IGF-F1-1 derivado de un
fago. La región B (hélice I) adopta una conformación muy similar en
ambos complejos. El bucle C está ordenado sólo parcialmente en el
complejo del detergente, y mal definido en el complejo del péptido.
Se observan diferencias inducidas por el ligando para la región A
del IGF-1 (hélice III), a nivel del esqueleto
(residuos 52-60) y a nivel de cadena lateral
(leucina 54 y 57). Sin limitarse a ninguna teoría, se cree que la
maleabilidad en este área de la región A es lo que permite al
IGF-1 unirse a tantas proteínas (seis IGFBPs y tres
receptores).
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(Apéndice pasa a página
siguiente)
\newpage
Claims (3)
1. Un método para identificar agonistas
indirectos del IGF-1 que comprende las etapas
de:
- (a)
- la determinación de la capacidad de N,N-bis-(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina para inhibir la unión de IGFBP-1 o -3 a IGF-1, y la comparación de dicha capacidad con la capacidad de un agonista indirecto del IGF-1 candidato para inhibir así la unión; y
- (b)
- la determinación de si el agonista indirecto candidato inhibe tal unión al menos igual de bien que la N,N-bis-(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El método de la reivindicación 1, en el que
la comparación se lleva a cabo mediante un ensayo de competición
entre la
N,N-bis-(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
y el agonista indirecto candidato.
3. El método de la reivindicación 1, en el que
la inhibición de la unión es medida mediante la preincubación de
N,N-bis-(3-D-gluconamidopropil)-desoxicolamina
o del agonista indirecto candidato con IGF-1
expresado en partículas de bacteriófago y la medida de la unión
residual de IGF-1 a IGFBP-1 o a
IGFBP-3 en un ensayo de ELISA en placa.
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