CN113289050B - 一种止血海绵及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种止血海绵及其制备方法。止血海绵由三层组成:内层为凝血酶涂层;中间层由胶原蛋白、海藻酸钠和抗菌肽通过交联剂谷氨酰胺转氨酶交联后,与负载有凝血酶的壳聚糖微球混合,再通过两步冷冻干燥制得,外层为由聚己内酯、壳聚糖、凝血酶和柞蚕丝素蛋白构成的静电纺丝层;其中中间层中胶原蛋白、海藻酸钠、含凝血酶的壳聚糖微球和抗菌肽的质量比为(30‑40):(60‑70):(30‑50):(3‑5);外层中聚己内酯、壳聚糖、凝血酶和柞蚕丝素蛋白的质量比为(40‑50):(30‑40):(3‑5):(10‑30)。通过上述方式,本发明的止血海绵具有良好的生物相容性、抗菌性能和止血性能。
Description
技术领域
本发明涉及止血海绵技术领域,特别是涉及一种妇科用抗菌止血海绵。
背景技术
在外科手术中,止血是非常重要的问题。机械的止血方法例如缝合等在很多手术中并不能达到要求,因此还需要使用止血剂。以往多采用非吸收性纱条填塞的方法止血,但此方法会给病人带来一些痛苦。
止血海绵是一种吸水性很强的海绵状固体止血剂,目前得到了广泛的应用。目前常见的止血海绵包括淀粉为原料制成的淀粉海绵、明胶海绵等,也有含药海绵,例如在海绵中增加消炎止血作用的中草药成分。但现有技术中目前存在的止血海绵也存在着各种不足。例如,明胶海绵是目前常用的止血材料,但是止血效果不理想,与创面的贴附也不够紧密。而中药止血海绵的止血效果欠理想,愈合时间较慢,并且价格较贵。2002年,美国食品药品监督局批准了一种壳聚糖外用止血产品,上世纪八十年代,英国将商品名为Sorbsan的海藻酸盐纤维敷料应用于止血领域。这些止血材料在轻度出血创面的应用中效果显著,但对于严重出血创面的止血效果不稳定,存在止血速度慢、局部炎症反应等情况。
公开号CN102247615A的专利公开了一种明胶-PCL牙科止血材料及其制备方法,将辅助添加剂加入明胶和PCL的溶液中冷冻干燥制备得到止血海绵。公开号CN103330678A的专利公开了一种采用类溶剂溶媒扩散法制备得到的丹皮酚微海绵制剂,主要步骤包括将丹皮酚、聚合物溶于制孔剂中,制备外相,将蒸馏水和乳化剂搅拌均匀,将内向加入到外相中搅拌形成类乳剂,搅拌使有机溶剂挥发,过滤分离。公开号为CN104623722A的专利公开了一种海藻酸抗菌止血海绵材料,其中水为载体,组分由海藻酸钠、海藻酸钙短纤维、增塑剂甘油和含银抗菌剂组成。但上述各种止血海绵的止血和抗菌效果距离期望还有一定差距。
针对上述问题,本申请提出了一种具有更好的生物相容性、抗菌性能和止血性能的止血海绵。
发明内容
本发明目的是提供一种具有良好生物相容性、抗菌性能和止血性能的止血海绵。
本发明的技术方案是:
一种止血海绵,其特征在于,该止血海绵由三层组成:内层为凝血酶涂层;中间层由胶原蛋白、海藻酸钠和抗菌肽通过交联剂谷氨酰胺转氨酶交联后,与负载有凝血酶的壳聚糖微球混合,再通过两步冷冻干燥制得,外层为由聚己内酯、壳聚糖、凝血酶和柞蚕丝素蛋白构成的静电纺丝层;其中中间层中胶原蛋白、海藻酸钠、含凝血酶的壳聚糖微球和抗菌肽的质量比为(30-40):(60-70):(30-50):(3-5);外层中聚己内酯、壳聚糖、凝血酶和丝素蛋白的质量比为(40-50):(30-40):(3-5):(10-30)。其中,聚谷氨酸分子量700~1000kDa,聚己内酯的分子量500-1000kDa,壳聚糖分子量为100kDa-200kDa。所述抗菌肽为聚L-赖氨酸或聚L-谷氨酸。凝血酶是从牛血或猪血中提取的凝血酶原,经激活而得的无菌冻干制品,每1mg效价不少于50单位。该止血海绵厚度小于1cm,优选为厚度3mm-8mm,更优选5mm。
上述止血海绵的制备方法,其特征在于该方法包括如下步骤:
步骤1:制备中间层;
步骤2:在中间层一侧制备静电纺丝层;
步骤3:在中间层的另一侧制备凝血酶层。
其中步骤1中制备中间层的方法,包括如下步骤:
(1)将胶原蛋白和海藻酸钠分别制成胶原蛋白和海藻酸钠溶液,混匀得到混合溶液,将抗菌肽和谷氨酰胺转氨酶依次加入混合溶液中,混匀,静置40-60分钟;
(2)制备负载有凝血酶的壳聚糖微球;
(3)将负载有凝血酶的壳聚糖微球加入第(1)步最终的混合溶液中,搅拌均匀;
(4)将混合溶液进行分步冷冻干燥,先在-30℃下预冻12小时,再将其放置于-80℃的冰箱中冷冻6-8小时,最后将其放入真空冷冻干燥箱中48小时冷冻干燥,得到中间层。
其中,负载有凝血酶的壳聚糖微球的制备方法为:将表面活性剂、酶稳定剂和溶剂混合,加入壳聚糖溶液,混合后,加入京尼平和凝血酶,离心、清洗冷冻干燥,其中表面活性剂为聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯和/或失水山梨醇脂肪酸酯。
在微球中,凝血酶活性非常稳定,优选还可以使用下组的凝血酶稳定剂:多元醇,多糖,聚二醇,氨基酸或它们的混合物。山梨糖醇、甘油、聚乙二醇、聚丙二醇、单糖或二糖比如葡萄糖或蔗糖、或者任何能够稳定凝血酶活性的糖类或者磺化氨基酸的示例性应用是优选的。
其中的聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯,可以为吐温20(TWEEN-20)、吐温21(TWEEN-21)、吐温40(TWEEN-40)、吐温60(TWEEN-60)、吐温61(TWEEN-61)、吐温80(TWEEN-80)、吐温81(TWEEN-81)、吐温85(TWEEN-85)。失水山梨醇脂肪酸酯可以为司盘20、司盘60、司盘40、司盘80等,在一种优选的方式中,所述表面活性剂包括聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯和失水山梨醇脂肪酸酯,体积比为1:(1~4),例如可以为1:1、1:2、1:3、1:4。
步骤2中制备静电纺丝层的方法包括如下步骤:
(1)制备静电纺丝溶液:聚己内酯、壳聚糖和柞蚕丝素蛋白加入到1%-2%的乙酸水溶液中形成混合溶液;然后将凝血酶添加至溶液中;
(2)将步骤1中得到的中间层固定于接收装置上,在一侧进行静电纺丝。静电纺丝的参数为调节微量注射泵的速率为10~12毫升/小时,调节高压发生器的电压为15~45kV,调节接收装置的接收距离为35.0~40.0厘米,调节电纺针头的移动速度1~20厘米/秒,接收辊转速为1500~1800圈/分。
步骤3中制备凝血酶层的方法为:将凝血酶溶解在PBS中,配置质量浓度为5-8mg/mL的凝血酶溶液,涂敷的方法在凝胶层的另一侧涂上凝血酶溶液,静置干燥40-50分钟。
壳聚糖是甲壳素脱乙酰后产生的一种天然生物多糖,迄今是自然界唯一的碱性多糖,其自然资源十分丰富。由于具有优良的生物相容性、广谱抗菌性、促伤口愈合作用,且可以生物降解安全无毒。
海藻酸钠是存在于褐藻类中的天然高分子多糖,具有良好的生物相容性、生物降解性、凝胶性等,可广泛应用于医药、食品、化工等领域。
柞蚕丝素蛋白是丝素蛋白的一种,但在绝大部分的丝素蛋白材料的研究或报道中,所用的原料都是家蚕丝。柞蚕丝素蛋白是由柞蚕丝腺内壁上的内皮细胞分泌的高纯度蛋白质,其氨基酸组成中以甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸为主,具有良好的生物相容性,其本身及其降解产物对细胞和机体无毒,不会或较少引起炎症和免疫排斥反应。特别是其蛋白质分子中含有特殊的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(RGD)三肽序列。RGD序列作为细胞膜整合素受体与细胞外配体相结合的识别位点,介导细胞与细胞外基质及细胞之间的相互作用,能够促进细胞对于支架的识别及粘附。
胶原蛋白是动物体内含量最多、分布最广的蛋白质,是细胞外基质中的主要蛋白质,也是组成动物皮肤的主要蛋白质,其对于伤口愈合、钙化作用和血液凝固有着密切的关系,在止血海绵中也有着广泛的应用。
聚己内酯是一种结晶性生物可降解聚合物,在体内降解初期的表观速率常数为3.07*10-3/d,只有当聚己内酯分子量降低到约5000以后才伴随着低分子量聚己内酯碎片的损失,具有良好的力学性能。
ε-多聚赖氨酸、L-多聚精氨酸等多肽抗菌剂具有与纳米无机银、季铵盐等化学抗菌剂同样的抗菌与消炎作用,可水解病菌细胞壁不溶性黏多糖,也可与带负电荷的病毒蛋白直接结合使多种病毒失活,且这类抗菌肽稳定性较好,对高等动物的正常细胞几乎无毒害作用。
本发明的止血海绵具有如下有益效果:
(1)具有优异的生物相容性。本发明所使用原材料均为具有优异生物相容性的医用材料,使用抗菌肽替代常用的抗菌剂,将异物反应减少到最低。
(2)具有良好的力学性能,本申请使用力学性能优异的聚己内酯和柞蚕丝素蛋白通过静电纺丝形成的层作为底层,为止血海绵提供了良好的力学性能和生物相容性。
(3)独特的多层设计之间相互配合,产生协同的作用,加快了凝血的速度,提高了凝血和灭菌的效果,并保证了海绵吸血后的形态完好。表层的凝血酶直接应用于伤口,中间层的多孔结构可以吸附血液,胶原蛋白和海藻酸钠吸附血液中的水后变为凝胶态,有助于堵住较大的伤口。同时抗菌肽、凝血酶以及壳聚糖共同起到优异的抗菌和凝血的效果。对于出血量特别大的情况,静电纺丝层中的壳聚糖和凝血酶起到继续凝血的作用,静电纺丝形成的多孔结构可以吸收大量的血液,而聚己内酯的力学性能保证整个止血海绵的吸收了大量血液后依然形态完好,具有良好的湿强度。在伤口愈合时,便于移除,不会造成刚愈合的娇嫩的伤口因海绵的移除而再次受伤。
(4)产品具有较好的稳定性,抗菌肽与中间层其它物质交联,壳聚糖包裹凝血酶,使得产品具有较好的稳定性,便于储存。
(5)产品具有优异的吸湿性。产品主体为冷冻干燥和静电纺丝得到,孔隙率高,具有优异的吸湿性能。
附图说明
图1是本发明止血海绵的示意图,其中,1为凝血酶涂层,2为中间层,3为静电纺丝层。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明做进一步的阐述,但本发明并不限于此特定例子。
实施例1
一种止血海绵的制备方法,具体为以下步骤:
步骤1:制备中间层:
(1)将3g胶原蛋白和6g海藻酸钠分别溶解于水中,再将两者混匀得到混合溶液,再将0.3g的聚L-赖氨酸和0.1g的交联剂谷氨酰胺转氨酶加入到混合溶液中,混合均匀,静置40-60分钟;
(2)制备含凝血酶的壳聚糖微球:取20mL吐温80,40mL司班80,10ml丙三醇共同放入容器中,加入液体石蜡定容到1000mL,放在搅拌机下搅拌均匀,混匀后加入50mL2wt%壳聚糖乙酸溶液,继续搅拌,搅拌至半透明,再加入10ml 0.4μ/ml的凝血酶,继续搅拌,搅拌至乳白色,最后加入1%京尼平10mL,调节pH值至5,继续搅拌5h;当溶液变成蓝色且杯底有沉淀颗粒时停止反应,将溶液装入离心管中,调节转速1000r/min,离心10min;离心后将上层液体吸出,再加入石油醚清洗颗粒,清洗2遍;接着用无水乙醇清洗2遍;最后用PBS清洗2遍;离心后吸去上层液体,将得到的颗粒样品冷冻干燥后得到含有凝血酶的壳聚糖微球;
(3)将3g含有凝血酶的壳聚糖微球加入步骤(1)的混合液中,搅拌均匀;然后进行分步冷冻干燥,先在-30℃下预冻12小时,再将其放置于-80℃的冰箱中冷冻6小时,最后将其放入真空冷冻干燥箱中48小时冷冻干燥,得到中间层;
步骤2:制备静电纺丝层:
(1)制备静电纺丝溶液:将4g聚己内酯、3g壳聚糖和1g柞蚕丝素蛋白分别加入到100ml的1%的乙酸水溶液中形成溶液,再将三者混合得到混合溶液;然后将0.3g凝血酶添加至溶液中。
(2)将步骤1中得到的中间层固定于接收装置上,在一侧进行静电纺丝。静电纺丝的参数为调节微量注射泵的速率为10毫升/小时,调节高压发生器的电压为15~45kV,调节接收装置的接收距离为35.0厘米,调节电纺针头的移动速度1厘米/秒。
步骤3:制备凝血酶层的方法为:
将1g凝血酶溶解在PBS中,配置质量浓度为5mg/mL的凝血酶溶液,在凝胶层的另一侧反复涂上凝血酶溶液,静置干燥40分钟。即得到该止血海绵。
实施例2
一种止血海绵的制备方法,具体为以下步骤:
步骤1:制备中间层:
(1)将3.5g胶原蛋白和6.5g海藻酸钠分别溶解于水中,再将两者混匀得到混合溶液,再将0.4g的聚L-赖氨酸和0.1g的交联剂谷氨酰胺转氨酶加入到混合溶液中,混合均匀,静置40-60分钟;
(2)制备含凝血酶的壳聚糖微球:具体方法同实施例1;
(3)将4g含有凝血酶的壳聚糖微球加入步骤(1)的混合液中,搅拌均匀;然后进行分步冷冻干燥,先在-30℃下预冻12小时,再将其放置于-80℃的冰箱中冷冻6小时,最后将其放入真空冷冻干燥箱中48小时冷冻干燥,得到中间层;
步骤2:制备静电纺丝层:
(1)制备静电纺丝溶液:将4.5g聚己内酯、3.5g壳聚糖和2g柞蚕丝素蛋白分别加入到100ml的1.5%的乙酸水溶液中形成溶液,再将三者混合得到混合溶液;然后将0.4g凝血酶添加至溶液中。
(2)将步骤1中得到的中间层固定于接收装置上,在一侧进行静电纺丝。静电纺丝的参数为调节微量注射泵的速率为10毫升/小时,调节高压发生器的电压为15~45kV,调节接收装置的接收距离为35.0厘米,调节电纺针头的移动速度1厘米/秒。
步骤3:制备凝血酶层的方法为:
将1g凝血酶溶解在PBS中,配置质量浓度为6mg/mL的凝血酶溶液,在凝胶层的另一侧反复涂上凝血酶溶液,静置干燥45分钟。即得到该止血海绵。
实施例3
一种止血海绵的制备方法,具体为以下步骤:
步骤1:制备中间层:
(1)将4g胶原蛋白和7g海藻酸钠分别溶解于水中,再将两者混匀得到混合溶液,再将0.5g的聚L-赖氨酸和0.1g的交联剂谷氨酰胺转氨酶加入到混合溶液中,混合均匀,静置40-60分钟;
(2)制备含凝血酶的壳聚糖微球:具体方法同实施例1;
(3)将5g含有凝血酶的壳聚糖微球加入步骤(1)的混合液中,搅拌均匀;然后进行分步冷冻干燥,先在-30℃下预冻12小时,再将其放置于-80℃的冰箱中冷冻6小时,最后将其放入真空冷冻干燥箱中48小时冷冻干燥,得到中间层;
步骤2:制备静电纺丝层:
(1)制备静电纺丝溶液:将5g聚己内酯、4g壳聚糖和3g柞蚕丝素蛋白分别加入到100ml的2%的乙酸水溶液中形成溶液,再将三者混合得到混合溶液;然后将0.4g凝血酶添加至溶液中。
(2)将步骤1中得到的中间层固定于接收装置上,在一侧进行静电纺丝。静电纺丝的参数为调节微量注射泵的速率为10毫升/小时,调节高压发生器的电压为15~45kV,调节接收装置的接收距离为35.0厘米,调节电纺针头的移动速度1厘米/秒。
步骤3:制备凝血酶层的方法为:
将1g凝血酶溶解在PBS中,配置质量浓度为8mg/mL的凝血酶溶液,在凝胶层的另一侧反复涂上凝血酶溶液,静置干燥45分钟。即得到该止血海绵。
对比例1
依照CN104623722A的实施例1制备止血海绵,作为对比例1。
对比例2
依照CN106620824A的实施例1制备止血海绵,作为对比例2。
对本发明的海绵样品进行了如下测试:
1、促凝血试验
通过对实施例1~3得到的海绵样品和对比例1和2进行了促凝血试验。
测试溶液使用加抗凝剂柠檬酸钠的新鲜兔血,模拟人体伤口渗出的血液,其由新鲜兔血添加10%柠檬酸钠搅拌均匀配制而成。
测试方法为取5支试管分别加入1ml测试溶液,在37℃恒温水浴中加热1h,分别加入实施例1~3和对比例1-2得到的海绵样品碎片80mg,继续恒温加热,每隔半分钟转动一次试管,直至试管中的血液不流动为止,分别记录各组试管中兔血的凝固时间。
表1:促凝血试验结果
组号 | 促凝血时间(min) |
实施例1 | 1.32 |
实施例2 | 1.29 |
实施例3 | 1.27 |
对比例1 | 2.12 |
对比例2 | 1.64 |
由上表可知,本发明的复合止血海绵材料具有快速止血的性能,且相比对比例的止血效果更好。
2、吸湿性实验
测试溶液使用英国药典中测试海藻酸医用敷料吸湿性能指定的标准测试液,这种溶液模拟了伤口渗出液中的钙离子和钠离子的含量,由含2.5mmol/L的CaCl2·2H2O和142mmol/L的NaCl水溶液配制而成。使用的模拟液由8.3gNaCl、0.277gCaCl2稀释至1L后配制。
测试方法按照英国药典为海藻酸医用敷料所制定的方法。将海绵样品剪切成5cm×5cm尺寸,测定其干重为W克。将海绵样品置于其干重60倍的模拟溶液中,在37℃条件下放置30min,将吸湿后的海绵样品悬空30s后测量其湿重(w1)。则单位重量海绵样品的吸湿性=(W1-W)/W g·g-1,而单位面积的吸湿性=4(W1-W)g·100cm-2。吸湿性能结果如表2所示。
表2:吸湿性能的测试结果
单位重量海绵的吸湿性 | 单位面积海绵的吸湿性 | |
实施例1 | 30.54 | 0.496 |
实施例2 | 29.32 | 0.487 |
实施例3 | 28.67 | 0.479 |
对比例1 | 24.32 | 0.378 |
对比例2 | 23.41 | 0.363 |
由吸湿性实验可见,本发明的复合止血海绵材料具有优异的吸湿性能,且相比对比例的吸湿性能更好。
3、抗菌实验
采用振荡法对制得的止血海绵进行抗菌试验,通过对含有止血海绵的溶液在振荡前和振荡18h后的金黄色葡萄球菌浓度进行分别测定,并以此计算抑菌率,用于表征制得的盆底补片的抗菌性能。实施例1-3的止血海绵在不同时间的抑菌率见表3所示。
表3:止血海绵的抗菌性能
由表3可见,本发明的海绵均具有良好的抗菌性能。
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
还需要说明的是,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、商品或者设备不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、商品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下,由语句“包括一个……”限定的要素,并不排除在包括要素的过程、方法、商品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上仅为本申请的实施例而已,并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说,本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本申请的权利要求范围之内。
Claims (1)
1.一种妇科用抗菌止血海绵的制备方法,其特征在于该止血海绵由三层组成:内层为凝血酶涂层;中间层由胶原蛋白、海藻酸钠和抗菌肽通过交联剂谷氨酰胺转氨酶交联后,与负载有凝血酶的壳聚糖微球混合,再通过两步冷冻干燥制得,外层为由聚己内酯、壳聚糖、凝血酶和柞蚕丝素蛋白构成的静电纺丝层;其中中间层中胶原蛋白、海藻酸钠、含凝血酶的壳聚糖微球和抗菌肽的质量比为(30-40):(60-70):(30-50):(3-5);外层中聚己内酯、壳聚糖、凝血酶和柞蚕丝素蛋白的质量比为(40-50):(30-40):(3-5):(10-30);
该方法包括如下步骤:
步骤1:制备中间层,包括如下步骤:
(1)将胶原蛋白和海藻酸钠分别制成胶原蛋白和海藻酸钠溶液,混匀得到混合溶液,将抗菌肽和谷氨酰胺转氨酶依次加入混合溶液中,混匀,静置40-60分钟;
(2)制备负载有凝血酶的壳聚糖微球:将表面活性剂、酶稳定剂和溶剂混合,加入壳聚糖溶液,混合后,加入京尼平和凝血酶,离心、清洗冷冻干燥,其中表面活性剂为聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯和/或失水山梨醇脂肪酸酯;
(3)将负载有凝血酶的壳聚糖微球加入第(1)步最终的混合溶液中,搅拌均匀;
(4)将混合溶液进行分步冷冻干燥,先在-30℃下预冻12小时,再将其放置于-80℃的冰箱中冷冻6-8小时,最后将其放入真空冷冻干燥箱中48小时冷冻干燥,得到中间层;
步骤2:在中间层一侧制备静电纺丝层,包括如下步骤:
(1)制备静电纺丝溶液:聚己内酯、壳聚糖和柞蚕丝素蛋白加入到1%-2%的乙酸水溶液中形成混合溶液;然后将凝血酶添加至溶液中;
(2)将步骤1中得到的中间层固定于接收装置上,在一侧进行静电纺丝, 静电纺丝的参数为调节微量注射泵的速率为10~12毫升/小时,调节高压发生器的电压为15~45kV,调节接收装置的接收距离为35.0~40.0厘米,调节电纺针头的移动速度1~20厘米/秒,接收辊转速为1500~1800圈/分;
步骤3:在中间层的另一侧制备凝血酶层,制备方法为将凝血酶溶解在PBS溶液中,配置质量浓度为5-8mg/mL的凝血酶溶液,在中间层的另一侧涂上凝血酶溶液,静置干燥40-50分钟。
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