ES2311122T3 - Antagonistas de kim-1 y uso para la modulacion del sistema inmune. - Google Patents

Abstract

Uso de un antagonista de KIM-1 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad autoinmune, en el que el antagonista de KIM-1 es (a) un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la porción extracelular del polipéptido KIM-1 de longitud completa, seleccionándose el polipéptido KIM-1 del grupo que consiste en la SEC ID Nº:1 y la SEC ID Nº: 2 o (b) un polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina de KIM-1 y que carece de un dominio transmembrana y de un dominio citoplasmático de KIM-1.

Description

Antagonistas de KIM-1 y uso para la modulación del sistema inmune.

Campo de la invención

El campo de la invención es la medicina, la inmunología, la biología molecular y la química de proteínas.

Antecedentes de la invención

KIM-1 (Molécula de daño renal-1) es una glicoproteína de membrana celular de tipo I (Ichimura et al., 1998, J. Biol. Chem. 273: 4135-4142). La porción extracelular (ectodominio) de KIM-1 contiene un dominio similar a inmunoglobulina de seis cisteínas y un dominio rico en T/SP característico de proteínas O-glicosiladas de tipo mucina. El dominio de mucina prolonga el dominio similar a Ig fuera de la superficie celular como un tallo (Jentoft, 1990, Trends Biochem. Sci. 15: 291-294). KIM-1 se ha identificado como el receptor para el virus de la hepatitis A (Kaplan et al., 1996, EMBO J. 15: 4282-4296; documento WO 96/04376; patente US Nº 5.622.861). Se han descubierto dos variantes de corte y empalme (en inglés "splice variants") de KIM-1 humana, siendo una predominante en el hígado (Feigelstock, 1998, J. Virol. 72: 6621-6628) y la otra siendo predominante en el riñón (Ichimura et al., anteriormente).

KIM-1 es un miembro de una familia de genes conocida como la familia TIM (dominio de mucina e inmunoglobulina de células T). Además de KIM-1, existen al menos otros dos miembros de la familia TIM en seres humanos. Un miembro se clonó y se denominó originariamente "gen 200" (documento WO200073498), pero posteriormente se hizo conocido como TIM-3. Otro miembro se clonó y se denominó "gen 58" (documento W099/38881).

KIM-1 ha atraído interés como marcador de diagnóstico clínico para lesiones renales (Bailly et al., 2002, J. Biol. Chem. 277: 39739-39748; Han et al., 2002, Kidney Intl. 62: 237-244). Se ha descrito que existe un homólogo de ratón de KIM-1 (TIM-1) en el interior de un locus genético que se piensa está implicado en el desarrollo de la hiperreactividad de las vías respiratorias (Mclntire et al., 2001, Nature Immunology 2: 11 09). Se ha descrito que una proteína de ratón conocida como TIM-2 desempeña un papel en la generación in vivo de células T específicas de antígeno (Kumanogoh et al., 2002, Nature 419: 629-633). Una proteína de ratón conocida como TIM-3 se ha asociado con la regulación de la respuesta inmune en ratones (Monney et al., 2002. Nature 415: 536-541).

Se ha evaluado un anticuerpo monoclonal de CD4 quimérico, cM-T412, en pacientes con lupus eritematoso cutáneo (Prinz et al., 1996, J. Am. Acad. Dermatol., 34 (2 Pt 1): 244-52, véase el Resumen), y se ha desarrollado una proteína de fusión de receptor de TNF soluble (Etanercept) para el tratamiento de la artritis reumatoide temprana y de moderada a gravemente activa (Yung, 2001, Current Opinion in Investigational Drugs, 2 (2): 216-221).

Descripción resumida de la invención

Se ha descubierto que el tratamiento de un mamífero con un antagonista de KIM-1 altera la interacción de las células T con otras células del sistema inmune, por ejemplo, células dendríticas, monocitos, macrófagos y células B y, por lo tanto, suprime enérgicamente una respuesta de IgG contra un antígeno. Además, se ha descubierto que dicho tratamiento elimina prácticamente la producción de Ig1 por parte de las células B de memoria en respuesta a una exposición posterior con el antígeno. Además, se ha descubierto que el bloqueo de la unión de KIM-1 a su receptor reduce la secreción de IFN-\gamma por células inmunes implicadas en una respuesta antigénica en el ensayo de respuesta mixta de linfocitos (MLR). En base a estos descubrimientos, la invención proporciona métodos para modular terapéuticamente la función inmune en enfermedades autoinmune y otros trastornos del sistema inmune de mamíferos.

La invención describe un método de inhibir la señalización entre una célula T y un segunda célula, por ejemplo, una célula presentadora de antígeno (CPA) en un mamífero. El método implica identificar a un mamífero, por ejemplo, uno con una enfermedad o trastorno inmune, o uno que se esté preparando para recibir un injerto tisular. La invención proporciona un uso de un antagonista de KIM-1 que es: (a) un polipéptido que comprende un dominio de Ig de KIM-1 y que carece de un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático de KIM-1; (b) un anticuerpo anti-KIM-1 que se une específicamente a la porción extracelular del polipéptido KIM-1 de longitud completa, seleccionándose el polipéptido KIM-1 del grupo que consiste en la SEC ID Nº: 1 y la SEC ID Nº: 2 o (c) un fragmento de unión a antígeno de dicho anticuerpo anti-KIM-1 para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de enfermedades autoinmunes.

La célula T puede ser una célula T activada, por ejemplo, una célula T auxiliar. Puede ser una célula Th2 o una célula Th1. En algunas realizaciones de la invención, la célula T es una célula T de donante injertada. La CPA puede ser, pero no se limita a, un monocito, un macrófago, una célula dendrítica o una célula B. En algunas realizaciones de la invención, la CPA está presentando un autoantígeno.

Preferiblemente, el antagonista de KIM-1 es un polipéptido soluble que puede incluir un dominio de mucina de KIM-1 además del dominio de Ig de KIM-1. En algunas realizaciones, el polipéptido incluye una unidad heteróloga, por ejemplo, una unidad de inmunoglobulina (Ig), una unidad de albúmina sérica, una unidad de dirección, una unidad indicadora, una unidad de multimerización y una unidad que facilita la purificación. Una unidad heteróloga preferida es una unidad de Ig tal como una unidad de Fc.

En algunas realizaciones, el antagonista de KIM-1 es un polipéptido conjugado a un polímero tal como un polialquilenglicol, un polímero de azúcar o un polipéptido. Un polímero preferido es un polialquilenglicol, prefiriéndose particularmente polietilenglicol (PEG). El peso molecular medio del polímero es preferiblemente de 2.000 Da a 30.000 Da y, más preferiblemente, de 5.000 Da a 20.000 Da, por ejemplo, de aproximadamente 10.000 Da.

La invención describe un método de inhibición de la activación de una célula B en un mamífero, por ejemplo, mediante una célula T activada tal como una célula Th2. El método incluye poner en contacto a la célula B u otra CPA con una cantidad eficaz del antagonista de KIM-1, o de la célula T, si el antagonista es un anticuerpo anti-KIM-1 de la invención. La célula T activada puede ser una célula T de donante injertada.

La invención describe un método de inhibición de la producción en un mamífero de un subconjunto de anticuerpos tales como IgG, por ejemplo IgG1, reactivos frente a uno o más antígenos. El método incluye administrar una cantidad eficaz del antagonista de KIM-1. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz del antagonista de KIM-1 se administra entre 30 minutos y 30 días antes de que el sistema inmune del mamífero reconozca por primera vez el uno o más antígenos. Los antígenos son aloantígenos o autoantígenos, dependiendo de la enfermedad, trastorno o afección que se trate.

La invención describe un método de inhibición de la recaída de enfermedad en una enfermedad autoinmune. El método incluye administrar una cantidad eficaz del antagonista de KIM-1.

La invención describe un método de inhibición de la propagación de epítopos en una enfermedad autoinmune. El método incluye administrar una cantidad eficaz del antagonista de KIM-1.

La invención describe un método de tratamiento de una enfermedad mediada por células Th2, por ejemplo, lupus eritematoso sistémico, miastenia grave, anemia hemolítica autoinmune, enfermedad de Chagas, enfermedad de Graves, púrpura trombocitopénico idiopático (ITP), granulomatosis de Wegener, poliarteritis nodosa, glomerulonefritis semilunar rápidamente progresiva o enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD), asma, dermatitis atópica, trastornos atópicos tales como enfermedades de hipersensibilidad de las vías respiratorias y síndromes de insuficiencia de las vías respiratorias. El método incluye administrar una cantidad eficaz del antagonista de KIM-1.

La invención describe un método de inhibición de la GVHD. El método incluye administrar una cantidad eficaz del antagonista de KIM-1 entre 30 minutos y 30 días antes del injerto.

La invención describe un método de inhibición de la secreción de IFN-\gamma por linfocitos en un mamífero. El método incluye administrar al mamífero una cantidad eficaz del antagonista de KIM-1.

La invención describe un método de inhibición de la activación de la función efectora de células T Th1 y, por lo tanto, de las respuestas inmunes celulares que aparecen en situaciones inflamatorias. Un ejemplo de dicha situación inflamatoria es la enfermedad inflamatoria del intestino. El método incluye administrar al mamífero una cantidad eficaz del antagonista de KIM-1.

La invención describe un método de tratamiento de una enfermedad o trastorno inflamatorio en un mamífero, por ejemplo, enfermedades inflamatorias del intestino tales como enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa e ileitis. El método incluye administrar al mamífero una cantidad eficaz de un antagonista de KIM-1.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "anticuerpo anti-KIM-1" se refiere a un anticuerpo, por ejemplo, una molécula de IgG, que se une específicamente a la porción extracelular de un polipéptido KIM-1 de longitud completa.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "polipéptido KIM-1 humano de longitud completa" se refiere al polipéptido de la SEC ID Nº: 1 en su totalidad o de la SEC ID Nº: 2 en su totalidad. Estos dos polipéptidos representan variantes de corte y empalme del gen de KIM-1 humano.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "unidad heteróloga" se refiere a una secuencia de aminoácidos que no está presente en un polipéptido KIM-1 de longitud completa.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "antagonista de HIM-1" se refiere a (a) un polipéptido que comprende un dominio de Ig de KIM-1; y que carece de un dominio transmembrana y de un dominio citoplasmático de KIM-1; y (b) un anticuerpo anti-KIM-1 que se une específicamente a la porción extracelular del polipéptido KIM-1 de longitud completa, seleccionándose el polipéptido KIM-1 del grupo que consiste en la SEC ID Nº: 1 y la SEC ID Nº: 2, o (c) un fragmento de unión a antígeno de dicho anticuerpo anti-KIM-1, cada uno de los cuales bloqueando, inhibiendo o interfiriendo con la actividad biológica de un KIM-1 de origen natural.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "proteína de fusión de KIM-1" se refiere a una proteína de fusión que incluye una unidad de KIM-1 fusionado a una unidad heteróloga.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "unidad de KIM-1" se refiere a un fragmento biológicamente activo de un polipéptido KIM-1 de longitud completa.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "polipéptido KIM-1" se refiere a una unidad de KIM-1 solo o en una proteína de fusión que incluye una unidad de KIM-1.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "dominio de Ig de KIM-1" se refiere a una porción de la SEC ID Nº: 1 cuyo extremo amino terminal son los aminoácidos 29-36 y cuyo extremo carboxi terminal son los aminoácidos 105-107.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "dominio de mucina de KIM-1" se refiere a una porción de la SEC ID Nº: 1 cuyo extremo amino terminal son los aminoácidos 126-130 y cuyo extremo carboxi terminal son los aminoácidos 255-274.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "dominio transmembrana de KIM-1" se refiere a los aminoácidos 290-311 de la SEC ID Nº: 1.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "dominio citoplasmático de KIM-1" se refiere a los aminoácidos 312-334 de la SEC ID Nº: 1 ó 312-359 de SEC ID Nº: 2.

A menos que se defina otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que comúnmente se entiende por un experto en la materia a la que pertenece la invención. En caso de conflicto, dominará la presente memoria descriptiva incluyendo las definiciones.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción detallada y de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 (técnica anterior) es una representación esquemática de dos variantes de corte y empalme de origen natural del polipéptido KIM-1 humano. Las dos secuencias de aminoácidos son idénticas hasta el residuo 323. La secuencia señal (residuos 1-20) se indica mediante subrayado. El dominio transmembrana (residuos 290-311) se indica mediante un doble subrayado.

La Figura 2 (técnica anterior) es una representación esquemática de la variante de corte y empalme de KIM-1 humano de 359 aminoácidos. La secuencia señal y los dominios transmembrana se indican mediante un sombreado oscuro. Los residuos de cisteína en el dominio de Ig se indican mediante "C." Los triángulos invertidos indican puntos de unión de N-glicanos. Una región rica en TSP, que se corresponde con el dominio de mucina, se indica mediante un sombreado más intenso.

La Figura 3 es un histograma que resume las titulaciones de inmunoglobulinas medidos el día 14 en ratones Balb/c que reciben una exposición primaria con eritrocitos de oveja (experimento 1).

La Figura 4 es un histograma que resume las titulaciones de inmunoglobulinas medidos el día 14 en ratones Balb/c que reciben una exposición primaria con eritrocitos de oveja (experimento 2).

La Figura 5 es un histograma que resume las titulaciones de inmunoglobulinas medidos el día 7 en ratones C57B1/6 que reciben una exposición primaria con eritrocitos de oveja.

La Figura 6 es un histograma que resume las titulaciones de inmunoglobulinas medidos en ratones del experimento 1 después de permitírseles una recuperación completa tras la exposición primaria (Figura 3) y después de volverlos a exponer. La titulación de inmunoglobulinas se midió el día 3 después de la nueva exposición.

La Figura 7 es un histograma que resume las titulaciones de inmunoglobulinas medidos en ratones del experimento 2 después de permitírseles una recuperación completa tras la exposición primaria (Figura 4) y después de volverlos a exponer. La titulación de inmunoglobulinas se midió el día 3 después de la nueva exposición.

La Figura 8 es un histograma que resume los datos sobre la producción de IFN\gamma en cultivos de MLR de ratón. Se usaron esplenocitos de Balb/c irradiados para estimular esplenocitos obtenidos de ratones C57B16. Después de 48 h en cultivo los sobrenadantes se recogieron y se usaron para medir los niveles de IFN\gamma. El tratamiento de los cultivos con mAb 3A2 y 1 H9 durante la incubación redujo significativamente el nivel de IFN\gamma secretado en el sobrenadante.

La Figura 9 es un histograma que resume los datos sobre la proliferación celular en cultivos de MLR de ratón. Se usaron esplenocitos de Balb/c irradiados para estimular esplenocitos obtenidos de ratones C57B16. Después de 72 h en cultivo se añadió un colorante vital a los cultivos y se dejó que se desarrollara durante 1-4 horas. El tratamiento de los cultivos con anticuerpos anti-KIM-1 durante el periodo de cultivo de 3 días no afectó a la proliferación
celular.

La Figura 10 es un histograma que resume los datos sobre la producción de IFN\gamma en cultivos de MLR de ratón. Se usaron esplenocitos de Balb/c irradiados para estimular los esplenocitos obtenidos de ratones C57B16. Después de 48 h en cultivo, los sobrenadantes se recogieron y se usaron para medir los niveles de IFN\gamma. El tratamiento de los cultivos con proteína de fusión de KIM-1-Ig durante la incubación redujo significativamente el nivel de IFN\gamma secretado en el sobrenadante.

La Figura 11 es un histograma que resume los datos sobre la proliferación celular en cultivos de MLR de ratón. Se usaron esplenocitos de Balb/c irradiados para estimular esplenocitos obtenidos de ratones C57B16. Después de 72 h en cultivo se añadió un colorante vital a los cultivos y se dejó que se desarrollara durante 1-4 horas. El tratamiento de los cultivos con proteína de fusión de KIM-1-Ig durante el periodo de cultivo de 3 días no afectó a la proliferación celular.

Las Figuras 12A y 12B son histogramas que resumen los datos sobre la producción de IFN\gamma en cultivos de MLR humanos. Se usaron células JY irradiadas para estimular células mononucleares de sangre periférica de un donante humano normal. Después de 5 días en cultivo se recogieron los sobrenadantes y se usaron para medir los niveles de IFN-\gamma e II-2. El tratamiento de los cultivos con los mAb AUF1 y AKG7 durante la incubación redujo significativamente el nivel de IFN\gamma secretado en el sobrenadante (Figura 12A), mientras que el nivel de II-2 producido permaneció invariable (Figura 12B).

La Figura 13 es un histograma que resume los datos sobre la proliferación celular en cultivos de MLR humanos. Se usaron células JY irradiadas para estimular células mononucleares de sangre periférica de un donante humano normal. Después de 6 días en cultivo se añadió un colorante vital a los cultivos y se dejó que se desarrollara durante 1-4 horas. El tratamiento de los cultivos con mAb anti-KIM-1 humano durante el periodo de cultivo de 6 días no afectó significativamente a la proliferación celular.

La Figura 14 es un histograma que resume los datos sobre la pérdida de peso después de la inducción de enfermedad inflamatoria del intestino en ratones. Se expusieron ratones Balb/c hembra a sulfato sódico de dextrano (DSS). Después de 8 días, los ratones se cambiaron de nuevo a agua sola y se dejó que se recuperaran de la exposición con DSS. Tres días después, los ratones se pesaron. El peso se calculó como porcentaje del peso al comienzo del experimento. El tratamiento con la proteína de fusión de KIM-1-Ig confirió una protección significativa a los ratones, como indicaba la mejora en la puntuación de peso. Había 10 ratones/grupo. Un ensayo de la equivalencia de las medias dio una significación de > p = 0,0001.

Las Figuras 15A y 15B son histogramas que resumen los datos de puntuación clínica después de la inducción de la enfermedad inflamatoria del intestino en ratones. Después de un periodo de recuperación de 3 días, se evaluaron en los ratones por la diarrea y la presencia de sangre en las heces. Los ratones tratados con proteína de fusión de KIM-1-Ig tenían una puntuación significativamente mejor que los grupos no tratados o tratados con control-Ig (Figura 15A). Esto se debía en parte a que significativamente menos ratones tenían sangre presente en los sedimentos fecales (Figura 15B). Los ensayos de equivalencia de las medias dieron un valor significativo para las diferencias en la puntuación clínica (p = 0,05) de controles no tratados en comparación con las cohortes tratadas con KIM-1-Ig.

Descripción detallada de la invención

El gen de KIM-1 humano nativo codifica un polipéptido (Figura 1) que contiene 334 aminoácidos o 359 aminoácidos (SEC ID Nº: 1), dependiendo de la variante de corte y empalme, que es al menos parcialmente dependiente de tejido. Ambas secuencias incluyen: una secuencia señal, un dominio de Ig, un dominio de mucina, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático.

Usando una proteína de fusión dimerizada soluble de ectodominio de KIM-1-Fc (cada monómero conteniendo el ectodominio de KIM-1 de ratón y una unidad de Fc humano) y un modelo animal reconocido (respuesta a SRBC en murino), los inventores han logrado una profunda alteración de la respuesta inmune de mamíferos. Sin pretender ligarse a teoría alguna, los inventores interpretan que los resultados observados indican que la proteína de fusión actúa como un antagonista de KIM-1 y que este antagonismo interfiere con una interacción de señalización mediada por KIM-1 entre células T y CPA. Los efectos aguas abajo de esta interferencia incluyen una modulación útil de la respuesta inmune de mamíferos. Dicha modulación puede usarse para tratar enfermedades autoinmunes y otras enfermedades y trastornos en los que un sistema inmune de mamífero ataca a una diana inapropiada, ya sea a través de la citotoxicidad de células T o a través de una respuesta de inmunoglobulinas. Los ejemplos de enfermedades o trastornos en los que sería beneficiosa una modulación del sistema inmune incluyen, pero no se limitan a, artritis, lupus eritematoso sistémico (también conocido como SLE o lupus) y enfermedad de injerto contra hospedador
(GVHD).

En los usos de la presente invención, un polipéptido antagonista de KIM-1 soluble o un anticuerpo bloqueante de KIM-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno) puede administrarse directamente como un polipéptido preformado. Como alternativa, puede administrarse indirectamente a través de un vector de ácido nucleico (que codifique y exprese el polipéptido). De cualquier forma, el resultado es antagonizar los efectos mediados por KIM-1 sobre células T, incluyendo la activación de células T y la estimulación de la proliferación de células T. Este antagonismo de KIM-1 localizado sobre células T puede conseguir un efecto terapéutico deseado de manera directa mediante bloqueo de las acciones destructivas de las propias células T. Además, el antagonismo puede conseguir el efecto terapéutico deseado de manera indirecta, mediante bloqueo de la activación de células B mediada por células T activadas, reduciendo de este modo la producción de anticuerpos perjudiciales.

En diversas enfermedades, incluyendo enfermedades autoinmune y ciertos tipos de infecciones patógenas, las lesiones son el resultado de respuestas de autoanticuerpos, es decir, la producción de anticuerpos que reconocen antígenos propios. La presente invención proporciona métodos y moléculas para reducir dichas lesiones por interferencia en la activación y diferenciación de células T. Esto, a su vez, interfiere en la activación de células B mediada por células T activadas, que interfiere en la producción y secreción de inmunoglobulinas específicas, por ejemplo, IgG1, por las células B. Por consiguiente, cualquier enfermedad o trastorno caracterizado por respuestas de autoanticuerpos puede tratarse mediante el uso de los métodos y moléculas de la invención.

Cuando se tratan determinadas enfermedades autoinmunes, la exposición a antígenos y las respuestas del sistema inmune son transitorias. Esto da como resultado remisiones durante las que la administración de una cantidad eficaz de un antagonista de KIM-1 inhibiría la posterior reactivación de las respuestas inmunes contra uno o más antígenos. En este sentido la invención puede usarse para bloquear la recaída de enfermedad. Cuando se tratan determinadas enfermedades autoinmunes, el sistema inmune del mamífero reconoce primero el uno o más antígenos como parte de un proceso de propagación de epítopos en el curso de una enfermedad autoinmune.

Gran parte del daño en la enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD) es el resultado directo de las acciones de células T de donante que se activan en el hospedador (en respuesta a antígenos del hospedador), una vez injertadas, por ejemplo, en un transplante de médula ósea. En virtud de su capacidad para interferir con la activación de células T, la presente invención es útil para inhibir la GVHD. Además de los daños de las acciones directas de las células T de donante activadas, también existe un componente mediado por anticuerpos en la GVHD. Debido a que este componente mediado por anticuerpos depende de la activación de células T de donante, que activan a las células B productoras de autoanticuerpos, la invención reduce las lesiones mediadas por autoanticuerpos, así como las lesiones mediadas por la inmunidad celular en la GVHD.

Enfermedades autoinmunes mediadas por anticuerpos

El lupus eritematoso sistémico (SLE; lupus) es un trastorno autoinmune mediado por T_{H}-2 caracterizado por altos niveles de autoanticuerpos dirigidos contra antígenos intracelulares tales como ADN bicatenario, ADN monocatenario e histonas. En vista de estas características, el lupus ejemplifica una enfermedad autoinmune que puede tratarse de acuerdo con la presente invención.

Ejemplos de otras enfermedades autoinmunes sistémicas o específicas de órgano adecuadas para el tratamiento de acuerdo con la invención incluyen miastenia grave, anemia hemolítica autoinmune, enfermedad de Chagas, enfermedad de Graves, púrpura trombocitopénico idiopático (ITP), granulomatosis de Wegener, poliarteritis nodosa y glomerulonefritis semilunar rápidamente progresiva. Véase, por ejemplo, Benjamini et al., 1996, Immunology, A Short Course, Tercera Ed. (Wiley-Liss, Nueva York). Además, la artritis reumatoide (RA), que antes se pensaba que estaba mediada por la actividad citotóxica de células T, actualmente se sabe que tiene un componente de células B y/o anticuerpos (Leandro et al., 2002, Ann. Rheum. Dis., 61: 863-866; De Vita et al., Arthritis Rheum. 46: 2029-2033; Tsujietal., 2002, J. Exp. Med. 196: 1277-1290) y, por lo tanto, es adecuada para el tratamiento de acuerdo con la invención.

La respuesta inmune normal contra algunos agentes infecciosos patógenos provoca respuestas de autoanticuerpos perjudiciales. Un ejemplo es la enfermedad de Chagas, una cardiomiopatía inflamatoria que se desarrolla en seres humanos y animales de experimentación crónicamente infectados con Trypanosoma cruzi. Aparecen anticuerpos anti-moléculas propias en los sueros de pacientes con enfermedad de Chagas (Bach-Elias et al., 1998, Parasitol. Res. 84: 796-799; Tibbetts, et al., 1994, J. Immunol. 152: 1493-1499) y, por lo tanto esta enfermedad es adecuada para el tratamiento de acuerdo con la invención.

Otro ejemplo de destrucción de células por autoanticuerpos que resulta de una infección es el púrpura trombocitopénico idiopático (ITP), en el que los autoanticuerpos causan destrucción de plaquetas (mediante el complemento o células fagocíticas con receptor de Fc o C3b) y pueden conducir a sangrados. El ITP es adecuado para el tratamiento de acuerdo con la invención.

Enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD)

La GVHD ejemplifica una afección mediada por células T que puede tratarse usando los métodos de la invención. La GVHD se inicia cuando las células T del donante reconocen antígenos del hospedador como extraños. La GVHD, con frecuencia una consecuencia mortal del transplante de médula ósea (BMT) en pacientes humanos, puede ser aguda o crónica. Las formas aguda y crónica de la GVHD ejemplifican el desarrollo de respuestas de Th1 y Th2 específicas de antígeno, respectivamente. La GVHD aguda aparece en los primeros 2 meses después del BMT y se caracteriza por lesiones en piel, intestino, hígado y otros órganos mediados por células T citotóxicas del donante. La GVHD crónica aparece más tarde (más de 100 días después del BMT) y se caracteriza por hiperproducción de inmunoglobulinas (Ig), incluyendo autoanticuerpos y lesiones causadas por depósito de Ig en la piel, riñón, y otros órganos. Casi el 90% de los pacientes de GVHD aguda evolucionan hasta desarrollar GVHD crónica. La GVHD crónica parece ser una enfermedad mediada por células T Th2 (De Wit et al., 1993, J. Immunol. 150: 361-366). La GVHD aguda es una enfermedad mediada por Th1 (Krenger et al., 1996, Immunol. Res. 15: 50-73; Williamson et al., 1996, J. Immunol. 157: 689-699). La citotoxicidad de células Tes una característica de la GVHD aguda. La consecuencia de la citotoxicidad antihospedador del donante puede observarse de diversas formas. En primer lugar, los linfocitos del hospedador se destruyen rápidamente, de tal modo que los ratones que experimentan una GVHD aguda están profundamente inmunodeprimidos. En segundo lugar, los linfocitos del donante se injertan y se expanden en el bazo del hospedador y su actividad citotóxica puede medirse directamente in vitro aprovechando líneas celulares que expresan los antígenos del hospedador que pueden reconocerse (como extraños) por las células del donante. En tercer lugar, la enfermedad se vuelve mortal a medida que se destruyen tejidos y poblaciones celulares
adicionales.

La GVHD crónica es el resultado de la destrucción mediada por anticuerpos de tejidos y células del hospedador y se ha denominado GVHD "similar a SLE". Las manifestaciones incluyen formación de autoanticuerpos, depósito de Ig en diversos órganos (riñón, hígado), erupción cutánea, hiperplasia linfoide, lesiones similares a Sjögren, lesiones similares a esclerodermia, poliarteritis y otras patologías. Esta enfermedad está parcialmente mediada por la formación de autoanticuerpos. En vista de lo anterior, la GVHD crónica es adecuada para el tratamiento de acuerdo con la invención.

Otras enfermedades relacionadas con Th2

Los trastornos atópicos se caracterizan por la expresión por células del sistema inmune, incluyendo células T activadas y CPA, de citocinas, quimiocinas y otras moléculas que son características de respuestas Th2, tales como las citocinas IL-4, IL-5 e IL-13, entre otras. Dichos trastornos atópicos, por lo tanto, serán susceptibles de tratamiento mediante métodos que antagonizan el desarrollo de la respuesta Th2, tales como los antagonistas de KIM-1 de la invención. Los trastornos atópicos incluyen asma, hipersensibilidad y síndromes de insuficiencia de las vías respiratorias y patologías tales como dermatitis atópica. La invención proporciona un método de inhibición de los trastornos atópicos. El método incluye administrar una cantidad eficaz de un antagonista de KIM-1.

Enfermedades y trastornos inflamatorios mediados por linfocitos activados, CPA y citocinas proinflamatorias

Usando el ensayo de reacción mixta de linfocitos (MLR) en los sistemas de modelo de ratón y humano, los inventores han demostrado que el bloqueo de la unión de KIM-1 a su receptor, por ejemplo, usando mAb anti-KIM-1 o una proteína de fusión de KIM-1-Ig, reduce la secreción de IFN\gamma por células respondedoras. Por consiguiente, puede usarse un antagonista de KIM-1 para tratar cualquier enfermedad o trastorno mediado por IFN\gamma.

El IFN\gamma es una citocina crítica en las respuestas inmunes. Tiene efectos pleiotrópicos sobre el desarrollo y el alcance de procesos inflamatorios e inmunes (Boehm et al. 1997, Ann Rev Immunol 15: 749-795). Las deficiencias en la producción de IFN\gamma reducen las respuestas antivíricas y antibacterianas y atenúan las respuestas inflamatorias. Un antagonista de KIM-1 puede usarse ventajosamente para reducir la producción de IFN\gamma en enfermedades o trastornos en los que la producción de IFN\gamma es excesiva o inapropiada. Ejemplos de dichas enfermedades o trastornos incluyen enfermedades autoinmunes, colitis e inflamación crónica.

El IFN\gamma es un componente clave de la activación de células T y de las respuestas de células B. Influye en el desarrollo de células efectoras de células T (por ejemplo, mediante regulación cruzada con 11-4) y en la activación de células B (por ejemplo, mediante la regulación de la presentación de antígenos mediada por MHC y la expresión de moléculas B7). El IFN\gamma es un componente crítico de las respuestas inmunes mediadas por células T Th1. El IFN\gamma tiene efectos pronunciados sobre otros componentes del sistema inmune, tales como macráfagos y neutrófilos. Estimula su activación y la liberación de moléculas efectoras tóxicas.

El IFN\gamma tiene potentes efectos sobre tipos celulares que residen en tejidos. El endotelio se activa por IFN\gamma. Cuando se estimulan con IFN\gamma, las células que residen en un tejido enfermo, por ejemplo, sinoviocitos en la artritis reumatoide, secretan TNF y otras citocinas, MCP-1 y otras quimiocinas y moléculas efectoras tóxicas tales como óxido nítrico. Todas estas últimas funciones mediadas por IFN\gamma influyen en el tránsito de células hacia los tejidos durante la inflamación.

Como se muestra en el Ejemplo 5 (más abajo), el bloqueo de la unión de KIM-1 a su receptor reduce o elimina la producción de IgG-1 en el sistema modelo de SRBC. En el ensayo de MLR, los inventores han descubierto que el bloqueo de la unión de KIM-1 a su receptor reduce la producción de IFN\gamma por los linfocitos. Sin pretender ligarse a teoría alguna, se señala que la reducción en la producción de IgG1 y la reducción en la producción de IFN\gamma pueden representar dos efectos separados del bloqueo de KIM-1 y pueden no estar directamente relacionados. Por lo tanto, cuando se usa un antagonista de KIM-1 para modular la función inmune de acuerdo con la invención, el antagonista de KIM-1 puede proporcionar un efecto beneficioso a través de dos mecanismos de acción separados.

Proteínas de fusión y polipéptidos conjugados

Algunas realizaciones de la invención implican un polipéptido antagonista de KIM-1 en el que una unidad de KIM-1 se fusiona con una unidad heteróloga para formar una proteína de fusión de KIM-1. Las proteínas de fusión de KIM-1, al contrario que una unidad de KIM-1 en solitario, pueden usarse para lograr diversos objetivos. Dichos objetivos incluyen, por ejemplo, una vida media en suero aumentada, una biodisponibilidad mejorada, el direccionamiento in vivo a un órgano o tipo tisular específico, una eficacia de expresión recombinante mejorada, una secreción de la célula hospedadora mejorada y facilitación de purificación. Dependiendo del objetivo u objetivos a alcanzar, la unidad heteróloga puede ser inerte o biológicamente activo. Además, puede escogerse que se fusione de manera estable con la unidad de KIM-1 o que sea escindible in vitro o in vivo. Se conocen en la técnica unidades heterólogas para lograr diferentes objetivos.

Como una alternativa a la expresión de una proteína de fusión de KIM-1, una unidad heteróloga seleccionada puede preformarse y conjugarse químicamente a la unidad de KIM-1. En la mayoría de los casos, una unidad heteróloga seleccionada funcionará de manera similar, ya esté fusionada o conjugada a la unidad de KIM-1. Por lo tanto, en el siguiente análisis de secuencias aminoacídicas heterólogas, a menos que se indique otra cosa, debe entenderse que la secuencia heteróloga puede unirse a la unidad de KIM-1 en forma de una proteína de fusión o como un conjugado químico.

Los polipéptidos farmacológicamente activos tales como un polipéptido KIM-1 a menudo presentan una rápida aclaración in vivo, siendo necesarias dosis mayores para alcanzar las concentraciones terapéuticamente eficaces en el cuerpo. Además, los polipéptidos de un tamaño inferior a aproximadamente 20 kDa potencialmente experimentan filtración glomerular, que a veces conduce a nefrotoxicidad. Puede emplearse la fusión o conjugación de polipéptidos relativamente pequeños, tales como fragmentos de KIM-1, para reducir o evitar el riesgo de dicha nefrotoxicidad. Se conocen diversas secuencias de aminoácidos heterólogas, es decir, unidades polipeptídicas o "transportadoras" para aumentar la estabilidad in vivo, es decir, la vida media en suero, de polipéptidos terapéuticos.

Debido a su larga vida media, amplia distribución in vivo y ausencia de función enzimática o inmunológica, una unidad heteróloga preferida es esencialmente la albúmina sérica humana de longitud completa (HSA) o un fragmento de HSA. Mediante la aplicación de métodos y materiales tales como los que se muestran en Yeh et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 1904-1908 y Syed et al., 1997, Blood 89: 3243-3252, puede usarse HSA para formar una proteína de fusión o conjugado de KIM-1 que presente actividad farmacológica en virtud de la unidad de KIM-1, al tiempo que presente una estabilidad in vivo significativamente aumentada, por ejemplo, de 10 veces a 100 veces superior. Preferiblemente, el extremo N-terminal de la HSA se fusiona con el extremo C-terminal de la unidad de KIM-1. Puesto que la HSA es una proteína secretada de forma natural, la secuencia señal de HSA puede aprovecharse para obtener la secreción de la proteína de fusión de KIM-1 en el medio de cultivo celular, cuando la proteína de fusión se produce en un sistema de expresión eucariota, por ejemplo, un mamífero.

Algunas realizaciones de la invención emplean un polipéptido KIM-1 en el que una unidad de KIM-1 se fusiona con una región Fc, es decir, la porción C-terminal de una región constante de la cadena pesada de Ig. Las ventajas potenciales de una fusión de KIM-1-Fc incluyen solubilidad, estabilidad in vivo y multivalencia, por ejemplo, dimerización. La región Fc usada puede ser una región Fc de IgA, IgD o IgG (bisagra-CH2-CH3). Como alternativa, puede ser una región Fc de IgE o IgM (bisagra-CH2-CH3-CH4). Se prefiere una región Fc de IgG, por ejemplo, una región Fc de IgG1 o una región Fc de IgG4. Se conocen en la técnica materiales y procedimientos para construir y expresar ADN que codifica fusiones de Fc y pueden aplicarse para obtener fusiones de KIM-1 sin una experimentación
excesiva.

Preferiblemente, la fusión KIM-1-Fc se construye con una orientación en la que la unidad de KIM-1 forma la porción amino terminal de la proteína de fusión. Para un ejemplo de construcción y expresión de una fusión con Fc con esta orientación, véase, por ejemplo, Wallner et al., patente US Nº 5.547.853 (pSAB152). Como alternativa, la fusión puede construirse con la orientación opuesta, es decir, en la que la unidad de KIM-1 forma la porción carboxi-terminal de la fusión. Para ejemplos y un análisis de esta orientación, véase, por ejemplo, Lo et al., patente US Nº 5.541.087.

Algunas realizaciones de la invención emplean una proteína de fusión de KIM-1 obtenida por construcción de un ADN de inmunofusina de KIM-1 de acuerdo con Lo et al., patente US Nº 5.541.087. Un ADN de inmunofusina incluye un polinucleótido que codifica un casete de secreción. El casete de secreción incluye secuencias que codifican (en la dirección 5' a 3') una secuencia señal, una región Fc de inmunoglobulina y una unidad de KIM-1 fusionado al extremo 3' del casete de secreción. El ADN puede expresarse a niveles elevados en una célula hospedadora y la proteína de fusión se produce y se secreta eficazmente a partir de la célula hospedadora. La inmunofusina secretada puede recogerse de los medios de cultivo sin la necesidad de lisis de la célula hospedadora.

En algunas realizaciones, la secuencia de ADN codifica un sitio de escisión proteolítica entre la unidad de KIM-1 y la unidad heteróloga. Un sitio de escisión proporciona la escisión proteolítica de la proteína de fusión codificada, separando de este modo el dominio Fc de la proteína diana. Los sitios de escisión proteolítica útiles incluyen secuencias de aminoácidos reconocidas por enzimas proteolíticas tales como tripsina, plasmina o enteroquinasa K.

Una construcción de polipéptido KIM-1 puede incorporarse en un vector de expresión replicable. Los vectores útiles incluyen ácidos nucleicos lineales, plásmidos, fagémidos, cósmidos y similares. Un vector de expresión ejemplificativo es pSAB152 (Waliner et al., patente US Nº 5.547.853). Otro vector de expresión ejemplar es pdC, en el que la transcripción del ADN de inmunofusina se coloca bajo el control del potenciador y promotor del citomegalovirus humano (Lo et al., 1991, Biochim. Biophys. Acta 1088: 712; y Lo et al., 1998, Protein Engineering 11: 495-500). Una célula hospedadora apropiada puede transformarse o transfectarse con un ADN que codifica un polipéptido KIM-1 y usarse para la expresión y secreción del polipéptido KIM-1. Las células hospedadoras preferidas incluyen células de mieloma, células 293, células de ovario de hámster chino (CHO), células Hela, células COS y células de hibridoma inmortales.

Las regiones Fc de tipo salvaje completamente intactas presentan funciones efectoras que normalmente son innecesarias y no deseadas en una proteína de fusión con Fc de acuerdo con la presente invención. Por lo tanto, preferiblemente se delecionan determinados sitios de unión de la región Fc durante la construcción de una proteína de fusión de KIM-1-Fc. Por ejemplo, puesto que la coexpresión con la cadena ligera es innecesaria, el sitio de unión para la proteína de unión a la cadena pesada, Bip (Hendershot et al., 1987, Immunol. Today 8: 111-114) se deleciona de la región Fc de la IgE, de tal modo que este sitio no interfiera con la secreción eficaz de la proteína de fusión. Asimismo, los residuos de cisteína presentes en las regiones Fc que son responsables de la unión a la cadena ligera de la inmunoglobulina deberían delecionarse o sustituirse con otro aminoácido, de tal modo que estos residuos de cisteína no interfieran en el plegamiento apropiado de la región Fc cuando se produce como una inmunofusina. Deberían delecionarse las secuencias de dominios transmembrana, tales como las presentes en IgM.

Se prefiere la región Fc de IgG1. Como alternativa, puede usarse la región Fc de las otras subclases de gamma inmunoglobulinas (gamma 2, gamma 3 y gamma 4) en el casete de secreción. La región Fc de IgG1 de la inmunoglobulina gamma 1 que se usa preferiblemente en el casete de secreción incluye la región bisagra (al menos parte), la región CH2 y la región CH3. En algunas realizaciones, la región Fc de la inmunoglobulina gamma 1 es una Fc con CH2 delecionada, que incluye parte de la región bisagra y la región CH3, pero no la región CH2. Se ha descrito una Fc con CH2 delecionada por Gillies et al., 1990, Hum. Antibod. Hybridomas, 1:47. En algunas realizaciones, se usan las regiones Fc de IgA, IgD, IgE o IgM.

Pueden construirse proteínas de fusión de KIM-1-Fc en varias configuraciones diferentes. En una configuración, el extremo C-terminal de la unidad de KIM-1 se fusiona directamente con el extremo N-terminal de la unidad de Fc. En una configuración ligeramente diferente, se incorpora un engarce corto, por ejemplo, de 2-10 aminoácidos, en la fusión entre el extremo C-terminal de la unidad de KIM-1 y el extremo N-terminal de la unidad de Fc. Dicho engarce proporciona una flexibilidad conformacional que puede mejorar la actividad biológica en algunas circunstancias. Si se conserva una porción suficiente de la región bisagra en el resto de Fc, la fusión de KIM-1-Fc dimerizará, formando de este modo una molécula divalente. Una población homogénea de fusiones con Fc monoméricas darán dímeros bivalentes monoespecíficos. Una mezcla de dos fusiones con Fc monoméricas, teniendo cada una especificidad diferente, darán dímeros bivalentes biespecíficos.

Pueden construirse conjugados de KIM-1 usando métodos conocidos en la técnica. Puede usarse cualquiera de varios reticulantes que contienen un grupo amino reactivo y un grupo tiol reactivo correspondiente para unir KIM-1 a albúmina sérica. Ejemplos de engarces adecuados incluyen reticulantes reactivos con amina que insertan una maleimida reactiva con tiol. Estos incluyen, por ejemplo, SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS o GMBS. Otros engarces adecuados insertan un grupo haloacetato reactivo con tiol. Estos incluyen, por ejemplo, SBAP, SIA, SIAB, y que proporcionan un tiol protegido o no protegido para la reacción con grupos sulfhidrilo para producir un enlace reducible son SPDP, SMPT, SATA o SATP, estando todos disponibles en el mercado (por ejemplo, Pierce Chemicals). Un experto en la materia puede prever de forma similar estrategias alternativas que enlazarán el extremo N-terminal de KIM-1 con la albúmina sérica.

Un experto en la materia puede generar conjugados con albúmina sérica que no estén dirigidos al extremo N-terminal de un polipéptido KIM-1 o a la unidad de tiol en la albúmina sérica. Por ejemplo, pueden generarse fusiones de KIM-1-albúmina usando técnicas de ingeniería genética en las que la unidad de KIM-1 se fusiona con el gen de la albúmina sérica en su extremo amino terminal (N-ter), extremo carboxi terminal (C-ter) o en ambos extremos.

Otros derivados de polipéptidos KIM-1 incluyen conjugados covalentes o agregados de KIM-1 modificado o sus fragmentos, con otras proteínas o polipéptidos, tal como mediante síntesis en cultivo recombinante como extremos N-terminales o C-terminales adicionales. Por ejemplo, el péptido conjugado puede ser una secuencia polipeptídica señal (o líder) en la región N-terminal de la proteína que cotraduccionalmente o postraduccionalmente dirija la transferencia de la proteína desde su lugar de síntesis hasta su lugar de función en el interior o en el exterior de la membrana o pared celular (por ejemplo, el líder del factor alfa de levaduras). Los polipéptidos KIM-1 pueden fusionarse a péptidos heterólogos para facilitar la purificación e identificación de la unidad de KIM-1 (por ejemplo, fusiones de histidina/KIM-1). La unidad de KIM-1 también puede unirse al péptido Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (SEC ID Nº:) (Hopp et al., 1988, Biotechnology 6: 1204). Esta secuencia es muy antigénica y proporciona un epítopo reversiblemente unido por un anticuerpo monoclonal específico. Por consiguiente, facilita el ensayo y la purificación de la proteína recombinante expresada. Esta secuencia se escinde específicamente mediante la enteroquinasa de la mucosa bovina en el residuo inmediatamente posterior a la pareja Asp-Lys.

Se han usado sistemas de expresión que emplean construcciones de fusión de genes para potenciar la producción de proteínas en bacterias. El empleo de una proteína bacteriana que normalmente se expresa a un nivel muy elevado como el compañero de fusión amino terminal de una proteína de fusión ayuda a asegurar una transcripción y traducción eficaces del mensaje y, en algunos casos, la secreción y solubilización de la proteína de fusión. (Smith et. al., 1988 Gene 67: 31; Hopp et al., anteriormente; LaVallie et. al., 1993, Biotechnology 11: 187).

Polímeros conjugados (distintos de polipéptidos))

Algunas realizaciones de la invención implican un polipéptido KIM-1 en el que uno o más polímeros se conjugan (se unen covalentemente) al polipéptido KIM-1. Ejemplos de polímeros adecuados para dicha conjugación incluyen polipéptidos (analizados anteriormente), polímeros de azúcares y cadenas de polialquilenglicol. Típicamente, pero no necesariamente, un polímero se conjuga con el polipéptido KIM-1 con el fin de mejorar uno o más de los siguientes: solubilidad, estabilidad o biodisponibilidad.

Una clase preferida de polímero para la conjugación a un polipéptido KIM-1 es un polialquilenglicol. Es un polialquilenglicol preferido el polietilenglicol (PEG). Pueden conjugarse unidades de PEG, por ejemplo, polímeros de PEG 1-6, con cada polipéptido KIM-1 para aumentar la vida media en suero, en comparación con el polipéptido KIM-1 solo. Las unidades de PEG no son antigénicas y son, esencialmente, biológicamente inertes. Las unidades de PEG usadas en la práctica de la invención pueden ser ramificadas o no ramificadas.

El número de unidades de PEG unidas al polipéptido KIM-1 y el peso molecular de las cadenas de PEG individuales pueden variar. En general, cuanto mayor el peso molecular del polímero, menos cadenas de polímero unidas al polipéptido. Preferiblemente, el peso molecular medio del PEG es de 2 kDa a 100 kDa. Más preferiblemente, el peso molecular medio es de 5 kDa a 20 kDa, prefiriéndose más de 8-12 kDa.

El polímero, por ejemplo PEG, puede unirse al polipéptido KIM-1 a través de cualquier grupo reactivo expuesto adecuado en el polipéptido. El grupo o los grupos reactivos expuestos pueden ser, por ejemplo, un grupo amino N-terminal o el grupo amino épsilon de un residuo de lisina interno, o ambos. Pueden aprovecharse con este fin residuos de lisina de origen natural o pueden introducirse residuos de lisina por ingeniería genética en la secuencia de aminoácidos de KIM-1. Un polímero activado puede reaccionar y unirse covalentemente a cualquier grupo amino libre en el polipéptido KIM- 1. También pueden usarse grupos carboxílicos libres, grupos carbonilo convenientemente activados, unidades de hidroxilo, guanidilo, imidazol, de carbohidratos oxidados y grupos mercapto del KIM-1 (si están disponibles) como grupos reactivos para la unión de polímeros.

Preferiblemente, en una reacción de conjugación, se emplean de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 10 moles de polímero activado por mol de polipéptido dependiendo de la concentración de polipéptido. Habitualmente, la proporción elegida representa un equilibrio entre maximizar la reacción al tiempo que se minimizan las reacciones secundarias (con frecuencia inespecíficas) que pueden reducir la actividad farmacológica deseada de la unidad de KIM-1. Preferiblemente, se conserva al menos el 50% de la actividad biológica de polipéptido KIM-1 y, más preferiblemente, se conserva cerca del 100%.

El polímero puede conjugarse al polipéptido KIM-1 usando química convencional. Por ejemplo, una unidad de polialquilenglicol puede acoplarse con un grupo amino épsilon de lisina del polipéptido KIM-1. El enlace con la cadena lateral de la lisina puede realizarse con un éster activo de N-hidroxilsuccinimida (NHS), tal como PEG succinato de succinimidilo (SS-PEG) y propionato de succinimidilo (SPA-PEG). Las unidades de polialquilenglicol adecuadas incluyen, por ejemplo carboximetil-NHS, norleucina-NHS, SC-PEG, tresilato, aldehído, epóxido, carbonilimidazol y PNP carbonato. Estos reactivos están disponibles en el mercado. Otros engarces de PEG reactivos con amina pueden sustituirse por la unidad de succinimidilo. Estos incluyen, por ejemplo, isotiocianatos, nitrofenilcarbonatos, epóxidos y carbonatos de benzotriazol. Las condiciones se seleccionan preferiblemente para maximizar la selectividad y el grado de reacción. Dicha optimización de las condiciones de reacción está dentro del conocimiento rutinario en la
materia.

La PEGilación puede llevarse a cabo mediante cualquiera de las reacciones de PEGilación conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Focus on Growth Factors, 3: 4-10, 1992; solicitudes de patente europea publicadas EP 0 154 316 y EP 0 401 384. La PEGilación puede llevarse a cabo usando una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de polietilenglicol reactivo (o un polímero soluble en agua reactivo análogo).

La PEGilación por acilación generalmente implica la reacción de un derivado éster activo de polietilenglicol. Cualquier molécula de PEG reactivo puede emplearse en la PEGilación. Un éster de PEG activado preferido es PEG esterificado con N-hidroxisuccinimida (NHS). Como se usa en la presente memoria, la "acilación" incluye los siguientes tipos de enlaces entre la proteína terapéutica y un polímero soluble en agua tal como PEG: amida, carbamato, uretano y similares. Véase, por ejemplo, Bioconjugate Chem. 5: 133-140, 1994. Los parámetros de reacción deberían seleccionarse para evitar condiciones de temperatura, disolvente y pH que dañarían o inactivarían el polipéptido KIM-1.

Preferiblemente, el enlace de unión es una amida. Preferiblemente, al menos el 95% del producto resultante está mono-, dio- o tri-PEGilado. Sin embargo, pueden formarse algunas especies con grados mayores de PEGilación en cantidades que dependen de las condiciones de reacción específicas usadas. Opcionalmente, las especies PEGiladas purificadas se separan de la mezcla, particularmente especies sin reaccionar, mediante métodos de purificación convencionales, que incluyen, por ejemplo, diálisis, extracción salina, ultrafiltración, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel y electroforesis.

La PEGilación por alquilación generalmente implica la reacción de un derivado de aldehído terminal de PEG con KIM-1 en presencia de un agente reductor. Además, se pueden manipular las condiciones de reacción para favorecer la PEGilación sustancialmente sólo en el grupo \alpha-amino del extremo N-terminal de KIM-1 (es decir, una proteína mono-PEGilada). En cualquier caso de mono-PEGilación o poli-PEGilación, los grupos de PEG están preferiblemente unidos a la proteína mediante un grupo -CH_{2}-NH-. Con referencia particular al grupo -CH_{2}-, este tipo de enlace se conoce como enlace "alquilo".

La derivatización mediante alquilación reductora para producir un producto mono-PEGilado aprovecha la reactividad diferencial de diferentes tipos de grupos amino primarios (lisina frente al N-terminal) disponibles para derivatización. La reacción se realiza a un pH que permite aprovechar las diferencias de pKa entre los grupos \varepsilon-amino de los residuos de lisina y del grupo \alpha-amino del residuo N-terminal de la proteína. Mediante dicha derivatización selectiva, se controla la unión de un polímero soluble en agua que contiene un grupo reactivo tal como un aldehído a una proteína: la conjugación con el polímero tiene lugar predominantemente en el extremo N-terminal de la proteína y no se produce una modificación significativa de otros grupos reactivos, tales como grupos amino de la cadena lateral de la lisina. Las moléculas de polímero usadas tanto en las estrategias de acilación como de alquilación pueden seleccionarse entre polímeros solubles en agua, como se han descrito anteriormente. El polímero seleccionado debería ser modificado para que tenga un solo grupo reactivo, tal como un éster activo para la acilación o un aldehído para la alquilación, preferiblemente, de tal modo que el grado de polimerización puede controlarse como se proporciona en los presentes métodos. Un aldehído de PEG reactivo ejemplificativo es propionaldehído de polietilenglicol, que es estable en agua, o derivados mono C_{1}-C_{10} alcoxi o ariloxi del mismo (véase, la patente US Nº 5.252.714). El polímero puede ser ramificado o no ramificado. Para las reacciones de acilación, el polímero o polímeros seleccionados deberían tener un solo grupo éster reactivo. Para la alquilación reductora, el polímero o polímeros seleccionados deberían tener un solo grupo aldehído reactivo. Generalmente, el polímero soluble en agua no se seleccionará de entre los residuos glicosilo de origen natural, puesto que estos se generan habitualmente más convenientemente mediante sistemas de expresión recombinante en mamíferos.

Los métodos para preparar un KIM-1 PEGilado incluyen generalmente las etapas de (a) hacer reaccionar una proteína o polipéptido KIM-1 con polietilenglicol (tal como un éster reactivo o derivado aldehído de PEG) en condiciones por las que la molécula se une a uno o más grupos de PEG y (b) obtener el producto o productos de reacción. En general, las condiciones óptimas de reacción para las reacciones de acilación se determinarán caso por caso en base a parámetros conocidos y al resultado deseado. Por ejemplo, cuanto mayor sea la proporción de PEG:proteína, mayor el porcentaje de producto poli-PEGilado.

La alquilación reductora para producir una población sustancialmente homogénea de monopolímero/KIM-1 generalmente incluye las etapas de: (a) hacer reaccionar un polipéptido KIM-1 con una molécula de PEG reactivo en condiciones de alquilación reductora, a un pH adecuado para permitir la modificación selectiva del grupo \alpha-amino en el extremo amino terminal de KIM-1; y (b) obtener el producto o productos de reacción.

Para una población sustancialmente homogénea de monopolímero/polipéptido KIM-1, las condiciones de la reacción de alquilación reductora son las que permiten la unión selectiva de la unidad polimérica soluble en agua al extremo N-terminal de KIM-1. Dichas condiciones de reacción proporcionan generalmente diferencias de pKa entre los grupos amino de la lisina y el grupo \alpha-amina del extremo N-terminal (siendo el pKa el pH al que el 50% de los grupos amino están protonados y el 50% no lo están). El pH también afecta a la proporción de polímero con respecto a proteína que se va a usar. En general, si el pH es menor, se deseará un mayor exceso de polímero con respecto a proteína (es decir, cuanto menos reactivo sea el grupo \alpha-amino N-terminal, más polímero será necesario para conseguir las condiciones óptimas. Si el pH es mayor, la proporción de polímero:proteína no necesita ser tan grande. (Debido a que están disponibles grupos más reactivos, son necesarias menos moléculas de polímero). Para los fines de la presente invención, el pH preferido está en el intervalo de 3-9, preferiblemente de 3-6.

Los polipéptidos KIM-1 pueden incluir un marcador, por ejemplo, una unidad que posteriormente puede liberarse por proteólisis. Por lo tanto, el residuo de lisina puede modificarse selectivamente haciéndolo reaccionar primero con un marcador de His modificado con un engarce de bajo peso molecular, tal como un reactivo de Traut (Pierce), que reaccionará tanto con la lisina como con el extremo N-terminal y, después, liberando el marcador His. El polipéptido contendrá entonces un grupo SH libre que puede modificarse selectivamente con un PEG que contenga un grupo de cabeza reactivo con tiol, tal como un grupo maleimida, un grupo vinilsulfona, un grupo haloacetato o un SH libre o protegido.

El reactivo de Traut puede reemplazarse con cualquier engarce que preparará un sitio específico para la unión de PEG. A modo de ejemplo, el reactivo de Traut puede reemplazarse con SPDP, SMPT, SATA o SATP (todos disponibles de Pierce). De forma similar se podría hacer reaccionar la proteína con un engarce reactivo con una amina que inserte una maleimida (por ejemplo, SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS o GMBS), un grupo haloacetato (SBAP, SIA, SIAB) o un grupo vinilsulfona y hace reaccionar el producto resultante con un PEG que contenga un SH libre. La única limitación con respecto al tamaño del engarce que se emplea es que no puede bloquear la posterior eliminación del marcador N-terminal.

En algunas realizaciones, la unidad de polialquilenglicol se acopla a un grupo cisteína del polipéptido KIM-1. El acoplamiento puede efectuarse usando, por ejemplo, un grupo maleimida, un grupo vinilsulfona, un grupo haloacetato y un grupo tiol.

Opcionalmente, el polipéptido KIM-1 se conjuga a la unidad de polietilenglicol a través de un enlace inestable. El enlace inestable puede escindirse en, por ejemplo, hidrólisis bioquímica, proteólisis o escisión por sulfhidrilo. Por ejemplo, el enlace puede escindirse en condiciones (fisiológicas) in vivo.

Las reacciones pueden tener lugar mediante cualquier método adecuado usado para hacer reaccionar materiales biológicamente activos con polímeros inertes, preferiblemente a un pH de aproximadamente 5-8, por ejemplo, a un pH de 5, 6, 7 u 8, si los grupos reactivos están en el grupo alfa amino del extremo N-terminal. Generalmente, el proceso indica preparar un polímero activado y, después, hacer reaccionar la proteína con el polímero activado para producir la proteína soluble adecuada para formulación.

Uno o más sitios en un polipéptido KIM-1 pueden acoplarse a un polímero. Por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro o cinco unidades de PEG pueden unirse al polipéptido. En algunas realizaciones, una unidad de PEG se une al extremo amino terminal.

Anticuerpos anti-KIM-1

Un anticuerpo anti-KIM-1 o fragmento de unión a antígeno del mismo usado de acuerdo con la invención puede ser cualquiera de los diversos tipos de moléculas, incluyendo, pero no limitándose, un anticuerpo policlonal, anticuerpo monoclonal (mAb), anticuerpo humanizado, anticuerpo completamente humano, anticuerpo quimérico, anticuerpo de cadena sencilla, diacuerpo, fragmento Fab, fragmento Fab', F(ab')_{2}, fragmento Fv, fragmento Fd, fragmento dAb y fragmento que contiene una región determinante de complementariedad (CDR).

Como se usa en la presente memoria: Fd se refiere a un fragmento que consiste en los dominios V_{H} y C_{H1}; Fv se refiere a un fragmento que consiste en los dominios V_{L} y V_{H} de un solo brazo de un anticuerpo; y dAb se refiere a un fragmento que consiste en un dominio VH (Ward et al., 1989, Nature 341: 544-546). Como se usa en la presente memoria, un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) se refiere a un anticuerpo en el que una región V_{L} y una región V_{H} se emparejan para formar una molécula monovalente mediante un engarce sintético que permite que se generen como una sola cadena proteica (Bird et al., 1988, Science 242: 423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Como se usa en la presente memoria, un diacuerpo se refiere a un anticuerpo biespecífico en el que los dominios VH y V_{L} se expresan en una sola cadena polipeptídica mediante el uso de un engarce que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando de este modo que los dominios se emparejen con los dominios complementarios de otra cadena y generen dos sitios de unión a antígeno (véase, por ejemplo, Holliger, et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; y PoIjak et al., 1994, Structure 2: 1121-1123).

Se conocen en la técnica procedimientos aplicables en general para obtener anticuerpos. Para una revisión de procedimientos y materiales útiles para generar anticuerpos anti-KIM-1 véase, por ejemplo, Harlow et al., 1988, Antibodies, A Laboratory Manual; Yelton, et al., 1981, Ann. Rev. Biochem., 50: 657-80.; y Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology (Nueva York: John Wiley & Sons). Las propiedades de unión a antígenos de anticuerpos anti-KIM-1 pueden ser determinadas por un experto en la materia usando cualquiera de los diversos procedimientos convencionales, que incluyen, por ejemplo, radioinmunoensayo, ensayo de inmunotransferencia y ELISA. Otras técnicas adecuadas para producir un anticuerpo de la invención implican la exposición in vitro de linfocitos a un polipéptido KIM-1 o la exploración de bibliotecas de anticuerpos en fagos o vectores similares. Véase, por ejemplo, Huse et al., 1989. Science, 246: 1275-1281.

Vectores

La invención proporciona vectores que comprenden los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos KIM-1. La selección del vector y de las secuencias de control de la expresión a las que los ácidos nucleicos de esta invención se unen operativamente depende de las propiedades funcionales deseadas, por ejemplo, la expresión de proteína y la célula hospedadora que se va a transformar. Un vector de la presente invención puede ser al menos capaz de dirigir la replicación o inserción en el cromosoma del hospedador y, preferiblemente, también la expresión del gen estructural incluido en la molécula de ADNr.

Se conocen en la técnica elementos de control de la expresión útiles para regular la expresión de una secuencia codificante unida operativamente. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, promotores inducibles, promotores constitutivos, señales de secreción y otros elementos reguladores. Cuando se usa un promotor inducible, puede controlarse, por ejemplo, mediante un cambio en el estado de nutrientes o un cambio en la temperatura en el medio de las células hospedadoras.

El vector puede incluir un replicón procariota, es decir, una secuencia de ADN que tenga la capacidad de dirigir la replicación autónoma y el mantenimiento de la molécula de ADN recombinante extracromosómicamente en una célula hospedadora procariota, tal como una célula hospedadora bacteriana transformada con el mismo. Dichos replicones se conocen bien en la técnica. Además, los vectores que incluye un replicón procariota también pueden incluir un gen cuya expresión confiera un marcador detectable tal como una resistencia a fármacos. Son genes de resistencia a fármacos típicos de bacterias los que confieren resistencia a ampicilina o tetraciclina.

Los vectores que incluyen un replicón procariota pueden incluir además un promotor procariota o de bacteriófagos para dirigir la expresión de las secuencias génicas codificantes en una célula hospedadora bacteriana. Típicamente, se proporcionan secuencias promotoras compatibles con hospedadores bacterianos en vectores plasmídicos que contienen sitios de restricción adecuados para la inserción de un segmento de ADN de la presente invención. Son ejemplos de dichos plásmidos vectores pUC8, pUC9, pBR322 y pBR329 (BioRad Laboratories), pPL y pKK223 (Pharmacia). Puede usarse cualquier hospedador procariota adecuado para expresar una molécula de ADN recombinante que codifica una proteína de la invención.

Se conocen en la técnica vectores de expresión en células eucariotas y están disponibles en el mercado. Típicamente, dichos vectores contienen sitios de restricción adecuados para la inserción del segmento de ADN deseado. Los vectores ejemplares incluyen pSVL y pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1, pML2d (International Biotechnologies), pTDT1 (ATCC 31255).

Los vectores de expresión en células eucariotas pueden incluir un marcador de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a fármacos. Un gen de resistencia a fármacos preferido confiere resistencia a neomicina, es decir, el gen de la neomicina fosfotransferasa (neo) (Southern et al., 1982; J. Mol. Anal. Genet. 1: 327-341).

Para expresar los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, se insertan en vectores de expresión ADN que codifican las cadenas ligera y pesada parciales o de longitud completa. Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, cósmidos, YAC, episomas derivados de EBV y similares. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se seleccionan para que sean compatibles con la célula hospedadora de expresión usada. El gen de la cadena ligera de un anticuerpo y el gen de la cadena pesada de un anticuerpo pueden insertarse en vectores separados. En algunas realizaciones, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión.

Un vector conveniente es uno que codifica una secuencia de inmunoglobulina C_{H} o C_{L} humana funcionalmente completa. Preferiblemente, se generan por ingeniería genética sitios de restricción, de tal modo que cualquier secuencia V_{H} o V_{L} pueda insertarse y expresarse fácilmente, como se ha descrito anteriormente. En dichos vectores, habitualmente se produce corte y empalme entre el sitio donante de corte y empalme en la región J insertada y el sitio aceptor de corte y empalme que precede a la región C humana, y también en las regiones de corte y empalme que aparecen dentro de los exones de C_{H} humana. La poliadenilación y la terminación de la transcripción se producen en sitios cromosómicos nativos cadena abajo de las regiones codificantes. El vector de expresión recombinante también puede codificar un péptido señal que facilite la secreción de la cadena de anticuerpo a partir de una célula hospedadora.

Las secuencias reguladoras preferidas para la expresión en células hospedadoras de mamífero incluyen elementos víricos que dirigen altos niveles de expresión proteica en células de mamíferos, tales como promotores y potenciadores procedentes de LTR retrovirales, citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor/potenciador de CMV), virus de los simios 40 (SV40) (tal como el promotor/potenciador de SV40), adenovirus (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)), promotores de polioma y fuertes de mamíferos, tales como los promotores de inmunoglobulina y actina nativos. Para una descripción adicional de elementos reguladores víricos y de secuencias de los mismos, véanse, por ejemplo, la patente US Nº 5.168.062 por Stinski, la patente US Nº 4.510.245 por Bell et al. y la patente US Nº 4.968.615 por Schaffner et al.

Los vectores de expresión recombinantes pueden llevar secuencias que regulen la aplicación del vector en células hospedadoras (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores de selección. El gen marcador de selección facilita la selección de las células hospedadoras en las que se ha introducido el vector (véanse, por ejemplo, las patentes US Nº 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todas por Axel et al.). Por ejemplo, típicamente, el gen marcador de selección confiere una resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula hospedadora en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores de selección preferidos incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para usar en células hospedadoras dhfr con selección/amplificación con metotrexato) y el gen neo (para la selección con G418).

Pueden usarse moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos KIM-1 y anticuerpos anti-KIM-1, y vectores que comprenden estas moléculas de ácido nucleico, para la transformación de una célula hospedadora adecuada. Se conocen bien en la técnica procedimientos para la introducción de ADN exógeno en células de mamíferos e incluyen la transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del o de los polinucleótidos en liposomas y microinyección directa del ADN en los núcleos. Además, las moléculas de ácido nucleico pueden introducirse en células de mamíferos mediante vectores víricos.

La transformación de células hospedadoras puede lograrse mediante procedimientos convencionales adaptados al vector y a la célula hospedadora empleada. Con respecto a la transformación de células hospedadoras procariotas, pueden emplearse procedimientos de electroporación y tratamiento con sales (Cohen et al., 1972, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2110-2114). Con respecto a la transformación de células de vertebrados, pueden emplearse métodos de electroporación, lípidos catiónicos o tratamiento con sales. Véanse, por ejemplo, Graham et al., 1973, Virology 52: 456-467; Wigler et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1373-1376).

Las células hospedadoras pueden ser procariotas o eucariotas. Las células hospedadoras eucariotas preferidas incluyen, pero no se limitan a, células de levaduras y mamíferos. Los ejemplos de células hospedadoras eucariotas útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) (Nº de acceso de ATCC CCL61), células de embrión de ratón Swiss de NIH NIH-3T3 (Nº de acceso de ATCC CRL1658) y células de riñón de hámster recién nacido (BHK). Se conocen en la técnica líneas celulares de mamíferos disponibles como hospedadores para la expresión e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC). Estas incluyen, entre otras, células de ovario de hámster chino (CHO), NSO, células SP2, células HeLa, células de riñón de hámster recién nacido (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células A549 y varias otras líneas celulares.

La expresión de polipéptidos a partir de líneas celulares de producción puede potenciarse usando técnicas conocidas. Por ejemplo, comúnmente se usa el sistema de la glutamina sintetasa (GS) para potenciar la expresión en determinadas condiciones. Véanse, por ejemplo, las patentes europeas Nº 0216846, 0256055 y 0323997 y la solicitud de patente europea Nº 89303964.4.

Formulaciones

Las composiciones que contienen polipéptidos KIM-1, anticuerpos anti-KIM-1 o fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos anti-KIM-1 pueden contener vehículos adecuados farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, pueden contener excipientes y/o adyuvantes que faciliten el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones diseñadas para la administración en el lugar de acción. Las formulaciones adecuadas para administración por vía parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en una forma soluble en agua, por ejemplo, sales solubles en agua. Además, pueden administrarse suspensiones de los compuestos activos como suspensiones para inyección oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo, aceite de sésamo o ésteres de ácidos grasos sintéticos, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos. Las suspensiones para inyección acuosas pueden contener sustancias que aumenten la viscosidad de la suspensión incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes. También pueden usarse liposomas para encapsular las moléculas de la invención para administrarlas en células o espacios intersticiales. Son vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplificativos los disolventes fisiológicamente compatibles, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares. En algunas realizaciones, la composición comprende agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico. En algunas realizaciones, las composiciones comprenden sustancias farmacéuticamente aceptables tales como sustancias humectantes o adyuvantes en cantidades minoritarias, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que aumentan la vida útil o la eficacia de los ingredientes activos.

La composiciones de la invención pueden estar en una diversidad de formas incluyendo, por ejemplo, formas de dosificación líquida, semisólida y sólida, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones. La forma preferida depende del modo deseado de administración y de la aplicación terapéutica. En algunas realizaciones, las composiciones están en forma de soluciones inyectables o infundibles, tales como composiciones similares a las usadas para la inmunización pasiva en seres humanos.

La composición puede formularse como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una concentración elevada de fármaco. Pueden prepararse soluciones inyectables estériles mediante incorporación del ingrediente activo en la cantidad necesaria en un disolvente apropiado, con uno o con una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, se preparan dispersiones por incorporación del ingrediente activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y liofilización ("freeze-drying"), que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución de los mismos previamente esterilizada por filtración, la fluidez apropiada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. Pueden producirse composiciones inyectables de absorción prolongada mediante la inclusión en la composición de un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

En algunas realizaciones, el ingrediente activo se formula con un dispositivo o formulación de liberación controlada. Los ejemplos de dichas formulaciones y dispositivos incluyen implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables y biocompatibles, por ejemplo, acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Se conocen en la técnica métodos para la preparación de dichas formulaciones y dispositivos. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, 1978, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York.

También pueden incorporarse compuestos activos complementarios en las composiciones. En algunas realizaciones, un polipéptido KIM-1, anticuerpo anti-KIM-1 o fragmento del mismo se coadministra con un segundo agente inmunomodulador, por ejemplo, BAFF-R-Ig, LT\beta-R-Ig, CTLA4-Ig, anti-CD40L o un anticuerpo monoclonal anti-CD20.

Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta óptima deseada. Por ejemplo, puede administrarse un solo bolo, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es ventajoso formular composiciones parenterales en forma unitaria de dosificación para facilitar la administración, y la uniformidad de la forma unitaria de dosificación, como se usa en la presente memoria, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos que se van a tratar, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico necesario.

En algunas realizaciones, una dosis terapéuticamente eficaz para un polipéptido KIM-1 está en el intervalo de 0,1 a 100 mg/kg. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz está en el intervalo de 0,5 a 50 mg/kg. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz está en el intervalo de 1,0 a 10 mg/kg, por ejemplo, de aproximadamente 5 mg/kg. La determinación de una dosis terapéuticamente eficaz también puede evaluarse mediante la realización de experimentos in vitro que miden la concentración del agente modificador necesario para recubrir células diana (células positivas para KIM-1 o receptor de KIM-1, dependiendo del agente modificador) durante periodos de tiempo (terapéuticos) adecuados. Pueden usarse ensayos de unión ligando-receptor de ELISA y de FACS para controlar la reacción de recubrimiento celular. En base a los resultados de dichos ensayos de unión in vitro, puede seleccionarse un intervalo de concentraciones adecuadas de agente modificador.

Las moléculas de la invención pueden formularse en composiciones farmacéuticas por mezcla con excipientes o vehículos no tóxicos farmacéuticamente aceptables. Dichas composiciones pueden prepararse para el uso en la administración por vía parenteral, particularmente en forma de soluciones o suspensiones líquidas. La composición puede administrarse en forma de dosificación unitaria y puede prepararse mediante cualquier método adecuado. Dichos métodos se conocen en la técnica. Por ejemplo, véase Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, PA 1980).

Las formas de dosificación líquidas incluyen soluciones, emulsiones, microemulsiones y suspensiones farmacéuticamente aceptables. Además del compuesto activo, la forma de dosificación líquida puede contener ingredientes inertes que incluyen agua, alcohol etílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites, glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles, ésteres de ácidos grasos de sorbitán y mezclas de los mismos.

Pueden prepararse formulaciones de liberación prolongada inyectables mediante formación de matrices microencapsuladas del fármaco en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la proporción de fármaco con respecto al polímero y de la naturaleza del polímero empleado, puede controlarse la velocidad de liberación de fármaco. Otros polímeros biodegradables ejemplares incluyen poliortoésteres y polianhídridos. También pueden prepararse formulaciones depot inyectables por inclusión del fármaco en liposomas o microemulsiones que sean compatibles con tejidos corporales.

Ejemplos

La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos experimentales. Los ejemplos se proporcionan solamente con fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitantes del alcance o contenido de la invención de ningún modo.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Secuencia pasa a página siguiente)

\newpage

Ejemplo 1

Construcción de dominio extracelular de KIM-1 humano-Fc (pH1105)

El dominio extracelular (residuos 1-290) de KIM-1 humano se fusionó con la porción Fc de la IgG1 humana (bisagra, CH2, CH3) y se clonó en pEAG347, un plásmido de expresión en mamíferos de Biogen. El plásmido contenía un promotor en tándem para la expresión constitutiva y el gen de la dihidrofolato reductasa para la selección con metotrexato de líneas celulares que lo expresen de forma estable. La secuencia de aminoácidos del polipéptido de fusión codificado era la siguiente:

\vskip1.000000\baselineskip

1

\vskip1.000000\baselineskip

La secuencia señal se indica mediante subrayado. La bisagra de Fc se indica mediante una caja.

\newpage

Ejemplo 2

KIM1_{ECDmucina\Delta} humano-Fc (PHI100)

El ADN que codifica los residuos 1-129 de KIM-1 humano fusionado con la porción Fc de la IgG1 humana (bisagra, CH2, CH3) se clonó en pEAG347, un plásmido de expresión en mamíferos de Biogen que contenía un promotor en tándem para la expresión constitutiva y el gen de la dihidrofolato reductasa para la selección con metotrexato de líneas celulares que lo expresen de forma estable. La secuencia de aminoácidos del polipéptido de fusión codificado era la siguiente:

2

Ejemplo 3

KIM1_{ECD} humano-6xHis (pVB602)

El dominio extracelular (residuos 1-290) de KIM-1 humano se fusionó con un péptido C-terminal corto
[VEHHHHHH] que incluía una repetición de 6 residuos de histidina y se clonó en pCAl25, un plásmido de expresión en mamíferos de BIOGEN que contenía un promotor de CMV para la expresión constitutiva transitoria en células de mamífero. La secuencia de aminoácidos del polipéptido de fusión codificado era la siguiente:

3

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4

Fusión de KIM-1 murino-Fc

Un ectodominio amplificado por PCR de kim-1 murino flanqueado por sitios NotI y SalI se fusionó con la Fc de la IgG1 humana (aislada a partir de EAG409 como un fragmento Sall-Notl) y se clonó en el vector de expresión en células Ebna 293 CH269 (construcción PEM073-6) y en el vector de expresión en células CHO pV90 (construcción PEM078-1). El sitio Sall está en la unión entre kim1 y Fc. La secuencia de nucleótidos resultante del ORF para la proteína de fusión era la siguiente (sitio Sall en letras mayúsculas):

30

\vskip1.000000\baselineskip

La secuencia traducida del ectodominio de kim-1 murino-Fc humana era la siguiente. Se indican en negrita los dos aminoácidos de unión proporcionados por el sitio SalI:

5

\newpage

Ejemplo 5

Fusión de KIM-1-Fc en Modelo de SRBC murino

La respuesta inmune de roedores a eritrocitos de oveja (SRBC) depende de la interacción de células T competentes con CPA y células B. Por lo tanto, la respuesta anti-SRBC es un modelo útil para examinar el papel que las proteínas celulares en linfocitos y CPA desempeñan en el desarrollo y la maduración de la respuesta inmune. La respuesta anti-SRBC en ratones consiste en la producción de IgM y de los diversos isotipos de IgG, incluyendo elevados niveles del isotipo IgG1, con niveles considerables de IgG2a e IgG2b observados también. Se considera que IgG1 es un isotipo que está dirigido por una respuesta inmune mediada por Th2, que se caracteriza por la expresión de citocinas tales como 11-4, 11-5 e 11-13. Los isotipos IgG2a e IgG2b son más característicos de una respuesta inmune dirigida por Th1 y están asociados con la expresión de 11-12. Por último, el isotipo IgG3 es típico de respuestas inmunes independientes de T. Los 4 isotipos están representados en la respuesta anti-SRBC.

Se siguió la evolución de la respuesta anti-SRBC en ratones tratados con proteína de fusión de KIM-1 murino-Ig (mKIM-1-Ig) para interrumpir la actividad dependiente de KIM-1 en células T. Los ratones se trataron el día antes de la exposición (D -1) con 150 \mug/ratón de mKIM-1-Ig, se expusieron a 100 \mul de una solución al 10% de SRBC (Colorado Serum Company) en PBS el día 0, después se trataron de nuevo con 150 \mug de mKIM-1-Ig los días 3 y 6. Se extrajo sangre de los ratones para muestras de suero los días 7, 14, 21 y 30 después de la inmunización y se obtuvieron las titulaciones de anticuerpo anti-SRBC usando el ensayo de hemaglutinación. Este ensayo se basa en la capacidad de los anticuerpos por entrecruzar y agrupar ("aglutinar") SRBC en base a su estructura pentamérica (para IgM) o en presencia de una tercera especie de antisueros anti-idiotípicos (para las clases de Ig).

En resumen, el protocolo era el siguiente. Las muestras de suero se diluyeron según fuera apropiado (de 1:15 a 1:200), dependiendo del isotipo que se estaba midiendo y del día de la respuesta. Después se titularon en etapas 1:2 usando placas de ensayo de 96 pocillos que se obtuvieron de Coming (Costar® nº 3795). Para el ensayo de IgM, las muestras de suero se ensayaron por duplicado. Se añadieron 25 \mul de SRBC al 10% en glucosa-PBS G-PBS) a los pocillos y se dejó que se desarrollara la respuesta de aglutinación durante 1 hora a 37ºC. Para los ensayos de Ig, las muestras de suero se cargaron en las placas y se diluyeron por triplicado. Se añadieron 25 \mul de 2-mercaptoetanol (Sigma) al 1%, diluido en G-PBS, a cada serie de muestras de suero, después la placa se incubó durante 30 minutos a 37ºC. Esto se realizó para romper todos los enlaces disulfuro que mantenían unidos los pentámeros de IgM y, por lo tanto, eliminar cualquier fondo de IgM. Después, se añadieron 25 \mul de SRBM al 10% en G-PBS y 25 \mul de una dilución 1:250 en G-PBS de antisueros anti-idiotípicos (IgG1, IgG2a, IgG2b o IgG3 de anti-ratón de cabra, todos de Southern Biotechnology Associates) a los 2 primeros de cada triplicado para entrecruzar las IgG anti-SRBC de ese subtipo presente. El tercer pocillo de cada triplicado se dejó sin entrecruzar para servir como control para cualquier actividad de IgM residual que pudiera haber sobrevivido al tratamiento con 2-mercaptoetanol. Las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Todas las placas de ensayo se dejaron durante una noche a 4ºC para estabilizar la hemaglutinación resultante antes de puntuarse y fotografiarse. Todos las titulaciones se puntuaron como la última dilución que daba una lectura de aglutinación positiva.

El efecto del tratamiento con mKIM-1-Ig en la respuesta anti-SRBC se comparó con los grupos control de ratones que no se expusieron a SRBC o que se expusieron a SRBC pero se les administraron dosis de anti-CD40L, hIgG policlonal inespecífica o PBS. Los ratones no expuestos y los tratados con anti-CD40L no tenían respuesta anti-SRBC, como se esperaba. Los ratones a los que se administró SRBC y que se dosificaron con PBS o hIgG tenían titulaciones de anticuerpos robustos contra todas las clases de Ig ensayadas. Los ratones tratados con mKIM-1-Ig, por el contrario, tenían una deficiencia específica y muy sorprendente en el isotipo anti-SRBC de IgG1. En 2 experimentos independientes usando la cepa de ratones Balb/c se detectaron niveles notablemente deficientes de IgG1 anti-SBRC (Figuras 3 y 4). Siete días después de la inducción de la respuesta anti-SRBC, la titulación de IgG1 era de media un 70% inferior en ratones tratados con mKIM-1-Ig que en ratones tratados con control. El día 14 después de la inducción de la respuesta anti-SRBC, la titulación de IgG1 se redujo en más del 85%. Se observó una deficiencia similar en 1 experimento que usaba la cepa de ratones C57B1/6 (Figura 5). Se considera que los ratones Balb/c y los ratones C57B1/6 tienen tendencias diferentes en sus respuestas inmunes, caracterizándose los ratones Balb/c por tener predominantemente una respuesta mediada por Th2 y los ratones C57B1/6 por tener predominantemente una respuesta mediada por Th1. Por lo tanto, en estas cepas de ratones la capacidad de la proteína de fusión de KIM-1 murino-Ig para bloquear la producción del isotipo IgG1 anulaba las tendencias de Th inherentes a las cepas. Sorprendentemente, el efecto del tratamiento con mKIM-1-Ig se extendía hasta la respuesta secundaria, por lo que no se produjo IgG1 mediante células B de memoria en respuesta a una exposición posterior a SRBC (Figuras 6 y 7).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6

Enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD)

La GVHD se modela en ratón usando regímenes de transplante de células de parental en F1. Se inyectan iv esplenocitos de la cepa de ratones DBA2 en ratones (DBA2 x C57B1/6) F1, que se denominan B6D2F1. Los esplenocitos inyectados constituyen el injerto y el ratón DBA2 es el donante de ese injerto. El ratón F1 que recibe el injerto es el hospedador. Las células T donantes presentes en el injerto reconocen la mitad de los marcadores de MHC (haplotipos) en las células hospedadoras como extraños porque proceden del otro parental, el C57B1/6. Esto induce una respuesta de células T del donante contra el hospedador dando como resultado una GVHD. Cuando los esplenocitos parenterales de DBA/2 se inyectan en el hospedador B6D2F1, se desarrolla una GVHD crónica. Por el contrario, cuando se inyectan esplenocitos C57B1/6 en el hospedador B6D2F1, se desarrolla una GVHD aguda. Aunque todavía no está claro qué mecanismo subyacente es responsable de los diferentes resultados de enfermedad usando estos 2 protocolos de inyección, se piensa que las citocinas expresadas por las células contenidas en el interior del injerto de esplenocitos de DBA/2 favorecen el desarrollo de una GVHD crónica, mientras que las citocinas expresadas por las células contenidas en el interior del injerto de esplenocitos de C57B1/6 favorecen el desarrollo de una GVHD aguda. Los reactivos que interfieren con las interacciones de células T con células presentadoras de antígeno (por ejemplo, células dendríticas, macrófagos, células B: CPA) bloquean eficazmente la GVHD tanto aguda como crónica. Los antagonistas de KIM-1 modifican el desarrollo de una respuesta inmunológica en un modelo de ratón de GVHD crónica. La capacidad para bloquear la GVHD crónica incluye efectos sobre la activación y proliferación de células B y sobre la generación de IgG secretadas. Los ratones se tratan por vía intraperitoneal (ip) con antagonistas de KIM-1 o agentes modificadores, tratamientos de control o se dejan sin tratar. 4 horas después los ratones reciben 1 x 10^{8} esplenocitos aislados de ratones DBA/2 en una inyección de 0,5 ml suministrada por vía intravenosa (iv). Los esplenocitos de DBA/2 inyectados iv constituyen el aloinjerto. 2, 4 y 6 días después de que se suministre el injerto, los ratones se tratan de nuevo con antagonistas de KIM-1 o agentes modificadores o con tratamientos de control. Un grupo de ratones de control adicional reciben 1 x 10^{8} esplenocitos de B6D2F1, que no pueden inducir enfermedad en receptores de B6D2F1. Como alternativa, se usan como controles ratones B6D2F1 sin injerto y sin tratar. Catorce días después de que se suministre el injerto, los ratones se sacrifican y se examinan para pruebas de enfermedad.

Los ratones receptores de injerto sin tratar manifiestan una diversidad de síntomas que son indicativos del desarrollo de una GVHD crónica. La esplenomegalia, o aumento de tamaño del bazo, es una prueba de que las células T del donante y las células B del hospedador se han activado y están experimentando una expansión policlonal, con aumentos espectaculares en el número de células. La aparición de proteínas de superficie celular tales como CD69 en un subconjunto de células B es indicativo de la activación de células B. La pérdida de moléculas de L-selectina de células T CD4+ y CD8+ es una prueba de la activación de células T. La secreción de moléculas de Ig, tales como clases de IgG, IgA e IgE, ya sea en el suero o en ensayos de cultivos celulares in vitro, indica que las células B se han activado y han cambiado su clase de Ig. A este respecto, la aparición de Ig anti-propias en el suero o en ensayos de cultivos celulares in vitro demuestra que las Ig que se están produciendo tienen un reconocimiento de autoantígenos inapropiado. Por último, la supervivencia puede medirse como un resultado de diferentes regímenes de tratamiento. El tratamiento con antagonistas de KIM-1 (por ejemplo, KIM-1-Ig) bloquea estas lecturas del desarrollo de una GVHD crónica, como se muestra por la reducción en el grado de esplenomegalia, la reducción en la expansión policlonal de poblaciones de linfocitos, la reducción de la aparición o desaparición de marcadores de superficie celular que indican activación de linfocitos, la reducción de la secreción de Ig y/o la reducción de la mortalidad.

Se comparan ratones de control con ratones receptores de aloinjertos sin tratar para examinar el grado de esplenomegalia, la activación de células B y la secreción de Ig durante la GVHD. Se usan mAb anti-CD40L MR1 como un control positivo en estos experimentos, puesto que se ha demostrado previamente que el bloqueo de la interacción CD4OL/CD40 es un medio eficaz de interferir con el desarrollo de la GVHD crónica (Durie et al., 1994, J. Clin. Invest. 94: 1333-1338). Para investigar poblaciones celulares afectadas por el tratamiento con antagonistas de KIM-1 se realizan análisis de FACS en esplenocitos extraídos de ratones receptores 14 días después de la inyección del injerto. Se aíslan y se combinan células de bazo de 3-4 ratones por grupo. La activación de células B del receptor es una característica que define la GVHD crónica. En ratones que padecen una GVHD crónica, una proporción pequeña pero fácilmente visible de células B B200+ expresan el marcador de activación CD69. Por lo tanto, la expresión de CD69 se usa como una medida del alcance de la enfermedad. También se determina la IgG total en cultivos de esplenocitos en ratones de diferentes grupos de tratamiento, puesto que la expresión de CD69 por células B es indicativa de su estado de activación.

En el modelo de ratón el desarrollo de la enfermedad depende de la citocina de Th2 11-4 y puede bloquearse por tratamiento con mAb anti-II-4. Dicho tratamiento bloquea la expansión de células B del hospedador y la hiperproducción de Ig concomitante. El desarrollo de GVHD puede seguirse de varias formas. La expansión de las poblaciones de células T del donante y células B del hospedador se mide mediante el índice del bazo, que es la proporción de peso del bazo con respecto al peso corporal, normalizada para ratones de control (no enfermos). La activación de células B en ratones enfermos se mide usando análisis de marcadores de activación de células B. Por último, los efectos de la activación de células B se observan en los niveles de Ig circulantes (por ejemplo, en suero) o producidas por cultivos de esplenocitos del hospedador recogidos varias semanas después de la inducción de la enfermedad. La Ig circulante en animales enfermos contendrá anticuerpos anti-propias. Por último, los animales enfermos sucumben a una insuficiencia renal y de otros órganos debido a la acumulación de depósitos de Ig y, por lo tanto, la supervivencia es una medida importante de la actividad de la enfermedad.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7

Modelos de ratón SCID-hu

Es posible estudiar respuestas inmunes humanas en el ratón SCID-hu. Por ejemplo, a ratones SCID se les inyectan por vía intraperitoneal 2-5 x 10^{7} células mononucleares de sangre periférica humanas y estas células residen y funcionan en el intestino durante algún tiempo, y responden a la exposición a antígenos. Se reconstituyen ratones NOD-SCID con PBL humanos y estos ratones tienen la ventaja adicional de la siembra de células humanas (T, B, CPA) en el bazo, donde pueden mantenerse respuestas inmunes sistémicas. Se analizan modelos apropiados en Berney et al., 2001, Transplantation 72: 133-140. Otros modelos de respuestas inmunes usan el ratón SCID/beige e implican el cotransplante de PBL o células fetales con ganglios linfáticos mesentéricos fetales para proporcionar un soporte para respuestas inmunes (Carballido et al., 2000, Nat. Med. 6: 103-106).

Se reconstituyen ratones SCID-hu o NOD-SCID-hu con células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas de donantes humanos inmunizados con toxoide tetánico (TT). Los ratones SCID-hu reconstituidos de este modo tienen células humanas que residen en diversos compartimentos, incluyendo el peritoneo. Los ratones NOD-SCID-hu reconstituidos de este modo tienen células T humanas que residen en diversos compartimentos, incluyendo el interior de sus órganos linfoides secundarios, tales como el bazo. Se inducen respuestas inmunes primarias en estos ratones reconstituidos por inmunización con antígeno acoplado a TT, o a una porción antigénica de TT, o a liposomas, o a liposomas que contienen TT. Los ratones reconstituidos de este modo y expuestos producen una titulación elevada (>1:1000) de respuesta de Ig contra un antígeno (por ejemplo, NP, DNP, KLH, OVA, HIV gp120 o porciones de la misma, antígeno asociado a melanoma GD2 y mucino ovino, son sólo algunos de muchos ejemplos). Algunos ejemplos se presentan en Ifverson et al., 1995, Imnunology 84: 111 - 116. Los ratones reconstituidos de este modo y después tratados con antagonistas de KIM-1 o agentes modificadores no producen una titulación elevada frente a una exposición a un antígeno.

En otra metodología, se reconstituyen ratones SCID-hu con timo, fragmentos de piel, ganglios linfáticos mesentéricos (MLN) y hueso humano fetal. La presencia de MLN es suficiente para soportar respuestas inmunes robustas frente a la inmunización con TT (y, puesto que todo el tejido del donante es fetal, esta es estrictamente una respuesta inmune primaria). Este modelo se analiza en detalle en Carballido et al., 2000, Nat. Med. 6: 103-106. La inmunización con TT provoca la proliferación de linfocitos humanos y la activación y la secreción de IgM e IgG por células B. El tratamiento de ratones SCID reconstituidos de este modo con antagonistas de KIM-1 o agentes modificadores reduce la proliferación y activación de linfocitos humanos y la secreción de inmunoglobulinas tras la exposición a TT.

En una modificación de estos modelos u otros modelos de NOD-SCID-hu o SCID-hu similares, se miden respuestas inmunes secundarias en un entorno de enfermedad, por ejemplo, de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH). En este caso, la exposición a TT se suministra en la almohadilla plantar de ratones SCID o NOD-SCID reconstituidos con PBMC procedente de individuos inmunes a TT y se mide la hinchazón de la almohadilla plantar en respuesta. Las repuestas de DTH se basan en la presencia de células T de memoria humanas en circulación en el ratón reconstituido. Dichos modelos también pueden usarse para detectar el posible rechazo de tejido del donante en pacientes de transplantes, como en los modelos "trans vivo". Un ejemplo de este tipo de estrategia se analiza en Carrodeguas et al., 1999, Hum. Immunol. 60: 640-651. El tratamiento de ratones reconstituidos de este modo con antagonistas de KIM-1 o agentes modificadores evita respuestas de DTH. Otros modelos de respuestas de enfermedades humanas en el ratón SCID incluyen la transferencia de esplenocitos o PBMC de pacientes autoinmunes al ratón, por lo que continúa la expresión de inmunoglobulinas y otros marcadores de enfermedad (véase, Martino y Grinaldim 1997, en: Immunology Methods Manual, vol 3. Lefkovits, ed. Academic Press, San Diego). El tratamiento de estos ratones con antagonistas de KIM-1 o agentes modificadores antes de la transferencia de células autoinmunes de pacientes reduce la expresión de inmunoglobulinas u otros marcadores de la patología autoinmune.

Una metodología muy valiosa que utiliza el ratón SCID implica el xenoinjerto de tejido enfermo en el ratón receptor. Los métodos de transferencia de piel de pacientes con soriasis o dermatitis atópica, por ejemplo, son modelos muy usados de estas enfermedades. La dermatitis atópica es una enfermedad inmune celular mediada por Th2 que puede modelarse en ratones SCID por transferencia de las PBMC y de biopsias de piel a la vez en el ratón receptor. El tratamiento de estos ratones con antagonistas de KIM-1 o modificadores previene la acumulación celular y la secreción local de citocinas, que es una prueba de la activación de linfocitos y células efectoras (eosinófilos, basófilos, etc.) en el injerto de piel. Esto es una prueba de la eficacia en la prevención de la dermatitis en el paciente donante.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8

Otros modelos murinos de enfermedad atópica

Se realizan en el ratón modelos útiles de alergia, asma, hipersensibilidad de las vías respiratorias (AHR) y otras enfermedades atópicas. Por ejemplo, se induce una inflamación alérgica cutánea mediante sensibilización epicutánea con antígeno. En un ejemplo, el antígeno es ovoalbúmina (OVA). La respuesta de Th2 a esta sensibilización se demuestra por la presencia de eosinófilos en la piel, la expresión local en la piel de citocinas de Th2 y la hipersensibilidad de las vías respiratorias (AHR) a un antígeno inhalado. Los eosinófilos están ausentes de la piel de ratones sensibilizados con OVA que se tratan primero con antagonistas de KIM-1 o modificadores y el nivel de citocinas de Th2 se reduce. Los ratones que se sensibilizan de forma repetida producen IgE específicas de OVA y sus esplenocitos secretan las citocinas de Th2, IL-4 e IL-5 después de la estimulación in vitro con OVA. Estas lecturas de la respuesta inmune de Th2 se bloquean tras el tratamiento con antagonistas de KIM-1 o modificadores. Como alternativa, pueden sensibilizarse ratones (por ejemplo, ratones BALB/c) con una inyección i. p. de antígeno (día 0), después volver a exponerse a antígeno intranasal 3 semanas después (una vez) y 4 semanas después (3 veces: días 26, 27, 28, por ejemplo). Esto produce una hipersensibilidad del pulmón (AHR), que está mediada por citocinas de Th2 tales como IL-13. Esta respuesta inmune de Th2 se bloquea tras el tratamiento con antagonistas de KIM-1 o modificadores.

Usando el modelo transgénico para TCR específico de OVA (DO11.10), se induce una respuesta inmune específica de OVA, después se transfieren células T específicas de OVA de Th2 a receptores sin tratamiento previo, que después se exponen con aerosol de OVA. Estos ratones desarrollan rápidamente una AHR específica de antígeno. Esta respuesta se bloquea cuando los ratones se tratan con antagonistas de KIM-1 o modificadores antes de la exposición con aerosol de OVA.

El tratamiento con aerosol de metacolina induce el reclutamiento de eosinófilos en el pulmón, causando una AHR en ratones. El tratamiento de ratones con antagonistas de KIM-1 o agentes modificadores bloqueará el desarrollo de una AHR.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 9

Artritis inducida por colágeno

En este modelo murino de artritis, se usa colágeno para desencadenar la activación de células B mediada por células T y la producción de autoanticuerpos que atacan las articulaciones, dando como resultado una afección que se asemeja a la artritis reumatoide. En diversas cepas de ratones esta respuesta está dominada por titulaciones elevadas de IgG1. En particular, en ratones que carecen de 11-12 por deficiencia genética (ratones knock out para 11-12: II-12-/-) la titulación de IgG1 es muy elevado, y estos Ab median eficazmente en la destrucción de la articulación.

Los ratones se tratan con colágeno en adyuvante completo de Freund mediante inyección por vía intradérmica en 2 lugares: un pequeño volumen se administra en cada oreja y un pequeño volumen se administra en la piel entre los hombros. Tres semanas después, los ratones se estimulan con colágeno soluble en solución salina, usando una vía intraperitoneal. En la semana, se evalúo el daño articular por medición de la hinchazón de la articulación con un calibrador y por medición de las titulaciones de anticuerpos. El tratamiento de ratones durante el curso del desarrollo de la enfermedad mejora la puntuación de la enfermedad. En particular, el tratamiento con 0,1-1 mg/kg de antagonistas de KIM-1 o agentes modificadores el día antes del inicio de la enfermedad, seguido de tratamientos posteriores, bloqueará el desarrollo de la enfermedad, como se evalúa por una hinchazón articular reducida y titulaciones de inmunoglobulinas reducidas. Esto es un curso de tratamiento profiláctico.

El tratamiento con antagonista de KIM-1 después de la inducción o antes de la estimulación mejora el desarrollo en la enfermedad, como se evalúa por una hinchazón articular reducida y titulaciones de inmunoglobulinas reducidas. Este es un curso de tratamiento terapéutico. El tratamiento con antagonistas de KIM-1 o agentes modificadores después de la inyección de estimulación bloquea el desarrollo de la enfermedad, como se evalúa por una hinchazón articular reducida y titulaciones de inmunoglobulinas reducidas. Este es un curso de tratamiento terapéutico.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 10

Modelos murinos de lupus

En el modelo NZB/W, ratones procedentes de la cepa NZB se cruzan con ratones de la cepa NZW y la progenie F1 desarrolla una enfermedad similar al lupus a lo largo del tiempo. Las manifestaciones de la enfermedad incluyen la producción de autoanticuerpos y de factor reumatoide. El depósito de Ig en el riñón es el resultado de la elevada cantidad de Ig y RF producidos, que conduce a una función renal disminuida a lo largo del tiempo, que puede medirse por la proteinuria en la orina.

La progenie NZB/W F1 comienza a manifestar síntomas de enfermedad aproximadamente a los 5 meses de edad, con puntuaciones de proteinuria moderadas en ese momento (PU de 2). A los 9 meses de edad, los ratones habrán alcanzado un máximo de PU = 4 y comenzarán a sucumbir a la enfermedad como consecuencia de la insuficiencia renal. Otro modelo denominado SNF1 (cruce SWR x NZB F1) sigue una cinética similar.

Los ratones se tratan con 0,1-1 mg/kg de antagonistas de KIM-1 el día antes del comienzo de la enfermedad, seguido de tratamientos posteriores. Esto bloquea el desarrollo de la enfermedad, como se mide por la puntuación de PU y/o por medición de las titulaciones de inmunoglobulinas en el suero y/o por análisis inmunohistoquímico de la hiperplasia del bazo y/o por análisis inmunohistoquímico del depósito de complejos inmunes y de cambios en la estructura de los glomérulos en el riñón.

El tratamiento con antagonistas de KIM-1 después de la inducción de la enfermedad, por ejemplo, en el 5º mes, pero antes de la enfermedad grave (es decir, PU = 2-3) mejora el desarrollo de la enfermedad o revierte las lesiones de la enfermedad. Esto puede medirse por la puntuación de PU y/o por medición de las titulaciones de inmunoglobulinas en el suero y/o por análisis inmunohistoquímico de la hiperplasia del bazo y/o por análisis inmunohistoquímico del depósito de complejos inmunes y de cambios en la estructura de los glomérulos en el riñón.

El tratamiento con antagonista de KIM-1 después de que la enfermedad sea grave (PU = 3-4) bloquea el desarrollo de la enfermedad o revierte las lesiones de la enfermedad. Esto puede medirse por la puntuación de PU y/o por medición de las titulaciones de inmunoglobulinas en el suero y/o por análisis inmunohistoquímico de la hiperplasia del bazo y/o por análisis inmunohistoquímico del depósito de complejos inmunes y de cambios en la estructura de los glomérulos en el riñón.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 11

Reacción mixta de linfocitos (MLR)

Ensayos de MLR en ratón y antagonismo de KIM-1. Se realizaron reacciones mixtas de linfocitos (MLR) de la forma siguiente: se aislaron bazos de ratones C57B16 y Balb/c usando una técnica estéril, se trituraron toscamente para liberar los linfocitos, después se trataron con una solución hipotónica (solución de Gey) para lisar los eritrocitos. Las células restantes se separaron del tejido residual haciéndolas pasar a través de un tamiz celular (BD Falcon, Bedford, MA, Estados Unidos) y después se lavaron con PBS estéril sin pirógenos y se centrifugaron para sedimentar las células. Las células se resuspendieron en la solución de PBS una segunda vez, se sedimentaron de nuevo y después se resuspendieron en medio RPMI completo. Las células se contaron y se diluyeron según fuera necesario. Los linfocitos de Balb/c se usaron como las células estimuladoras, por lo tanto, éstos se irradiaron a 3000 RAD antes del
uso.

Para preparar los ensayos, se añadieron células estimuladoras a los pocillos como proporciones variables con respecto al número de células respondedoras (2 x 10^{5}/pocillo). Los medios se suplementaron con anticuerpos anti-KIM-1 de rata o proteína de fusión de KIM-1-Ig y proteínas de fusión de control-Ig a 20 \mug/ml, como se indica. Los cultivos se prepararon en tres placas idénticas y cada condición experimental estaba representada por 3 pocillos por placa. Se usó una placa para generar datos de la proliferación celular usando un ensayo de MTS (CellTiter 96, Promega, Madison, WI, Estados Unidos). Las otras placas se usaron para recoger muestras de sobrenadante para el análisis de citocinas. Se usaron ELISA (Pierce Endogen, Rockford, IL, Estados Unidos) para medir los niveles de mIFN\gamma, mTNF, y mll-2 en los sobrenadantes de cultivo. Los errores estándar para los valores obtenidos de los ensayos de proliferación y ELISA fueron menores del 10% y se han omitido de las figuras. Se observaron grandes desviaciones de los valores de control positivo para IFN\gamma, mientras que los niveles de II-2 y TNF en los cultivos no eran significativamente diferentes entre los grupos de control positivo y de tratamiento. Por lo tanto, se han omitido los datos de II-2 y TNF; los datos para IFN\gamma y para la proliferación celular se muestran para cada experimento representativo.

El tratamiento del cultivo de MLR con los mAb anti-KIM-1 de ratón de rata 3A2.5 y 1H9.11 redujo significativamente el nivel de IFN\gamma secretado en el sobrenadante (Figura 8). Este efecto era específico para IFN\gamma, puesto que no se observó ninguna disminución en el nivel de II-2 o TNF secretados en el sobrenadante. El efecto no se debía al número disminuido de células en estos cultivos, puesto que el ensayo de proliferación celular demostró que el número de células vivas en los cultivos era similar (Figura 9).

El tratamiento del cultivo de MLR con proteína de fusión de KIM-1-Ig redujo significativamente el nivel de IFN\gamma secretado en el sobrenadante (Figura 10). Este efecto era específico para IFN\gamma, puesto que no se observó ninguna disminución en el nivel de II-2 o TNF secretados en el sobrenadante (no se muestran los datos). El efecto no se debía al número disminuido de células en estos cultivos, puesto que el ensayo de proliferación celular demostró que el número de células vivas en el cultivo tratado con proteína de fusión de KIM-1-Ig era muy similar al control no tratado (Figura 11).

Ensayos de MLR humanos y antagonismo de KIM-1. Se realizaron reacciones de mezclas de linfocitos (MLR) de la forma siguiente: se aislaron células mononucleares de sangre periférica a partir de sangre total extraída de donantes humanos normales usando centrifugación en gradiente de Ficoll. Después, las células se lavaron con PBS estéril sin pirógenos y se centrifugaron para sedimentar las células. Las células se resuspendieron en la solución de PBS por segunda vez, se sedimentaron de nuevo, y después se resuspendieron en medio RPMI completo. Las células se contaron y se diluyeron según fuera necesario. Se usaron células JY (ATCC, Bethesda, MD, Estados Unidos) como células estimuladoras, por lo tanto, éstas se irradiaron a 10.000 RAD antes del uso.

Para preparar los ensayos, se añadieron estimuladores a los pocillos como proporciones variables con respecto al número de células respondedoras (2 x 10^{5}/pocillo). Los medios se suplementaron con anticuerpos anti-KIM-1 de ratón a 20 \mug/ml, como se indica. Los cultivos se prepararon en tres placas idénticas y cada condición experimental fue representada por 3 pocillos por placa. Se usó una placa para generar datos de la proliferación celular usando un ensayo de MTS (CellTiter 96, Promega, Madison, WI, Estados Unidos). Las otras placas se usaron para recoger muestras de sobrenadante para análisis de citocinas. Se usaron ELISA (Pierce Endogen, Rockford, IL, Estado Unidos o R+D Systems, Minneapolis, MN, Estados Unidos) para medir los niveles de hIFN\gamma, hTNF y hIl-2 en sobrenadantes de cultivo. Los errores estándar para los valores obtenidos de los ensayos de proliferación y ELISA eran menores del 10% y se han omitido de las figuras. Se observaron grandes desviaciones de los valores de control positivo para IFN\gamma, mientras que los niveles de II-2 y TNF en los cultivos no eran significativamente diferentes entre los grupos de control positivo y de tratamiento. Los datos de TNF se han omitido. Los datos para II-2, IFN\gamma y proliferación celular se muestran para este experimento representativo.

El tratamiento del cultivo de MLR con los mAb anti-KIM-1 humano de ratón AUF1 y AKG7 redujo significativamente el nivel de IFN\gamma secretado en el sobrenadante (Figura 12A). Este efecto era específico para IFN\gamma, puesto que no se observó ninguna disminución en el nivel de II-2 o TNF secretados en el sobrenadante (Figura 12B). El efecto no se debía al número de células diminuido en estos cultivos, puesto que el ensayo de proliferación celular demostró que el número de células vivas en los cultivos era similar (Figura 13).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 12

Modelo de enfermedad inflamatoria del intestino en ratón (IBP)

La capacidad de una forma soluble de proteína de fusión de KIM-1-Ig para influir en la evolución o en la gravedad de los síntomas en un modelo de IBD en ratones de experimentación. En este modelo, se usó DSS para irritar de forma crónica el intestino grueso (colon), causando que se desarrollara una inflamación. Se sabe que mediadores proinflamatorios tales como IFN\gamma, TNF e 11-12 son importantes para el desarrollo y la gravedad de la IBD, tanto en modelos de ratón como en pacientes humanos (Egger et al., 2000, Digestion 62: 240-248; Monteleone et al., 2000, Ann. Med. 32: 552-560; Bouma et al., 2003, Nat. Rev. Immunol. 3: 521-533). Como se ha descrito anteriormente, los datos de MLR habían sugerido que la modulación de KIM-1 podría influir en la producción de mediadores proinflamatorios tales como IFN\gamma. Por lo tanto, se ensayó un reactivo modificador de KIM-1 in vivo. Se hipotetizó que la proteína de fusión de KIM-1-Ig estaba actuando por interrupción de la interacción de uno o más ligandos con KIM-1 expresado en células tales como linfocitos activados u otras células inmunes.

La IBD se indujo en ratones usando el modelo de sulfato sódico de dextrano (DSS) (Copper et al., 1993, Lab. Invest. 69: 238-249) Se proporcionó una solución de DSS al 4,5% (ICN Biomedicals, Aurora, OH, Estados Unidos) en agua destilada estéril como la fuente de bebida. Los ratones se pesaron justo antes de la introducción de DSS y se pesaron después diariamente. Los ratones también se puntuaron por el grado de diarrea (1: heces blandas, 2: heces sueltas, 3: heces claramente líquidas, 4: incontinencia pronunciada) y por la presencia de sangre en las heces (0: sin sangre, 1: con sangre) usando los portaobjetos ColoScreen (Helena Labs, Beaumont, TX, Estados Unidos). A cantidades de sangre pequeñas pero detectables se les dio una puntuación intermedia de 0,5. A los ratones se les administraron dosis i. p. de 200 \mug de proteína de fusión de KIM-1-Ig o control de hIgG policlonal (Sandimmune, Sandoz, Ginebra, Suiza) el día 0, día 2 y día 5. El día 8, a los ratones se les retiró el agua con DSS y se les suministró agua de bebida normal. El control del peso y de las puntuaciones clínicas continuó hasta el día 12, momento en el que terminó el experimento.

El tratamiento de ratones durante la fase de inducción de IBD (días 0, 2 y 5) tuvo un impacto significativo sobre la pérdida de peso acumulada y la puntuación de enfermedad hasta el día 8 incluido. Por lo tanto, a los ratones se les retiró el DSS y volvieron a agua de bebida normal y se controló su recuperación. Los ratones que había recibido proteína de fusión de KIM-1-Ig los días 0, 2 y 5 estaban sistemáticamente más sanos el día 11 (3 días en recuperación) como indicaba el grado de pérdida de peso (Figura 14) y por su puntuación clínica (diarrea y sangrado; Figura 15A). Muchos menos ratones en la cohorte tratada con KIM-1-Ig tenía sangre presente en las heces (Figura 15B).

Estos datos sugirieron que la modulación de KIM-1 in vivo tiene efectos protectores en un contexto inflamatorio agudo, tal como el que está presente después de la lesión del DSS en la mucosa del intestino. Estos resultados sugirieron que los antagonistas de KIM-1 serán eficaces en otros entornos inflamatorios agudos o crónicos, por ejemplo, en artritis reumatoide, esclerosis múltiple, soriasis y pancreatitis.

Otras realizaciones están dentro de las siguientes reivindicaciones.

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patentes citados en la descripción

\bullet WO 9604376 A [0002]

\bullet US 4510245 A, Bell [0099]

\bullet US 5622861 A [0002]

\bullet US 4968615 A, Schaffner [0099]

\bullet WO 200073498 A [0003]

\bullet US 4399216 A [0100]

\bullet WO 9938881 A [0003]

\bullet US 4634665 A [0100]

\bullet US 5547853 A, Wallner [0057] [0060]

\bullet US 5179017 A, Axel [0100]

\bullet US 5541087 A, Lo [0057] [0058]

\bullet EP 0216846 A [0104]

\bullet EP0154316 A [0074]

\bullet EP 0256055 A [0104]

\bullet EP 0401384 A [0074]

\bullet EP 0323997 A [0104]

\bullet US 5252714 A [0078]

\bullet EP 89303964 A [0104]

\bullet US 5168062 A, Stinski [0099]

\bullet US 60436934 B [0156]

\vskip1.000000\baselineskip

Bibliografía no relativa a patentes citada en la descripción

\bulletICHIMURA et al. J. Biol. Chem., 1998, vol. 273, 4135-4142 [0002]

\bulletJENTOFT. Trends Biochem. Sci., 1990, vol. 15, 291-294 [0002]

\bulletKAPLAN et al. EMBO J., 1996, vol. 15, 4282-4296 [0002]

\bulletFEIGELSTOCK. J. Virol., 1998, vol. 72, 6621-6628 [0002]

\bulletBAILLY et al. J. Biol. Chem. 2002, vol. 277, 39739-39748 [0004]

\bulletHAN et al Kidney Intl., 2002, vol. 62, 237-244 [0004]

\bulletMCINTIRE et al. Nature Immunology, 2001, vol. 2, 1109 [0004]

\bulletKUMANOGOH et al. Nature, 2002, vol. 419,629-633 [0004]

\bulletMONNEY et al. Nature, 2002, vol. 415, 536-541 [0004]

\bulletPRINZ et al. J. Am. Acad. Dermatol., 1996, vol. 34 (1), 244-52 [0005]

\bulletYUNG. Current Opinion in Investigational Drugs, 2001, vol. 2(2), 216-221 [0005]

\bulletBENJAMINI et al. Immunology, A Short Course. Wiley-Liss, 1996 [0041]

\bulletLEANDRO et al. Ann. Rheum. Dis., 2002, vol. 61, 863-866 [0041]

\bullet DE VITA et al. Arthritis Rheum., vol. 46, 2029-2033 [0041]

\bulletTSUJI et al. J. Exp. Med., 2002, vol. 196, 1277-1290 [0041]

\bulletBACH-ELIAS et al. Parasitol. Res., 1998, vol. 84, 796-799 [0042]

\bulletTIBBETTS et al. J. Immunol., 1994, vol. 152, 1493-1499 [0042]

\bullet DE WIT et al. J. Immunol., 1993, vol. 150, 361-366 [0044]

\bulletKRENGER et al. Immunol. Res., 1996, vol. 15, 50-73 [0044]

\bulletWILLIAMSON et al. J. Immunol., 1996, vol. 157, 689-699 [0044]

\bulletBOEHM et al. Ann Rev. Immunol. 1997, vol. 15, 749-795 [0048]

\bulletYEH et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, 1904-1908 [0055]

\bulletSYED et al. Blood, 1997, vol. 89, 3243-3252 [0055]

\bulletLO et al. Biochim. Biophys. Acta, 1991, vol. 1088, 712 [0060]

\bulletLO et al. Protein Engineering, 1998, vol. 11, 495-500 [0060]

\bulletHENDERSHOT et al. Immunol. Today, 1987, vol. 8, 111-114 [0061]

\bulletGILLIES et al. Hum. Antibod. Hybridomas, 1990, vol. 1, 47 [0062]

\bulletHOPP et al. Biotechnology, 1988, vol. 6, 1204 [0066]

\bulletSMITH et al. Gene, 1988, vol. 67, 31 [0067]

\bullet LA VALLIE et al. Biotechnology, 1993, vol 11, 187 [0067]

\bulletFocus on Growth Factors, 1992, vol. 3, 4-10 [0074]

\bulletBioconjugate Chem., 1994, vol. 5, 133-140 [0075]

\bulletWARD et al. Nature, 1989, vol. 341, 544-546 [0089]

\bulletBIRD et al. Science, 1988, vol. 242, 423-426 [0089]

\bulletHUSTON et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, vol. 85, 5879-5883 [0089]

\bulletHOLLIGER et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, vol. 90, 6444-6448 [0089]

\bulletPOLJAK et al. Structure, 1994, vol. 2, 1121-1123 [0089]

\bulletHARLOW et al. Antibodies, A. Laboratory Manual, 1988 [0090]

\bulletYELTON et al., Ann. Rev. Biochem., 1981, vol. 50, 657-80 [0090]

\bulletAUSUBEL et al. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, 1989 [0090]

\bulletHUSE et al. Science, 1989, vol. 246, 1275-1281 [0090]

\bulletSOUTHERN et al. J. Mol. Anal. Genet., 1982, vol. 1, 327-341 [0096]

\bulletCOHEN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1972, vol. 69, 2110-2114 [0102]

\bulletGRAHAM et al. Virology, 1973, vol. 52, 456-467 [0102]

\bulletWIGLER et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, vol. 73, 1373-1376 [0102]

\bullet Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., 1978 [0108]

\bullet Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack Pub. Co, 1980 [0112]

\bulletDURIE et al. J. Clin. Invest., 1994, vol. 94, 1333-1338 [0126]

\bulletBERNEY et al. Transplantation, 2001, vol. 72, 133-140 [0128]

\bulletCARBALLIDO et al. Nat. Med., 2000, vol. 6, 103-106 [0128] [0130]

\bulletIFVERSON et al. Immunology, 1995, vol. 84, 111-116 [0129]

\bulletCARRODEGUAS et al. Hum. Immunol., 1999, vol. 60, 640-651 [0131]

\bulletMARTINO; GRINALDIM. Immunology Methods Manual, 1997, vol. 3 [0131]

\bulletEGGER et al. Digestion, 2000, vol. 62, 240-248 [0151]

\bulletMONTELEONE et al. Ann. Med., 2000, vol. 32, 552-560 [0151]

\bulletBOUMA et al. Nat. Rev. Immunol., 2003, vol. 3, 521-533 [0151]

\bulletCOPPER et al. Lab. Invest., 1993, vol. 69, 238-249 [0152]

<110> BIOGEN IDEC MA INC.

\hskip1cm

RENNERT, Paul

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Antagonistas de KIM-1 y uso para modular el sistema inmune

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> A184 PCT

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> No asignado todavía

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 29-12-2003

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/436934

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 30-12-2002

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ para Windows versión 4.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 518

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Construcción de dominio extracelular de KIM-1 humano-Fc

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 357

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Construcción de dominio extracelular parcial de KIM-1 humano-Fc

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 298

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Construcción de dominio extracelular de KIM-1 humano con marcador His

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1398

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Construcción de dominio extracelular de KIM-1 humano-Fc

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 465

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fusión de KIM-1-Fc

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

11

Claims (12)

1. Uso de un antagonista de KIM-1 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad autoinmune, en el que el antagonista de KIM-1 es (a) un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la porción extracelular del polipéptido KIM-1 de longitud completa, seleccionándose el polipéptido KIM-1 del grupo que consiste en la SEC ID Nº:1 y la SEC ID Nº: 2 o (b) un polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina de KIM-1 y que carece de un dominio transmembrana y de un dominio citoplasmático de KIM-1.

2. Uso de la reivindicación 1, en el que la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste en lupus, miastenia grave, anemia hemolítica autoinmune, enfermedad de Chagas, enfermedad de Graves, púrpura trombocitopénico idiopático, granulomatosis de Wegener, poliarteritis nodosa, glomerulonefritis semilunar rápidamente progresiva, enfermedad de injerto contra hospedador y artritis reumatoide.

3. Uso de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la enfermedad autoinmune es lupus.

4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la composición comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a KIM-1.

5. Uso de la reivindicación 4, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo policlonal, anticuerpo monoclonal, anticuerpo humanizado, anticuerpo completamente humano, anticuerpo quimérico, anticuerpo de cadena sencilla, diacuerpo, fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento F(ab')_{2}, fragmento Fv, fragmento Fd, fragmento dAb o fragmento que contiene una región determinante de complementariedad.

6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la composición comprende un polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina de KIM-1 y que carece de un dominio transmembrana y de un dominio citoplasmático de KIM-1.

7. Uso de la reivindicación 6, en el que el polipéptido comprende además un dominio de mucina de KIM-1.

8. Uso de las reivindicaciones 6 ó 7, en el que el polipéptido comprende además una unidad heteróloga.

9. Uso de la reivindicación 8, en el que la unidad heteróloga se selecciona del grupo que consiste en una unidad de albúmina sérica, una unidad de direccionamiento, una unidad indicadora y una unidad que facilita la purificación.

10. Uso de la reivindicación 8, en el que la unidad heteróloga es una unidad de inmunoglobulina.

11. Uso de la reivindicación 10, en el que la unidad de inmunoglobulina es una unidad de Fc.

12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, en el que el polipéptido está conjugado a un polímero.