ES2315223T3 - Crecimiento celular. - Google Patents
Crecimiento celular. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2315223T3 ES2315223T3 ES00901189T ES00901189T ES2315223T3 ES 2315223 T3 ES2315223 T3 ES 2315223T3 ES 00901189 T ES00901189 T ES 00901189T ES 00901189 T ES00901189 T ES 00901189T ES 2315223 T3 ES2315223 T3 ES 2315223T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- polysaccharide
- substrate according
- layer
- cell adhesion
- adhesion protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 title claims abstract description 40
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 115
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 115
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 104
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 76
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims abstract description 76
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 claims abstract description 71
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims abstract description 29
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 115
- 239000010410 layer Substances 0.000 claims description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 45
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 43
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 claims description 26
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 claims description 26
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 claims description 25
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims description 25
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 claims description 22
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 claims description 22
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 claims description 17
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 16
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 15
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 claims description 14
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 13
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 13
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical group CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 claims description 12
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 claims description 12
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 238000005507 spraying Methods 0.000 claims description 6
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 5
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 claims description 5
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 claims description 5
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 4
- -1 carboxymethylguar Polymers 0.000 claims description 4
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000000416 hydrocolloid Substances 0.000 claims description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 4
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims description 3
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 claims description 3
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 claims description 3
- AEMOLEFTQBMNLQ-BZINKQHNSA-N D-Guluronic Acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-BZINKQHNSA-N 0.000 claims description 3
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 claims description 3
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 claims description 3
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 3
- AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactopyranuronic acid Natural products OC1OC(C(O)=O)C(O)C(O)C1O AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 claims description 3
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 claims description 3
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 claims description 3
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 235000010492 gellan gum Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000216 gellan gum Substances 0.000 claims description 3
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims description 3
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 3
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 claims description 3
- 229920001285 xanthan gum Polymers 0.000 claims description 3
- 235000010493 xanthan gum Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000230 xanthan gum Substances 0.000 claims description 3
- 229940082509 xanthan gum Drugs 0.000 claims description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 claims description 2
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 claims description 2
- 229940105329 carboxymethylcellulose Drugs 0.000 claims description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 2
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 claims description 2
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 claims description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,5-tetrahydroxypentanal Chemical compound OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 claims 1
- 238000009960 carding Methods 0.000 claims 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 claims 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 claims 1
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 49
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 30
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 13
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 10
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 10
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 9
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- 230000003416 augmentation Effects 0.000 description 3
- 229960005069 calcium Drugs 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 3
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 3
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 3
- 238000007380 fibre production Methods 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 235000010410 calcium alginate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000648 calcium alginate Substances 0.000 description 2
- 229960002681 calcium alginate Drugs 0.000 description 2
- LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L calcium chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Cl-].[Ca+2] LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940052299 calcium chloride dihydrate Drugs 0.000 description 2
- OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L calcium;(2s,3s,4s,5s,6r)-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxy-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxylato-4,5,6-trihydroxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylate Chemical compound [Ca+2].O[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H](C([O-])=O)[C@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O2)C([O-])=O)O)[C@H](C(O)=O)O1 OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 102000034238 globular proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005896 globular proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 2
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 2
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 2
- 239000004014 plasticizer Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 229920000045 Dermatan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 101710145505 Fiber protein Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- XOYXESIZZFUVRD-UVSAJTFZSA-M acemannan Chemical compound CC(=O)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](OC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](OC(C)=O)[C@H](O[C@@H]2[C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@@H]4[C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](O[C@@H]5[C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](O[C@@H]6[C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](O[C@@H]7[C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC)[C@@H](CO)O7)O)[C@@H](CO)O6)O)[C@H](O5)C([O-])=O)O)[C@@H](CO)O4)O)[C@@H](CO)O3)NC(C)=O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](CO)O1 XOYXESIZZFUVRD-UVSAJTFZSA-M 0.000 description 1
- 229960005327 acemannan Drugs 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 1
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000002975 chemoattractant Substances 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 description 1
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L dermatan sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C([O-])=O)O1 AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L 0.000 description 1
- 229940051593 dermatan sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 238000010981 drying operation Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 229940102213 injectable suspension Drugs 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012007 large scale cell culture Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000002052 molecular layer Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920000867 polyelectrolyte Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000029983 protein stabilization Effects 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 229940082569 selenite Drugs 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000004381 surface treatment Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000012876 topography Methods 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000037314 wound repair Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0068—General culture methods using substrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/70—Polysaccharides
- C12N2533/72—Chitin, chitosan
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/70—Polysaccharides
- C12N2533/74—Alginate
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Artificial Filaments (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Sustrato para crecimiento celular que comprende un polisacárido y una proteína de adhesión celular proporcionada en la superficie del sustrato y asociada con el mismo mediante puentes de hidrógeno, fuerzas de van der Waals o atrapamiento físico.
Description
Crecimiento celular.
La presente invención se refiere a sustratos
para su uso en crecimiento celular y a métodos para producir tales
sustratos. La invención se refiere más particularmente a sustratos
que tienen actividad promotora de la adhesión celular que pueden
usarse en diversas aplicaciones de crecimiento celular, por ejemplo
cicatrización de heridas e ingeniería de tejidos. La invención
también se refiere a métodos para preparar tales sustratos y a su
uso en diversas aplicaciones de crecimiento celular.
Todas las células eucariotas, de mamífero,
dependen de un sustrato porque necesitan estar unidas a una
superficie con el fin de poder crecer, secretar o dividirse. El
fenotipo que expresan las células está determinado parcialmente por
su interacción con el sustrato al que están unidas. El sustrato al
que están unidas las células de mamífero es el colágeno. Todos los
tejidos blandos (excluyendo la sangre) y duros del organismo están
compuestos de células unidas a una estructura de colágeno. El
colágeno es una proteína que forma fibras y las fibras forman
matrices; estas matrices pueden formar cualquier configuración desde
al azar hasta alineada.
Las propias fibras de colágeno están compuestas
de fibrillas, de modo que una fibra de colágeno se parece a un cable
de fibrillas alineadas. La química de la fibrilla de colágeno varía
según el tipo de tejido y se ha identificado una gama de
colágenos.
Los sustratos para la aumentación de tejidos o
para actuar como soportes para transferencia de células cultivadas
en el tratamiento de heridas normalmente están basados en colágeno.
En esta situación, el sustrato de colágeno normalmente debe ser
específico para el tipo de crecimiento celular requerido y el
fenotipo y estado (secretor, replicatorio) hechos crecer sobre el
sustrato pueden no resultar los requeridos.
El documento
WO-A-9812228 da a conocer alginatos
modificados que comprenden al menos una cadena de alginato a la que
está unida covalentemente al menos una molécula útil para la
interacción celular, por ejemplo una proteína de adhesión celular.
Los materiales son útiles para proporcionar matrices poliméricas
para aplicaciones de ingeniería de tejidos para sustitución de
tejidos blandos o huesos.
El documento
US-A-5 610 148 (R. Brown) titulado
"Macroscopically Orientated Cell Adhesion Protein" describe la
producción de una fibra compuesta de fibrillas de una proteína de
adhesión celular seleccionada de fibronectina (Fn), vitronectina y
proteína de von Willebrand que se ha desnaturalizado y entonces las
cadenas poliméricas se han alineado mediante cizalladura
unidireccional permitiendo la agregación y precipitación. Estas
fibras son de una construcción peroneal no diferente en algunos
aspectos al colágeno. Las células sembradas sobre las fibras
demuestran un crecimiento celular direccional como resultado de la
orientación longitudinal del sitio de unión de adhesión celular.
Sin embargo, tales estructuras de fibra requieren una alta
concentración de fibronectina o fibrinógeno/fibronectina, son algo
complicadas de producir y son de resistencia relativamente baja.
Es un objeto de la presente invención obviar o
mitigar las desventajas mencionadas anteriormente.
Según la presente invención, se proporciona un
sustrato para crecimiento celular que comprende un polisacárido y
una proteína de adhesión celular proporcionada en la superficie del
sustrato y asociada covalentemente con el mismo mediante puentes de
hidrógeno, fuerzas de van der Waals o atrapamiento físico.
Los sustratos según la invención tienen la
ventaja (con respecto a los sustratos compuestos de fibrillas de
fibronectina u otra proteína de adhesión celular) de tener una
resistencia superior que un sustrato compuesto sustancialmente del
100% de proteína y son también más fáciles de fabricar. Los
sustratos de la invención pueden usarse en una amplia gama de
aplicaciones de crecimiento celular, por ejemplo reparación de
heridas, reparación o aumentación de tejidos o para el crecimiento
de células en cultivo celular habitual in vitro, en cultivo
celular a gran escala, biorreactores o cultivo de órganos.
En los sustratos de la invención, la orientación
de la proteína de adhesión celular no es necesariamente
significativa y se logra el guiado de las células durante el
crecimiento de las mismas mediante la forma física del sustrato. Por
tanto, por ejemplo, en el caso de una fibra (véase más adelante)
puede producirse el crecimiento celular a lo largo y/o alrededor de
la fibra, tal como se determina mediante la presencia de la proteína
de adhesión celular. Sin embargo, no se excluye la posibilidad de
que la proteína de adhesión celular tenga al menos algún grado de
alineamiento.
La proteína de adhesión celular incorpora
preferiblemente el sitio de unión RGD (arginina, glicina, ácido
aspártico). Se prefiere particularmente que la proteína de adhesión
celular sea fibronectina, vitronectina o proteína de von Willebrand
o un fragmento de tales proteínas que incorpora este sitio de unión
RGD.
La proteína de adhesión celular preferida es
fibronectina, que puede usarse en la forma aislada habitualmente del
plasma sanguíneo, por ejemplo mediante crioprecipitación. La
fibronectina puede contener fibrinógeno y albúmina.
El polisacárido y la proteína de adhesión
celular pueden distribuirse uniformemente por todo el sustrato de
modo que la proteína de adhesión celular esté presente en la
superficie como resultado de esta distribución.
El sustrato puede comprender una capa basal de
polisacárido que tiene una capa superficial de una proteína de
adhesión celular.
La capa basal de polisacárido tendrá
preferentemente un espesor de al menos el 60%, más preferiblemente
de al menos el 80% y de manera ideal de al menos el 90% de la
profundidad combinada de la capa basal y la capa de proteína de
adhesión celular.
La proteína de adhesión celular proporcionada
como una capa superficial para la capa basal de polisacárido puede
ser una capa integrada o puede ser una capa molecular absorbida
sobre la superficie. La capa superficial de la proteína de adhesión
celular puede tener, dependiendo del método mediante el que se
produce, sólo varias moléculas de espesor o puede tener un espesor
algo mayor de modo que forma una capa externa diferenciada. Por
tanto, la capa de proteína puede ser cualquiera desde
3-5 moléculas de "profundidad" en el caso de
adsorción superficial hasta, por ejemplo, 20 \mum (por ejemplo,
1-20 \mum) cuando se forma como un
"recubrimiento". Esta capa de proteína puede ser una red
esencialmente amorfa, tener algo de cristalinidad o incluso poca o
nada estructura de fibrilla. La capa de proteína puede estabilizarse
y unirse a la capa basal (de polisacárido) mediante puentes de
hidrógeno, fuerzas de van der Waals o atrapamiento físico. El grado
de estabilidad de la capa de proteína puede usarse como un mecanismo
para dirigir ciertas respuestas celulares. Por tanto, el sustrato
puede "adaptarse" para garantizar el crecimiento de un tipo de
célula particular y/o para proporcionar un grado conocido de
crecimiento celular en un tiempo predeterminado.
La capa de polisacárido comprenderá
preferentemente al menos el 50%, más preferiblemente al menos el
60%, incluso más preferiblemente al menos el 80% y de manera ideal
al menos el 90% de polisacárido. La capa de proteína de adhesión
celular comprenderá preferiblemente al menos el 50%, más
preferiblemente al menos el 60%, incluso más preferiblemente al
menos el 80% y de manera ideal al menos el 90% de proteína de
adhesión celular.
La capa de proteína de adhesión celular puede
incorporar proteínas diferentes de las proteínas de adhesión
celular.
Los sustratos de crecimiento celular según la
invención pueden incorporar, por ejemplo en la capa de polisacárido,
un principio activo para su administración durante la aplicación de
crecimiento celular. Este principio puede administrarse, por
ejemplo, mediante difusión y puede ser por ejemplo un fármaco.
Ejemplos adicionales de principios activos incluyen factores de
crecimiento, agentes quimiotácticos, etc. Los principios activos
pueden estar libres o encapsulados, por ejemplo en gotitas de tipo
lipídicas. El principio activo puede disponerse de manera continua o
discontinua a lo largo, a través y/o alrededor del sustrato de
crecimiento celular y puede proporcionarse en diferentes cantidades
en diferentes regiones del sustrato de modo que se establece un
gradiente de concentración.
Pueden producirse sustratos según la invención
mediante varios métodos. En un método de este tipo, se extruye una
disolución que contiene polisacárido y proteína de adhesión celular
disueltos (conteniendo la disolución menos de la proteína que del
polisacárido) en un baño de coagulación. Se cree que, en un método
de este tipo, existe una deposición preferente de la proteína de
adhesión celular. El baño de coagulación puede incorporar, por
ejemplo, cationes divalentes o superiores (por ejemplo, Ca^{2+})
que sirven para efectuar la precipitación y también estabilizan la
capa de proteína mediante puentes iónicos.
En un método adicional, el polisacárido se
extruye en un baño de coagulación que incorpora proteína (que
contiene la proteína de adhesión celular) como coagulante. El
coagulante de proteína puede ser por ejemplo un plasma sanguíneo
enriquecido (que contiene una proteína de adhesión celular). De
nuevo otra vez, se cree que existe una deposición preferente de la
proteína de adhesión celular en la superficie del sustrato. Este
procedimiento es particularmente eficaz cuando el polisacárido es
quitosano.
En un método alternativo de producción del
sustrato, puede aplicarse una capa superficial de una proteína de
adhesión celular a un polisacárido preformado. La aplicación de la
capa de proteína puede efectuarse, por ejemplo, en un baño de
recubrimiento que contiene una disolución de proteína o mediante una
técnica tal como pulverización.
Ejemplos de polisacáridos que pueden usarse para
el sustrato incluyen alginatos, quitosano, almidones catiónicos,
derivados catiónicos de otros hidrocoloides, pectina baja en
metoxilo, carragenanos, condroitina sulfato, ácido hialurónico,
carboximetilcelulosa, carboximetilalmidón, carboximetilguar,
celulosa sulfato, dextran sulfato, goma gellan, goma xantana y
derivados aniónicos de otros hidrocoloides. Se prefiere
particularmente que el polisacárido esté compuesto de un material de
alginato reticulado con iones calcio como otro catión divalente o
superior que puede reticular alginatos.
Ejemplos particularmente preferidos de sustratos
de crecimiento celular según la invención están en forma de fibras
que tienen un núcleo (que proporciona la capa basal) que consiste
en, o es rica en, el material de polisacárido y una superficie en la
que se proporciona la proteína de adhesión celular.
Las fibras según la invención pueden tener un
diámetro de 10-1000 \mum, más preferiblemente de
40-150 \mum, incluso más preferiblemente de
40-100 \mum y de manera ideal de
50-80 \mum. Las fibras pueden ser de cualquier
longitud apropiada.
Tales fibras pueden producirse hilando una masa
hilable compuesta por una disolución del polisacárido en un baño de
coagulación que provoca la precipitación de las fibras. La masa
hilable también puede contener proteína de adhesión disuelta que va
a formar la capa superficial, siendo tal la técnica de hilatura que
hay una precipitación inicial preferente de polisacárido en el baño
de coagulación seguida por una precipitación posterior de la
proteína de adhesión celular que forma así una capa externa rica en
proteína de la fibra (siendo esta capa solidaria con el núcleo). La
masa hilable para su uso en este procedimiento puede comprender, por
ejemplo (basándose en el peso total del polisacárido y la proteína
de adhesión celular) el 60-95% (preferiblemente de
manera aproximada el 90%) en peso del polisacárido y el
5-40% (preferiblemente de manera aproximada el 10%)
en peso de la proteína de adhesión celular. La fibra producida
mediante un procedimiento de este tipo puede tener un núcleo
compuesto por el 50-80% en peso del polisacárido y
una capa externa compuesta por el 50-80% en peso de
la proteína de adhesión celular y el 20-50% en peso
del polisacárido.
En un método de hilatura alternativo, las fibras
pueden formarse mediante una técnica de extrusión coaxial en la que
se extruye una disolución de la proteína de adhesión de manera
coaxial alrededor de una disolución (separada) del polisacárido,
hilándose ambas disoluciones en el mismo baño de coagulacion,
mediante lo cual se forma una fibra que tiene un núcleo de
polisacárido y una capa superficial de la proteína de adhesión
celular.
En un procedimiento alternativo para producir
las fibras, puede hilarse una masa hilable compuesta por una
disolución del polisacárido (pero no de la proteína de adhesión
celular) en un baño de coagulación y la fibra así formada se trata
con la proteína de adhesión celular. Este tratamiento puede
efectuarse, por ejemplo, proporcionando la proteína de adhesión
celular en el baño de coagulación de modo que la proteína se adsorba
como una capa superficial sobre la capa basal de polisacárido. Sin
embargo, es más preferible que la proteína de adhesión celular se
aplique en un baño posterior al baño de coagulación. Las condiciones
en el baño de proteína pueden ser tales como para garantizar que se
obtenga la formación de un recubrimiento estabilizado de la capa de
proteína.
Además, para todas las realizaciones de la
formación de fibras, la proteína de adhesión celular debe
concentrarse en la superficie de las fibras. Si la fibra se produce
mediante hilatura conjunta de una disolución del polisacárido y la
proteína de adhesión celular, puede usarse la combinación de tamaño
molecular relativo, equilibrio hidrófilo/hidrófobo y estabilidad
relativa para provocar una precipitación preferente. Si la fibra se
produce mediante un procedimiento de dos fases, entonces puede
lograrse la concentración de la proteína en la superficie mediante
el uso de la concentración del polisacárido y la proteína en cada
fase, mezclándose en la primera fase el polisacárido y la proteína,
en la segunda fase predominantemente la proteína más agentes
tensioactivos y/o estabilizadores.
Cualquiera que sea el método usado, la proteína
debe estabilizarse en la superficie y, de hecho, cuanto menor sea la
cantidad de proteína más importante es la estabilización. La
estabilización puede efectuarse garantizando que las partes de la
cadena molecular de la proteína estén embebidas en el polisacárido a
granel. En el caso en el que el polisacárido se ha reticulado
mediante cationes divalentes, la estabilización de la proteína puede
ser mediante puentes catiónicos divalentes. Cuando se usa quitosano
para formar el núcleo, sólo se producirán puentes catiónicos de
soporte dentro de las especies proteicas que ayudarán a estabilizar
la proteína en la superficie.
Se describen a continuación realizaciones más
específicas de la producción de fibras según la invención.
En una realización de este tipo, se produce una
fibra expeliendo una disolución acuosa de alginato de sodio a través
de una hilera en un baño de coagulación que contiene iones
Ca^{2+}. Entonces se hace pasar la fibra a través de una
disolución de fibronectina (o disolución de proteína mixta) en un
baño de recubrimiento (posterior al baño de coagulación) que está a
un pH que proporcionará a la fibronectina una carga neta positiva
provocando que pueda interaccionar con el ácido algínico. La
fibronectina puede unirse además al alginato haciendo pasar la fibra
a través de un baño de coagulación/estabilización a un pH que
favorece que la fibronectina se cargue negativamente, favoreciendo
así los puentes catiónicos divalentes de modo que se estabiliza la
fibronectina sobre el polisacárido. El baño de
coagulación/estabilización puede contener agentes que modifican o
bien directamente la interacción de la fibra con las células (por
ejemplo a través de la naturaleza de un contraión, por ejemplo Zn,
Ag, Mn, Ce) o bien indirectamente influyendo en el entorno
circundante mediante la difusión de una especie molecular activa,
tal como factores de crecimiento, agentes de agregación,
quimioatrayentes, tensioactivos, etc.
Como alternativa a aplicar la fibronectina en un
baño de recubrimiento, es posible aplicar un recubrimiento de
fibronectina pulverizando una disolución de fibronectina sobre la
fibra. La pulverización proporciona un medio de recubrimiento fino
(es decir, sólo varias moléculas de espesor) y también un método de
recubrimiento que producirá potencialmente una forma fibrilar del
recubrimiento si las condiciones de cizalladura, etc. se fijan
correctamente. Estas condiciones también pueden ajustarse para dar
orientación a la fibrilla formada en relación con el sustrato.
En una realización adicional de la producción de
fibras, pueden encontrarse fibras en un procedimiento de una única
fase hilando una masa hilable que contiene alginato de sodio
disuelto y fibronectina en una disolución de calcio u otros iones
divalentes (que proporcionan la fuerza de transmisión para la
precipitación). La masa hilable se formula de modo que la
fibronectina precipita preferentemente en la superficie de la fibra.
Las cantidades relativas del alginato de calcio con respecto a la
fibronectina en la masa hilable serán preferiblemente del orden de
al menos 80 partes en peso de alginato y como máximo 20 partes de
fibronectina.
En el procedimiento descrito en el párrafo
anterior, la fibra se producirá en condiciones que estimulan la
naturaleza globular de la proteína. Esto puede lograrse mediante el
uso de un pH o una temperatura (para el baño de coagulación) que
provoque que las cadenas de la molécula de proteína se
"enrollen" sobre sí mismas con una tendencia a embeber los
extremos de la cadena en la estructura de la fibra.
En un procedimiento de producción de fibras
alternativo, se mezclará un polielectrolito tal como quitosano con
la disolución de fibronectina y precipitará una fibra mediante
hilatura en un baño de hidróxido de sodio. El peso molecular del
quitosano se elegirá para estimular la formación de fibras.
Como una alternativa al procedimiento descrito
en el párrafo anterior, es posible hilar una masa hilable que
comprende una disolución de quitosano (como el polisacárido) para
formar una fibra que puede recubrirse posteriormente con
fibronectina. Este recubrimiento (de fibronectina) se formará
mediante interacción de cargas directamente entre las cadenas
laterales cargadas del quitosano y los grupos de aminoácidos de la
fibronectina así como mediante puentes catiónicos.
Para todos los métodos de producción de fibras,
puede ser apropiado someter las fibras hiladas a estiramiento,
lavado y/u operaciones de secado. En el caso en el que se aplica un
tratamiento superficial (separado) de la proteína de adhesión
celular tras la formación de la capa basal de polisacárido, puede
ser apropiado efectuar un estiramiento y/o lavado antes del
tratamiento con la proteína de adhesión celular.
Aunque las fibras son la forma preferida del
sustrato de crecimiento celular según la invención, son posibles
otras formas. Los ejemplos incluyen láminas y tiras que pueden
producirse conformando (mediante un método de cuchilla sobre rodillo
o recubrimiento por transferencia o boquilla de ranura) una película
fina de una disolución del polisacárido que entonces se precipita en
un baño de coagulación. Como en el caso de la formación de fibras,
la disolución también puede incorporar la proteína de adhesión
celular que va a depositarse preferentemente al coagularse en la
superficie del polisacárido. Alternativamente, la disolución que va
a precipitarse en el baño de coagulación no necesita incluir la
proteína de adhesión celular que entonces puede aplicarse
posteriormente a la lámina o tira mediante pulverización con una
disolución de la proteína. En este caso, la naturaleza del
recubrimiento se determina mediante la concentración de la proteína
en disolución, la velocidad, orificio, tamaño y dirección de la
pulverización en relación con la superficie. El ajuste acertado de
estos parámetros debe producir moléculas no desnaturalizadas pero
alineadas de la proteína activa. La capa superficial de la proteína
de adhesión celular puede aplicarse a la lámina mediante
pulverización con una disolución de la proteína. Pulverizando a alta
concentración y velocidad de flujo a través de un orificio pequeño,
pueden obtenerse la desnaturalización de la proteína, la formación
de fibrillas y el alineamiento y si esto se dirige en paralelo a una
superficie, entonces este alineamiento se mantendrá en el
recubrimiento superficial obtenido; el alineamiento molecular de la
proteína se reflejará entonces en el alineamiento de las especies
celulares que han crecido sobre el sustrato.
Independientemente de la forma física (fibra,
lámina, etc) del sustrato de crecimiento celular de la invención y
también independientemente de la manera en la que la capa
superficial de proteína de adhesión celular se incorpora al mismo,
se prefiere que la capa basal de polisacárido se forme hilando o
extruyendo una disolución de alginato de sodio en un baño que
contiene iones calcio. El alginato de sodio preferido para su uso en
una técnica de este tipo tiene un contenido en ácido gulurónico (G)
de al menos el 35% en peso y un contenido en ácido manurónico (M) de
cómo máximo el 65% en peso. Preferiblemente, el contenido en G es
del 35-70% en peso y el contenido en M es del
65-30% en peso. También preferiblemente, el alginato
de sodio tiene una viscosidad para una disolución al 1% (en agua)
del alginato de sodio de 30-300 cP, más
preferiblemente 40-100 cP. La disolución de
alginato que va a hilarse o extruirse en el baño de coagulación debe
tener generalmente un contenido en sólidos disueltos total inferior
al 10% en peso, más preferiblemente en el intervalo del
5-7%. La cantidad del catión (por ejemplo calcio)
presente en el baño de coagulación (para efectuar la precipitación
del alginato) es preferiblemente inferior al 1% en peso.
Para productos según la invención producidos
mediante coagulación de una disolución de un alginato, es posible
que la disolución de alginato (que va a coagularse) contenga al
menos un polisacárido adicional para modificar las propiedades del
alginato. El polisacárido adicional puede ser, por ejemplo, uno que
tenga grupos COO^{-} a lo largo de las cadenas de polisacárido,
por ejemplo pectina, carboximetilcelulosa N-,
O-carboximetilquitosano, carragenanos, goma xantana
o goma gellan. Alternativa o adicionalmente, el polisacárido que va
a coagularse con el alginato puede ser uno que tiene grupos
SO_{4}^{2-} proporcionados a lo largo de la cadena de
polisacárido, por ejemplo condroitina sulfato, dermatán sulfato,
heparán sulfato o heparán. Pueden usarse polisacáridos no cargados
junto con el alginato, por ejemplo acemanano. El polisacárido
adicional puede ser uno que mejore la absorbencia de agua del
alginato. Se facilita una descripción adicional de productos
obtenidos mediante coagulación de una disolución de alginato que
contiene al menos otro polisacárido en el documento
WO-A-9610106 (Innovative
Technologies Ltd), cuya descripción se incorpora al presente
documento como referencia.
Para todos los sustratos de crecimiento celular
según la invención, la capa superficial de la proteína de adhesión
celular puede ser continua o discontinua. Por tanto, por ejemplo, en
el caso de una fibra, la proteína puede proporcionarse de manera
continua a lo largo y alrededor de la longitud de la fibra o como
repeticiones periódicas (por ejemplo, de longitud predeterminada) a
lo largo de la longitud de la fibra y al menos parcialmente
alrededor de la circunferencia de la fibra, o como una "raya"
que no se extiende completamente alrededor de la circunferencia y
que se extiende de manera continua o discontinua a lo largo de la
longitud de la fibra. Si la capa de proteína de adhesión celular es
discontinua, partes de la superficie del sustrato de crecimiento
celular pueden ser (cuando se usan para crecimiento celular)
interactivas de manera positiva ("parlantes") y otras partes
pasivas ("silenciosas") y otras partes interactivas de manera
negativa ("desestimulantes"). En términos celulares, esto
significa que una superficie positiva estimula la propagación de la
adhesión celular, la motilidad y el crecimiento, mientras que una
superficie pasiva ("silenciosa") puede tener un bajo nivel de
interacción.
Los sustratos de crecimiento celular según la
invención pueden usarse en varias formas para diversas aplicaciones
de crecimiento celular. Meramente a modo de ejemplo, los sustratos
en forma de fibras pueden formarse en una estructura, por ejemplo
matrices al azar (por ejemplo fieltros y vellones no tejidos),
matrices orientadas (fibras que tienen algún alineamiento relativo),
estructuras tricotadas (por ejemplo telas tricotadas), estructuras
trenzadas (por ejemplo hebras trenzadas), estructuras empaquetadas y
cintas cardadas. Una estructura preferida comprende fibras según la
invención colocadas en paralelo o al azar entre sí y preferentemente
unidas a una capa de soporte, por ejemplo una película de
poliuretano. Esta capa de soporte puede estar recubierta de manera
adhesiva.
Una posibilidad adicional es para fibras que van
a disponerse en un gel amorfo.
Una posibilidad adicional se refiere a fibras
producidas con un polisacárido (por ejemplo alginato) reticulado
mediante un catión divalente o superior (por ejemplo calcio). Tales
fibras pueden mezclarse (usando las técnicas descritas en el
documento WO-A-9613285 (Innovative
Technologies Ltd) con una disolución acuosa de un material precursor
de hidrogel mediante el cual los cationes de las fibras reticulan el
material precursor dando como resultado la formación de un hidrogel
en el que las moléculas del precursor de hidrogel están reticuladas
mediante los cationes divalentes o superiores donados por las
fibras. La mezcla puede incorporar un plastificante. Posteriormente,
puede eliminarse el agua del hidrogel de modo que se proporciona una
forma deshidratada del mismo que contiene las fibras como refuerzo.
Un producto de este tipo es sumamente adecuado para su uso en la
cicatrización de heridas durante la cual las fibras se expondrán en
la superficie del producto para proporcionar un sustrato para
crecimiento celular. El precursor de hidrogel puede ser por ejemplo
alginato de sodio y el plastificante puede ser por ejemplo glicerol,
polietilenglicol, sorbitol o un polímero de PEO/PPO.
Los sustratos de crecimiento celular en forma de
tiras o láminas pueden enrollarse por ejemplo en tubos u otras
estructuras tridimensionales.
Tal como se indicó anteriormente, los sustratos
de crecimiento celular según la invención pueden usarse en una gama
de aplicaciones de crecimiento celular. Si el alineamiento celular
sobre la superficie del sustrato es importante, entonces éste puede
estar impuesto por la naturaleza de la célula y su relación con su
superficie. Por ejemplo, el alineamiento celular puede determinarse
mediante el tamaño de una fibra sobre la cual se hace crecer la
célula. Si se requiere alineamiento de la longitud de la célula o
bien perpendicular o bien paralelo a un eje particular del sustrato,
entonces esto puede conseguirse o bien mediante cualquier exposición
de la superficie a un flujo que producirá una tensión de corte en la
pared paralela a la orientación deseada o bien a un esfuerzo axial
que tenderá a provocar que las células se sitúen a través del eje de
tensión y por tanto a través del eje de la superficie.
Se facilitarán ahora varios ejemplos específicos
(pero no limitativos) de usos de sustratos de crecimiento celular
según la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Los sustratos pueden usarse en el tratamiento de
heridas. Para este fin, puede preferirse un sustrato de crecimiento
celular (según la invención) en forma de una lámina o película
plana. El material de película o lámina puede incorporar un agente
que va a administrarse a la herida.
Alternativamente, pueden ponerse sobre la herida
series en paralelo o al azar de fibras con o sin células sembradas o
bien individualmente, empaquetadas o bien fijas a un soporte que
puede estar recubierto de manera adhesiva. Un ejemplo de un soporte
adecuado es un material de película polimérico, particularmente una
película transpirable (por ejemplo, película de MVTR alta). La
película puede ser una que tiene una MVTR cuando está en contacto
con agua líquida que es al menos el doble que cuando está en
contacto con vapor de agua (pero no agua líquida). Por ejemplo, la
MVTR en contacto con vapor de agua sólo puede ser de
3000-5000 g m^{-2} 24 h^{-1} (tal como se mide
según la norma ASTM E96B) y una MVTR en presencia de agua líquida
(tal como se mide según la norma ASTM E96BW) de 8000 a 10000 g
m^{-2} 24 h^{-1}. El soporte puede tener un aparato para
permitir la transferencia de exudado. Ya se use o no un soporte, las
fibras aplicadas a la herida pueden incorporar factores de
crecimiento para administrar a células de la superficie o incorporar
agentes que influirán en el entorno circundante, por ejemplo
bactericidas, etc. Pueden aplicarse mezclas de fibras a la herida,
por ejemplo dos cualquiera de (i) fibras sembradas con células, (ii)
fibras no sembradas y (iii) fibras que contienen un agente que va a
administrarse a la herida.
\vskip1.000000\baselineskip
Los sustratos de crecimiento celular según la
invención pueden cultivarse con capas sencillas de queratinocitos
epidérmicos o fibroblastos dérmicos (cualquiera de los cuales puede
ser de origen autólogo o heterólogo). El sustrato (con células
cultivadas) puede usarse solo o en combinación con sustratos
cultivados de manera similar. Estos sustratos y células pueden
usarse para el tratamiento de heridas de espesor parcial, por
ejemplo sitios donantes y para el tratamiento de úlceras.
Los sustratos de crecimiento celular en forma de
fibras continuas pueden colocarse en relación con una estructura u
órgano dañado. Pueden colocarse o bien individualmente o bien en
paquetes durante el tratamiento invasivo o no invasivo.
Alternativamente, los sustratos de crecimiento
celular en forma de fibras pueden proporcionarse como una suspensión
inyectable. La suspensión puede introducirse en el organismo a lo
largo de un sistema de guía de catéter o pueden formarse las fibras
en el sitio. Como alternativa, es posible formular dos disoluciones;
una que contiene el polisacárido, la otra el coagulante, conteniendo
por tanto al menos una de las disoluciones proteína de adhesión
celular y aplicar estas disoluciones a un paciente en condiciones
tales que se produce la formación de fibras in situ, siendo
la fibra formada posiblemente continua.
Los sustratos de crecimiento celular en forma de
fibras pueden alinearse en paralelo a tendones y sembrarse in
situ con células apropiadas, condrocitos, etc. Alternativamente,
pueden cultivarse fibras más células en un laboratorio y
administrarse luego al paciente. Para ambas realizaciones, las
fibras pueden contener, o asociarse con fibras construidas con ácido
hialurónico u otras sustancias derivadas de cartílago.
Los sustratos de crecimiento celular en forma de
fibras pueden tricotarse, tejerse o hilarse en tubos para estimular
el crecimiento celular para formar un conducto sanguíneo.
Pueden repararse nervios dañados usando fibras
para unir los dos extremos (separados) del nervio, proporcionando
así un trayecto a lo largo del cual el nervio puede crecer.
Los sustratos de crecimiento celular pueden
incorporar moléculas activas ubicadas en la capa de polisacárido.
Estos agentes pueden usarse para influir en la incorporación de la
fibra al tejido. Alternativamente, el agente puede proporcionar un
depósito de fármaco para los fines de tratamiento tópico o
sistémico.
Para todas las realizaciones anteriores de la
invención, la proteína de adhesión celular puede sustituirse por un
componente del plasma sanguíneo.
La invención se ilustra además con referencia a
los siguientes ejemplos y las figuras de los dibujos adjuntos que
muestran los resultados de los ejemplos.
Para los ejemplos, se usaron los siguientes
procedimientos.
Se hicieron crecer células de fibroblastos de
ratón L929 para su uso en un experimento hasta la confluencia y
entonces se extrajeron de las placas de cultivo tisular lavando con
solución salina tamponada con Hepes, seguido por tratamiento con
disolución de tripsina al 0,25%. Se centrifugó el sobrenadante
resultante y se resuspendió el sedimento de células en medio de
Eagle modificado por Dulbecco [que contenía suero de ternero fetal
al 10%, penicilina al 5%/estreptomicina, ITS al 1%
(insulina-transferrina-selenita)].
Si se subcultivaron, entonces las células se sembraron en placas
sobre placas de cultivo tisular a una dilución de 1:5.
Se pesaron 15 mg de cada tipo de fibra que iba a
someterse a prueba y se colocaron en cada pocillo de una placa de
cultivo tisular de 12 pocillos. En todos los experimentos, se
lavaron las fibras con medios que contenían suero durante un periodo
de 24 horas. Los controles experimentales fueron células sembradas
sobre plástico de cultivo tisular. Las células usadas para las
pruebas de las fibras se sembraron en placas a una densidad de
80.000 células por pocillo. Todos los experimentos se terminaron en
un punto de tiempo de hasta 72 horas.
Se lavaron las células y fibras dos veces con
solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego se fijaron
usando disolución de formalina (tamponada neutra al 10%) durante 10
minutos. Se eliminó el fijador y se lavaron las células y fibras dos
veces más con PBS. Entonces se tiñeron las células con Giemsa
durante 10 minutos, seguido por 3 lavados de cinco minutos con PBS.
Entonces se observaron las células usando un microscopio Nikon
Diaphot y se capturaron las imágenes usando una videocámara digital
JVC DV1. Entonces se descargaron las imágenes a un ordenador Apple
Macintosh Power PC Performa 6400/200 y se realizó el análisis usando
el programa de dominio NIH image. Para la microscopía electrónica de
barrido, se deshidrataron las muestras fijadas en etanol al 100%
durante un periodo de 2 horas. Entonces se recubrieron por
pulverización las muestras usando un aparato Denton Vacuum modelo
desk 1. Se montaron las muestras sobre un portamuestras y se
observaron usando un microscopio electrónico de barrido Hitachi
S-510. Se capturaron las imágenes usando la cámara
JVC y se analizaron en el ordenador Macintosh usando NIH image.
Se extrajo sangre bovina y se mezcló en una
razón 9:1 con una disolución acuosa al 4% p/p de citrato de trisodio
(Sigma Chemicals) como anticoagulante. Entonces se centrifugó la
mezcla a 1000 rpm durante 10 minutos, tiempo tras el cual se eliminó
el plasma sobrenadante con una pipeta, se congeló a de -15 a 20ºC y
entonces se descongeló con refrigeración a 4ºC. Esto provocó que el
contenido en proteína globular del plasma se mantuviera precipitado
y se concentró mediante deposición en el fondo del recipiente de
almacenamiento. Se eliminó el sobrenadante del plasma refrigerado y
cuando se descongeló la fracción restante formó un plasma
enriquecido adicionalmente en proteína globular, concentración que
puede enriquecerse adicionalmente mediante otro ciclo de
congelación-descongelación. La fracción de plasma
así aislada se usó en algunos de los experimentos explicados
resumidamente a continuación.
Ejemplo
1
(Comparativo)
Se produjeron fibras de alginato de calcio
mediante eyección a 12 m/min de una disolución acuosa al 5,5% p/p de
alginato de sodio (de Pronova Biopolymer, que tiene un contenido en
ácido gulurónico del 70%) a través de una hilera que tiene 40.000
agujeros de 70 \mum de diámetro cada uno en un baño de coagulación
de cloruro de calcio dihidratado (1,5% p/p) y se lavaron las fibras
resultantes con acetona y se secaron. Se observaron las fibras bajo
un microscopio electrónico de barrido (Hitachi modelo S510) y se
encontró que eran cilíndricas, lisas, de aproximadamente
10-20 \mum de diámetro, con pocas características
topográficas superficiales destacadas (véase la figura 1). Entonces
se evaluaron las propiedades de adhesión celular de las fibras
usando células de fibroblastos de ratón L929 según el método
explicado de manera resumida anteriormente. No se observó unión
celular a las fibras en el plazo de 2 horas, tiempo durante el cual
las fibras formaron un gel y luego se desintegró.
Ejemplo
2
Se preparó una mezcla de disolución acuosa al
5,5% p/p de alginato de sodio (tal como en el ejemplo 1) con plasma
sanguíneo bovino mezclando los componentes en una razón de 3:2.
Entonces se usó esta mezcla para producir fibras en el laboratorio
mediante eyección a partir de una jeringa de insulina de 1 ml a
través de una aguja de un diámetro externo de 35 \mum en un baño
de coagulación de cloruro de calcio dihidratado (1,5% p/p) y se
lavaron las fibras resultantes en acetona y se secaron. Se
observaron las fibras bajo el microscopio electrónico de barrido
(véase la figura 2a). Entonces se evaluaron las propiedades de
adhesión celular de las fibras usando células de fibroblastos de
ratón L929 según el método explicado de manera resumida
anteriormente. En el plazo de 48 horas, las células habían crecido
hasta la confluencia sobre las fibras (véase la figura 2b), una
mejora considerable del resultado observado en el ejemplo 1.
Ejemplo
3
(Comparativo)
Se preparó una disolución al 3% p/p de
quitosano, que tiene un grado de desacetilación >70% (disponible
de Nigerian Fisheries), en ácido acético glacial acuoso al 2%.
Se prepararon fibras de quitosano en el
laboratorio eyectando la disolución de quitosano a partir de una
jeringa de insulina de 1 ml a través de una aguja de 35 \mum de
diámetro externo en un baño de coagulación de hidróxido de sodio (5%
p/p) y se secaron las fibras resultantes. Se observaron las fibras
bajo el microscopio electrónico de barrido, se encontró que las
fibras tenían un diámetro de 40-100 \mum y que
eran lisas, cilíndricas con pocas características topográficas
superficiales destacadas. Entonces se evaluaron las propiedades de
adhesión celular de las fibras usando células de fibroblastos de
ratón L929 según el método explicado de manera resumida
anteriormente. Tras 48 horas, se encontró que varias células se
adherían a las fibras pero no resultó evidente ninguna prueba de
alineamiento y alargamiento celular (véase la figura 3).
Ejemplo
4
Se prepararon fibras de quitosano en el
laboratorio eyectando una disolución de quitosano (tal como se
especificó en el ejemplo 3) a partir de una jeringa de insulina de 1
ml a través de una aguja de 35 \mum de diámetro externo en un baño
de coagulación de plasma sanguíneo bovino enriquecido (aislado tal
como se describió anteriormente) y se lavaron las fibras resultantes
con acetona y se secaron. Entonces se evaluaron las propiedades de
adhesión celular de las fibras usando células de fibroblastos de
ratón L929 según el método explicado de manera resumida
anteriormente. En el plazo de 48 horas, las células habían crecido
hasta la confluencia (tal como se observa en la figura 4) sobre las
fibras, un grado mucho mayor de unión celular que el observado para
fibras coaguladas en hidróxido de sodio (en comparación con el
ejemplo 3).
Claims (62)
1. Sustrato para crecimiento celular que
comprende un polisacárido y una proteína de adhesión celular
proporcionada en la superficie del sustrato y asociada con el mismo
mediante puentes de hidrógeno, fuerzas de van der Waals o
atrapamiento físico.
2. Sustrato según la reivindicación 1, que
comprende una capa basal de polisacárido que tiene una capa
superficial que incorpora la proteína de adhesión celular.
3. Sustrato según la reivindicación 2, en el que
la capa basal de polisacárido tiene un espesor superior al 60% del
espesor combinado de la capa basal de polisacárido y la capa de
proteína de adhesión celular.
4. Sustrato según la reivindicación 3, en el que
la capa basal de polisacárido tiene un espesor superior al 80% del
espesor combinado de la capa basal de polisacárido y la capa de
proteína de adhesión celular.
5. Sustrato según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 4, en el que la capa de proteína de adhesión
celular es solidaria con la capa basal de polisacárido.
6. Sustrato según la reivindicación 5, en el que
la capa de la proteína de adhesión celular tiene un espesor de
1-20 \mum.
7. Sustrato según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 5, en el que la capa de la proteína de adhesión
celular es una capa adsorbida a la superficie.
8. Sustrato según la reivindicación 7, en el que
la capa de la proteína de adhesión celular tiene 3-5
moléculas de profundidad.
9. Sustrato según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 8, en el que la capa basal de polisacárido
comprende al menos el 80% en peso de polisacárido.
10. Sustrato según la reivindicación 9, en el
que la capa basal de polisacárido comprende al menos el 90% en peso
de polisacárido.
11. Sustrato según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 10, en el que la capa superficial de la
proteína de adhesión celular comprende al menos el 80% en peso de
proteína de adhesión celular.
12. Sustrato según la reivindicación 11, en el
que la capa superficial de la proteína de adhesión celular comprende
al menos el 90% en peso de proteína de adhesión celular.
13. Sustrato según la reivindicación 12, en el
que la capa superficial de la proteína de adhesión celular comprende
del 95 al 100% en peso de proteína de adhesión celular.
14. Sustrato según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 13, en el que la capa de proteína de adhesión
celular es una capa discontinua.
15. Sustrato según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 14, en el que la capa de polisacárido incorpora
un principio activo seleccionado de un fármaco, factor de
crecimiento o agente quimiotáctico.
16. Sustrato según la reivindicación 15, en el
que el principio activo está encapsulado.
17. Sustrato según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, en el que el polisacárido se selecciona de
alginatos, quitosano, almidones catiónicos, derivados catiónicos de
otros hidrocoloides, pectina baja en metoxilo, carragenanos,
condroitina sulfato, ácido hialurónico, carboximetilcelulosa,
carboximetilalmidón, carboximetilguar, celulosa sulfato, dextran
sulfato, goma gellan, goma xantana y derivados aniónicos de otros
hidrocoloides.
18. Sustrato según la reivindicación 17, en el
que el polisacárido es un alginato.
19. Sustrato según la reivindicación 18, en el
que el alginato tiene un contenido en ácido gulurónico (G) de al
menos el 35% en peso y un contenido en ácido manurónico (M) de como
máximo el 65% en peso.
20. Sustrato según la reivindicación 19, en el
que el polisacárido tiene un contenido en G del
35-70% en peso y un contenido en M del
65-30% en peso.
21. Sustrato según una cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 20, en el que el alginato está reticulado con
cationes divalentes.
22. Sustrato según la reivindicación 21, en el
que los cationes divalentes son iones calcio.
23. Sustrato según la reivindicación 22, en el
que la proteína de adhesión celular se estabiliza mediante puentes
de ión calcio.
24. Sustrato según la reivindicación 17, en el
que el polisacárido es quitosano.
25. Sustrato según la reivindicación 24, en el
que el quitosano comprende al menos el 70% de quitina
desacetilada.
26. Sustrato según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 25, en el que la proteína de adhesión celular
está presente en el plasma sanguíneo.
27. Sustrato según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 26, en el que la proteína de adhesión celular
incorpora el sitio de unión RGD.
28. Sustrato según la reivindicación 27, en el
que la proteína de adhesión celular es fibronectina, vitronectina o
proteína de von Willebrand.
29. Sustrato según la reivindicación 28, en el
que la proteína de adhesión celular es fibronectina.
30. Sustrato para crecimiento celular que
comprende un polisacárido y un componente del plasma sanguíneo
proporcionado en la superficie del sustrato y asociado de manera no
covalente con el mismo mediante puentes de hidrógeno, fuerzas de van
der Waals o atrapamiento físico.
31. Sustrato según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 30 en forma de una fibra.
32. Sustrato según la reivindicación 31, en el
que la fibra tiene un diámetro de 10-1000
\mum.
33. Sustrato según la reivindicación 32, en el
que la fibra tiene un diámetro de 40-150 \mum.
34. Sustrato según la reivindicación 33, en el
que la fibra tiene un diámetro de 40-100 \mum.
35. Sustrato según la reivindicación 34, en el
que la fibra tiene un diámetro de 50-80 \mum.
36. Sustrato según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 30, que está en forma de una lámina o
película.
37. Sustrato según la reivindicación 36, que
tiene un espesor de 2-2000 \mum.
38. Sustrato según la reivindicación 37, que
tiene un espesor de 10-100 \mum.
39. Sustrato según la reivindicación 37, que
tiene un espesor de 200-1000 \mum.
40. Sustrato según la reivindicación 37, que
tiene un espesor de 500-2000 \mum.
41. Montaje de fibras según una cualquiera de
las reivindicaciones 31 a 35.
42. Montaje según la reivindicación 41, en forma
de una matriz al azar, una matriz orientada con fibras que tienen
algo de alineamiento relativo, una estructura tricotada, una
estructura trenzada, una estructura empaquetada o una cinta
cardada.
43. Montaje que comprende una pluralidad de
fibras según una cualquiera de las reivindicaciones 31 ó 35, en el
que las fibras están dispuestas paralelas entre sí.
44. Montaje que comprende una pluralidad de
fibras según una cualquiera de las reivindicaciones 31 ó 34, en el
que las fibras están dispuestas aleatoriamente.
45. Montaje según la reivindicación 43 ó 44, en
el que las fibras se proporcionan en un soporte en forma de una
lámina o película.
46. Montaje según la reivindicación 45, en el
que las fibras se proporcionan en una película de alta tasa de
transmisión de vapor de humedad.
47. Montaje según la reivindicación 41, en el
que dichas fibras se proporcionan en una matriz de un gel
amorfo.
48. Método para producir un sustrato de
crecimiento celular que comprende extruir una disolución que
contiene polisacárido disuelto y proteína de adhesión celular,
estando presente el polisacárido en una cantidad mayor que la
proteína de adhesión celular, en un baño de coagulación de manera
que precipita un sustrato compuesto de una capa basal de un
polisacárido y una capa superficial de proteína de adhesión celular
asociada con la misma mediante puentes de hidrógeno, fuerzas de van
der Waals o atrapamiento físico.
49. Método según la reivindicación 48, en el que
el sustrato se precipita en un baño que contiene cationes
divalentes.
50. Método según la reivindicación 49, en el que
los cationes divalentes son iones calcio.
51. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 48 a 50, en el que la disolución que va a extruirse
comprende, basándose en el peso total del polisacárido y la proteína
de adhesión celular, el 60-99% en peso del
polisacárido y el 1-40% en peso de la proteína de
adhesión celular.
52. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 48 a 51, en el que el polisacárido disuelto es
alginato de sodio.
53. Método según la reivindicación 52, en el que
el alginato de sodio tiene un contenido en G del
35-70% en peso y un contenido en M del
65-35% en peso.
54. Método según la reivindicación 52 ó 53, en
el que el alginato de sodio tiene una viscosidad para una disolución
al 1% en agua de 30-300 cP.
55. Método según la reivindicación 54, en el que
el alginato de sodio tiene una viscosidad de una disolución al 1% en
agua de 40-100 cP.
56. Método para producir un sustrato de
crecimiento celular que comprende aplicar a la superficie de una
capa preformada de un polisacárido una capa superficial de una
proteína de adhesión celular o componente del plasma sanguíneo de
modo que dicha proteína de adhesión celular o componente del plasma
sanguíneo se asocie con el polisacárido mediante puentes de
hidrógeno, fuerzas de van der Waals o atrapamiento físico.
57. Método según la reivindicación 56, en el que
el método de aplicación es mediante inmersión de la capa de
polisacárido en un baño de recubrimiento que contiene la proteína de
adhesión celular o componente del plasma sanguíneo.
58. Método según la reivindicación 56, en el que
el polisacárido se precipita en un baño de coagulación que contiene
la proteína de adhesión celular.
59. Método según la reivindicación 56, en el que
el método de aplicación es mediante pulverización.
60. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 56 a 59, efectuado con estabilización de la capa de
proteína.
61. Método de cultivo celular in vitro
que comprende efectuar el crecimiento de las células en un sustrato
según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 40 o montaje según
una cualquiera de las reivindicaciones 41 a 47.
62. Sustrato según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 40 o montaje según una cualquiera de las
reivindicaciones 41 a 47, para su uso en un tratamiento.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB9901272 | 1999-01-21 | ||
GBGB9901272.6A GB9901272D0 (en) | 1999-01-21 | 1999-01-21 | Fibres |
GB9903561 | 1999-02-17 | ||
GBGB9903561.0A GB9903561D0 (en) | 1999-02-17 | 1999-02-17 | Cell growth |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2315223T3 true ES2315223T3 (es) | 2009-04-01 |
Family
ID=26315009
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES00901189T Expired - Lifetime ES2315223T3 (es) | 1999-01-21 | 2000-01-21 | Crecimiento celular. |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20060051867A1 (es) |
EP (2) | EP1144592B1 (es) |
JP (2) | JP2002536974A (es) |
AT (1) | ATE412733T1 (es) |
AU (2) | AU2115300A (es) |
DE (1) | DE60040648D1 (es) |
ES (1) | ES2315223T3 (es) |
WO (2) | WO2000047716A2 (es) |
Families Citing this family (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6589199B1 (en) * | 1997-08-28 | 2003-07-08 | Boston Scientific Corporation | System for implanting a cross-linked polysaccharide fiber and methods of forming and inserting the fiber |
US7033603B2 (en) | 1999-08-06 | 2006-04-25 | Board Of Regents The University Of Texas | Drug releasing biodegradable fiber for delivery of therapeutics |
US6596296B1 (en) | 1999-08-06 | 2003-07-22 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Drug releasing biodegradable fiber implant |
JP2002142752A (ja) * | 2000-11-13 | 2002-05-21 | Asahi Techno Glass Corp | コラーゲンコート細胞培養容器及びその製造方法 |
JP2002142751A (ja) * | 2000-11-13 | 2002-05-21 | Asahi Techno Glass Corp | コラーゲンコート細胞培養容器及び培養部材 |
EP2029727B1 (en) | 2006-06-16 | 2012-04-11 | FMC Biopolymer AS | Alginate coated, collagen matrix cellular device, preparative methods, and uses thereof. |
EP2084264A1 (en) | 2007-03-09 | 2009-08-05 | Corning Incorporated | Three dimensional gum matrices for cell culture, manufacturing methods and methods of use |
EP2018864A1 (en) | 2007-07-23 | 2009-01-28 | Biomet Deutschland GmbH | Pharmaceutical composition, substrate comprising a pharmaceutical composition, and use of a pharmaceutical composition |
US20110033504A1 (en) * | 2007-07-23 | 2011-02-10 | Drexel University | Articles and methods for repairing damaged nervous tissue |
TWI414328B (zh) * | 2008-09-18 | 2013-11-11 | Nat Health Research Institutes | 可植入性神經再生導管 |
EP2480596A1 (en) * | 2009-09-25 | 2012-08-01 | Armark Authentication Technologies, LLC | Tissue fiber scaffold and method for making |
US8961592B2 (en) | 2010-11-12 | 2015-02-24 | Biotronik Ag | Functionalized RGD peptidomimetics and their manufacture, and implant having a coating containing such functional-ized RGD peptidomimetics |
EP2452702B1 (de) * | 2010-11-12 | 2015-03-04 | Biotronik AG | Funktionalisierte RGD-Peptidmimetika und deren Herstellung sowie Implantat mit einer Beschichtung, die solche funktionalisierte RGD-Peptidmimetika enthält |
CN102499994A (zh) * | 2011-11-04 | 2012-06-20 | 无锡中科光远生物材料有限公司 | 一种神经组织工程纤维膜及制备方法 |
US20140017263A1 (en) | 2012-06-28 | 2014-01-16 | Clemson University | Delivery Agents for Targeted Treatment of Elastin Degradation |
CN103966096A (zh) * | 2014-05-26 | 2014-08-06 | 扬州大学 | 一种细胞培养板及其制备方法和应用 |
CN103966097A (zh) * | 2014-05-26 | 2014-08-06 | 扬州大学 | 一种涂覆羧甲基纤维素偶联rgd短肽的细胞培养板的制备方法和应用 |
CN106435815B (zh) * | 2016-09-20 | 2018-07-13 | 大连工业大学 | 化学交联改性丝素蛋白/海藻酸盐复合纤维及其制备方法 |
CN111996616B (zh) * | 2020-08-20 | 2021-09-28 | 江南大学 | 一种尺寸可控的海藻酸钠/聚赖氨酸自组装纤维 |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS59192709A (ja) * | 1983-04-15 | 1984-11-01 | Toray Ind Inc | 太細を有し、表面に溝のある繊維及びその製造方法 |
JPH01309682A (ja) * | 1988-06-03 | 1989-12-14 | Sanyo Chem Ind Ltd | 動物細胞培養用基体 |
US4948575A (en) * | 1989-01-24 | 1990-08-14 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Alginate hydrogel foam wound dressing |
GB9403135D0 (en) * | 1994-02-18 | 1994-04-06 | Univ Glasgow | Wound healing device |
US5610145A (en) * | 1994-04-15 | 1997-03-11 | Warner-Lambert Company | Tachykinin antagonists |
US5855608A (en) * | 1994-05-13 | 1999-01-05 | Thm Biomedical, Inc. | Device and methods for in vivo culturing of diverse tissue cells |
AU3530695A (en) * | 1994-09-29 | 1996-04-19 | Innovative Technologies Limited | Fibres |
GB9515327D0 (en) * | 1995-07-26 | 1995-09-20 | Univ London | Site-directed bone formation |
JP2822174B2 (ja) * | 1996-03-01 | 1998-11-11 | オーミケンシ株式会社 | キチンキトサン繊維及び構造体の製造法 |
ES2317657T3 (es) * | 1996-09-19 | 2009-04-16 | The Regents Of The University Of Michigan | Polimeros que contienen polisacaridos tales como alginatos o alginatos modificados. |
-
2000
- 2000-01-21 JP JP2000599861A patent/JP2002536974A/ja active Pending
- 2000-01-21 EP EP00901189A patent/EP1144592B1/en not_active Revoked
- 2000-01-21 EP EP00901188A patent/EP1147175A2/en not_active Withdrawn
- 2000-01-21 AT AT00901189T patent/ATE412733T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-01-21 DE DE60040648T patent/DE60040648D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-21 AU AU21153/00A patent/AU2115300A/en not_active Abandoned
- 2000-01-21 AU AU21152/00A patent/AU2115200A/en not_active Abandoned
- 2000-01-21 WO PCT/GB2000/000144 patent/WO2000047716A2/en not_active Application Discontinuation
- 2000-01-21 ES ES00901189T patent/ES2315223T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-21 JP JP2000598616A patent/JP2002536011A/ja active Pending
- 2000-01-21 WO PCT/GB2000/000145 patent/WO2000049135A2/en active Application Filing
-
2005
- 2005-04-20 US US11/110,362 patent/US20060051867A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2115200A (en) | 2000-08-29 |
EP1144592B1 (en) | 2008-10-29 |
WO2000047716A3 (en) | 2000-12-14 |
WO2000049135A2 (en) | 2000-08-24 |
WO2000049135A3 (en) | 2000-12-14 |
WO2000047716A2 (en) | 2000-08-17 |
JP2002536974A (ja) | 2002-11-05 |
JP2002536011A (ja) | 2002-10-29 |
AU2115300A (en) | 2000-09-04 |
DE60040648D1 (de) | 2008-12-11 |
US20060051867A1 (en) | 2006-03-09 |
EP1147175A2 (en) | 2001-10-24 |
EP1144592A2 (en) | 2001-10-17 |
ATE412733T1 (de) | 2008-11-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2315223T3 (es) | Crecimiento celular. | |
US11744926B2 (en) | Anti-adhesive barrier membrane using alginate and hyaluronic acid for biomedical applications | |
Biswas et al. | Recent advancement of biopolymers and their potential biomedical applications | |
JP6433465B2 (ja) | 高強度キチン複合材料および製造方法 | |
Gu et al. | Gelatin blending and sonication of chitosan nanofiber mats produce synergistic effects on hemostatic functions | |
CN102600013B (zh) | 一种医用植绒止血材料及其制备和应用 | |
US20070254016A1 (en) | Biodegradable foam | |
US20080254091A1 (en) | Multi-Layered Antiadhesion Barrier | |
Buriuli et al. | Polyelectrolyte complexes (PECs) for biomedical applications | |
JPH10503098A (ja) | 生体人工細胞外マトリックスのための組成物および方法 | |
CN113289050B (zh) | 一种止血海绵及其制备方法 | |
Joo et al. | Fibrinogen as a promising material for various biomedical applications | |
CN202605114U (zh) | 一种医用植绒止血材料 |