ES2327389T3 - Operon de caucho aislado de xylella fastidiosa, moleculas de acido nucleico aisladas del mismo, y usos del mismo. - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia nucleotídica que codifica al menos una proteína, cuya secuencia de aminoácidos está representada en SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, o 19, o una secuencia nucleotídica que tiene al menos 70% de identidad total de la misma.

Description

Operón de caucho aislado de Xylella fastidiosa, moléculas de ácido nucleico aisladas del mismo, y usos del mismo.

Campo de la invención

Esta invención se refiere al aislamiento de un operón del microorganismo Xylella fastidiosa. Más particularmente, se refiere al aislamiento de dicho operón que comprende nueve genes, denominados en adelante "xfgum B, C, D, E, F, H, J, K, y M". También, una parte de la invención son las moléculas de ácido nucleico aisladas para cada uno de estos 9 genes por separado. También, una parte de la invención son los vectores de expresión que comprenden el operón, o uno o más de los genes componente, en unión operativa con un promotor, células recombinantes que incluyen el operón o uno o más de los genes, el producto de expresión de estos genes, y varios usos de los mismos.

Estado de la técnica y técnica anterior

La goma Xantana es un exopolisacárido ("EPS" en adelante) producido por la bacteria fitopatogénica Xanthomonas campestris (Ielpi et al., 1981, FEBS Lett. 130:253-256). La biosíntesis de este polisacárido extracelular en X. Campestris está dirigida por un grupo de 12 genes, gumB-gumM (Becker et al., 1998, Appl Microbiol Biotechnol, 50:145-152; Vojnov et al., 1998, Microbiology 144:487-493). Está compuesto por unidades repetidas de pentasacárido polimerizado que están ensambladas por la adición secuencial de glucosa-1-fosfato, glucosa, manosa, ácido glucurónico, y manosa sobre un vehículo de fosfato de poliprenol (Ielpi et al., 1992, J. Bacteriol. 175:2490-2500). La unidad repetitiva de pentasacárido también está O-acetilada y piruvilada en varios grados (Ielpi et al., 1993, J. Bacteriol. 175:2490-2500).

La transformación con un grupo de genes que lleva gumB y gumC restauró la producción de goma xantana en mutantes deficientes, sugiriendo que gumB y gumC están implicados en la translocación de la goma xantana a través de la membrana bacteriana (Vojnol et al., 1998, Microbiology 144:487-493).

Dos grupos de genes están implicados en la biosíntesis de xantana: los genes xpsIII, xps IV y xps VI, que son responsables de la síntesis de UDP-glucosa, ácido UDP-glucurónico y GDP-manosa, respectivamente (Harding et al., J. Bacteriol. 196:2854-2861); Harding et al., J. Gen Micobiol 139:447-457 (1993); Hötte et al., 1999; Köplin et al, J. Bacteriol 174:191-199 (1992), 1992) y los genes gum y xpsI, que codifican las enzimas implicadas en la polimerización del pentasacárido unido a fosfato de poliprenol y la secreción del EPS al medio extracelular (Ielpi et al., 1992; más arriba Ielpi et al., 1993 más arriba).

Los genes gum de X. campestris están agrupados en un operón (operón GUM) de aproximadamente 16 Kb de longitud, que contiene 12 genes denominados gumB, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L y M. El gen gumD codifica la enzima glucosiltransferasa I, responsable de la transferencia de la glucosa-1-fosfato de UDP-glucosa al vehículo de fosfato de poliprenol para formar el lípido-monosacárido. GumM codifica la enzima glucosiltransferasa II, que cataliza la adición del segundo resto de glucosa para formar el lípido-disacárido. GUM codifica la enzima glucosiltransferasa II, que cataliza la adición del segundo resto de manosa para formar el lípido-disacárido. GumH codifica a enzima glucosiltransferasa III, que cataliza la adición del primer resto de manosa para formar el lípido-trisacárido. GumK codifica la enzima glucosiltransferasa IV, que cataliza la adición de un resto de ácido glucurónico para formar el lípido-tetrasacárido. GumI codifica la enzima glucosiltransferasa V, que cataliza la adición de un segundo resto manosa para formar el lípido-pentasacárido. GumF codifica la enzima acetiltransferasa I, que cataliza la acetilación del resto interno de manosa. GumG codifica la enzima acetiltransferasa II, que cataliza la acetilación del resto externo de manosa. Finalmente, gumL codifica la enzima piruvato cetal tranferasa que cataliza la piruvilación del resto externo de manosa. GumB, C y E están implicadas en la polimerización y secreción del EPS a través de la membrana bacteriana mientras que gumJ se piensa que está implicado en una fase paralela de polimerización y secreción del EPS. (Ielpi et al., 1992 más arriba; Ielpi et al., 1993 más arriba).

La goma xantana tiene una amplia aplicación comercial como un agente que confiere viscosidad a las soluciones acuosas. Se usa tanto en las industrias alimentarias como no alimentarias y también es un estabilizador de suspensiones, emulsiones, y espumas. Se ha visto que las cepas mutantes de Xanthomonas defectuosas en la ruta de biosíntesis de goma xantana sintetizan y polimerizan gomas xantanas con estructuras variantes, con propiedades reológicas similares y diferentes viscosidades (Hassler y Doherty, 1990, Biotechnical Prog 6:182-187). La acetilación y la piruvilación pueden afectar a las propiedades viscométricas de la goma xantana. La presencia de piruvato aumenta la viscosidad, mientras que el acetato disminuye la viscosidad (Hassler y Doherty, más arriba). La eliminación de restos de azúcar de las cadenas laterales de la goma xantana también afecta a la viscosidad. En comparación con la goma Xantana tipo salvaje, los polímeros sin la manosa terminal (politetrámeros) son malos agentes que confieren viscosidad. Por el contrario, los polímeros sin los restos de manosa terminal ni el ácido glucurónico (politrímeros) son agentes que confieren viscosidad superiores (Hassler y Doherty, más arriba). Un tetrámero no acetilado y acetilado, ambos sin el resto de manosa terminal de la cadena lateral y en el primer caso sin un grupo acetato en su resto de manosa interna mostraron viscosidad superior (en el primer caso) y menor viscosidad (en el segundo caso) cuando se compararon con una bacteria salvaje (Levy et al., 1996, Biopolimers 38:251-272). Una diferencia conformacional principal entre las viscosidades superiores e inferiores es la aumentada cantidad de estructura helicoide abierta y el aumento en la flexibilidad de alta viscosidad de la cadena lateral (Levy et al., 1996, Biopolymers 38:251-272).

La goma xantana también se ha usado como estabilizante de fármacos, para mejorar la absorción de fármacos, para retrasar la liberación del fármaco y también se puede usar en formulaciones de liberación controlada (Talukdar et al., 1996, J Phar Sci 185:537-540). En combinación con la goma xantana, la alfa-ciclodextrina reducía el metabolismo de primer paso de la morfina en la mucosa rectal y por el hígado, y se mostró que mejora la biodisponibilidad aparente rectal del opioide en aproximadamente 4 veces (Kondo et al., 1996, Biol. Pharm Bull 19:280-286). La goma xantana-alginato se ha usado para la encapsulación de enzimas. Las esferas de goma xantana-alginato mostraban 75% de actividad máxima de ureasa incluso tras 20 usos repetidos en condiciones óptimas (Elçin, 1995, Biomaterial 16:1157-1161).

Los supositorios de hidrogel de liberación sostenida preparados con fibras dietéticas solubles en agua, goma xantana y goma garrofín han mostrado sostener la liberación de fármacos durante un tiempo mucho más largo que los supositorios convencionales. El tiempo medio de residencia era superior, sin una disminución en el área bajo la concentración de plasma frente a la curva del tiempo. Estudios histopatológicos mostraron buena seguridad biológica de los supositorios de hidrogel en la mucosa rectal. Estos resultados sugieren que los supositorios de hidrogel IMC preparados con goma xantana y goma garrofín fueron una preparación rectal práctica que tiene acción prolongada y efectos secundarios reducidos (Watanabe et al., 1993, Bio Pharm Bull 16:391-394).

El ritmo aparente de liberación de prednisolona a partir de los hidrogeles preparados con goma xantana disminuyó con el aumento de la concentración de la goma, sugiriendo que la difusión de las moléculas de fármaco estaba controlada principalmente por la densidad de la estructura de red tridimensional en la matriz. Estos resultados indicaban que la liberación del fármaco podría estar controlada no sólo por la densidad de la estructura de red, sino también por la viscosidad microscópica de los hidrogeles (Watanabe et al., 1992, Chem Pharm Bull 40:459-462).

Se ha visto que un complejo de neomicina-furazolidona-goma xantana aumenta la actividad antimicrobiana del fármaco (Dumitriu et al., 1993, J. Biomater 7:256-276).

También se ha visto que la goma xantana atenúa la diabetes mellitus. La administración de goma xantana disminuyó la glucosa sérica en ayunas y tras la alimentación y redujo los niveles en ayuno del colesterol plasmático total en individuos diabéticos. La goma xantana también tendía a disminuir los niveles en ayuno y tras alimentación de la gastrina y del péptido inhibidor gástrico (PIG) y los niveles en ayuno de VLDL y triglicéridos totales y del colesterol en las fracciones VLDL y LDL. Los individuos mostraron una sensación de plenitud tras consumir magdalenas con goma xantana, pero no síntomas digestivos severos (Osilesi et al., 1985, Am J Clin Nutr 42:597-603).

Se han asociado varios factores con la patogenicidad de bacterias fitopategénicas, que incluyen la producción de enzimas extracelulares, la producción de exopolisacáridos, la producción de toxinas y fitohormonas junto con factores que median interacciones específicas de plantas patógenas (Agrios, 1988, Plant Pathology, 3a edición, Academic Press; Alippi, 1992, Agronomie 12:115-122). El papel de EPSs en la patogenicidad de varias bacterias es bien conocido. Están asociados con (i) muerte celular debido a oclusión de los vasos del xilema, (ii) lesiones mucoides y (iii) ayudan a la interacción planta/patógeno y al crecimiento bacteriano en los tejidos de la planta.

Varios grupos han investigado el papel de la goma xantana en la patogenicidad de Xanthomonas. Aunque se creyó durante mucho tiempo que la goma xantana es clave en la patogenicidad, muchos autores no han tenido éxito para demostrar un enlace directo entre este EPS y la patogenicidad (Kamoun y Kado, 1990, J. Becteriol 172:5165-5172). Recientemente, se ha demostrado que la deleción de gumD (Chou et al., 1997, Biochem Biophys Res. Común 233:265-269) o alteraciones en las etapas tardías de la biosíntesis de la goma xantana (Katzen et al., 1998, J. Bacteriol 180:1607-1617) reducía la virulencia que causa la raíz negra en el brócoli y disminuía la agresividad de Xanthomonas frente a plantas. Aunque son bien conocidos los síntomas de la infección por X. fastidiosa en los naranjos, por ejemplo, clorosis de las hojas, síntomas de deficiencia nutricional, reducido tamaño de los frutos, etc. (DeNegri, 1990, Com. Tec. No. 82, Ext. Rural, Cats, Compinas, Malavolta et al., 1990, Cordeiripolis, v. 11, n. 1, p. 15-18), el mecanismo por el que la bacteria causa la enfermedad es desconocido. La infección bacteriana depende de los insectos vector tales como Oncometopia fecialis, Acrogonia terminalis y Dilobopterus costalimai (Gravena, et al., 1997, "Os vetores de Xylella fastidiosa In: Clorose Variegada do Citros"). Estos insectos, cuando se alimentan de nutrientes del xilema, introducen la bacteria en los vasos, donde la bacteria crece meticulosamente (Lopes et al., 1996, "Xylella fastidiosa", Fitopathologin Brasileira, Brasilia v. 21, Suplemento p. 343; Roberto et al., 1996, Fitopatología Brasileira, Brasilia v. 21, n. 4m p. 517-18). El EPS sintetizado por el operón XfGUM, que es una característica de la invención, podría estar directamente implicado en la patogenicidad que causa la Clorosis Multicolor del Cítrico en naranjos y otras enfermedades en plantas, tales como plantas del café y plantas de la uva.

Compendio de la invención

La invención se refiere, en parte, a una molécula de ácido nucleico de aproximadamente 12710 nucleótidos que codifica los miembros del operón XfGUM, incluyendo genes para xfgumB, xfgumC, xfgumD, xfgumE, xfgumF, xfgumH, xfgumJ, xfgumK y xfgumM y los usos de dichos operones, así como las proteínas codificadas por los mismos. Estos pueden usarse, por ejemplo, para controlar las enfermedades de los naranjos, tales como la Clorosis Multicolor del Cítrico (CMC) y enfermedades causadas por la bacteria en otras plantas. Los EPS producidos por las enzimas codificadas por el operón XfGUM pueden causar las enfermedades al ocluir los vasos del xilema, o al participar en el mecanismo de la infección, adhesión y propagación bacteriana; sin embargo, los solicitantes no se limitan a sí mismos a una sola teoría de funcionamiento. La invención también se relaciona con el uso de componentes del operón XfGUM para la producción de exopolisacáridos, la utilidad para la aplicación industrial y/o médica de esta nueva goma y las variantes estructurales de la goma, usando Xylella fastidiosa o cualquier otra bacteria como hospedador.

La invención se basa en un número de descubrimientos no anticipados y sorprendentes. Uno es el descubrimiento de una secuencia de ADN de 12710 nucleótidos en el genoma de la bacteria fitopatogénica Xylella fastidiosa. Anteriormente se ha encontrado un operón GUM de goma xantana sólo en Xanthomonas campestris. Otro es el descubrimiento de que el operón XfGUM carece de genes gumI, gumG y gumL, que codifican las enzimas glucosiltransferasa V, acetiltransferasa II y piruvato cetal transferasa, respectivamente. La ausencia de estos genes indica que el operón XfGUM codifica las enzimas necesarias para sintetizar un exopolisacárido compuesto por unidades tetraméricas que consisten en glucosa, glucosa, manosa y ácido glucurónico y que, en vista de la ausencia de los genes que codifican la acetiltransferasa II y la piruvato cetal transferasa, el tetrasacárido resultante no está piruvilado del todo y, como se demostró para Xanthomonas, su manosa puede estar sólo parcialmente acetilada. Estos descubrimientos indican que XfGUM codifica las enzimas que producen una nueva goma con nuevas propiedades reológicas y químicas.

La invención incluye, Inter. alia, (a) secuencias nucleotídicas que contienen las regiones estructurales y reguladoras del operón XfGUM que codifica las enzimas glucosiltransferasa I, glucosiltransferasa II, glucosiltransferasa III, glucosiltransferasa IV, y acetiltransferasa I, así como las proteínas denominadas en lo sucesivo GUMB, GUMC, GUME, y GUMJ; (b) la expresión de dichas secuencias nucleotídicas en células; (c) las enzimas, proteínas, y formas activas de las mismas aisladas, así como mutantes, fragmentos y proteínas de fusión; (d) los usos de las enzimas y/o proteínas codificadas por el Operón de tipo GUM en métodos de escrutinio para identificar compuestos que son útiles para controlar enfermedades causadas por Xylella fastidiosa y/o organismos relacionados; (e) la construcción de hospedadores bacterianos para expresar las enzimas y/o proteínas codificadas por XfGUM; y (f) el uso de los hospedadores construidos que expresan las enzimas y/o proteínas codificadas por XfGUM para producir el exopolisacárido para aplicaciones industriales y/o médicas, y para uso animal, incluyendo seres humanos.

Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1A-1I comparan las secuencias de aminoácidos deducidas de las proteínas de la invención con proteínas homólogas de Xanthomonas campestris.

La Figura 2 representa una ruta biosintética propuesta usando los componentes de la invención.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico de aproximadamente 12710 nucleótidos del genoma de Xylella fastidiosa que codifica el operón XfGUM que comprende genes xfgumB, xfgumC, xfgumD, xfgumE, xfgumF, xfgumH, xfgumJ, xfgumK, y xfguM y los usos de dicho operón, tanto el ADN como las proteínas que codifica, para el control de la enfermedad Clorosis Multicolor del Cítrico (CMC) del naranjo o enfermedades relacionadas causadas por la bacteria en otras plantas, tales como robles y parras.

La siguiente definición se proporciona para retirar cualquier ambigüedad potencial con la intención o alcance de su uso en la memoria descriptiva y las reivindicaciones.

"Similitud", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a identidad de secuencia nucleotídicas. Se dice que una secuencia es 70% similar a otra si, tras una alineación global, el 70% de los nucleótidos de la secuencia más pequeña son idénticos a los nucleótidos correspondientes de la otra secuencia. Las alineaciones globales se hacen por medio de programación dinámica (Thompson JD et al. (1997). Nucleic Acid Res. 25, 4876-4882 incorporado aquí por referencia). Esto garantiza una alineación matemática óptima que asigna un valor para apareamientos y desapareamientos entre todos los nucleótidos y penalizaciones para inserciones o deleciones de diferentes longitudes. Los números típicos son de una puntuación de 1,9 para un apareamiento, 0 para un desapareamiento, 15 para abrir un hueco y 6,66 para extender este hueco.

Ejemplo 1

Se preparó una cosmoteca a partir de ADN total de Xylella fastidiosa, usando técnicas clásicas, que incluyen la digestión del ADN con la enzima de restricción BamHI. Se seleccionaron como los más relevantes aquellos fragmentos que tenían un intervalo de aproximadamente 35-45 kilobases. Se preparó un mapa de hibridación, y se revisó para seleccionar los cósmidos que no solapaban. Tras la selección, los cósmidos que no solapaban se secuenciaron usando la aproximación de perdigonada reconocida en el estado de la técnica. Se seleccionó un cósmido, en vista de la similitud con las secuencias de Xanthomonas spp. Se aisló un fragmento de aproximadamente 12710 nucleótidos y se estudió con más detalle.

Ejemplo 2

Los estudios detallados mencionados en el ejemplo 1, más arriba, incluían la comparación del fragmento de 12710 nucleótidos con el operón GUM conocido de Xanthomonas campestris. Se ha descrito que el operón conocido contiene 12 genes; sin embargo, el operón aquí descrito parece que sólo contiene nueve, es decir, contiene genes con alguna homología a gumB, C, D, E, F, H, J, K, y M; sin embargo no se encontraron secuencias homólogas a gumG, I o L.

Con el fin de distinguir los dos grupos de genes, aquellos que son una parte de la invención se describirán en lo sucesivo como genes "xfgum", y el operón se denominará "XfGUM".

Las secuencias nucleotídicas de xfgumB, C, D, E, F, H, J, K y M se muestran en SEQ ID NOs: 1-9, respectivamente. El operón XfGUM completo se muestra en SEQ ID NO: 10.

Las secuencias aminoacídicas putativas codificadas por los denominados genes xfgum se muestran en SEQ ID NOs: 11-19. Estas se compararon con las secuencias aminoacídicas comparables para Xanthomonas campestris. En las figuras 1A-1I, se presenta el análisis de homología, usando las abreviaturas "GUMBXf, GUMCXf", etc., para las proteínas de la invención, y "GUMBXc, GUMCXc", etc., para las proteínas de X. campestris.

Ejemplo 3

La homología de las secuencias de Xylella fastidiosa con las secuencias de Xanthomonas campestris llevaron a conclusiones sobre las funciones de las proteínas codificadas, y a un mecanismo propuesto para la síntesis del producto de tipo goma xantana por Xylella fastidiosa, que se presenta en la Figura 2. Específicamente, xfgumD codifica un homólogo de glucosiltransferasa I, implicado en la adición de un primer resto de glucosa vía transferencia de glucosa-1-fosfato a partir de UDP-glucosa a un vehículo de fosfato de isoprenol, dando como resultado el monosacárido lípido. La siguiente etapa en la síntesis implica la adición de un segundo resto de glucosa vía un homólogo de glucosiltransferasa II, codificado por xfgumM, para formar un disacárido lípido. Tras esto, se cree que un homólogo de glucosiltransferasa III codificado por xfgumH añade un resto de manosa para formar el trisacárido, tras el cual, un homólogo de glucosiltransferasa IV codificado por xfgumK añade un resto de ácido glucurónico, para formar el tetrasacárido. El gen xfgumF codifica un homólogo de acetiltransferasa I, que cataliza la acetilación del resto de manosa tal como se denominó más arriba. Las proteínas codificadas por xfgumB, C y E parece que están implicadas en la secreción del EPS de tipo goma xantana a través de las membranas bacterianas, mientras que la proteína codificada por xfgumJ parece estar implicada en la polimerización y secreción del EPS de tipo goma xantana.

Tal como se mencionó más arriba, el operón XfGUM carece de componentes que corresponden a genes GUMG, I y L de Xanthomonas spp., que codifican acetiltransferasa II, glucosiltransferasa V, y piruvato transferasa. Esto sugiere que los EPS producidos por Xylella fastidiosa consisten en unidades tetraméricas de glucosa-glucosa-manosa-ácido glucurónico, donde estos tetrámeros no están piruvilados, y están acetilados en su totalidad o en parte.

Hassler et al., Biotechnol Proj, 6:182-187 (1990), y Levy et al., Biopolymers 38:251-272 (1996), indican que las cepas mutantes de Xanthomonas, que son defectuosas en una o más etapas de la ruta biosintética de la goma xantana, sintetizan variantes estructurales de las gomas xantanas, que tienen propiedades químicas que difieren de otras y de las gomas xantanas clásicas. Tanto la acetilación como la piruvilación son conocidos como procesos que afectan a las propiedades viscométricas de la goma xantana. El piruvato aumenta la viscosidad, y el acetato la disminuye. Además, cuando la manosa terminal está ausente, la viscosidad disminuye. Los tetrámeros no acetilados que carecen de la manosa terminal de la cadena lateral tienen viscosidad superior. Esta observación previa sugiere que el EPS descrito en la presente memoria tendrá propiedades que difieren de las gomas xantanas previamente identificadas.

La descripción precedente, incluyendo ejemplos, describe características de la invención. Estas incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican cualquiera y todas las proteínas xfgum descritas en la presente memoria, que incluyen GUMxfB, C, D, E, F, H, J, K y M, así como las proteínas en sí. Especialmente preferidas son aquellas moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden o consisten en las secuencias nucleotídicas de SEQ ID NOs: 1-9, y las moléculas de ácido nucleico que difieren de las mismas pero, en vista de la degeneración del código genético, todavía codifican las proteínas que tienen secuencias aminoacídicas representadas en SEQ ID NOs: 11-19.

Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la invención pueden estar incluidas en vectores de expresión, de forma que las moléculas de ácido nucleico están en enlace operativo con un promotor. De acuerdo con esta característica de la invención, más de una de las moléculas de ácido nucleico descritas y reivindicadas en la presente memoria pueden estar incluidas en el vector de expresión. En la presente memoria se describen nueve familias de moléculas de ácido nucleico. Cualquiera o todas las combinaciones de estas pueden ser una parte de estos vectores de expresión. En otras palabras, las combinaciones de 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 de las moléculas de ácido nucleico pueden ser una parte de estos vectores, así como vectores de expresión que incluyen las 9, o sólo 1.

También, una parte de la invención son células recombinantes, tales como cepas recombinantes de células procarióticas, y líneas recombinantes de células eucarióticas, que han sido transformadas o transfectadas con una o más de las moléculas de ácido nucleico aisladas o vectores de expresión recombinantes de la invención.

También, una parte de la invención, como se describe en la presente memoria, es el operón XfGUM aislado. Una realización preferida es la que se representa en SEQ ID NO: 10; sin embargo, se entenderá que la declaración con respecto a la degeneración del código genético arriba mencionado también se aplica aquí. Además, con respecto al operón, así como las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente memoria, los principios del uso preferido de codones se aplican con respecto al uso de las moléculas de ácido nucleico para transformar y tranfectar las células.

Como se indica más arriba, también una característica de la invención son las proteínas codificadas por las moléculas de ácido nucleico aisladas. Estas proteínas tienen actividad enzimática, tal como se describe en la presente memoria. Además, estas se pueden usar como inmunógenos para generar anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales, que se pueden usar tal como se describe más abajo. Además, estas proteínas se pueden producir en varias formas recombinantes, incluyendo proteínas de fusión, en formas activas que consisten en menos de la secuencia aminoacídica de la proteína, y etc. Por ejemplo, es bien conocido que las enzimas están compuestas por varios dominios estructurales, que incluyen uno o más sitios activos. Dichos sitios activos son una parte de la invención, y comprenden menos de la secuencia aminoacídica de la proteína.

Tal como se indicó, las proteínas de la invención se pueden usar para preparar moléculas de tipo goma xantana, tales como aquellas ilustradas en la Figura 2, es decir:

[glucosa-glucosa-manosa-ácido glucurónico]n.

Donde n es un número natural de 1 a aproximadamente 5000, preferiblemente de aproximadamente 300 a aproximadamente 5000, lo más preferiblemente de aproximadamente 1500-3000.

Esta estructura puede estar acetilada; sin embargo, tal como se indica más arriba, cuando se hace vía un proceso que comprende el uso de las enzimas que son una parte de esta invención, la estructura del tetrasacárido resultante difiere de las gomas xantanas conocidas en el hecho de que no está completamente acetilado o piruvilado. Los compuestos descritos más arriba, pueden estar polimerizados vía procesos intracelulares o extracelulares.

El aislamiento y caracterización del operón XfGUM permite determinar al experto en la materia qué sustancias actúan como inhibidores o activadores del operón como un conjunto, o como miembros individuales del operón. Como se indicó más arriba, los productos del tipo goma xantana de la invención tienen varios usos industriales, y la determinación de los activadores y/o agonista permite al experto aumentar la producción de los materiales bajo condiciones apropiadas, tales como cultivo de laboratorio de Xylella fastidiosa, o células transformadas o transfectadas que producen el compuesto de tipo goma xantana. "En el campo" donde, es deseable inhibir o antagonizar X. fastidiosa, y el operón y las moléculas de ácido nucleico de la invención permiten al experto identificar materiales que son útiles para inhibir el organismo.

Otras facetas de la invención serán evidentes para el experto en la materia, y no es necesario elaborarlas aquí.

Los términos y expresiones que han sido empleados se usan como términos de descripción y no como limitación, y no hay intención, en el uso de dichos términos y expresiones, de excluir cualquier equivalente de las características mostradas y descritas o porciones de las mismas, reconociéndose que son posibles varias modificaciones dentro del alcance de la invención.

Claims (14)

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia nucleotídica que codifica al menos una proteína, cuya secuencia de aminoácidos está representada en SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, o 19, o una secuencia nucleotídica que tiene al menos 70% de identidad total de la misma.

2. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, que codifica todas las proteínas, cuyas secuencias aminoacídicas están representadas en SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 y 19.

3. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, que comprende al menos una de las secuencias nucleotídicas representadas en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9.

4. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 2, que comprende la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 10.

5. Vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 ó 2, unida de forma operativa a un promotor.

6. Célula bacteriana distinta de la de Xylella fastidiosa o célula eucariótica recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 ó 2.

7. Célula recombinante que comprende el vector de expresión de la reivindicación 5.

8. Proteína aislada que comprende la secuencia aminoacídica representada en SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19.

9. Proteína aislada que consiste en la secuencia aminoacídica representada en SE ID NOs: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19.

10. Anticuerpo que se une específicamente a la proteína aislada de la reivindicación 9.

11. Un proceso para hacer un compuesto de fórmula:

[glucosa-glucosa-manosa-ácido glucurónico]n

donde n es un número natural de 1 a aproximadamente 5000, que comprende cultivar una célula que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 2, y aislar dicho compuesto tras la producción del mismo por dicha célula.

12. El proceso de la reivindicación 11, donde dicha célula es Xylella fastidiosa.

13. El proceso de la reivindicación 11, donde dicha célula es una célula recombinante.

14. Un proceso para determinar el efecto de una sustancia sobre un miembro del operón XfGUM, que comprende poner en contacto una célula que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 2 con dicha sustancia, y determinar el efecto de dicha sustancia sobre la producción de un compuesto de fórmula [glucosa-glucosa-manosa (Ac)-ácido glucurónico]n

donde n es un número natural de 1 a aproximadamente 5000.