ES2313070T3 - Metodo de deteccion de analatos multiples. - Google Patents
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Abstract
Una placa de microtitulación que comprende una pluralidad de pocillos de un material rígido seleccionado entre el grupo que consta de vidrio, poliestireno, poliacrilo, poliamida, polietileno, polipropileno, estireno-acrilato-butadieno (ABS), Barnox, cloruro de polivinilo (PVC), nailon, acetato de etileno-vinilo (EVA), tereftalato de polietileno (PET) y combinaciones de éstos, en la que cada pocillo es un pocillo de una placa de microtitulación regular, y en la que cada pocillo está separado de un pocillo adyacente mediante una pared divisoria de pocillos, caracterizada porque el fondo de cada pocillo está compuesto por un filtro de membrana semipermeable capaz de enlazar directa o indirectamente un analito, y en la que dichos pocillos están agrupados en uno o más clusters, comprendiendo cada cluster al menos dos pocillos, en la que dichos clusters están separados de clusters adyacentes mediante una pared divisoria de clusters y en la que al menos parte de la pared divisoria de pocillos es más baja que la pared divisoria de clusters, o en la que la pared divisoria de pocillos contiene al menos un pasaje que conecta al menos dos pocillos adyacentes dentro de un cluster, estando dicho pasaje a una distancia del fondo del pocillo y al menos parcialmente por debajo de la parte superior del pocillo.
Description
Método de detección de analitos múltiples.
La presente invención se refiere a un método
rápido y efectivo en términos de su costo para la detección de
analitos en una muestra. En particular, la presente invención se
refiere a una placa de microtitulación, cuyo fondo comprende un
filtro de membrana semipermeable y al uso del mismo para la
detección simultánea de múltiples analitos (sustancias
constituyentes de una muestra sometida a análisis) en una muestra de
fluido.
El uso del Ensayo de Enzimas Ligadas a
Inmunosorbentes (ELISA, por las siglas de su expresión inglesa,
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) para la
detección y cuantificación de analitos específicos, tales como
anticuerpos o antígenos, es una metodología de diagnóstico bien
estandarizada. En la actualidad tales métodos se realizan de manera
rutinaria utilizando placas de microtitulación de poliestireno de 96
pocillos. El método comprende un número de pasos esenciales que
incluyen i) la inmovilización de un ligando de captura a las paredes
del pocillo de la placa de microtitulación (el paso denominado de
recubrimiento), ii) la separación de ligandos de captura enlazados y
libres mediante lavados, iii) el enlace de un analito de interés al
ligando de captura enlazado, iv) la separación de analitos
enlazados y libres mediante lavados, v) el enlace de una enzima
conjugada al analito enlazado, vi) la separación de conjugado
enlazado y libre mediante lavados, y vii) la detección de conjugado
enlazado mediante conversión enzimática de un sustrato añadido.
Debido a estos pasos esenciales del proceso, y particularmente a los
extensos procedimientos de lavado necesarios para separar reactantes
enlazados de los no enlazados, el método es laborioso y
relativamente lento.
Aparte del hecho de que los procesos de difusión
están implicados en las diversas reacciones de enlace, retardando
por tanto el procedimiento, el gran número de pasos de lavado crea
grandes cantidades de fluidos de desecho. Esto es particularmente
problemático cuando se utilizan materiales de riesgo biológico o
muestras infecciosas y crea grandes cantidades de fluidos de desecho
contaminados.
Es más, para poder llevar a cabo exámenes con
respecto a múltiples analitos presentes en una muestra, deben
revestirse placas de microtitulación independientes con ligandos de
captura específicos, capaces de enlazar específicamente los analitos
individuales a ser determinados. Por tanto, debe aplicarse una
muestra a diferentes placas. Las placas independientes se requieren
también porque el recubrimiento difiere de ligando de captura a
ligando de captura (e. g. búferes diferentes, tiempos de incubación,
temperaturas de incubación, etc.). Adicionalmente se requieren
placas independientes debido a que el recubrimiento de pocillos
individuales en una placa con ligandos de captura expresos alberga
el riesgo de contaminación cruzada entre pocillos.
En muchos campos de diagnóstico, se examina una
muestra individual en busca de la presencia o ausencia de un número
de analitos. Cuando se detecta un gran número de diferentes analitos
en muestras mediante el ELISA, el requerimiento antes descrito con
respecto a placas de microtitulación independientes para cada prueba
ELISA individual implica diversas desventajas. Por ejemplo, un gran
número de pocillos de una placa de microtitulación puede quedar sin
uso en los casos en que se examine solo un número limitado de
muestras. También, las muestras a examen deben ser distribuidas a
partes iguales en diferentes placas de examen en caso que en ellas
deban determinarse diferentes analitos, necesitando por tanto
volúmenes de muestra relativamente grandes. Es más, los resultados
de diferentes placas son inherentemente difíciles de comparar. Como
se señaló anteriormente, otro problema que tienen los métodos de la
técnica anterior radica en que se requieren grandes volúmenes de
fluidos de lavado y que en caso de detección de agentes infecciosos,
surgen grandes cantidades de fluidos de desecho contaminados. Cuando
se procesa de manera secuenciada el procedimiento consume mucho
tiempo y es susceptible a error.
La Patente de los EE. UU. 2003/0 113 713
presenta un método para conducir múltiples ensayos químicos,
bioquímicos y biológicos en una muestra. El método consiste en el
uso de una Placa Multidominios Multipocillos o Placa MDMW que
comprende una pluralidad de pocillos, comprendiendo cada uno una
pluralidad de dominios de ensayo.
Winklhofer et al. (FEBS Letters
53(1):41-45, 2001) presenta un ensayo de
retención mediante filtro utilizando un dispositivo convencional de
mancha de ranura para detectar un analito único PrP^{Sc}. No se
menciona el uso de una placa de microtitulación.
Barnett et al. (J. Virol.
20(4):323-332, 1988) presenta un inmunoensayo
de filtración de enzimas mediante membrana (MFEIA) para detectar
anticuerpos de virus. El método comprende el uso de placas de
microtitulación GV (Millipore Corp. EE. UU.) que representan placas
de microtitulación de 96 pocillos que tienen un filtro de membrana
en el fondo. No se mencionan adaptaciones a la placa para facilitar
la detección simultánea de múltiples analitos.
La Patente de los EE. UU. 5 279 937 describe un
ensayo de hibridación de oligonucleótidos utilizando una placa de
filtración de 96 pocillos. No se mencionan adaptaciones a la placa
para facilitar la detección simultánea de múltiples analitos.
Guerin-Marchand et al.
(J. Immunol. Methods
167(1-2):219-225, 1994)
presenta un ensayo ELISA utilizando una placa de filtración de 96
pocillos Multiscreen DV (Millipore Corp.). No se mencionan
adaptaciones a la placa para facilitar la detección simultánea de
múltiples analitos.
Stya et al. (J. Immunol. Methods
73(1):75-81, 1984) presenta un ensayo ELISA
utilizando placas de filtración de 96 pocillos de nitrocelulosa o
fluorocarbono (Millipore Corp.). No se mencionan adaptaciones a la
placas para facilitar la detección de múltiples analitos.
Aranha-Creado et al. (J.
Int. Ass. Biol. Stand. 26(2):167-172, 1998)
expone que partículas de virus pueden retirarse de una solución
utilizando membranas PVDF. No se menciona una placa de
microtitulación.
Los presentes inventores han encontrado ahora un
método para detectar un analito en una muestra líquida que supera
una o más desventajas con respecto a los métodos de la técnica
anterior. El método incluye a) la provisión de una placa de
microtitulación específica tal como se define en la reivindicación
1. El método de la presente invención comprende además los pasos de
b) aplicar dicha muestra líquida al menos a un cluster de pocillos,
filtrando dicha muestra a través de dicho filtro de membrana,
enlazando por tanto dicho uno o más analitos a dicho filtro de
membrana o ligandos de captura, y realizando opcionalmente pasos de
lavado; y c) detectar dicho uno o más analitos enlazados en dichos
pocillos llevando a cabo un ensayo de enlace en dicho filtro de
membrana, siendo dicho ensayo de enlace preferentemente un
inmunoensayo quimioluminiscente.
La presente invención se refiere aún más a la
placa de microtitulación específica en sí tal como se provee en el
método anterior y al uso de ésta en la detección de analitos.
De hecho, cuando se utiliza el método anterior,
los inventores presentes han encontrado que este procedimiento
reduce grandemente la cantidad de fluidos de lavado requeridos. Es
más, se encontró que pueden llevarse a cabo diferentes exámenes
analíticos en una sola placa de microtitulación.
Como resultado de ello, los presentes inventores
han encontrado que una muestra puede aplicarse a un número de
contenedores adyacentes en una sola placa de microtitulación
mediante un solo paso de aplicación para llevar a cabo diferentes
exámenes analíticos en ésta.
En un primer aspecto, la presente invención
brinda un método para detectar un analito en una muestra tal como se
ha descrito aquí anteriormente. En las realizaciones del método de
la presente invención, se brinda una pluralidad de pocillos de
muestra en la forma de una placa de microtitulación. La totalidad
del fondo de dicha placa de microtitulación está provista de un
filtro de membrana semipermeable, de manera que el fondo de cada
pocillo esté compuesto por un filtro de membrana semipermeable.
Tal como se utilizan aquí, los términos
"filtro de membrana semipermeable", "membrana
semipermeable" y "filtro de membrana" son todos
intercambiables.
La pluralidad de pocillos puede ser de cualquier
número y configuración y puede disponerse bajo cualquier patrón
ornamental, preferentemente, la pluralidad de pocillos se brinda en
el formato de una placa de microtitulación estándar de 96 pocillos,
pero también pueden ser particularmente apropiados formatos que
comprenden alrededor de 384, 864, 1536, 2400 o alrededor de 3456
pocillos.
El número de pocillos adyacentes en un cluster
de contenedores puede ser cualquier número apropiado con el objetivo
de determinar múltiples analitos en una pluralidad de pocillos. En
una realización particularmente preferente del método anterior, el
método consiste en el uso de una placa de microtitulación que
comprende al menos n^{2} pocillos adyacentes, donde n es un
entero, preferentemente un entero de 2-10, más
preferente de 2-5. Tales números son ventajosos para
la codificación de posiciones, estandarización de procedimientos y
por razones de manufactura.
La presente invención se refiere también a una
placa de microtitulación que comprende una pluralidad de pocillos,
en la que el fondo de cada pocillo comprende una membrana
semipermeable capaz de enlazar directa o indirectamente un analito,
y en la que cada pocillo está separado de un pocillo adyacente
mediante una pared divisoria de pocillos, en la que los pocillos
están agrupados en uno o más clusters, comprendiendo cada cluster al
menos dos pocillos, en la que dichos clusters están separados de los
clusters adyacentes mediante una pared divisoria de clusters y en la
que al menos parte de la pared divisoria de pocillos es más baja
que la pared divisoria de clusters o en la que la pared divisoria de
pocillos contiene al menos un pasaje que conecta al menos dos
pocillos adyacentes dentro de un cluster, estando dicho pasaje a una
distancia del fondo del pocillo y al menos parcialmente por debajo
de la parte superior del pocillo.
En este método, el funcionamiento de dicha placa
de microtitulación es tal que cuando un fluido de muestra se aplica
a un primer pocillo en un cluster, y la cantidad de dicho fluido
aplicado es tal que el nivel del fluido se eleva sobre la pared
divisoria de pocillos o sobre la posición del pasaje, al menos una
porción de dicha fluido de muestra aplicado fluirá o se derramará de
dicho primer pocillo hacia un segundo pocillo adyacente hasta que el
nivel del fluido de nuevo se equilibre con la pared divisoria de
pocillos o quede por debajo de la posición del pasaje. Ahora cuando
se aplica una cantidad de fluido que es, debido a su volumen, capaz
de dividirse equitativamente en todos los pocillos dentro de un
cluster, entonces todos dichos pocillos dentro de ese cluster pueden
proporcionarse con un volumen igual del fluido de muestra en un solo
paso de aplicación de la muestra.
Preferentemente, las paredes de división de los
pocillos tienen una altura mínima particular o la posición del
pasaje entre pocillos conectados y adyacentes se eleva sobre el
fondo del pocillo de manera que una cantidad del fluido de muestra
pueda ser contenido en éste. Esencialmente dicha cantidad es
suficiente para llevar a cabo el ensayo de detección sobre el
analito. Una dimensión típica de un pocillo es aquella que sea capaz
de contener, o tenga la capacidad antes del derrame, de entre 1 y 5
000 \mul, preferentemente de 5 a 1 000 \mul, más preferente
entre 5 y 250 \mul de fluido. Por tanto, la placa de
microtitulación de la presente invención se caracteriza por la
presencia de paredes divisorias de clusters y paredes divisorias de
pocillos, en la que las paredes divisorias de clusters permiten el
derrame del fluido de muestra de un pocillo al otro. Esencialmente
en un método de la presente invención, el derrame ocurrirá cuando la
cantidad de fluido cargado dentro de un pocillo exceda la capacidad
antes del derrame, también denominado aquí el volumen de derrame. La
altura de una pared divisoria de un contenedor es típicamente de 0,1
a 20 milímetros, preferentemente de 1 a 5 milímetros. La altura de
una pared divisoria de clusters es típicamente de 0,1 a 1,5
milímetros más alta que la pared divisoria de pocillos,
preferentemente de 1 a 5 milímetros más elevada.
Las paredes de división de los pocillos y de los
clusters pueden ser de cualquier material y pueden por ejemplo ser
todas claras, blancas, negras o transparentes o bloqueadoras de la
luz y pueden en principio ser de cualquier color. Preferentemente,
las paredes deben bloquear la luz.
Puede llevarse a cabo en principio un método
según la presente invención para detectar analitos en cualquier
muestra líquida y en cualquier fluido, tal como material flotante de
cultivo de células, agua (incluyendo potable, de torre de
enfriamiento, de desecho y de procesamiento), extractos de suelos u
otros fluidos tales como petróleo, pero preferentemente fluidos
corporales tales como, por ejemplo, leche, calostros, orina, sangre
(entera), suero, plasma, fluido pleural, fluido gástrico, fluido
duodenal, fluido intraocular, fluido ascítico, fluido peritoneal,
fluido amniótico, fluido sinovial, fluido cístico, fluido
cerebroespinal, fluidos vaginales (incluyendo fluidos menstruales),
semen, esputo, saliva, extractos de heces o estiércol, sudor o
exudados provenientes de lesiones.
Para la detección de analitos en muestras no
fluidas, tales como muestras de tejido de biopsias, puede preparase
apropiadamente una muestra en la forma de una mezcla pastosa, una
suspensión, una solución, un macerado, un homogenizado y similares.
La muestra puede por tanto comprender una muestra de fluido, un
fluido de una muestra, una muestra fluidizada o una preparación a
partir de una muestra que es fluida. El analito puede estar presente
en la muestra en forma suspendida o disuelta.
La muestra puede derivarse de cualquier fuente o
cualquier sujeto incluyendo, pero no limitada a mamíferos,
incluyendo, e. g., un humano, un primate no humano, ratón, cerdo,
vaca, cabra, gato, conejo, rata, conejillo de Indias, ratón blanco,
caballo, mono, oveja, u otro mamífero no humano; y animales no
mamíferos, incluyendo, e. g., un vertebrado no mamífero, tal como un
ave (e. g., un pollo o pato) o un pez, y un invertebrado no
mamífero.
El método es útil para detectar una gran
variedad de analitos en una muestra. Los analitos tales como
nucleótidos, péptidos o sacáridos, o polímeros de éstos, tales como
ADN o ARN, proteínas y polisacáridos, pueden también detectarse
utilizando un método de la presente invención. También pueden
detectarse anticuerpos, antígenos, enzimas, cofactores, metabolitos,
hormonas, priones, virus, bacteria y/u hongos. En general cualquier
sustancia química o biológica para la cual pueda proporcionarse una
pareja de enlace específico, tal como, por ejemplo, cada uno de los
miembros de la pareja de enlace en un par de una pareja de enlace
anticuerpo-antígeno, o pares de enlace tales como
enzima-sustrato, complejos
carga-transferencia, complejos apilados, complejos
covalentes, etc., puede determinarse utilizando el método
presente.
El término "más" en "uno o más
analitos" tal como se utiliza aquí, se entiende que indica
diferentes tipos de analitos.
Tal como aquí se utilizan, los términos
"anticuerpo" y "anticuerpos" se refieren a anticuerpos
monoclonales, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos sintéticos,
anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos
quiméricos, Fvs de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de cadena
sencilla, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), Fvs vinculados a
bisulfuro (sdFv) y anticuerpos antidiotípicos
(anti-Id) (incluyendo, e. g., anticuerpos
anti-Id a anticuerpos de la presente invención) y
fragmentos de enlace a epítopes de cualquiera de los anteriores. En
particular, los anticuerpos de la presente invención incluyen
moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas
de moléculas de inmunoglobulina, i. e., moléculas que contienen un
sitio de enlace de antígeno que enlaza inmunoespecíficamente a un
analito a ser detectado. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser
de cualquier tipo (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase
(e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 y IgA2) o subclase de moléculas
de inmunoglobulina.
Los métodos y placas de microtitulación de la
presente invención son particularmente útiles para detectar
múltiples analitos en una muestra biológica tal como por ejemplo
diversos agentes de enfermedades infecciosas o un anticuerpo contra
éstas en el hombre o en animales o en parámetros generales en
paneles de examen o en menús de exámenes destinados al salón de
operaciones, exámenes de emergencia, exámenes de fertilidad,
alimentación-conversión, marcadores de tumores,
enfermedades autoinmunes, enfermedades de huesos y minerales,
enfermedades metabólicas, trastornos y parámetros
gastrointestinales, hemostasis, drogas susceptibles de abuso,
diabetes, quetosis, leucosis, el campo de la donación de sangre así
como paneles de examen respecto a hormonas, alérgenos, GMOs y
contaminantes y/o residuos en alimentos, alimentación o el
entorno.
Los analitos preferentes a ser detectados por
tal ensayo de múltiples analitos son virus y bacterias o anticuerpos
contra éstos. En una realización particularmente preferente, los
agentes (o anticuerpos contra éstos) que causan tales enfermedades
como la encefalopatía bovina espongiforme (BSE), fiebre aftosa,
enfermedad inducida por el virus respiratorio bovino sincitial
(BRSV), diarrea viral bovina, brucelosis, leptospirosis, infección
por lombriz pulmonar, fiebre porcina clásica, enfermedad inducida
por parvo virus porcino (PPV), enfermedad inducida por virus de
pseudorrabia (PrV) (o enfermedad de Aujeszky), enfermedad vesicular
porcina, ántrax, Salmonelosis, enfermedad inducida por
Campilobacter, enfermedad inducida por E. coli, cólera, y
otras enfermedades bacterianas inducidas, HIV, HBV, HCV, HTLVI y/o
HTLVII, se detectan utilizando un método de la presente
invención.
También pueden prepararse menús de exámenes de
hormonas, enfermedades metabólicas,
alimentación-conversión, fertilidad, enfermedad ósea
y mineral, quetosis, leucosis, etc., donde dichos menús comprenden
un número de exámenes para diferentes agentes. Los menús
particularmente apropiados son aquellos dirigidos a exámenes
realizados en un campo específico, tal como en la industria de
alimentos/alimentación, cuyo menú puede entonces comprender exámenes
microbiológicos sobre seguridad alimenticia, exámenes para detectar
la presencia de organismos genéticamente modificados (GMOs), o la
presencia de contaminantes, toxinas, residuos y hormonas en
alimentos y/o productos de la alimentación.
Otros menús apropiados son aquellos dirigidos a
exámenes realizados en el campo de la detección ambiental tal como
paneles para la detección de atracinas, piretroidenas, toxinas
agrícolas o pesticidas tales como herbicidas, fungicidas,
molusquicidas, insecticidas, etc. El experto en la técnica
identificará fácilmente otros menús apropiados para otros campos a
examinar. Por ejemplo, los paneles de ensayo pueden desarrollarse
para medir en un ensayo de múltiples analitos una pluralidad de
analitos o actividades asociadas a un sistema biológico particular
(e. g. paneles de inmunoensayos o ensayos de hibridación para
monitorear el ARNm de citoquinas o niveles de proteínas), estado de
la enfermedad (e. g. paneles de ensayo para marcadores cardiacos,
para identificar alérgenos responsables de las reacciones alérgicas,
para identificar organismos infecciosos, etc.), tipo de tejido,
organismo, clase de proteínas, enzima o molécula biológica, etc. En
una realización, se utiliza un panel de ensayos para proporcionar
una huella para identificar un sistema biológico (e. g. un patrón de
niveles de analitos asociados a un tipo de célula particular, tipo
de organela, tipo de organismo, tipo de tejido, bacteria o virus).
Puede utilizarse, por ejemplo, una pluralidad de ensayos para
diferentes componentes encontrados dentro de un género de sistemas
biológicos para identificar especies o subespecies dentro de ese
género. En otra realización, se utiliza una medición diferencial que
involucra una pluralidad de ensayos para diferentes componentes
dentro de un sistema biológico para identificar el estado del
sistema biológico (e. g. estado normal vs. estado enfermo, estado
normal vs. activado, etc.) o para identificar los componentes dentro
de un sistema biológico que son afectados por una condición externa
o estímulo (e. g., cambios en la distribución de componentes
asociados al desarrollo de un estado de la enfermedad, adición de
una especie estimulante, adición de un candidato potencial a un
medicamento, cambios en las condiciones ambientales tales como el
pH, la temperatura, etc.). Los paneles de ensayo pueden también
utilizarse para determinar la función de una o más proteínas. Por
ejemplo, una proteína puede ser seleccionada previamente contra una
biblioteca pautada de sustratos de enzimas y/o de parejas
potenciales de enlace para identificar actividades enzimáticas o de
enlace. A la inversa, una biblioteca pautada de proteínas puede ser
expuesta a un material biológico conocido para determinar si alguna
de las proteínas enlaza a, reacciona con, o de alguna otra forma es
transformada por el material biológico.
Un analito preferente que es detectado por un
método de la presente invención es el agente causante de la
encefalopatía espongiforme transmisible (TSE) tal como scrapie (Sc),
BSE, enfermedad crónica de consunción (CWD) y enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob (CJD), y en particular aquellas
causadas por isoformas patogénicas proteicas anteriores PrPSc
(Scrapic), PrP^{BSE} (encefalopatía espongiforme bovina),
PrP^{CWD} (enfermedad crónica de consunción), y PrP^{CJD}
(enfermedad de Creutzfeld-Jakob).
Tal como aquí se utiliza un pocillo se define
como un contenedor cilíndrico (circular) que comprende un extremo
superior abierto, paredes y un extremo inferior cerrado. Un
contenedor típico es un pocillo de una placa de microtitulación
regular. Según la presente invención el fondo del pocillo está
provisto de un filtro de membrana semipermeable. Aquí, el filtro de
membrana semipermeable representa el fondo de pocillos y el fluido
aplicado al pocillo puede ser retirado de ese pocillo aplicando una
presión reducida de gas o vacío bajo dicho filtro de membrana,
extrayendo por tanto el contenido líquido de pocillos a través de
dicho filtro. Alternativamente, el fluido aplicado al pocillo puede
ser retirado apropiadamente de ese pocillo aplicando una presión
positiva de gas, empujando por tanto el contenido líquido de
pocillos a través de dicho filtro. La configuración real del
pocillo no es esencial siempre y cuando puedan utilizarse medios
apropiados, tales como por ejemplo un aspirador de vacío, para
retirar su contenido a través del filtro de membrana comprendido en
el fondo de dicho pocillo. En una realización preferente de una
placa de microtitulación de la presente invención la placa se adapta
específicamente para ser utilizada en combinación con un aspirador
de vacío.
El pocillo puede ser de cualquier material
rígido apropiado tal como vidrio, poliestireno, poliacrilo,
poliamida, polietileno, polipropileno,
estireno-acrilato-butadieno (ABS),
Barnox, cloruro de polivinilo (PVC), nailon,
etileno-vinil-acetato (EVA),
tereftalato de polietileno (PET), etc. y combinaciones de éstos. El
material puede por ejemplo ser todo claro, blanco, negro o
transparente u opaco y puede en principio ser de cualquier
color.
El filtro de membrana semipermeable puede ser de
cualquier material apropiado tal como nitrato de celulosa, acetato
de celulosa, éster de celulosa mezclado, polisulfona, sulfona de
poliéter, polipropileno, fluoruro de polivinilideno(PVDF),
policarbonato, nailon, vidrio (e. g. como microfibras), o
politetrafluoretileno (PFTE o Teflón ®). En principio el filtro
puede ser hidrófilo o hidrófobo, cargado positiva o negativamente,
en dependencia de la aplicación específica y del analito examinado o
ligando utilizado. El fluoruro de polivinilideno (PVDF) es un filtro
de membrana particularmente preferido en el caso de detección de
priones.
El filtro de membrana semipermeable debe ser
capaz de enlazar analitos y/o capturar ligandos para analitos a la
vez que permita el paso de reactantes no reaccionados, tales como
ligandos de captura no enlazados y/o analitos no enlazados en
fluidos de lavado. En principio, por tanto, todos los reactantes
excepto el analito a ser detectado y el ligando de captura utilizado
en un método de la presente invención, deben ser capaces de pasar
sin obstáculos a través de la membrana semipermeable de manera que
puedan ser arrastrados por el lavado.
Con ventaja, la membrana semipermeable tiene un
tamaño nominal de poros en el intervalo de aproximadamente 0,01 a
aproximadamente 15 \mum, preferentemente de aproximadamente 0,02 a
aproximadamente 2 \mum, aún más preferente aproximadamente 0,05 a
aproximadamente 0,45 \mum.
Según la presente invención el filtro de
membrana es capaz de enlazar el analito de interés. Este enlace
puede ser un enlace directo tal como por ejemplo, un enlace en el
que el analito se enlace al filtro de membrana mediante interacción
electroestática, o por interacción hidrófoba, enlace covalente,
interacciones de carga-transferencia, etc. Tal
enlace directo puede ser un enlace permanente o irreversible tal
como un enlace covalente o un enlace reversible.
De manera alternativa, el enlace del analito de
interés al filtro de membrana puede ser indirecto, i. e., facilitado
al proporcionar una pareja de enlace específica o no específica para
el analito en la forma de un ligando de captura o dentro de dicho
filtro de membrana, preferentemente en la forma de un recubrimiento
de membrana. El ligando de captura es entonces inmovilizado en o
dentro de dicho filtro de membrana, y cualquier técnica apropiada
conocida por un experto en la técnica puede ser empleada para tal
inmovilización. Los ligandos de captura apropiados pueden ser
cualquier pareja de enlace capaz de enlazar al analito, tal como por
ejemplo, estreptoavidina o anticuerpos, preferentemente anticuerpos
monoclonales, que pueden ser creados contra analitos específicos y
que puedan entonces usarse para enlazar el analito indirectamente al
filtro de membrana. Otros ligandos de captura apropiados
constituyen, por ejemplo, ácidos nucleicos complementarios,
incluyendo sondas de ADN, APN o ARN o similares. El experto en la
técnica está consciente de las diversas parejas de enlace que pueden
ser utilizadas como ligandos de captura en un método de la presente
invención.
El enlace a la membrana semipermeable es
preferentemente específico. El enlace indirecto tal como se
describió anteriormente tiene la ventaja de que el enlace resultante
es en la mayoría de los casos específico, en particular cuando se
utilizan parejas de enlace específicas para el analito como ligandos
de captura.
En lugar de los procedimientos laboriosos y
prolongados de recubrimiento de la técnica anterior, el método
presente consiste en la aplicación del ligando de captura en un
medio líquido apropiado, aplicando el medio líquido que comprende
el ligando de captura al pocillo, incubando opcionalmente durante un
corto período de tiempo, usualmente varios minutos, y filtrando todo
el contenido del pocillo a través del filtro de membrana,
preferentemente mediante presión al vacío efectuando por tanto el
enlace del ligando de captura a la membrana semipermeable.
Opcionalmente, puede seguirse a continuación con una pequeña
cantidad de una solución de lavado para limpiar el filtro de
membrana de ligandos de captura no enlazados. Tal procedimiento es
mucho más rápido que los procedimientos de recubrimiento
convencionales.
Existe también la posibilidad de enlazar primero
un ligando de captura al analito, por ejemplo al proporcionar tal
ligando de captura a la muestra, creando por tanto un complejo
ligando de captura-analito, y enlazando dicho
complejo al filtro de membrana, estableciendo también por tanto un
enlace indirecto del analito al filtro de membrana.
Un método para detectar un analito en una
muestra según la presente invención comprende un segundo paso de
aplicación de dicha muestra líquida a dicho uno o más pocillos de
muestras, filtrando dicha muestra a través de dicho filtro de
membrana, preferentemente mediante presión al vacío, enlazando por
tanto dicho uno o más analitos a dicho filtro de membrana, y
llevando a cabo opcionalmente los pasos de lavado.
Como se expuso anteriormente, el enlace de dicho
uno o más analitos al filtro de membrana puede ser directo o
indirecto. En ambos casos, puede requerirse un medio específico o
búfer para optimizar el enlace del analito al filtro de membrana
directamente, para facilitar la interacción entre el analito y el
filtro de membrana-ligando de captura inmovilizado o
para optimizar el enlace del complejo
analito-ligando de captura al filtro de
membrana.
Al llevar a cabo el método de detección de la
presente invención puede ser apropiado por ejemplo incluir ciertos
"bloqueadores" en el medio de incubación para asegurar que las
proteínas no específicas o proteasas presentes en la muestra
experimental no se entrecrucen o destruyan los ligandos de captura,
tales como por ejemplo anticuerpos, que arrojan resultados falsos
positivos o falsos negativos. La selección de "bloqueadores"
por tanto puede añadir sustancialmente a la especificidad de los
métodos de ensayo descritos en la presente invención. El experto en
la técnica estará consciente de los diversos componentes que pueden
utilizarse en tal medio o búferes para posibilitar y optimizar el
enlace de dicho analito al filtro de membrana directamente, o al
ligando de captura, tal como un anticuerpo.
Un tercer paso en un método para detectar uno o
más analitos en una muestra según la presente invención comprende la
detección de dicho uno o más analitos enlazados en dichos pocillos
de muestras llevando a cabo un ensayo de enlace en dicho filtro de
membrana. El experto en la técnica está bien consciente de las
diversas posibilidades de detección del analito inmovilizado en el
filtro de membrana utilizando ensayos de enlace. Los inmunoensayos
son ensayos muy apropiados en este caso, tales como los ensayos
ELISA.
Típicamente, los ensayos de enlace comprenden
una fase de enlace, en la que una pareja de enlace específica se
enlaza al analito, y una fase subsiguiente de detección, en la que
se mide una señal. La fase de enlace puede llevarse a cabo antes de
aplicar dicha muestra líquida a dicho uno o más pocillos de
muestras, i. e. mediante la adición de una pareja de enlace a un
fluido de muestras, y permitiendo que ésta se enlace al analito
antes de llevar a cabo el segundo paso del método de la presente
invención. La fase de enlace se lleva a cabo preferentemente en el
tercer paso. La fase de detección por otra parte siempre se lleva a
cabo en el filtro de membrana en el tercer paso de un método de la
presente invención.
En principio, cualquier tipo de método de
detección es apropiado para uso en un método de la presente
invención. Por ejemplo, los métodos cromogénico, fosforescente,
luminiscente y fluorescente son todos apropiados para uso en un
método de detección de uno o más analitos en una muestra según la
presente invención. Las técnicas de luminiscencia pueden comprender
bioluminiscencia, electro-quimioluminiscencia y
quimioluminiscencia. De la última son apropiadas, ambas el tipo de
fulgor, utilizando por ejemplo peroxidasa de rábano picante (HRP) o
fosfatasa alcalina (AP) para la conversión enzimática de los
sustratos, y el tipo flash, mediante activación del luminol,
dioxetano o de la etiqueta de éster-acridinio. El
tipo de método de detección utilizado dependerá de las condiciones
del ensayo y la persona experta en la técnica será capaz de elegir
un método apropiado. La quimioluminiscencia se prefiere respecto a
la electro-quimioluminiscencia ya que ésta permite
exámenes más simples debido a que no se requiere de electrodo para
aplicar una carga eléctrica al sitio de análisis (i. e. al pocillo o
a la superficie de la membrana semipermeable a ser medida) y no
requiere de equipo específico de detección. Es más mientras el
equipo que se pone en contacto con el material infeccioso debe ser
lavado intensamente, el equipo que se pone en contacto con material
relacionado con priones nunca puede utilizarse de nuevo y debe ser
destruido. Por tanto, una placa de microtitulación según la presente
invención es preferentemente económica y consumible.
Un típico inmunoensayo quimioluminiscente para
la detección de la aplicación del analito inmovilizado enlazado
directamente o vía un ligando de captura específico en el filtro de
membrana incluye i) la aplicación de un conjugado
enzima-anticuerpo, capaz de enlazar específicamente
al analito en un búfer apropiado de conjugación; ii) una incubación
breve para permitir que ocurra el enlace específico, usualmente del
orden de 30 minutos a 2 horas, en dependencia de las condiciones de
incubación; iii) la retirada del conjugado no enlazado filtrando la
totalidad del contenido del pocillo a través del filtro de
membrana, preferentemente mediante presión negativa (vacío); iv) el
lavado opcional del filtro de membrana mediante una solución de
lavado; v) aplicación del sustrato quimioluminiscente y vi)
evaluación luminométrica de la quimioluminiscencia producida en el
pocillo. Para aplicaciones de quimioluminiscencia, el pocillo es
preferentemente de un material de color blanco, mientras que para
aplicaciones fluorescentes se prefiere material de color negro.
El método de la presente invención puede por
tanto comprender el uso de una primera pareja de enlace como un
ligando de captura en un paso de enlace del analito al filtro de
membrana y el uso de una segunda pareja de enlace como parte del
ensayo de detección. Tal realización es conocida en la técnica como
un ensayo tipo sándwich.
En una realización preferente del método de la
presente invención, los pocillos de muestras están provistos en la
forma de una placa de microtitulación que comprende una pluralidad
de pocillos de muestras, siendo utilizada entonces dicha placa de
microtitulación para llevar a cabo un método de la presente
invención. La totalidad del fondo de dicha placa de microtitulación
está entonces provista de un filtro de membrana semipermeable que
está conectado de manera sellada a las paredes de cada pocillo, de
manera que el fondo de cada pocillo esté compuesto por un filtro de
membrana semipermeable.
El término "fondo" como aquí se utiliza se
entiende que indica la parte inferior del pocillo o una posición
esencialmente cercana a la base del pocillo, tal que provea al
pocillo con un cierto volumen sobre el filtro de membrana, pero por
debajo del pasaje o pared divisoria de pocillos, de estar presente,
e incluye el borde inferior o base de la pared del pocillo.
En otra realización preferente, el método
incluye el uso de una placa de microtitulación particularmente útil
para detectar de forma distintiva múltiples analitos en una sola
muestra. Para esta realización, los pocillos individuales en dicha
placa de microtitulación están ordenados de manera tal que, dos o
más pocillos forman un cluster de pocillos, basándose en la altura
de las paredes que los separan, midiendo desde el fondo del pocillo,
o basándose en la presencia de un pasaje que conecta a los pocillos
individuales dentro de un cluster (ver Figuras 1 y 2).
Las características de las paredes que separan
los pocillos individuales en un cluster de pocillos pueden ser tales
que las paredes que separan dos o más pocillos adyacentes (paredes
divisorias de pocillos) sean más bajas que las paredes que separan
dos o más clusters de pocillos (paredes divisorias de clusters). El
funcionamiento de la placa de microtitulación según tal realización
de la presente invención consiste en que cuando un fluido de la
muestra se aplica a un pocillo arbitrario en un primer cluster de
pocillos y la cantidad de fluido de la muestra es tal que el nivel
del fluido se eleva sobre la pared divisoria de pocillos, al menos
una porción de dicho fluido de la muestra se derramará dentro del
pocillo adyacente. Por tanto, en principio, la altura de la pared
divisoria de pocillos dentro de un cluster es tal que el fluido de
la muestra puede fluir libremente entre pocillos adyacentes dentro
de dicho primer cluster cuando se aplica un volumen de fluido mayor
que un cierto volumen crítico. Sin embargo, el fluido no fluirá
libremente entre dos clusters, siempre y cuando la cantidad de dicho
fluido sea tal que el nivel de fluido no se eleve sobre la pared
divisoria de clusters.
En un segundo aspecto, la presente invención se
refiere a una placa de microtitulación que comprende una pluralidad
de pocillos, en la que el fondo de cada pocillo comprende una
membrana semipermeable capaz de enlazar directa o indirectamente un
analito, y en la que cada pocillo está separado de un pocillo
adyacente mediante una pared divisoria de pocillos, en la que los
pocillos están agrupados en uno o más clusters, comprendiendo cada
cluster al menos dos pocillos, en la que dichos clusters están
separados de los clusters adyacentes mediante una pared divisoria de
clusters y en la que al menos parte de la pared divisoria de los
pocillos es más baja que la pared divisoria de los clusters o en la
que la pared divisoria del contenedor contiene al menos un pasaje
que conecta al menos dos pocillos adyacentes dentro de un cluster,
estando dicho pasaje a una distancia del fondo del pocillo y al
menos parcialmente por debajo de la parte superior del pocillo.
Dentro de cada cluster de pocillos, se detectan
preferentemente de manera simultánea, varios analitos de una
muestra, siendo detectado cada analito preferentemente en un pocillo
independiente. Como tal, el filtro de membrana de varios pocillos
individuales puede estar recubierto con diferentes ligandos de
captura, cuyo detalle se describirá aquí más adelante.
En una realización alternativa de un placa de
microtitulación según la presente invención, las paredes del pocillo
y las paredes de clusters no necesitan diferir en altura pero, en su
lugar, se provee un pasaje, por ejemplo en la forma de una muesca o
abertura, perforación o entrada, entre pocillos individuales dentro
de un cluster, pero no entre pocillos individuales entre clusters.
Dicho pasaje está colocado esencialmente en una posición en la pared
del pocillo que está a alguna distancia del fondo de dicho pocillo,
de manera que el pocillo pueda ser provisto de una cierta cantidad
de fluido sin que dicho fluido fluya o se derrame en un pocillo
adyacente y conectado. Esta característica tiene la ventaja de que
los pocillos individuales pueden estar provistos con reactantes
diferentes, que, en el caso que los reactantes estén contenidos en
un volumen de fluido que es inferior al volumen de derrame de dicho
pocillo, estos se mantendrán en un pocillo sin trasvasar a pocillos
adyacentes. En esta forma, las membranas semipermeables en pocillos
individuales pueden estar provistas de diferentes ligandos de
captura en una manera más simple.
El término "volumen de derrame" tal como
aquí se utiliza, se entiende que abarca el volumen crítico, por
sobre el cual el fluido aplicado comienza a fluir hacia dentro de un
pocillo adyacente dentro de un cluster.
Una placa de microtitulación según la presente
invención no solo apoya un método de la invención en la que una
acción individual de descarga (entrega) o aplicación de un fluido de
muestra a un pocillo resulta en una partición de esa muestra en
múltiples pocillos, sino también a los métodos que comprenden
descargas individuales de fluidos de lavado y descargas individuales
de medios de detección y reactantes. En tal placa de
microtitulación, los fluidos se distribuyen equitativamente
automática e instantáneamente en múltiples pocillos, siempre y
cuando el volumen provisto en dicha descarga sea al menos el volumen
de derrame de un pocillo individual multiplicado por el número de
pocillos en ese cluster. Esto reduce grandemente el número de
descargas necesarias para llevar a cabo el ensayo de detección. Se
prefiere por tanto, que el volumen de derrame de todos los pocillos
en una placa de microtitulación sea esencialmente igual.
En una realización particularmente preferente de
una placa de microtitulación según la presente invención, cada
cluster de pocillos comprende al menos 2, preferentemente al menos
n^{2} pocillos adyacentes, donde n es un entero, preferentemente
un entero de 2-10, más preferentemente de
2-5. El número máximo de pocillos en un cluster
dependerá del tipo de placa de microtitulación utilizada (i. e. el
número total de pocillos provistos en la misma) y del número de
clusters en dicha placa de microtitulación. En principio una placa
de microtitulación puede tener uno, pero tiene preferentemente más
clusters, siendo cada cluster preferentemente idéntico al otro.
Cada pocillo dentro de un cluster no está
necesariamente conectado mediante derrame a todos y cada uno de los
pocillos dentro de ese cluster. Por ejemplo, como puede verse en las
Figuras 1 y 2, los clusters indicados como F, G, H, K, M y N,
también estarán total e igualmente llenos de fluido cuando el
volumen de ellos sea al menos el volumen de derrame de un pocillo
individual multiplicado por el número de pocillos en ese cluster. El
cluster puede adoptar cualquier configuración o forma tal como lo
definen los contenedores interconectados que comprenden el mismo,
pero las formas cuadradas, rectangulares o lineales son preferentes
debido a que ellas permiten una identificación más fácil atendiendo
al marcado en la placa.
Una placa de microtitulación según la presente
invención es apropiada preferentemente para la detección de un
analito por pocillo y múltiples analitos por cluster.
La estructura de una placa de microtitulación
según la presente invención puede ser tal que uno o más clusters, o
preferentemente uno o más contenedores dentro de un cluster estén
destinados a estándares internos, controles y calibradores. Por
ejemplo, uno o más pocillos pueden dejarse sin ligando de captura o
pueden ser recubiertos con un agente bloqueador para inhibir el
enlace del analito a la membrana o con un material biológico que no
está previsto que participe en una reacción con una muestra; tales
pocillos pueden ser utilizados para medir y/o corregir el enlace no
específico de marcas a la superficie del pocillo. En otro ejemplo,
uno o más pocillos se recubren con un reactante marcado (e. g. un
reactante marcado con un marcador de detección); tales pocillos
pueden utilizarse para medir y/o corregir las condiciones que pueden
afectar la generación y medición de la señal de un marcador (e. g.
pH, temperatura, interferentes químicos, especies coloreadas, etc.).
En otro ejemplo, uno o más pocillos se utilizan para llevar a cabo
un ensayo de control de un analito de control que está imbricado
dentro de la mezcla de ensayo. Preferentemente, el ensayo de control
es similar en formato a ensayos llevados a cabo en otros pocillos de
un cluster. Los ensayos de control pueden utilizarse para medir y/o
corregir enlaces no específicos, las condiciones que afectan la
generación de señales a partir de un marcador y las condiciones que
afectan las reacciones del ensayo (variaciones en el tiempo de
incubación, temperatura, mezclado, etc.).
Un método para detectar múltiples analitos en
una muestra está particularmente bien apoyado ahora mediante tal
ordenamiento de los clusters de los pocillos dentro de la placa de
microtitulación de la presente invención. Se requiere que en una
placa de microtitulación de la presente invención las paredes de al
menos cierta altura se mantengan entre pocillos adyacentes, o que un
pasaje esté a alguna distancia del fondo. El resultado de esto
radica en que dentro de un cluster de pocillos adyacentes, a cada
pocillo individual se le puede proporcionar de un fluido que
comprende un ligando de captura específico diferente, de manera que
los filtros de membrana en diferentes pocillos se les provea de
ligandos de captura específicos diferentes, y que como resultado de
esto diferentes analitos específicos de una muestra puedan ser
capturados o inmovilizados mediante enlace indirecto al filtro de
membrana en el fondo de los pocillos individuales. Las detecciones
de diferentes analitos a partir de una muestra individual pueden
llevarse a cabo simultáneamente en esos pocillos adyacentes. Una
placa de microtitulación de la presente invención comprende en una
realización al menos un pocillo en un cluster de pocillos que
comprende un ligando de captura para enlazar un analito al filtro de
membrana de dicho pocillo. En otra realización cada pocillo en un
cluster de pocillos comprende un ligando de captura diferente para
enlazar indirectamente el analito al filtro de membrana.
En el caso de que varios pocillos en un cluster
estén provistos de diferentes cantidades de ligandos de captura
(preferentemente conocidos, más preferentemente calibrados), tal que
diferentes cantidades de analitos (preferentemente conocidos, más
preferentemente calibrados), se enlacen en diferentes pocillos
dentro de un cluster, tal cluster puede utilizarse para determinar
la cantidad de analito presente en la muestra, o determinar la
capacidad de enlace del ligando de captura.
Los ligandos de captura específicos
inmovilizados en los filtros de membrana de pocillos individuales
pueden por ejemplo ser seleccionados a partir de anticuerpos
específicos para agentes de enfermedades infecciosas o estructuras
seleccionadas o partes de agentes de infección tales como los
agentes descritos. El experto en la técnica entenderá que pueden
seleccionarse muchos ligandos de captura a analitos diferentes para
enlazar analitos a los filtros de membrana de pocillos específicos.
Es más, el experto en la técnica entenderá que el procedimiento de
detección puede seleccionarse a partir de muchos formatos de ensayo
de enlace diferentes y que tal procedimiento puede aún ser llevado a
cabo con anticuerpos no específicos en caso de que la captura al
propio filtro de membrana sea específica, aunque se prefiere el uso
de anticuerpos específicos.
Para producir una placa de microtitulación
particularmente útil para detectar de manera distintiva múltiples
analitos en una muestra según un método de la presente invención, el
experto en la técnica entenderá que las paredes de los contenedores
adyacentes en una placa de microtitulación estándar pueden reducirse
en altura o eliminarse (parcialmente) desbastando (parte de) las
paredes que separan dos o más pocillos adyacentes. De manera
alternativa, por ejemplo, una placa de microtitulación que comprende
96 pocillos cuadrados sin fondo puede pegarse en la parte superior
de una placa de microtitulación de 384 pocillos cuadrados cuya base
está provista de un filtro de membrana semipermeable. La alineación
de los pocillos de la placa superior en relación a la placa inferior
debe ser tal que la esquina de abajo de cada pared de un pocillo de
la placa de 96 pocillos sin fondo se alinea con 4 pocillos en la
placa inferior. Mediante tal procedimiento, se provee una placa de
microtitulación según la presente invención que comprende 96
clusters, comprendiendo cada cluster 4 pocillos. También pueden
barrenarse o proporcionarse de otras formas, pasajes a pocillos
adyacentes dentro de un cluster tales como los antes descritos de
manera tal que todos los pocillos en ese cluster estén conectados de
alguna forma, directa o indirectamente.
En un aspecto final, la presente invención se
refiere al uso de una placa de microtitulación según la invención
para la detección de analitos en una muestra. En un uso preferente,
se detectan analitos múltiples, diferentes en dicha placa de manera
simultánea. El uso según este aspecto de la presente invención puede
ser ventajoso para todos los campos del análisis químico y
(bio)médico en los que las muestras deban estar sometidas a
ensayos de enlaces múltiples. Preferentemente, el uso se refiere al
diagnóstico de múltiples agentes de enfermedades.
En una realización particularmente preferente de
diversos aspectos de la presente invención se provee un ensayo de
múltiples analitos cuyo ensayo comprende el uso de una placa de
microtitulación según la presente invención en la que en cada
cluster de pocillos, se detectan simultáneamente diversos analitos
de una sola muestra, siendo detectado cada analito preferentemente
en un pocillo separado. Como se expuso, esto puede lograrse de
manera muy apropiada recubriendo el filtro de membrana de varios
pocillos individuales con diferentes ligandos de captura.
En una realización muy preferente, los diversos
ligandos de captura se seleccionan de manera tal que la placa de
microtitulación de la presente invención apoye la realización de
menús específicos de diagnóstico o paneles tal como se describió
anteriormente que, por ejemplo, cuando se lleve a cabo, indique el
agente causante específico de una enfermedad. Por ejemplo, menús
dirigidos al diagnóstico del agente causante de la mastitis pueden
entonces llevarse a cabo utilizando una placa de microtitulación de
la presente invención cuyo filtro de membrana de los pocillos
individuales esté recubierto con ligandos de captura capaces de
enlazar específicamente los agentes causantes de la mastitis, e. g.
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus uteris,
Streptococcus galacticae y/o Streptococcus agalacticae,
potencialmente presentes en una muestra de la que se sospecha. De
manera alternativa, o en combinación con ellos, los anticuerpos
contra tales agentes que son producidos por el sujeto del cual se
obtiene la muestra pueden ser detectados en dicha muestra.
Otros menús apropiados incluyen menús para
agentes específicos de enfermedades o para tipos de enfermedades
específicas tales como:
Pestivirus (incluyendo ligando de captura para
el Virus de la Diarrea Viral Bovina (BVDV), Virus de la Enfermedad
de la Frontera (BDV), Virus Clásico de Fiebre Porcina (CSFV), etc.
y/o anticuerpos de estos).
Diarrea (incluyendo ligandos de captura para
E. coli, Rotavirus, Coronavirus (e.g. coronavirus (BCV)),
Cryptosporidium, Escherichia coli K99, enterotoxigénica,
Salmonellae spp. y/o anticuerpos de éstos).
Enfermedades respiratorias (incluyendo ligandos
de captura para Virus 1 de herpes bovino (BHV1), BVD, virus
sincítico respiratorio bovino (BRSV), virus bovino de parainfluenza
3 (Pl3), adenovirus, Mycoplasma bovine, Pasteurella
haemotytica y/o anticuerpos de éstos.
- Enfermedad de Johne (sensibilidad
incrementada): (incluyendo e. g. ligandos de captura para
anticuerpos contra Mycobacterium paratuberculosis, interferón
gamma, etc.).
Menú de prión aberrante (incluyendo ligandos
para nvBSE, nveScrapie, nvCWD, nvCFJ).
Alternativamente, una placa de microtitulación
de la presente invención puede diseñarse de manera que apoye la
realización de menús específicos de diagnóstico relacionados con un
animal en particular, por ejemplo que comprenda ligandos de captura
para diversos agentes causantes o para anticuerpos producidos contra
cerdos, ovejas, vacas, caballos, etc. Por ejemplo:
- Vacas (Ganado): un menú en el cual pueden
incluirse ligandos de captura para detectar la presencia de Virus
Respiratorio Bovino Sincitial (BRSV); Virus de Diarrea Viral Bovina
(BVDV); Brucilla, opcionalmente subdividida en B. abortus y B
melitensis; Virus de Fiebre Aftosa (FMDV); Leptospirosis (e. g.
Leptospira interrogans serovar hardjo); Dictyocaulus
viviparous (lombriz de pulmón); BSE (enfermedad de las vacas
locas); Hemophilussomnus; Pasteurella haemotytica;
Cerdos: un menú en el cual pueden incluirse
ligandos de captura para detectar la presencia de Virus de Fiebre
Bovina Clásica (CSFv), opcionalmente de cepa específica; Virus de
Fiebre Aftosa (FDMV); Parvo Virus Porcino (PPV); Virus de
Pseudorabia; Virus de Enfermedad Vesicular Porcina (SVDV), virus
porcino de síndrome respiratorio y reproductivo (PRRSV o
Lelystadvirus), circovirus 1 y 2 porcino (causante de síndrome de
consunción multisistémica (PMWS), Virus de Influenza en Cerdos
(SIV).
Ovejas: Un menú en el cual pueden incluirse
ligandos de captura para detectar la presencia de Brucella,
opcionalmente subdividida en B. abortus y B.
melitensis; Virus de Fiebre Aftosa (FMDV).
También diversos menús de propósito específico
pueden diseñarse tales como menús específicos de exportación que son
dependientes del país, tales como menús que comprenden ligandos de
captura para llevar a cabo por ejemplo un examen Aujeszky, un examen
de Salmonella, un examen SVDV y un cuarto examen, que puede
variarse en dependencia del status específico de las diversas
enfermedades en ese país.
Otro menú de propósito específico puede
comprender por ejemplo un menú específico de banco de sangre que
comprenda un menú de ligandos de captura para la detección de los
diversos agentes de enfermedades infecciosas que son examinados en
instalaciones de donaciones de sangre, e. g. parejas de enlace para
virus de inmunodeficiencia humana (HIV) 1 y 2; virus de la hepatitis
B (HBV); Anticuerpo de núcleo de Hepatitis B (AHBC); virus de
Hepatitis C (HCV); virus linfotrópicos-T humanos I y
II (HTLV); sífilis, gonorrea; enfermedad de Lyme y Enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob (CJD).
Otros menús aún pueden por ejemplo incluir
tales menús para exámenes de alergias específicas.
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Este listado de referencias citadas por el
solicitante es únicamente para conveniencia del lector. Éste no
forma parte del documento de la patente europea. Aunque se ha tomado
especial cuidado en la compilación de las referencias, no pueden
excluirse errores u omisiones y la OEP no reconoce reclamaciones o
responsabilidad en este sentido.
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Claims (14)
1. Una placa de microtitulación que comprende
una pluralidad de pocillos de un material rígido seleccionado entre
el grupo que consta de vidrio, poliestireno, poliacrilo, poliamida,
polietileno, polipropileno,
estireno-acrilato-butadieno (ABS),
Barnox, cloruro de polivinilo (PVC), nailon, acetato de
etileno-vinilo (EVA), tereftalato de polietileno
(PET) y combinaciones de éstos, en la que cada pocillo es un pocillo
de una placa de microtitulación regular, y en la que cada pocillo
está separado de un pocillo adyacente mediante una pared divisoria
de pocillos, caracterizada porque el fondo de cada pocillo
está compuesto por un filtro de membrana semipermeable capaz de
enlazar directa o indirectamente un analito, y en la que dichos
pocillos están agrupados en uno o más clusters, comprendiendo cada
cluster al menos dos pocillos, en la que dichos clusters están
separados de clusters adyacentes mediante una pared divisoria de
clusters y en la que al menos parte de la pared divisoria de
pocillos es más baja que la pared divisoria de clusters, o en la que
la pared divisoria de pocillos contiene al menos un pasaje que
conecta al menos dos pocillos adyacentes dentro de un cluster,
estando dicho pasaje a una distancia del fondo del pocillo y al
menos parcialmente por debajo de la parte superior del pocillo.
2. Placa de microtitulación según la
reivindicación 1, en la que cada cluster de contenedores comprende
al menos n^{2} contenedores, donde n es un entero, preferentemente
un entero de 2-10, más preferente de
2-5.
3. Placa de microtitulación según la
reivindicación 1 o 2, en la que dicho filtro de membrana comprende
fluoruro de polivinilideno (PVDF).
4. Placa de microtitulación según una cualquiera
de las reivindicaciones de la 1 a la 3, en la que al menos un
pocillo en un cluster de pocillos comprende un ligando de captura
para enlazar específicamente un analito al filtro de membrana de
dicho pocillo.
5. Placa de microtitulación según una cualquiera
de las reivindicaciones de la 1 a la 4, en la que al menos dos
pocillos en un cluster de pocillos comprende una cantidad diferente
de ligandos de captura para enlazar específicamente un analito a
dicho filtro de membrana.
6. Placa de microtitulación según una cualquiera
de las reivindicaciones de la 1 a la 5, en la que al menos dos
pocillos en un cluster de pocillos comprenden un ligando de captura
diferente para enlazar específicamente un analito a dicho filtro de
membrana.
7. Placa de microtitulación según una cualquiera
de las reivindicaciones de la 4 a la 6, en la que dicho analito es
un agente de enfermedad infecciosa o un anticuerpo contra éste.
8. Placa de microtitulación según una cualquiera
de las reivindicaciones de la 1 a la 7, en la que al menos un
cluster comprende ligandos de captura específicos para la detección
del agente causante de la tembladera ovina o caprina
(scrapie), encefalopatía espongiforme bovina (BSE),
enfermedad de consunción crónica y/o enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob.
9. Placa de microtitulación según la
reivindicación 8, en la que al menos un cluster comprende ligandos
de captura para la detección de isoformas patogénicas de proteínas
de priones PrP^{Sc} (scrapie), PrP^{BSE} (encefalopatía
espongiforme bovina), PrP^{CWD} (enfermedad de consunción crónica)
y/o PrP^{CJD} (enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob).
10. Un método para la detección de uno o más
analitos en una muestra líquida que comprende:
a) proporcionar una placa de microtitulación
según una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 9;
b) aplicar dicha muestra líquida al menos a un
cluster de pocillos, filtrando dicha muestra líquida a través de
dicho filtro de membrana, enlazando por tanto dicho uno o más
analitos a dicho filtro de membrana o ligandos de captura, y
llevando a cabo opcionalmente los pasos de lavado;
c) detectar dicho uno o más analitos enlazados
en dichos pocillos llevando a cabo un ensayo de enlace en dicho
filtro de membrana, siendo dicho ensayo de enlace preferentemente un
inmunoensayo quimioluminiscente.
11. Método según la reivindicación 10, en el que
dicho uno o más analitos comprenden un agente de enfermedad
infecciosa o un anticuerpo contra éste.
12. Método según la reivindicación 11, en el que
el agente de enfermedad infecciosa es un prión, preferentemente un
prión causante de encefalopatía espongiforme (TSE).
13. Uso de una placa de microtitulación tal como
se define en una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 9,
para la detección de analitos en una muestra líquida.
14. Uso según la reivindicación 13, en el que
dicha detección comprende la detección simultánea de múltiples
analitos en dicha muestra.
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