ES2322825T3 - Mutantes de alfa-amilasa. - Google Patents
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Abstract
Una variante de una {alpha}-amilasa parental tipo Termamyl, donde la {alpha}-amilasa parental tipo Termamyl es seleccionada entre: (i) SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7 o SEC ID NO: 8; (ii) una {alpha}-amilasa parental tipo Termamyl que tiene al menos el 80% de homología para una de las secuencias en (i); y donde la variante tiene actividad {alpha}-amilasa y comprende las mutaciones siguientes 1181* y G182* y N193F en SEC ID NO: 3 o en posiciones correspondientes en otra {alpha}-amilasa parental tipo Termamyl.
Description
Mutantes de
\alpha-amilasa.
La presente invención está relacionada, entre
otras cosas, con las variantes nuevas (mutantes) de
\alpha-amilasas parentales tipo Termamyl, sobre
todo variantes que presentan termoestabilidad aumentada a pH ácido
y/o a bajas concentraciones de Ca^{2+} (con respecto a la
parental) que es ventajoso con respecto a las aplicaciones de las
variantes en el tratamiento industrial del almidón particularmente
(p. ej. licuefacción o sacarificación del almidón).
Las \alpha-amilasas
(\alpha-1,4-glucan-4-glucanohidrolasas,
EC 3,2,1,1) constituyen un grupo de enzimas que catalizan la
hidrólisis del almidón y otros oligo y polisacáridos
1,4-glucosídicos lineales y ramificados.
Hay un cuerpo muy extenso de patentes y de
bibliografía científica acerca de esta clase de enzimas muy
importante industrialmente. Varias \alpha-amilasas
tales como variantes de \alpha-amilasas tipo
Termamyl son conocidas a partir de p. ej. WO 90/11352, WO 95/10603,
WO 95/26397, WO 96/23873 y WO 96/23874.
Entre las descripciones más recientes referentes
a las \alpha-amilasas, WO 96/23874 proporciona
datos estructurales tridimensionales en cristales de rayos X para
una \alpha-amilasa tipo Termamyl que consiste en
300 residuos de aminoácidos N-terminales de la
\alpha-amilasa de B. amyloliquefaciens y
los aminoácidos 301-483 del extremo
C-terminal de la \alpha-amilasa de
B. licheniformis que comprende la secuencia de aminoácidos
(estando disponible comercialmente bajo el nombre comercial
Termamyl^{TM}), y que está así cercanamente relacionada con las
\alpha-amilasas de Bacillus industrialmente
importantes (que en el contexto presente están incluidas dentro del
significado del término "\alpha-amilasas tipo
Termamyl", y que incluyen, entre otras cosas, las
\alpha-amilasas de B. licheniformis, B.
amyloliquefaciens y B. stearothermophilus). WO 96/23874
también describe la metodología para diseñar, basándose en un
análisis de la estructura de una \alpha-amilasa
parental tipo Termamyl, variantes de la
\alpha-amilasa parental tipo Termamyl que
presentan propiedades alteradas con respecto a la parental.
WO 95/35382 (Gist Brocades B.V.) se refiere a
enzimas amilolíticas derivadas de B. licheniformis con
propiedades mejoradas que permiten la reducción de la concentración
de Ca^{2+} bajo la aplicación sin una pérdida de rendimiento de
la enzima. La enzima amilolítica comprende uno o más cambios de
aminoácidos en las posiciones seleccionadas del grupo de 104, 128,
187, 188 de la secuencia de \alpha-amilasa de
B. licheniformis.
WO 96/23873 (Novo Nordisk) expone variantes de
\alpha-amilasa tipo Termamyl que tienen
termoestabilidad aumentada obtenida por la deleción de pares en la
región R181*, G182*, T183* y G184* de la secuencia mostrada en SEC
ID NO: 1 de la misma.
La presente invención se refiere a nuevas
variantes (mutantes) \alpha-amilolíticas de una
\alpha-amilasa tipo Termamyl, en particular
variantes que presentan termoestabilidad aumentada (con respecto a
la parental) que es ventajosa en relación con el tratamiento
industrial del almidón (licuefacción, sacarificación del almidón y
similares).
Los inventores han descubierto sorprendentemente
que en el caso de combinar dos o tres mutaciones (se describirá más
abajo), la termoestabilidad de las
\alpha-amilasas tipo Termamyl es aumentada a pH
ácido y/o a baja concentración de Ca^{2+} en comparación con
mutaciones únicas, tal como la mutación descrita en WO 96/23873
(Novo Nordisk), es decir, eliminación de pares en la región R181*,
G182*, T183* y G184* de la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 1 de
la presente.
La invención se refiere adicionalmente a
constructos de ADN que codifican variantes de la invención, a la
composición que comprende variantes de la invención, a métodos para
preparar variantes de la invención, y al uso de las variantes y
composiciones de la invención, solas o en combinación con otras
enzimas \alpha-amilolíticas, en varios procesos
industriales, p. ej., licuefacción de almidón.
Figura 1 es un alineamiento de las secuencias de
aminoácidos de seis \alpha-amilasas parentales
tipo Termamyl en el contexto de la invención. Los números en el
extremo izquierdo designan las secuencias de aminoácidos respectivas
como sigue:
1: SEC ID NO: 2,
2: Kaoamyl,
3: SEC ID NO: 1,
4: SEC ID NO: 5,
5: SEC ID NO: 4,
6: SEC ID NO: 3.
Es bien sabido que varias
\alpha-amilasas producidas por Bacillus
spp. son altamente homólogas a nivel aminoácido. Por ejemplo,
la \alpha-amilasa de B. licheniformis que
comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 4
(comercialmente disponible como Termamyl^{TM}) se ha descubierto
que es aproximadamente un 89% homóloga a la
\alpha-amilasa de B. amiloliquefaciens que
comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 5 y
aproximadamente un 79% homóloga a la
\alpha-amilasa de B. stearothermophilus
que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:
3. \alpha-amilasas homólogas adicionales incluyen
una \alpha-amilasa derivada de una cepa NCIB
12289, NCIB 12512, NCIB 12513 o DSM 9375 de Bacillus sp.,
todas las cuales están descritas con detalle en WO 95/26397, y la
\alpha-amilasa descrita por Tsukamoto et
al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 151
(1988), págs. 25-31.
Otras \alpha-amilasas
homólogas adicionales incluyen la \alpha-amilasa
producida por la cepa de B. licheniformis descrita en EP
0252666 (ATCC 27811), y las \alpha-amilasas
identificadas en WO 91/00353 y WO 94/18314. Otras
\alpha-amilasas de B. licheniformis
comerciales tipo Termamyl son Optitherm^{TM} y Takatherm^{TM}
(disponible de Solvay), Maxamyl^{TM} (disponible de
Gist-Brocades/Genencor), Spezym AA^{TM} y Spezyme
Delta AA^{TM} (disponible de Genencor), y Keistase^{TM}
(disponible de Daiwa).
Por la homología sustancial descubierta entre
estas \alpha-amilasas, éstas se consideran que
pertenecen a la misma clase de \alpha-amilasas, es
decir la clase de "\alpha-amilasas tipo
Termamyl".
Por consiguiente, en el contexto presente, el
término "\alpha-amilasa tipo Termamyl" se
destina a indicar una \alpha-amilasa que, a nivel
aminoácido, muestra una homología sustancial a Termamyl^{TM}, es
decir, la \alpha-amilasa de B.
licheniformis que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en
la SEC ID NO: 4 de la presente. En otras palabras, una
\alpha-amilasa tipo termamyl es una
\alpha-amilasa que tiene la secuencia de
aminoácidos mostrada en las SEC ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8 en
la presente, y la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID
NO: 1 de WO 95/26397 (la misma que la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC ID NO: 7 aquí) o en la SEC ID NO: 2 de WO
95/26397 (la misma que la secuencia de aminoácidos mostrada como la
SEC ID NO: 8 aquí) o en Tsukamoto et al., 1988, (que la
secuencia de aminoácidos está mostrada en la SEC ID NO: 6 aquí) o
i) que muestra al menos un 80%, especialmente al menos un 85%,
especialmente preferido al menos un 90%, incluso especialmente más
preferido al menos un 95% de homología con al menos una de dichas
secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC ID Nos 1 o 2 o 3 o 4
o 5 o 6 o 7 o 8.
En relación con la propiedad i), la
"homología" puede ser determinada usando cualquier algoritmo
convencional, preferiblemente usando el programa GAP del paquete
GCG versión 7.3 (Junio 1993) usando valores por defecto para
penalizaciones de espacio, que es una penalización por creación de
espacio de 3.0 y penalización por extensión de espacio de 0.1,
(Genetic Computer Group (1991) Programme Manual for the GCG
Package, version 7, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA
53711).
Un alineamiento estructural entre Termamyl y una
\alpha-amilasa tipo Termamyl puede ser usado para
identificar posiciones equivalentes/correspondientes en otras
\alpha-amilasas tipo Termamyl. Un método de
obtención de dicho alineamiento estructural es mediante el uso del
programa Pile Up del paquete GCG usando valores por defecto de
penalizaciones de espacio, es decir, una penalización por creación
de espacio de 3.0 y penalización por extensión de espacio de 0.1.
otros métodos de alineamiento estructural incluyen el análisis de
agregados hidrofóbicos (Gaboriaud et al., (1987), FEBS
LETTERS 224, pp. 149-155) y enroscado inverso
(Huber, T; Torda, AE, PROTEIN SCIENCE Vol. 7, No. 1 pp.
142-149 (1998).
En el contexto presente, "derivado de" está
destinado no sólo a indicar una \alpha-amilasa
producida o producible por una cepa del organismo en cuestión, sino
también una \alpha-amilasa codificada por una
secuencia de ADN aislada de esta cepa y producida en un organismo
huésped transformado con dicha secuencia de ADN. Finalmente, el
término se destina a indicar una \alpha-amilasa
que está codificada por una secuencia de ADN de origen sintético y/o
de ADNc y que tiene las características de identificación de la
\alpha-amilasa en cuestión. El término está
también destinado a indicar que la \alpha-amilasa
parental puede ser una variante de \alpha-amilasa
de origen natural, es decir, una variante que es el resultado de
una modificación (inserción, sustitución, deleción) de uno o más
residuos aminoácidos de la \alpha-amilasa de
origen natural.
La \alpha-amilasa parental
puede ser una \alpha-amilasa híbrida, es decir una
\alpha-amilasa que comprende una combinación de
secuencias de aminoácidos parciales derivada de al menos dos
\alpha-amilasas.
La \alpha-amilasa parental
híbrida puede ser una que basándose en la homología de aminoácidos
y/o reactividad cruzada y/o hibridación del ADN (como se ha
definido arriba) puede ser determinada para pertenecer a la familia
de \alpha-amilasas tipo Termamyl. En este caso, la
\alpha-amilasa híbrida está normalmente compuesta
de al menos una parte de una \alpha-amilasa tipo
Termamyl y parte(s) de una o varias otras
\alpha-amilasas seleccionadas de las
\alpha-amilasas tipo Termamyl o
\alpha-amilasas no de tipo Termamyl de origen
microbiano (bacteriano o fúngico) y/o mamífero.
Así, la \alpha-amilasa híbrida
parental puede comprender una combinación de secuencias de
aminoácidos parciales que derivan de al menos dos
\alpha-amilasas tipo Termamyl, o de al menos una
\alpha-amilasa tipo Termamyl y al menos una
\alpha-amilasa bacteriana no de tipo Termamyl, o
de al menos una \alpha-amilasa tipo Termamyl y al
menos una fúngica. La \alpha-amilasa tipo Termamyl
de la cual deriva una secuencia de aminoácidos parcial puede, p.
ej., ser cualquiera de estas \alpha-amilasas tipo
Termamyl específicas a las que se hace referencia en este caso.
Por ejemplo, la \alpha-amilasa
parental puede comprender una parte C-terminal de
una \alpha-amilasa derivada de una cepa de B.
licheniformilicheniformis y una parte
N-terminal de una \alpha-amilasa
derivada de una cepa de B. amyloliquefaciens o de una cepa
de B. stearothermophilus. Por ejemplo, la
\alpha-amilasa parental puede comprender al menos
430 residuos de aminoácidos de la parte C-terminal
de la \alpha-amilasa de B. licheniformis, y
puede, p. ej. comprender a) un segmento de aminoácido
correspondiente a los 37 residuos de aminoácidos
N-terminales de la \alpha-amilasa
de B. amyloliquefaciens que tiene la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 5 y un segmento de aminoácido
correspondiente a 445 residuos de aminoácidos
C-terminales de la \alpha-amilasa
de B. licheniformis que tiene la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC ID nº. 4, o b) un segmento de aminoácido
correspondiente a los 68 residuos de aminoácidos
N-terminales de la \alpha-amilasa
de B. stearothermophilus que tiene la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 3 y un segmento de aminoácido
correspondiente a los 415 residuos de aminoácidos
C-terminales de la \alpha-amilasa
de B. licheniformis que tiene la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC ID NO: 4.
La \alpha-amilasa no de tipo
Termamyl puede, p. ej., ser una \alpha-amilasa
fúngica, una \alpha-amilasa mamífera o vegetal o
una \alpha-amilasa bacteriana (diferente de una
\alpha-amilasa tipo Termamyl). Ejemplos
específicos de tales \alpha-amilasas incluyen la
TAKA \alpha-amilasa de Aspergillus oryzae,
la \alpha-amilasa ácida de A. niger, la
\alpha-amilasa de Bacillus subtilis, la
\alpha-amilasa pancreática porcina y una
\alpha-amilasa de cebada. Todas estas
\alpha-amilasas han dilucidado estructuras que
son marcadamente diferentes de la estructura de una
\alpha-amilasa típica tipo Termamyl como se ha
hecho referencia en este caso.
Las \alpha-amilasas fúngicas
mencionadas arriba, es decir, derivadas de A. niger y A.
oryzae, son altamente homólogas a nivel aminoácido y se
considera generalmente que pertenecen a la misma familia de
\alpha-amilasas. La
\alpha-amilasa fúngica derivada de Aspergillus
oryzae está comercialmente disponible bajo el nombre comercial
Fungamyl^{TM}.
Además, cuando se hace referencia a una variante
particular de una \alpha-amilasa (variante de la
invención) tipo Termamyl - en una manera convencional - por
referencia a la modificación (p. ej. deleción o sustitución) de
residuos de aminoácidos específicos en la secuencia de aminoácidos
de una \alpha-amilasa específica tipo Termamyl,
debe entenderse que otras variantes de
\alpha-amilasa tipo Termamyl modificadas en
la(s) posición(es) equivalente(s) (según está
determinado a partir de la secuencia de aminoácidos el mejor
alineamiento posible entre las secuencias de aminoácidos
respectivas) están incluidas de ese modo.
Una forma de realización preferida de una
variante de la invención es una derivada de una
\alpha-amilasa de B. licheniformis (como la
\alpha-amilasa parental tipo Termamyl), p. ej.
una de aquellas a las que se hace referencia arriba, tal como la
\alpha-amilasa de B. licheniformis que
tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 4.
La construcción de la variante de interés puede
ser realizada para cultivar un microorganismo que comprende una
secuencia de ADN que codifica la variante bajo condiciones que son
propicias para producir la variante. La variante puede luego ser
recuperada posteriormente del caldo de cultivo resultante. Esto se
describe con más detalle abajo.
A continuación se discute la relación entre
mutaciones que pueden estar presentes en variantes de la invención,
y alteraciones deseables en propiedades (relativas a las de la
\alpha-amilasa parental tipo Termamyl) que pueden
resultar de las mismas.
Mutaciones de relevancia particular en relación
con la obtención de variantes según la invención con
termoestabilidad aumentada a pH ácido y/o a baja concentración de
Ca^{2+} incluyen mutaciones en las posiciones siguientes
(relativas a \alpha-amilasa de B.
licheniformis, SEC ID NO: 4): N190, E211.
En el contexto de la invención el término "pH
ácido" significa un pH debajo de 7.0, especialmente debajo del
margen de pH, donde se realizan normalmente los procesos
industriales de licuefacción del almidón, que está entre pH 5.5 y
6.2.
En el contexto de la presente invención el
término "baja concentración de calcio" significa
concentraciones por debajo del nivel normal usado en la
licuefacción del almidón industrial. Las concentraciones normales
varían dependiendo de la concentración de Ca^{2+} libre en el
maíz. Normalmente se añade una dosificación correspondiente a 1 mM
(40 ppm) que con el nivel en el maíz da entre 40 y 60 ppm de
Ca^{2+} libre.
En el contexto de la invención el término
"temperaturas elevadas" significa temperaturas entre 95ºC y
160ºC, especialmente el rango de temperatura donde se realizan
normalmente los procesos industriales de licuefacción del almidón
que está entre 95ºC y 105ºC.
Los inventores han descubierto ahora que la
termoestabilidad a pH ácido y/o a baja concentración de Ca^{2+}
puede ser aumentada incluso más combinando ciertas mutaciones que
incluyen las mutaciones anteriormente mencionadas y/o I201 entre
sí.
Dichas "ciertas" mutaciones son las
siguientes (relativas a la \alpha-amilasa de
B. licheniformis, SEC ID NO: 4): N190 y E211.
Dicha mutación puede además ser combinada con
deleciones en dos posiciones como se describe en WO 96/23873 (es
decir, en las posiciones R181, G182, T183, G184 en SEC ID NO: 1 de
la presente). Según la invención las variantes de una
\alpha-amilasa parental tipo Termamyl con
actividad \alpha-amilasa comprendiendo mutaciones
en dos o tres de las posiciones anteriores están contempladas.
Debe ser enfatizado que no sólo las
\alpha-amilasas tipo Termamyl mencionadas
específicamente abajo están contempladas. También otras
\alpha-amilasas comerciales tipo Termamyl están
contempladas. Una lista no exhaustiva de estas
\alpha-amilasas es la siguiente:
\alpha-amilasas producidas por
la cepa de B. licheniformis descrita en EP 0252666 (ATCC
27811), y las \alpha-amilasas identificadas en WO
91/00353 y WO 94/18314. Otras \alpha-amilasas
comerciales tipo Termamyl de B. licheniformis son
Optitherm^{TM} y Takatherm^{TM} (disponibles de Solvay),
Maxamyl^{TM} (disponible de
Gist-Brocades/Genencor), Spezym AA^{TM} Spezyme
Delta AA^{TM} (disponible de Genencor), y Keistase^{TM}
(disponible de Daiwa).
Se puede mencionar aquí que los residuos de
aminoácidos, respectivamente, en posiciones correspondientes a
N190, I201, D207 y E211, respectivamente, en la SEC ID NO: 4
constituyen residuos de aminoácidos que son conservadas en
numerosas \alpha-amilasas tipo Termamyl. Así, por
ejemplo, las posiciones correspondientes de estos residuos en las
secuencias de aminoácidos de varias
\alpha-amilasas tipo Termamyl que han sido ya
mencionadas (véase supra) son las siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
Mutaciones de estos residuos de aminoácidos
conservados son muy importantes en relación con la mejora de la
termoestabilidad a pH ácido y/o a baja concentración de calcio, y
las mutaciones siguientes son de interés particular a este respecto
(con referencia a la numeración de la secuencia de aminoácidos de
B. licheniformis mostrada en la SEC ID NO: 4).
Deleciones de aminoácidos emparejados en
posiciones correspondientes a R179-G182 en la SEC
ID NO: 3 correspondientes a un espacio en la SEC ID NO: 4. cuando
se alinea con numerosas \alpha-amilasas tipo
Termamyl. Así, por ejemplo, las posiciones correspondientes de estos
residuos en las secuencias de aminoácidos de varias
\alpha-amilasas tipo Termamyl que ya han sido
mencionadas (véase supra) son las siguientes:
Cuando se usa la SEC ID NO: 1 a la SEC ID NO: 6
como el esqueleto (es decir, como la
\alpha-amilasa parental tipo Termamyl) dos o tres
mutaciones pueden según la invención ser hechas en las siguientes
regiones/posiciones para aumentar la termoestabilidad a pH ácido
y/o a bajas concentraciones de Ca^{2+} (relativas a la
parental):
(relativas a SEC ID NO: 1 aquí):
1: T183*, G184*
2: N195F,
3: E216Q;
\vskip1.000000\baselineskip
(relativo a la SEC ID NO: 2 aquí):
1: D183*, G184*
2: N195F;
3: E216, Q,
\vskip1.000000\baselineskip
(relativo a SEC ID NO: 3 aquí):
1: 1181 *, G 182*
2: N193, F,;
3: E214Q;
\vskip1.000000\baselineskip
Relativo a SEC ID NO: 4 aquí):
1: Q178*, G179*
2: N190F;
3: E211 Q,;
\vskip1.000000\baselineskip
(relativo a SEC ID NO: 5 aquí):
1: E178, G179*
2: N 190, F,;
3: E211, Q,
\vskip1.000000\baselineskip
(relativo a SEC ID NO: 6 aquí):
1: H183*, G184*
2: N195F;
3: E216Q;
\vskip1.000000\baselineskip
Está contemplada según la presente invención la
combinación de tres o cuatro mutaciones.
Mutaciones específicas dobles para el esqueleto
SEC ID N: 1 a SEC ID NO: 6 están catalogadas a continuación.
Usando la SEC ID NO: 1 como el esqueleto, las
siguientes mutaciones dobles resultando en el efecto deseado están
contempladas según la invención:
- T183*/G184*/N195F,
\vskip1.000000\baselineskip
Usando la SEC ID NO: 2 como el esqueleto, las
siguientes mutaciones dobles resultando en el efecto deseado están
contempladas según la invención:
- D 183*/G 184*/N 195 F,
\vskip1.000000\baselineskip
Usando la SEC ID nº. 3 como el esqueleto, las
siguientes mutaciones dobles resultando en el efecto deseado están
contempladas según la invención:
- 1181 */G 182*/N 193 F,
\vskip1.000000\baselineskip
Usando la SEC ID nº. 4 como el esqueleto, las
siguientes mutaciones dobles resultando en el efecto deseado están
contempladas según la invención:
N190F/E211 Q;
\vskip1.000000\baselineskip
Usando la SEC ID NO: 5 como el esqueleto, las
siguientes mutaciones dobles resultando en el efecto deseado están
contempladas según la invención:
- E 178*/G 179*/N 190 F;
\vskip1.000000\baselineskip
Usando la SEC ID NO: 6 como el esqueleto, las
mutaciones siguientes dobles resultando en el efecto deseado están
contempladas según la invención:
- H 183*/G 184*/N 195F;
\vskip1.000000\baselineskip
Todas las \alpha-amilasas tipo
Termamyl definidas arriba pueden ser usadas de manera adecuada como
el esqueleto para preparar variantes de la invención.
La variante de la invención comprende las
mutaciones siguientes: 1181*/G182*/N193F en SEC ID NO: 3
(TVB146) o en posiciones correspondientes en otras \alpha-amilasas parentales tipo Termamyl. Dicha variante puede además comprender una sustitución en la posición E214Q.
(TVB146) o en posiciones correspondientes en otras \alpha-amilasas parentales tipo Termamyl. Dicha variante puede además comprender una sustitución en la posición E214Q.
En una forma de realización preferida de la
invención, la \alpha-amilasa parental tipo
termamyl es una \alpha-amilasa híbrida de la SEC
ID NO: 4 y SEC ID NO: 5. Específicamente, la
\alpha-amilasa parental híbrida tipo Termamyl
puede ser una alfa-amilasa híbrida que comprende los
445 residuos de aminoácidos C-terminales de la
\alpha-amilasa de B. licheniformis mostrada
en la SEC ID NO: 4 y los 37 residuos de aminoácidos
N-terminales de la \alpha-amilasa
derivada de B. amyloliquefaciens mostrada en la SEC ID NO:
5, que puede de manera adecuada tener adicionalmente las mutaciones
siguientes: H 156Y+A181 T+N 190F+A209V+Q264S (usando la numeración
en la SEC ID NO: 4). Éste híbrido mencionado se usa en los ejemplos
abajo y se le hace referencia como LE174.
Puede ser preferido que una variante de la
invención comprenda una o más modificaciones además de estas
perfiladas arriba. Así, puede ser ventajoso que uno o más residuos
de prolina presentes en la parte de la variante de
\alpha-amilasa que está modificada sea/n
sustituido(s) con un residuo sin prolina que puede ser
cualquiera de los residuos sin prolina posibles de origen natural,
y que preferiblemente es una alanina, glicina, serina, treonina,
valina o leucina.
De forma análoga, puede ser preferido que uno o
más residuos de cisteína presentes entre los residuos de
aminoácidos con el cual la \alpha-amilasa
parental es modificada sea/n sustituidos por un residuo sin cisteína
tal como serina, alanina, treonina, glicina, valina o leucina.
Además, una variante de la invención puede -bien
como la única modificación o en combinación con cualquiera de las
modificaciones perfiladas anteriores- ser modificada de modo que
uno o más Asp y/o Glu presentes en un fragmento de aminoácido
correspondiente al fragmento de aminoácido 185-209
de la SEC ID NO: 4 sea sustituido por un Asn y/o Gln,
respectivamente. También de interés es la sustitución, en la
\alpha-amilasa tipo Termamyl, de uno o más de los
residuos de Lys presentes en un fragmento de aminoácido
correspondiente al fragmento de aminoácido 185-209
de la SEC ID NO: 4 por un Arg.
Será entendido que la presente invención
comprende variantes que incorporan dos o más de las modificaciones
perfiladas arriba.
Además, puede ser ventajoso introducir
mutaciones puntuales en cualquiera de las variantes descritas
aquí.
Diferentes métodos para introducir mutaciones en
genes son conocidos en la técnica. Después de una discusión breve
de la clonación de las secuencias de ADN que codifican la
\alpha-amilasa, métodos para generar mutaciones
en sitios específicos dentro de la secuencia que codifica la
\alpha-amilasa serán discutidos.
La secuencia de ADN que codifica una
\alpha-amilasa parental puede ser aislada de
cualquier célula o microorganismo que produce la
\alpha-amilasa en cuestión, usando varios métodos
bien conocidos en la técnica. Primero, un ADN genómico y/o
biblioteca de ADNc debería ser construido usando ADN cromosómico o
ARN mensajero del organismo que produce la
\alpha-amilasa que debe ser estudiada. Luego, si
la secuencia de aminoácidos de la \alpha-amilasa
es conocida, homólogos, sondas de oligonucleótidos marcadas pueden
ser sintetizadas y usadas para identificar clones de codificación
de \alpha-amilasa de una genoteca obtenida a
partir del organismo en cuestión. De forma alternativa, una sonda
de oligonucleótidos marcada que contiene secuencias homólogas a un
gen de \alpha-amilasa conocido podría ser usada
como una sonda para identificar clones de codificación de
\alpha-amilasa, usando condiciones de hibridación
y de lavado de menor astringencia.
Otro método adicional para identificar clones de
codificación de \alpha-amilasa implica insertar
fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, tal como un
plásmido, transformar las bacterias
\alpha-amilasa-negativas con la
biblioteca resultante de ADN genómico, y luego disponer en placas
las bacterias transformadas sobre agar con un sustrato para
\alpha-amilasa, de ese modo permitiendo que los
clones que expresan la \alpha-amilasa sean
identificados.
De forma alternativa, la secuencia de ADN que
codifica la enzima puede ser preparada sintéticamente por métodos
estándares establecidos, p. ej. el método de fosforamidita descrito
por S.L. Beaucage y M.H. Caruthers (1981) o el método descrito por
Matthes et al. (1984). En el método de fosforamidita, los
oligonucleótidos son sintetizados, p. ej. en un sintetizador de ADN
automático, purificados, anillados, ligados y clonados en vectores
apropiados.
Finalmente, la secuencia de ADN puede ser de
origen mezclado genómico y sintético, de origen mezclado sintético
y de ADNc o de origen mezclado genómico y de ADNc, preparada para
ligar fragmentos de origen sintético, genómico o de ADNc (según sea
apropiado, los fragmentos correspondientes a varias partes de la
secuencia de ADN entera), conforme a las técnicas estándares. La
secuencia de ADN puede también ser preparada por reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) usando cebadores específicos, por ejemplo
como se describe en US 4,683,202 o R.K. Saiki et al.
(1988).
Una vez que se ha aislado una secuencia de ADN
de codificación de \alpha-amilasa, y se han
identificado los sitios deseables para la mutación, las mutaciones
pueden ser introducidas usando oligonucleótidos sintéticos. Estos
oligonucleótidos contienen secuencias de nucleótidos que flanquean
los sitios de mutación deseados; los nucleótidos mutantes son
insertados durante la síntesis de oligonucleótidos. En un método
específico, un espacio monocatenario de ADN, que enlaza la
secuencia de codificación de \alpha-amilasa, está
creado en un soporte de vector del gen de
\alpha-amilasa. Luego el nucleótido sintético,
que soporta la mutación deseada, es anillado a una parte homóloga
del ADN monocatenario. El espacio restante es luego rellenado con
ADN polimerasa I (fragmento de Klenow) y el constructo es ligado
usando T4 ligasa. Un ejemplo específico de este método se describe
en Morinaga et al. (1984). US 4,760,025 expone la
introducción de oligonucleótidos que codifican mutaciones múltiples
mediante la realización de alteraciones menores del casete. No
obstante, una variedad incluso superior de mutaciones puede ser
introducida en cualquier momento por el método de Morinaga, porque
una multitud de oligonucleótidos, de varias longitudes, pueden ser
introducidas.
Otro método para introducir mutaciones en
secuencias de ADN de codificación de
\alpha-amilasa está descrita en Nelson y Long
(1989). Esto implica la generación en 3 fases de un fragmento de la
PCR que contiene la mutación deseada introducida usando una cadena
de ADN sintetizada químicamente como uno de los cebadores en las
reacciones de la PCR. Del fragmento generado por PCR, un fragmento
de ADN portador de la mutación puede ser aislado por seccionamiento
con endonucleasas de restricción y reinsertado en un plásmido de
expresión.
Mutagénesis aleatoria es realizada de manera
adecuada bien como mutagénesis aleatoria localizada o específica en
al menos tres partes del gen que traduce para la secuencia de
aminoácidos mostrada en cuestión, o dentro del gen entero.
La mutagénesis aleatoria de una secuencia de ADN
que codifica una \alpha-amilasa parental puede
ser convenientemente realizada usando cualquier método conocido en
la técnica.
En relación con lo anterior, otro aspecto de la
presente invención se refiere a un método para generar una variante
de una \alpha-amilasa parental, p. ej. donde la
variante muestra termoestabilidad alterada o aumentada con respecto
a la parental, el método comprendiendo:
(a) someter una secuencia de ADN que codifica la
\alpha-amilasa parental a mutagénesis
aleatoria,
(b) expresar la secuencia de ADN mutada obtenida
en la fase (a) en una célula huésped, y
(c) seleccionar las células huéspedes que
expresan una variante de \alpha-amilasa que tiene
una propiedad alterada (es decir, termoestabilidad) con respecto a
la \alpha-amilasa parental
\vskip1.000000\baselineskip
Fase (a) del método anterior de la invención es
preferiblemente realizado usando cebadores dopados.
Por ejemplo, la mutagénesis aleatoria puede ser
realizada usando un agente mutagenizante físico o químico adecuado,
usando un oligonucleótido adecuado, o sometiendo la secuencia de
ADN a mutagénesis generada por PCR. Además, la mutagénesis
aleatoria puede ser realizada usando cualquier combinación de estos
agentes mutagenizantes. El agente mutagenizante puede, p. ej., ser
uno que induce transiciones, transversiones, inversiones,
aleatorización, deleciones, y/o inserciones.
Ejemplos de un agente mutagenizante físico o
químico adecuado para el presente objetivo incluyen irradiación
ultravioleta (UV), hidroxilamina,
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(MNNG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, etil
metano de sulfonato (EMS), bisulfito de sodio, ácido fórmico, y
análogos de nucleótidos. Cuando tales agentes son usados, la
mutagénesis es normalmente realizada incubando la secuencia de ADN
que codifica la enzima madre para ser mutagenizada en presencia del
agente mutagenizante de elección bajo condiciones adecuadas para
que la mutagénesis tenga lugar, y seleccionando el ADN mutado con
las propiedades deseadas.
Cuando la mutagénesis es realizada por el uso de
un oligonucleótido, el oligonucleótido puede ser dopado o
adicionado con los tres nucleótidos no parentales durante la
síntesis del oligonucleótido en las posiciones que deben ser
cambiadas. El dopaje o adicionado puede ser hecho de modo que los
codones para los aminoácidos indeseados sean evitados. Los
oligonucleótidos dopados o adicionados pueden ser incorporados en
el ADN que codifica la enzima \alpha-amilasa por
cualquier técnica publicada, usando p. ej. PCR, LCR o cualquier ADN
polimerasa y ligasa según se estime apropiado.
Preferiblemente, el dopaje se realiza usando el
"dopaje aleatorio constante", donde el porcentaje de tipo
salvaje y la mutación en cada posición está predefinido. Además, el
dopaje puede ser dirigido hacia una preferencia para la
introducción de nucleótidos determinados, y de ese modo una
preferencia para la introducción de uno o más residuos de
aminoácidos específicos. El dopaje puede ser hecho, p. ej., para
permitir la introducción del 90% de tipo salvaje y del 10% de
mutaciones en cada posición. Una consideración adicional en la
elección de un esquema de dopaje se basa en limitaciones genéticas
así como en estructurales de las proteínas. El esquema de dopaje
puede ser hecho usando el programa DOPE que, entre otras cosas,
asegura que se evita la introducción de codones de parada.
Cuando se usa la mutagénesis generada por PCR,
bien un gen tratado químicamente o que codifica una
\alpha-amilasa parental no tratada es sometido a
PCR bajo condiciones que aumentan la desincorporación de nucleótidos
(Deshler 1992. Leung et al., Technique, Vol.1, 1989, págs.
11-15).
Una cepa mutágena de E. coli (Fowler
et al., Molec. Gen. Genet., 133, 1974, págs.
179-191), S. cereviseae o cualquier otro
organismo microbiano puede ser usada para la mutagénesis aleatoria
del ADN que codifica la \alpha-amilasa por, p.
ej., transformación de un plásmido conteniendo la glicosilasa
parental en la cepa mutágena, crecimiento de la cepa mutágena con el
plásmido y aislamiento del plásmido mutado de la cepa mutágena. El
plásmido mutado puede ser posteriormente transformado en el
organismo de expresión.
\newpage
La secuencia de ADN para ser mutagenizada puede
estar convenientemente presente en una biblioteca genómica o de
ADNc obtenida a partir de un organismo que expresa la
\alpha-amilasa parental. De forma alternativa, la
secuencia de ADN puede estar presente en un vector adecuado tal como
un plásmido o un bacteriófago, que como tal puede ser incubado con o
expuesto de otra manera al agente mutagenizante. El ADN para ser
mutagenizado puede también estar presente en una célula huésped
bien siendo integrado en el genoma de dicha célula o estando
presente en un vector albergado en la célula. Finalmente, el ADN
para ser mutagenizado puede estar en forma aislada. Se entenderá
que la secuencia de ADN para ser sometida a mutagénesis aleatoria
es preferiblemente una secuencia de ADNc o de ADN genómico.
En algunos casos puede ser conveniente
amplificar la secuencia de ADN mutada antes de realizar la fase de
expresión b) o la fase de selección c). Tal amplificación puede ser
realizada conforme a métodos conocidos en la técnica, el método
actualmente preferido siendo la amplificación generada por PCR
usando cebadores oligonucleótidos preparados basándose en la
secuencia de ADN o de aminoácidos de la enzima madre.
Después de la incubación con o exposición al
agente mutagenizante, el ADN mutado es expresado mediante cultivo
de una célula huésped adecuada llevando la secuencia de ADN bajo
condiciones que permiten que la expresión tenga lugar. La célula
huésped usada para este propósito puede ser una que haya sido
transformada con la secuencia de ADN mutada, opcionalmente presente
en un vector, o una que lleve la secuencia de ADN que codifica la
enzima madre durante el tratamiento de mutagénesis. Ejemplos de
células huéspedes adecuadas son los siguientes: bacterias gram
positivas tales como Bacillus subtilis, Bacillus
licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis,
Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus,
Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans,
Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus
megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces
lividans o Streptomyces murinus; y bacterias
gram-negativas tales como E. coli.
La secuencia de ADN mutada puede además
comprender una secuencia de ADN que codifica funciones que permiten
la expresión de la secuencia de ADN mutada.
La mutagénesis aleatoria puede estar
ventajosamente localizada en una parte de la
\alpha-amilasa parental en cuestión. Esto puede,
p. ej., ser ventajoso cuando ciertas regiones de la enzima han sido
identificadas para ser de importancia particular para una propiedad
dada de la enzima, y cuando se modifican se prevé que resultarán en
una variante con propiedades mejoradas. Tales regiones pueden
normalmente ser identificadas cuando la estructura terciaria de la
enzima madre ha sido dilucidada y relacionada con la función de la
enzima.
La mutagénesis aleatoria localizada, o
específica es convenientemente realizada usando técnicas de
mutagénesis generada por PCR como se ha descrito anteriormente o
cualquier otra técnica adecuada conocida en la técnica. De forma
alternativa, la secuencia de ADN que codifica la parte de la
secuencia de ADN para ser modificada puede ser aislada, p. ej., por
inserción en un vector adecuado, y dicha parte puede ser
posteriormente sometida a mutagénesis usando cualquiera de los
métodos de mutagénesis mencionados anteriormente.
Métodos alternativos para suministrar variantes
de la invención incluyen el método de transposición de genes
conocido en la técnica incluyendo los métodos p. ej. descritos en
WO 95/22625 (de Affymax Technologies N.V.) y WO 96/00343 (de Novo
Nordisk A/S).
Según la invención, una secuencia de ADN que
codifica la variante producida por métodos anteriormente descritos,
o por cualesquiera métodos alternativos conocidos en la técnica,
pueden ser expresados, en forma enzimática, usando un vector de
expresión que normalmente incluye las secuencias de control que
codifican un promotor, operador, sitio de unión al ribosoma, señal
de iniciación de la traducción, y, opcionalmente, un gen represor o
varios genes activadores.
El vector de expresión recombinante que lleva la
secuencia de ADN que codifica una variante de
\alpha-amilasa de la invención puede ser cualquier
vector que puede ser sometido convenientemente a procedimientos de
ADN recombinante, y la elección del vector frecuentemente dependerá
de la célula huésped en la que debe ser introducido. Así, el vector
puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector
que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es
independiente de la replicación cromosómica, p. ej. un plásmido, un
bacteriófago o un elemento extracromosómico, minicromosoma o un
cromosoma artificial. De forma alternativa, el vector puede ser uno
que, cuando se introduce en una célula huésped, se integra en el
genoma de la célula huésped y se replica con el(los)
cromosoma(s) en el(los) que ha sido integrado.
En el vector, la secuencia de ADN debería ser
operativamente conectada a una secuencia del promotor adecuada. El
promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestra actividad
transcripcional en la célula huésped de elección y puede ser
derivada de genes que codifican proteínas bien homólogas o
heterólogas a la célula huésped. Ejemplos de promotores adecuados
para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica
una variante de \alpha-amilasa de la invención,
especialmente en un huésped bacteriano, son el promotor del operón
lac de E. coli, los promotores del gen dagA de
agarasa de Streptomyces coelicolor, los promotores del gen de
\alpha-amilasa (amyL) de Bacillus
licheniformis, los promotores del gen de amilasa maltogénica
(amyM) de Bacillus stearothermophilus, los promotores
de la \alpha-amilasa (amyQ) de Bacillus
amyloliquefaciens, los promotores de los genes xylA y xylB de
Bacillus subtilis etc. Para la transcripción en un huésped
fúngico, ejemplos de promotores útiles son estos derivados del gen
que codifica la TAKA amilasa de A. oryzae, la proteinasa
aspártica de Rhizomucor miehei, la
\alpha-amilasa neutra de A. niger, la
\alpha-amilasa estable en ácido de A.
niger, la glucoamilasa de A. niger, la lipasa de
Rhizomucor miehei, la proteasa alcalina de A. oryzae,
la triosa fosfato isomerasa de A. oryzae o la acetamidasa de
A. nidulans.
El vector de expresión de la invención puede
también comprender un terminador de la transcripción adecuado y, en
eucariotas, las secuencias de poliadenilación conectadas
operativamente a la secuencia de ADN que codifica la variante de
\alpha-amilasa de la invención. Las secuencias de
terminación y de poliadenilación pueden derivar de manera adecuada
de las mismas fuentes que el promotor.
El vector puede además comprender una secuencia
de ADN que permite que el vector se replique en la célula huésped
en cuestión. Ejemplos de tales secuencias son los orígenes de
replicación de los plásmidos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1
y pIJ702.
El vector puede también comprender un marcador
seleccionable, p. ej. un gen cuyo producto implementa una falta en
la célula huésped, tal como los genes dal de B. subtilis o
B. licheniformis, o uno que confiere resistencia antibiótica
tal como resistencia a la ampicilina, la canamicina, el
cloranfenicol o la tetraciclina. Además, el vector puede comprender
marcadores de selección de Aspergillus tales como
amdS, argB, niaD y sC, un marcador que
da lugar a la resistencia a la higromicina, o la selección puede
ser realizada por cotransformación, p. ej. como se describe en WO
91/17243.
Mientras que la expresión intracelular puede ser
ventajosa en algunos aspectos, p. ej. cuando se usan bacterias
determinadas como las células huéspedes, es generalmente preferido
que la expresión sea extracelular. En general, las
\alpha-amilasas de Bacillus mencionadas
aquí comprenden una prerregión que permite la secreción de la
proteasa expresada en el medio de cultivo. Si se desea, esta
prerregión puede ser sustituida por una prerregión diferente o
secuencia señal, convenientemente realizada por sustitución de las
secuencias de ADN que codifican las prerregiones respectivas.
Los procedimientos usados para enlazar el
constructo de ADN de la invención que codifica una variante de
\alpha-amilasa, el promotor, terminador y otros
elementos, respectivamente, y para insertarlos en vectores adecuados
conteniendo la información necesaria para la replicación, son
conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo,
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd
Ed., Cold Spring Harbor, 1989).
La célula de la invención, bien comprendiendo un
constructo de ADN o un vector de expresión de la invención tal como
se ha definido anteriormente, es usado ventajosamente como una
célula huésped en la producción recombinante de una variante de
\alpha-amilasa de la invención. La célula puede
ser transformada con el constructo de ADN de la invención que
codifica la variante, integrando convenientemente el constructo de
ADN (en una o más copias) en el cromosoma huésped. Esta integración
está generalmente considerada como una ventaja puesto que la
secuencia de ADN es más propensa a ser mantenida de forma estable
en la célula. La integración de los constructos de ADN en el
cromosoma huésped puede ser realizada según métodos convencionales,
p. ej. por recombinación homóloga o heteróloga. De forma
alternativa, la célula puede ser transformada con un vector de
expresión como se ha descrito anteriormente en relación con los
diferentes tipos de células huéspedes.
La célula de la invención puede ser una célula
de un organismo mayor tal como un mamífero o un insecto, pero es
preferiblemente una célula microbiana, p. ej. una célula bacteriana
o una fúngica (incluyendo la levadura).
Ejemplos de bacterias adecuadas son bacterias
gram positivas tales como Bacillus subtilis, Bacillus
licheniformis, bacillus lentus, Bacillus brevis,
Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus,
Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans,
Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus
megaterium, Bacillus thuringiensis o Streptomyces
lividans o Streptomyces murinus, o bacterias
gram-negativas tales como E. coli. La
transformación de las bacterias puede, por ejemplo, ser efectuada
por transformación de protoplastos o usando células competentes de
una manera conocida per se.
El organismo de levadura puede ser seleccionado
favorablemente de una especie de Saccharomyces o
Schizosaccharomyces, p. ej. Saccharomyces cerevisiae.
El hongo filamentoso puede ventajosamente pertenecer a una especie
de Aspergillus, p. ej. Aspergillus oryzae o
Aspergillus niger. Células micóticas pueden ser
transformadas por un proceso que implica la formación de
protoplastos y la transformación de los protoplastos seguida por la
regeneración de la pared celular de una manera conocida per
se. Un procedimiento adecuado para la transformación de células
huéspedes de Aspergillus está descrito en EP 238 023.
En otro aspecto adicional, la presente invención
se refiere a un método para producir una variante de
\alpha-amilasa de la invención, dicho método
comprende el cultivo de una célula huésped como se ha descrito
anteriormente bajo condiciones propicias para la producción de la
variante y la recuperación de la variante de las células y/o del
medio de cultivo.
\newpage
El medio usado para cultivar las células pueden
ser cualquier medio convencional adecuado para el crecimiento de la
célula huésped en cuestión y la obtención de la expresión de la
variante de \alpha-amilasa de la invención.
Medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o
pueden ser preparados según recetas publicadas (p. ej. como se
describe en los catálogos de la American Type Culture
Collection).
La variante de \alpha-amilasa
segregada de las células huéspedes pueden ser recuperadas
convenientemente del medio de cultivo por procedimientos bien
conocidos, incluyendo la separación de las células del medio por
centrifugado o por filtración, y la precipitación de los componentes
proteináceos del medio mediante una sal tal como sulfato de amonio,
seguido del uso de procedimientos cromatográficos tales como la
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, o
similares.
Las variantes de
\alpha-amilasa de esta invención poseen
propiedades valiosas que permiten una variedad de aplicaciones
industriales. En particular, las variantes de la enzima de la
invención son aplicables como un componente en composiciones de
detergentes para lavar la ropa, la vajilla y de limpieza de
superficies duras. Numerosas variantes son particularmente útiles en
la producción de edulcorantes y etanol del almidón, y/o para el
desencolado textil. Condiciones para procesos de conversión del
almidón convencionales, incluyendo procesos de licuefacción y/o de
sacarificación del almidón, están descritos en, p. ej., US
3,912,590 y en las publicaciones de patentes EP Nos. 252 730 y 63
909.
Un proceso "tradicional" para la conversión
del almidón en jarabes de fructosa normalmente consiste en tres
procesos enzimáticos consecutivos, es decir, un proceso de
licuefacción seguido de un proceso de sacarificación y un proceso
de isomerización. Durante el proceso de licuefacción, el almidón es
degradado por dextrinas por una \alpha-amilasa (p.
ej. Termamyl^{TM}) a valores de pH entre 5.5 y 6.2 y a
temperaturas de 95-160ºC para un periodo de aprox. 2
horas. Para asegurar una estabilidad enzimática óptima bajo estas
condiciones, se añade 1 mM de calcio (40 ppm de iones de calcio
libre).
Después del proceso de licuefacción las
dextrinas son convertidas en dextrosa por adición de una
glucoamilasa (p. ej. AMG^{TM}) y una enzima desramificante, tal
como una isoamilasa o una pululanasa (p. ej. Promozyme^{TM}).
Antes de esta fase el pH es reducido a un valor debajo de 4.5,
manteniendo la temperatura elevada (por encima de 95ºC), y la
actividad licuefactora de la \alpha-amilasa es
desnaturalizada. La temperatura es bajada a 60ºC, y la glucoamilasa
y la enzima desramificante son agregadas. El proceso de
sacarificación procede durante 24-72 horas.
Después del proceso de sacarificación el pH es
aumentado a un valor en la gama de 6-8,
preferiblemente pH 7.5, y el calcio es eliminado por intercambio
iónico. El jarabe de dextrosa es luego convertido en jarabe rico en
fructosa usando, p. ej., una glucosaisomerasa inmovilizada (tal como
Sweetzyme^{TM}).
Al menos 1 mejora enzimática de este proceso
podría ser prevista. La reducción de la dependencia de calcio de la
\alpha-amilasa licuefactora. La adición de calcio
libre es requerida para asegurar una estabilidad adecuadamente alta
de la \alpha-amilasa, pero el calcio libre inhibe
fuertemente la actividad de la glucosaisomerasa y necesita ser
eliminada, mediante una operación de unidad costosa, hasta una
extensión que reduce el nivel de calcio libre por debajo de
3-5 ppm. Se podrían obtener ahorros en el coste si
tal operación pudiera ser evitada y el proceso de licuefacción
pudiera ser realizado sin adición de iones de calcio libre.
Para conseguir esto, una
\alpha-amilasa tipo Termamyl menos dependiente de
calcio que es estable y altamente activa a concentraciones bajas de
calcio libre (< 40 ppm) es requerida. Tal
\alpha-amilasa tipo Termamyl debería tener un pH
óptimo a un pH en la gama de 4.5-6.5,
preferiblemente en la gama de 4.5-5.5.
Como se ha mencionado anteriormente, variantes
de la invención pueden de manera adecuada ser incorporadas en
composiciones de detergentes. Una termoestabilidad aumentada a
concentraciones de calcio bajas serían muy provechosas para el
rendimiento de la amilasa en detergentes, es decir, la región
alcalina. Se hace referencia, por ejemplo, a WO 96/23874 y WO
97/07202 para detalles adicionales en lo que se refiere a
ingredientes pertinentes de composiciones de detergentes (tales como
detergentes para lavar la ropa o la vajilla), métodos apropiados de
formulación de las variantes en tales composiciones de detergentes,
y a ejemplos de tipos pertinentes de composiciones de
detergentes.
Composiciones de detergentes que comprenden una
variante de la invención pueden adicionalmente comprender una o más
enzimas adicionales, tales como una lipasa, cutinasa, proteasa,
celulasa, peroxidasa o lacasa, y/u otra
\alpha-amilasa.
Las variantes de
\alpha-amilasa de la invención pueden ser
incorporadas en detergentes a concentraciones empleadas de forma
convencional. Está actualmente contemplado que una variante de la
invención puede ser incorporada en una cantidad correspondiente a
0,00001-1 mg (calculada como proteína enzimática
pura activa) de \alpha-amilasa por litro de
solución de detergente para lavar la ropa/la vajilla usando niveles
de dosificación convencionales de detergente.
La invención también se refiere a una
composición comprendiendo una mezcla de una o más variantes de la
invención derivadas de (como la \alpha-amilasa
parental tipo Termamyl) la \alpha-amilasa de B.
stearothermophilus que tiene la secuencia mostrada en SEC ID
NO: 3 y una alfa-amilasa tipo Termamyl derivada de
la \alpha-amilasa de B. licheniformis que
tiene la secuencia mostrada en SEC ID NO: 4.
Además, la invención también se refiere a una
composición comprendiendo una mezcla de una o más variantes según
la invención derivada de (como la \alpha-amilasa
de parental tipo Termamyl) la \alpha-amilasa de
B. stearothermophilus que tiene la secuencia mostrada en la
SEC ID NO: 3 y una alfa-amilasa híbrida que
comprende una parte de la \alpha-amilasa de B.
amyloliquefaciens mostrada en la SEC ID NO: 5 y una parte de la
\alpha-amilasa de B. licheniformis
mostrada en la SEC ID NO: 4. Esta \alpha-amilasa
híbrida tipo Termamyl mencionada comprende los 445 residuos de
aminoácidos C-terminales de B. licheniformis
mostrados en la SEC ID NO: 4 y los 37 residuos de aminoácidos
N-terminales de la \alpha-amilasa
derivada de B. amyloliquefaciens mostrada en la SEC ID NO:
5. Esta última \alpha-amilasa híbrida mencionada
puede de manera adecuada comprender las mutaciones siguientes:
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (usando la numeración en la SEC ID
NO: 4). En los ejemplos abajo dicha \alpha-amilasa
híbrida parental tipo Termamyl, se usa en combinación con variantes
de la invención, dichas variantes pueden ser usadas en
composiciones de la invención.
En una forma de realización específica de la
invención la composición comprende una mezcla de TVB146 y LE174, p.
ej., en una proporción de 2:1 a 1:2, tal como 1:1.
Una variante de \alpha-amilasa
de la invención o una composición de la invención puede en un
aspecto de la invención ser usada para lavar la ropa y/o la
vajilla; para desencolado textil o para licuefacción de almidón.
BSG alfa-amilasa:
alfa-amilasa de B. stearothermophilus
representada en la SEC ID NO: 3.
Variante TVB146 de alfa-amilasa:
una variante de alfa-amilasa de B.
stearothermophilus representada en la SEC ID NO: 3 con las
mutaciones siguientes: con la deleción en las posiciones
1181-G182 + N193F. variante LE174 de
alfa-amilasa híbrida:
LE174 es una alfa-amilasa
híbrida tipo Termamyl que es idéntica a la secuencia de Termamyl,
es decir, la \alpha-amilasa de Bacillus
licheniformis mostrada en la SEC ID NO: 4, a excepción de que
los 35 residuos de aminoácidos N-terminales (de la
proteína madura) han sido sustituidos por los 33 residuos
N-terminales de BAN (proteína madura), es decir, la
alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens
mostrada en la SEC ID NO: 5, que además tiene las siguientes
mutaciones:
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (usando la
numeración de la SEC ID NO: 4). LE174 fue construida por
SOE-PCR (Higuchi et al. 1988, Nucleic Acids
Research 16:7351).
Una cepa de B. subtilis que alberga el
plásmido de expresión pertinente es dispuesta en líneas en una
placa de LB-agar con 10 \mug/ml de canamicina a
partir de materia prima a -80ºC, y crecida durante toda la noche a
37ºC. Las colonias son transferidas a 100 ml de medios de BPX
suplementados con 10 \mug/ml de canamicina en un matraz de
agitación de 500 ml.
Composición de medio BPX:
El cultivo es agitado a 37ºC a 270 rpm durante 5
días.
Células y detritos celulares son eliminados del
caldo de fermentación por centrifugado a 4500 rpm en
20-25 minutos. Después el sobrenadante es filtrado
para obtener una solución completamente clara. El filtrado es
concentrado y lavado en un filtro UF (membrana de corte de 10000) y
el tampón es cambiado a 20 mM de acetato a pH 5.5. El filtrado UF
es aplicado en una S-sepharose F.F. y la elución se
realiza por elución de fase con 0,2M de NaCl en el mismo tampón. El
eluato es dializado contra 10 mM de Tris, pH 9.0 y aplicado en una
Q-sepharose F.F. y eluido con un gradiente lineal de
0-0,3M de NaCl sobre 6 volúmenes de columna. Las
fracciones que contienen la actividad (medida por el ensayo
Phadebas) son agrupadas, el pH fue ajustado a pH 7.5 y el color
restante fue eliminado por un tratamiento con 0,5% p/vol. carbón
activo en 5 minutos.
Una unidad Kilo Novo de
alfa-amilasa (1 KNU) es la cantidad de enzima que
degrada 5,26 g de almidón (Merck, Amylum Solubile, Erg. B 6, lote
9947275) por hora en el método estándar de Novo Nordisk para la
determinación de alfa-amilasa basada en la condición
siguiente:
Una descripción detallada del método analítico
de Novo Nordisk (AF 9) está disponible bajo pedido.
Este método se utiliza para determinar la
actividad \alpha-amilasa en fermentación y
recuperación de muestras y productos formulados y granulados.
La BS-amilasa degrada el
sustrato
(4,6-etilideno(G_{7})-p-nitrofenil(G_{1})-\alpha,D-maltoheptaósido
(escrito como etilideno-G_{7}-PNP)
en, entre otras cosas, G_{2}-PNP y
G_{3}-PNP, donde G se refiere a glucosa y PNP a
p-nitrofenol.
G_{2}-PNP y
G_{3}-PNP son degradados por
\alpha-glucosidasa, que se añade en exceso, en
glucosa y el p-nitrofenol coloreado de amarillo.
La reacción del color es vigilada in situ
y el cambio de absorbencia en el tiempo es calculado como una
expresión de la velocidad de la reacción y por lo tanto de la
actividad de la enzima. Véanse las pautas de Boehringer Mannheim
1442 309 para detalles adicionales.
La actividad alfa-amilasa de
Bacillus stearotermofius (BS-amilasa) es
determinada respecto a un estándar de actividad declarada y
establecida en unidades Kilo Novo (Stearothermophilus) o
KNU(S)).
Límite de determinación: aprox. 0.4
KNU(s)/g
Analizador de Cobas Fara
Diluido (p. ej. Hamilton Microlab 1000)
Equilibrio analítico (p. ej. Mettler AE 100)
Placas de agitación
Un equipo preparado se usa en este análisis para
determinar la actividad \alpha-amilasa. Obsérvese
que los reactivos específicos para el sustrato y la
\alpha-glucosidasa no se usan como se describe en
las pautas de Boehringer Mannheim. No obstante, las designaciones
"tampón", "cristal 1", cristal 1a" y cristal 2" son
aquellas a las que se hace referencia en estas pautas.
4,6-etilideno(G_{7})-p-nitrofenil(G_{1})-\alpha,D-maltoheptaósido
(escrito como
etilideno-G_{7}-PNP) p. ej.
Boehringer Mannheim 1442 309
\alpha-glucosidasa, p. ej.
Boehringer Mannheim 1442 309
El estándar pertinente es diluido a 0.60
KNU(s)/ml como sigue. Una cantidad calculada de estándar es
pesada y añadida a un matraz aforado de 200 ml, que es rellenado
hasta alrededor de la marca de 2/3 con agua desmineralizada. Se
añade estabilizador correspondiente al 1% del volumen del matraz y
el matraz es rellenado hasta la marca con agua desmineralizada. Se
utiliza un Hamilton Microlab 1000 para producir las diluciones
mostradas abajo. Agua desmineralizada con 10/0 de estabilizador se
usa como el diluyente.
Un control del nivel de BS amilasa de Novo
Nordisk A/S está incluido en todas las series usando el Cobas Fara.
El control es diluido con 1% estabilizador de modo que la dilución
final está en la gama de la curva estándar. Todos los pesos y
diluciones están anotados en la lista de trabajo
Muestras de fermentación (no muestras finales) a
partir de la producción, todas las muestras de fermentación de
instalaciones experimentales y muestras de estabilidad de
almacenamiento son pesadas y analizadas una vez sólo.
Muestras de proceso, muestras de fermentación
final a partir de la producción, muestras de estudios de GLP y
muestras de R&D son pesadas y analizadas dos veces.
Muestras de producto acabado son pesadas y
analizadas dos veces en dos series separadas.
Muestras de prueba son diluidas con agua
desmineralizada con el 1% de estabilizador hasta aprox. 0.037
KNU(S)/ml basándose en su actividad prevista. La dilución
final es hecha directamente en el vaso de muestra.
- \sqbullet
- El Programa de menú de Cobas se utiliza para sugerir el peso/diluciones de muestras y el control de nivel que debe ser usado.
- \sqbullet
- Las muestras son introducidas en el programa con un único código de identificación y una lista de trabajo es impresa
- \sqbullet
- Las muestras y control son pesados y diluidos como se establece en la lista de trabajo con los datos de peso escritos a mano se insertan en el cuaderno de trabajo para el análisis de BS-amilasa
- \sqbullet
- Los resultados son computerizados automáticamente por el Cobas Fara como se describe en artículo 9 y se imprime junto con la curva estándar.
- \sqbullet
- Las listas de trabajo y resultados impresos son insertados en el cuaderno de trabajo para el análisis de BS-amilasa.
- \sqbullet
- Las muestras son colocadas en el porta muestras
- \sqbullet
- Los cinco estándares son colocados en el bastidor de calibrado en la posición 1 a 5 (estándar más fuerte en la posición 5), y el control colocado en el mismo bastidor en la posición 10.
- \sqbullet
- El sustrato es transferido a un contenedor de reactivo de 30 ml y colocado en un bastidor de reactivo en la posición 2 (soporte 1).
- \sqbullet
- El reactivo auxiliar de \alpha-glucosidasa es transferido a un contenedor de reactivo de 50 ml y colocado en el bastidor de reactivo en la posición 2 (soporte C)
Los principios principales del análisis son los
siguientes: 20 \muL de muestra y 10 \muL de agua de enjuague
son introducidos con pipeta en la cubeta junto con 250 \muL de
reactivo auxiliar de \alpha-glucosidasa. La cubeta
gira durante 10 segundos y los reactivos son expulsados en las
cubetas horizontales. 25 \muL de sustrato y 20 \muL de agua de
enjuague son extraídos con pipeta. Después de un 1 segundo de
espera para asegurar que la temperatura es de 37ºC, la cubeta gira
otra vez y el sustrato es mezclado en las cubetas horizontales. La
absorbencia es medida por primera vez después de 120 segundos y
luego cada 5 segundos. La absorbencia es medida un total de 37
veces para cada muestra.
La actividad de las muestras es calculada
respecto a Novo Nordisk A/S estándar.
La curva estándar es trazada por el analizador.
La curva debe ser suavemente curvada, enjuagando sin parar hasta
una absorbencia de alrededor de 0.25 para el estándar nº. 5.
La actividad de las muestras en KNU(S)/ml
es leída de la curva estándar por el analizador.
Los cálculos finales para permitir que los
pesos/diluciones usados emplean la fórmula siguiente:
Actividad en
KNU (S)/g = S x V x
F/W
S = lectura del resultado del análisis
(KNU(S)/mL
V = volumen de matraz aforado usado en mL
F = factor de dilución para segunda dilución
W = peso de muestra enzimática en g
Los resultados están establecidos con 3 dígitos
significantes. No obstante, para la actividad de la muestra < 10
KNU(S)/g, sólo 2 dígitos significantes están provistos.
Las siguientes reglas se aplican en el cálculo
de valores medios:
1. Los datos que se desvían más de 2
desviaciones estándares del valor medio no están incluidos en el
cálculo.
2. Determinación única y doble sobre una
serie:
El valor medio es calculado en base de
resultados que figuran dentro del área de actividad de la curva
estándar.
3. Determinaciones dobles sobre dos series:
todos los valores están incluidos en el valor medio. Los valores
atípicos están omitidos.
El coeficiente de variación es del 2,9% basado
en la validación retrospectiva de resultados de análisis para
varios productos finales y el control de nivel.
La actividad \alpha-amilasa
está determinada por un método que utiliza comprimidos Phadebas®
como sustrato. Comprimidos de Phadebas (prueba de amilasa de
Phadebas®, suministrados por Pharmacia Diagnostic) contienen un
polímero de almidón coloreado de azul insoluble reticulado que ha
sido mezclado con albúmina de suero bovino y una sustancia de
tampón y dispuesto en comprimidos.
Para cada medición única una pastilla es
suspendida en un tubo que contiene 5 ml de tampón
Britton-Robinson 50 mM (50 mM de ácido acético, 50
mM de ácido fosfórico, 50 mM de ácido bórico, 0.1 mM de CaCl_{2},
pH ajustado al valor de interés con NaOH). La prueba es realizada
al baño maría a la temperatura de interés. La
\alpha-amilasa que debe evaluarse es diluida en x
ml de 50 mM de tampón Britton-Robinson. 1 ml de
esta solución de \alpha-amilasa se añade a 5 ml
de tampón Britton-Robinson 50 mM. El almidón es
hidrolizado por la \alpha-amilasa dando
fragmentos azules solubles. La absorbencia de la solución azul
resultante, medida espectrofotométricamente a 620 nm, es una función
de la actividad \alpha-amilasa.
Es importante que la absorbencia de 620 nm
medida después de 10 o 15 minutos de incubación (duración de la
prueba) esté en el rango de 0.2 a 2.0 unidades de absorbencia a 620
nm. En este rango de absorbencia hay linealidad entre actividad y
absorbencia (ley de Lambert-Beer). La dilución de la
enzima debe en consecuencia ser ajustada para cumplir este
criterio. Bajo un grupo especifico de condiciones (temp., pH,
tiempo de reacción, condiciones de tampón) 1 mg de una
\alpha-amilasa dada hidrolizará una cantidad
determinada de sustrato y un color azul será producido. La
intensidad del color es medida a 620 nm. La absorbencia medida es
directamente proporcional a la actividad específica (actividad/mg
de proteína \alpha-amilasa pura) de la
\alpha-amilasa en cuestión bajo el conjunto de
condiciones dadas.
El gen que codifica BSG, amyS, está localizado
en el plásmido pPL1117. Este plásmido contiene también el gen que
confiere resistencia a la canamicina y un origen de replicación,
ambos obtenidos del plásmido pUB110 (Gryczan, T.J. et al
(1978) J.Bact 134:318-329).
La secuencia de ADN de la parte madura de amyS
está mostrada como la SEC ID NO: 11 y la secuencia de aminoácidos
de la proteína madura está mostrada como la SEC ID NO: 3
La variante TVB145 de BSG, que contiene una
deleción de 6 nucleótidos correspondientes a los aminoácidos
1181-G182 en la proteína madura, es construida como
sigue:
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es
utilizada para amplificar la parte del gen amyS (del plásmido
pPL1117), localizada entre los cebadores de ADN BSG1 (SEC ID Nº:
15) y BSGM2 (SEC ID Nº: 18). BSG1 es idéntico a una parte del gen
amyS mientras que BSGM2 contiene la deleción de 6 bp de
nucleótidos. Una reacción PCR estándar se realiza: 94ºC durante 5
minutos, 25 ciclos de (94ºC durante 45 segundos, 50ºC durante 45
segundos, 72ºC durante 90 segundos), 72ºC durante 7 minutos usando
la polimerasa Pwo bajo condiciones recomendadas por el fabricante,
Boehringer Mannheim Gmbh.
La banda amplificada de aproximadamente 550 bp
resultante fue usada como un megaprimer (Barik, S and Galinski, MS
(1991): Biotechniques 10: 489-490) junto con el
cebador BSG3 en una segunda PCR con pPL1117 como molde dando como
resultado un fragmento de ADN de aproximadamente 1080 bp.
Este fragmento de ADN es digerido con
endonucleasas de restricción Acc65I y SalI y el fragmento
resultante de aproximadamente 550 bp es ligado en el plásmido
pPL1117 digerido con las mismas enzimas y transformadas en la cepa
SHA273 de Bacillus subtilis delecionada de proteasa y de
amilasa (descrita en WO92/11357 y WO95/10603).
Los transformantes resistentes a la canamicina y
degradantes del almidón fueron analizados para la presencia de las
mutaciones deseadas (digestión de restricción para verificar la
introducción de un sitio HindIII en el gen). La secuencia de ADN
entre los sitios de restricción Acc65I y SalI fue verificada por la
secuenciación del ADN para asegurar la presencia de sólo las
mutaciones deseadas.
La variante TVB146 de BSG que contiene la misma
deleción de 6 nucleótidos como TVB145 y una sustitución adicional
de asparagina 193 para una fenilalanina, N193F, fue construida en
una vía similar como TVB145 utilizando el cebador BSGM3 (SEC ID Nº:
19) en la primera PCR.
La variante TVB161 de BSG, conteniendo la
deleción de 1181-G182. N193F, y L204F, se construye
de una manera similar a las dos variantes precedentes con la
excepción de que el molde para las reacciones de la PCR sea el
plásmido pTVB146 (pPL1117 conteniendo las mutaciones de TVB146
dentro de amyS y el oligonucleótido mutagénico para la primera PCR
sea BSGM3.
La variante TVB162 de BSG, conteniendo la
deleción de I181-G182. N193F, y E210H, es
construida en una vía similar como TVB161 a excepción de que el
oligonucleótido mutagénico es BSGM4 (SEC ID Nº: 20).
La variante TVB163 de BSG, conteniendo la
deleción de I181-G182. N193F, y E214Q, es
construida en una vía similar como TVB161 a excepción de que el
oligonucleótido mutagénico es BSGM5 (SEC ID Nº: 21).
Las variantes de BSG arriba construidas fueron
luego fermentadas y purificadas como se ha descrito anteriormente
en la sección "Materiales y Métodos".
\vskip1.000000\baselineskip
Normalmente, el proceso de licuefacción
industrial funciona usando pH 6.0-6.2 como pH de
licuefacción y una adición de 40 ppm de calcio libre para mejorar
la estabilidad a 95ºC-105ºC. Algunas sustituciones
aquí propuestas han sido hechas para mejorar la estabilidad a
1. pH inferior a pH 6.2 y/o
2. a niveles de calcio libre inferiores a 40 ppm
de calcio libre.
Dos métodos diferentes han sido usados para
medir las mejoras en estabilidad obtenidas por las diferentes
sustituciones en la \alpha-amilasa de B.
stearotermophilus:
Método 1. Un ensayo que mide la estabilidad a pH
reducido, pH 5.0, en presencia de 5 ppm de calcio libre. 10 \mug
de la variante fueron incubadas bajo las condiciones siguientes:
una solución de acetato 0.1 M, pH ajustado a pH 5.0, que contiene 5
ppm de calcio y 5% p/p de almidón de maíz común (libre de calcio).
La incubación fue hecha al baño maría a 95ºC durante 30 minutos.
Método 2. Un ensayo que mide la estabilidad en
la ausencia de calcio libre y donde el pH es mantenido a pH 6.0.
Este ensayo mide la reducción en la sensibilidad de calcio: 10
\mug de la variante fueron incubados bajo las condiciones
siguientes: una solución de acetato 0.1 M, pH ajustado a pH 6.0,
que contiene 5% p/p de almidón de maíz común (libre de calcio). La
incubación fue hecha al baño maría a 95ºC durante 30 minutos.
Todos los procesos de estabilidad 1, 2 han sido
hechos usando la misma configuración. El método fue:
La enzima fue incubada bajo las condiciones
pertinentes (1-4). Las muestras fueron tomadas a 0,
5, 10, 15 y 30 minutos y diluidas 25 veces (misma dilución para
muestras tomadas) en tampón de ensayo (0.1 M Tampón de Britton 50 mM
pH 7.3) y la actividad fue medida usando el ensayo Phadebas
(Pharmacia) bajo condiciones estándares pH 7.3, 37ºC.
La actividad medida antes de la incubación (0
minutos) fue usada como referencia (100%). El descenso en
porcentaje fue calculado como función del período de incubación. La
tabla muestra la actividad residual después de 30 minutos de
incubación.
Método de estabilidad 1. / Mejora de la
estabilidad a bajo pH
Método de estabilidad 1. / Mejora de estabilidad
a pH bajo
La temperatura descrita en método 1 ha sido
reducida de 95ºC a 70ºC puesto que las amilasas mencionadas para la
SEC ID NO: 1 y 2 tiene una termoestabilidad inferior que aquella
para la SEC ID NO: 3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Método de estabilidad 2. / Sensibilidad a bajo
calcio
\newpage
La actividad específica fue determinada usando
el ensayo Phadebas (Pharmacia) como actividad/mg de enzima. La
actividad fue determinada usando el ensayo de
\alpha-amilasa descrito en la sección Materiales y
Métodos de la
presente.
presente.
La actividad específica de la enzima madre y una
mutación única y doble fue determinada para:
\vskip1.000000\baselineskip
Experimentos de licuefacción en instalación
experimental fueron realizados en el sistema
mini-jet usando una dosificación de 50 NU (S)/g DS a
pH 5.5 con 5 ppm de Ca^{++} añadido, para comparar el rendimiento
de la variante de BSG alfa-amilasa TVB146 formulada
(SEC ID Nº: 3 con deleción en posiciones 1181-G182
+ N193F) con aquella de BSG alfa-amilasa madre (SEC
ID Nº: 3). La reacción fue vigilada midiendo el aumento de DE
(método de Neocuproina) como función de tiempo.
Mezclas de almidón de maíz fueron preparadas
suspendiendo 11,8 kg de Cerestar C*Pharm GL 03406 (89% almidón) en
agua desionizada y compensando hasta 30 kg. El pH fue ajustado a
5.5 a temperatura ambiente, después de la adición de 0,55 g de
CaCl_{2}.2H_{2}O.
Las enzimas siguientes fueron usadas:
\vskip1.000000\baselineskip
Una cantidad de enzima correspondiente a 50 NU
(SM9)/g DS fue añadida, y la conductividad ajustada a 300 mS usando
NaCl. Las condiciones estándares fueron las siguientes:
Después del sometimiento a presión, el almidón
licuado fue recogido y transportado en
termo-matraces sellados de la instalación
experimental al laboratorio, donde se continuó la licuefacción
secundaria a 95ºC.
10 ml de muestras fueron tomadas a intervalos de
15 minutos de 15-90 minutos. 2 gotas de 1 N HCl
fueron añadidas para inactivar la enzima. A partir de estas
muestras, 0,3-0,1 g (según el DE previsto) fueron
pesadas y diluidas a 100 ml. Azúcares de reducción fueron luego
determinados según el método Neocuproina (Determinación de azúcar
de reducción con precisión mejorada. Dygert, Li, Florida and Thomas
(1965). Anal. Biochem 13: 368) y los valores de DE determinados. El
desarrollo de DE como función del tiempo está provisto en la
siguiente tabla:
Como se puede observar la variante de
alfa-amilasa TVB146 dio mejor rendimiento
significativamente bajo condiciones de aplicación industrialmente
relevantes a niveles bajos de calcio que la BSG
alfa-amilasa madre.
\vskip1.000000\baselineskip
La cocción a presión y licuefacción usando una
combinación de las variantes de alfa-amilasa,
TVB146 y LE174 (proporción 1:1) fueron realizadas en las
condiciones siguientes:
Almidón de maíz en polvo de grado alimentario
Sustrato A.E. Staley (100lbs) D.S. 35% usando agua DI
Ca^{2+} Libre 2.7 ppm a pH 5.3 (ningún
añadido, del almidón sólo) pH 5.3 inicial
Unidades en dosis de AF9 (AF9 está disponible
bajo pedido) para cada variante enzimática fue 28 NU/g de almidón
db para una dosis total de 56 NU/g de temperatura en licuefacción
primaria 105ºC
Tiempo de mantenimiento en licuefacción primaria
5 minutos
Temperatura en licuefacción secundaria 95ºC
A 15 minutos en licuefacción secundaria 1.5 gms
de hidrolizado fue añadido a un litro volumétrico pesado que
contiene 500 cc de agua DI y 1 ml de un HCl normal y el peso exacto
añadido fue registrado. Esto fue repetido a intervalos de 15
minutos hasta a 90 minutos con un punto adicional a 127 minutos.
Estos fueron diluidos hasta un litro y determinados para
equivalencia de dextrosa por medio del método de Neocuproina como
se describe por Dygert, Li, Florida and Thomas. Determination of
reducing sugar with improved precision (1965). Anal. Biochem 13:
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\vskip1.000000\baselineskip
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solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector. No forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
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\bulletDYGERT, LI, FLORIDA
THOMAS Determination of reducing sugar with improved precision
Anal. Biochem, 1965, vol. 13, 368- [0169]
\bulletKLEIN, C. et al.
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\bulletLAWSON, C.L. J. Mol.
Biol., 1994, vol. 236, 590-600 [0171]
\bulletQIAN, M. et al. J.
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\bulletBOEL et al.
Biochemistry, 1990, vol. 29, 6244-6249
[0171]
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: NOVO NORDISK A/S
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: novo Alle
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: DK-2880 Bagsvaerd
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Dinamarca
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): DK-2880
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: +45 44 44 88 88
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: +45 44 49 32 56
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: VARIANTES DE AMILASA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 21
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 485 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 485 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 514 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 483 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 480 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 485 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 485 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 485 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1455 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1455 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1548 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1920 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN:421..1872
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2084 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN:343..1794
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1455 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1455 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador BSG1"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador BSG3"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 70 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador BSGM1"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador BSGM2"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador BSGM3"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador BSGM4"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador BSGM5"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 21:
Claims (28)
1. Una variante de una
\alpha-amilasa parental tipo Termamyl, donde la
\alpha-amilasa parental tipo Termamyl es
seleccionada entre:
(i) SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3,
SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7 o SEC ID NO:
8;
(ii) una \alpha-amilasa
parental tipo Termamyl que tiene al menos el 80% de homología para
una de las secuencias en (i);
y donde la variante tiene actividad
\alpha-amilasa y comprende las mutaciones
siguientes 1181* y G182* y N193F en SEC ID NO: 3 o en posiciones
correspondientes en otra \alpha-amilasa parental
tipo Termamyl.
\vskip1.000000\baselineskip
2. La variante según la reivindicación 1, donde
la \alpha-amilasa tipo Termamyl parental tiene al
menos un 90% de homología con una de las secuencias en (i).
3. La variante según la reivindicación 2, donde
la \alpha-amilasa tipo Termamyl parental tiene al
menos el 95% de homología con una de las secuencias en (i).
4. La variante según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo además la sustitución E214Q
en la posición 214 en la SEC ID NO: 3 o en una posición
correspondiente en otra \alpha-amilasa tipo
Termamyl parental.
5. Un constructo de ADN comprendiendo una
secuencia de ADN que codifica una variante de
\alpha-amilasa según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4.
6. Un vector de expresión recombinante que lleva
un constructo de ADN según la reivindicación 5.
7. Una célula aislada que es transformada con un
constructo de ADN según la reivindicación 5 o un vector según la
reivindicación 6.
8. La célula según la reivindicación 7, que es
un microorganismo.
9. La célula según la reivindicación 8, que es
una bacteria o un hongo.
10. La célula según la reivindicación 9, que es
una bacteria Gram positiva.
11. La célula según la reivindicación 10, donde
la bacteria Gram positiva es seleccionada entre Bacillus
subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus
lentus, Bacillus brevis, Bacillus
stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus
amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus
circulans, Bacillus lautus o Bacillus
thuringiensis.
12. Un aditivo de detergente comprendiendo una
variante de \alpha-amilasa según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4.
13. El aditivo de detergente según la
reivindicación 12, donde el aditivo detergente está en forma de un
granulado no pulverulento, líquido estabilizado o enzima
protegida.
14. El aditivo de detergente según la
reivindicación 12 o 13, que contiene 0,02-200 mg de
proteína enzimática/g de aditivo.
15. El aditivo de detergente según cualquiera de
las reivindicaciones 12 a 14, que adicionalmente comprende otra
enzima.
16. El aditivo de detergente según la
reivindicación 15, donde la otra enzima es seleccionada entre una
proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra enzima amilolítica y/o
una celulasa.
17. Una composición de detergente comprendiendo
una variante de \alpha-amilasa según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4.
18. La composición de detergente según la
reivindicación 17, que adicionalmente comprende otra enzima.
19. La composición de detergente según la
reivindicación 18, donde la otra enzima es seleccionada entre una
proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra enzima amilolítica y/o
una celulasa.
20. Una composición de detergente para lavar la
vajilla a mano o a máquina comprendiendo una variante de
\alpha-amilasa según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4.
21. La composición de detergente para lavar la
vajilla según la reivindicación 20, que adicionalmente comprende
otra enzima.
22. La composición de detergente para lavar la
vajilla según la reivindicación 21, donde la otra enzima es
seleccionada entre una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra
enzima amilolítica y/o una celulasa.
23. Una composición de detergente para lavar la
ropa a mano o a máquina comprendiendo una variante de
\alpha-amilasa según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4.
24. La composición de detergente para lavar la
ropa según la reivindicación 23, que adicionalmente comprende otra
enzima.
25. La composición de detergente para lava la
ropa según la reivindicación 24, donde la otra enzima es
seleccionada entre una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, una
enzima amilolítica y/o una celulasa.
26. Uso de una variante de
\alpha-amilasa según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, para lavar la ropa y/o la vajilla.
27. Uso de una variante de
\alpha-amilasa según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, para desencolado textil.
28. Uso de una variante de
\alpha-amilasa según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, para licuefacción del almidón.
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