ES2321045T3 - Metodo para detectar salmonella a partir de un cultivo enriquecido. - Google Patents
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Abstract
Un método de determinación microbiológica, caracterizado por que las bacterias pertenecientes al género Salmonella se detectan con claridad en el medio de cultivo antes del pico de crecimiento poblacional mediante el uso de antígenos fimbriales proteínaceos cuyas células se expresan tras su inoculación en el medio y con anterioridad a la fase de crecimiento logarítmico o al comienzo de ésta.
Description
Método para detectar salmonella a partir
de un cultivo enriquecido.
Actualmente la Salmonella es uno de los
principales contaminantes bacterianos presentes en alimentos. Su
capacidad para adaptarse rápidamente, por la cual se caracteriza,
dificulta su detección. En la actualidad existen más de 2000 cepas
de Salmonella identificadas, de las cuales en torno a 100 son
destacables en términos higiénicos y clínicos. La Salmonella
es una causa frecuente de enfermedades entéricas en seres humanos y
animales. El número de cepas de mayor relevancia presentes durante
epidemias es aproximadamente de diez. La presencia de la
Salmonella en alimentos suele provocar que un gran número de
personas se vean expuestas a la infección. La detección de la
fuente original de contaminación es a menudo una tarea compleja.
Los alimentos o el agua contaminados constituyen fuentes comunes de
propagación del contagio. La Salmonella pertenece a las
denominadas bacterias entéricas. La mayoría de las cepas provocan
gastroenteritis.
Por regla general, las Salmonellas
habitan en el exterior del cuerpo de las personas y animales huésped
en condiciones de crecimiento muy deficientes. Estas bacterias
tienen que sobrevivir y mantener su viabilidad por ejemplo en el
agua, donde normalmente otros microbios compiten con ellos por los
nutrientes. En estas circunstancias es muy común que las células
evolucionen y se conviertan en células en reposo. Una vez que
alcanzan unas condiciones de crecimiento adecuadas deben adaptarse
rápidamente a las nuevas condiciones para poder colonizar, por
ejemplo, la superficie epitelial de las células del tracto
gastrointestinal.
Fuera del cuerpo, la Salmonella y otras
bacterias entéricas suelen estar expuestas a condiciones de elevado
estrés medioambiental. Cuando la Salmonella u otros
microorganismos penetran en el cuerpo con los alimentos, alcanzan
rápidamente el ambiente de pH bajo del estómago, lo que destruye un
elevado número de células vivas microbianas. Por otro lado, un pH
bajo también disocia los apéndices en la superficie de las células,
de las cuales, especialmente las fimbrias o estructuras análogas se
utilizan para adherirse sobre el epitelio. Una vez han penetrado en
el duodeno, para invadir el organismo, las Salmonellas y
otras especies entéricas patógenas deben sintetizar rápidamente los
componentes de los distintos filamentos de unión y construir
correspondientemente estos apéndices en la superficie de las
células. Estos filamentos pueden servir de base de métodos
inmunológicos de detección de microbios, puesto que normalmente son
altamente inmunogénicos. Asimismo, pueden disociarse en las
moléculas independientes que los componen. Del mismo modo, para la
detección inmunológica de microbios, puede aprovecharse la
detección de los flagelos que numerosas bacterias sintetizan para
poder moverse, así como la proteína flagelina, componente principal
del flagelo.
Por lo general, antes de utilizar un método de
detección inmunológica, el cultivo de Salmonella o la muestra
o el cultivo de la bacteria entérica, otras bacterias u otros
microorganismos deben desarrollarse selectivamente y deben
enriquecerse los microbios deseados.
Normalmente, en un cultivo de enriquecimiento,
la muestra o cultivo suele cultivarse durante el tiempo suficiente
para que las células en cuestión superen con creces el número de las
de la muestra original, lo cual suele requerir al menos 12 horas.
Generalmente, es de esperar que el número de antígenos también
aumente en una proporción aproximadamente directa al número de
células o a la masa celular.
Uno de los principales objetivos de la higiene
de los alimentos y el agua, entre otros, es la prevención de la
propagación de la Salmonella. Este es el motivo por el cual
la detección de la Salmonella y otros microbios similares
constituye un importante campo de expansión para la investigación y
la actividad económica. El problema de la utilización de métodos
tradicionales de cultivo bacteriano para diagnósticos de
Salmonella y otros patógenos es que la obtención de
resultados requiere mucho tiempo. Esto genera gastos muy elevados
por ejemplo en la industria alimentaria, en la que suele ser
necesario almacenar los productos mientras se esperan los
resultados del control higiénico o retirarlos del mercado o de la
cadena de distribución en caso de que éstos concluyan la
contaminación con Salmonella u otras bacterias.
Recientemente, los trabajos de investigación y el desarrollo
destinados a la determinación microbiana vienen centrándose en la
búsqueda de métodos de detección de microbios más rápidos.
Son necesarios métodos más rápidos, fiables y
eficaces de muestreo clínico en los hospitales y de categorización
higiénica de cepas microbianas resistentes a los antibióticos. Estos
métodos deben servir al mismo tiempo para la detección de microbios
en las condiciones más sencillas posibles, incluso fuera de los
laboratorios.
Asimismo, la industria alimentaria requiere
métodos de detección y enriquecimiento nuevos y rápidos para
mantener la seguridad de los productos, reducir el tiempo de
almacenamiento y controlar las materias primas. Por otra parte,
distintos análisis medioambientales y de agua, cuya importancia se
ha incrementado en los últimos tiempos, requieren urgentemente
métodos de este tipo.
En la detección de microbios a partir de por
ejemplo muestras clínicas, muestras de alimentos o medioambientales,
las concentraciones microbianas de la muestra original suelen ser
tan bajas que son necesarios los denominados métodos de
enriquecimiento. Estos métodos aumentan la cantidad y concentración
de microbios detectados en la muestra. Se utilizan métodos
microbianos específicos de cultivo, que suelen implicar la
utilización de un factor selectivo para prevenir la multiplicación
de otros microbios. Este factor puede ser una sustancia química, un
antibiótico o producto equivalente, o un determinado factor físico,
como la presión parcial de un gas. El pH puede constituir también
un factor selectivo. A menudo, en una selección, puede aprovecharse
la sinergia de los distintos factores selectivos para el cultivo de
enriquecimiento del microbio deseado.
La necesidad de recurrir a métodos de
enriquecimiento para la detección de microbios implica una pérdida
de tiempo significativa y por tanto, lo más deseable el ahorro de
tiempo en estos procedimientos supondría una gran ventaja.
La identificación microbiana específica suele
recurrir a anticuerpos producidos en animales o cultivos de células
(métodos inmunológicos). Se utilizan a menudo para detectar, por
ejemplo, microbios de cultivos de enriquecimiento. En dichas
situaciones, el problema puede residir en que el usuario de la
prueba no sepa a ciencia cierta si el cultivo en cuestión, u otra
muestra y sus células, contienen el número suficiente de moléculas
de antígenos para la detección.
La invención puede utilizarse a gran escala para
el control de la Salmonella en productos alimentarios. Así
por ejemplo, en los controles de higiene que se realizan en la
industria cárnica, las concentraciones de Salmonella suelen
ser tan bajas que, con los métodos actuales, la detección directa
mediante el uso de análisis inmunológicos resulta imposible. En
estos casos, a menudo es necesario realizar un cultivo de
enriquecimiento en un medio líquido durante al menos 24 horas. El
proceso de enriquecimiento suele dividirse en dos fases: la fase de
pre-enriquecimiento y la fase de enriquecimiento
propiamente dicha. Este proceso puede acelerarse mediante el
control de las condiciones de crecimiento durante el
preenriquecimiento de la posible bacteria Salmonella y la
expresión de sus antígenos deseados en la muestra. El ajuste de las
condiciones del cultivo también ayuda a evitar que se desarrollen
cepas indeseables, con reacciones cruzadas. El cultivo de
enriquecimiento también se utiliza como una ayuda para la detección
e identificación de muchas otras bacterias y microorganismos.
Debido a que la invención acelera el proceso de
detección de la Salmonella, puede utilizarse por ejemplo en
la industria cárnica y en diagnósticos clínicos, con necesidades
urgentes de métodos rápidos. En En la industrial, es habitual que
se suministren los productos antes de que pueda disponerse de los
resultados del control microbiológico. Esto, en caso de
contaminación, puede provocar grandes pérdidas. Los métodos rápidos
permitirían retirar productos contaminados con la antelación
suficiente.
En una publicación previa (GB 2 234 587A) se
describe un método que usa moléculas de lipopolisacáridos (LPS)
como antígenos diana. En dicho método la detección más rápida de
E. coli tiene lugar en 5 + 2 horas. El método depende
directamente de la consecución de concentraciones bacterianas que
sean lo suficientemente elevadas para su uso con fines de
detección, ya que la cantidad de LPS es proporcional al número de
células.
En los documentos de patente WO 92/06197, WO
94/28163 y WO 94/28420 se describen otros métodos anteriores de
detección de la Salmonella y otras bacterias entéricas usando
métodos inmunológicos. Dichos métodos utilizaban el crecimiento de
la población celular como factor determinante para conseguir una
mejora de los resultados de la detección. En el documento de
patente WO 92/06197 la detección bacteriana se basa en los epítopos
de las regiones de la fimbria. El método implica tiempos de cultivo
tales como 24 horas o de un día para otro.
Durante el cultivo de especies bacterianas del
género Salmonella y otras bacterias entéricas en medios de
nutrientes selectivos, se observó que éstas producían multitud de
moléculas de antígenos específicos incluso antes de que el
crecimiento de la población microbiana, basado en el número de
células, alcanzase su punto máximo. De hecho, la concentración de
antígeno que pudo detectar el anticuerpo específico en las
superficies celulares decrecía de forma sustancial en comparación
con las cifras registradas a medida que el crecimiento celular del
cultivo de enriquecimiento aumentaba hasta alcanzar prácticamente
sus niveles máximos. Esto hace que sea posible aplicar un método de
detección inmunológica en una fase anterior a la de los métodos
actuales, justo después de la denominada fase de latencia y antes
de que el número de células, definido por ejemplo a partir de
métodos de cálculo basados en recuento de colonias, haya aumentado
de forma notable. Así, la temperatura, la composición del medio
nutritivo, los anticuerpos u otras moléculas selectivas y el control
de las presiones parciales de distintos gases pueden utilizarse
como factores selectivos en el cultivo de enriquecimiento.
Según el método de esta invención, el
procedimiento de identificación de microbios procedentes de
distintas muestras puede realizarse con mayor rapidez al utilizar
modificaciones de las expresiones de las distintas estructuras
superficiales de los microbios de acuerdo con los cambios en la fase
de crecimiento y con las condiciones de crecimiento. Gracias a la
explotación del enriquecimiento "mejorado" de antígenos es
posible observar, por ejemplo, un aumento de las concentraciones de
antígenos fimbriales tipo 1 en un lapso de tiempo de entre 3 y 10
horas a partir del comienzo del crecimiento (Ejemplos 4 y 5). Estas
fimbrias o sus componentes, las cuales son producidas por los
microbios para, por ejemplo, adherirse a las células epiteliales del
tracto alimentario, pueden utilizarse en métodos de detección de
microbios más rápidamente que en los métodos de acuerdo con los
conocimientos actuales.
En una posible forma de aplicación, tras un
periodo de tiempo de enriquecimiento adecuado, pueden detectarse
microbios mediante la extracción con filtro (Patente finlandesa n.º
93742). Dicha detección inmunológica puede realizarse con tiras
inmunocromatográficas (immunostrips), el método ELISA, un
método luminométrico u otro dispositivo o método similar que
utiliza anticuerpos, que resultan adecuados específicamente para
estructuras superficiales extraídas. En teoría, este procedimiento
puede añadir sensibilidad a la detección cuando el número de
células continúa siendo relativamente bajo.
En teoría, las características de la adhesión
también podrían aprovecharse para revestir el émbolo de la jeringa
de inyección utilizada para tomar la muestra (Patente de EE.UU. n.º
5.846.209). El émbolo usado para tomar la muestra a su vez, podría
convertirse en un émbolo revestido de anticuerpos específicos frente
a las moléculas de adhesión o las moléculas que imitan el objeto de
las moléculas de adhesión de las bacterias que se buscan. Cuando se
utilicen muestras de líquidos, no es necesario cambiar el émbolo.
Una vez que los microbios han alcanzado unas condiciones de
crecimiento adecuadas, comienzan a expresar sus moléculas de
adhesión y se adhieren con ellas a las moléculas de la superficie
del émbolo. La adhesión se verifica mediante un método adecuado (por
ejemplo, eléctricamente u ópticamente).
Los ejemplos 4 - 5 describen las reacciones de
un anticuerpo anti-péptido producido contra
distintas cepas de Salmonella con cultivos bacterianos en
distintas fases de crecimiento. Los resultados de estos experimentos
sirvieron de base para demostrar que existían niveles elevados de
reacción inmunológica incluso antes del comienzo de la fase de
crecimiento logarítmico. Durante la producción de anticuerpos contra
las proteínas fimbriales y los péptidos derivados de éstas, se
observaron niveles de reactividad inmunológica elevados en el
periodo de entre 3 y 5 horas posterior a la producción de los
anticuerpos contra péptidos fimbriales (Ejemplos 4 - 5). Los
resultados implican que la secuencia fimbrial tipo 1 de
Salmonella, utilizada en el experimento como material de
partida para la producción de péptidos sintéticos, se expresaría en
unos niveles extremadamente elevados incluso con anterioridad a la
fase de crecimiento logarítmico o en el momento en que ésta
comienza.
Al analizar el crecimiento de los cultivos
bacterianos en distintos medios y bajo distintas condiciones de
crecimiento, se observó que, por ejemplo, el crecimiento de un
cultivo de S. enteritidis en un medio selectivo (RVS)
alcanza su punto álgido tras un periodo de entre 3 y 6 horas a +37ºC
de temperatura, y que la masa del cultivo crece hasta alcanzar
prácticamente su nivel máximo en un plazo de 8 horas (Ejemplo
4).
El fenómeno descrito anteriormente se basa en la
teoría según la cual, al alcanzar las condiciones favorables del
intestino humano o de un animal de sangre caliente, la bacteria
Salmonella, relacionada con intoxicación alimentaria, u
otras bacterias entéricas, producen, en un primer momento, fimbrias
y otras estructuras moleculares necesarias para la adhesión para
poder adaptarse a este entorno favorable en el que tienen acceso
inmediato a los nutrientes. Igualmente, cabe la posibilidad de que,
en las células en fase estacionaria, las proteínas de adhesión o
sus precursoras estén preparadas, al menos parcialmente, en el
citoplasma o en un sitio similar desde el cual, desde el punto de
vista de la célula bacteriana, pueden moverse con mayor rapidez.
Se mantuvieron cepas de Salmonella
enteriditis 9, 12:-g, m:-, fago tipo 4 (IHS 59813) y
Salmonella tiphymurium 4,5,12: i:1,2, fago tipo 1 (IHS
59929) a 37ºC de temperatura en un medio THG (5% de triptona, 2,5%
de extracto de levadura, 1% de glucosa) y se sembraron en intervalos
de dos semanas durante el experimento. Las cepas de
Salmonella se obtuvieron en el Instituto Nacional de Salud
Pública (Helsinki, Finlandia). Los cultivos se iniciaron a partir
de un cultivo de 3-4 días de edad mediante
inoculando 5% del cultivo en un medio RVS nuevo selectivo para
Salmonella (caldo Rappaport-vassiliadis de
peptona de soja, Oxoid, Inglaterra). La suspensión RVS se cultivó
en matraces Erlenmeyer con agitación (de 100 ml) a dos temperaturas
distintas: +37ºC y +43ºC, y se tomaron muestras cada hora.
La secuencia en la síntesis del péptido fue
trazada a partir de las fimbrias tipo 1 de Salmonella
tipimurium. Se compararon ambas secuencias para seleccionar una
secuencia específica distinta de las fimbrias tipo 1 de
E.coli correspondientes. Se seleccionó la secuencia de 18
aminoácidos Ala Ser Phe Thr Ala Ile Gly Asp Thr Thr Ala Gln Val Pro
Phe Ser Ile Val. El péptido se sintetizó en forma de moléculas y a
uno de sus extremos se adhirieron 4 péptidos idénticos, formando
una presentación antigénica multipeptídica (MAP). Para la síntesis
de péptidos se utilizó el sintetizador de péptidos automático
Millipore PerSeptive 9050 Plus y la estrategia de síntesis Fmoc. Se
utilizó Fmoc-Lys(Fmoc)-OH a
modo de esqueleto para la estructura en ramificada.
Para la inmunización se utilizaron péptidos sin
ninguna conjugación con moléculas portadoras. Se inmunizaron
conejos mediante inyección subcutánea de 500 \mug de péptido MAP.
La solución de inmunización también contenía adyuvante completo de
Freund. Se inyectaron potenciadores en intervalos de dos semanas. La
solución también contenía adyuvante incompleto de Freund. Junto con
la inmunización, se extrajo sangre de los conejos para tomar
muestras de suero, las cuales se almacenaron en la cámara
refrigeradora (-20ºC).
Para el estudio de las reacciones del anticuerpo
anti-péptido frente a cultivos de bacterias en
distintas fases de crecimiento, se realizó una prueba ELISA para
velocidad de crecimiento utilizando dos cultivos bacterianos con
distintas densidad celular. En el experimento se utilizó la cepa
Salmonella enteriditis IHS 59813, y el medio de
crecimiento escogido fue un caldo RVS a +37ºC de temperatura. Se
iniciaron las placas de cultivo de forma simultánea a las
mediciones de la prueba ELISA. Al comienzo del experimento las
densidades bacterianas eran de 1,3 E+6 y 1,0 E+4. Los resultados
de la prueba ELISA y los recuentos de placas se muestran en la
Tabla 1 y en la Figura 1. La prueba ELISA para velocidad de
crecimiento se realizó del modo siguiente:
1. Las placas de microtitulación se trataron con
glutaraldehído:
- a)
- Se añadieron 150 \mug de glutaraldehído al 0,5% en los pocillos y
- b)
- se incubó la microplaca a temperatura ambiente con un agitador durante 15 minutos.
2. Lavado: Se vaciaron los pocillos de
glutaraldehído y se lavaron dos veces con 200 \mul de solución de
lavado 1 x ELISA de (5 mM de Tris + 0,15 M de NaCl + 0,05 de
Tween20).
3. Se añadió el antígeno a los pocillos
correspondientes en forma de disolución de tampón de ensayo (1:1)
50 \mul por pocillo (tampón de ensayo PBS + 1% de BSA + 0,05% de
NaCL + 1 mM de EDTA).
No se añadió antígeno a los pocillos cero, se
pipeteó una solución de lavado de 1 x 50 \mul por pocillo.
Posteriormente, se envolvió la microplaca en un pliego y se dejó
incubar durante la noche en una sala de frío.
4. Al día siguiente se vaciaron los pocillos y
se lavaron tres veces utilizando el método descrito
anteriormente.
5. Se añadió solución 1,5% de BSA/TBS a los
pocillos (200 \mul/pocillo) para el bloqueo y se incubó la
microplaca en un agitador durante una hora.
6. Se lavaron los pocillos según lo descrito en
el punto 4.
7. Se añadieron anticuerpos primarios (suero
péptido H463):
- a)
- Se pipeteó una disolución de suero (1:100) (50 \mul por pocillo).
- b)
- Se incubó la placa en un agitador durante 0,5 horas a temperatura ambiente.
8. Se lavaron los pocillos cuatro veces mediante
el procedimiento descrito anteriormente.
9. Se añadieron los anticuerpos secundarios:
- a)
- Anticuerpo secundario (anti-conejo). Se pipeteó una dilución a 1:1000, 50 \mul por pocillo
- b)
- Se incubó la placa en un agitador durante 0,5 horas a temperatura ambiente.
10. Las placas se lavaron tres veces mediante el
procedimiento descrito anteriormente y una vez con tampón Afos (200
\mul/pocillo).
11. Se pipeteó solución de color (pNPP) en la
placa (50 \mul/pocillo).
12. Se midió la absorbancia con un lector ELISA
(longitud de onda de 405 nm) a los 15 minutos, media hora, hora y
media y tres horas posteriores a la adición del color.
\vskip1.000000\baselineskip
Para el estudio de las reacciones del anticuerpo
anti-péptido frente a los cultivos bacterianos en
distintas fases de crecimiento se realizó un experimento ELISA para
velocidad de crecimiento mediante el uso de dos cepas de
Salmonella distintas (IHS 59813 e IHS 59929).
El medio de crecimiento utilizado fue caldo RVS
y la temperatura de cultivo 43ºC. Las placas comenzaron a
cultivarse de forma simultánea al comienzo del experimento ELISA. El
experimento ELISA se llevó a cabo tal y como describe el Ejemplo 4.
Los resultados se muestran en la Tabla 2 y en la Figura 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Hakalehto, E. Patente finlandesa n.º
93742, Menetelmä ja laite solujen osoittamiseksi, (A method
and an apparatus for detecting cells), 1995.
Hakalehto, E. Patente de EE.UU. n.º
5.846.209, Syringe comprising an adhering substrate for
microbes, 1998.
Claims (8)
1. Un método de determinación microbiológica,
caracterizado por que las bacterias pertenecientes al género
Salmonella se detectan con claridad en el medio de cultivo
antes del pico de crecimiento poblacional mediante el uso de
antígenos fimbriales proteínaceos cuyas células se expresan tras su
inoculación en el medio y con anterioridad a la fase de crecimiento
logarítmico o al comienzo de ésta.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado por que los antígenos microbianos se detectan
inmunológicamente utilizando anticuerpos de forma directa después de
que el crecimiento del cultivo por división celular haya
comenzado.
3. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-2, caracterizado por que
las bacterias detectadas son bacterias entéricas.
4. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, caracterizado por que
los antígenos detectados son proteínas fimbriales tipo 1.
5. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, caracterizado por que
se detectan antígenos microbianos con anticuerpos producidos frente
al péptido sintético Ala Ser Phe Thr Ala Ile Gly Asp Thr Thr Ala
Gln Val Pro Phe Ser Ile Val o a un derivado del mismo.
6. Un método de acuerdo con una o varias de las
reivindicaciones 1-5, caracterizado por que
las bacterias se cultivan en la fase de 3-10 horas
previa a la detección.
7. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, caracterizado por que
los microbios se incuban antes de la detección inmunológica en su
temperatura de crecimiento óptima.
8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7,
caracterizado por que los microbios se incuban con
anterioridad a la detección a temperaturas próximas a los 37ºC.
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