CN100436585C - 一个可用作控制甘蓝黑腐病的靶标基因 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与甘蓝黑腐病黄单胞菌致病性相关的激酶基因wxcB在防治植物甘蓝黑腐病害中的用途，该激酶基因是编码序列表中序列2所示蛋白质的DNA序列。该激酶基因是序列表中序列1所示的DNA序列。本发明为植物甘蓝黑腐病害的有效防治提供了药物靶标。

Description

一个可用作控制甘蓝黑腐病的靶标基因

技术领域

本发明涉及植物病原细菌的新的致病相关基因，尤其是甘蓝黑腐病菌的致病相关基因。

背景技术

植物病害一直是农作物减产、品质降低的主要因子之一。随着病原菌对药物抗性的增强，农药用量在不断增加，这不仅加剧了环境污染、药物残留，也大大提高了农业成本，因此，亟待研发新的防病治病策略和新型的无公害药物。甘蓝黑腐病黄单胞菌，也称为甘蓝黑腐病黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris，简称Xcc)，是一种能在全球范围内引起所有十字花科植物黑腐病的革兰氏阴性细菌。该菌能在寄主的任何生长期通过水孔、气孔或伤口侵入植物体内，引起病害，寄主包括甘蓝、花椰菜、大白菜、萝卜、油菜等。典型的黑腐病症状是在叶缘上形成V字形病斑，随着病斑的扩大，叶脉变黑，因而被称为黑腐病。黑腐病被认为是对十字花科植物危害最为严重的病害，尤其在热带和亚热带地区，温度和湿度都适宜于该菌的生长繁殖，因此发病更加严重。由于遗传稳定性和遗传可操作性，甘蓝黑腐病黄单胞菌一直被用作研究微生物与植物相互作用分子机理的模式细菌。因此，鉴定与黄单胞菌致病相关的新基因，对防治植物病害具有显著的意义。

弄清植物病原菌侵染寄主的遗传机制是开发新型药物和防病策略的关键，基因组学研究为人们从分子水平上全面、***地认识植物-微生物的互作关系提供了有效的方法和手段。随着DNA测序技术的不断进步，基因组学研究已由以序列测定为主的结构基因组学阶段全面进入了以开放阅读框(OpenReading Frame，ORF)功能解析、基因功能开发为主的功能基因组学时期。高通量、大规模的基因功能的研究为新兴的生命科学产业奠定了基础。已发现的与致病相关的基因主要包括以下几个类型：过敏性与致病性基因(hrp)(He1998)；无毒基因(avr)(Bonas 1999)；致病性因子调节基因(rpf)(Barber 1997)；胞外酶类基因；胞外多糖合成基因(Tang et al 1991；Dow et al 2000a)，脂多糖合成基因(Dow et al 2000b)等。目前，已完成了甘蓝黑腐病黄单胞菌ATCC33913菌株的全基因组序列的测定，全基因组序列在美国国家生物信息研究所管理的网站NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)向公众开放。该菌株4182个编码蛋白的基因，仅有2300个基因的功能是已知的。

发明内容

本发明的目的是通过建立甘蓝黑腐病黄单胞菌的突变体，鉴定与致病相关的新基因，提供用于防治植物病害的药物靶标。

本发明提供了一种与甘蓝黑腐病黄单胞菌致病相关的激酶基因wxcB在防治植物甘蓝黑腐病害上的用途，该基因是编码序列表中序列2所示蛋白质的DNA序列。

进一步地，该基因是序列表中序列1所示的DNA序列。

该基因序列保存在NCBI基因序列库中，序号为NP_635994。

序列表中序列1的DNA是甘蓝黑腐病黄单胞菌ATCC33913菌株的DNA，由2689个碱基组成，含完整的wxcB激酶基因，自5’端的第197-2488位核苷酸为该基因的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，自5’端的第197-199位核苷酸为该基因的起始密码子ATG，自5’端的第2489-2491位核苷酸为终止密码子TAA。

依照本发明提供的wxcB激酶基因编码的脂多糖O-抗原合成激酶产物，其蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列2，该蛋白质由764个氨基酸组成，该蛋白质预测分子量为84924.85道尔顿，等电点为5.35。

本发明提供了控制黑腐病新的药物靶标，用于防治黑腐病药物筛选和生产。

附图说明

图1为wxcB基因的克隆酶切电泳图谱。

1：λ/Hind III2标准DNA(片段大小从大到小依次为：23.1kb，9.4kb，6.6kb，2.4kb，2.0kb)；2：克隆载体pLAFR3作为对照；3：基因克隆pLWXCB/BamH I/EcoR I。

图2为wxcB基因单点整合突变体的PCR验证凝胶图。

1：100bp标准DNA(片段大小从大到小依次为：3kb，2kb，1.5kb，1.2kb，1kb，0.9kb，0.8kb，0.7kb等)；2：野生型ATCC33913菌株；3-5：wxcB基因单点整合突变体。

图3为wxcB基因突变体在固体培养基上的生长状况。

上排为：野生型ATCC33913菌株；

下排为：wxcB基因单点整合突变体。

图4为wxcB基因单点整合突变体的致病性试验。

A为ATCC33913野生型菌株；B为wxcB基因单点整合突变体；C为清水(空白对照)。

具体实施方式

在本发明的实施例中所用到的材料包括：大肠杆菌(Escherichia coli)株系JM109，载体pGEM-3Zf(+)购自Promega公司；***质粒pK18mob与穿梭pLAFR3为本研究室(广西大学生命科学与技术学院分子遗传研究所)保存；限制性内切酶、修饰酶等试剂购自Promega、Stratagene、TAKARA、QIAGEN等公司；抗生素(利福平、卡那霉素)和培养基原料(蛋白胨、酵母提取粉、甘油)购于上海生物工程公司。

实施例1、wxcB基因(脂多糖O-抗原合成激酶基因)的克隆

根据wxcB的基因序列，设计引物：

正向引物：WF1，5′-TACGAATTCATCTCGCTCGGCATCTCCAG-3′，

反向引物：WR1，5′-AACGGATCCCACCGATAAGGCAGCTGTAC-3′。

以甘蓝黑腐病黄单胞菌总DNA为模板，PCR扩增该基因全长序列，并将其克隆至pLAFR3中，构建基因克隆pLWXCB并酶切验证(见图1)。序列被亚克隆于pGEM-3Zf(+)中，并进行了末端测序。

实施例2、wxcB基因单点整合突变体的构建

根据Windgassen et al.(2000)提供的研究方法，对wxcB基因进行突变。

按照wxcB基因的内部序列，设计引物：

正向引物：WF2，5′-ATCGGATCCTGAGACAGAGCATCATCG-3′，

反向引物：WR2，5′-ATCAAGCTTACGCTTTGGGTGTCGAGG-3′。

PCR扩增wxcB基因ORF内一段420bp的同源DNA片段，将其定向克隆到***质粒pK18mob上(BamH I、HindIII双酶切)，将得到的重组质粒通过三亲接合导入甘蓝黑腐病黄单胞菌野生型ATCC33913菌株，抗生素(利福平50微克/毫升、卡那霉素25微克/毫升)筛选发生wxcB基因非极性整合突变的突变体。随机选择3株突变体进行标准PCR验证(见图2)。

实施例3、wxcB基因突变体在固体培养基上的生长状况

在固体培养基(每升含蛋白胨5.0g，酵母提取粉3g，甘油20g，pH7.0)平板上，用牙签点接野生型黄单胞菌、wxcB基因单点整合突变菌株，28℃培养72小时。结果表明，wxcB基因的突变体三个重复菌落均表现为边缘不整齐、表面粗糙，而野生型菌株则生长正常，胞外多糖较多(见图3)。

实施例4、wxcB基因突变体的致病性检测

实验所用寄主植物为萝卜苗(种名为Raphanus sativus L.var.radiculusPers.)，所用的接种方法为剪叶法。wxcB基因单点整合突变体和野生型菌株进行液体培养，28℃，15-18个小时。用NYGB稀释到OD₆₀₀＝0.2，用灭过菌的剪刀在菌液浸泡5秒钟后，在健康叶片距叶尖1-2cm垂直叶脉的方向剪到中轴处，停留5秒钟，25-30℃培养，一周后观察结果，正对照选用甘蓝黑腐病黄单胞菌野生型33913菌株，负对照用清水。致病试验表明，wxcB基因的单点整合突变体的致病性显著降低，证实wxcB基因与甘蓝黑腐病黄单胞菌的致病性有关。

wxcB基因序列表

                                                        

序列1：DNA序列

ATCTCGCTCGGCATCTCCAGCGGCGATCCGCTGGTGGAATTGACACCGCT

GGATCGGCGCTACGATGCCATCGTGCTGAACGTGGCCCGAGGCATGCAG

TTCTGGGGGATGATGGATCTGAAGGCCGATTTCGAAATCGTGGAGGCCTT

GTCATGAAGGCGCCAGCAATTCACCTCAACGCAGAGAGCGAACAGCCAT

GATCGAGTCACTGAATATAGGGGCGCTTGTGGCAGCCCTGCCAGAGAAG

TACCAGCCGATCTTTGCGCATCCGGAGCTGTCCGACGGCAGCTCGCGTGG

GTGCGAGGACAGGCTTGTGCTGATCCGCCAATGCGCGCAGCGCCTGCAG

CATGCGCTTGGCCGCCCGCTGCGTGTGCTCGACCTTGGCTGTGCCCAGGG

GTTTTTCTCTCTGAACCTTGCAGCCGATGGTCACACGGTACACGGCGTGG

ATTTTCTCGATCTCAACGTCAATGTGTGCAAGGCGCTGGCTGCCGAGAAC

CCTGCATGTGCAGCTACCTTTGAGCACGGCACGGTGGAAGATGTGATAGA

TCGCCTTGAGCACGATGAGTGCGACCTGGTCCTCGGCCTGAGCGTCTTCC

ATCATCTAATTCACGACAAAGGCATCCTGAAGGTATCCGCGCTGTGTCGG

AAGCTTTCAGAAACGACCAGCGCGGGCATTTATGAGCTCGCCCTGCGTGA

GGAGCCGCTCTACTGGGCGCCATCGTTGTCGCAGGACCCGGCCGAGTTGC

TATCCAGTTATGCATTTTTGCGCCTGCTTTCACAGCAGCAGACACATCTTT

CGGCGGTTTCAAGGCCACTATATTTTGCCAGTAGCCGTTTCTGGTACGTG

GATGGAGCCATTGGTAATTTTACGTCTTGGTCATCCGAGTCACATGCGCA

TGGCCGCGGCACGCATCTGCAATCGCGCCGTTATTATTTCAGCGAACAGT

CGTTCGTAAAGAAAATGACGCTGGGCGTGGGAGATCGCGCAGAGATCAA

TTTGCAGGAGTTCGTCAATGAGGTGGAGTTTCTGGGCAATCCACCGGAGA

GCTACCCGGCACCGCGCCTGATCGCATCGCTGAACGATTCCAGGGATCTG

TTCATTGCAAGGTCCATGATGAATGGACGGCTTCTCTCCCAGGCGATCGA

TGATGGGGCCGCTTATGATGCTGATGAAATAATTGCACAGATTCTTGCGC

AACTTGTTTTGCTTGAGCGTGCTGGTCTGTACCACAACGACGTGCGCTGC

TGGAATATCCTTATCGCGCCTGAAGGGCGTGCTGTATTGATCGACTATGG

CGCAATATCGGCCAATCCATTCGATTGCTCATGGCTCGACGATCTTCTGCT

TTCCTTCCTGATCACGGTCAAGGAGATTCTTGAGCGCAAGGTTGTTCCCTC

CAGTCCGAGCCGGGAGCCCGCTCTGGATTTCATGACGCTGCCCGCGCGTT

ATCGCAATGCGTTCATCGGGTTTTTTGGTCAGAATCGGTCCCCGTTGACAT

TCGCCTTGCTGCAAC AGTGTCTTCAGCAGGCAGATGCGACCCCTCACTCT

GCCCCCGAGTGGGTGACCATCTATCAGCGCCTGCAGAAAGCACTGCTCG

GCTATAATGCGCGGCTTAGTGCTGTGCATATTGAGACAGAGCATCATCGG

GTGGAGCTTGCCGCGCGCGGGGCGGCAATTGAGCATCTTCGCGATAGTAC

ATTGCAAGACCAAGAGCGCACTCAGGCGTTTGAGCAGGGGGTTGCCGCT

GCCGAGGAAAGGTACAAGCGCCTCGAGGAGGAGAGCGAGAAGCTGGCG

GCGTGGGCGAAAGGACTTGAAGCTCAGACTATCGAGTCCAACCGTGACA

AAGAAGCGCTTGCCGCGCTCAATGCAGAACTGGAATCAGACAAAGCTGC

GCTCGCGACGCGAATTGCGTCACTTGGCCAGGAGCTGGAAGAGCGTCAG

CGTGCGCGTGAGTTGGCCGAGTTGCTGGCTGCCGACGTGGGACGGCTGAC

CGAGGAGCGTGACGCTGCCAGGTCCGATCTCCTCGACACCCAAAGCGTC

GTTGAGCAGCACCAGGCGACGATTACAGCGCTGGAGGCGCGTGTCGCCG

TTCAGCAGCAACAGATCAGTGGCCTTGAGAGTTCGCGCGATCAGGAAAG

AAATAGGTTGAGGGAGTTGCAGGTGGATCTCTCGCGTAGCATGGACGGT

ACTGCAAGTGCGCGTGAGTACATTCGTGAGCTTGAGATGGCGGTGGATGC

TCTGGAGGGACAGATCAACAGCCTCCACGGAAGTCGGTCCTGGCGCGTT

ACGGCACCTCTGCGTCTGTTCACCACACGGGTACTGAAGCGTGGCAATGC

TGACGCTGCGACCATCCGCAAGGTTTCAGACGCGCGCCTTGAAAGTCCTG

TCCATACGGATGGTGTGACACCTACACCGGCAGAGGCTGCGATGGACGA

ACGCTTAGCTGCAGTCGATCAATTGGGTAGCCGGATTCGTAAGTCGCTTA

AATAATCCGGGTAGAGGGAATCGTTGTGGTAAGGACATCATGCAAGAGG

TTGTGGCCGTGAAGAGAGTCATTGTTCTGGGTGCGCAGGTACCGTTTGTC

AGAGGAGGAGCAGAGTTCCTGAATGAAGAACTTGTCCGCCAGATCAATC

TGTGGGGAAAAAAACGCCAGGTTGTCGCGGAATTGGTACAGCTGCCTTAT

CGGTG

序列2：蛋白质序列

MIESLNIGALVAALPEKYQPIFAHPELSDGSSRGCEDRLVLIRQCAQRLQHAL

GRPLRVLDLGCAQGFFSLNLAADGHTVHGVDFLDLNVNVCKALAAENPAC

AATFEHGTVEDVIDRLEHDECDLVLGLSVFHHLIHDKGILKVSALCRKLSETT

SAGIYELALREEPLYWAPSLSQDPAELLSSYAFLRLLSQQQTHLSAVSRPLYF

ASSRFWYVDGAIGNFTSWSSESHAHGRGTHLQSRRYYFSEQSFVKKMTLGV

GDRAEINLQEFVNEVEFLGNPPESYPAPRLIASLNDSRDLFIARSMMNGRLLS

QAIDDGAAYDADEIIAQILAQLVLLERAGLYHNDVRCWNILIAPEGRAVLIDY

GAISANPFDCSWLDDLLLSFLITVKEILERKVVPSSPSREPALDFMTLPARYRN

AFIGFFGQNRSPLTFALLQQCLQQADATPHSAPEWVTIYQRLQKALLGYNAR

LSAVHIETEHHRVELAARGAAIEHLRDSTLQDQERTQAFEQGVAAAEERYKR

LEEESEKLAAWAKGLEAQTIESNRDKEALAALNAELESDKAALATRIASLGQ

ELEERQRARELAELLAADVGRLTEERDAARSDLLDTQSVVEQHQATITALEA

RVAVQQQQISGLESSRDQERNRLRELQVDLSRSMDGTASAREYIRELEMAV

DALEGQINSLHGSRSWRVTAPLRLFTTRVLKRGNADAATIRKVSDARLESPV

HTDGVTPTPAEAAMDERLAAVDQLGSRIRKSLK^*

Claims (2)

1、一种与甘蓝黑腐病黄单胞菌致病性相关的激酶基因wxcB在防治植物甘蓝黑腐病害中的用途，所述的激酶基因是编码序列表中序列2所示蛋白质的DNA序列。

2、根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的激酶基因是序列表中序列1所示的DNA序列。

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