ES2314664T3 - Procedimiento para estabilizar reactivos de ensayo, recipiente de reactivos con reactivos de ensayo estabilizados y su utilizacion. - Google Patents
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Abstract
Recipiente de reactivos para la detección y/o cuantificación de por lo menos un analito biológico o químico a partir de una muestra, comprendiendo dicho recipiente de reactivos una superficie interna que encierra un volumen, en el que tienen lugar las reacciones analíticas del volumen de por lo menos un análisis para la detección y/o cuantificación de por lo menos un analito, y por lo menos dos reactivos de un análisis de un analito han sido secados sobre dicha superficie interior y por lo menos un primer dicho reactivo ha sido secado sobre una primera zona de la superficie interior separada de manera clara, es decir, sin ningún solapamiento, de una segunda zona de la superficie interna, sobre la que ha sido secado por lo menos un segundo dicho reactivo, caracterizado porque el primer reactivo y el segundo reactivo forman un par en el que el primer reactivo es una enzima y el segundo reactivo es un sustrato de dicha enzima, y dicho par está constituido por una polimerasa de ácido nucleico y su sustrato.
Description
Procedimiento para estabilizar reactivos de
ensayo, recipiente de reactivos con reactivos de ensayo
estabilizados y su utilización.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para estabilizar reactivos de detección química y
biológica en forma seca.
Los procedimientos analíticos in vitro
que permiten la detección de moléculas analitos específicas -
moléculas pequeñas, electrólitos, proteínas, lípidos, hidratos de
carbono o ácidos nucleicos - o incluso microorganismos tales como
bacterias, virus hongos u organismos protozoarios, son esenciales
para la moderna medicina humana y veterinaria, el control del
entorno, el control de la seguridad alimentaria y todos los otros
campos de investigación biológica. En muchas técnicas analíticas,
la detección está por lo menos basada parcialmente en la
amplificación de ácidos nucleicos. Los ejemplos de técnicas de
amplificación de ácidos nucleicos incluyen pero no se limitan a la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki et al,
1985), la amplificación basada en la secuencia ácido nucleica
(NASBA) (Compton, 1991), la PCR de transcripción inversa y la PCR en
tiempo real (Higuchi et al, 1992 y 1993). Mientras que las
técnicas de amplificación de ácidos nucleicos se utilizan para
detectar analitos de ácidos nucleicos, existen técnicas que combinan
un ensayo ácido nucleico y un ensayo diferente de unión al ligando.
En dichos procedimientos combinatorios, la amplificación del ácido
nucleico se utiliza en la detección de una molécula tal como una
proteína u otra molécula no ácido nucleica. Los ejemplos de
procedimientos de combinación que incluyen una etapa de
amplificación ácido nucleica incluyen la reacción en cadena de la
inmunopolimerasa (Niemeyer et al., 2005), y el ensayo de
proximidad de unión (Fredriksson et al., 2002).
Los ensayos analíticos en general pueden ser
heterogéneos, lo que significa que por lo menos uno de los
componentes del ensayo se une a un soporte sólido y por lo menos,
uno de los componentes del ensayo está en solución, u homogéneo, lo
que significa que todos los componentes del ensayo están en
solución.
Dichas técnicas analíticas requieren a menudo
varias etapas de pipeteo para combinar un conjunto de reactivos de
detección con las muestras. Estas etapas de pipeteo, si se llevan a
cabo manualmente, constituyen un origen importante de errores
analíticos, especialmente en el caso de ensayos en los que pequeñas
variaciones en las concentraciones de los componentes del ensayo
provoquen errores significativos (tales como inmunoensayos
competitivos) y requieran una cantidad considerable de tiempo
manual. Si las etapas de pipeteo están automatizadas, como ocurre a
menudo, los errores que se deben a acciones humanas, así como la
cantidad de manipulaciones manuales pueden minimizarse pero, por
otra parte, es necesario un costoso equipo para el manejo de
líquidos. Para llevar a cabo técnicas analíticas que presenten una
etapa en la que una muestra se combina con un equipo de reactivos
de detección, más simples, rápidos, más fidedignos y que pueden
aplicarse incluso fuera del entorno de un laboratorio
especializado, es posible dispensar previamente los reactivos de
detección a un recipiente, después de lo cual el agua en exceso se
elimina y los reactivos se guardan de forma seca. El recipiente de
reactivos secos actuará subsiguientemente también como un
recipiente de reacción. De este modo, la realización del ensayo
requiere una etapas mínimas de manipulación de líquidos:sólo es
necesario añadir una muestra en un volumen apropiado de líquido
apropiado a un recipiente que contiene ya los reactivos secos para
la detección. Después de la adición de la muestra, los reactivos
secos se aplican a, por ejemplo, inmunoensayos (Lövgren et
al., 1996) y ensayos PCR (Nurmi et al., 2001).
Muchos reactivos químicos y biológicos son
estables cuando están secos. Sin embargo, un problema al que se
hace frente a menudo es que la composición de los reactivos de
detección, cuando están secos en una muestra, es inestable, incluso
en el caso de que todos los componentes, cuando están secos
individualmente, fueran estables. Esta inestabilidad puede, por
ejemplo, estar causada por uno o varios de los reactivos que actúan
sobre uno o varios de los otros reactivos durante el secado o el
almacenamiento, de forma que afecte adversamente a la estabilidad
de los reactivos. Una manera de superar este problema es situar una
capa aislante entre los distintos reactivos y prevenir de este modo
cualesquiera reacciones adversas que puedan tener lugar entre los
distintos componentes de los ensayos. Este tipo de enfoque se ha
descrito en la técnica anterior (patente WO9738311, Lövgren et
al. 1996). Separando por lo menos uno de los reactivos que
intervienen en las reacciones no deseadas, la mezcla reactiva puede
estabilizarse. Sin embargo, este enfoque requiere la adición de una
capa aislante, que introduce algunos problemas en el proceso de
preparación. En primer lugar, el reactivo que se añade después de
la capa aislante debe dispensarse en un volumen tan pequeño como sea
posible, para evitar la disolución de la capa aislante. La
dispensación de un volumen pequeño tiende completamente a la
variación, de forma que, como resultado, el error del ensayo
analítico puede aumentar. Además, en algunas aplicaciones, puede
ser imposible encontrar una composición apropiada para una capa
aislante, ya que algunos de los componentes de la capa aislante en
sí misma puede afectar adversamente al ensayo de detección. Así, la
producción de reactivos secos sería más simple, menos proclive al
error y posible más a menudo, si no se requiriera una capa de
aislamiento. Otro problema relacionado con los problemas del ensayo
seco, es el procedimiento para secar en sí mismo:habitualmente, se
utiliza la liofilización. La liofilización, sin embargo, constituye
un procedimiento que se solicita técnicamente más que el secado por
aire, y sería ventajoso contar con una forma de estabilizar los
reactivos para ensayos, de forma que pudiera utilizarse, en vez de
la liofilización, el secado por aire para eliminar el agua en
exceso de las mezclas reactivas.
La patente FR 2 674 253 da a conocer una
composición que comprende los reactivos para una reacción de
amplificación y la polimerasa, pero también indica que resulta
preferido no incluir la polimerasa en los reactivos secos cuando se
utilice la Taq polimerasa.
En algunos ensayos que incluyen una etapa de
amplificación ácido nucleica utilizando una polimerasa del ácido
nucleico, es posible secar los reactivos como una mezcla sin que se
presente ninguna reacción indeseada. Un ejemplo de un ensayo
funcional completo en el que todos los reactivos se secan como una
mezcla, se ha publicado, por ejemplo, por Nurmi et al
(2001). Sin embargo, en otros casos, algunas polimerasas de ácidos
nucleicos muestran reacciones no deseadas o son inestables cuando
se secan junto con otros reactivos de ensayo. Para resolver este
problema, es necesario un procedimiento que permita la
estabilización de dichas mezclas reactivas.
Un objetivo de la presente invención consiste en
proporcionar un recipiente de reactivos con reactivos estabilizados
para ensayos que utilizan la polimerasa ácido nucleica como un
reactivo.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en proporcionar un procedimiento para estabilizar reactivos
químicos o biológicos para la detección y/o cuantificación de
analitos biológicos o químicos para ensayos que utilizan la
polimerasa ácido nucleica como un reactivo.
Todavía otro objetivo de la presente invención
consiste en proporcionar la utilización de un recipiente de
reactivos con reactivos estabilizados, en ensayos que utilicen la
polimerasa ácido nucleica como un reactivo.
La presente invención proporciona un recipiente
de reactivos para la detección y/o cuantificación de por lo menos
un analito biológico o químico a partir de una muestra,
comprendiendo dicho recipiente de reactivos una superficie interna
que encierra un volumen, en el cual volumen tienen lugar reacciones
analíticas de por lo menos, un análisis para la detección y/o
cuantificación de por lo menos, un analito, y por lo menos dos
reactivos de un análisis de un analito se secaron sobre dicha
superficie interior secándose dicho primer reactivo, por lo menos,
sobre una primera zona de la superficie interior separada de manera
clara, es decir, sin ningún solapamiento, de una segunda zona de la
superficie interna, sobre la cual se secó, por lo menos, dicho
segundo reactivo. Resulta característico para el recipiente de
reactivos es que el primer reactivo y el segundo reactivo forman
una pareja en la que el primer reactivo es una enzima y el segundo
reactivo es un sustrato de dicha enzima, estando formado dicho par
por una polimerasa de ácido nucleico y su sustrato.
La presente invención proporciona asimismo un
procedimiento para estabilizar sobre una superficie interna de un
recipiente de reactivos, reactivos secos para ensayo, para la
detección y/o cuantificación de un analito biológico o químico a
partir de una muestra, comprendiendo dicho procedimiento las etapas
que consisten en:
- a)
- dispensar por lo menos dos reactivos, un primer reactivo y un segundo reactivo, necesarios en la detección del analito, sobre la superficie interna del recipiente de reactivos, y
- b)
- eliminar el agua en exceso de los reactivos,
en el que en la etapa a), el primer reactivo se
dispensa sobre una primera zona de la superficie interna separada
de manera clara, es decir, sin ningún solapamiento, de una segunda
zona de la superficie interna, sobre la cual se dispensa el segundo
reactivo. Resulta característico del procedimiento, es que el primer
reactivo y el segundo reactivo forman una pareja en la que el
primer reactivo es una enzima y el segundo reactivo es un sustrato
de dicha enzima, y dicha pareja está constituida por una polimerasa
de ácido nucleico y su sustrato.
La presente invención proporciona además la
utilización del recipiente de reactivos según la invención, para
llevar a cabo un ensayo seleccionado de entre el grupo constituido
por un ensayo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), un
ensayo que utiliza una transcriptasa inversa, una reacción en cadena
de la polimerasa transcriptasa inversa, un ensayo
inmuno-PCR, un ensayo basado en una secuencia ácido
nucleica (NASBA), un ensayo de proximidad de unión, un ensayo de la
reacción en cadena de la ligasa (LCR), un ensayo de amplificación
por círculo rodante (RCA), y un ensayo de amplificación del
desplazamiento de hebra (SDA).
La Figura 1 representa la inestabilidad de los
reactivos PCR cuando se secaron como una mezcla.
La Figura 2 representa la estabilidad de
reactivos PCR cuando se secaron separando la ADN polimerasa del
resto de los reactivos del ensayo.
La Figura 3 representa la estabilidad de los
reactivos secos de síntesis del cADN, cuando se secaron
conjuntamente o separando la transcriptasa inversa, comparados con
los reactivos líquidos.
El término recipiente de reactivos tal como se
utiliza en la presente memoria, se refiere a un recipiente en el
que se guardan reactivos. En el contexto de la presente invención,
el recipiente de reactivos comprende un volumen que puede funcionar
como una cámara reactiva. Típicamente, los reactivos son
dispensados, secados y almacenados en el recipiente de reactivos
que, subsiguientemente, puede actuar como un recipiente en el que
tiene lugar una reacción analítica.
El término analito tal como se utiliza en la
presente memoria se refiere a cualquier sustancia u organismo
viviente, o a parte de un organismo muerto o viviente, o a un virus
o a parte de un virus, cuya presencia o cuantía es para su medición
en una muestra de cualquier tipo.
El término muestra que se utiliza en la presente
memoria se refiere a cualquier parte que se tome de lo que vaya a
ser analizado. Puede hacer referencia asimismo a dicha parte ya
diluida en un diluyente en una proporción conocida, típicamente un
tampón o disolvente, tal como agua.
El término reactivo tal como se utiliza en la
presente memoria se refiere a cualquier sustancia individual o
composición de distintas sustancias que es necesaria para determinar
la presencia y/o la cuantía de un analito en una muestra.
El término enzima tal como se utiliza en la
presente memoria se refiere a cualquier fracción química que puede
catalizar una reacción química. Una enzima es típicamente una
proteína, formada en un organismo vivo o sintético, que actúa como
un catalizador.
El término sustrato de una enzima tal como se
utiliza en la presente memoria, se refiere a una sustancia que
puede, en condiciones apropiadas, constituir un reaccionante de una
reacción química catalizada por la enzima. En un ensayo, un
sustrato puede ser un analito y/o un reactivo.
El término polimerasa de ácido nucleico, tal
como se utiliza en la presente memoria, se refiere a cualquier
fracción química que puede catalizar la síntesis o degradación de
ácidos nucleicos o de derivados de ácidos nucleicos. Los ejemplos
de dichas polimerasas de ácidos nucleicos incluyen pero no se
limitan a ADN polimerasas, transcriptasa inversa, ARN polimerasa,
ADN ligasa y ARN ligasa.
El término agente de unión tal como se utiliza
en la presente memoria se refiere a cualquier molécula que puede
formar por lo menos un enlace covalente o no, con una segunda
molécula.
Los ejemplos de agentes de unión incluyen pero
no se limitan a inmunoglobulinas y sus derivados, tales como
anticuerpos recombinantes, fragmentos Fab y scFv; agentes de unión
ácido nucleicos, tales como ácidos nucleicos y derivados de ácidos
nucleicos y aptámeros y ADNzimas y ribozimas; y proteínas que pueden
unir ligandos específicos.
El término ligando tal como se utiliza en la
presente memoria se refiere a cualquier molécula que puede formar
por lo menos un enlace covalente o no, con un agente de unión. Un
ligando puede presentarse de forma natural o ser sintético. En un
ensayo, un ligando puede ser el analito y/o un reactivo necesario en
la detección de un analito.
El término transcriptasa inversa, tal como se
utiliza en la presente memoria, se refiere a cualquier fracción
química capaz de catalizar la síntesis del ácido desoxiribonucleico
utilizando ácido ribonucleico o ácido desoxiribonucleico como
matriz.
La expresión eliminación de agua en exceso, tal
como se utiliza en la presente memoria, se refiere a cualquier
procedimiento para reducir la cantidad de agua en el interior de un
recipiente de reactivos. Como apreciará el experto en la materia,
existen diversas formas de reducir la cantidad de agua.
Preferentemente, el agua en exceso se elimina mediante secado por
aire. Los ejemplos de otros procedimientos apropiados incluyen,
pero no se limitan, al secado al vacío, secado térmico y
liofilización.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para estabilizar reactivos de detección química y
biológica, de una forma seca, procediendo a dispensar los reactivos
a, por lo menos, dos zonas separadas espacialmente en el interior
del mismo espacio recipiente reactivo antes de secar los reactivos,
separando así físicamente uno o varios de los reactivos del resto
de ellos sin utilizar una capa aislante entre las zonas.
Debe considerarse que un recipiente de reactivos
según la invención puede comprender más de dos zonas separadas de
manera clara, en las que los reactivos se han secado. De este modo,
el recipiente de reactivos puede, por ejemplo, comprender una
tercera, cuarta o incluso 21ª zonas separadas distintamente en las
que los reactivos se han secado. Dichas formas de realización que
contienen más de una zona sobre las que se han secado los
reactivos, resultan preferidas si más de dos reactivos tienen que
mantenerse separados de otros, para que sea seguro que los
reactivos son estables durante el secado y/o el almacenamiento.
Según una forma de realización típica de la
presente invención, los reactivos del ensayo incluyen por lo menos
una enzima, es decir, una polimerasa ácido nucleica. Los ejemplos de
enzimas apropiadas que pueden incluirse son, pero no se limitan a
oxidoreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, ligasas. Por
ejemplo, la composición de los reactivos del ensayo puede ser
apropiada para llevar a cabo un ensayo cualitativo o cuantitativo
para un analito que es:
- a)
- un reaccionante en,
- b)
- un inhibidor de,
- c)
- un activador de, o
- d)
- proteína, o
- e)
- una enzima que puede catalizar
una reacción química que tiene lugar después de
combinar una muestra que contiene dicho analito con la composición
de los reactivos del ensayo. Para estabilizar la composición de
dichos reactivos del ensayo de una forma seca, puede separarse una
enzima, por lo menos, de uno de los otros reactivos del ensayo, por
lo menos, de uno de los otros reactivos del ensayo que constituyen,
en una forma de realización preferida, un sustrato de la enzima.
Según otra forma de realización típica de la
presente invención, los reactivos del ensayo incluyen, por lo
menos, un sustrato para una enzima, es decir, una polimerasa de
ácido nucleico. Sustratos preferidos incluyen pero no se limitan a
ácidos nucleicos y sus derivados, ribonucleótidos,
desoxiribonucleótidos, péptidos, aminoácidos, hidratos de carbono,
lípidos, iones, moléculas orgánicas, moléculas inorgánicas,
sustratos fluorogénicos, sustratos cromogénicos.
Por ejemplo, la composición de los reactivos del
ensayo pueden ser apropiada para llevar a cabo un ensayo
cualitativo o cuantitativo para un analito que es:
- a)
- un reaccionante en, o
- b)
- un inhibidor de, o
- c)
- un activador de, o
- d)
- proteína, o
- e)
- una enzima que puede catalizar
una reacción química que tiene lugar como
resultado de combinar una muestra que contiene dicho analito con la
composición de los reactivos del ensayo. Para estabilizar la
composición de dichos reactivos del ensayo de una forma seca, puede
separarse un sustrato para una enzima, a partir, por lo menos, de
uno de los otros reactivos del ensayo, siendo, por lo menos, uno de
los otros reactivos del ensayo, en una forma de realización
preferente, una enzima capaz de actuar sobre dicho sustrato.
En todas las formas de realización de la
invención, por lo menos, un primer reactivo, y un segundo reactivo,
forman un par, en el que el primer reactivo es una enzima y el
segundo reactivo es sustrato de dicha enzima, estando formada la
pareja por una polimerasa de ácido nucleico y su sustrato. Los
sustratos típicos son ácidos nucleicos o sus derivados, es decir,
cualquier molécula que contenga ácido nucleico tal como el ácido
desoxiribonucleico o el ácido ribonucleico, así como cualquier
sustancia sintética o que se encuentre naturalmente que esté
relacionada estructuralmente con los ácidos nucleicos.
Los ejemplos de derivados sintéticos de ácidos
nucleicos incluyen pero no se limitan a ácido nucleico bloqueado
(LNA), ácido nucleico peptídico (PNA), ácidos fosforotioato
nucleicos, ácidos nucleicos conjugados covalente o no
covalentemente a, por lo menos, una molécula orgánica o inorgánica,
así como moléculas quiméricas que comprenden monómeros de ácidos
nucleicos que se presentan de forma natural, y monómeros de
derivados de ácidos nucleicos.
Según todas las formas de realización de la
presente invención, los reactivos del ensayo incluyen una polimerasa
de ácido nucleico, apropiadamente una ADN polimerasa termoestable o
una ARN polimerasa termoestable. Por ejemplo, es posible que la
composición de los reactivos del ensayo sea tal que pueda ser
utilizada para llevar a cabo una reacción de amplificación del
ácido nucleico, por ejemplo la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). En tal caso, se puede estabilizar la composición de
reactivos del ensayo dispensando la ADN polimerasa en una zona
separada de, por lo menos, algunas de las otras zonas necesarias
para realizar la reacción de amplificación del ácido nucleico
(véase la sección experimental).
Según las formas de realización preferidas de la
presente invención, los reactivos del ensayo incluyen ácidos
nucleicos o sus derivados, apropiadamente oligonucleótidos. Por
ejemplo, es posible que la composición de los reactivos del ensayo
incluya oligonucleótidos marcados y/o no, que se estabilizan de la
degradación mediante una enzima que también se encuentra en la
composición de los reactivos de ensayo, mediante separación física
de la enzima. Si la composición de reactivos es apropiada para
llevar a cabo la PCR, por ejemplo, entonces los reactivos del
ensayo pueden estabilizarse separando físicamente los reactivos
ácido nucleicos del ensayo del resto de los reactivos de éste, tal
como se describe en la presente invención. El procedimiento puede
aplicarse asimismo para estabilizar los reactivos que son necesarios
para llevar a cabo otras reacciones de amplificación ácido
nucleicas, que incluyen pero no se limitan a la PCR transcriptasa
inversa, a la amplificación basada en la secuencia ácido nucleica
(NASBA), a la amplificación de desplazamiento del filamento (SDA), a
la reacción en cadena de la ligasa (LCR) o a la amplificación
continuada en círculo (RCA).
En una forma de realización preferida de la
invención, el primer reactivo es una transcriptasa inversa. Por
ejemplo, la composición de los reactivos del ensayo puede ser
apropiada para llevar a cabo una reacción de síntesis del cADN o
una reacción PCR de transcripción inversa (RT-PCR).
En tal caso, la composición de los reactivos del ensayo puede
estabilizarse de forma seca separando físicamente la transcriptasa
inversa de, por lo menos, uno de los otros reactivos del
ensayo.
El recipiente de reactivos puede comprender más
de un par de reactivos, estando formado cada par por un primer y un
segundo reactivo que se utiliza en la detección de un analito
químico y/o biológico, habiéndose secado el primer reactivo de cada
par en una primera zona para dicho par de la superficie interna
separada distintamente, es decir, sin ningún solapamiento, de una
segunda zona para dicho par de la superficie interna, sobre la que
se ha secado el segundo reactivo del par.
Debe considerarse que la primera zona y/o la
segunda zona de cualquier par de reactivos, no necesitan ser la
primera zona y/o la segunda zona de cualquier otro par de reactivos,
aunque lo puedan ser. Cualquier primera o segunda zona de un par
puede ser una primera o segunda zona de otro par. Es, sin embargo
esencial para la invención, que reactivos que puedan interferirse,
(es decir, reactivos cuya estabilidad esté esencialmente
comprometida durante el secado y/o el almacenamiento si se
encuentran en la misma zona), no estén en la misma zona.
El recipiente de reactivos puede ser para la
detección de más de un analito químico y/o biológico, y el
recipiente de reactivos puede comprender uno o más pares de
reactivos, estando formado cada par por un primer y un segundo
reactivo, para detectar y/o cuantificar un analito químico y/o
biológico, el mismo o distinto para cada par, pudiéndose secar el
primer reactivo de cada par en una primera zona para dicho par de la
superficie interna separada distintamente, es decir, sin ningún
solapamiento, de una segunda zona para cada par de la superficie
interna, en la cual se puede secar el segundo reactivo del mismo
par.
Según algunas formas de realización de la
invención, otro primer reactivo es un agente de unión y otro segundo
reactivo es un ligando de dicho agente de unión.
En otras formas de realización de la invención
con varios pares de reactivos, otro primer reactivo puede ser un
anticuerpo. Por ejemplo, la composición de reactivos del ensayo
puede ser apropiada para llevar a cabo una reacción de
inmunoensayo, de forma apropiada, un inmunoensayo competitivo o no
competitivo. En tal caso, la composición de reactivos del ensayo
puede estabilizarse de una forma seca separando físicamente, por lo
menos, uno de los componentes del ensayo, del resto de los
componentes del ensayo. Por ejemplo, se puede separar un anticuerpo
marcado o un ligando marcado de un anticuerpo de, por lo menos, uno
de los otros reactivos del ensayo que son necesarios para realizar
éste. Por ejemplo, la separación de un anticuerpo de un ligando
marcado evita la formación de complejos
anticuerpo-ligando antes de la adición de una
muestra, lo que comprometería la realización de un inmunoensayo
competitivo. Asimismo, la separación de un anticuerpo marcado o no,
del resto de los reactivos en un inmunoensayo competi-
tivo o no, puede reducir la señal de fondo medida en el ensayo, mejorando de este modo la sensibilidad del mismo.
tivo o no, puede reducir la señal de fondo medida en el ensayo, mejorando de este modo la sensibilidad del mismo.
En las formas de realización preferidas, todos
los reactivos del análisis de cada analito, excluyendo la muestra y
opcionalmente el tampón, se secaron en la superficie interna del
recipiente de reactivos.
Las zonas que están distintamente separadas, en
las que los reactivos se han secado, son típicamente puntos con un
diámetro de 1 \mum a 2 cm, preferentemente de 0,1
mm a 5 mm.
Muchas de las formas de realización típicas del
procedimiento de la presente invención, corresponden a las del
recipiente de reactivos, tal como se han dado a conocer
anteriormente.
En una forma de realización preferida del
procedimiento de la presente invención, el agua en exceso se elimina
mediante secado por aire o liofilización en la etapa b) del
procedimiento.
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Ejemplo
1
Se preparó un ensayo PCR para Bacillus
subtilis en un tubo de ensayo cerrado. La Tabla 1 muestra las
secuencias y modificaciones de todos los cebadores (SEC ID nºs: 1 y
2) y sondas (SEC ID nºs: 3 y 4) oligonucleótidos. La química del
ensayo PCR, que se basa en la utilización de sondas marcadas con
lantánidos, se ha descrito en Nurmi et al (2002). Todas las
amplificaciones PCR se llevaron a cabo en un volumen de 30 \mul
que contenía 1 X Tampón Taq HotMaster (Eppendorf, Alemania);2,5 mM
MgCl_{2}; 0,2 mM dNTPs; 0,3 MM cebadores hacia adelante e
inversos; sonda marcada con 28 nM lantánidos; sonda extintora 280
nM y 1,25 unidades de polimerasa Taq Hotmaster (Eppendorf,
Alemania).
Para preparar pocillos secos PCR, mezclas PCR
que contenían todos los otros reactivos PCR, excepto ADN matriz, se
prepararon y dispensaron a pocillos reactivos de plástico. Para
investigar el efecto estabilizante de la separación de la ADN
polimerasa de los otros componentes del ensayo, se prepararon
también mezclas reactivas que contenían todos los otros
componentes del ensayo, excepto la ADN polimerasa y el ADN matriz.
Las mezclas que no contenían ADN polimerasa se dispensaron a un
pocillo reactivo de plástico y, en un lugar distinto en el mismo
pocillo, se dispensó la ADN polimerasa en un volumen de 0,3 \mul,
de tal forma que el líquido que contenía la polimerasa no estaba en
contacto con el resto de los reactivos. El agua en exceso se
eliminó de todos los pocillos mediante secado al aire a temperatura
ambiente.
Para demostrar la estabilidad de los reactivos
secos PCR, se ensayó su cumplimiento añadiendo un ADN matriz en un
volumen de 30 \mul de agua estéril. Después de añadir la muestra,
los reactivos secos del ensayo se disolvieron, por lo tanto.
Después de precintar los pocillos reactivos, se sometieron a un
protocolo de ciclado térmico que consistió en 43 ciclos de 15
segundos a 95ºC; 1 minuto a 60ºC; y 15 segundos a 55ºC. Las
amplificaciones se controlaron midiendo el tiempo de resolución de
la fluorescencia del europio a baja temperatura (55ºC) en ciclos
PCR seleccionados, tal como se describe por Nurmi et al
(2002). Se calcularon las relaciones
señal-a-ruido para la totalidad de
las mediciones de la fluorescencia del europio, dividiendo cada
señal del europio por una señal promedio del europio obtenida a
partir del mismo pocillo PCR en las tres primeras mediciones.
La Figura 1 muestra la inestabilidad de los
reactivos PCR secados como una mezcla. La figura muestra las
proporciones señal-ruido del europio (sobre el eje
y), que se obtuvieron en los ciclos 21-43 (sobre el
eje x), medidas a partir de las reacciones PCR que se prepararon
utilizando reactivos presecados PCR, que se habían secado como
mezclas que contenían todos los componentes PCR, incluyendo la ADN
polimerasa. PTC 1 (triángulos rellenos) y PTC 2 (rombos rellenos)
denotan reacciones positivas de control, en las que se añadió como
matriz ADN de Bacillus subtilis. NTC 1 (triángulos abiertos)
y NTC 2 (rombos abiertos) denotan reacciones negativas de control,
en las que se añadió agua pura en vez del ADN matriz. Las reacciones
positivas de control dieron lugar a gráficas de amplificación que
no fueron distintas de las obtenidas para las reacciones negativas
de control: no existe señal amplificadora, indicando que los
reactivos PCR secados como una mezcla que contiene todos los
componentes PCR incluyendo la ADN polimerasa, no fueron
estables.
La Figura 2 muestra la estabilidad de los
reactivos PCR que se secaron separando la ADN polimerasa del resto
de los reactivos del ensayo. La figura muestra las relaciones
señal-ruido del europio (sobre el eje y) que se
obtuvieron en los ciclos 23-43 (sobre el eje x)
medidas a partir de las relaciones que se prepararon utilizando
reactivos presecados PCR, que se habían secado en dos puntos
separados, un primer punto que contenía la ADN polimerasa y uno
segundo, que contenía los nucleótidos, tampón, cebador y sonda
oligonucleótidos. PTC 3 (cuadrados rellenos) y PTC 4 (círculos
rellenos) denotan reacciones positivas de control, en las que se
añadió como matriz el ADN de Bacillus subtilis. NTC 3
(círculos abiertos) y NTC 4 (cuadrados abiertos) denotan reacciones
negativas de control, en las que se añadió agua pura en vez de ADN
matriz. Las reacciones positivas de control dieron lugar a gráficas
de amplificación que son claramente distintas de las gráficas
obtenidas para las reacciones negativas de control: existe una
clara señal amplificadora, que indica que los reactivos PCR, cuando
se secan como dos puntos separados, fueron estables.
Las Figuras 1 y 2 muestran el efecto de la
separación de la ADN polimerasa del resto de los reactivos PCR.
Cuando los reactivos del ensayo se secaron como una mezcla, las
mezclas no eran estables y no pudo detectarse una amplificación del
ADN diana (figura 1). Solamente se obtuvo una clara señal de
amplificación a partir de los pocillos reactivos en los que la ADN
polimerasa se separó del resto de los reactivos (figura 2). Esto se
explica probablemente por una reacción adversa catalizada por la ADN
polimerasa durante el secado. Ya al comienzo de la amplificación,
las señales absolutas de fluorescencia del europio obtenidas a
partir de las reacciones que se prepararon sin separación de la ADN
polimerasa, fueron significativamente más altas que en las
reacciones en las que la ADN polimerasa se había secado separada del
resto de los reactivos. Es por tanto, probable, que durante el
secado, la ADN polimerasa ejerciera una función adversa,
posiblemente un ataque nucleolítico, sobre uno o la totalidad de
los oligonucleótidos que se encontraban en la mezcla de reactivos.
Este tipo de comportamiento podría explicarse por el hecho de que
durante el secado, las concentraciones de todos los reactivos
aumentan hasta un nivel muy alto, antes de que el agua en exceso se
haya eliminado. A dichas altas concentraciones de la enzima,
nucleótidos, electrólitos y oligonucleótidos, pueden tener lugar
reacciones impredecibles.
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Ejemplo
2
Se llevaron a cabo reacciones de transcripción
inversa utilizando el Equipo Archivo del cADN de Alta Capacidad
(Applied Biosystems, USA) para transcribir inversamente una cantidad
constante (10.000 moléculas) de mmPSA, que es una especie de ARN
sintetizado in vitro (Nurmi et al., 2002). Como
controles negativos, se llevaron a cabo también reacciones que
contenían agua en vez del ARN matriz. Se prepararon y compararon
tres tipos de reacciones (a-c):
- a.
- Reacciones normales de síntesis de cADN (volumen de 10 \mul) que se prepararon y realizaron según las instrucciones proporcionadas por el fabricante.
- b.
- Reacciones químicas en seco, en las que todos los componentes reactivos, excepto el ARN matriz (tampón, dNTPs, cebadores oligonucleótidos de secuencia al azar y transcriptasa inversa) se predispensaron al fondo de un recipiente reactivo, eliminándose el agua en exceso mediante secado al aire. El ARN de la muestra se añadió en un volumen de 10 \mul de agua.
- c.
- Reacciones químicas en seco, que se prepararon y llevaron a cabo como anteriormente (b), excepto porque la transcriptasa inversa se dispensó y secó sobre una zona distinta en el fondo del recipiente reactivo, no existiendo solapamiento entre las zonas ocupadas por la trancriptasa inversa y el resto de los reactivos de síntesis del cADN (es decir, tampón, nucleótidos e cebadores oligonucleótidos secuenciales al azar)
Para analizar la eficiencia de la síntesis del
cADN en los distintos casos, muestras de cADN de 2,5 \mul
obtenidas de las tres formas diferentes que se han descrito
anteriormente, se analizaron en reacciones PCR en tiempo real. Las
reacciones de amplificación de 10 \mul consistieron en 1 X Tampón
HotMaster (Eppendorf, Alemania); 0,15 mM dNTPs; 0,075 \muM
cebadores hacia adelante e inversos; sonda marcada con 0,12 \muM
terbio, sonda extintora 1,2 \muM y 0,25 unidades de ADN polimerasa
Hotmaster (Eppendorf, Alemania). Las secuencias y modificaciones de
todos los oligonucleótidos sonda e cebadores se muestran en la
tabla 1 (Nurmi et al., 2002). Todas las reacciones PCR se
llevaron a cabo en un único experimento sobre Placas ópticas
MicroAmp precintadas con Tapas ópticas MicroAmp (Applied
Biosystems). La ciclación térmica (dispositivo PTC 200 ADN, MJ
Research, USA), consistió en los siguientes segmentos:10 ciclos de
desnaturalización a 95ºC durante 15 segundos, seguido por la
hibridización y alargamiento de los cebadores y la digestión de la
sonda a 63,5ºC durante 1 minuto; 8 ciclos de desnaturalización a
95ºC durante 15 segundos, seguido por la hibridización y
alargamiento de los cebadores y la digestión de la sonda a 61,5ºC
durante 1 minuto; 23 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante 15
segundos, seguido por la hibridización y alargamiento de los
cebadores y la digestión de la sonda a 61,5ºC durante 1 minuto. En
los ciclos 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 y 41 (es
decir, ciclos 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 y 23 del último
segmento), la temperatura se bajó a 35ºC durante 15 segundos
después de la etapa de hibridización/prolongación/digestión de la
sonda. A esta temperatura más baja, se obtuvieron las intensidades
de la fluorescencia del terbio resueltas en el tiempo de todas las
reacciones, utilizando un Contador Multimarcador Victor 1420
(PerkinElmer Life and Analytical Sciences, USA). Las relaciones
señal-ruido se calcularon para todas las mediciones
de la fluorescencia del terbio dividiendo cada señal del terbio por
la señal promedio del terbio obtenida a partir del mismo pocillo PCR
en las dos primeras mediciones (en los ciclos PCR 19 y 21).
La Figura 3 y la tabla 2 muestran cómo los
reactivos de la síntesis del cADN pueden ser estabilizados de forma
seca secando la transcriptasa inversa en una zona que está separada
del resto de los reactivos.
La Figura 3 muestra la estabilización de los
reactivos secos de la síntesis del cADN. La graficación de la
amplificación se generó utilizando como matriz PCR, cADN que se
sintetizó empezando a partir de 10.000 moléculas de mmPSA RNA
(símbolos abiertos) o, en reacciones negativas de control,
absolutamente no ARN matriz (símbolos cerrados). Se llevaron a cabo
tres tipos distintos de reacciones de síntesis del cADN: en a), se
llevó a cabo una síntesis normal del cADN, según las instrucciones
proporcionadas por el fabricante (círculos); en b), todos los
reactivos de la síntesis del cADN se secaron como una mezcla
(cuadrados), y en c), la enzima transcriptasa inversa y el resto de
los reactivos de la síntesis del cADN se secaron en zonas separadas
(rombos). Cada reacción de síntesis del cADN se llevó a cabo en
tres tubos de ensayo duplicados y cada muestra de cADN se analizó
en dos reacciones duplicadas de amplificación PCR; cada curva en la
figura representa las relaciones promedio
señal-ruido del terbio obtenidas a partir de las
seis amplificaciones PCR duplicadas. El blanco PCR (triángulos) fue
un control PCR negativo que contenía sólo agua como matriz y
representa el promedio de dos reacciones duplicadas. Como puede
apreciarse en la figura, la separación de la transcriptasa inversa
del resto de los reactivos (c) da lugar a resultados comparables
con el procedimiento de síntesis normal del cADN que utiliza
reactivos líquidos (a), mientras que si los reactivos se secan como
una mezcla (b), la eficiencia de la síntesis del cADN es muy
baja.
Las gráficas de amplificación de las reacciones
PCR que contienen como matrices los cADN obtenidos utilizando los
tres procedimientos distintos (a-c) que se han
descrito en (el apartado) materiales y métodos, se muestran en la
figura 3. Como puede apreciarse, el funcionamiento de los reactivos
secos, cuando son estabilizados dispensando la transcriptasa
inversa a una zona separada, es igual o casi igual a los reactivos
normales que no se secaron. En su lugar, si la mezcla reactiva se
seca sin separar la trancriptasa inversa del resto de los
reactivos, el rendimiento del ensayo cae de manera importante. En la
figura 3, esto es visible como la curva de amplificación, que
muestra la relación señal-ruido de la fluorescencia
del terbio en el eje y, y el número de ciclos de PCR en el eje x,
cruzando el valor 1,3 del umbral en un ciclo PCR mucho más tarde que
cuando los reactivos se estabilizan o cuando se utilizan reactivos
recientes.
La tabla 2 muestra los valores umbral de los
ciclos obtenidos utilizando mezclas de reactivos de cADN preparadas
de tres formas distintas. Cada reacción de síntesis de cADN se llevó
a cabo en tres tubos de ensayo duplicados y cada muestra de cADN se
analizó en dos reacciones de amplificación PCR duplicadas; para cada
caso, se muestra el valor promedio del umbral del ciclo obtenido a
partir de seis amplificaciones PCR-transcripción
inversa duplicadas. Los valores del umbral de ciclo (C_{t}), o
los números de ciclo PCR a los cuales las proporciones
señal-ruido de la fluorescencia cruzan el valor del
umbral, se muestran para las distintas reacciones. El valor C_{t}
está relacionado inversamente con el logaritmo en base diez del
número inicial de copias de la matriz en PCR; por tanto, cuanto
más alto era el umbral del ciclo, menos cADN se encontraba en el
recipiente PCR al comienzo de la amplificación. Por tanto, cuanto
más eficiente fue la síntesis del cADN, más bajo fue el valor
C_{t}. Puede apreciarse en la tabla 2 que la eficiencia de la
transcripción inversa fue la más alta cuando se utilizaron
reactivos recién preparados y casi tan alta cuando los reactivos se
estabilizaron secando la trancriptasa inversa en una zona separada
del resto de los reactivos;sin embargo, la eficiencia de la
síntesis del cADN es claramente inferior cuando todos los reactivos
se secaron como una mezcla. Esto puede explicarse, por ejemplo,
por la inactivación parcial de la transcriptasa inversa cuando se
secó conjuntamente con los otros reactivos de la síntesis del cADN,
o por las reacciones adversas catalizadas por la transcriptasa
inversa durante el secado. Está claro, por lo tanto, que el
procedimiento según la presente invención permite la conservación
de los reactivos de la síntesis del cADN de forma seca.
Las formas de realización que se describen son
ilustrativas y no limitativas.
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<110> Abacus Diagnostica Oy
\hskip1cmKorpimäki, Teemu
\hskip1cmLövgren, Timo
\hskip1cmNurmi, Jussi
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<120> Procedimiento para estabilizar
reactivos de ensayo, recipiente de reactivos con reactivos de ensayo
estabilizados y su utilización
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<130> AP101913
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<150> FI 20040768
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<151>
2004-06-04
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<160> 8
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<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> sonda
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<400> 1
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<210> 2
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> sonda extintora
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<400> 2
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> cebador
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> sonda
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<223> sonda extintora
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<221> base modificada
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<222> (17)..(17)
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<223> amino modificado
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\hskip1cmLövgren, Timo
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<120> Procedimiento para estabilizar
reactivos de ensayo, recipiente de reactivos con reactivos de
ensayo estabilizados y su utilización
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<130> AP102336
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<151>
2004-06-04
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<150> US 60/576,820
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<151>
2004-06-04
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<160> 8
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<170> PatentIn version 3.1
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<213> Secuencia artificial
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<223> sonda
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<212> ADN
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<223> sonda extintora
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<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> amino modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda extintora
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> amino modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
Claims (13)
1. Recipiente de reactivos para la detección y/o
cuantificación de por lo menos un analito biológico o químico a
partir de una muestra, comprendiendo dicho recipiente de reactivos
una superficie interna que encierra un volumen, en el que tienen
lugar las reacciones analíticas del volumen de por lo menos un
análisis para la detección y/o cuantificación de por lo menos un
analito, y por lo menos dos reactivos de un análisis de un analito
han sido secados sobre dicha superficie interior y por lo menos un
primer dicho reactivo ha sido secado sobre una primera zona de la
superficie interior separada de manera clara, es decir, sin ningún
solapamiento, de una segunda zona de la superficie interna, sobre
la que ha sido secado por lo menos un segundo dicho reactivo,
caracterizado porque el primer reactivo y el segundo reactivo
forman un par en el que el primer reactivo es una enzima y el
segundo reactivo es un sustrato de dicha enzima, y dicho par está
constituido por una polimerasa de ácido nucleico y su sustrato.
2. Recipiente de reactivos según la
reivindicación 1, caracterizado porque el primer reactivo es
una transcriptasa inversa.
3. Recipiente de reactivos según la
reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el recipiente de
reactivos comprende más de un par de reactivos, estando constituido
cada par por un primer y un segundo reactivo, de un analito químico
y/o biológico que se va a detectar, y el primer reactivo de cada par
se ha secado sobre una primera zona para dicho par, de la
superficie interior separada claramente, es decir sin solapamiento,
de una segunda zona para dicho par, de la superficie interna sobre
la que se secó el segundo reactivo del par.
4. Recipiente de reactivos según la
reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el recipiente de
reactivos es para la detección de más de un analito químico y/o
biológico y el recipiente de reactivos comprende uno o más pares de
reactivos, estando constituido cada par por un primer y un segundo
reactivo, para un analito biológico y/o químico, igual o diferente
para cada par, que debe ser detectado, y el primer reactivo de cada
par ha sido secado sobre una primera zona para dicho par, de la
superficie interna separada de manera clara, es decir, sin ningún
solapamiento, de una segunda zona para cada par, de la superficie
interna sobre la que el segundo reactivo del mismo par ha sido
secado.
5. Recipiente de reactivos según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque todos
los reactivos del análisis de cada analito, excluyendo la muestra y
opcionalmente el tampón, se secaron sobre la superficie interna del
recipiente de reactivos.
6. Recipiente de reactivos según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las
zonas separadas de manera clara en las que los reactivos se
secaron, son puntos con un diámetro de 1 \mum a 2 cm,
preferentemente de 0,1 mm a 5 mm.
7. Procedimiento para estabilizar sobre una
superficie interna de un recipiente de reactivos reactivos de
ensayo secos para la detección y/o cuantificación de un analito
biológico y/o químico a partir de una muestra, comprendiendo dicho
procedimiento las etapas que consiste en
- a)
- dispensar por lo menos dos reactivos, un primer y un segundo reactivos, que resultan necesarios en la detección del analito sobre la superficie interna del recipiente de reactivos, y
- b)
- eliminar el agua en exceso de los reactivos,
en el que en la etapa a) el primer reactivo se
dispensa sobre una primera zona de la superficie interna separada
de manera clara, es decir, sin ningún solapamiento, de una segunda
zona de la superficie interna sobre la que se dispensa el segundo
reactivo, caracterizado porque el primer reactivo y el
segundo reactivo forman un par en el que el primer reactivo es una
enzima y el segundo reactivo es un sustrato de dicha enzima, y
dicho par está constituido por una polimerasa ácido nucleica y su
sustrato.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque el primer reactivo es una transcriptasa
inversa.
9. Procedimiento según la reivindicación 7 u 8,
caracterizado porque el recipiente de reactivos comprende
más de un par de reactivos, estando cada par constituido por lo
menos por un primer y un segundo reactivo, de un analito químico
y/o biológico que debe ser detectado y en la etapa a) el primer
reactivo de cada par es dispensado sobre una primera zona para cada
par de la superficie interna separada de manera clara, es decir,
sin ningún solapamiento, de una segunda zona para cada par de la
superficie interna sobre la que se dispensa el segundo reactivo del
mismo par.
10. Procedimiento según la reivindicación 7 u 8,
caracterizado porque el recipiente de reactivos es para la
detección y/o cuantificación de más de un analito químico y/o
biológico, comprendiendo dicho recipiente de reactivos pares de
reactivos constituidos por lo menos por un primer y un segundo
reactivo para un analito químico y/o biológico, igual o diferente
para cada par, que debe ser detectado en la etapa a) el primer
reactivo de cada par se dispensa sobre una primera zona para cada
par de la superficie interna separada claramente, es decir, sin
ningún solapamiento, de una segunda zona para cada par de la
superficie interna sobre la que se dispensa el segundo reactivo del
mismo par.
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 10, caracterizado porque en la etapa a)
todos los reactivos del análisis del analito, o los análisis de
cada analito, excluyendo la muestra y opcionalmente un tampón, se
dispensan sobre la superficie interna del recipiente de
reactivos.
12. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 11, caracterizado porque en la etapa b)
el agua en exceso es eliminada mediante secado por aire o
liofilización.
13. Utilización del recipiente de reactivos
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para llevar a cabo
un ensayo seleccionado de entre el grupo constituido por un ensayo
de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), un ensayo que
utiliza una transcriptasa inversa, una reacción en cadena de la
polimerasa transcriptasa inversa, un ensayo
inmuno-PCR, un ensayo basado en una secuencia ácido
nucleica (NASBA), un ensayo de proximidad de unión, un ensayo de la
reacción en cadena de la ligasa (LCR), un ensayo de amplificación
por círculo rodante (RCA), y un ensayo de amplificación por
desplazamiento de hebra (SDA).
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