ES2327389T3 - Operon de caucho aislado de xylella fastidiosa, moleculas de acido nucleico aisladas del mismo, y usos del mismo. - Google Patents
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Abstract
Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia nucleotídica que codifica al menos una proteína, cuya secuencia de aminoácidos está representada en SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, o 19, o una secuencia nucleotídica que tiene al menos 70% de identidad total de la misma.
Description
Operón de caucho aislado de Xylella
fastidiosa, moléculas de ácido nucleico aisladas del mismo, y
usos del mismo.
Esta invención se refiere al aislamiento de un
operón del microorganismo Xylella fastidiosa. Más
particularmente, se refiere al aislamiento de dicho operón que
comprende nueve genes, denominados en adelante "xfgum B, C, D, E,
F, H, J, K, y M". También, una parte de la invención son las
moléculas de ácido nucleico aisladas para cada uno de estos 9 genes
por separado. También, una parte de la invención son los vectores de
expresión que comprenden el operón, o uno o más de los genes
componente, en unión operativa con un promotor, células
recombinantes que incluyen el operón o uno o más de los genes, el
producto de expresión de estos genes, y varios usos de los
mismos.
La goma Xantana es un exopolisacárido
("EPS" en adelante) producido por la bacteria fitopatogénica
Xanthomonas campestris (Ielpi et al., 1981, FEBS Lett.
130:253-256). La biosíntesis de este polisacárido
extracelular en X. Campestris está dirigida por un grupo de
12 genes, gumB-gumM (Becker et al.,
1998, Appl Microbiol Biotechnol, 50:145-152; Vojnov
et al., 1998, Microbiology 144:487-493). Está
compuesto por unidades repetidas de pentasacárido polimerizado que
están ensambladas por la adición secuencial de
glucosa-1-fosfato, glucosa, manosa,
ácido glucurónico, y manosa sobre un vehículo de fosfato de
poliprenol (Ielpi et al., 1992, J. Bacteriol.
175:2490-2500). La unidad repetitiva de
pentasacárido también está O-acetilada y piruvilada
en varios grados (Ielpi et al., 1993, J. Bacteriol.
175:2490-2500).
La transformación con un grupo de genes que
lleva gumB y gumC restauró la producción de goma
xantana en mutantes deficientes, sugiriendo que gumB y
gumC están implicados en la translocación de la goma xantana
a través de la membrana bacteriana (Vojnol et al., 1998,
Microbiology 144:487-493).
Dos grupos de genes están implicados en la
biosíntesis de xantana: los genes xpsIII, xps IV y xps
VI, que son responsables de la síntesis de
UDP-glucosa, ácido UDP-glucurónico y
GDP-manosa, respectivamente (Harding et al.,
J. Bacteriol. 196:2854-2861); Harding et al.,
J. Gen Micobiol 139:447-457 (1993); Hötte et
al., 1999; Köplin et al, J. Bacteriol
174:191-199 (1992), 1992) y los genes gum y
xpsI, que codifican las enzimas implicadas en la
polimerización del pentasacárido unido a fosfato de poliprenol y la
secreción del EPS al medio extracelular (Ielpi et al., 1992;
más arriba Ielpi et al., 1993 más arriba).
Los genes gum de X. campestris
están agrupados en un operón (operón GUM) de aproximadamente 16 Kb
de longitud, que contiene 12 genes denominados gumB, C, D, E, F,
G, H, I, J, K, L y M. El gen gumD codifica la
enzima glucosiltransferasa I, responsable de la transferencia de la
glucosa-1-fosfato de
UDP-glucosa al vehículo de fosfato de poliprenol
para formar el lípido-monosacárido. GumM
codifica la enzima glucosiltransferasa II, que cataliza la adición
del segundo resto de glucosa para formar el
lípido-disacárido. GUM codifica la enzima
glucosiltransferasa II, que cataliza la adición del segundo resto de
manosa para formar el lípido-disacárido. GumH
codifica a enzima glucosiltransferasa III, que cataliza la adición
del primer resto de manosa para formar el
lípido-trisacárido. GumK codifica la enzima
glucosiltransferasa IV, que cataliza la adición de un resto de
ácido glucurónico para formar el
lípido-tetrasacárido. GumI codifica la enzima
glucosiltransferasa V, que cataliza la adición de un segundo resto
manosa para formar el lípido-pentasacárido.
GumF codifica la enzima acetiltransferasa I, que cataliza la
acetilación del resto interno de manosa. GumG codifica la
enzima acetiltransferasa II, que cataliza la acetilación del resto
externo de manosa. Finalmente, gumL codifica la enzima piruvato
cetal tranferasa que cataliza la piruvilación del resto externo de
manosa. GumB, C y E están implicadas en la
polimerización y secreción del EPS a través de la membrana
bacteriana mientras que gumJ se piensa que está implicado en
una fase paralela de polimerización y secreción del EPS. (Ielpi
et al., 1992 más arriba; Ielpi et al., 1993 más
arriba).
La goma xantana tiene una amplia aplicación
comercial como un agente que confiere viscosidad a las soluciones
acuosas. Se usa tanto en las industrias alimentarias como no
alimentarias y también es un estabilizador de suspensiones,
emulsiones, y espumas. Se ha visto que las cepas mutantes de
Xanthomonas defectuosas en la ruta de biosíntesis de goma
xantana sintetizan y polimerizan gomas xantanas con estructuras
variantes, con propiedades reológicas similares y diferentes
viscosidades (Hassler y Doherty, 1990, Biotechnical Prog
6:182-187). La acetilación y la piruvilación pueden
afectar a las propiedades viscométricas de la goma xantana. La
presencia de piruvato aumenta la viscosidad, mientras que el acetato
disminuye la viscosidad (Hassler y Doherty, más arriba). La
eliminación de restos de azúcar de las cadenas laterales de la goma
xantana también afecta a la viscosidad. En comparación con la goma
Xantana tipo salvaje, los polímeros sin la manosa terminal
(politetrámeros) son malos agentes que confieren viscosidad. Por el
contrario, los polímeros sin los restos de manosa terminal ni el
ácido glucurónico (politrímeros) son agentes que confieren
viscosidad superiores (Hassler y Doherty, más arriba). Un
tetrámero no acetilado y acetilado, ambos sin el resto de manosa
terminal de la cadena lateral y en el primer caso sin un grupo
acetato en su resto de manosa interna mostraron viscosidad superior
(en el primer caso) y menor viscosidad (en el segundo caso) cuando
se compararon con una bacteria salvaje (Levy et al., 1996,
Biopolimers 38:251-272). Una diferencia
conformacional principal entre las viscosidades superiores e
inferiores es la aumentada cantidad de estructura helicoide abierta
y el aumento en la flexibilidad de alta viscosidad de la cadena
lateral (Levy et al., 1996, Biopolymers
38:251-272).
La goma xantana también se ha usado como
estabilizante de fármacos, para mejorar la absorción de fármacos,
para retrasar la liberación del fármaco y también se puede usar en
formulaciones de liberación controlada (Talukdar et al.,
1996, J Phar Sci 185:537-540). En combinación con la
goma xantana, la alfa-ciclodextrina reducía el
metabolismo de primer paso de la morfina en la mucosa rectal y por
el hígado, y se mostró que mejora la biodisponibilidad aparente
rectal del opioide en aproximadamente 4 veces (Kondo et al.,
1996, Biol. Pharm Bull 19:280-286). La goma
xantana-alginato se ha usado para la encapsulación
de enzimas. Las esferas de goma xantana-alginato
mostraban 75% de actividad máxima de ureasa incluso tras 20 usos
repetidos en condiciones óptimas (Elçin, 1995, Biomaterial
16:1157-1161).
Los supositorios de hidrogel de liberación
sostenida preparados con fibras dietéticas solubles en agua, goma
xantana y goma garrofín han mostrado sostener la liberación de
fármacos durante un tiempo mucho más largo que los supositorios
convencionales. El tiempo medio de residencia era superior, sin una
disminución en el área bajo la concentración de plasma frente a la
curva del tiempo. Estudios histopatológicos mostraron buena
seguridad biológica de los supositorios de hidrogel en la mucosa
rectal. Estos resultados sugieren que los supositorios de hidrogel
IMC preparados con goma xantana y goma garrofín fueron una
preparación rectal práctica que tiene acción prolongada y efectos
secundarios reducidos (Watanabe et al., 1993, Bio Pharm Bull
16:391-394).
El ritmo aparente de liberación de prednisolona
a partir de los hidrogeles preparados con goma xantana disminuyó
con el aumento de la concentración de la goma, sugiriendo que la
difusión de las moléculas de fármaco estaba controlada
principalmente por la densidad de la estructura de red
tridimensional en la matriz. Estos resultados indicaban que la
liberación del fármaco podría estar controlada no sólo por la
densidad de la estructura de red, sino también por la viscosidad
microscópica de los hidrogeles (Watanabe et al., 1992, Chem
Pharm Bull 40:459-462).
Se ha visto que un complejo de
neomicina-furazolidona-goma xantana
aumenta la actividad antimicrobiana del fármaco (Dumitriu et
al., 1993, J. Biomater 7:256-276).
También se ha visto que la goma xantana atenúa
la diabetes mellitus. La administración de goma xantana disminuyó
la glucosa sérica en ayunas y tras la alimentación y redujo los
niveles en ayuno del colesterol plasmático total en individuos
diabéticos. La goma xantana también tendía a disminuir los niveles
en ayuno y tras alimentación de la gastrina y del péptido inhibidor
gástrico (PIG) y los niveles en ayuno de VLDL y triglicéridos
totales y del colesterol en las fracciones VLDL y LDL. Los
individuos mostraron una sensación de plenitud tras consumir
magdalenas con goma xantana, pero no síntomas digestivos severos
(Osilesi et al., 1985, Am J Clin Nutr
42:597-603).
Se han asociado varios factores con la
patogenicidad de bacterias fitopategénicas, que incluyen la
producción de enzimas extracelulares, la producción de
exopolisacáridos, la producción de toxinas y fitohormonas junto con
factores que median interacciones específicas de plantas patógenas
(Agrios, 1988, Plant Pathology, 3a edición, Academic Press; Alippi,
1992, Agronomie 12:115-122). El papel de EPSs en la
patogenicidad de varias bacterias es bien conocido. Están asociados
con (i) muerte celular debido a oclusión de los vasos del xilema,
(ii) lesiones mucoides y (iii) ayudan a la interacción
planta/patógeno y al crecimiento bacteriano en los tejidos de la
planta.
Varios grupos han investigado el papel de la
goma xantana en la patogenicidad de Xanthomonas. Aunque se
creyó durante mucho tiempo que la goma xantana es clave en la
patogenicidad, muchos autores no han tenido éxito para demostrar un
enlace directo entre este EPS y la patogenicidad (Kamoun y Kado,
1990, J. Becteriol 172:5165-5172). Recientemente,
se ha demostrado que la deleción de gumD (Chou et al.,
1997, Biochem Biophys Res. Común 233:265-269) o
alteraciones en las etapas tardías de la biosíntesis de la goma
xantana (Katzen et al., 1998, J. Bacteriol
180:1607-1617) reducía la virulencia que causa la
raíz negra en el brócoli y disminuía la agresividad de
Xanthomonas frente a plantas. Aunque son bien conocidos los
síntomas de la infección por X. fastidiosa en los naranjos,
por ejemplo, clorosis de las hojas, síntomas de deficiencia
nutricional, reducido tamaño de los frutos, etc. (DeNegri, 1990,
Com. Tec. No. 82, Ext. Rural, Cats, Compinas, Malavolta et
al., 1990, Cordeiripolis, v. 11, n. 1, p.
15-18), el mecanismo por el que la bacteria causa la
enfermedad es desconocido. La infección bacteriana depende de los
insectos vector tales como Oncometopia fecialis,
Acrogonia terminalis y Dilobopterus costalimai
(Gravena, et al., 1997, "Os vetores de Xylella
fastidiosa In: Clorose Variegada do Citros"). Estos
insectos, cuando se alimentan de nutrientes del xilema, introducen
la bacteria en los vasos, donde la bacteria crece meticulosamente
(Lopes et al., 1996, "Xylella fastidiosa",
Fitopathologin Brasileira, Brasilia v. 21, Suplemento p. 343;
Roberto et al., 1996, Fitopatología Brasileira, Brasilia v.
21, n. 4m p. 517-18). El EPS sintetizado por el
operón XfGUM, que es una característica de la invención, podría
estar directamente implicado en la patogenicidad que causa la
Clorosis Multicolor del Cítrico en naranjos y otras enfermedades en
plantas, tales como plantas del café y plantas de la uva.
La invención se refiere, en parte, a una
molécula de ácido nucleico de aproximadamente 12710 nucleótidos que
codifica los miembros del operón XfGUM, incluyendo genes para
xfgumB, xfgumC, xfgumD, xfgumE, xfgumF, xfgumH, xfgumJ,
xfgumK y xfgumM y los usos de dichos operones, así como
las proteínas codificadas por los mismos. Estos pueden usarse, por
ejemplo, para controlar las enfermedades de los naranjos, tales como
la Clorosis Multicolor del Cítrico (CMC) y enfermedades causadas
por la bacteria en otras plantas. Los EPS producidos por las
enzimas codificadas por el operón XfGUM pueden causar las
enfermedades al ocluir los vasos del xilema, o al participar en el
mecanismo de la infección, adhesión y propagación bacteriana; sin
embargo, los solicitantes no se limitan a sí mismos a una sola
teoría de funcionamiento. La invención también se relaciona con el
uso de componentes del operón XfGUM para la producción de
exopolisacáridos, la utilidad para la aplicación industrial y/o
médica de esta nueva goma y las variantes estructurales de la goma,
usando Xylella fastidiosa o cualquier otra bacteria como
hospedador.
La invención se basa en un número de
descubrimientos no anticipados y sorprendentes. Uno es el
descubrimiento de una secuencia de ADN de 12710 nucleótidos en el
genoma de la bacteria fitopatogénica Xylella fastidiosa.
Anteriormente se ha encontrado un operón GUM de goma xantana sólo en
Xanthomonas campestris. Otro es el descubrimiento de que el
operón XfGUM carece de genes gumI, gumG y gumL, que
codifican las enzimas glucosiltransferasa V, acetiltransferasa II y
piruvato cetal transferasa, respectivamente. La ausencia de estos
genes indica que el operón XfGUM codifica las enzimas necesarias
para sintetizar un exopolisacárido compuesto por unidades
tetraméricas que consisten en glucosa, glucosa, manosa y ácido
glucurónico y que, en vista de la ausencia de los genes que
codifican la acetiltransferasa II y la piruvato cetal transferasa,
el tetrasacárido resultante no está piruvilado del todo y, como se
demostró para Xanthomonas, su manosa puede estar sólo
parcialmente acetilada. Estos descubrimientos indican que XfGUM
codifica las enzimas que producen una nueva goma con nuevas
propiedades reológicas y químicas.
La invención incluye, Inter. alia, (a)
secuencias nucleotídicas que contienen las regiones estructurales y
reguladoras del operón XfGUM que codifica las enzimas
glucosiltransferasa I, glucosiltransferasa II, glucosiltransferasa
III, glucosiltransferasa IV, y acetiltransferasa I, así como las
proteínas denominadas en lo sucesivo GUMB, GUMC, GUME, y GUMJ; (b)
la expresión de dichas secuencias nucleotídicas en células; (c) las
enzimas, proteínas, y formas activas de las mismas aisladas, así
como mutantes, fragmentos y proteínas de fusión; (d) los usos de las
enzimas y/o proteínas codificadas por el Operón de tipo GUM en
métodos de escrutinio para identificar compuestos que son útiles
para controlar enfermedades causadas por Xylella fastidiosa
y/o organismos relacionados; (e) la construcción de hospedadores
bacterianos para expresar las enzimas y/o proteínas codificadas por
XfGUM; y (f) el uso de los hospedadores construidos que expresan
las enzimas y/o proteínas codificadas por XfGUM para producir el
exopolisacárido para aplicaciones industriales y/o médicas, y para
uso animal, incluyendo seres humanos.
Las Figuras 1A-1I comparan las
secuencias de aminoácidos deducidas de las proteínas de la invención
con proteínas homólogas de Xanthomonas campestris.
La Figura 2 representa una ruta biosintética
propuesta usando los componentes de la invención.
La presente invención se refiere a una molécula
de ácido nucleico de aproximadamente 12710 nucleótidos del genoma
de Xylella fastidiosa que codifica el operón XfGUM que
comprende genes xfgumB, xfgumC, xfgumD, xfgumE, xfgumF, xfgumH,
xfgumJ, xfgumK, y xfguM y los usos de dicho operón, tanto
el ADN como las proteínas que codifica, para el control de la
enfermedad Clorosis Multicolor del Cítrico (CMC) del naranjo o
enfermedades relacionadas causadas por la bacteria en otras plantas,
tales como robles y parras.
La siguiente definición se proporciona para
retirar cualquier ambigüedad potencial con la intención o alcance de
su uso en la memoria descriptiva y las reivindicaciones.
"Similitud", tal como se usa en la presente
memoria, se refiere a identidad de secuencia nucleotídicas. Se dice
que una secuencia es 70% similar a otra si, tras una alineación
global, el 70% de los nucleótidos de la secuencia más pequeña son
idénticos a los nucleótidos correspondientes de la otra secuencia.
Las alineaciones globales se hacen por medio de programación
dinámica (Thompson JD et al. (1997). Nucleic Acid Res. 25,
4876-4882 incorporado aquí por referencia). Esto
garantiza una alineación matemática óptima que asigna un valor para
apareamientos y desapareamientos entre todos los nucleótidos y
penalizaciones para inserciones o deleciones de diferentes
longitudes. Los números típicos son de una puntuación de 1,9 para un
apareamiento, 0 para un desapareamiento, 15 para abrir un hueco y
6,66 para extender este hueco.
Se preparó una cosmoteca a partir de ADN total
de Xylella fastidiosa, usando técnicas clásicas, que incluyen
la digestión del ADN con la enzima de restricción BamHI. Se
seleccionaron como los más relevantes aquellos fragmentos que
tenían un intervalo de aproximadamente 35-45
kilobases. Se preparó un mapa de hibridación, y se revisó para
seleccionar los cósmidos que no solapaban. Tras la selección, los
cósmidos que no solapaban se secuenciaron usando la aproximación de
perdigonada reconocida en el estado de la técnica. Se seleccionó un
cósmido, en vista de la similitud con las secuencias de
Xanthomonas spp. Se aisló un fragmento de aproximadamente
12710 nucleótidos y se estudió con más detalle.
Los estudios detallados mencionados en el
ejemplo 1, más arriba, incluían la comparación del fragmento de
12710 nucleótidos con el operón GUM conocido de Xanthomonas
campestris. Se ha descrito que el operón conocido contiene 12
genes; sin embargo, el operón aquí descrito parece que sólo contiene
nueve, es decir, contiene genes con alguna homología a gumB, C, D,
E, F, H, J, K, y M; sin embargo no se encontraron secuencias
homólogas a gumG, I o L.
Con el fin de distinguir los dos grupos de
genes, aquellos que son una parte de la invención se describirán en
lo sucesivo como genes "xfgum", y el operón se denominará
"XfGUM".
Las secuencias nucleotídicas de xfgumB, C, D, E,
F, H, J, K y M se muestran en SEQ ID NOs: 1-9,
respectivamente. El operón XfGUM completo se muestra en SEQ ID NO:
10.
Las secuencias aminoacídicas putativas
codificadas por los denominados genes xfgum se muestran en SEQ ID
NOs: 11-19. Estas se compararon con las secuencias
aminoacídicas comparables para Xanthomonas campestris. En
las figuras 1A-1I, se presenta el análisis de
homología, usando las abreviaturas "GUMBXf, GUMCXf", etc., para
las proteínas de la invención, y "GUMBXc, GUMCXc", etc., para
las proteínas de X. campestris.
La homología de las secuencias de Xylella
fastidiosa con las secuencias de Xanthomonas campestris
llevaron a conclusiones sobre las funciones de las proteínas
codificadas, y a un mecanismo propuesto para la síntesis del
producto de tipo goma xantana por Xylella fastidiosa, que se
presenta en la Figura 2. Específicamente, xfgumD codifica un
homólogo de glucosiltransferasa I, implicado en la adición de un
primer resto de glucosa vía transferencia de
glucosa-1-fosfato a partir de
UDP-glucosa a un vehículo de fosfato de isoprenol,
dando como resultado el monosacárido lípido. La siguiente etapa en
la síntesis implica la adición de un segundo resto de glucosa vía
un homólogo de glucosiltransferasa II, codificado por xfgumM, para
formar un disacárido lípido. Tras esto, se cree que un homólogo de
glucosiltransferasa III codificado por xfgumH añade un resto de
manosa para formar el trisacárido, tras el cual, un homólogo de
glucosiltransferasa IV codificado por xfgumK añade un resto de
ácido glucurónico, para formar el tetrasacárido. El gen xfgumF
codifica un homólogo de acetiltransferasa I, que cataliza la
acetilación del resto de manosa tal como se denominó más arriba. Las
proteínas codificadas por xfgumB, C y E parece que están implicadas
en la secreción del EPS de tipo goma xantana a través de las
membranas bacterianas, mientras que la proteína codificada por
xfgumJ parece estar implicada en la polimerización y secreción del
EPS de tipo goma xantana.
Tal como se mencionó más arriba, el operón XfGUM
carece de componentes que corresponden a genes GUMG, I y L de
Xanthomonas spp., que codifican acetiltransferasa II,
glucosiltransferasa V, y piruvato transferasa. Esto sugiere que los
EPS producidos por Xylella fastidiosa consisten en unidades
tetraméricas de
glucosa-glucosa-manosa-ácido
glucurónico, donde estos tetrámeros no están piruvilados, y están
acetilados en su totalidad o en parte.
Hassler et al., Biotechnol Proj,
6:182-187 (1990), y Levy et al., Biopolymers
38:251-272 (1996), indican que las cepas mutantes
de Xanthomonas, que son defectuosas en una o más etapas de la
ruta biosintética de la goma xantana, sintetizan variantes
estructurales de las gomas xantanas, que tienen propiedades químicas
que difieren de otras y de las gomas xantanas clásicas. Tanto la
acetilación como la piruvilación son conocidos como procesos que
afectan a las propiedades viscométricas de la goma xantana. El
piruvato aumenta la viscosidad, y el acetato la disminuye. Además,
cuando la manosa terminal está ausente, la viscosidad disminuye. Los
tetrámeros no acetilados que carecen de la manosa terminal de la
cadena lateral tienen viscosidad superior. Esta observación previa
sugiere que el EPS descrito en la presente memoria tendrá
propiedades que difieren de las gomas xantanas previamente
identificadas.
La descripción precedente, incluyendo ejemplos,
describe características de la invención. Estas incluyen moléculas
de ácido nucleico aisladas que codifican cualquiera y todas las
proteínas xfgum descritas en la presente memoria, que incluyen
GUMxfB, C, D, E, F, H, J, K y M, así como las proteínas en sí.
Especialmente preferidas son aquellas moléculas de ácido nucleico
aisladas que comprenden o consisten en las secuencias nucleotídicas
de SEQ ID NOs: 1-9, y las moléculas de ácido
nucleico que difieren de las mismas pero, en vista de la
degeneración del código genético, todavía codifican las proteínas
que tienen secuencias aminoacídicas representadas en SEQ ID NOs:
11-19.
Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la
invención pueden estar incluidas en vectores de expresión, de forma
que las moléculas de ácido nucleico están en enlace operativo con un
promotor. De acuerdo con esta característica de la invención, más
de una de las moléculas de ácido nucleico descritas y reivindicadas
en la presente memoria pueden estar incluidas en el vector de
expresión. En la presente memoria se describen nueve familias de
moléculas de ácido nucleico. Cualquiera o todas las combinaciones de
estas pueden ser una parte de estos vectores de expresión. En otras
palabras, las combinaciones de 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 de las moléculas
de ácido nucleico pueden ser una parte de estos vectores, así como
vectores de expresión que incluyen las 9, o sólo 1.
También, una parte de la invención son células
recombinantes, tales como cepas recombinantes de células
procarióticas, y líneas recombinantes de células eucarióticas, que
han sido transformadas o transfectadas con una o más de las
moléculas de ácido nucleico aisladas o vectores de expresión
recombinantes de la invención.
También, una parte de la invención, como se
describe en la presente memoria, es el operón XfGUM aislado. Una
realización preferida es la que se representa en SEQ ID NO: 10; sin
embargo, se entenderá que la declaración con respecto a la
degeneración del código genético arriba mencionado también se aplica
aquí. Además, con respecto al operón, así como las moléculas de
ácido nucleico descritas en la presente memoria, los principios del
uso preferido de codones se aplican con respecto al uso de las
moléculas de ácido nucleico para transformar y tranfectar las
células.
Como se indica más arriba, también una
característica de la invención son las proteínas codificadas por las
moléculas de ácido nucleico aisladas. Estas proteínas tienen
actividad enzimática, tal como se describe en la presente memoria.
Además, estas se pueden usar como inmunógenos para generar
anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales, que se pueden
usar tal como se describe más abajo. Además, estas proteínas se
pueden producir en varias formas recombinantes, incluyendo
proteínas de fusión, en formas activas que consisten en menos de la
secuencia aminoacídica de la proteína, y etc. Por ejemplo, es bien
conocido que las enzimas están compuestas por varios dominios
estructurales, que incluyen uno o más sitios activos. Dichos sitios
activos son una parte de la invención, y comprenden menos de la
secuencia aminoacídica de la proteína.
Tal como se indicó, las proteínas de la
invención se pueden usar para preparar moléculas de tipo goma
xantana, tales como aquellas ilustradas en la Figura 2, es
decir:
[glucosa-glucosa-manosa-ácido
glucurónico]n.
Donde n es un número natural de 1 a
aproximadamente 5000, preferiblemente de aproximadamente 300 a
aproximadamente 5000, lo más preferiblemente de aproximadamente
1500-3000.
Esta estructura puede estar acetilada; sin
embargo, tal como se indica más arriba, cuando se hace vía un
proceso que comprende el uso de las enzimas que son una parte de
esta invención, la estructura del tetrasacárido resultante difiere
de las gomas xantanas conocidas en el hecho de que no está
completamente acetilado o piruvilado. Los compuestos descritos más
arriba, pueden estar polimerizados vía procesos intracelulares o
extracelulares.
El aislamiento y caracterización del operón
XfGUM permite determinar al experto en la materia qué sustancias
actúan como inhibidores o activadores del operón como un conjunto, o
como miembros individuales del operón. Como se indicó más arriba,
los productos del tipo goma xantana de la invención tienen varios
usos industriales, y la determinación de los activadores y/o
agonista permite al experto aumentar la producción de los materiales
bajo condiciones apropiadas, tales como cultivo de laboratorio de
Xylella fastidiosa, o células transformadas o transfectadas
que producen el compuesto de tipo goma xantana. "En el campo"
donde, es deseable inhibir o antagonizar X. fastidiosa, y el
operón y las moléculas de ácido nucleico de la invención permiten al
experto identificar materiales que son útiles para inhibir el
organismo.
Otras facetas de la invención serán evidentes
para el experto en la materia, y no es necesario elaborarlas
aquí.
Los términos y expresiones que han sido
empleados se usan como términos de descripción y no como limitación,
y no hay intención, en el uso de dichos términos y expresiones, de
excluir cualquier equivalente de las características mostradas y
descritas o porciones de las mismas, reconociéndose que son posibles
varias modificaciones dentro del alcance de la invención.
Claims (14)
1. Una molécula de ácido nucleico aislada que
comprende una secuencia nucleotídica que codifica al menos una
proteína, cuya secuencia de aminoácidos está representada en SEQ ID
NOs: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, o 19, o una secuencia
nucleotídica que tiene al menos 70% de identidad total de la
misma.
2. La molécula de ácido nucleico aislada de la
reivindicación 1, que codifica todas las proteínas, cuyas secuencias
aminoacídicas están representadas en SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14,
15, 16, 17, 18 y 19.
3. La molécula de ácido nucleico aislada de la
reivindicación 1, que comprende al menos una de las secuencias
nucleotídicas representadas en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o
9.
4. La molécula de ácido nucleico aislada de la
reivindicación 2, que comprende la secuencia nucleotídica de SEQ ID
NO: 10.
5. Vector de expresión que comprende la molécula
de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 ó 2, unida de forma
operativa a un promotor.
6. Célula bacteriana distinta de la de
Xylella fastidiosa o célula eucariótica recombinante que
comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación
1 ó 2.
7. Célula recombinante que comprende el vector
de expresión de la reivindicación 5.
8. Proteína aislada que comprende la secuencia
aminoacídica representada en SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,
18 o 19.
9. Proteína aislada que consiste en la secuencia
aminoacídica representada en SE ID NOs: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,
18 o 19.
10. Anticuerpo que se une específicamente a la
proteína aislada de la reivindicación 9.
11. Un proceso para hacer un compuesto de
fórmula:
[glucosa-glucosa-manosa-ácido
glucurónico]n
donde n es un número natural de 1 a
aproximadamente 5000, que comprende cultivar una célula que
comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la
reivindicación 2, y aislar dicho compuesto tras la producción del
mismo por dicha
célula.
12. El proceso de la reivindicación 11, donde
dicha célula es Xylella fastidiosa.
13. El proceso de la reivindicación 11, donde
dicha célula es una célula recombinante.
14. Un proceso para determinar el efecto de una
sustancia sobre un miembro del operón XfGUM, que comprende poner en
contacto una célula que comprende la molécula de ácido nucleico
aislada de la reivindicación 2 con dicha sustancia, y determinar el
efecto de dicha sustancia sobre la producción de un compuesto de
fórmula [glucosa-glucosa-manosa
(Ac)-ácido glucurónico]n
donde n es un número natural de 1 a
aproximadamente 5000.
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