ES2253320T3 - Polipeptido y acido nucleico que lo codifica. - Google Patents

Abstract

Ácido nucleico aislado que comprende ADN que codifica o que es complementario al ADN que codifica: (a) un polipéptido que posee los aminoácidos 1 a 415 de la figura 2 (SEQ ID NO:2); o (b) un polipéptido que es una variante de (a) que posee como mínimo un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 (SEQ ID NO:2), determinándose dicha identidad de secuencia a lo largo de la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de la figura 2 (SEQ ID NO:2) y teniendo dicha

Description

Polipéptido y ácido nucleico que lo codifica.

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere en general a la identificación y aislamiento de ADN novedoso y a la producción recombinante de polipéptidos novedosos codificados por dicho ADN.

Estado de la técnica anterior a la invención

Las proteínas extracelulares y unidas a membrana juegan papeles importantes en la formación, diferenciación y mantenimiento de los organismos multicelulares. El destino de muchas células individuales, es decir, la proliferación, migración, diferenciación o interacción con otras células, está gobernado típicamente por información recibida de otras células y/o del entorno inmediato. Esta información se transmite a menudo a través de polipéptidos de secreción (por ejemplo, factores mitogénicos, factores de supervivencia, factores citotóxicos, factores de diferenciación, neuropéptidos y hormonas), los cuales a su vez son recibidos e interpretados por diversos receptores celulares o proteínas de membrana. Dichos polipéptidos de secreción o moléculas señalizadoras pasan normalmente a través de la ruta de secreción celular para alcanzar su lugar de acción en el entorno extracelular, habitualmente una proteína receptora unida a membrana.

Las proteínas de secreción tienen diversas aplicaciones industriales, incluyendo su utilización como productos farmacéuticos, agentes de diagnóstico, biosensores y bioreactores. De hecho, la mayoría de medicamentos proteicos disponibles comercialmente en la actualidad, por ejemplo los agentes trombolíticos, los interferones, las interleucinas, las eritropoyetinas, los factores estimulantes de colonia y otras citoquinas diversas, son proteínas de secreción. Sus receptores, que son proteínas de membrana, también tienen potencial como agentes terapéuticos o de diagnóstico. Por ejemplo, las inmunoadhesinas pueden utilizase como agentes terapéuticos que bloquean la interacción receptor-ligando. Las proteínas de membrana también pueden utilizarse para explorar potenciales inhibidores de la interacción relevante receptor/ligando, cuyos potenciales inhibidores son peptídicos o están basados en pequeñas moléculas. Dichas proteínas de membrana y receptores celulares incluyen, pero no se limitan a, receptores de citoquinas, receptores quinasas, receptores fosfatasas, receptores implicados en interacciones célula-célula y moléculas de adhesión celular como por ejemplo las selectinas y las integrinas. La transducción de las señales que regulan el crecimiento celular y la diferenciación celular se regula en parte por la fosforilación de diversas proteínas celulares. Las proteínas tirosin-quinasas, las enzimas que catalizan dicho proceso, también pueden comportarse como receptores de factores de crecimiento. Algunos ejemplos incluyen el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos y el receptor del factor de crecimiento nervioso.

Se están llevando a cabo esfuerzos tanto en la industria como en el marco académico para identificar nuevas proteínas receptoras nativas de secreción y de membrana. Muchos esfuerzos se centran en la exploración de bibliotecas de ADN recombinante de mamíferos para identificar las secuencias codificantes de proteínas receptoras de secreción y de membrana novedosas. Algunos ejemplos de procedimientos y técnicas de exploración -screening- se han descrito en la literatura [véase, por ejemplo, Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 7108-7113 (1996); patente E.E.U.U. Núm. 5,536,637]

En la presente invención se describe la identificación y caracterización de polipéptidos de secreción y transmembrana novedosos y ácidos nucleicos novedosos que codifican dichos polipéptidos.

PRO287

La proteína potenciadora de la procolágeno C proteinasa se une y promueve la actividad de la proteína morfogenética ósea "BMP1"/procolágeno C proteinasa (PCP). Dicha proteína tiene importancia en la deposición de la matriz extracelular. Las proteínas BMP1 pueden utilizarse para inducir la formación de hueso y/o cartílago y en la curación de heridas y reparación de tejido. Así pues, la proteína de la procolágeno C proteinasa, BMP1 y las proteínas que tienen homología con las anteriores, son de interés para la comunidad científica y médica.

En la presente invención se describe la identificación y caracterización de polipéptidos novedosos que tienen homología con el precursor de la proteína potenciadora de la procolágeno C proteinasa y con la proteína potenciadora de la procolágeno C proteinasa, designados en la presente invención como polipéptidos PRO287.

Breve descripción de la invención

Los solicitantes han identificado un clon de ADNc que codifica un nuevo polipéptido, designándose dicho polipéptido en la presente solicitud como "PRO287".

En una realización preferida de la invención, tal y como se define en las reivindicaciones, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende el ADN que codifica un polipéptido PRO287. En una realización de la invención, el ácido nucleico aislado comprende el ADN que codifica el polipéptido PRO287 que tiene los residuos de aminoácidos 1 a 415 de la figura 2 (SEQ ID NO:2) o el ADN que es complementario a dicha secuencia codificante de ácido nucleico y que permanece unido a la misma de forma estable en condiciones como mínimo moderadamente restrictivas y opcionalmente bajo condiciones altamente restrictivas.

En otra realización preferida de la invención, tal y como se define en las reivindicaciones, la invención proporciona un polipéptido PRO287 aislado. En particular, la invención proporciona un polipéptido PRO287 de secuencia nativa, el cual en una realización de la invención incluye una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 1 a 415 de la figura 2 (SEQ ID NO:2).

Realizaciones adicionales

En otra realización de la presente invención, la invención proporciona vectores que comprenden ADN que codifica cualquiera de los polipéptidos descritos más arriba o más abajo. También se proporciona una célula huésped que contenga cualquiera de dichos vectores. A modo de ejemplo, las células huésped pueden ser células CHO, E. coli o levadura. Adicionalmente se proporciona un procedimiento para la preparación de cualquiera de los polipéptidos descritos más arriba o más abajo y que comprende cultivar las células huésped en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido deseado y recuperar el polipéptido deseado a partir del cultivo celular.

En otras realizaciones, la invención proporciona moléculas quiméricas que comprenden cualquiera de los polipéptidos descritos más arriba o más abajo fusionados a un polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácido. Un ejemplo de dicha molécula quimérica comprende cualquiera de los polipéptidos descritos más arriba o más abajo fusionado a una secuencia identificadora de un epítopo de una inmunoglobulina o a una región Fc de una inmunoglobulina.

En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo que se une de forma específica a cualquiera de los polipéptidos descritos más arriba o más abajo. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:1) de una secuencia nativa de ADNc de PRO287, designándose la SEQ ID NO:1 en la presente invención como "UNQ250" y/o "ADN39969-1185".

La Figura 2 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:2) derivada de la secuencia codificante de la SEQ ID NO:1 mostrada en la figura 1.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas I. Definiciones

Los términos "polipéptido PRO" y "PRO", en el sentido que se utilizan en la presente invención, y cuando están seguidos inmediatamente por una designación numérica, se refieren a diversos polipéptidos cuya designación completa (es decir PRO/número) se refiere a secuencias polipeptídicas específicas, tal como se describe en la presente invención. Los términos "polipéptido PRO/número" en el sentido que se utiliza en la presente invención se refieren a secuencias polipeptídicas nativas y variantes de polipéptidos (definidas con más detalle en la presente invención). Los polipéptidos PRO descritos en la presente invención pueden aislarse de una diversidad de fuentes, como por ejemplo a partir de tipos de tejidos humanos o de otras fuentes, o prepararse por procedimientos recombinantes o sintéticos.

Una "secuencia nativa de un polipéptido PRO" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el correspondiente polipéptido PRO derivado de la naturaleza. Dicha secuencia nativa de polipéptidos PRO pueden aislarse de la naturaleza o puede producirse mediante procedimientos recombinantes o sintéticos. El término "secuencia nativa de un polipéptido PRO" se refiere específicamente a formas del polipéptido PRO específico presentes en la naturaleza truncadas o secretadas (es decir, una secuencia de dominio extracelular), formas variantes presentes en la naturaleza (es decir, formas derivadas de un corte y empalme -splicing- alternativo) y variantes alélicas del polipéptido presentes en la naturaleza. En una realización de la invención, la secuencia nativa del polipéptido PRO287 es una secuencia nativa del polipéptido PRO287 madura o de longitud completa que comprende los aminoácidos 1 a 415 de la figura 2 (SEQ ID NO:2).

La "variante del polipéptido PRO287" quiere decir un polipéptido PRO activo, tal como se ha definido más arriba o más abajo, que posee como mínimo aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia nativa del polipéptido PRO de longitud completa, tal y como se ha definido en la presente invención. Dichas variantes de polipéptidos PRO incluyen, por ejemplo, polipéptidos PRO en los cuales se ha añadido o deleccionado uno o más residuos de aminoácido en el extremo N-terminal o C-terminal de la secuencia de aminoácidos nativa de longitud completa. Habitualmente, una variante de polipéptido PRO poseerá como mínimo aproximadamente un 80% de identidad de la secuencia de aminoácidos, más preferentemente como mínimo aproximadamente un 90% de identidad de la secuencia de aminoácidos e incluso más preferentemente como mínimo aproximadamente un 95% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos nativa de longitud completa, tal y como se ha definido en la presente invención.

El "porcentaje (%) de identidad de la secuencia de aminoácidos", en referencia a las secuencias polipeptídicas PRO identificadas en la presente invención, se define como el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácido en la secuencia polipeptídica PRO específica, después de alinear las secuencias y de introducir espacios, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar las substituciones conservativas como parte de la identidad de secuencia. La alineación con el objeto de determinar el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos puede conseguirse de diferentes maneras que pertenecen al estado de la técnica, por ejemplo, utilizando software de ordenador accesible al público como por ejemplo software BLAST, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Aquellas personas expertas medias en la técnica podrán determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la alineación máxima a lo largo de la longitud completa de la secuencia con la que se está haciendo la comparación.

El término "aislado", cuando se utiliza para describir los diferentes polipéptidos descritos en la presente invención, quiere decir un polipéptido que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que típicamente interferirían con el diagnóstico o los usos terapéuticos del polipéptido y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos y no proteináceos. En las realizaciones preferidas, el polipéptido se purificará (1) hasta el grado de pureza suficiente para obtener como mínimo 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna, mediante la utilización de un secuenciador de taza giratoria, o (2) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones no-reductoras o reductoras, utilizando Coomassie blue o, preferentemente, tinción de plata. El polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ dentro de células recombinantes, dado que como mínimo un componente del entorno natural del polipéptido PRO no estará presente. Habitualmente, sin embargo, el polipéptido aislado se preparará mediante como mínimo una etapa de purificación.

Un ácido nucleico de un polipéptido "PRO" aislado es una molécula de ácido nucleico que se ha identificado y separado de como mínimo una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual habitualmente se encuentra asociada la fuente natural del ácido nucleico del polipéptido PRO. Una molécula de ácido nucleico de un polipéptido PRO aislada se encuentra en forma o ajuste diferente de la presente en la naturaleza. Así pues, las moléculas de ácido nucleico de un polipéptido PRO aisladas se distinguen de la molécula específica de ácido nucleico del polipéptido PRO que existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula aislada de ácido nucleico de un polipéptido PRO incluye moléculas de ácido nucleico de polipéptido PRO que se encuentran dentro de aquellas células que habitualmente expresan un polipéptido PRO, en las cuales, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se encuentra en una localización cromosómica diferente de la correspondiente a las células naturales.

El "análisis Southern" o el "Southern blotting" es un procedimiento mediante el cual se confirma la presencia de secuencias de ADN en una muestra de ADN o de una composición que contiene ADN, digerida mediante endonucleasas de restricción, mediante la hibridación a un oligonucleótido o fragmento de ADN marcado conocido. El análisis Southern implica típicamente la separación electroforética de muestras de ADN digeridas sobre geles de azarosa, desnaturalización del ADN después de la separación electroforética y transferencia del ADN a nitrocelulosa, nylon u otro soporte de membrana adecuado para el análisis con una sonda marcada radioactivamente, biotinilada o marcada enzimáticamente, tal como se describe en las secciones 9.37-9.52 de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New Cork: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

El "análisis Northern" o "Northern blotting" es un procedimiento que se utiliza para identificar secuencias de ARN que se hibridan a una sonda conocida, por ejemplo un oligonucleótido, un fragmento de ADN, ADNc o un fragmento del mismo o un fragmento de ARN. La muestra se marca con un isótopo radiactivo, por ejemplo ^{32}P o mediante biotinilación o con una enzima. El ARN a analizar se separa generalmente por electroforesis sobre un gel de azarosa o poliacrilamida, se transfiere a una membrana adecuada de nitrocelulosa, nylon u otra membrana adecuada y se hibrida con la sonda utilizando técnicas estándar bien conocidas en el estado de la técnica, como por ejemplo las descritas en las secciones 7.39-7.52 de Sambrook et al, supra.

El término "secuencias control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión a ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando está situado en relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o de un líder de secreción se encuentra operativamente unido al ADN que codifica un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o un potenciador se encuentra unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma se encuentra operativamente unido a una secuencia codificante si se posiciona de manera que facilita la traducción. Generalmente, "unido operativamente" quiere decir que las secuencias de ADN que se encuentran unidas son contiguas y que, en el caso de un líder de secreción, son contiguas y se encuentran en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen por qué ser contiguos. La unión se consigue mediante ligación en dianas de restricción convenientes. Si dichas dianas no existen, los adaptadores o secuencias conectoras de oligonucleótidos sintéticos se utilizan de acuerdo a la práctica convencional.

El término "anticuerpo" se utiliza en su sentido más amplio y específicamente cubre anticuerpos monoclonales anti-polipéptido PRO (incluyendo agonistas, antagonistas y anticuerpos neutralizadores) y composiciones de anticuerpo anti-polipéptido PRO con especificidad polipepitópica. El término "anticuerpo monoclonal" tal y como se utiliza en la presente invención se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones presentes en la naturaleza que pueden estar presentes en cantidades menores.

El término "activo" o "actividad" a efectos de la presente invención se refiere a una forma/formas del polipéptido PRO que retienen las actividades biológicas y/o inmunológicas del polipéptido PRO específico nativo o presente en la naturaleza.

El término "tratamiento" o "tratar" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas. Aquellas personas que necesitan tratamiento incluyen aquellas personas que ya presentan la enfermedad así como aquellas personas propensas a tener la enfermedad, en las cuales debe prevenirse la enfermedad.

El término "mamífero" a efectos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja y animales de zoológico, animales para el deporte o animales de compañía, como por ejemplo oveja, perros, caballos, gatos, vacas y similares. Preferentemente, el mamífero en la presente invención es un humano.

El término "transportadores" tal y como se utiliza en la presente invención incluye los transportadores farmacéuticamente aceptables, los excipientes o los estabilizadores que no son tóxicos para la célula o para el mamífero que se está exponiendo al mismo a las dosis y concentraciones empleadas. A menudo, el transportador fisiológicamente aceptable es una disolución acuosa de pH tamponado. Algunos ejemplos de transportadores fisiológicamente aceptables incluyen tampones como por ejemplo el fosfato, el citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, como por ejemplo la albúmina del suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como por ejemplo la polivinilpirrolidona; aminoácidos como por ejemplo la glicina, la glutamina, la asparagina, la arginina o la lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo la glucosa, la manosa o las dextrinas; agentes quelantes como por ejemplo el EDTA; alcoholes de azúcares como por ejemplo el manitol o el sorbitol; contraiones que forman sales como por ejemplo el sodio; y/o surfactantes no iónicos como por ejemplo el TWEEN^{TM}, el polietilenglicol (PEG) y PLURONICS^{TM}.

El término "agonista" se utiliza haciendo referencia a los análogos peptídicos y no peptídicos de los polipéptidos PRO nativos (refiriéndose el término polipéptido PRO nativo a un polipéptido pro-PRO, a un polipéptido pre-PRO, a un polipéptido prepro-PRO o a un polipéptido PRO maduro) de la presente invención y a anticuerpos que se unen específicamente a dichos polipéptidos PRO nativos, siempre y cuando retengan como mínimo una actividad biológica de un polipéptido PRO nativo. Preferentemente, los agonistas de la presente invención retienen las propiedades de reconocimiento por unión cualitativa y las propiedades de activación de receptor del polipéptido PRO nativo.

El término "antagonista" se utiliza haciendo referencia a una molécula que inhibe una actividad biológica de un polipéptido PRO nativo de la presente invención, refiriéndose el término polipéptido PRO nativo a un polipéptido pro-PRO, a un polipéptido pre-PRO, a un polipéptido prepro-PRO o a un polipéptido PRO maduro. Preferentemente, los antagonistas de la presente invención inhiben la unión de un polipéptido PRO nativo de la presente invención. Un "antagonista" de polipéptido PRO es una molécula que impide o interfiere con una función efectora PRO antagonista (por ejemplo, una molécula que impide o interfiere con la unión y/o activación de un receptor de un polipéptido PRO mediante un polipéptido PRO). Puede explorarse la capacidad de dichas moléculas de inhibir de forma competitiva la activación de un receptor de un polipéptido PRO monitorizando la unión del polipéptido PRO nativo en presencia y ausencia de la molécula antagonista a analizar, por ejemplo. Un antagonista de la invención también comprende un polinucleótido antisentido contra el gen del polipéptido PRO, cuyo polinucleótido antisentido bloquea la transcripción o traducción del gen del polipéptido PRO, inhibiendo de esta manera su expresión y su actividad
biológica.

El término "condiciones restrictivas" significa (1) emplear una fuerza iónica baja y una temperatura elevada para lavar, por ejemplo cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/dodecilsulfato de sodio al 0,1% a 50ºC, o (2) emplear durante la hibridación un agente desnaturalizante, como por ejemplo formamida, por ejemplo un 50% (vol/vol) de formamida con un 0,1% de albúmina del suero bovina/un 0,1% de Ficoll/un 0,1% de polivinilpirrolidona/un tampón de fosfato sódico 50 nM a un pH de 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC. Otro ejemplo es utilizar un 50% de formamida, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6/8), un 0,1% de pirofosfato sódico, 5 x disolución de Dernhardt, ADN de esperma de salmón sometido a ultrasonidos (50 \mug/ml), un 0,1% de SDS y un 10% de dextransulfato a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC y 0,1% de SDS. Un ejemplo adicional es hibridar utilizando un tampón de un 10% de dextransulfato, 2 x SSC (cloruro sódico/citrato sódico) y un 50% de formamida a 55ºC, seguido de un lavado en condiciones altamente restrictivas que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.

El término "condiciones moderadamente restrictivas" se describe en Sambrook et al., supra, e incluye la utilización de una disolución de lavado y de condiciones de hibridación (es decir, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos restrictivas que las descritas más arriba. Un ejemplo de condiciones moderadamente restrictivas son condiciones como por ejemplo una incubación a 37ºC en una disolución que comprende: un 20% de formamida, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5 x disolución de Dernhardt, un 10% de dextransulfato y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón triturado desnaturalizado, seguido de un lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50ºC. Un experto medio en la técnica sabrá cómo ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc, de la forma necesaria para adecuarse a factores como por ejemplo la longitud de la sonda y similares.

Composiciones y procedimientos según la invención Polipéptidos PRO287 de longitud completa

La presente invención proporciona secuencias de nucleótidos recién aisladas e identificadas que codifican polipéptidos a los cuales se hace referencia en la presente solicitud como PRO287. En particular, los solicitantes han identificado y aislado ADNc que codifica un polipéptido PRO287, tal y como se describe con mayor detalle en los ejemplos más abajo. Utilizando programas de ordenador de alineación de secuencia BLAST y FastA, los solicitantes encontraron que varias porciones del polipéptido PRO287 tenían una homología significativa con el precursor de la proteína potenciadora de la procolágeno C proteinasa de tipo 1 y con la proteína potenciadora de la procolágeno C proteinasa de tipo 1. De acuerdo con lo anterior, se cree actualmente que el polipéptido PRO287 descrito en la presente invención es un miembro recién identificado de la familia de proteínas potenciadoras de la C proteinasa.

Variantes del polipéptido PRO

Además de los polipéptidos PRO de secuencia nativa de longitud completa descritos en la presente invención, se contempla que pueden prepararse variantes de polipéptidos PRO. Las variantes de polipéptidos PRO pueden prepararse introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ADN del polipéptido PRO o sintetizando el polipéptido PRO deseado. Los expertos medios en la técnica remarcarán que los cambios de aminoácidos pueden alterar los procesos post-translacionales de los polipéptidos PRO, como por ejemplo cambios en el número o posición de los sitios de glicosilación o alteración de las características de anclaje a membrana.

Las variaciones en la secuencia de longitud completa de los polipéptidos PRO o en varios dominios de los polipéptidos PRO descritos en la presente invención pueden realizarse, por ejemplo, utilizando cualquiera de las técnicas y ayudas para llevar a cabo mutaciones conservativas y no conservativas, por ejemplo en la patente E.E.U.U. Num. 5,364,934. Las variaciones pueden ser la substitución, delección o inserción de uno o más codones que codifican el polipéptido PRO, provocando un cambio en la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO en comparación con la secuencia nativa del polipéptido PRO. Opcionalmente, la variación es por substitución de cómo mínimo un aminoácido por cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios de polipéptido PRO. Para determinar qué residuo de aminoácido debe insertarse, substituirse o deleccionarse sin afectar de forma adversa la actividad deseada, puede obtenerse ayuda comparando la secuencia del polipéptido PRO con la de las moléculas de proteína homólogas conocidas y minimizando el número de cambios en la secuencia de aminoácidos que se ha realizado en las regiones de alta homología. Las substituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de cambiar un aminoácido por otro aminoácido que tenga propiedades estructurales y/o químicas similares, como por ejemplo la substitución de una leucina por una serina, es decir, substituciones de aminoácidos conservativas. Las inserciones o deleciones pueden llevarse a cabo, opcionalmente, en el rango de 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida puede determinarse realizando sistemáticamente inserciones, deleciones o substituciones de aminoácidos en la secuencia y analizando la actividad de las variantes resultantes en el ensayo in vitro descrito en los ejemplos más abajo.

Las variaciones pueden realizarse utilizando procedimientos descritos en el estado de la técnica, como por ejemplo mutagénesis (dirigida) mediada por oligonucleótidos, barrido de alanina y mutagénesis por PCR. La mutagénesis dirigida [Carter et al., Nucl. Acids Res. 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)]; la mutagénesis en casete [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], la mutagénesis de selección por restricción [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc., London SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas pueden llevarse a cabo sobre el ADN clonado para producir la variante de ADN deseada del polipéptido PRO.

Puede emplearse también un análisis de barrido de aminoácidos para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de barrido preferidos se encuentran los aminoácidos neutros relativamente pequeños. Dichos aminoácidos incluyen la alanita, la glicina, la serina y la cisterna. La alanina es típicamente un aminoácido de barrido preferido entre este grupo, porque elimina la cadena lateral más allá del carbón beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante. También se prefiere típicamente la alanina porque es el aminoácido más común. Además, se encuentra frecuentemente tanto en posiciones escondidas como expuestas [Creighton, The Proteins (las Proteínas), (W.H. Freeman & Co. N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la substitución de alanina no rinde cantidades adecuadas de variante, puede utilizarse un aminoácido isotérico.

Modificaciones de los polipéptidos PRO

Las modificaciones covalentes de los polipéptidos PRO están incluidas dentro del alcance de la presente invención. Un tipo de modificación covalente incluye la reacción entre los residuos diana de aminoácidos del polipéptido PRO con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas de los residuos N- o C-terminales del polipéptido PRO. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para entrecruzar un polipéptido PRO con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para utilizar en el procedimiento de purificación de anticuerpos anti polipéptido PRO y viceversa. Algunos agentes de entrecruzamiento utilizados comúnmente incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehido ésteres de la N-hidroxisuccinimida como por ejemplo 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionales como por ejemplo el bis-N-maleimido-1,8-octano y agentes como por ejemplo el metil-3-[(p-azofenil)ditio]propioimidato.

Otras modificaciones incluyen la desamidación de residuos de glutaminilo y asparaginilo para dar los correspondientes residuos de glutamilo y aspartilo, respectivamente, la hidroxilación de la prolina y la lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de los residuos serilo o treonilo, la mutilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de la lisina, de la arginina y de la histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], acetilación de la amina N-terminal y la amidación de cualquier grupo carboxílico C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente de los polipéptidos PRO incluidos dentro del alcance de la invención comprende alterar el patrón nativo de glicosilación del polipéptido. El término "alterar el patrón nativo de glicosilación" se refiere, para los objetos de la presente invención, a la delección de uno o más esqueletos de carbohidrato que se encuentran en una secuencia nativa de un polipéptido PRO y/o adicionar una o más dianas de glicosilación que no se encuentran presentes en la secuencia polipeptídica PRO nativa.

La adición de dianas de glicosilación al polipéptido PRO puede llevarse a cabo alternando la secuencia de aminoácidos. La alteración puede realizarse, por ejemplo, adicionando, o substituyendo por, uno o más residuos de serina o de treonina a la secuencia nativa del polipéptido PRO (para dianas de glicosilación unidas por O). La secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO puede alterarse opcionalmente mediante cambios a nivel de ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el polipéptido PRO en bases preseleccionadas, de manera que se generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.

Otra manera de aumentar el número de esqueletos de carbohidrato en el polipéptido PRO es mediante el acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al polipéptido. Dichos procedimientos se han descrito en el estado de la técnica, por ejemplo en la solicitud de patente WO 87/05330, publicada en 11 de septiembre de 1987 y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).

La separación de los esqueletos de carbohidrato presentes en el polipéptido PRO se puede llevar a cabo química o enzimáticamente o mediante substituciones mutacionales de codones que codifican residuos de aminoácidos que actúan como dianas de glicosilación. Las técnicas de deglicosilación químicas son conocidas en el estado de la técnica y se han descrito, por ejemplo, en Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) y en Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981). La ruptura enzimática de los esqueletos de carbohidratos en polipéptidos puede llevarse a cabo mediante la utilización de diversas endo- y exo-glicosidasas, tal como se ha descrito en Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987).

Otro tipo de modificación covalente de los polipéptidos PRO según la invención comprende unir el polipéptido PRO a un polímero no proteinaceo, de los cuales existe un gran número, por ejemplo el polietilenglicol, el polipropilenglicol o los polioxoalquilenos, de la manera que se describe en las patentes E.E.U.U. Nums. 4,460,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ó 4,179,337.

Los polipéptidos PRO de la presente invención pueden modificarse también de manera que se forme una molécula quimérica que comprenda un polipéptido PRO fusionado a otro polipéptido heterólogo o a otra secuencia de aminoácidos. En una realización de la invención, dicha molécula quimérica comprende una fusión del polipéptido PRO con un polipéptido identificador que proporciona un epítopo al cual se puede unir selectivamente un anticuerpo anti-identificador. El identificador de epítopo se sitúa generalmente en el extremo amino- o carboxiterminal del polipéptido PRO. La presencia de dichas formas de identificador de epítopo en el polipéptido PRO puede detectarse utilizando un anticuerpo contra el polipéptido identificador. Además, la proporción del identificador de epítopo permite que el polipéptido PRO pueda purificarse fácilmente mediante purificación de afinidad utilizando un anticuerpo anti-identificador u otro tipo de matriz de afinidad que se une al identificador de epítopo. En una realización alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión del polipéptido PRO con una inmunoglobulina o con una región particular de una inmunoglobulina. En el caso de una forma bivalente de la molécula quimérica, dicha fusión podría ser en la región Fc de una molécula de IgG.

Se ha descrito en el estado de la técnica diversos polipéptidos identificadores y sus respectivos anticuerpos. Algunos ejemplos incluyen el identificador de la polihistidina (poli-his) o la poli-histidina-glicina (poli-his-gli); el polipéptido identificador de la gripe HA y su anticuerpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)] y el identificador de la glicoproteína D (gD) del virus de la Herpes Simples y su anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. Otros polipéptidos identificadores incluyen el péptido Flag [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; el péptido del epítopo KT3 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; un péptido del epítopo de la \alpha-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; y el péptido identificador de la proteína 10 del gen T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)].

Preparación de los polipéptidos PRO

La descripción más abajo se refiere en primer lugar a la producción de polipéptidos PRO mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que contiene el ácido nucleico del polipéptido PRO deseado. Evidentemente, se contempla que pueden utilizarse procedimientos alternativos bien conocidos en el estado de la técnica. Por ejemplo, la secuencia del polipéptido PRO, o porciones de la misma, pueden producirse mediante síntesis peptídico directa utilizando técnicas en fase sólida [véase, por ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Síntesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)]. La síntesis de proteínas in vitro puede llevarse a cabo utilizando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada puede llevarse a cabo, por ejemplo, utilizando un Sintetizador de Péptidos Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante. Puede sintetizarse químicamente de forma separada diversas porciones del polipéptido PRO deseado y combinarlas utilizando procedimientos químicos o enzimáticos para preparar el polipéptido PRO de longitud completa.

A. Aislamiento del ADN que codifica los polipéptidos PRO

El ADN que codifica los polipéptidos PRO puede obtenerse a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido del cual se cree que posee el ARNm del polipéptido PRO deseado y que lo expresa en un nivel detectable. De acuerdo con lo anterior, puede obtenerse convenientemente ADN del polipéptido PRO humano a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido humano, tal y como se describe en los ejemplos. El gen que codifica el polipéptido PRO puede obtenerse también a partir de una biblioteca genómica o mediante síntesis de oligonucleótidos.

Pueden explorarse las bibliotecas son sondas (por ejemplo anticuerpos contra el polipéptido PRO deseado o oligonucleótidos de cómo mínimo aproximadamente 20-80 bases), diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por el mismo. La exploración de la biblioteca de ADNc o biblioteca genómica con la sonda seleccionada puede llevarse a cabo utilizando procedimientos estándar, tal y como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New Cork: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Una manera alternativa de aislar el gen que codifica el polipéptido PRO deseado consiste en utilizar metodología PCR [Sambrook et al, supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].

Los ejemplos que se muestran más abajo describen técnicas para explorar una biblioteca de ADN. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deben ser de longitud suficiente y suficientemente unambiguas para minimizar los falsos positivos. El oligonucleótido se marca preferentemente de manera que pueda detectarse mediante hibridación al ADN en la biblioteca que se está explorando. Algunos procedimientos de marcaje son bien conocidos en el estado de la técnica e incluyen la utilización de radiomarcas como por ejemplo ATP marcado con ^{32}P, la biotinilación o el marcaje enzimático. Las condiciones de hibridación, que incluyen condiciones moderadamente restrictivas y altamente restrictivas, se proporcionan en Sambrook et al, supra.

Las secuencias identificadas mediante dichos procedimientos de exploración de bibliotecas pueden comprarse y alinearse con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de datos públicas, como por ejemplo el GenBank u otras bases de datos de secuencias privadas. La identidad de secuencia (tanto a nivel de aminoácidos como a nivel de nucleótidos) en regiones definidas de la molécula o a lo largo de la longitud completa de la secuencia puede determinarse mediante alineación de secuencia utilizando programas de software de ordenador como por ejemplo BLAST, ALIGN, Enastar e INHERIT, que utilizan diferentes algoritmos para medir la homología.

Los ácidos nucleicos que poseen la secuencia codificante de proteína pueden obtenerse mediante la exploración de bibliotecas de ADNc o bibliotecas genómicas utilizando la secuencia de aminoácidos deducida descrita en la presente invención por primera vez y, en caso necesario, utilizando procedimientos convencionales de extensión de cebador, tal como se describe en Sambrook et al., supra, para detectar los precursores e intermedios de procesamiento de ARNm que puede no haberse transcrito de forma reversa a ADNc.

B. Selección y transformación de las células huésped

Las células huésped se transfectan o transforman con vectores de expresión o clonación descritos en la presente invención para la producción de un polipéptido PRO y se cultivan en un medio nutriente convencional modificado de la forma apropiada para intuir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Un experto medio en la técnica podrá seleccionar las condiciones de cultivo, como por ejemplo el medio, la temperatura, el pH y similares, sin experimentación indebida. En general, los principios, protocolos y las técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos celulares pueden encontrarse en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach (Biotecnología de Células de Mamíferos: una Aproximación Práctica), M. Buttles, ed (IRL Press, 1991) y Sambrook et al., supra.

Algunos procedimientos de transfección son conocidos para un experto común en la técnica, por ejemplo, CaPO_{4} y electroporación. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se lleva a cabo utilizando técnicas estándar apropiadas para dichas células. El tratamiento con calcio empleando cloruro de calcio, tal y como se describe en Sambrook et al., supra, o la electroporación, se utilizan en general para células procariotas u otras células que contienen barreras substanciales tipo pared celular. La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de ciertas células de plantas, tal y como se describe en Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y en la solicitud de patente WO 89/05859, publicada el 29 de junio de 1989. Para las células de mamíferos, sin dichas paredes celulares, puede utilizarse el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio de Gram. y van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1987). Algunos aspectos generales de las transformaciones en un sistema de células huésped de mamífero se han descrito en la patente E.E.U.U. Num. 4,399,216. Las transformaciones en levaduras se llevan a cabo típicamente según el procedimiento de Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Sin embargo, también pueden utilizarse otros procedimientos de introducción de ADN en células, como por ejemplo mediante microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplasto bacteriano con células intactas o policationes, por ejemplo polibreno, poliornitina. Para obtener información sobre la transformación de células de mamífero, véase Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) y Manssur et al., Nature, 336:348-352 (1988).

Algunas células huésped adecuadas para la clonación o expresión del ADN en los vectores, según la invención, incluyen células procariotas, levaduras o células eucariotas superiores. Las células procariotas adecuadas incluyen, pero no se limitan a eubacterias, del tipo organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo Enterobacteriaceas como por ejemplo la E. coli. Diversas cepas de E. coli están disponibles públicamente, como por ejemplo la cepa K12 de E. coli MM294 (ATCC 31, 446); E. coli X1776 (ATCC 31, 537); la cepa de E. coli W3110 (ATCC 27, 325) y K5 772 (ATCC 53, 635). Otras células huésped procariotas adecuadas incluyen Enterobacteriaceas del tipo Escherichia, por ejemplo E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo Serratia marcescans y Shigella, así como Bacilli como por ejemplo B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo B. licheniformis 41P, descrito en DD 266,710, publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas como por ejemplo P. aeruginosa y Streptomyces. Diferentes cepas de E. coli están disponibles públicamente, como por ejemplo la cepa K12 de E. coli MM294 (ATCC 31, 446); E. coli X1776 (ATCC 31, 537); la cepa de E. coli W3110 (ATCC 27, 325) y K5 772 (ATCC 53, 635). Estos ejemplos son ilustrativos y no limitantes. La cepa W3110 es un huésped o progenitor de huésped particularmente preferido, debido a que es una cepa huésped común para las fermentaciones de producto de ADN recombinante. Preferentemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la cepa W3110 puede modificarse de manera que se produzca una mutación en los genes que codifican proteínas endógenas para el huésped; algunos ejemplos de dichos huéspedes incluyen la cepa W3110 de E. coli 1A2, la cual posee el genotipo completo tonA; la cepa W3110 de E. coli 9E4, la cual posee el genotipo completo tonA ptr3; la cepa W3110 de E. coli 27C7 (ATCC 55, 244), la cual posee el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ampT kan'; la cepa W3110 de E. coli 37D6 (ATCC 55, 244), la cual posee el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ampT rbs7 ilvG kan'; la cepa W3110 de E. coli 40B4, que es la cepa 37D6 con una mutación por delección de degP no resistente a la canamicina; y una cepa de E. coli que tiene la proteasa periplasmática mutante descrita en la patente EEUU Núm. 4,946,783 publicada el 7 de agosto de 1990. Alternativamente, también son adecuados los procedimientos de clonación in vitro, por ejemplo PCR y otras reacciones de la polimerasa de ácidos nucleicos.

Además de los microbios procariotas, los microbios eucariotas del tipo hongos filamentosos o levaduras, son adecuados como huéspedes de clonación o expresión para vectores que codifican polipéptidos PRO. La Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped inferior comúnmente utilizado. Otros microorganismos incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; patente EP 139,383, publicada el 2 de mayo de 1985); huéspedes de Kluyvermyces (patente EEUU Núm. 4,943,529; Fleer et al., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)), como por ejemplo K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacterial., 737 [1983]), K.fragilis (ATCC 12, 424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24, 178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8: 135 (1990)), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP 402, 226); Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekirishna et al., J. Basic Microbiol., 28: 265-278 [1988]); Candida; Trichoderma recia (EP 244,234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces del tipo Scwanniomyces occidentalis (EP 394,538, publicada el 31 de octubre de 1990); y hongos filamentosos del tipo, por ejemplo, Neurospora, Penicillum, Tolypocladium (WO 91/00357, publicada el 10 de enero de 1991) y huéspedes de Aspergillus del tipo A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 112: 284-289 [1983]; Tiburn et al., Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984] y A. niger (Nelly e Hynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]). Las levaduras metilotrópicas son adecuadas según la presente invención e incluyen, pero no se limitan a las levaduras capaces de crecer en metanol, seleccionadas del grupo de géneros que consiste en Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharaomyces, Torulopsis y Rhodotorula. Puede encontrarse una lista de especies específicas que son ilustrativas de esta clase de levaduras en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs (Bioquímica de Metilotrofos), 269 (1982).

Algunas células huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos PRO glicosilados derivan de organismos multicelulares. Algunos ejemplos de células de invertebrados incluyen células de insectos como por ejemplo células de Drosophila S2 y de Spodoptera Sf9, así como células de plantas. Algunos ejemplos de líneas celulares huésped de mamíferos útiles incluyen las células de ovario de hámster chino (CHO) y las células COS. Algunos ejemplos más específicos incluyen la línea de riñón de mono CV1 transformada con SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embriónico humano (células 293 ó células 293 subclonadas para su crecimiento en un cultivo en suspensión, Gram. et al., J. Gen. Virol., 36: 59 (1977)); las células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)); las células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de páncreas humano (Hep G2, HB 8065); y tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51). La selección de la célula huésped apropiada se considera dentro del estado de la técnica.

C. Delección y uso de un vector replicable

El ácido nucleico (es decir, ADNc o ADN genómico) que codifica un polipéptido PRO deseado puede insertarse en un vector replicable para su clonación (amplificación del ADN) o para su expresión. Diversos vectores se encuentran a disposición pública. El vector puede encontrarse, por ejemplo, en forma de plásmido, cósmico, partícula vírica o fago. La secuencia de ácido nucleica apropiada puede insertarse en el vector mediante diversos procedimientos. En general, el ADN se inserta en una diana(s) de restricción adecuada utilizando técnicas descritas en el estado de la técnica. Los componentes del vector pueden incluir, pero no se limitan a, uno o más de los miembros del grupo formado por, una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. El constructo de vectores adecuados que contienen uno o más de dichos componentes utiliza técnicas de ligación estándar, que son conocidas por un experto medio en la técnica.

El polipéptido PRO de interés puede prepararse mediante técnicas recombinantes o directamente, pero también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, el cual puede ser una secuencia señal y otro polipéptido que tenga una diana de restricción específica en el extremo N-terminal de la proteína madura o polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector o puede ser parte del ADN del polipéptido PRO que se inserta en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, entre el grupo formado por la fosfatasa alcalina, la penicilinasa, lpp o líderes de la enterotoxina II estables al calor. Para la secreción en levaduras, la secuencia señal puede ser, por ejemplo, el líder invertasa de levadura, el líder del factor alfa (incluyendo líders del factor \alpha de Saccharomyces y Kluyveromyces, este último descrito en la patente E.E.U.U. Núm. 5,010,182) o el líder del a fosfatasa ácida, el líder del a glucoamilasa de C. albicans (patente EP 362,179, publicada el 4 de abril del 1990) o la señal descrita en la solicitud de patente internacional WO 90/13646, publicada el 15 de noviembre del 1990. En la expresión de células de mamífero, las secuencias señal de mamíferos pueden utilizarse para dirigir la secreción de la proteína, como por ejemplo secuencias señal de polipéptidos de secreción de la misma especie o especies relacionadas, así como líderes de secreción virales.

Tanto los vectores de expresión como los de clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Dichas secuencias son bien conocidas en caso de un gran número de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2 \mu es adecuado para levaduras y diversos orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamíferos.

Los vectores de expresión y clonación contendrán típicamente un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, la ampicilina, la neomicina, el metotrexato o la tetraciclina, (b) complementan deficiencias autotróficas, o (c) proporcionan nutrientes críticos que no se encuentran en el medio complejo, por ejemplo el gen que codifica la racemasa de D-alanina para Bacilli.

Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para las células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para introducir el ácido nucleico del polipéptido PRO, como por ejemplo DHFR o la timidinaquinasa. Una célula huésped apropiada cuando se utiliza DHFR de tipo salvaje es la línea celular CHO deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada tal y como describe Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980). Un gen de selección adecuado para su utilización en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de levadura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979); Kinsman et al., Gene, 7: 141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10: 157 (1980)]. El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura a la cual le falta la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo ATCC Núm. 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85: 12 (1977)].

Los vectores de expresión y clonación contienen habitualmente un promotor unido operativamente a la secuencia de ácidos nucleicos del polipéptido PRO para dirigir la síntesis de ARNm. Se han descrito promotores que son reconocidos por un gran número de potenciales células huésped. Algunos promotores adecuados para su utilización con huéspedes procariotas incluyen la \beta-lactamasa y los sistemas del promotor de lactosa [Chang et al, Nature, 275: 615 (1978); Goeddl et al., Nature, 281: 544 (1979)], la fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980); EP 36,776] y promotores híbridos tipo promotor tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)]. Los promotores a utilizar en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al ADN que codifica el polipéptido PRO deseado.

Algunos ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para su utilización en huéspedes de levadura incluyen los promotores de la 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)] y otras enzimas glicolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 (1968); Holland, Biochemistry, 17: 4900 (1978)], tipo enolasa, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenada, hexoquinasa, piruvato decarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

Otros promotores de levaduras, que son promotores inducibles que poseen la ventaja adicional de que la transcripción está controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras del alcohol deshidrogenado 2, el isocitocromo C, la fosfatasa ácida, las enzimas degradativas asociadas con el metabolismo de nitrógeno, la metalotioneina, la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa y las enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Algunos vectores y promotores adecuados para su utilización en la expresión de levaduras se describen con mayor detalle en la patente EP 73,657.

La transcripción del polipéptido PRO a partir de vectores en células huésped de mamífero se controla, por ejemplo, mediante los promotores obtenidos a partir de los genomas de virus tipo virus del polioma, virus fowlpox (patente UK 2,211,504, publicada el 5 de julio de 1989), los adenovirus (por ejemplo el adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma avian, los citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis-B y el virus Simian 40 (SV40), a partir de promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de la actina o un promotor de inmunoglobulina, y a partir de promotores de shock térmico, siempre y cuando dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.

La transcripción de un ADN que codifica el polipéptido PRO deseado en eucariotas superiores puede aumentarse insertándose una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de actuación cis del ADN, habitualmente de tamaño de 10 pb a 300 pb, que actúan sobre el promotor para aumentar su transcripción. Actualmente se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (de la globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Sin embargo, típicamente se utilizará un potenciador de un virus de célula eucariota. Algunos ejemplos incluyen el potenciador SV40 en el extremo tardío del origen de replicación (100-270 pb), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma en el extremo tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. El potenciador puede cortarse y empalmarse en el vector a una posición 5' ó 3' de la secuencia codificante del polipéptido PRO, pero se localiza preferentemente en el extremo 5' del promotor.

Los vectores de expresión utilizados en las células huésped eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanos o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán las secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias se pueden obtener a partir de las regiones 5' terminales y ocasionalmente 3' terminales, no traducidas de ADNs o ADNc's eucariotas o víricos. Dichas regiones contienen segmentos de nucleótidos que se transcriben como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica polipéptidos PRO.

Procedimientos, vectores y células huésped adicionales adecuadas para ser adaptadas a la síntesis de polipéptidos PRO en cultivos celulares vertebrados recombinantes se describen en Gething et al., Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281: 40-46 (1979); EP 117,060 y EP 117,058.

D. Detección de la amplificación/Expresión de genes

La amplificación y/o expresión puede medirse en una muestra directamente, por ejemplo, mediante análisis Southern convencional, análisis Northern convencional para cuantificar la transcripción del ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)], análisis sobre mancha -dot blot- (análisis de ADN) o hibridación in situ, utilizando una sonda marcada apropiada, basada en las secuencias que se proporcionan en la presente invención. Alternativamente, pueden utilizarse anticuerpos que reconozcan híbridos bicatenarios específicos, incluyendo los híbridos bicatenarios de ADN, los híbridos bicatenarios de ARN, los híbridos bicatenarios ADN-ARN o los híbridos bicatenarios ADN-proteína. Los anticuerpos pueden marcarse a su vez y el ensayo puede llevarse a cabo estando el dúplex unido a una superficie de manera que tras la formación de dúplex sobre la superficie puede detectarse la presencia de anticuerpo unido al dúplex.

La expresión génica, alternativamente, puede medirse mediante procedimientos inmunológicos, como por ejemplo la tinción inmunohistoquímica de células o secciones de tejido y el ensayo de cultivos celulares o fluidos del cuerpo, para cuantificar directamente la expresión del producto génico. Algunos anticuerpos adecuados para la tinción inmunohistoquímica y/o ensayo de muestras de fluidos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden prepararse en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse contra una secuencia de un polipéptido PRO nativa o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN proporcionadas en la presente invención o contra una secuencia exógena fusionada a ADN de un polipéptido PRO y que codifica un epítopo de anticuerpo específico.

E. Purificación del polipéptido

Las formas de los polipéptidos PRO pueden recuperarse del medio de cultivo o de los lisados de células huésped. Si están unidos a membrana, pueden separarse de la membrana utilizando una disolución de detergente adecuado (por ejemplo Triton-X 100) o mediante ruptura enzimática. Las células que se utilizan en la expresión de los polipéptidos PRO pueden romperse mediante diversos procedimientos físicos o químicos, como por ejemplo ciclos congelación-descongelación, sonicación, disrupción mecánica o agentes de lisado celular.

Puede desearse purificar los polipéptidos PRO de las proteínas o polipéptidos de las células recombinantes. Los siguientes procedimientos ilustran algunos procedimientos de purificación adecuados: fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación en etanol; HPLC de fase reversa; cromatografía en una resina de sílica o de intercambio catiónico como por ejemplo DEAE; cromofocalización; SDS-PAGE; precipitación en sulfato amónico; filtración en gel, utilizando, por ejemplo, columnas de Sephadex G-75; columnas de Proteínas A Sefarosa para separar contaminantes tipo IgG; y columnas quelantes de metales para unir formas identificadoras de epítopos del polipéptido PRO. Pueden emplearse diferentes procedimientos de purificación de proteínas y dichos procedimientos son conocidos en el estado de la técnica y están descritos, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology, (Procedimientos en Enzimología) 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, (Purificación de Proteínas: Principios y Práctica), Springer-Verlag, New Cork (1982). La etapa(s) de purificación seleccionada(s) dependen, por ejemplo, de la naturaleza del procedimiento de producción utilizado y del polipéptido PRO particular producido.

F. Usos de los polipéptidos PRO

Las secuencias de nucleótidos (o sus secuencias complementarias) que codifican los polipéptidos PRO de la presente invención tienen diversas aplicaciones en el campo de la técnica de la biología molecular, incluyendo usos como sondas de hibridación, en el mapeo de cromosomas y genes y en la generación de ARN y ADN antisentido. El ácido nucleico que codifica un polipéptido PRO también será útil para la preparación de polipéptidos PRO mediante técnicas recombinantes descritas en la presente invención.

El ácido nucleico que codifica la secuencia nativa de secuencia completa de un polipéptido PRO o porciones del mismo, puede utilizarse como sondas de hibridación para una biblioteca de ADNc para aislar el gen del polipéptido PRO de cadena completa o para aislar otros genes (por ejemplo, aquellos que codifican variantes presentes en la naturaleza del polipéptido PRO o polipéptidos PRO de otras especies), los cuales tengan la identidad de secuencia deseada con las secuencias de ácido nucleico del polipéptido PRO. Opcionalmente, la longitud de las sondas será de aproximadamente 20 hasta aproximadamente 50 bases. Las sondas de hibridación pueden derivar de la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las moléculas de ADN que se describen en la invención o a partir de secuencias genómicas que incluyen promotores, elementos potenciadores e intrones del ADN que codifica la secuencia nativa del polipéptido PRO. A modo de ejemplo, un procedimiento de exploración comprenderá aislar la región codificante del gen del polipéptido PRO utilizando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda seleccionada de aproximadamente 40 bases. Las sondas de hibridación pueden marcarse mediante diferentes marcas, incluyendo los radionucleótidos como por ejemplo 32P o 35S o marcas enzimáticas como por ejemplo la fosfatasa alcalina acoplada ala sonda vía sistemas de acoplamientos avidina/biotina. Las sondas marcadas que tengan una secuencia complementaria a la del gen del polipéptido PRO específico de la presente invención pueden utilizarse para explorar bibliotecas de ADNc, ADN genómico o ARNm humano para determinar a qué miembros de dichas bibliotecas se hibrida dicha sonda. Las técnicas de hibridación se describen con mayor detalle en los ejemplos más abajo.

Las EST's descritas en la presente solicitud pueden utilizarse de forma similar como sondas, utilizando los procedimientos descritos en la solicitud.

Las sondas pueden emplearse también en técnicas de PCR para generar un almacén de secuencias para la identificación de secuencias de polipéptidos PRO muy relacionadas.

Las secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido PRO pueden utilizarse también para construir sondas de hibridación para mapear el gen que codifica dicho polipéptido PRO y para el análisis genético de individuos con enfermedades genéticas. Las secuencias de nucleótidos que se proporcionan en la presente solicitud pueden mapearse a regiones cromosómicas y específicas de un cromosoma utilizando técnicas conocidas, como por ejemplo hibridación in situ, análisis de ligamiento contra marcadores cromosómicos conocidos y exploración de hibridación con bibliotecas.

El polipéptido PRO puede utilizarse en ensayos para identificar sus ligandos. De forma similar, pueden identificarse inhibidores de la interacción receptor/ligando. Las proteínas implicadas en dichas interacciones de unión pueden utilizarse también para explorar péptidos o pequeñas moléculas que son inhibidores o agonistas de la interacción de unión. Los ensayos de exploración pueden diseñarse de manera que se encuentren compuestos guía que mimeticen la actividad biológica de un polipéptido PRO nativo o de un ligando del polipéptido PRO. Dichos ensayos de exploración incluirán ensayos susceptibles de utilizarse en la exploración de alto rendimiento de las bibliotecas química, haciéndolos particularmente adecuados para la identificación de pequeñas moléculas candidatas como fármacos. Algunas moléculas pequeñas contempladas incluyen compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos. Los ensayos pueden llevarse a cabo en diversos formatos, incluyendo ensayos de unión proteína-proteína, ensayos de exploración bioquímica, inmunoensayos y ensayos basados en células, los cuales se encuentran bien caracterizados en el estado de la técnica.

Los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido PRO o sus formas modificadas pueden utilizarse también para generar animales transgénicos o animales "knock out", los cuales, a su vez, son útiles en el desarrollo y exploración de reactivos útiles terapéuticamente. Un animal transgénico (por ejemplo un ratón o rata) es un animal que tiene células que contienen un transgen, cuyo transgen se ha introducido en el animal o en un ancestro del animal en un estadio prenatal, por ejemplo un estadio embriónico. Un transgen es un ADN que se ha integrado en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico. En una realización de la invención, puede utilizarse ADNc que codifica un polipéptido PRO de interés para clonar ADN genómico que codifica el polipéptido PRO, de acuerdo con técnicas establecidas y las secuencias genómicas utilizadas, generando animales transgénicos que contienen células que expresan ADN que codifica el polipéptido PRO. Algunos procedimientos para generar animales transgénicos, particularmente animales tipo mono o ratas, se han hecho convencionales en el estado de la técnica y se describen, por ejemplo, en las patentes EEUU Nums. 4,736,866 y 4,870,009. Típicamente, se dirigirá la incorporación de un transgen del polipéptido PRO a células particulares mediante potenciadores específicos de tejido. Los animales transgénicos que incluyen una copia de un transgen que codifica un polipéptido PRO introducido en la línea germinal del animal en un estadio embriónico pueden utilizarse par examinar el efecto de una expresión aumentada del ADN que codifica el polipéptido PRO. Dichos animales pueden utilizarse como animales de ensayo de reactivos de los que se piensa que confieren protección contra, por ejemplo, estados patológicos asociados con su sobreexpresión. De acuerdo con este aspecto de la invención, se trata un animal con el reactivo y si se produce una incidencia reducida del estado patológico, en comparación con animales no tratados que contienen el transgen, este hecho indicaría una potencial mediación terapéutica para tratar el estado patológico.

Alternativamente, los homólogos no humanos de los polipéptidos PRO pueden utilizarse para construir un animal "knock out" para el polipéptido PRO, el cual tiene un gen defectuoso o alterado que codifica el polipéptido PRO de interés como resultado de una recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica el polipéptido PRO y un ADN genómico alterado que codifica el polipéptido PRO introducido en una célula embriónica del animal. Por ejemplo, puede utilizarse ADNc que codifica un polipéptido PRO de interés para clonar ADN genómico que codifica el polipéptido PRO, de acuerdo con técnicas establecidas. Una porción del ADN genómico que codifica un polipéptido PRO puede seleccionarse o substituirse con otro gen, por ejemplo un gen que codifique un marcador de selección que puede utilizarse para monitorizar su integración. Típicamente se incluyen en el vector varias kilobases de ADN flanqueante inalterado (tanto en el extremo 5' como 3') [véase por ejemplo Thomas y Capecchi, Cell, 51: 503 (1987) en relación a una descripción de vectores recombinantes homólogos]. El vector se introduce en una línea celular madre embriónica (por ejemplo mediante electroporación) y las células en las cuales el ADN introducido se haya recombinado homólogamente con el ADN endógeno se seleccionan [véase por ejemplo, Li et al., Cell, 69: 915 (1992)]. Las células seleccionadas se inyectan entonces en un blastocisto de un animal (por ejemplo un ratón o una rata), formando quimeras de agregación [véase, por ejemplo, Bradley en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach (Teratocarcinomoas y Células Madre Embriónicas: una Aproximación Práctica), E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152]. Entonces puede implantarse un embrión quimérico en un animal hembra de acogida pseudopreñada adecuada y desarrollar el embrión para crear un animal "knock out". La progenie que presente el ADN recombinado de forma homóloga en sus células germinales podrán indentificarse mediante técnicas estándar y utilizarse para engendrar animales en los cuales todas las células del animal contengan el ADN recombinado de forma homóloga. Los animales knock out pueden caracterizarse, por ejemplo, por su capacidad de defenderse contra ciertos estados patológicos y por su desarrollo de estados patológicos debido a la ausencia del polipéptido
PRO.

Los polipéptidos PRO287 y las porciones de los mismos que manifiestan la actividad de la proteína morfogénica del hueso "BMP1"/procolágeno C-proteinasa (PCP) pueden ser útiles también para objetivos terapéuticos in vivo, así como para diversas aplicaciones in vitro. Además, los polipéptidos PRO287 y las porciones de los mismos pueden tener aplicaciones terapéuticas en la curación de heridas y la reparación de tejidos. Los péptidos que tengan homología con la proteína potenciadora del procolágeno C proteinasa y su precursor pueden utilizarse también para inducir la formación de hueso y/o cartílago y tienen por tanto un interés particular en la comunidad científica y médica.

Anticuerpos anti-polipéptido PRO

La presente invención proporciona también anticuerpos anti-polipéptidos PRO. Algunos anticuerpos ilustrativos incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados.

A. Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos anti-polipéptido PRO pueden comprender anticuerpos policlonales. Un experto medio en la técnica conoce diversos procedimientos de preparación de anticuerpos policlonales. Los anticuerpos policlonales pueden obtenerse en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante si se desea, un coadyuvante. Típicamente, el agente inmunizante y/o coadyuvante puede incluir el polipéptido PRO o una proteína fusionada al mismo. Puede ser útil conjugar el agente inmunizante a una proteína que es inmunogénica para el mamífero que se está inmunizando. Algunos ejemplos de dichas proteínas inmunogénicas incluyen, pero no se limitan a hemocianina de lapa, albúmina del suero, tiroglobulina bovina y el inhibidor de la tripsina de la semilla de soja. Algunos ejemplos de coadyuvantes que pueden utilizarse incluyen el coadyuvante completo de Freund y el coadyuvante MPL-TDM (Lípido A monofosforilado, dicorinomicolato de trehalosa sintético). Un experto medio en la técnica podrá seleccionar el protocolo de inmunización sin experimentación indebida.

B. Anticuerpos monoclonales

Alternativamente, los anticuerpos anti-polipéptido PRO pueden ser anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando procedimientos de hibridoma, por ejemplo los descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256: 495(1975). En un procedimiento de hibridoma, se inmuniza típicamente un ratón, hámster u otro animal huésped apropiado, con un agente inmunizante parar obtener linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro.

El agente inmunizante incluirá típicamente el polipéptido PRO de interés o una proteína de fusión del mismo. Generalmente, se utiliza cualquier linfocito de la sangre periférica ("Pals") si se desean células de origen humano, o bien se utilizan células de bazo o células de nódulos linfáticos si se desean fuentes mamíferas no humanas. Los linfocitos se fusionan entonces con una línea celular inmortalizada utilizando un agente de fusión adecuado, como por ejemplo el polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (Anticuerpos Monoclonales: Principios y Práctica), Academic Press, (1986), pp. 59-103]. Las líneas celulares inmortalizadas son habitualmente células de mamífero transformadas, en particular células de mieloma de origen roedor, bovino y humano. Habitualmente, se utilizan células de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que contenga preferentemente una o más substancias que inhiban el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo de los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina y timidita ("medio HAT"), cuyas substancias impiden el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Algunas líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, que soportan un nivel de expresión alto y estable del anticuerpo a cargo de las células productoras de anticuerpos seleccionadas y que son sensibles al medio, por ejemplo al medio HAT. Aún son más preferidas como líneas celulares inmortalizadas son las líneas de mieloma murino, que pueden obtenerse, por ejemplo, a partir del Salk Institute Cell Distribution Center (Centro de Distribución de Células del Instituto Salk), San Diego, California y la American Type Culture Collection (Colección de Cultivos Tipo Americana), Rockville, Maryland. También se ha descrito la utilización de líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (Técnicas de Producción de Anticuerpos y Aplicaciones), Marcel Dekker, Inc., New Cork, (1987), pp. 51-63].

Puede explorarse la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el polipéptido PRO de interés en el medio de cultivo en el cual se cultivan las células de hibridoma. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos mediante las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, por ejemplo un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA). Dichas técnicas y ensayos son conocidos en el estado de la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980).

Después de identificar las células de hibridoma deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y hacerse crecer mediante procedimientos estándar [Goding, supra]. Algunos medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, el medio de Tagle modificado por Dulbecco y el medio RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridoma pueden hacerse crecer in vivo como ascitis en un mamífero.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden aislarse o purificarse a partir del medio de cultivo o del fluido ascítico mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales, como por ejemplo, proteína A Sefarosa, cromatrografía en hidroxilapatatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

Los anticuerpos monoclonales también pueden obtenerse mediante procedimientos de ADN recombinante, como por ejemplo los descritos en la patente EEUU Núm. 4.816,567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede aislarse y secuenciarse fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo utilizando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos). Las células de hibridoma de la invención son la fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede introducirse en vectores de expresión, los cuales se transfectan entonces en células huésped, por ejemplo células de simio COS, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que en caso contrario no producirían la proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células recombinantes huésped. También puede modificarse el ADN, por ejemplo introduciendo la secuencia codificante de los dominios constantes de la cadena pesada y ligera en la posición de las secuencias murinas homólogas [patente EEUU Núm. 4,816,567; Morrison et al., supra] o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de la inmunoglobulina, la secuencia completa o parte de la secuencia de un polipéptido diferente de inmunoglobulina. Dichos polipéptido diferentes de inmunoglobulina pueden substituirse por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o pueden substituirse por los dominios variables de un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Algunos procedimientos de preparación de anticuerpos monovalentes son bien conocidos en el estado de la técnica. Por ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de la cadena ligera de la inmunoglobulina y la cadena pesada modificada. La cadena pesada se trunca en general en cualquier punto de la región Fc, de manera que se impide el entrecruzamiento de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos de cisterna relevantes se substituyen por otro residuo de aminoácido o se seleccionan de manera que se impida el entrecruzamiento.

Los procedimientos in vitro también son adecuados para la preparación de anticuerpos monovalentes. La digestión de los anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente fragmentos Fab, puede realizarse utilizando técnicas rutinarias conocidas en el estado de la técnica.

C. Anticuerpos humanizados

Los anticuerpos anti-polipéptido PRO de la invención pueden comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de los anticuerpos no humanos (por ejemplo murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas quiméricas o fragmentos quiméricos de las mismas (por ejemplo Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de anticuerpos de unión a antígeno) que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen las inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales se reemplazan residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor por residuos de un CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), por ejemplo ratón, rata o conejo, con la especificidad, afinidad y capacidad deseada. Los anticuerpos humanizados pueden comprender también residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el CDR importado o secuencias armazón. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá substancialmente todos los dominios variables o como mínimo un dominio, y típicamente dos dominios variables, en los cuales todas o substancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o substancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de una inmunoglobulina humana. Óptimamente, el anticuerpo humanizado también comprenderá como mínimo una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)].

Algunos procedimientos para humanizar anticuerpos no-humanos son bien conocidos en el estado de la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado ha introducido uno o más residuos de aminoácido a partir de una fuente que es no-humana. A menudo se hace referencia a dichos residuos de aminoácidos no humanos como residuos "importados", los cuales se toman típicamente a partir de un dominio variable "importado". La humanización puede llevarse a cabo esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y cotrabajadores [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)], substituyendo CDRs de roedor o secuencias de CDR de roedor por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. De acuerdo con lo anterior, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente EEUU Núm. 4,816,567), en los cuales se ha substituido menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR se han substituido por residuos tomados de posiciones análogas en anticuerpos de roedor.

Los anticuerpos humanos pueden producirse también utilizando diversas técnicas conocidas en el estado de la técnica, incluyendo las bibliotecas de exposición de fagos [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)]. También se encuentran disponibles las técnicas de Cole et al. y Boerner et al. para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (Anticuerpos Monoclonales y Terapia del Cáncer), Alan R. Liss, p. 77 (1985) y Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)].

D. Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferentemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión para como mínimo dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es para el polipéptido PRO, la otra es para cualquier otro antígeno y preferentemente para una proteína o de superficie celular o receptor de superficie celular o subunidad de receptor de superficie celular.

Se han descrito en el estado de la técnica procedimientos para la preparación de anticuerpos biespecíficos. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la co-expresión de dos pares cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, teniendo cada una de las cadenas pesadas diferente especificidades [Milstein y Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)]. Debido al surtido al azar de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, dichos hibridomas (cuadrotas) producen una mezcla potencial de diez moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta se lleva a cabo habitualmente mediante etapas de cromatografía de afinidad. Algunos procedimientos similares se describen en la solicitud de patente WO 93/08829, publicada el 13 de mayo de 1993 y en Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).

Los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de unión anticuerpo-antígeno) pueden fusionarse a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión es preferentemente con un dominio constante de una cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende como mínimo parte de la región de la bisagra y de las regiones CH2 y CH3. Se prefiere que la primera región constante de cadena pesada (CH1) contenga el sitio necesario para la unión de la cadena ligera en como mínimo una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se cotransfectan en organismos huésped adecuados. Para más detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos, véase, por ejemplo, Zurres et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).

E. Anticuerpos heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugados también están incluidos dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos por dos anticuerpos unidos covalentemente. Se ha propuesto, por ejemplo, direccionar dichos anticuerpos hacia células del sistema inmune contra células indeseadas [patente EEUU Núm. 4,676,980] y utilizarlos en el tratamiento de la infección HIV [solicitud de patente WO 91/00360; solicitud de patente WO 92/200373; patente EP 03089]. Se contempla que los anticuerpos pueden prepararse in vitro utilizando procedimientos conocidos en química de proteínas sintéticas, incluyendo aquellos que implican agentes de entrecruzamiento. Por ejemplo, puede construirse inmunotoxinas utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioeter. Algunos ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen el iminotiolato y el metil-4-mercaptobutirimidato y los reactivos descritos, por ejemplo, en la patente EEUU Núm. 4,676,980.

Usos de los anticuerpos anti-polipéptido PRO

Los anticuerpos anti-polipéptido PRO de la invención tienen diversas utilidades. Por ejemplo, puede utilizarse anticuerpos anti-polipéptido PRO en ensayos de diagnóstico de un polipéptido PRO, es decir, para detectar su expresión en células, tejidos o suero específicos. Puede utilizarse diversas técnicas de ensayo de diagnóstico conocidas en el estado de la técnica, por ejemplo los ensayos de unión competitiva, los ensayos sándwich directos o indirectos y los ensayos de inmunoprecipitación conducidos en fases heterogéneas u homogéneas [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques (Anticuerpos Monoclonales: un Manual de Técnicas), CRC Press, Inc. (1987) pp.147-158]. Los anticuerpos utilizados en los ensayos de diagnóstico pueden marcarse con un esqueleto detectable. El esqueleto detectable debe ser capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, el esqueleto detectable puede ser un radioisótopo, por ejemplo ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S o ^{125}I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, por ejemplo el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina, o la luciferina, o una enzima, por ejemplo la fosfatasa alcalina, la beta-galactosidasa o la peroxidasa de rábano picante. Puede emplearse cualquier procedimiento conocido en el estado de la técnica para conjugar el anticuerpo a un esqueleto detectable, incluyendo aquellos procedimientos descritos por Hunter et al., Nature, 144: 945 (1962); David et al., Biochemistry, 13: 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40: 219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407
(1982).

Los anticuerpos anti-polipéptido PRO también son útiles para la purificación por afinidad de un polipéptido PRO a partir de un cultivo celular o de fuentes naturales. En dicho procedimiento, los anticuerpos contra el polipéptido PRO se inmovilizan sobre un soporte adecuado, por ejemplo una resina Sephadex o un papel de filtro, utilizando procedimientos bien conocidos en el estado de la técnica. El anticuerpo inmovilizado se pone entonces en contacto con una muestra que contenga el polipéptido PRO a purificar y después el soporte se lava con un disolvente adecuado que extraerá substancialmente todo el material en la muestra excepto el polipéptido PRO, que se encuentra unido al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro disolvente adecuado que liberará el polipéptido PRO del anticuerpo.

Los antígenos asociados al cáncer o los antígenos específicos de cáncer permiten la creación de anticuerpos monoclonales específicos de tumor o cáncer (mAbs) que son específicos para dichos antígenos de tumor. Dichos mAbs, que pueden distinguir entre las células normales y cancerígenas, son útiles en el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de la enfermedad.

Anticuerpos monoclonales específicos de cáncer (mAbs) que son específicos para dichos antígenos de tumor. Dichos mAbs, que pueden distinguir entre las células normales y cancerígenas, son útiles en el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de la enfermedad. Se sabe que algunos antígenos particulares están asociados a enfermedades neoplásicas, por ejemplo el cáncer colorectal o el cáncer de pecho. Dado que el cáncer de colon es una enfermedad muy extendida, su diagnóstico temprano y tratamiento es un importante objetivo médico. El diagnóstico y tratamiento del cáncer puede implementarse utilizando anticuerpos monoclonales (mAbs) específicos con identificadores fluorescentes, magnético nucleares o radioactivos. Los mAbs etiquetados con genes, toxinas y/o fármacos radioactivos pueden utilizarse para el tratamiento in situ con una descripción del paciente mínima.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo ilustrativo y no pretenden limitar el alcance de la presente invención en manera alguna.

Ejemplos

Los reactivos comerciales a los cuales se hace referencia en los ejemplos se utilizaron según las instrucciones del fabricante a menos que se indique lo contrario. La fuente de aquellas células identificadas en los siguientes ejemplos y a lo largo de la descripción, mediante números de acceso ATCC corresponde a la American Type Culture Collection (Colección de Cultivos Tipo Americana), Rockville, Maryland.

Ejemplo 1 Exploración de homología de dominio extracelular para identificar polipéptidos novedosos y el ADNc que los codifica

Las secuencias del dominio extracelular (ECD) (incluyendo la secuencia señal de secreción, si hubiera) de aproximadamente 950 proteínas de secreción conocidas de la base de datos pública Swiss-PRot, se utilizaron para buscar en las bases de datos EST. Las bases de datos EST incluían bases de datos públicas (por ejemplo Dayhoff, GenBank) y bases de datos propietarias (por ejemplo LIFEQEQ^{TM}, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA). La búsqueda se llevó a cabo utilizando el programa de ordenador BLAST o BLAST2 (Altschul y Gish, Methods in Enzymology, 266: 460-80 (1996); http:77blast.wustl/edu/blast/README.html) como comparación de las secuencias de proteína ECD con una traducción de marco 6 de las secuencias EST. Dichas comparaciones con una puntuación Blast de 70 (o en algunos casos de 90) o mayores que no codificaban proteínas conocidas, se agruparon y ensamblaron en secuencias de ADN consenso con el programa "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, WA; (http://boezeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/phrap.html).

Utilizando esta exploración de homología de dominio extracelular, se ensamblaron secuencias de ADN consenso con las otras secuencias EST identificadas. Además, las secuencias de ADN consenso obtenidas se extendieron a menudo (aunque no siempre) utilizando ciclos repetidos de BLAST y phrap para extender la secuencia consenso tanto como era posible utilizando las fuentes de las secuencias EST discutidas más arriba.

Basándose en las secuencias consenso obtenidas tal y como se ha descrito más arriba, se sintetizaron oligonucleótidos y se utilizaron para identificar por PCR una biblioteca de ADNc que contenía la secuencia de interés y para su utilización como sondas para aislar un clon de la secuencia codificante de longitud completa de un polipéptido PRO. Los cebadores de PCR directo (.f) y reverso (.r) tienen un tamaño que va generalmente de 20 a 30 nucleótidos y se diseñan a menudo de manera que se obtenga un producto de PCR de aproximadamente 100-1000 pb de longitud. Las secuencias sonda (.p) tienen típicamente 40-55 pb de longitud. En algunos casos, se sintetizan oligonucleótidos adicionales cuando la secuencia consenso es mayor de aproximadamente 1-1,5 pkb. Para explorar un clon de longitud completa en diferentes bibliotecas, se exploró el ADN de las bibliotecas mediante amplificación PCR, según Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, con el par de cebadores de PCR. Se utilizó entonces una biblioteca positiva para aislar los clones que codificaban el gen de interés utilizando la sonda de oligonucleótidos y uno de los pares de cebadores.

Las bibliotecas de ADNc utilizadas para aislar los clones de ADNc se construyeron mediante procedimientos estándar utilizando reactivos comerciales, por ejemplo los de Invitrogen, San Diego, Ca. El ADNc se cebó con un oligo dT que contenía una diana Notl, unido con extremos romos a adaptadores de hemiquinasa SalI, se rompieron con Notl, se comprobó que tenían el tamaño adecuado mediante electroforesis en gel y se clonaron en una orientación definida en un vector de clonación adecuado (por ejemplo pRkb o pRkd, pRk5B es un precursor de pRK5D que no contiene la diana SfiI; véase Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 (1991)) en las dianas únicas XhoI y
NotI.

Ejemplo 2 Aislamiento de clones de ADNc que codifican PRO287 humano

Se ensambló una secuencia de ADN consenso que codifica PRO287 con otras secuencias EST identificadas, tal como se ha descrito en el ejemplo 1 más arriba, designándose en la presente invención dicha secuencia consenso como ADN28728. Basándose en la secuencia consenso ADN28728, se sintetizaron oligonucleótidos para identificar mediante PCR una biblioteca de ADNc que contenía la secuencia de interés y para utilizarlos como sondas para aislar un clon de la secuencia codificante de longitud completa de PRO287.

Se sintetizaron un par de cebadores de PCR (directo e inverso):

Cebador de PCR directo:	5'-CCGATTCATAGACCTCGAGAGT-3'
	(SEQ ID NO:3)
Cebador de PCR inverso:	5'-GTCAAGGAGTCCTCCACAATAC-3'
	(SEQ ID NO:4)

Adicionalmente, se construyó una sonda de hibridación oligonucleotídica a partir de la secuencia consenso
ADN28728, la cual tenía la siguiente secuencia de nucleótidos

Sonda de hibridación:	5'-GTGTACAATGGCCATGCCAATGGCCAGCGCATTGGCCGCTTCTGT-3'
	(SEQ ID NO:5)

Para explorar la presencia de un clon de longitud completa en diferentes bibliotecas, se exploró el ADN de las bibliotecas mediante amplificación PCR con el par de cebadores de PCR identificados más arriba. Entonces se utilizó una biblioteca positiva para aislar los clones que codificaban el gen PRO287 utilizando la sonda de oligonucleótidos y uno de los cebadores de PCR.

Se aisló ARN para la construcción de las bibliotecas de ADNc a partir de tejido de riñón fetal humano.

La secuenciación de ADN de los clones aislados tal y como se ha descrito más arriba proporcionó la secuencia de ADN de longitud completa de PRO287 [designada en la presente invención como UNQ250 (ADN39969-1185), SEQ ID NO:1] y la secuencia de la proteína derivada PRO287. La secuencia de nucleótidos completa de UNQ250 (ADN39969-1185) se muestra en la figura 1 (SEQ ID NO:1). El clon UNQ250 (ADN39969-1185) contiene un sólo marco de lectura abierta con un sitio de iniación de la traducción aparente en las posiciones de nucleótidos 307-309 y finaliza en el codón de terminación en las posiciones de nucleótidos 1552-1554 (figura 1; SEQ ID NO:1). El precursor de polipéptido que se predice tiene 415 aminoácidos de longitud (figura 2). El clon UNQ250 (ADN39969-1185) se ha depositado en la ATCC y se le ha asignado el número de depósito ATCC 209400.

El análisis de la secuencia de aminoácidos de longitud completa de PRO287 sugiere que puede poseer uno o más precursores de la proteína potenciadora del procolágeno C proteinasa o dominios similares al de la proteína potenciadora de la procolágeno C proteinasa. Basándose en un análisis de alineación BLAST y FastA de la secuencia de longitud completa, PRO287 muestra una identidad de secuencia de ácidos nucleicos con el precursor de la proteína potenciadora del procolágeno C proteinasa y a la proteína potenciadora del procolágeno C proteinasa (47% y 54%, respectivamente).

Ejemplo 3 Utilización de un Ácido Nucleico que Codifica un Polipéptido PRO como Sondas de Hibridación

El siguiente procedimiento describe la utilización de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PRO como sonda de hibridación.

El ADN que comprende la secuencia codificante de un polipéptido PRO de interés, descrito en la presente invención, puede utilizarse como sonda o utilizarse como base a partir de la cual preparar sondas para explorar ADNs homólogos (por ejemplo aquellos que codifican variantes del polipéptido PRO presentes en la naturaleza) en bibliotecas de ADNc de tejido humano o en bibliotecas genómicas de tejido humano.

La hibridación y el lavado de filtros que contienen bibliotecas de ADNs se llevan a cabo bajo las siguientes condiciones altamente restrictivas. La hibridación de una sonda marcada radioactivamente derivada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido PRO en los filtros se lleva a cabo en una disolución de un 50% de formamida, 5 x SSC, un 0,1% de SDS, un 0,1% de pirofosfato de sodio, fosfato sódico 50 mM, pH 6,8, 2 x solución de Dernhardt y un 10% de sulfato de dextrano a 42ºC durante 20 horas. El lavado de los filtros se lleva a cabo en una disolución acuosa de 0,1 x SSC y un 0,1% de SDS a 42ºC.

Así pues, los ADNs que tienen la identidad de secuencia deseada con la secuencia nativa de longitud completa del polipéptido PRO pueden identificarse utilizando técnicas estándar conocidas en el estado de la técnica.

Ejemplo 4 Expresión de polipéptidos PRO en E. coli

El presente ejemplo ilustra la preparación de una forma no glicosilada de un polipéptido PRO deseado mediante su expresión recombinante en E. coli.

La secuencia de ADN que codifica el polipéptido PRO deseado se amplifica inicialmente utilizando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores deben contener dianas de restricción enzimáticas que correspondan a las dianas e restricción enzimáticas en el vector de expresión seleccionado. Puede utilizarse un gran número de vectores de expresión. Un ejemplo de un vector adecuado es pBR322 (derivado de E. coli; véase Bolivar et al., Gene, 2: 95 (1977)), que contiene genes de resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina. El vector se digiere con una enzima de restricción y se defosforila. Las secuencias amplificadas por PCR se ligan entonces en el vector. Preferentemente, el vector incluirá secuencias que codifiquen un gen de resistencia a antibiótico, un promotor trp, un líder de polihis (incluyendo los primeros seis codones STII, la secuencia de polihis y dianas de restricción por enteroquinasa), la región codificante del polipéptido PRO específico, un terminador de la transcripción lambda y un gen argU.

La mezcla de ligación se utiliza entonces para transformar una cepa de E. coli seleccionada utilizando los procedimientos descritos en Sambrook et al., supra. Los transformantes se identifican por su capacidad de crecer en placas LB y se seleccionan las colonias resistentes a antibiótico. El ADN plasmídico puede aislarse y confirmarse mediante análisis de restricción y secuenciación del ADN.

Los clones seleccionados pueden hacerse crecer durante una noche en un medio de cultivo líquido, por ejemplo caldo de cultivo LB suplementado con antibióticos. El cultivo de una noche puede utilizarse a continuación para inocular un cultivo a mayor escala. Las células se hacen crecer entonces hasta una densidad óptica deseada, activándose el promotor de expresión.

Después de cultivar las células durante varias horas, las células pueden recogerse mediante centrifugación. El pellet de células obtenido por centrifugación puede solubilizarse utilizando diversos agentes conocidos en el estado de la técnica y el polipéptido PRO solubilizado puede purificarse entonces utilizando una columna quelante de metal en condiciones que permiten una unión estrecha de la proteína.

En la solicitud de patente EP 1027434 A (98946090.2), se expresó con éxito PRO187, PRO317, PRO301, PRO224 y PRO238 en E. coli en una forma etiquetada con poli-his, utilizando el siguiente procedimiento. El ADN que codifica PRO187, PRO317, PRO301, PRO224 o PRO238 se amplificó inicialmente utilizando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores contenían dianas de restricción enzimáticas que correspondían a las dianas de restricción enzimáticas existentes en el vector de expresión seleccionado y otras secuencias útiles que proporcionaban una iniciación de la traducción eficiente y fiable, una rápida purificación sobre una columna quelante de metales y la separación proteolítico con enteroquinasa. Las secuencias etiquetadas con poli-his amplificadas por PCR se ligaron entonces en un vector de expresión, que se utilizó para transformar un huésped de E. coli basado en la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA)lon galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq). Los transformantes se hicieron crecer primero en medio LB que contenía 50 mg/ml de carbenicilina a 30ºC bajo agitación basculante hasta alcanzarse una O.D. 600 de 3-5. Los cultivos se diluyeron entonces 50-100 veces en medio CRAP (preparado mezclando 3,57 g (NH_{4})SO_{4}, 0,71 g de citrato sódico·2H_{2}O, 1,07 g de KCl, 5,36 g de extracto de levadura Difco, 5,36 g de hicasa Sheffield SF en 500 ml de agua, así como MPOS 110 mM, pH 7,3, un 0,55% (peso/volumen) de glucosa y MgSO_{4}) y se hizo crecer durante aproximadamente 20-30 horas a 30ºC bajo agitación basculante. Se extrajeron muestras para verificar la expresión mediante análisis SDS-PAGE y el cultivo en grosso se centrifugó para sedimentar las células. Los pellets celulares se congelaron hasta su purificación y renaturalización.

La pasta de E. coli de la fermentación de 0,5 l a 1 l (6-10 g pellet) se resuspendió en 10 volúmenes (peso/volumen) en guanidina 7 M, tampón Tris 20 mM, pH 8. Se adicionó sulfito sódico sólido y tetrahionato sódico hasta una concentración final 0,1 M y 0,02 M, respectivamente y la solución se agitó durante una noche a 4ºC. Esta etapa da como resultado una proteína desnaturalizada con todos los residuos de cisteína bloqueadas por sulfitolización. La solución se centrifugó a 40,000 rpm en una Ultracentrífuga Beckman durante 30 min. El sobrenadante se diluyó con 3-5 volúmenes de un tampón para columna quelante de metales (guanidina 6 M, Tris 20 mM, pH 7,4) y se filtró a través de filtros de 0,22 micrones para clarificarlo. El extracto clarificado se cargó en una columna quelante de metales de 5 ml Qiagen Ni-NTA equilibrada en tampón para columna quelante de metales. La columna se lavó con tampón adicional que contenía imidazol 50 mM (Calbiochem, grado Utrol), pH 7,4. La proteína se eluyó con un tampón que contenía imidazol 250 mM. Las fracciones que contenían la proteína deseada se juntaron y se almacenaron a 4ºC. Se estimó la concentración de proteína por su absorbancia a 280 nm utilizando el coeficiente de extinción calculado basado en su secuencia de aminoácidos.

Las proteínas se renaturalizaron diluyendo la muestra lentamente en un tampón de renaturalización recién preparado, el cual consistía en: Tris 20 mM, pH 8,6, NaCl 0,3 M, urea 2,5 M, cisteína 5 mM, glicina 20 mM y EDTA 1 mM. Los volúmenes de renaturalización se escogieron de tal manera que la concentración final de proteína fuera de 50 a 100 microgramos/ml. La disolución de renaturalización se agitó suavemente a 4ºC durante 12-36 horas. La reacción de renaturalización se paró mediante la adición de TFA hasta una concentración final de 0,4% (pH de aproximadamente 3). Antes de continuar purificando la proteína, la solución se filtró a través de un filtro de 0,22 micrones y se añadió acetonitrilo hasta una concentración final de 2-10%. La proteína renaturalizada se purificó por cromatografía a través de una columna de fase reversa Poros R1/H, utilizando un tampón móvil de TFA al 0,1%, eluyendo con un gradiente de acetonitrilo de 10% a 80%. Se analizaron alícuotas de las fracciones mediante absorbancia a A280 de geles de poliacrilamida SDS y las fracciones que contenían proteínas renaturalizadas homólogas se juntaron. Generalmente, las especies correctamente renaturalizadas de la mayoría de las proteínas eluyen a concentraciones menores de acetonitrilo, dado que dichas especies son más compactas, con sus interiores hidrofóbicos apantallados en cuanto a poder interaccionar con la resina de fase reversa. Las especies agregadas eluyen habitualmente a concentraciones mayores de acetonitrilo. Además de discernir las formas plegadas erróneamente de la forma deseada, la etapa de fase reversa también separa las endotoxinas de las muestras.

Las fracciones que contienen las proteínas plegadas deseadas PRO187, PRO317, PRO301, PRO224 y PRO238, respectivamente, se juntaron y se extrajo el acetonitrilo utilizando una corriente suave de nitrógeno dirigida a la disolución. Las proteínas se formularon en Hepes 20 mM, oH 6,8 con cloruro sódico 0,14 M y un 4% de manitol mediante diálisis o mediante filtración en gel utilizando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas en tampón de formulación y filtradas en condiciones estériles.

Ejemplo 5 Expresión de polipéptidos PRO en células de mamífero

El presente ejemplo ilustra la preparación de una forma glicosilada de un polipéptido deseado mediante su expresión recombinante en células de mamífero.

El vector pRK5 (véase la patente EP 307,247, publicada el 15 de marzo de 1989) se utiliza como vector de expresión. Opcionalmente, el ADN que codifica el polipéptido PRO se liga en pRK5 con enzimas de restricción seleccionadas, para permitir la inserción del ADN del polipéptido PRO utilizando procedimientos de ligamiento, por ejemplo los descritos en Sambrook et al., supra. El vector resultante se denomina pRK5-polipéptido PRO.

En una realización de la invención, las células huésped seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC CCL 1573) se hacen crecer hasta su confluencia en placas de cultivo de tejido en medio tipo DMEM suplementado con suero de ternera fetal y opcionalmente, componentes nutrientes y/o antibióticos. Se mezcla aproximadamente 10 \mug de pRK5-polipéptido PRO con aproximadamente 1 \mug de ADN que codifica el gen ARN VA [Thimmappaya et al., Cell, 31: 543 (1982)] y se disuelve en 500 \mul de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, CaCl_{2} 0,227 M. A esta mezcla se añade, gota a gota, 500 \mul de HEPES 50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, NaPO_{4} 1,5 mM y se permite la formación de precipitado durante cuatro horas a 37ºC. EL medio de cultivo se extrae por aspiración y se añaden 2 ml de glicero al 20% en PBS durante un intervalo de tiempo de 30 segundos. Las células 293 se lavan entonces con medio libre de suero, se añade medio fresco y las células se incuban durante aproximadamente
5 días.

Aproximadamente 24 horas después de las transfecciones, el medio de cultivo se separa y se substituye por medio de cultivo (sólo) o por medio de cultivo que contiene 200 \muCi/ml de ^{35}S-cisteína y 200 \muCi/ml de ^{35}S-metionina. Después de una incubación de 12 horas, se recoge el medio condicionado, se concentra en un filtro centrifugador y se carga en un gel de SDS al 15%. El gel procesado puede secarse y exponerse a film durante un período de tiempo seleccionado para revelar la presencia del polipéptido PRO. Los cultivos que contienen células transfectadas pueden incubarse de nuevo (en medio libre de suero) y se analiza el medio en bioensayos seleccionados.

En una técnica alternativa, el polipéptido PRO puede introducirse de forma transiente en las células 293 utilizando el procedimiento de dextran sulfato descrito por Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12: 7575 (1981). Las células 293 se hacen crecer hasta densidad máxima en un frasco centrifugador y se añaden 700 \mug de pRK5-polipéptido PRO. Primero se concentran las células a partir del frasco centrifugador mediante centrifugación y se lavan con PBS. El precipitado ADN-dextrano se incuba sobre el pellet celular durante cuatro horas. Las células se tratan con glicerol al 20% durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo de tejido y se reintroducen en un frasco centrifugador que contiene medio de cultivo de tejido, 5 \mug/ml de insulina bovina y 0,1 \mugml de transferrina bovina. Después de aproximadamente cuatro días, el medio condicionado se centrifuga y se filtra para separar las células y debris celular. La muestra que contenga polipéptido PRO expresado puede entonces concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, por ejemplo diálisis y/o cromatografía en columna.

En otra realización, los polipéptidos PRO pueden expresarse en células CHO. El vector pRK5-polipéptido PRO puede transfectarse en células CHO utilizando reactivos conocidos como por ejemplo CaPO_{4} o DEAE-dextrano. Tal y como se ha descrito más arriba, los cultivos celulares pueden incubarse y puede substituirse el medio con medio de cultivo (sólo) o con medio que contenga una radiomarca como por ejemplo ^{35}S-metionina. Después de determinar la presencia del polipéptido PRO, el medio de cultivo puede substituirse con medio libre de suero. Preferentemente, los cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días y entonces se recoge el medio condicionado. El medio que contiene péptido PRO expresado puede entonces concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado.

También puede expresarse el polipéptido PRO con una secuencia identificadora de epítopo en células huésped CHO. EL polipéptido PRO puede subclonarse a partir del vector pRK5. Puede realizarse PCR del inserto del subclon y fusionarse de forma limítrofe con un identificador de epítopo seleccionado, por ejemplo un identificador poli-his, en un vector de expresión de Baculovirus. El inserto de polipéptido PRO con identificador poli-his puede entonces subclonarse en un vector dirigido por SV40 que contenga un marcador de selección tipo DHFR para la selección de clones estables. Finalmente, las células CHO pueden transfectarse (tal como se ha descrito más arriba) con el vector dirigido por SV40. Puede llevarse a cabo un marcaje, tal como se ha descrito más arriba, para verificar la expresión. El medio de cultivo que contenga el polipéptido PRO expresado, el cual tiene una secuencia identificadora de poli-his, puede entonces concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, por ejemplo mediante cromatografía de afinidad quelante de Ni^{2+}.

En la solicitud de patente EP 1027434 A (9894609.2), se expresó con éxito PRO211, PRO217, PRO230, PRO219, PRO245, PRO221, PRO258, PRO301, PRO224, PRO222, PRO234, PRO229, PRO223, PRO328 Y PRO332 en células CHO tanto por un procedimiento transiente como por un procedimiento estable. Adicionalmente, se expresó con éxito de forma transiente en células CHO.

La expresión estable en células CHO se llevó a cabo utilizando el siguiente procedimiento. Las proteínas se expresaron como constructo IgG (inmunoahesina) en las cuales las secuencias codificantes de las formas solubles (por ejemplo, los dominios extracelulares) de cada una de las proteínas se fusionaron con una secuencia de región constante de IgG1 que contenía la región de la bisagra, los dominos CH2 y CH3 y/o una forma etiquetada con poli-his.

Después de la amplificación por PCR, cada uno de los ADNs se subclonó en un vector de expresión en CHO utilizando técnicas estándar, tal como se ha descrito en Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology (Protocolos Actuales en Biología Molecular), Unidad 3.16, John Wiley e hijos (1997). Los vectores de expresión en CHO se construyen de manera que tengan dianas de restricción compatibles en 5' y 3' del ADN de interés, para permitir el movimiento oscilante conveniente de los ADNc's. El vector se utilizó para expresión en células CHO tal como se ha descrito en Lucas et al., Nucl. Acids. Res., 24: 9, 1774-1779, (1996), utilizando el promotor temprano/potenciador de SV40 para dirigir la expresión del ADNc de interés y de la dihidrofolato reductasa (DHFR). La expresión de DHFR permite la selección de mantenimiento estable del plásmido tras la transfección.

Se introdujeron doce microgramos del ADN plasmídico deseado en aproximadamente 10 millones de células CHO utilizando reactivos de transfección comerciales Superfect© (Quiagen), Dosper© o Fugene© (Boehringer Mannheim). Las células se hicieron crecer y se describió en Lucas et al., supra. Aproximadamente 3 x 10^{-7} células se congelaron en una ampolla para continuar haciéndolas crecer y producirlas tal y como se describe más abajo.

Las ampollas que contenían el ADN plasmídico se descongelaron poniéndolas en un baño de agua y se mezclaron por vórtex. Los contenidos se pipetearon en un tubo de centrífuga que contenía 10 ml de medio y se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se aspiró y a continuación se resuspendieron las células en 10 ml de medio selectivo (0,2 \mum de PS20 filtrado con un 5% de suero bovino fetal diafiltrado en un filtro de 0,2 \mum). Entonces se dividieron las células en alícuotas y se introdujeron en centrifugadores de 100 ml que contenían 90 ml de medio selectivo. Después de 1-2 días, las células se transfirieron a un centrifugador de 250 ml con 150 ml de medio de crecimiento selectivo y se incubaron a 37ºC. Después de otros 2-3 días, se sembraron centrifugadores de 250 ml, 500 ml y 2000 ml con 3 x 10^{5} células/ml. El medio de cultivo se substituyó con medio fresco mediante centrifugación y resuspensión en medio de producción. Aunque puede utilizarse cualquier medio adecuado para CHO, se utilizó en concreto un medio de producción descrito en la patente EEUU Núm. 5,122,469, publicada el 16 de junio de 1992. Se sembró un centrifugador de producción de 3l con 1,2 x 10^{6} células/ml. En el día 0, el número de células se determinó por pH. En el día 1, se tomó una muestra del centrifugador y se empezó a burbujear con aire filtrado. En el día 2, se tomó una muestra del centrifugador, la temperatura se disminuyó a 33ºC y se añadieron 30 ml de glucosa 500 g/l y 0,6 ml de antiespumante al 10% (por ejemplo, emulsión de polidimetilsiloxano al 35%, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion). A lo largo de la producción, se ajustó el pH según necesidad para mantenerlo alrededor de 7,2. Después de 10 días, o hasta que la viabilidad bajo por debajo del 70%, el cultivo celular se recogió mediante centrifugación y filtrado a través de un filtro de 0,22 \mum. El filtrado se almacenó a 4ºC o se cargó inmediatamente en columnas para su purificación.

Para los constructos etiquetados con poli-his, las proteínas se purificaron utilizando una columna Ni-NTA (Quiagen). Antes de la purificación, se añadió imidazol al medio condicionado hasta una concentración de 5 mM. El medio condicionado se bombeó en una columna de Ni-NTA de 6 ml equilibrada en 20 ml de tampón Hepes, pH 7,4, que contenía NaCl 0,3 M y imidazol 5 mM a una velocidad de flujo de 4-5 ml/min a 4ºC. Después de la carga, la columna se lavó con un tampón de equilibración adicional y se eluyó la proteína con tampón de equilibración que contenía imidazol 0,25 M. A continuación, la proteína altamente purificada se desaló en un tampón de almacenamiento que contenía Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y un 4% de manitol, pH 6,8, con una columna de 25 ml G25 Superfine (Pharmacia) y se almacenó a -80ºC.

Los constructos de inmunoadhesina (que contienen Fc) se purificaron a partir del medio condicionado como se indica a continuación. El medio condicionado se bombeó en una columna de 5 ml Protein A (Pharmacia) que se había equilibrado en un tampón de fosfato sódico 20 mM, pH 6,8. Después de la carga, la columna se lavó extensivamente con un tampón de equilibración antes de la elución con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluída se neutralizó inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contenían 275 \mul de tampón Tris 1 M, pH 9. A continuación, la proteína altamente purificada se desaló en tampón de almacenamiento tal como se ha descrito más arriba para el caso de las proteínas etiquetadas con poli-his. La homogeneidad se determinó a través de geles de poliacrilamida SDS y mediante secuenciado a partir del aminoácido N-terminal mediante degradación de Edman.

PRO287 se expresó también con éxito de forma transiente en células COS.

Ejemplo 6 Expresión de polipéptidos PRO en levaduras

El siguiente procedimiento describe la expresión recombinante de un polipéptido PRO deseado en levaduras.

En primer lugar, los vectores de expresión en levaduras se construyen para la producción intracelular o secreción de polipéptidos PRO a partir del promotor ADH2/GAPDH. Se inserta el ADN que codifica un polipéptido PRO deseado, un péptido señal seleccionado y el promotor en dianas de restricción enzimática adecuadas en el plásmido seleccionado, para dirigir la expresión intracelular del polipéptido PRO. Para la secreción, puede clonarse el ADN que codifica el polipéptido PRO en el plásmido seleccionado, junto a ADN que codifica el promotor ADH2/GAPDH, la secuencia señal de secreción del factor alfa de la levadura/secuencia líder, y secuencias conectoras (en caso necesario) para la expresión del polipéptido PRO.

Las células de levadura, por ejemplo la cepa de levadura AB110, pueden transformarse entonces en los plásmidos de expresión descritos más arriba y cultivarse en medios de fermentación seleccionados. Los sobrenadantes de la levadura transformada pueden analizarse por precipitación con un 10% de ácido tricloroacético y separación mediante SDS-PAGE, seguido de tinción de los geles con tintura Coomassie Blue.

El polipéptido PRO recombinante puede aislarse a continuación y purificarse separando las células de levadura del medio de fermentación mediante centrifugación y entonces concentrando el medio utilizando filtros de cartucho seleccionados. La solución concentrada que contiene el polipéptido PRO puede continuar purificándose utilizando resinas de cromatografía en columna seleccionadas.

Ejemplo 7 Expresión de polipéptidos PRO en células de insecto infectadas con baculovirus

El siguiente procedimiento describe la expresión recombinante de polipéptidos PRO en células de insecto infectadas con Baculovirus.

El polipéptido PRO deseado se fusiona secuencia arriba de un identificador de epítopo contenido en un vector de expresión de baculovirus. Dichos identificadores de epítopo incluyen identificadores de poli-his e identificadores de inmunoglobulina (tipo las regiones Fc de la IgG). Puede utilizarse un gran número de plásmidos, incluyendo los plásmidos derivados de plásmidos comerciales, como por ejemplo pVL1393 (Novagen). Brevemente, el polipéptido PRO o la porción deseada del polipéptido PRO (por ejemplo la secuencia que codifica el dominio extracelular de una proteína transmembrana) se amplifica mediante PCR con cebadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar dianas de restricción enzimática (seleccionadas) flanqueantes. El producto se digiere entonces con las enzimas de restricción seleccionadas y se subclona en el vector de expresión.

El baculovirus recombinante se genera cotransfectando el plásmido mencionado más arriba y ADN del virus BaculoGold^{TM} (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina (disponible comercialmente en GIBO-BRL). Después de 4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se recogen y se utilizan para posteriores amplificaciones. La infección vírica y la expresión de proteínas se lleva a cabo tal como ha descrito O'Reilley et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (Vectores de Expresión de Baculovirus: un Manual de Laboratory), Oxford: Oxford University Press (1994).

Los polipéptidos PRO etiquetados con poli-his expresados pueden purificarse entonces, por ejemplo mediante cromatografía de afinidad quelante de Ni^{2+}, como se indica a continuación. Se preparan extractos a partir de células Sf9 infectadas con virus recombinante, tal y como han descrito Rupert et al., Nature, 362: 175-179 (1993). Brevemente, se lavan las células Sf9, se resuspenden en tampón de sonicación (25 ml Hepes, pH 7,9; MgCl_{2} 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; 10% de glicerol, pH 7,8) y se filtran a través de un filtro de 0,45 \mum. Se prepara una columna de azarosa Ni^{2+}-NTA (disponible comercialmente en Quiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con 25 ml de agua y se equilibra con 25 ml de tampón de carga. El extracto celular filtrado se carga en la columna a 0,5 ml por minuto. La columna se lava hasta la línea base a A_{280} con tampón de carga, momento en el cual se empiezan a recoger fracciones. A continuación, la columna se lava con un tampón de lavado secundario (fosfato 50 mM; NaCl 300 mM; 10% de glicerol, pH 6,0), con lo cual se eluye la proteína unida de forma no específica. Después de alcanzar de nuevo la línea base a A_{280}, se desarrolla la columna con un gradiente de imidazol de 0 mM a 500 mM en el tampón de lavado secundario. Se recogen fracciones de 1 ml y se analizan mediante SDS-PAGE y tinción de plata o análisis Western con Ni^{2+}-NTA conjugado con la fosfatasa alcalina (Quiagen). Las fracciones que contienen el polipéptido PRO etiquetado con His_{10} se juntan y se dializan contra tampón de carga.

Alternativamente, puede llevarse a cabo la purificación del polipéptido PRO etiquetado con IgG (o etiquetado con Fc) utilizando técnicas de cromatografía habituales, incluyendo, por ejemplo cromatografía de columna de proteína A o proteína G.

Se expresó con éxito PRO287 en células de insecto Sf9 ó high5 infectadas con baculovirus. Aunque la expresión se llevó a cabo en realidad en una escala de 0,5 l - 2 l, se puede escalar fácilmente para preparaciones mayores (por ejemplo 8 l). las proteínas se expresaron como un constructo IgG (inmunoadhesina), en la cual la región extracelular de la proteína estaba fusionada a una secuencia de región constante de una IgG1 que contenía la región de la bisagra, los dominios CH2 y CH3 y/o formas etiquetadas con poli-His.

Después de la amplificación por PCR, cada una de las secuencias codificantes se subclonó en un vector de expresión de baculovirus (pb.PH.IgG para las fusiones con IgG y pb.PH.His.c para las proteínas etiquetadas con poli-His) y el vector y el ADN de baculovirus Baculogold® (Pharmingen) se cotransfectaron en 105 células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando Lipofectina (Gibco BRL). pb.PH.IgG y pb.PH.His.c son modificaciones del vector de expresión de baculovirus comercial pVL1393 (Pharmingen), con regiones policonectoras modificadas de manera que incluyan las secuencias de identificación His o Fc. Las células se hicieron crecer en medio TNM-FH de Hink suplementado con un 10% de FBS (Hyclone). Las células se incubaron durante 5 días a 28ºC. El sobrenadante se recogió y se utilizó a continuación para la primera amplificación vírica infectando las células Sf9 en medio TNM-FH de Hink suplementado con un 10% de FBS a una multiplicidad de infección (MOI) aproximada de 10. Las células se incubaron durante 3 días a 28ºC. El sobrenadante se recogió y se determinó la expresión de los constructos en el vector de expresión de baculovirus mediante unión discontínua de 1 ml de sobrenadante a 25 ml de tamices Ni-NTA (QUIAGEN) para proteínas etiquetadas con histidina o con tamices Proteína A Sefarosa CL-4B (Pharmacia) para proteínas etiquetadas con IgG, seguido de análisis SDS-PAGE y comparación con una concentración conocida de proteína estándar mediante tinción con azul de Coomassie.

El sobrenadante de la primera amplificación vírica se utilizó para infectar un cultivo centrifugador (500 ml) de células Sf9 crecidas en medio eSF-921 (Expresión Systems LLC) a una MOI aproximada de 0,1. Las células se incubaron durante 3 días a 28ºC. El sobrenadante se recogió y filtró. Se repitió la unión discontínua y el análisis SDS-PAGE, según fue necesario para que la expresión del cultivo centrifugador se confirmara.

El medio condicionado obtenido a partir de las células transfectadas (0,5 l a 3 l) se recogió mediante centrifugación para eliminar las células y se filtró a través de filtros de 0,22 micrones. En el caso de los constructor etiquetados con poli-His, el constructor de proteína se purificó utilizando una columna Ni-NTA (Quiagen). Antes de la purificación, se añadió imidazol al medio condicionado hasta una concentración de 5 mM. El medio condicionado se bombeó en una columna de Ni-NTA de 6 ml equilibrada en tampón Hepes 20 mM, pH 7,4, que contenía NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM a una velocidad de flujo de 4-5 ml/min a 4ºC. Después de cargar la columna, ésta se lavó con tampón de equilibrado adicional y la proteína se eluyó con tampón de equilibrado que contenía imidazol 0,25 mM. La proteína altamente purificada se desaló a continuación en un tampón de almacenamiento que contenía Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y un 4% de manitol, pH 6,8 a través de una columna G25 Superfine (Pharmacia) de 25 ml y se almacenó a -80ºC.

Los constructos proteicos de inmunoadhesina (que contienen Fc) se purificaron a partir del medio condicionado como se indica a continuación. El medio condicionado se bombeó en una columna Proteína A (Pharmacia) de 5 ml que se había equilibrado en tampón de fosfato sódico, pH 6,8. Después de cargar la columna, ésta se lavó extensivamente con tampón de equilibrado antes de la elusión con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluida se neutralizó inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contenían 275 ml de tampón Tris 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada se desaló a continuación en tampón de almacenamiento tal y como se ha descrito más arriba en el caso de las proteínas etiquetadas con poli-His. La homogeneidad de las proteínas se verificó mediante electroforesis en gel de SDS poliacrilamida (PEG) y secuenciación a partir del aminoácido N terminal mediante degradación de Edman.

Ejemplo 8 Preparación de anticuerpos que se unen a los polipéptidos PRO

El presente ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que pueden unirse específicamente a un polipéptido PRO.

Diferentes técnicas para la preparación de anticuerpos monoclonales son conocidas y se han descrito en el estado de la técnica, por ejemplo en Goding, supra. Los inmunógenos que pueden utilizarse incluyen un polipéptido PRO purificado, proteínas de fusión que contengan el polipéptido PRO y células que expresen el polipéptido PRO recombinante sobre la superficie celular. Un experto medio en la técnica podrá llevar a cabo la selección del inmunógeno sin experimentación indebida.

Se inmunizan ratones, por ejemplo Balb/c con el inmunógeno de polipéptido PRO emulsificado en coadyuvante de Freund completo mediante inyección subcutánea o intraperitoneal en una cantidad de 1-100 microgramos. Alternativamente, el inmunógeno se emulsifica en coadyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyecta en la zona terminal de las patas traseras del animal. Los ratones inmunizados se estimulan de 10 a 13 días más tarde con inmunógeno adicional emulsificado en el coadyuvante seleccionado. Después, durante varias semanas, los ratones pueden estimularse también con inyecciones de inmunización adicionales. Pueden obtenerse periódicamente muestras del suero a partir de los ratones mediante sangrado retro-orbital para su análisis en ensayos ELISA para detectar anticuerpos anti-polipéptido PRO.

Después de detectar un anticuerpo de titulación adecuado, se puede inyectar en los animales "positivos" para los anticuerpos una inyección intravenosa final de polipéptido PRO. De tres a cuatro días más tarde, los ratones se sacrifican y las células del bazo se recogen. Las células del bazo se fusionan entonces (utilizando un 35% de polietilenglicol) con una linea celular de mieloma murino, por ejemplo P3X63AgU.1, disponible en ATCC, Núm. CRL 1597. las fusiones generan células de hibridoma que pueden colocarse en placas de cultivo de tejido de 96 pozos, las cuales contienen medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidita) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, de híbridos de mieloma y de híbridos de células del bazo.

Puede ensayarse la reactividad contra el polipéptido PRO de las células de hibridoma mediante un ensayo ELISA. La determinación de las células de hibridoma "positivas" que secretan los anticuerpos monoclonales deseados contra el polipéptido PRO se encuentra dentro del estado de la técnica.

Las células de hibridoma positivas pueden inyectarse intraperitonealmente en ratones singénicos Balb/c para producir ascitis que contengan los anticuerpos monoclonales anti-polipéptido PRO. Alternativamente, las células de hibridoma pueden hacerse crecer en frascos de cultivo de tejido o en frascos rotativos. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en las ascitis puede llevarse a cabo utilizando precipitación en sulfato amónico, seguido de cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, puede utilizarse cromatografía de afinidad basada en la unión del anticuerpo a la proteína A o a la proteína G.

Ejemplo 9 Polipéptidos PRO quiméricos

Los polipéptidos PRO pueden expresarse como proteínas quiméricas con uno o más dominios de polipéptido adicionales añadidos para facilitar la purificación de la proteína. Dichos dominios facilitadores de la purificación incluyen, pero no se limitan a, péptidos quelantes de metales como por ejemplo módulos histidina-triptófano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación sobre una inmunoglobulina inmovilizada y el dominio utilizado en el sistema de extensión/purificación de afinidad FLAGSTM (Immunex Corp., Seattle Wash.). La inclusión de una secuencia conectora separable, como por ejemplo el Factor XA o la enteroquinasa (Invitrogen, San Diego California) entre el dominio de purificación y la secuencia del polipéptido PRO puede ser útil para facilitar la expresión del ADN que codifica el polipéptido PRO.

Ejemplo 10 Purificación de los polipéptidos PRO utilizando anticuerpos específicos

Los polipéptidos PRO nativos o recombinantes pueden purificarse mediante diversas técnicas estándar en el estado de la técnica en el marco de la purificación de proteínas. Por ejemplo, un polipéptido pro-PRO, un polipéptido PRO maduro o un polipéptido pre-PRO se purifica mediante cromatografía de afinidad utilizando anticuerpos específicos para el polipéptido PRO de interés. En general, se construye una columna de inmunoafinidad acoplando covalentemente el anticuerpo anti-polipéptido PRO con una resina cromatográfica activada.

Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a partir de suero inmune por precipitación con sulfato amónico o por purificación sobre Proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.). De forma similar, los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de fluido ascítico de ratón por precipitación con sulfato amónico o por purificación sobre Proteína A inmovilizada. La inmunoglobulina parcialmente purificada se une covalentemente a una resina cromatográfica como por ejemplo Sefarosa (Sepharose^{TM}) (Pharmacia LKB Biotechnology) activada con CnBr. El anticuerpo se acopla a la resina, la resina se bloquea y la resina derivada se lava según las instrucciones del fabricante.

Dicha columna de afinidad se utiliza en la purificación de un polipéptido PRO preparando una fracción a partir de las células que contienen el polipéptido PRO en forma soluble. Dicha preparación se deriva solubilizando la célula completa o una fracción subcelular obtenida vía centrifugación diferencial mediante la adición de detergente o mediante otros procedimientos bien conocidos en el estado de la técnica. Alternativamente, un polipéptido PRO soluble que contenga una secuencia señal puede secretarse en cantidad útil en el medio en el cual crecen las células.

Una preparación que contiene un polipéptido PRO soluble se pasa a través de la columna de afinidad y la columna se lava en condiciones que permiten la absorbancia preferencial del polipéptido PRO (por ejemplo tampones de elevada fuerza iónica en presencia de detergente). Entonces se eluye la columna en condiciones que rompen la unión anticuerpo/polipéptido PRO (por ejemplo un tampón de pH bajo, por ejemplo aproximadamente pH 2-3 o una elevada concentración de un Chaotrope, por ejemplo urea o ión tiocianato) y se recoge el polipéptido PRO.

Ejemplo 11 Exploración de fármacos

La invención es particularmente útil para la exploración de compuestos utilizando polipéptidos PRO o fragmentos de unión de los mismos según cualquier técnica de exploración de fármacos, seleccionada entre un gran número de técnicas. El polipéptido PRO o fragmento del mismo que se utiliza en un ensayo de este tipo puede estar libre en solución, fijado en un soporte sólido, expuesto sobre una superficie celular o localizado intracelularmente. Un procedimiento de exploración de fármacos utiliza células huésped eucariotas o procariotas que se transforman de forma estable con ácidos nucleicos recombinantes que expresan el polipéptido PRO o un fragmento del mismo. Se exploran los fármacos en relación a dichas células transformadas en ensayos de unión competitiva. Dichas células, en forma viable o fijada, pueden utilizarse para ensayos de unión estándar. Se puede medir, por ejemplo, la formación de complejos entre el polipéptido PRO o un fragmento del mismo y el agente que se está ensayando. Alternativamente, se puede examinar la disminución de formación de complejo entre el polipéptido PRO y su célula diana o receptores diana como provocada por el agente que se está ensayando.

Así pues, la presente invención proporciona procedimientos de exploración de fármacos u otros agentes que pueden afectar una enfermedad o estado grave asociado a un polipéptido PRO. Dichos procedimientos comprenden poner en contacto dicho agente con un polipéptido PRO o fragmento del mismo y ensayar (I) la presencia de un complejo entre el polipéptido PRO o fragmento del mismo y la célula, mediante procedimientos bien conocidos en el estado de la técnica. En dichos ensayos de unión competitiva, el polipéptido PRO o fragmento del mismo se marca típicamente. Después de una incubación adecuada, el polipéptido PRO o fragmento del mismo libre se separa del presente en forma unida, y la cantidad de marca libre o no complejada da la medida de la capacidad del agente particular de unirse al polipéptido PRO o de interferir con el complejo polipéptido PRO/célula.

Otra técnica de exploración de fármacos proporciona una exploración de alto rendimiento para compuestos que tienen una afinidad de unión adecuada a un polipéptido y se describe con detalle en la solicitud de patente WO 84/03564, publicada el 13 de septiembre de 1984. Brevemente, grandes cantidades de diferentes compuestos a ensayar basados en diferentes péptidos pequeños se sintetizan sobre un substrato sólido, por ejemplo agujas de plástico o cualquier otra superficie. Al exponerse al polipéptido PRO, los compuestos peptídicos a ensayar reaccionan con el polipéptido PRO y se lavan. El polipéptido PRO unido se detecta mediante procedimientos bien conocidos en el estado de la técnica. También pueden recubrirse directamente placas con el polipéptido PRO purificado y utilizarlas en las técnicas de exploración de fármacos mencionadas más arriba. Además, los anticuerpos no neutralizadores pueden utilizarse para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre el soporte sólido.

La presente invención también contempla la utilización de ensayos de exploración de fármacos competitivos en los cuales anticuerpos neutralizadores capaces de unirse específicamente al polipéptido PRO compiten con un compuesto de ensayo en cuanto a la unión de un polipéptido PRO o fragmentos del mismo. De esta manera, pueden utilizarse anticuerpos para detectar la presencia de cualquier péptido que comparte uno o más determinantes antigénicos con el polipéptido PRO.

Ejemplo 12 Diseño racional de fármacos

El objetivo del diseño racional de fármacos es producir análogos estructurales del polipéptido activo biológicamente de interés (es decir, un polipéptido PRO) o de pequeñas moléculas con las cuales interaccionan, por ejemplo agonistas, antagonistas o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos puede utilizarse para obtener fármacos que son formas más activas o más estables del polipéptido PRO o que potencian o interfieren con la función del polipéptido PRO in vivo (véase Hodgson, Bio/technology, 9: 19-21 (1991)).

En una aproximación, la estructura tridimensional del polipéptido PRO o de un complejo polipéptido PRO - inhibidor, se determina mediante cristalografía de rayos X, mediante modelado computacional o, más típicamente, mediante una combinación de las dos aproximaciones. Debe determinarse tanto la forma como las cargas del polipéptido PRO para elucidar la estructura y para determinar el centro(s) activo de la molécula. Menos habitualmente, puede obtenerse información útil sobre la estructura del polipéptido PRO mediante modelado basado en la estructura de proteínas homólogas. En ambos casos, se utiliza información estructural relevante para diseñar moléculas análogas al polipéptido PRO o para identificar inhibidores eficientes. Algunos ejemplos útiles sobre el diseño racional de fármacos pueden incluir moléculas que tienen una actividad o estabilidad mejorada, tal y como han mostrado Braxton y Wells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992) o que actúan como inhibidores, agonistas o antagonistas de péptidos nativos, tal y como han mostrado Athauda et al., J. Biochem., 113: 742-746 (1993).

También es posible aislar un anticuerpo específico de diana, seleccionado mediante un ensayo funcional, tal y como se ha descrito más arriba y entonces resolver su estructura cristalina. Esta aproximación, rinde en principio una estructura central de fármaco en la cual puede basarse el diseño de fármacos subsiguiente. Es posible evitar la cristalografía de proteínas en general generando anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ids) contra un anticuerpo funcional farmacéuticamente activo. Como una imagen especular de una imagen especular, el sitio de unión del anti-ids se espera que sea análogo al del receptor original. El anti-id puede utilizarse entonces para identificar y aislar péptidos a partir de bancos de péptidos producidos químicamente o biológicamente. Los péptidos aislados actuarían entonces como la estructura central de fármaco.

En virtud de la presente invención, pueden obtenerse cantidades suficientes del polipéptido PRO para llevar a cabo dichos estudios analíticos, como por ejemplo cristalografía de rayos X. Además, el conocimiento de la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO proporcionada en la presente invención proporcionaría una guía para las personas que utilicen técnicas de modelado computacional en vez o además de la cristalografía de rayos X.

Ejemplo 13 Inhibición de célula PDB12

Este ejemplo demuestra que diversos polipéptidos PRO son eficientes en la inhibición de producción de proteínas a cargo de las células del ducto pancreático PBD12.

Las células del ducto pancreático PBD12 se colocan en placas de 96 pozos recubiertas con fibronectina a 1,5 x 103 células por pozo, en 100 \mul/189 \mul de medio de crecimiento. Entonces se añaden a cada pozo 100 \mul de medio de crecimiento con la muestra de polipéptido PRO a ensayar o con el control negativo sin polipéptido PRO, hasta un volumen final de 200 \mul. Los controles contienen medio de crecimiento que contiene una proteína que ha mostrado ser inactiva en dicho ensayo. Las células se incuban durante 4 días a 37ºC. Se añade entonces a cada pozo 20 \mul de agente de tinción Azul de Alamar (AB) y se mide la fluorescencia 4 horas después de la adición de AB, sobre un lector de placa de microvaloración a una longitud de onda de excitación de 530 nm y a una longitud de onda de emisión de 590 nm. Se emplea como estándar células sin Extracto Pituitario Bovino (BPE) y con diversas concentraciones de BPE. Se analizan dos muestras control de tampón o CM a partir de muestras desconocidas sobre cada placa de 96 pozos.

Los resultados de estos ensayos se muestran en la Tabla 6 más abajo, calculándose el porcentaje de disminución de producción de proteínas comparando la concentración de proteína, calculada con el agente de tinción Azul de Alamar, producida por las células tratadas con polipéptido PRO, con la concentración de proteína, calculada con el agente de tinción Azul de Alamar, producida por las células control negativas. Se considera positivo un porcentaje de disminución en la producción de proteína mayor que o igual al 25%, en comparación con las células control negativas.

TABLA 6

Nombre PRO	Concentración PRO	Porcentaje de disminución en la producción de proteína
PRO287	2,0%	22,3%
PRO287	10%	18,2%
PRO287	50%	67,5%
PRO287	2,0%	45,53%
PRO287	10%	57,3%
PRO287	50%	52,24%

Ejemplo 14 Estimulación de hipertrofia de corazón en adultos

Este ensayo se designa para medir la capacidad de diversos polipéptidos PRO de estimular la hipertrofia de corazón en adultos.

Se colocan Miocitos ventriculares recién aislados de ratas Sprague Dawley adultas (250 g) en placas a 2000 células/pozo en 180 \mul de volumen. Las células se aíslan y se colocan en placas en el día 1, se añaden las muestras a analizar que contienen polipéptido PRO o medio de cultivo sólo (control negativo) (20 \mul de volumen) en el día 2 y las células se fijan y se tiñen en el día 5. Después de la tinción, se visualiza el tamaño celular, concediendo un valor de 0,0 a las células que no muestran un aumento en el crecimiento en comparación con las células control, concediendo un valor de 1,0 a las células que muestran de un pequeño aumento a un aumento moderado en el crecimiento en comparación con las células control y concediendo un valor de 2,0 a las células que muestran un gran aumento en el crecimiento en comparación con las células control. Cualquier nivel de aumento de crecimiento en comparación con las células control negativas se considera positivo para el ensayo. Los resultados se muestran en la Tabla 7 más abajo.

TABLA 7

Nombre PRO	Concentración PRO	Valor de aumento del crecimiento
PRO287	20%	1,0
PRO287	20%	1,0

Ejemplo 15 Hibridación in situ

La hibridación in situ es una técnica poderosa y versátil para la detección y localización de secuencias de ácidos nucleicos en preparaciones celulares o de tejido. Puede ser útil, por ejemplo, identificar sitios de expresión génica, analizar la distribución o transcripción en tejido, identificar y localizar infección vírica, seguir los cambios en la síntesis de ARNm específico y obtener ayuda en el mapeo cromosómico.

En la solicitud de patente EP 1027434 A (98946090.2) se llevó a cabo una hibridación in situ siguiendo una versión optimizada del protocolo de Lu y Gillett, Cell Vision 1: 169-176 (1994), utilizando ribosondas marcadas ^{33}P generadas por PCR. En resumen, se seccionaron tejidos humanos fijados con formalina y embebidos en parafina, se desparafinizaron, se desproteinaron en proteinasa K (20 g/ ml) durante 15 minutos a 37ºC y se continuaron procesando para hibridación in situ, tal y como han descrito Lu y Gillett, supra. Se generó una ribosonda antisentido marcada [^{33}P] UTP a partir de un producto de PCR y se hibridó a 55ºC durante una noche. Los cortes se sumergieron en emulsión nuclear Kodak NTB2 y se expusieron durante 4 semanas.

Síntesis de la ribosonda ^{33}P

6,0 \mul (125 mCi) de ^{33}P-UTP (Amersham BF 1002, SA < 2000 Ci/mmol) se sometieron a secado rápido al vacío. A cada tubo que contenía ^{33}P-UTP seco se añadieron los siguientes ingredientes:

2,0 \mul de tampón de transcripción x 5

1,0 \mul de DTT (100 mM)

2,0 \mul de mezcla NTP (2,5 mM; 10 \mul de cada uno de los siguientes componentes GTP 10 mM, CTP & ATP + 10 \mul de H_{2}O)

1,0 \mul de UTP (50 \muM)

1,0 \mul Rnasin

1,0 \mul de de ADN plantilla (1 \mug)

1,0 \mul H_{2}O

1,0 \mul de ARN polimerasa (para productos de PCR T3 = AS, T7 = S, habitualmente)

Los tubos se incubaron a 37ºC durante una hora. Se añadieron 1,0 \mul de ADNasa RQ1, seguido de una incubación a 37ºC durante 15 minutos. Se añadieron 90 \mul de TE (Tris 10 \muM, pH 7,6/EDTA 1 mM, pH 8,0) y entonces se pipeteó la muestra sobre papel DE81. La solución restante se cargó en una unidad de ultrafiltración Microcon-50 y se centrifugó utilizando el programa 10 (6 minutos). La unidad de filtración se invirtió sobre un segundo tubo y se centrifugó utilizando el programa 2 (3 minutos). Después de la centrifugación de recuperación final, se añadieron 100 \mul de TE. Se pipeteó 1 \mul del producto final sobre papel DE81 y se contó en 6 ml de Biofluor II.

La muestra se analizó en un gel de electroforesis TBE/urea. Se añadió 1-3 \mul de la muestra o 5 \mul de ARN Mrk III a 3 \mul de tampón de carga. Después de calentar en un block de calor a 95ºC durante 3 minutos, el gel se colocó inmediatamente sobre hielo. Los pozos del gel se nivelaron, se cargó la muestra y se llevó a cabo la electroforesis a 180-250 voltios durante 45 minutos. El gel se envolvió en envoltorio saran se expuso a un film XAR con una pantalla intensificadora en un congelador a -70ºC durante una noche.

Hibridación ^{33}P A. Pretratamiento de las secciones congeladas

Se extrajeron del congelador las láminas, se colocaron en bandejas de aluminio y se descongelaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Las bandejas se colocaron en un incubador a 55ºC durante cinco minutos para reducir la condensación. Se fijaron las láminas durante 10 minutos en paraformaldehido al 4% sobre hielo en la campana y se lavó en 0,5 x SSC durante 5 minutos a temperatura ambiente (25 ml 20 x SSC + 975 ml H_{2}O SQ). Después de la desproteinización en 0,5 mg/ml de proteinasa K durante 10 minutos a 37ºC (12,5 \mul de stock 10 mg/ml en 250 ml de tampón ARNasa libre de ARNasa precalentado) las secciones se lavaron en 0,5 x SSC durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se deshidrataron en etanol al 70%, en etanol al 95% y en etanol al 100% durante 2 minutos en cada caso.

B. Pretratamiento de las secciones embebidas en parafina

Las láminas de desparafinizaron, se colocaron en H_{2}O SQ y se aclararon dos veces con 2 x SSC a temperatura ambiente, durante 5 minutos cada vez. Las secciones se desproteinizaron en 20 \mug/ml de proteinasa K (500 \mul de 10 mg/ml en 250 ml de tampón ARNasa libre de ARNasa; 37ºC, 15 minutos) -embrión humano o en 8 x proteinasa (100 \mul en 250 ml de tampón ARNasa; 37ºC, 30 minutos)- tejidos de formalina. Se llevó a continuación un aclarado en 0,5 x SSC y una deshidratación, tal y como se ha descrito más arriba.

C. Prehibridación

Las láminas se extendieron en una caja de plástico alineada con un papel de filtro saturado en tampón Box (4 x SSC, 50% formamida). El tejido se cubrió con 50 \mul de tampón de hibridación (3,75 g Dextran Sulfato + 6 ml de H_{2}O SQ), se mezcló mediante vórtex y se calentó en el microondas durante 2 minutos con el tapón suelto. Después de enfriar sobre hielo, se añadieron 18,75 ml de formamida, 3, 75 ml de 20 x SSC y 9 ml de H_{2}O SQ, el tejido se mezcló bien mediante vórtex y se incubó a 42ºC durante 1-4 horas.

D. Hibridación

1,0 x 10^{6} cpm de muestra y 1,0 \mul de ARNt (50 mg/ml stock) por lámina se calentaron a 95ºC durante 3 minutos. Las láminas se enfriaron sobre hielo y se añadieron 48 \mul de tampón de hibridación por lámina. Después de mezclar mediante vórtex, se añadieron 50 \mul de mezcla ^{33}P a 50 \mul de prehibridación sobre la lámina. Las láminas se incubaron durante una noche a 55ºC.

E. Lavados

Se llevó a cabo un lavado 2 x 10 minutos con 2 x SSC, EDTA a temperatura ambiente (400 ml 20 x SSC + 16 ml de EDTA 0,25 M, Vf = 4 l), seguido de tratamiento con ARNasa A a 37ºC durante 30 minutos (500 \mul de 10 mg/ml en 250 ml de tampón ARNasa = 20 \mug/ml). Las láminas se lavaron 2 x 10 minutos con 2 x SSC, EDTA a temperatura ambiente. Las condiciones de lavado restrictivas fueron las siguientes: 2 hora a 55ºC, 0,1 x SSC, EDTA (20 ml 20 x SSC + 16 ml EDAT, Vf = 4 l).

Depósito de material

Los siguientes materiales se han depositado en la American Type Culture Collection (Colección de Cultivos Tipo Americana), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC):

Material	Núm. Depósito ATCC	Fecha de Depósito
ADN39969-1185	ATCC 209400	17 de octubre 1997

Dicho depósito se realizó bajo las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en materia de Patentes y las Regulaciones bajo el mismo (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años a partir de la fecha de depósito. Los depósitos se harán accesibles desde ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest y estarán sujetos a un acuerdo entre Genentech, Inc y ATCC, lo cual asegura la disponibilidad permanente y no restringida al público de la progenie del cultivo del depósito tras la expedición de la patente EEU pertinente o al quedar abierta al público cualquier solicitud de patente EEUU o extranjera, y asegura la disponibilidad de la progenie a una persona a quien el Comisionado EEUU en materia de Patentes y Marcas le ha concedido el derecho para ello, según la ley 35 USC \NAK 122 y el reglamento del Comisionado en relación a dicha ley (incluyendo la ley 37 USC \NAK 1.14 con referencia particular a 886 OG 638).

El de la presente solicitud ha convenido que se un cultivo de los materiales en depósito muriera o se perdiera o se destruyera al cultivarlo en condiciones adecuadas, los materiales se substituirían sin demora, bajo notificación, por otro cultivo de los mismos. La disponibilidad del material depositado no debe interpretarse como una licencia para poner en práctica la invención en contradicción con los derechos otorgados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes.

La presente descripción se considera suficiente para permitir a un experto medio en la técnica poner en práctica la invención. La presente invención no se limita en alcance al constructo depositado, dado que la realización depositada pretende ser una simple ilustración de ciertos aspectos de la invención. El depósito de material en el marco de la presente invención no constituye una admisión de que la descripción contenida sea inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo la mejor manera de ponerla en práctica, ni debe interpretarse como una limitación del alcance de las reivindicaciones a la ilustración específica que representa. De hecho, diversas modificaciones, además de aquellas mostradas y descritas en la presente invención, resultarán evidentes para un experto medio en la técnica a partir de la presente descripción, cuyas modificaciones entran dentro del alcance de las reivindicaciones dependientes.

<110> Genentech, Inc.

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<120> Polipéptidos de secreción y transmembrana y ácidos nucleicos que los codifican

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<130> CMD/FP5963012

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<140> EP 01127791.0

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<141> 2001-11-22

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<150> EP 98946090.2

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<151> 1998-09-16

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<150> PCT/US98/19330

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<151> 1998-09-16

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<150> US 60/063.128

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<151> 1997-10-24

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<160> 5

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<170> Patente Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 2026

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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1

2

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<210> 2

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<211> 415

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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3

4

5

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<210> 3

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<211> 22

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: sintética

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccgattcata gacctcgaga gt

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 22

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: sintética

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

gtcaaggagt cctccacaat ac

\hfill

22

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<210> 5

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<211> 45

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: sintética

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

gtgtacaatg gccatgccaa tggccagcgc attggccgct tctgt

\hfill

45

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Claims (25)

1. Ácido nucleico aislado que comprende ADN que codifica o que es complementario al ADN que codifica:

(a) un polipéptido que posee los aminoácidos 1 a 415 de la figura 2 (SEQ ID NO:2); o

(b) un polipéptido que es una variante de (a) que posee como mínimo un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 (SEQ ID NO:2), determinándose dicha identidad de secuencia a lo largo de la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de la figura 2 (SEQ ID NO:2) y teniendo dicha variante de polipéptido la capacidad de inhibir la producción de proteína en células del conducto pancreático PDB12.

2. Ácido nucleico según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que el nivel de identidad es de como mínimo el 90%.

3. Ácido nucleico según la reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que el nivel de identidad es de como mínimo el 95%.

4. Ácido nucleico según la reivindicación 1, sección (a).

5. Ácido nucleico según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que dicha secuencia de nucleótidos comprende la secuencia codificante de longitud completa de la secuencia que se muestra en la figura 1 (SEQ ID NO:1) o la secuencia complementaria a la misma.

6. Ácido nucleico según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que dicha secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la figura 1 (SEQ ID NO:1) o la complementaria a la misma.

7. Ácido nucleico aislado que comprende la secuencia codificante de longitud completa del inserto de ácido nucleico (ADN 39969-1185) contenida en el número de acceso ATCC 209400.

8. Vector que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

9. Vector según la reivindicación 8 unido operativamente a secuencias control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector.

10. Célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 8 o la reivindicación 9.

11. Célula huésped según la reivindicación 10, caracterizada por el hecho de que dicha célula es una célula CHO.

12. Célula huésped según la reivindicación 10, caracterizada por el hecho de que dicha célula es E. coli.

13. Célula huésped según la reivindicación 10, caracterizada por el hecho de que dicha célula es una célula de levadura.

14. Procedimiento para la preparación de un polipéptido que comprende cultivar la célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 10-13 en condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido y recuperar dicho polipéptido a partir del cultivo celular.

15. Polipéptido aislado que:

(a) es una secuencia nativa aislada del polipéptido PRO287 que incluye los aminoácidos 1 a 415 de la figura 2 (SEQ ID NO:2); o

(b) es una variante de (a) que posee como mínimo un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 (SEQ ID NO:2), determinándose dicha identidad de secuencia a lo largo de la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de la figura 2 (SEQ ID NO:2) y teniendo dicha variante de polipéptido la capacidad de inhibir la producción de proteína en células el conducto pancreático PDB12.

16. Polipéptido según la reivindicación 15, sección (a).

17. Polipéptido aislado que posee como mínimo un 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia codificante de longitud completa del inserto de ácido nucleico (ADN 39969-1185) contenida en el número de acceso ATCC 209400.

18. Polipéptido aislado según la reivindicación 17 que consiste en la secuencia codificante de longitud completa del inserto de ácido nucleico (ADN 39969-1185) contenida en el número de acceso ATCC 209400.

19. Polipéptido según la reivindicación 15 o la reivindicación 17, caracterizado por el hecho de que el nivel de identidad es de cómo mínimo el 90%.

20. Polipéptido según la reivindicación 15 o la reivindicación 19, caracterizado por el hecho de que el nivel de identidad es de cómo mínimo el 95%.

21. Molécula quimérica que comprende un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 2 fusionado a una secuencia de aminoácidos heteróloga.

22. Molécula quimérica según la reivindicación 21, caracterizada por el hecho de que dicha secuencia de aminoácidos heteróloga es una secuencia identificadora de epítopo.

23. Molécula quimérica según la reivindicación 21, caracterizada por el hecho de que dicha secuencia de aminoácidos heteróloga es una región Fc de una inmunoglobulina.

24. Anticuerpo que se une específicamente al polipéptido PRO según la reivindicación 16 o la reivindicación 18.

25. Anticuerpo según la reivindicación 24, caracterizado por el hecho de que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.