ES2309119T3 - USE OF ANTIGONISTS OF THE VEGF CELLULAR GROWTH FACTOR. - Google Patents

Abstract

(A) A compsn. is claimed comprising a human vascular endothelial growth factor (hVEGF) antagonist, provided however that the antagonist is not the flt or flk-1 or KOR receptor or a neutralising anti-hVEGF antibody. Also claimed are: (B) a monoclonal antibody (MAb) amino acid sequence capable of specifically binding to a HVEGF receptor (hVEGFr) or a hVEGF-hVEGFr; (C) a polypeptide comprising an amino acid sequence comprising a bVEGFr and an immunoglobulin chain; (D) a method of treatment of a tumour in a mammal comprising administering a HVEGF antagonist to reduce the size of the tumour.

Description

Utilización de antagonistas del factor de crecimiento celular VEGF.Use of factor antagonists VEGF cell growth.

Uso de antagonistas del factor de crecimiento endotelial vascular.Use of growth factor antagonists vascular endothelial

Campo de la invenciónField of the Invention

La presente invención se refiere a antagonistas del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), a composiciones terapéuticas que comprenden los antagonistas y a procedimientos de uso de los antagonistas para propósitos diagnósticos y terapéuticos.The present invention relates to antagonists of vascular endothelial growth factor (VEGF), to therapeutic compositions comprising the antagonists and a antagonist use procedures for purposes Diagnostic and therapeutic.

Antecedentes de la invenciónBackground of the invention

Los dos principales componentes celulares del sistema vascular son las células endoteliales y de la musculatura lisa. Las células endoteliales forman el revestimiento de la superficie interna de todos los vasos sanguíneos y constituyen una interfaz no trombogénica entre la sangre y el tejido. Además, las células endoteliales son un componente importante del desarrollo de nuevos capilares y vasos sanguíneos. De este modo, las células endoteliales proliferan durante la angiogénesis, o neovascularización, asociada con formación de tumores y metástasis, y con una variedad de enfermedades o trastornos no neoplásicos.The two main cellular components of vascular system are the endothelial cells and the muscles smooth. Endothelial cells form the lining of the inner surface of all blood vessels and constitute a non-thrombogenic interface between blood and tissue. In addition, the endothelial cells are an important component of the development of New capillaries and blood vessels. In this way, the cells endothelials proliferate during angiogenesis, or neovascularization, associated with tumor formation and metastasis, and with a variety of non-neoplastic diseases or disorders.

Varios polipéptidos de aparición natural inducen según se informa la proliferación de células endoteliales. Entre aquellos polipéptidos se incluyen los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) ácidos y básicos, Burgess and Maciag, Annual Rev. Biochem., 58: 575 (1989), el factor de crecimiento endotelial derivado de plaquetas (PD-ECGF), Ishikawa y otros, Nature, 338: 557 (1989) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), Leung y otros, Science 246: 1.306 (1989); Ferrara y Henzel, Biochem. Biophys. Res. Commun. 161: 851 (1989); Tischer y otros, Biochem. Biophys. Res. Commun. 165: 1.198 (1989); Ferrara y otros, publicación de patente PCT n.º WO 90/13649 (publicada el 15 de noviembre, 1990); Ferrara y otros, solicitud de patente US 07/360.229.Several naturally occurring polypeptides induce Reported proliferation of endothelial cells. Between those polypeptides include growth factors of acidic and basic fibroblasts (FGF), Burgess and Maciag, Annual Rev. Biochem., 58: 575 (1989), endothelial growth factor platelet derivative (PD-ECGF), Ishikawa and others, Nature, 338: 557 (1989) and endothelial growth factor vascular (VEGF), Leung et al., Science 246: 1,306 (1989); Ferrara and Henzel, Biochem. Biophys Res. Commun. 161: 851 (1989); Tischer and others, Biochem. Biophys Res. Commun. 165: 1,198 (1989); Ferrara and others, PCT Patent Publication No. WO 90/13649 (published on 15 November, 1990); Ferrara and others, US patent application 07 / 360,229.

El VEGF se identificó por primera vez en medios condicionados con células foliculares o foliculoestrelladas de hipófisis bovina. Los análisis bioquímicos indican que el VEGF bovino es una proteína dimérica con una masa molecular aparente de aproximadamente 45.000 dalton y con aparente especificidad mitógena por las células endoteliales. El ADN que codifica el VEGF bovino se aisló mediante cribado de una genoteca de ADNc preparada a partir de tales células, utilizando nucleótidos basados en la secuencia de aminoácidos aminoterminales de la proteína como sondas de hibridación.VEGF was first identified in the media conditioned with follicular or starred follicle cells of bovine pituitary gland Biochemical analyzes indicate that VEGF Bovine is a dimeric protein with an apparent molecular mass of approximately 45,000 dalton and with apparent mitogenic specificity by endothelial cells. The DNA encoding bovine VEGF is isolated by screening a cDNA library prepared from of such cells, using nucleotides based on the sequence of amino-terminal amino acids of the protein as probes of hybridization.

El VEGF humano se obtuvo mediante un primer cribado de una genoteca de ADNc preparada a partir de células humanas, utilizando ADNc de VEGF bovino como sonda de hibridación. Un ADNc identificado de este modo codifica una proteína de 165 aminoácidos que tiene una homología superior al 95% con el VEGF bovino, a la cual proteína se hace referencia como VEGF humano (hVEGF). La actividad mitógena del VEGF humano se confirmó expresando el ADNc del VEGF humano en células huésped de mamíferos. Los medios condicionados por células transfectadas con el ADNc del VEGF humano favorecieron la proliferación de células endoteliales capilares, mientras que las células de control no. Leung y otros, Science 246: 1.306 (1989).Human VEGF was obtained by a first screening of a cDNA library prepared from cells human, using bovine VEGF cDNA as a hybridization probe. A cDNA identified in this way encodes a 165 protein amino acids that have a homology greater than 95% with VEGF bovine, to which protein is referred to as human VEGF (hVEGF). The mitogenic activity of human VEGF was confirmed expressing the human VEGF cDNA in mammalian host cells. Media conditioned by cells transfected with the cDNA of the Human VEGF favored endothelial cell proliferation capillaries, while control cells do not. Leung and others, Science 246: 1,306 (1989).

Se identificaron varios ADNc adicionales en genotecas de ADNc humano que codifican isoformas de 121, 189 y 206 aminoácidos del hVEGF (a las que en conjunto también se hace referencia como proteínas afines a hVEGF). La proteína de 121 aminoácidos difiere del hVEGF en virtud de la deleción de los 44 aminoácidos entre los restos 116 y 159 en hVEGF. La proteína de 189 aminoácidos difiere de hVEGF en virtud de la inserción de 24 aminoácidos en el residuo 116 en hVEGF, y al parecer es idéntica al factor de permeabilidad vascular humano (hVPF). La proteína de 206 aminoácidos difiere del hVEGF en virtud de una inserción de 41 aminoácidos en el resto 116 en hVEGF. Houck y otros, Mol. Endocrin. 5: 1.806 (1991); Ferrara y otros, J. Cell. Biochem. 47: 211 (1991); Ferrara y otros, Endocrine Reviews 13: 18 (1992); Keck y otros, Science 246: 1.309 (1989); Connolly y otros, J. Biol. Chem. 264: 20.017 (1989); Keck y otros, EPO Pat. Pub. n.º 0 370 989 (publicada el 30 de mayo, 1990).Several additional cDNAs were identified in human cDNA libraries encoding isoforms of 121, 189 and 206 hVEGF amino acids (which together are also made reference as proteins related to hVEGF). 121 protein amino acids differs from hVEGF by virtue of the deletion of 44 amino acids between residues 116 and 159 in hVEGF. 189 protein amino acids differs from hVEGF by virtue of the insertion of 24 amino acids in residue 116 in hVEGF, and apparently is identical to Human vascular permeability factor (hVPF). 206 protein amino acids differs from hVEGF by virtue of an insertion of 41 amino acids in the remainder 116 in hVEGF. Houck and others, Mol. Endocrin 5: 1,806 (1991); Ferrara et al., J. Cell. Biochem 47: 211 (1991); Ferrara et al., Endocrine Reviews 13: 18 (1992); Keck and others, Science 246: 1,309 (1989); Connolly et al., J. Biol. Chem. 264: 20,017 (1989); Keck and others, EPO Pat. Pub. No. 0 370 989 (published May 30, 1990).

El VEGF no sólo estimula la proliferación de células endoteliales, sino que también induce la permeabilidad vascular y la angiogénesis. La angiogénesis, que implica la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de endotelio preexistente, es un componente importante de una variedad de enfermedades y trastornos entre los cuales la formación de tumores y la metástasis, la artritis reumatoide, la soriasis, la aterosclerosis, la retinopatía diabética, la fibroplasia retrolental, el glaucoma neovascular, los hemangiomas, el rechazo inmunitario del trasplante de un tejido de córnea y de otros tejidos y la inflamación crónica.VEGF not only stimulates the proliferation of endothelial cells, but also induces permeability Vascular and angiogenesis. Angiogenesis, which implies the formation of new blood vessels from endothelium preexisting, it is an important component of a variety of diseases and disorders among which tumor formation and metastasis, rheumatoid arthritis, psoriasis, atherosclerosis, diabetic retinopathy, fibroplasia retrolental, neovascular glaucoma, hemangiomas, rejection Immune transplantation of a cornea tissue and other tissues and chronic inflammation.

En el caso de formación de un tumor, la angiogénesis es al parecer fundamental para la transición de la hiperplasia a la neoplasia, y para proporcionar alimento al tumor sólido en crecimiento. Folkman y otros, Nature 339: 58 (1989). La angiogénesis también permite a los tumores estar en contacto con el lecho vascular del huésped, que puede proporcionar una vía para la metástasis de las células tumorales. Los indicios sobre la función de la angiogénesis en la metástasis tumoral proceden, por ejemplo, de estudios que muestran una correlación entre el número y la densidad de microvasos en secciones histológicas de carcinoma de mama humano invasivo y la presencia actual de metástasis distantes. Weidner y otros, New Engl. J. Med. 324: 1 (1991).In the case of tumor formation, the angiogenesis is apparently critical to the transition of the hyperplasia to the neoplasia, and to provide food to the tumor growing solid. Folkman et al., Nature 339: 58 (1989). The Angiogenesis also allows tumors to be in contact with the vascular bed of the host, which can provide a pathway for metastasis of tumor cells. The clues about the function from angiogenesis in tumor metastasis proceed, for example, of studies that show a correlation between number and density of microvessels in histological sections of carcinoma of Invasive human breast and the current presence of distant metastases. Weidner and others, New Engl. J. Med. 324: 1 (1991).

Dada la función del crecimiento endotelial vascular y la angiogénesis, y la función de aquellos procesos en muchas enfermedades y trastornos, es deseable contar con un medio para reducir o inhibir uno o más efectos biológicos del VEGF. También es deseable contar con un medio para analizar la presencia del VEGF en condiciones normales y patológicas, y en especial en el cáncer.Given the function of endothelial growth vascular and angiogenesis, and the function of those processes in many diseases and disorders, it is desirable to have a means to reduce or inhibit one or more biological effects of VEGF. It is also desirable to have a means to analyze the presence of VEGF under normal and pathological conditions, and especially in the Cancer.

Descripción resumida de la invenciónSummary Description of the Invention

La presente invención tal como se define en la reivindicaciones proporciona el uso de antagonistas del VEGF, entre los cuales: (a) anticuerpos y variantes de los mismos que pueden unirse específicamente al hVEGF o al receptor hVEGF y (b) receptor hVEGF y variantes del mismo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades o trastornos no neoplásicos caracterizados por un exceso de neovascularización no deseable, entre los cuales a modo de ejemplo artritis reumatoide, soriasis, aterosclerosis, retinopatía diabética y otras, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, hemangiomas, hiperplasias tiroideas (incluida la enfermedad de Grave), trasplante de córnea y de otros tejidos, e inflamación crónica.The present invention as defined in the claims provides the use of VEGF antagonists, between which: (a) antibodies and variants thereof that may specifically bind to hVEGF or hVEGF receptor and (b) receptor hVEGF and variants thereof in the manufacture of a medicament for  the treatment of non-neoplastic diseases or disorders characterized by an excess of undesirable neovascularization, among which as an example rheumatoid arthritis, psoriasis, atherosclerosis, diabetic and other retinopathy, fibroplasia retrolental, neovascular glaucoma, hemangiomas, hyperplasias Thyroid (including Grave's disease), cornea transplant and of other tissues, and chronic inflammation.

El antagonista del VEGF pueden ser anticuerpos monoclonales poliespecíficos que pueden unirse a: (a) un epítopo no hVEGF, por ejemplo, un epítopo de una proteína implicada en la trombogénesis o la trombólisis, o un antígeno de superficie de una célula tumoral y a (b) hVEGF o a un receptor hVEGF.The VEGF antagonist can be antibodies Polyspecific monoclonal that can bind to: (a) a non-epitope hVEGF, for example, an epitope of a protein involved in the thrombogenesis or thrombolysis, or a surface antigen of a tumor cell and a (b) hVEGF or an hVEGF receptor.

Los antagonistas del VEGF pueden conjugarse con una parte citotóxica.VEGF antagonists can be conjugated with a cytotoxic part

El antagonista del VEGF puede administrarse, simultánea o secuencialmente, junto con uno o más antagonistas del VEGF o con sustancias antiangiogénicas.The VEGF antagonist can be administered, simultaneously or sequentially, together with one or more antagonists of the VEGF or with antiangiogenic substances.

Breve descripción de las figurasBrief description of the figures

La figura 1 muestra el efecto de anticuerpos monoclonales anti-hVEGF (A4.6.1 o B2.6.2) o de un anticuerpo irrelevante del factor de crecimiento antihepatocítico (anti-HGF) en la unión de los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF a hVEGF.Figure 1 shows the effect of antibodies monoclonal anti-hVEGF (A4.6.1 or B2.6.2) or a irrelevant antihepatocyte growth factor antibody (anti-HGF) in antibody binding monoclonal anti-hVEGF to hVEGF.

La figura 2 muestra el efecto de anticuerpos monoclonales anti-hVEGF (A4.6.1 o B2.6.2) o de un anticuerpo irrelevante anti-HGF en la actividad biológica de hVEGF en cultivos de células endoteliales de capilares de corteza suprarrenal (ACE) bovina.Figure 2 shows the effect of antibodies monoclonal anti-hVEGF (A4.6.1 or B2.6.2) or a irrelevant anti-HGF antibody in activity Biological of hVEGF in capillary endothelial cell cultures of bovine adrenal cortex (ACE).

La figura 3 muestra el efecto de anticuerpos monoclonales anti-hVEGF (A4.6.1, B2.6.2 o A2.6.1) en la unión de hVEGF a células ACE bovinas.Figure 3 shows the effect of antibodies monoclonal anti-hVEGF (A4.6.1, B2.6.2 or A2.6.1) in the binding of hVEGF to bovine ACE cells.

La figura 4 muestra el efecto de un tratamiento con anticuerpos monoclonales anti-hVEGF A4.6.1 en el índice de formación de tumores NEG55 en ratones.Figure 4 shows the effect of a treatment with anti-hVEGF A4.6.1 monoclonal antibodies in the NEG55 tumor formation index in mice.

La figura 5 muestra el efecto de un tratamiento con anticuerpos monoclonales anti-hVEGF A4.6.1 en el tamaño de tumores NEG55 en ratones tras cinco semanas de tratamiento.Figure 5 shows the effect of a treatment with anti-hVEGF A4.6.1 monoclonal antibodies in the size of NEG55 tumors in mice after five weeks of treatment.

La figura 6 muestra el efecto de un tratamiento con anticuerpos monoclonales anti-hVEGF A4.6.1 (VEGF Ab) en la formación de tumores SK-LMS-1 en ratones.Figure 6 shows the effect of a treatment with anti-hVEGF A4.6.1 monoclonal antibodies (VEGF Ab) in tumor formation SK-LMS-1 in mice.

La figura 7 muestra el efecto de varias dosis de un tratamiento con anticuerpos monoclonales anti-hVEGF A4.6.1 (VEGF Ab) en la formación de tumores A673 en ratones.Figure 7 shows the effect of several doses of a treatment with monoclonal antibodies anti-hVEGF A4.6.1 (VEGF Ab) in the formation of A673 tumors in mice.

La figura 8 muestra el efecto de un tratamiento con anticuerpos monoclonales anti-hVEGF A4.6.1 en la formación y supervivencia de células de glioblastoma NEG55 (G55) en cultivo.Figure 8 shows the effect of a treatment with anti-hVEGF A4.6.1 monoclonal antibodies in the formation and survival of glioblastoma cells NEG55 (G55) in culture.

La figura 9 muestra el efecto de un anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 en la formación y supervivencia de células de rabdomiosarcoma A673 en cultivo.Figure 9 shows the effect of an antibody monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 in training and A673 rhabdomyosarcoma cell survival in culture.

La figura 10 muestra el efecto de un anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 en la quimiotaxis sinovial inducida por líquido sinovial de células endoteliales humanas.Figure 10 shows the effect of an antibody monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 in chemotaxis synovial induced by synovial fluid of endothelial cells human.

Descripción detallada de la invenciónDetailed description of the invention

El término "hVEGF" se utiliza en la presente invención para referirse al factor de crecimiento celular endotelial humano de 165 aminoácidos, y a los factores de crecimiento celular endotelial vascular de 121, 189 y 206 aminoácidos, tal como describieron Leung y otros, Science 246: 1.306 (1989) y Houck y otros, Mol. Endocrin. 5: 1.806 (1991) junto con las formas alélicas de aparición natural y procesadas de aquellos factores de crecimiento.The term "hVEGF" is used in the present invention to refer to the cell growth factor human endothelial of 165 amino acids, and to the factors of vascular endothelial cell growth of 121, 189 and 206 amino acids, as described by Leung et al., Science 246: 1,306 (1989) and Houck et al., Mol. Endocrin 5: 1,806 (1991) along with the allelic forms of natural and processed appearance of those growth factors

La presente invención proporciona antagonistas del hVEGF que pueden inhibir una o más de las actividades biológicas del hVEGF, por ejemplo, su actividad mitógena o angiogénica. Los antagonistas del VEGF actúan interfiriendo en la unión del hVEGF a un receptor celular. Dentro del alcance de la invención se incluyen anticuerpos, y preferiblemente anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos que se unen al hVEGF o al receptor hVEGF. También incluidos dentro del alcance de la invención destacan el receptor hVEGF y fragmentos y variantes de secuencias de aminoácidos de los mismos que pueden unirse al hVEGF.The present invention provides antagonists. of hVEGF that can inhibit one or more of the activities biological aspects of hVEGF, for example, its mitogenic activity or angiogenic VEGF antagonists act by interfering with the hVEGF binding to a cellular receptor. Within the scope of the invention include antibodies, and preferably antibodies monoclonal, or fragments thereof that bind to hVEGF or hVEGF receiver. Also included within the scope of the invention highlight the hVEGF receptor and fragments and variants of amino acid sequences thereof that can bind to hVEGF

La expresión "receptor hVEGF" o "hVEGFr" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a celular para hVEGF, normalmente un receptor de superficie celular observado en células endoteliales vasculares, así como a variantes del mismo que conservan la capacidad de unirse a hVEGF. Habitualmente, los receptores hVEGF y las variantes de los mismos que son antagonistas del hVEGF aparecerán de forma aislada, más que integradas en una membrana celular o fijadas en una superficie celular tal como puede ser el caso en la naturaleza. Un ejemplo de receptor hVEGF es la tirosinquinasa de tipo fms (flt), un receptor transmembrana en la familia de las tirosinquinasas. DeVries y otros, Science 255: 989 (1992); Shibuya y otros, Oncogene 5: 519 (1990). El receptor flt comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio intracelular con actividad tirosinquinasa. El dominio extracelular está implicado en la unión de hVEGF mientras que el dominio intracelular está implicado en la transducción de
señal.The term "hVEGF receptor" or "hVEGFr" as used in the present invention refers to cellular for hVEGF, normally a cell surface receptor observed in vascular endothelial cells, as well as variants thereof that retain the ability to bind to hVEGF Typically, hVEGF receptors and variants thereof that are hVEGF antagonists will appear in isolation, rather than integrated into a cell membrane or fixed to a cell surface as may be the case in nature. An example of the hVEGF receptor is the fms type tyrosine kinase ( flt ), a transmembrane receptor in the tyrosine kinase family. DeVries et al., Science 255: 989 (1992); Shibuya and others, Oncogene 5: 519 (1990). The flt receptor comprises an extracellular domain, a transmembrane domain and an intracellular domain with tyrosine kinase activity. The extracellular domain is involved in hVEGF binding while the intracellular domain is involved in transduction of
signal.

Otro ejemplo de receptor hVEGF es el receptor flk-1 (al que también se hace referencia como KDR). Matthews y otros, Proc. Nat. Acad. Sci. 88: 9.026 (1991); Terman y otros, Oncogene 6: 1.677 (1991); Terman y otros, Biochem. Biophys. Res. Commun. 187: 1579 (1992).Another example of the hVEGF receiver is the flk-1 receiver (also referred to as KDR). Matthews et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 88: 9.026 (1991); Terman et al., Oncogene 6: 1,677 (1991); Terman and others, Biochem. Biophys Res. Commun. 187: 1579 (1992).

La unión de hVEGF al receptor flt produce la formación de por lo menos dos complejos de peso molecular elevado, que tienen un peso molecular de al parecer 205.000 y 300.000 dalton. Se cree que el complejo de 300.000 dalton es un dímero que comprende dos moléculas receptoras unidas a una sola molécula del hVEGF.The binding of hVEGF to the flt receptor causes the formation of at least two high molecular weight complexes, which have a molecular weight of apparently 205,000 and 300,000 daltons. The 300,000 dalton complex is believed to be a dimer comprising two receptor molecules bound to a single hVEGF molecule.

Dentro del alcance de la presente invención también se incluyen variantes del hVEGFr. Entre los ejemplos representativos se incluyen formas truncadas de un receptor en el cual los dominios transmembrana y citoplasmático son eliminados del receptor, y proteínas de fusión en las que los polímeros o polipéptidos no hVEFGr están conjugados con el hVEGFr o, preferiblemente, con formas truncadas del mismo. Un ejemplo de tal polipéptido no hVEGF es una inmunoglobulina. En tal caso, por ejemplo, el dominio extracelular del hVEGFr es sustituido por el dominio Fv de una cadena ligera o (preferiblemente) una cadena pesada de inmunoglobulina, con el extremo terminal C del dominio extracelular del receptor unido covalentemente al extremo aminoterminal del CH1, la bisagra, el CH2 u otro fragmento de la cadena pesada. Dichas variantes se elaboran del mismo modo que las conocidas inmunoadhesonas Véase, por ejemplo, Gascoigne y otros, Proc. Nat. Acad. Sci. 84: 2.936 (1987); Capon y otros, Nature 337: 525 (1989); Aruffo y otros, Cell 61: 1.303 (1990); Ashkenazi y otros, Proc. Nat. Acad. Sci. 88: 10.535 (1991); Bennett y otros, J. Biol. Chem. 266: 23.060 (1991). En otras realizaciones, el hVEGFr se conjuga con un polímero no proteínico tal como polietilenglicol (PEG) (véase por ejemplo, Davis y otros, patente de EE.UU. US 4.179.337; Goodson y otros, BioTechnology 8: 343-346 (1990); Abuchowski y otros, J. Biol. Chem. 252: 3.578 (1977); Abuchowski y otros, J. Biol. Chem. 252: 3.582 (1977)) o carbohidratos (véase por ejemplo, Marshall y otros, Arch Biochem. Biophys., 167: 77 (1975)). Esto sirve para ampliar la semivida biológica del hVEGFr y reduce la posibilidad de que el receptor sea inmunógeno en el mamífero al cual se administre. El hVEGFr se utiliza sustancialmente del mismo modo que los anticuerpos del hVEGF, teniendo en cuenta la afinidad del antagonista y su valencia en hVEGF.Also within the scope of the present invention are variants of hVEGFr. Representative examples include truncated forms of a receptor in which the transmembrane and cytoplasmic domains are removed from the receptor, and fusion proteins in which non-hVEFGr polymers or polypeptides are conjugated to hVEGFr or, preferably, with truncated forms of the same. An example of such a non-hVEGF polypeptide is an immunoglobulin. In such a case, for example, the extracellular domain of hVEGFr is replaced by the Fv domain of a light chain or (preferably) an immunoglobulin heavy chain, with the C-terminal end of the extracellular domain of the receptor covalently linked to the aminoterminal end of CH1, the hinge, the CH2 or another fragment of the heavy chain. Such variants are made in the same manner as the known immunoadhesons See, for example , Gascoigne et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 84: 2,936 (1987); Capon et al., Nature 337: 525 (1989); Aruffo et al., Cell 61: 1303 (1990); Ashkenazi and others, Proc. Nat. Acad. Sci. 88: 10,535 (1991); Bennett et al., J. Biol. Chem. 266: 23,060 (1991). In other embodiments, the hVEGFr is conjugated to a non-protein polymer such as polyethylene glycol (PEG) ( see, for example , Davis et al., U.S. Patent 4,179,337; Goodson et al., BioTechnology 8: 343-346 ( 1990); Abuchowski et al., J. Biol. Chem. 252: 3,578 (1977); Abuchowski et al., J. Biol. Chem. 252: 3,582 (1977)) or carbohydrates (see for example, Marshall et al., Arch Biochem Biophys., 167: 77 (1975)). This serves to extend the biological half-life of hVEGFr and reduces the possibility that the receptor is immunogenic in the mammal to which it is administered. HVEGFr is used in substantially the same way as hVEGF antibodies, taking into account the affinity of the antagonist and its valence in hVEGF.

El dominio extracelular del receptor hVEGF, bien por sí mismo como fusionado a un polipéptido de inmunoglobulina o a otro polipéptido portador, es especialmente útil como antagonista de hVEGF, en virtud de su capacidad para secuestrar el hVEGF presente en un huésped que no está unido a hVEGFr en una superficie celular.The extracellular domain of the hVEGF receptor, well by itself as fused to an immunoglobulin polypeptide or to another carrier polypeptide is especially useful as an antagonist of hVEGF, by virtue of its ability to hijack the present hVEGF in a host that is not bound to hVEGFr on a surface mobile.

El hVEGFr y las variantes del mismo también son útiles en análisis de cribado para identificar agonistas y antagonistas de hVEGF. Por ejemplo, las células huésped transfectadas con ADN que codifica hVEGFr (por ejemplo, flt o flk1) sobreexpresan el polipéptido receptor en la superficie de la célula, haciendo que tales células huésped recombinantes sean en teoría adecuadas para analizar la capacidad de un compuesto de prueba (por ejemplo, una molécula pequeña, un péptido lineal o cíclico, o un polipéptido) para unirse a hVEFGr. El hVEGFr y las proteínas de fusión hVEGFr, tales como una proteína de fusión hVEGFr-IgG, pueden utilizarse de manera similar Por ejemplo, la proteína de fusión se une a un soporte inmovilizado y se determina la capacidad de un compuesto de prueba para desplazar el hVEFG radiomarcado del dominio hVEGFr de la proteína de fusión.The hVEGFr and its variants are also useful in screening analysis to identify agonists and hVEGF antagonists. For example, host cells transfected with DNA encoding hVEGFr (for example, flt or flk1) overexpress the receptor polypeptide on the cell surface, making such recombinant host cells theoretically suitable for analyzing the capacity of a test compound (for example, a small molecule, a linear or cyclic peptide, or a polypeptide) to bind hVEFGr. HVEGFr and proteins hVEGFr fusion, such as a fusion protein hVEGFr-IgG, can be used in a similar way example, the fusion protein binds to an immobilized support and is determines the ability of a test compound to displace the Radiolabeled hVEFG of the hVEGFr domain of the fusion protein.

El término "recombinante", utilizado para referirse al hVEGF, al receptor hVEGF, a anticuerpos monoclonales o a otras proteínas, se refiere a proteínas que son producidas por la expresión de ADN recombinante en una célula huésped. La célula huésped puede ser procariota (por ejemplo, una célula bacteriana tal como E. coli) o eucariota (por ejemplo, una levadura o una célula de mamífero).The term "recombinant", used to refer to hVEGF, hVEGF receptor, monoclonal antibodies or other proteins, refers to proteins that are produced by the expression of recombinant DNA in a host cell. The host cell can be prokaryotic (for example, a bacterial cell such as E. coli ) or eukaryotic (for example, a yeast or a mammalian cell).

Anticuerpos monoclonales antagonistasMonoclonal Antagonist Antibodies

La expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, cada uno de los anticuerpos comprendido en la población es idéntico en especificidad y afinidad excepto por posibles mutaciones de aparición natural que pueda haber en cantidades menores. Debería apreciarse que, como resultado de tales mutaciones de aparición natural y similares, una composición de anticuerpos monoclonales de la invención, que mayormente contendrá anticuerpos que pueden unirse específicamente al hVEFG o al hVEGFr también pueden contener cantidades de otros anticuerpos.The expression "monoclonal antibody" such as used herein refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, it is that is, each of the antibodies included in the population is identical in specificity and affinity except for possible mutations of natural appearance that may be in smaller quantities. Should it is appreciated that, as a result of such occurrence mutations natural and the like, a composition of monoclonal antibodies of the invention, which will mostly contain antibodies that can specifically bind to hVEFG or hVEGFr may also contain amounts of other antibodies.

De este modo, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como habiendo sido obtenido de tal población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier procedimiento en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales de la invención pueden crearse utilizando el procedimiento de hibridoma descrito por primera vez por Kohler y Milstein, Nature 256: 495 (1975), o pueden crearse mediante procedimientos de ADN recombinante. Cabilly y otros, Patente de EE.UU. US 4.816.567.In this way, the "monoclonal" modifier indicates the character of the antibody as having been obtained from such a substantially homogeneous population of antibodies, and should not be interpreted as requiring antibody production by any particular procedure. For example, the monoclonal antibodies of the invention can be created using the hybridoma procedure first described by Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975), or can be created by recombinant DNA procedures. Cabilly et al., Patent of USA US 4,816,567.

En el procedimiento de hibridoma, se inmuniza a un ratón o a otro animal huésped adecuado con antígeno por vía subcutánea, intraperitoneal, o intramuscular para descubrir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unen específicamente a la proteína o proteínas utilizadas en la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro. A continuación se fusionan los linfocitos con células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986).In the hybridoma procedure, a mouse or other suitable host animal is immunized with subcutaneous, intraperitoneal, or intramuscular antigen to discover lymphocytes that produce or are capable of producing antibodies that specifically bind to the protein or proteins used in immunization. . Alternatively, lymphocytes can be immunized in vitro . The lymphocytes are then fused with myeloma cells using a suitable fusion agent, such as polyethylene glycol, to form a hybridoma cell. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, p. 59-103 (Academic Press, 1986).

El antígeno puede ser hVEGF o hVEGFr. El antígeno es opcionalmente un fragmento o parte de cualquiera del hVEFG o el hVEGFr que tiene uno o más restos de aminoácidos que participan en la unión del hVEGF a uno de sus receptores. Por ejemplo, la inmunización con el dominio extracelular de un hVEGFr (es decir, un polipéptido hVEGFr truncado que carece de los dominios transmembrana e intracelular) será especialmente útil en la producción de anticuerpos que son antagonistas del hVEGF, ya que es el dominio extracelular el que está implicado en la unión hVEGF.The antigen can be hVEGF or hVEGFr. He antigen is optionally a fragment or part of any of the hVEFG or the hVEGFr that has one or more amino acid residues that They participate in the binding of hVEGF to one of its receptors. By example, immunization with the extracellular domain of an hVEGFr (i.e., a truncated hVEGFr polypeptide that lacks the transmembrane and intracellular domains) will be especially useful in the production of antibodies that are hVEGF antagonists, since it is the extracellular domain that is involved in the union hVEGF

Las células de hibridoma preparadas de este modo son cultivadas y dejadas crecer en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células parentales de mieloma no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales de mieloma carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas habitualmente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que impiden el crecimiento de células deficientes en HGPRT.Hybridoma cells prepared in this way are grown and allowed to grow in a suitable culture medium that preferably it contains one or more substances that inhibit the growth or survival of myeloma parental cells not merged For example, if myeloma parental cells they lack the enzyme hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase (HGPRT or HPRT), the culture medium for hybridomas It will usually include hypoxanthine, aminopterin and thymidine (medium HAT), substances that prevent the growth of deficient cells in HGPRT.

Las células preferidas de mieloma son aquellas que se fusionan de manera eficaz, que sostienen un nivel elevado estable de expresión de anticuerpo mediante las células productoras de anticuerpo seleccionadas y que son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre éstas, las estirpes celulares de mieloma preferidas son estirpes murinas, tales como las derivadas de los tumores murinos MOPC-21 y MPC-11, disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EE.UU., células SP-2, disponibles en la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland EE.UU. y células P3X63Ag8U.1 descritas por Yelton y otros, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81:1 (1978). También se han descrito estirpes celulares de mieloma humano y de heteromieloma humano-murino para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. Kozbor, J. Immunol. 133: 3.001 (1984). Brodeur y otros, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987).Preferred myeloma cells are those that merge effectively, that sustain a high level stable antibody expression by producing cells of antibodies selected and that are sensitive to a medium such as HAT medium. Among these, myeloma cell lines Preferred are murine strains, such as those derived from murine tumors MOPC-21 and MPC-11, available at the Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA, SP-2 cells, available in the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA and P3X63Ag8U.1 cells described by Yelton et al., Curr. Top. Microbiol Immunol 81: 1 (1978). Lineages have also been described human myeloma and heteromyeloma cells human-murine for antibody production human monoclonal. Kozbor, J. Immunol. 133: 3,001 (1984). Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, p. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).

El medio de cultivo en el que crecen las células de hibridoma se analiza para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un análisis de unión in vitro, tal como radioinmunoanálisis (RIA) o enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA). Los anticuerpos monoclonales de la invención son aquellos que preferiblemente inmunoprecipitan hVEGF o hVEGFr o aquellos que preferiblemente se unen a por lo menos uno de aquellos antígenos en el análisis de unión, y que son capaces de inhibir una actividad biológica del hVEGF.The culture medium in which the hybridoma cells grow is analyzed for the production of monoclonal antibodies directed against the antigen. Preferably, the binding specificity of monoclonal antibodies produced by hybridoma cells is determined by immunoprecipitation or by in vitro binding analysis, such as radioimmunoassay (RIA) or adsorption enzyme immunoassay (ELISA). The monoclonal antibodies of the invention are those that preferably immunoprecipitate hVEGF or hVEGFr or those that preferably bind to at least one of those antigens in the binding assay, and that are capable of inhibiting a biological activity of hVEGF.

Una vez identificadas las células de hibridoma que producen anticuerpos antagonistas de la especificidad, afinidad y actividad deseadas, pueden subclonarse los clones mediante procedimientos de dilución limitantes y cultivarse mediante procedimientos estándar. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, págs. 59-104 (Academic Press, 1986). Entre los medios de cultivo adecuados para este propósito se incluyen, por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco o medio RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como los tumores ascíticos en un animal.Once the hybridoma cells that produce antagonistic antibodies of the specificity, affinity and activity desired have been identified, the clones can be subcloned by limiting dilution procedures and cultured by standard procedures. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, p. 59-104 (Academic Press, 1986). Suitable culture media for this purpose include, for example, Eagle medium modified by Dulbecco or RPMI-1640 medium. In addition, hybridoma cells can be cultured in vivo like ascites tumors in an animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden aislarse o purificarse a partir del medio de cultivo, del líquido ascítico o del suero mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, columna de sefarosa-proteína A, cromatografía con hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.Monoclonal antibodies secreted by subclones can be isolated or purified from the medium of culture, ascites fluid or serum by procedures conventional immunoglobulin purification such as, by example, sepharose-protein A column, hydroxyapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, or affinity chromatography.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede aislarse y secuenciarse fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos). Las células de hibridoma de la invención sirven como fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión que a continuación son transfectados a células huésped tales como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma, que al contrario no producen proteína inmunoglobulínica, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes.DNA encoding monoclonal antibodies of the invention can be easily isolated and sequenced using conventional procedures (for example, using probes of oligonucleotides that are capable of specifically binding to genes encoding the heavy and light chains of antibodies murine). The hybridoma cells of the invention serve as preferred source of such DNA. Once isolated, the DNA can placed in expression vectors that are then transfected to host cells such as simian COS cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells or myeloma cells, which on the contrary they do not produce immunoglobulin protein, to obtain the synthesis of monoclonal antibodies in host cells recombinant

El ADN puede modificarse opcionalmente para cambiar el carácter de la inmunoglobulina producida por su expresión. Por ejemplo, las formas humanizadas de anticuerpos murinos son producidas mediante la sustitución de una región determinante de complementariedad (CDR) del dominio variable del anticuerpo murino por la región correspondiente de un anticuerpo humano. En algunas realizaciones, los restos de aminoácidos de la región de entramado (FR) seleccionada del anticuerpo murino son sustituidos por los restos de aminoácidos correspondientes en el anticuerpo humano. Carter y otros, Proc. Nat. Acad. Sci. 89: 4.285 (1992); Carter y otros, BioTechnology 10: 163 (1992). Las formas quiméricas de anticuerpos murinos también son producidas por sustitución de la secuencia codificante por dominios constantes de las cadenas ligera y pesada humanas seleccionadas en lugar de las secuencias murinas homólogas. Cabilly y otros, Patente de EE.UU. US 4.816.567; Morrison y otros, Proc. Nat. Acad. Sci. 81: 6851 (1984).The DNA can be optionally modified to change the character of the immunoglobulin produced by its expression. For example, humanized forms of antibodies murine are produced by replacing a region complementarity determinant (CDR) of the variable domain of the murine antibody by the corresponding region of an antibody human. In some embodiments, the amino acid residues of the selected framework region (FR) of the murine antibody are substituted by the corresponding amino acid residues in the human antibody Carter and others, Proc. Nat. Acad. Sci. 89: 4,285 (1992); Carter et al., BioTechnology 10: 163 (1992). The forms chimeric murine antibodies are also produced by substitution of the coding sequence by constant domains of the light and heavy human chains selected instead of the homologous murine sequences. Cabilly et al., US Pat. US 4,816,567; Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81: 6851 (1984).

Los anticuerpos incluidos dentro del alcance de la invención incluyen variantes de anticuerpos, tales como anticuerpos quiméricos (incluidos "humanizados") y anticuerpos híbridos que comprenden cadenas de inmunoglobulina que pueden unirse al hVEGF o al hVEGFr, y un epítopo no hVEGF.Antibodies included within the scope of the invention include antibody variants, such as chimeric antibodies (including "humanized") and antibodies hybrids comprising immunoglobulin chains that can bind to hVEGF or hVEGFr, and a non-hVEGF epitope.

Los anticuerpos de la presente invención incluyen todas las especies de origen, y clases de inmunoglobulina (por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM) y subclases, así como fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, Fab, F(ab')_{2} y Fv), en tanto que puedan unirse al hVEGF o hVEGFr y sean capaces de antagonizar una actividad biológica de hVEGF.The antibodies of the present invention include all species of origin, and immunoglobulin classes (for example, IgA, IgD, IgE, IgG and IgM) and subclasses, as well as antibody fragments (eg, Fab, F (ab ') 2 and Fv), as long as they can join the hVEGF or hVEGFr and are able to antagonize a biological activity of hVEGF.

En una realización preferida de la invención, el anticuerpo monoclonal tendrá afinidad por el antígeno inmunizante de por lo menos aproximadamente 10^{9} litros/mol, tal como se ha determinado, por ejemplo, mediante el análisis Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem. 107: 220 (1980). Asimismo, el anticuerpo monoclonal inhibirá habitualmente la actividad mitógena o angiogénica del hVEGF en aproximadamente un 50%, preferiblemente en más de un 80% y más preferiblemente en más de un 90%, tal como se ha determinado, por ejemplo, mediante un análisis de supervivencia o proliferación celular in vitro, tal como se describe en el Ejemplo 2.In a preferred embodiment of the invention, the monoclonal antibody will have affinity for the immunizing antigen of at least about 10 9 liters / mol, as determined, for example, by the Scatchard analysis of Munson and Pollard, Anal . Biochem 107: 220 (1980). Likewise, the monoclonal antibody will usually inhibit the mitogenic or angiogenic activity of hVEGF by approximately 50%, preferably more than 80% and more preferably more than 90%, as determined, for example, by an analysis of cell survival or proliferation in vitro , as described in Example 2.

Para algunas aplicaciones terapéuticas y diagnósticas, es deseable que el anticuerpo monoclonal reaccione con unas pocas de todas las formas moleculares distintas del hVEGF. Por ejemplo, puede ser deseable disponer de un anticuerpo monoclonal que pueda unirse específicamente a polipéptidos hVEGF de secuencia de 165 aminoácidos pero no a polipéptidos hVEGF de secuencia de 121 o 189 aminoácidos. Dichos anticuerpos se identifican fácilmente mediante análisis comparativos ELISA o mediante inmunoprecipitación comparativa de los distintos polipéptidos hVEGF.For some therapeutic applications and diagnostic, it is desirable for the monoclonal antibody to react with a few of all molecular forms other than hVEGF. For example, it may be desirable to have an antibody monoclonal that can specifically bind hVEGF polypeptides of sequence of 165 amino acids but not hVEGF polypeptides of 121 or 189 amino acid sequence. These antibodies are easily identify by comparative ELISA analysis or by comparative immunoprecipitation of the different hVEGF polypeptides.

Conjugados con partes citotóxicasConjugates with cytotoxic parts

En algunas realizaciones es deseable proporcionar una parte citotóxica conjugada con un anticuerpo monoclonal específico de hVEGF o con un hVEGFr. En estas realizaciones la citotoxina sirve para incapacitar o eliminar células que expresan hVEGF o se unen al mismo, o a su receptor. El conjugado es dirigido a la célula por el dominio que es capaz de unirse al hVEGF o al hVEGFr, De este modo, los anticuerpos monoclonales que son capaces de unirse al hVEGF o al hVEGFr están conjugados a citotoxinas. De un modo parecido, el hVEGFr está conjugado a una citotoxina. Mientras los anticuerpos monoclonales sean capaces de neutralizar de manera óptima sólo la actividad del hVEFG (sin la citotoxina), ya no es necesario en esta realización que el anticuerpo monoclonal o receptor sea capaz de unirse al hVEGF o al hVEGFr.In some embodiments it is desirable provide a cytotoxic part conjugated to an antibody monoclonal specific for hVEGF or with an hVEGFr. In these embodiments cytotoxin serves to incapacitate or eliminate cells that express hVEGF or bind to it, or its receptor. He conjugate is directed to the cell by the domain that is capable of bind to hVEGF or hVEGFr, thus the antibodies monoclonal that are able to bind to hVEGF or hVEGFr are conjugated to cytotoxins. Similarly, the hVEGFr is conjugated to a cytotoxin. While monoclonal antibodies are able to optimally neutralize only the activity of the hVEFG (without cytotoxin), is no longer necessary in this embodiment that the monoclonal antibody or receptor is capable of binding to the hVEGF or hVEGFr.

Habitualmente, la citotoxina es una citotoxina proteínica, por ejemplo, toxina de la difteria, toxina del ricino o toxina de Pseudomonas, aunque en el caso de algunas clases de inmunoglobulinas el propio dominio Fc del anticuerpo monoclonal puede servir para proporcionar la citotoxina (por ejemplo, en el caso de anticuerpos IgG2, que son capaces de fijar complemento y de participar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC)). No obstante, no es necesario que la citotoxina sea proteínica y puede incluir agentes quimioterapéuticos utilizados hasta ese momento, por ejemplo, en el tratamiento de tumores.Typically, cytotoxin is a protein cytotoxin, for example, diphtheria toxin, castor toxin or Pseudomonas toxin, although in the case of some classes of immunoglobulins the Fc domain of the monoclonal antibody itself can serve to provide cytotoxin (for example , in the case of IgG2 antibodies, which are capable of fixing complement and participating in antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC)). However, it is not necessary for cytotoxin to be proteinic and may include chemotherapeutic agents used up to that point, for example, in the treatment of tumors.

La citotoxina se relaciona habitualmente con un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo mediante un enlace amida en la cadena principal dentro del dominio Fc del anticuerpo (o situado en parte del mismo o en todo) Cuando la función direccional es proporcionada por el hVEGFr, la parte citotóxica es sustituida en cualquier dominio del receptor que no participe en la unión hVEGF; preferiblemente, la parte es sustituida en lugar de o en los dominios transmembrana y/o citoplasmático del receptor. El sitio óptimo de sustitución se determinará mediante experimentación sistemática y forma parte de las habilidades normales del experto en la materia.Cytotoxin is usually related to a monoclonal antibody or fragment thereof via a bond amide in the main chain within the Fc domain of the antibody (or located in part of it or in all) When the directional function is provided by hVEGFr, the cytotoxic part is replaced in any domain of the recipient that does not participate in the union hVEGF; preferably, the part is substituted instead of or in the transmembrane and / or cytoplasmic receptor domains. The place optimal replacement will be determined by experimentation systematic and part of the expert's normal skills in the matter.

Los conjugados que son fusiones de proteínas se crean fácilmente en cultivo celular recombinante mediante la expresión de un gen que codifica el conjugado. Alternativamente, los conjugados se crean entrecruzando covalentemente la parte citotóxica con una cadena secundaria de restos de aminoácidos o con un carboxilo del extremo terminal C del anticuerpo o del receptor, utilizando procedimientos conocidos per se tales como intercambio disulfuro o unión a través de un enlace tioéster utilizando por ejemplo iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimadato.Conjugates that are protein fusions are easily created in recombinant cell culture by expressing a gene encoding the conjugate. Alternatively, the conjugates are created by covalently cross-linking the cytotoxic part with a secondary chain of amino acid residues or with a carboxyl of the C-terminus of the antibody or receptor, using methods known per se such as disulfide exchange or binding through a thioester bond. using, for example, iminothiolate and methyl-4-mercaptobutyrimadate.

Conjugados con otras partesConjugated with other parties

Los anticuerpos monoclonales y el hVEGFr que son antagonistas del hVEGF están también conjugados a sustancias que quizás no se clasifican fácilmente como citotoxinas por sí mismas, pero que aumentan la actividad de las composiciones de la presente. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales o hVEGFr capaces de unirse al hVEGF o al hVEGFr están fusionados con polipéptidos heterólogos, tales como secuencias víricas, con receptores celulares, con citocinas tales como TFN, interferones o interleucinas, con polipéptidos que tienen actividad anticoagulante y con otros polipéptidos biológicamente o inmunológicamente activos. Dichas fusiones se crean fácilmente mediante procedimientos recombinantes. Habitualmente, tales polipéptidos no inmunoglobulínicos son sustituidos por el dominio o los dominios constantes de un anticuerpo anti-hVEGF o por el dominio transmembrana y/o intracelular de un hVEGFr. Alternativamente, son sustituidos por un dominio variable de un sitio de unión a antígenos de un anticuerpo anti-hVEGF descrito en la presente invención.The monoclonal antibodies and the hVEGFr that are hVEGF antagonists are also conjugated to substances that they may not be easily classified as cytotoxins by themselves, but that increase the activity of the compositions herein. For example, monoclonal or hVEGFr antibodies capable of binding  to hVEGF or hVEGFr they are fused with heterologous polypeptides, such as viral sequences, with cell receptors, with cytokines such as TFN, interferons or interleukins, with polypeptides that have anticoagulant activity and with others biologically or immunologically active polypeptides. These Fusions are easily created by recombinant procedures. Usually, such non-immunoglobulin polypeptides are replaced by the domain or constant domains of a anti-hVEGF antibody or transmembrane domain  and / or intracellular of an hVEGFr. Alternatively, they are substituted by a variable domain of an antigen binding site of a anti-hVEGF antibody described herein invention.

En realizaciones preferidas, tales polipéptidos no inmunoglobulínicos están unidos a los dominios constantes de un anticuerpo descrito en la presente invención, o son sustituidos por los mismos. Bennett y otros, J. Biol. Chem. 266: 23.060-23.067 (1991). Alternativamente, son sustituidos por el Fv de un anticuerpo de la presente invención para crear un anticuerpo polivalente quimérico que comprenda por lo menos un sitio presente de unión a antígenos que tenga especificidad por el hVEGF o el hVEGFr, y un sitio remplazado de unión a antígenos que tenga una función o especificidad distintas de las del anticuerpo de inicio.In preferred embodiments, such polypeptides non-immunoglobulins are bound to the constant domains of a antibody described in the present invention, or are replaced by the same. Bennett et al., J. Biol. Chem. 266: 23.060-23.067 (1991). Alternatively, they are substituted by the Fv of an antibody of the present invention to create a chimeric polyvalent antibody that comprises so least one present antigen binding site that has specificity for hVEGF or hVEGFr, and a replaced site of antigen binding that has a different function or specificity of those of the starting antibody.

Anticuerpos heteroespecíficosHeterospecific Antibodies

Los anticuerpos monoclonales capaces de unirse al hVEGF o al hVEGFr sólo es necesario que contengan un único sitio de unión para los epítopos enumerados, habitualmente un solo complejo cadena ligera/pesada o un fragmento del mismo. No obstante, tales anticuerpos también pueden llevar opcionalmente dominios de unión que son capaces de unirse a un epítopo que no se encuentra en el hVEGF ni en el hVEGFr. Por ejemplo, la sustitución de la correspondiente secuencia de aminoácidos o restos de aminoácidos de un anticuerpo nativo anti-hVEGF o anti-hVEGFr por la determinante de complementariedad, y si es necesario por restos de entramado, de un anticuerpo con especificidad por un antígeno distinto del hVEGF o el hVEGFr creará un anticuerpo poliespecífico que comprende un sitio de unión a antígenos que tiene especificidad por el hVEGF o el hVEGFr y otro sitio de unión a antígenos que tiene especificidad por el antígeno no hVEGF o hVEGFr. Estos anticuerpos son por lo menos bivalentes, pero pueden ser polivalentes, dependiendo del número de sitio de unión a antígenos que posea la clase de anticuerpos elegida. Por ejemplo, los anticuerpos de la clase IgM serán polivalentes.Monoclonal antibodies capable of binding the hVEGF or hVEGFr only needs to contain a single site binding for the epitopes listed, usually a single light / heavy chain complex or a fragment thereof. Do not However, such antibodies may also optionally carry binding domains that are capable of binding to an epitope that is not found in hVEGF or hVEGFr. For example, substitution of the corresponding amino acid sequence or residues of amino acids of a native anti-hVEGF antibody or anti-hVEGFr by the determinant of complementarity, and if necessary due to network remains, of a antibody with specificity for an antigen other than hVEGF or hVEGFr will create a polyspecific antibody comprising a antigen binding site that has specificity for hVEGF or the hVEGFr and another antigen binding site that has specificity for the non-hVEGF or hVEGFr antigen. These antibodies are so less bivalent, but may be versatile, depending on the antigen binding site number possessing the kind of chosen antibodies. For example, antibodies of the IgM class They will be versatile.

En realizaciones preferidas de la invención tales anticuerpos son capaces de unirse a un epítopo hVEGF o hVEGFr y a: (a) un polipéptido activo en coagulación sanguínea, tal como una proteína C o un factor tisular, (b) una proteína citotóxica tal como un factor de necrosis tumoral (TNF), o (c) un receptor de superficie celular no hVEGFr, tal como CD4, o un receptor HER-2 (Maddon y otros, Cell 42: 93 (1985); Coussens y otros, Science 230: 1.137 (1985)). Los anticuerpos multivalentes heteroespecíficos se crean de un modo conveniente cotransformando una célula huésped con ADN que codifica las cadenas pesada y ligera de ambos anticuerpos y recuperando a partir de entonces, mediante cromatografía de inmunoafinidad o similar, la proporción de anticuerpos expresados que tienen la propiedades de unión a antígenos deseadas. Alternativamente, tales anticuerpos se crean mediante recombinación in vitro de anticuerpos monoespecíficos.In preferred embodiments of the invention such antibodies are capable of binding to an hVEGF or hVEGFr epitope and: (a) a blood coagulation active polypeptide, such as a C protein or a tissue factor, (b) a cytotoxic protein such as a factor of tumor necrosis (TNF), or (c) a non-hVEGFr cell surface receptor, such as CD4, or an HER-2 receptor (Maddon et al., Cell 42: 93 (1985); Coussens et al., Science 230: 1,137 (1985)). Heterospecific multivalent antibodies are conveniently created by co-transforming a host cell with DNA encoding the heavy and light chains of both antibodies and thereafter recovering, by immunoaffinity chromatography or the like, the proportion of antibodies expressed that have the properties of binding to desired antigens. Alternatively, such antibodies are created by in vitro recombination of monospecific antibodies.

Anticuerpos monovalentesMonovalent antibodies

Los anticuerpos monovalentes que pueden unirse al hVEGFr son especialmente útiles como antagonistas del hVEGF. Sin limitar la invención a cualquier mecanismo particular de actividad biológica, se cree que la activación de receptores hVEGFr celulares procede mediante un mecanismo en el que la unión del hVEGF a receptores celulares hVEGF induce la agregación de los receptores y activa a su vez la actividad quinasa de los receptores intracelulares. Puesto que los anticuerpos monovalentes de receptores anti-hVEGF no pueden inducir tal agregación y por lo tanto no pueden activar el receptor hVEGF mediante aquel mecanismo, son antagonistas ideales del hVEGF.Monovalent antibodies that can bind hVEGFr are especially useful as hVEGF antagonists. Without limit the invention to any particular mechanism of activity biological, it is believed that the activation of cellular hVEGFr receptors proceeds through a mechanism in which the hVEGF binding to hVEGF cell receptors induces aggregation of receptors and activates the kinase activity of the receptors intracellular Since the monovalent antibodies of anti-hVEGF receptors cannot induce such aggregation and therefore cannot activate the hVEGF receiver by that mechanism, they are ideal antagonists of hVEGF.

No obstante, debería indicarse que estos anticuerpos deberían dirigirse contra el sitio de unión a hVEGF del receptor o que por el contrario deberían ser capaces de interferir con la unión hVEGF al receptor hVEGF, tal como dificultando estéricamente el acceso del hVEGF al receptor. No obstante, tal como se ha descrito en alguna otra parte de la presente invención, los anticuerpos anti-hVEGFr que no son capaces de interferir en la unión a hVEGF son útiles cuando se conjugan con partes no inmunoglobulínicas, por ejemplo, citotoxinas.However, it should be noted that these antibodies should be directed against the hVEGF binding site of the receiver or that on the contrary should be able to interfere with hVEGF binding to the hVEGF receptor, such as hindering sterically hVEGF access to the receiver. However, such as has been described elsewhere in the present invention, the anti-hVEGFr antibodies that are not capable of interfere with hVEGF binding are useful when conjugated with non-immunoglobulin parts, for example, cytotoxins.

Los procedimientos para preparar anticuerpos monovalentes son bien conocidos en el estado de la técnica. Por ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de la cadena ligera y la cadena pesada modificada de la inmunoglobulina. La cadena pesada se halla truncada generalmente en cualquier punto en la región Fc de modo que se impide el entrecruzamiento de las cadenas pesadas. Alternativamente, los restos relevantes de cisteína son sustituidos por otro resto de aminoácido o son eliminados para evitar el entrecruzamiento. Los procedimientos in vitro son también adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. Por ejemplo, los fragmentos Fab se preparan mediante escisión enzimática de un anticuerpo intacto.The procedures for preparing monovalent antibodies are well known in the state of the art. For example, one method involves recombinant expression of the light chain and the modified heavy chain of the immunoglobulin. The heavy chain is generally truncated at any point in the Fc region so that the cross-linking of the heavy chains is prevented. Alternatively, the relevant cysteine residues are replaced by another amino acid residue or are eliminated to avoid cross-linking. In vitro procedures are also suitable for preparing monovalent antibodies. For example, Fab fragments are prepared by enzymatic cleavage of an intact antibody.

Usos diagnósticosDiagnostic uses

Para las aplicaciones diagnósticas, los anticuerpos o hVEGFr de la invención habitualmente pueden marcarse con una parte detectable. La parte detectable puede ser cualquiera que sea capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la parte detectable puede ser un radioisótopo, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{36}S, o ^{125}I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como fluoresceína isotiocianato, rodamina o luciferina; marcadores isotópicos radiactivos, tales como por ejemplo, ^{126}I, ^{32}P, ^{14}C o ^{3}H o una enzima, tal como fosfatasa alcalina, betagalactosidasa o peroxidasa de rábano picante.For diagnostic applications, the antibodies or hVEGFr of the invention can usually be labeled With a detectable part. The detectable part can be any that is capable of producing, directly or indirectly, a signal detectable For example, the detectable part may be a radioisotope, such as 3 H, 14 C, 32 P, 36 S, or 125 I, a fluorescent or chemiluminescent compound, such as fluorescein isothiocyanate, rhodamine or luciferin; markers radioactive isotopics, such as, for example, 126 I, 32 P, 14 C or 3 H or an enzyme, such as alkaline phosphatase, betagalactosidase or horseradish peroxidase.

Puede utilizarse cualquier procedimiento conocido en el estado de la técnica para conjugar el anticuerpo o hVEGFr con la parte detectable, incluidos los procedimientos descritos por Hunter y otros, Nature, 144: 945 (1962); David y otros, Biochemistry, 13: 1.014 (1974); Pain y otros, J. Immunol. Meth. 40: 219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30: 407 (1982).Any procedure can be used. known in the state of the art to conjugate the antibody or hVEGFr with the detectable part, including procedures described by Hunter et al., Nature, 144: 945 (1962); David and others, Biochemistry, 13: 1,014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40: 219 (1981); and Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30: 407 (1982).

Los anticuerpos y receptores de la presente invención pueden utilizarse en cualquier procedimiento de análisis conocido, tal como análisis de unión competitiva, análisis de intercalado, directos e indirectos, y análisis de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, págs. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987).The antibodies and receptors of the present invention can be used in any analysis procedure known, such as competitive union analysis, analysis of interspersed, direct and indirect, and analysis of immunoprecipitation Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, p. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987).

Los análisis de unión competitiva se basan en la capacidad de un estándar marcado (que puede ser hVEGF o una parte inmunológicamente reactiva del mismo) para competir con el analito de la muestra de prueba (hVEGF) a la hora de unirse con una cantidad limitada de anticuerpo. La cantidad de hVEGF en la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de estándar que se une a los anticuerpos o receptores. Para facilitar la determinación de la cantidad de estándar que se une, los anticuerpos o receptores generalmente se insolubilizan antes o después de la competición, de modo que el estándar y el analito que están unidos a los anticuerpos o receptores pueden separarse de un modo conveniente del standard y el analito que permanecen sin unir.Competitive union analyzes are based on the capacity of a marked standard (which can be hVEGF or a part immunologically reactive thereof) to compete with the analyte of the test sample (hVEGF) when joining with a limited amount of antibody. The amount of hVEGF in the sample test is inversely proportional to the amount of standard which binds to antibodies or receptors. To facilitate the determination of the amount of standard that binds, the antibodies or receptors are generally insolubilized before or after the competition, so that the standard and analyte that are attached to antibodies or receptors can be separated in a way convenient standard and analyte that remain unbound.

Los análisis de intercalado implican el uso de dos anticuerpos o receptores, cada uno de ellos capaz de unirse a distinta parte inmunógena, o epítopo, de la proteína que tiene que detectarse. En un análisis de intercalado, el analito de la muestra de prueba se une con un primer anticuerpo o receptor que es inmovilizado en un soporte sólido y a partir de entonces un segundo anticuerpo se une al analito, formando de este modo un complejo insoluble de tres partes. David y Greene, patente de EE.UU. US 4.376.110. El segundo anticuerpo o receptor puede marcarse con una parte detectable (análisis de intercalado directo) o puede medirse utilizando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que está marcado con una parte detectable (análisis de intercalado indirecto). Por ejemplo, un tipo de análisis de intercalado es un análisis ELISA, en cuyo caso la parte detectable es una enzima.Collation analyzes involve the use of two antibodies or receptors, each capable of binding to different immunogenic part, or epitope, of the protein that has to be detected In an interleaving analysis, the sample analyte test binds to a first antibody or receptor that is immobilized on a solid support and thereafter a second antibody binds to the analyte, thereby forming a complex Insoluble three parts. David and Greene, U.S. Pat. US 4,376,110. The second antibody or receptor can be labeled with a detectable part (direct interleaving analysis) or can be measured using an anti-immunoglobulin antibody that is marked with a detectable part (interleaving analysis indirect). For example, one type of interleaving analysis is a ELISA analysis, in which case the detectable part is an enzyme.

Los anticuerpos o receptor de la presente invención también son útiles para una técnica de diagnóstico por la imagen in vivo, en la que se administra un anticuerpo o hVEGFr marcado con una parte detectable a un paciente, preferiblemente en el torrente circulatorio, y se analiza la presencia y localización del anticuerpo o receptor marcado en el paciente. Esta técnica de diagnóstico por la imagen es útil, por ejemplo, en la estadificación y tratamiento de neoplasmas. El anticuerpo o hVEGFr se marca con una parte que es detectable en un mamífero, bien mediante resonancia magnética nuclear, radiología u otro medio de detección conocido en el estado de la técnica.The antibodies or receptor of the present invention are also useful for an in vivo imaging technique, in which an antibody or hVEGFr labeled with a detectable part is administered to a patient, preferably in the bloodstream, and the presence and location of the labeled antibody or receptor in the patient. This imaging technique is useful, for example, in staging and treating neoplasms. The antibody or hVEGFr is labeled with a part that is detectable in a mammal, either by nuclear magnetic resonance, radiology or other means of detection known in the state of the art.

Variantes de antagonistas del hVEGFHVEGF antagonist variants

Además de los anticuerpos descritos en la presente invención, entre otros antagonistas útiles del hVEGF se incluyen fragmentos y variantes de secuencias de aminoácidos del hVEGF nativo que se unen al receptor hVEGF pero que no muestran la actividad biológica del hVEGF nativo. Por ejemplo, entre tales antagonistas se incluyen fragmentos y variantes de secuencias de aminoácidos que comprenden un dominio de unión a receptor, pero que carecen de un dominio que confiera actividad biológica o que de lo contrario no puedan activar receptores hVEGF celulares, tales como en el caso de un fragmento o una variante de secuencia de aminoácidos que no tiene capacidad para inducir agregación o activación de receptores celulares hVEGF. La expresión "dominio de unión a receptores" se refiere a secuencias de aminoácidos en hVEGF que están implicadas en la unión a receptores hVEGF. La expresión "dominio de actividad biológica" o "dominio que confiere actividad biológica" se refiere a una secuencia de aminoácidos en hVEGF que confiere una actividad biológica particular del factor, tal como actividad mitógena o angiogénica.In addition to the antibodies described in the present invention, among other useful hVEGF antagonists are include fragments and variants of amino acid sequences of the native hVEGF that bind to the hVEGF receptor but do not show the biological activity of native hVEGF. For example, among such antagonists include fragments and sequence variants of amino acids that comprise a receptor binding domain, but that they lack a domain that confers biological activity or that otherwise they cannot activate cellular hVEGF receptors, such as in the case of a fragment or a sequence variant of amino acids that has no ability to induce aggregation or hVEGF cell receptor activation. The expression "domain of receptor binding "refers to amino acid sequences in hVEGF that are involved in binding to hVEGF receptors. The expression "domain of biological activity" or "domain that confers biological activity "refers to a sequence of amino acids in hVEGF that confers a particular biological activity of the factor, such as mitogenic or angiogenic activity.

La observación según la cual hVEGF es al parecer capaz de formar un complejo con dos o más moléculas hVEGFr en la superficie de una célula sugiere que hVEGF tiene por lo menos dos sitios concretos de unión al hVEGFr y que se une a tales receptores celulares de manera secuencial, primero en un sitio y a continuación en el otro antes de que tenga lugar la activación, a la manera de la hormona de crecimiento, la prolactina y similares (véase por ejemplo, Cunningham y otros, Science 254: 821 (1991); de Vos y otros, Science 255: 306 (1992); Fuh y otros, Science 256: 1.677 (1992)). Por consiguiente, las variantes de antagonistas del hVEGF se seleccionan de modo que un sitio de unión a receptores del hVEGF (habitualmente el sitio implicado en la unión inicial del hVEGF a hVEGFr) permanece sin modificar (o si está modificado varía para estimular la unión), mientras que un segundo sitio de unión a receptores del hVEGF habitualmente se halla modificado por sustitución de restos de aminoácidos no conservativos o deleción para volver inoperativo este sitio de unión.The observation according to which hVEGF is apparently capable of forming a complex with two or more hVEGFr molecules in the surface of a cell suggests that hVEGF has at least two specific hVEGFr binding sites and that binds to such receptors phones sequentially, first on a site and then  in the other before activation takes place, in the manner of growth hormone, prolactin and the like (see for example, Cunningham et al., Science 254: 821 (1991); of you and others, Science 255: 306 (1992); Fuh et al., Science 256: 1,677 (1992)). Therefore, hVEGF antagonist variants are selected so that an hVEGF receptor binding site (usually the site involved in the initial hVEGF binding to hVEGFr) remains unchanged (or if modified varies for stimulate binding), while a second binding site to hVEGF receptors are usually modified by substitution of non-conservative amino acid residues or deletion to make this binding site inoperative.

Los dominios de unión a receptores en hVEGF y hVEGF se determinan mediante procedimientos conocidos en el estado de la técnica, entre los cuales estudios de rayos X, análisis mutacionales y estudios de unión a anticuerpos. Entre las estrategias mutacionales se incluyen las técnicas de mutagénesis por saturación aleatoria acopladas con la selección de mutantes de escape y mutagénesis insercional. Otra estrategia adecuada para identificar dominios de unión a receptores en ligandos se conoce como mutagénesis por rastreo de alanina (Ala) (alanine (Ala)-scanning mutagenesis). Cunningham y otros, Science 244, 1.081-1.985 (1989). Este procedimiento implica la identificación de regiones que contienen cadenas secundarias de aminoácidos cargadas. Los restos cargados en cada región identificada (es decir, Arg, Asp, His, Lys y Glu) son sustituidos (una región por molécula mutante) con Ala y se comprueba la unión a receptores de los ligandos obtenidos para evaluar la importancia de la región particular en la unión a receptores. Otro procedimiento convincente para la localización de los dominios de unión a receptores es mediante el uso de anticuerpos anti-hVEGF neutralizantes. Kim y otros, Growth Factors 7: 53 (1992). Normalmente se utiliza una combinación de estos procedimientos y similares para localizar los dominios implicados en la unión a receptores.The receptor binding domains in hVEGF and hVEGF are determined by methods known in the state of the art, among which X-ray studies, mutational analyzes and antibody binding studies. Mutational strategies include random saturation mutagenesis techniques coupled with the selection of escape mutants and insertional mutagenesis. Another suitable strategy to identify receptor binding domains in ligands is known as alanine (Ala) (alanine (Ala) -canning mutagenesis) screening mutagenesis . Cunningham et al., Science 244, 1,081-1,985 (1989). This procedure involves the identification of regions containing secondary chains of charged amino acids. The residues loaded in each identified region (i.e., Arg, Asp, His, Lys and Glu) are substituted (one region per mutant molecule) with Ala and receptor binding of the ligands obtained is checked to assess the importance of the region particular in receptor binding. Another convincing procedure for locating receptor binding domains is through the use of neutralizing anti-hVEGF antibodies. Kim et al., Growth Factors 7: 53 (1992). Normally a combination of these procedures and the like is used to locate the domains involved in receptor binding.

La expresión "variante de secuencia de aminoácidos" utilizada en referencia al hVEGF se refiere a polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que hasta cierto punto difieren de las secuencias de aminoácidos de las formas nativas del hVEGF. Normalmente, las variantes de secuencias de aminoácidos antagonistas tendrán por lo menos aproximadamente un 70% de homología con por lo menos un dominio de unión a receptores del hVEGF nativo y preferiblemente por lo menos aproximadamente un 80%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 90% de homología con un dominio de unión a receptores del hVEGF nativo. Las variantes de secuencias de aminoácidos tienen sustituciones, deleciones y/o inserciones en determinadas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos del hVEGF nativo, de tal modo que las variantes conservan la capacidad de unirse al receptor hVEGF (y de este modo compiten con el hVEGF nativo por la unión al receptor hVEGF) pero no pueden inducir uno o más efectos biológicos del hVEGF, tales como proliferación de células endoteliales, angiogénesis o permeabilidad vascular.The expression "sequence variant of amino acids "used in reference to hVEGF refers to polypeptides that have amino acid sequences that up to certain point differ from the amino acid sequences of the forms hVEGF native. Normally, the sequence variants of antagonist amino acids will have at least about a 70% homology with at least one receptor binding domain of the native hVEGF and preferably at least about one 80%, more preferably at least about 90% of homology with a receptor binding domain of the native hVEGF. The amino acid sequence variants have substitutions, deletions and / or insertions in certain positions within the amino acid sequence of the native hVEGF, such that the variants retain the ability to bind to the hVEGF receptor (and of this mode compete with the native hVEGF for receptor binding hVEGF) but cannot induce one or more biological effects of hVEGF, such as endothelial cell proliferation, angiogenesis or vascular permeability.

"Homología" se define como el porcentaje de restos en la secuencia de aminoácidos que son idénticos a los restos en la secuencia de aminoácidos de un dominio de unión a receptores de un hVEGF nativo después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para adquirir el porcentaje máximo de homología. Los procedimientos y los programas informáticos para la alineación son bien conocidos en el estado de la técnica. Un programa informático de este tipo es "Align 2", de Genentech, Inc., que se llenó con documentación de usuario en la oficina de derechos de autor de Estados Unidos, Washington, DC 20559, el 10 de diciembre de 1991. Las variantes de sustitución son aquellas que tienen por lo menos un resto de aminoácidos en una secuencia nativa eliminada y un aminoácido distinto insertado en su lugar en la misma posición. Las sustituciones pueden ser únicas, cuando sólo se ha sustituido un aminoácido en la molécula, o pueden ser múltiples, cuando se han sustituido dos o más aminoácidos en la misma molécula."Homology" is defined as the percentage of amino acid sequence residues that are identical to those residues in the amino acid sequence of a binding domain to receptors of a native hVEGF after aligning the e sequences enter spaces, if necessary, to acquire the percentage maximum homology The procedures and programs computer alignments are well known in the state of The technique. A computer program of this type is "Align 2", of Genentech, Inc., which was filled with user documentation in the United States Copyright Office, Washington, DC 20559, on December 10, 1991. The replacement variants are those that have at least one amino acid residue in a native sequence removed and a different amino acid inserted into its Place in the same position. Substitutions may be unique, when only one amino acid has been substituted in the molecule, or they can be multiple, when two or more amino acids have been substituted in the same molecule.

Las variantes de inserción son aquellas con uno o más aminoácidos insertados inmediatamente adyacentes a un aminoácido en una posición particular en una secuencia nativa. Inmediatamente adyacente a un aminoácido significa conectado bien al grupo funcional carboxilo \alpha o bien al amino \alpha del aminoácido.The insertion variants are those with one or more amino acids inserted immediately adjacent to a amino acid in a particular position in a native sequence. Immediately adjacent to an amino acid means connected well to the carboxyl α functional group or to the amino α of the amino acid

Las variantes de deleción son aquellas con uno o más restos de aminoácidos eliminados en una secuencia nativa. Normalmente, las variantes de deleción tendrán uno o dos restos de aminoácidos eliminados en una región particular de la molécula.Deletion variants are those with one or more amino acid residues removed in a native sequence. Normally, deletion variants will have one or two residues of amino acids removed in a particular region of the molecule.

Los fragmentos y variantes de secuencias de aminoácidos del hVEGF se preparan fácilmente mediante procedimientos conocidos en el estado de la técnica, tales como mediante mutagénesis dirigida del ADN que codifica el factor nativo. El ADN mutado se inserta en un vector de expresión apropiado y a continuación se transfectan las células huésped con el vector recombinante. Las células huésped recombinantes se cultivan en un medio de cultivo adecuado y a continuación se recupera del cultivo de células recombinantes el fragmento deseado o la variante de la secuencia de aminoácidos expresada en las células huésped mediante procedimientos de purificación cromatográficos o dis-
tintos.Fragments and variants of hVEGF amino acid sequences are readily prepared by methods known in the state of the art, such as by directed mutagenesis of the DNA encoding the native factor. The mutated DNA is inserted into an appropriate expression vector and then the host cells are transfected with the recombinant vector. Recombinant host cells are cultured in a suitable culture medium and then the desired fragment or variant of the amino acid sequence expressed in the host cells is recovered from recombinant cell culture by chromatographic or different purification procedures.
reds

Alternativamente, se preparan fragmentos y variantes de aminoácidos del hVEGF in vitro, por ejemplo mediante proteólisis del hVEGF nativo, o mediante síntesis utilizando procedimientos estándar de síntesis de péptidos de fase sólida tal como se describe en Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 85: 2.149 (1963]), aunque pueden utilizarse otras síntesis químicas equivalentes conocidas en el estado de la técnica. La síntesis de fase sólida se inicia a partir del extremo terminal C de aquel péptido mediante acoplamiento de un aminoácido \alpha protegido a una resina adecuada. Los aminoácidos se acoplan a la cadena peptídica utilizando técnicas bien conocidas en el estado de la técnica para la formación de enlaces peptídicos.Alternatively, fragments and amino acid variants of hVEGF are prepared in vitro , for example by proteolysis of native hVEGF, or by synthesis using standard solid phase peptide synthesis procedures as described in Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 85: 2,149 (1963]), although other equivalent chemical syntheses known in the state of the art can be used Solid phase synthesis is initiated from the C-terminus of that peptide by coupling a protected amino acid α to a resin Amino acids are coupled to the peptide chain using techniques well known in the state of the art for the formation of peptide bonds.

Usos terapéuticosTherapeutic uses

Para aplicaciones terapéuticas, se administran los antagonistas de la invención a un mamífero, preferiblemente a un humano, en una forma farmacéutica farmacéuticamente aceptable, que incluye aquellas que pueden administrarse a un humano por vía intravenosa como bolo o mediante infusión continua a lo largo de un período de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebrospinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación. Los antagonistas también se administran adecuadamente por vías intralesiva o perilesiva para ejercer efectos terapéuticos locales así como sistémicos.For therapeutic applications, they are administered antagonists of the invention to a mammal, preferably to a human, in a pharmaceutically acceptable pharmaceutical form, which includes those that can be administered to a human via intravenously as a bolus or by continuous infusion along a period of time, intramuscularly, intraperitoneally, intracerebral, subcutaneous, intraarticular, intrasynovial, intrathecal, oral, topical or by inhalation. Antagonists too are properly administered intralesively or perilesively to exert local as well as systemic therapeutic effects.

Dichas formas farmacéuticas incluyen portadores farmacéuticamente aceptables que son inherentemente no tóxicos y no terapéuticos. Entre los ejemplos de tales portadores se incluyen intercambiadores iónicos, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tales como albúmina sérica humana, sustancias tampón tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas glicéridas parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrólitos tales como sulfato de protamina, fosfato de hidrógeno disódico, fosfato de hidrógeno de potasio, cloruro de sodio, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, pirrolidona de polivinilo, sustancias a base de celulosa y polietilenglicol. Entre los portadores para formas tópicas de antagonistas a base de gel se incluyen polisacáridos tales como carboximetilcelulosa sódica o metilcelulosa, polivinilpirrolidona, poliacrilatos, polímeros bloque de polioxietileno-polioxipropileno y alcoholes de cera de madera. En todas las administraciones, son adecuadas formas convencionales de administración prolongada. Entre tales formas se incluyen, por ejemplo, microcápsulas, nanocápsulas, liposomas, parches, formas de inhalación, atomizadores nasales, comprimidos sublinguales y preparados de liberación prolongada. El antagonista se formulará habitualmente en tales vehículos a una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a 100 mg/ml.Such pharmaceutical forms include carriers pharmaceutically acceptable that are inherently non-toxic and not therapeutic Examples of such carriers include ion exchangers, alumina, aluminum stearate, lecithin, serum proteins, such as human serum albumin, substances buffer such as phosphates, glycine, sorbic acid, sorbate potassium, partial glyceride mixtures of vegetable fatty acids saturated, water, salts or electrolytes such as sulfate protamine, disodium hydrogen phosphate, hydrogen phosphate potassium, sodium chloride, zinc salts, colloidal silica, magnesium trisilicate, polyvinyl pyrrolidone, substances a cellulose and polyethylene glycol base. Among the carriers for Topical forms of gel-based antagonists are included polysaccharides such as sodium carboxymethyl cellulose or methylcellulose, polyvinylpyrrolidone, polyacrylates, block polymers of polyoxyethylene-polyoxypropylene and alcohols of wooden wax In all administrations, forms are appropriate Conventional prolonged administration. Among such forms are include, for example, microcapsules, nanocapsules, liposomes, patches, inhalation forms, nasal sprays, tablets Sublingual and prolonged release preparations. The antagonist it will usually be formulated in such vehicles at a concentration of approximately 0.1 mg / ml to 100 mg / ml.

Entre los ejemplos adecuados de preparados de liberación prolongada se incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el antagonista las cuales se hallan en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación prolongada se incluyen hidrogeles de poliésteres (por ejemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato) tal como se describe en Langer y otros, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167 (1981) y Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982), o poli(vinilalcohol), poliláctidos (Patente de EE.UU. US 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman y otros, Biopolymers, 22: 547 (1983), etileno-vinil acetato no degradable (Langer y otros, supra), copolímeros degradables de ácido láctico y ácido glicólico tales como el Lupron Depot^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido) y poli-D-(-)-3-ácido hidroxibutírico. Aunque polímeros tales como el etileno-vinil acetato y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, algunos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando los antagonistas de polipéptidos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un período largo de tiempo pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37ºC, lo que es causa de una pérdida de la actividad biológica y de posibles cambios en la inmunogenicidad. Pueden concebirse estrategias razonables para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces SS intermoleculares a través de intercambio tio-disulfuro, puede conseguirse la estabilización modificando restos sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, utilizando aditivos apropiados y elaborando composiciones de matrices de polímeros específicos.Suitable examples of extended-release preparations include semipermeable matrices of solid hydrophobic polymers containing the antagonist which are in the form of shaped articles, for example, films or microcapsules. Examples of extended-release matrices include polyester hydrogels (eg, poly (2-hydroxyethyl methacrylate) as described in Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 167 (1981) and Langer, Chem Tech., 12: 98-105 (1982), or poly (vinyl alcohol), polylactides (US Patent 3,773,919), copolymers of L-glutamic acid and gamma ethyl-L-glutamate (Sidman et al. , Biopolymers, 22: 547 (1983), ethylene-vinyl non-degradable acetate (Langer et al., Supra ), degradable copolymers of lactic acid and glycolic acid such as Lupron Depot ™ (injectable microspheres composed of lactic acid copolymer- glycolic acid and leuprólido acetate) and poly-D - (-) - 3-hydroxybutyric acid Although polymers such as ethylene vinyl acetate and lactic acid glycolic acid allow the release of molecules for more than 100 days, some hydrogels release proteins for shorter periods of time. When anta Encapsulated polypeptide gonists remain in the body for a long period of time can be denatured or added as a result of exposure to moisture at 37 ° C, which is the cause of a loss of biological activity and possible changes in immunogenicity. Reasonable strategies for stabilization can be devised depending on the mechanism involved. For example, if it is discovered that the aggregation mechanism is the formation of intermolecular SS bonds through thio-disulfide exchange, stabilization can be achieved by modifying sulfhydryl moieties, lyophilizing from acid solutions, controlling moisture content, using appropriate additives and developing specific polymer matrix compositions.

La liberación prolongada de composiciones antagonistas de hVEGF también incluye anticuerpos antagonistas y hVEGFr secuestrados por liposomas. Los liposomas que contienen los antagonistas se preparan mediante procedimientos conocidos en el estado de la técnica, tales como los que se describen en Epstein y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3.688 (1985); Hwang y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4.030 (1980); patente de EE.UU. US 4.485.045; patente de EE.UU. US 4.544.545. Normalmente los liposomas son de tipo unilamelar pequeño (aproximadamente 200-800 angstroms) en los cuales el contenido lípido es mayor que aproximadamente el 30% del colesterol molecular, ajustándose la proporción seleccionada al tratamiento HRG óptimo Los liposomas con aumento del tiempo de circulación se describen en la patente de EE.UU. US 5.013.556.The prolonged release of compositions hVEGF antagonists also includes antagonist antibodies and hVEGFr kidnapped by liposomes. The liposomes that contain the antagonists are prepared by methods known in the prior art, such as those described in Epstein and others, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 82: 3,688 (1985); Hwang and others, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4,030 (1980); U.S. Patent US 4,485,045; U.S. Patent US 4,544,545. Normally liposomes they are small unilamellar type (approximately 200-800 angstroms) in which the lipid content is greater than about 30% of molecular cholesterol, adjusting the selected proportion to the optimal HRG treatment The Liposomes with increased circulation time are described in the U.S. Patent US 5,013,556.

Otro uso de la presente invención comprende incorporar un antagonista del hVEGF en artículos formados. Dichos artículos pueden utilizarse para modular el crecimiento de las células endoteliales y la angiogénesis. Además, la invasión de tumores y la metástasis pueden modularse con estos artículos.Another use of the present invention comprises incorporate an hVEGF antagonist in formed articles. Sayings items can be used to modulate the growth of endothelial cells and angiogenesis. In addition, the invasion of Tumors and metastasis can be modulated with these articles.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la posología adecuada de antagonista dependerá del tipo de enfermedad que deba tratarse, tal como se ha definido anteriormente, la gravedad y el curso de la enfermedad, si los anticuerpos se administran con propósitos preventivos o terapéuticos, del tratamiento anterior, de los antecedentes clínicos del paciente y de la respuesta al antagonista, y del criterio del médico que lleva el caso. El antagonista se administra de manera adecuada al paciente de una sola vez o a lo largo de series de tratamientos.For the prevention or treatment of disease, the appropriate dosage of antagonist will depend on the type of disease to be treated, as defined previously, the severity and course of the disease, if the antibodies are administered for preventive purposes or therapeutic, previous treatment, background clinical and patient response to the antagonist, and criterion of the doctor who takes the case. The antagonist is administered adequately to the patient at one time or along series of treatments.

Los antagonistas del hVEGF son útiles en el tratamiento de varias enfermedades y trastornos no neoplásicos.HVEGF antagonists are useful in the treatment of various diseases and non-neoplastic disorders.

Las enfermedades no neoplásicas que pueden tratarse son artritis reumatoide, soriasis, aterosclerosis, retinopatía diabética y otras, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, hiperplasias tiroideas (entre las cuales enfermedad de Grave), trasplante de córnea y de otros tejidos, inflamación crónica, inflamación pulmonar, síndrome nefrótico, preeclampsia, ascitis, efusión pericárdica (tal como la asociada con pericarditis) y efusión pleural.Non-neoplastic diseases that can treated are rheumatoid arthritis, psoriasis, atherosclerosis, diabetic and other retinopathy, retrolental fibroplasia, glaucoma neovascular, thyroid hyperplasias (among which disease of Severe), corneal and other tissue transplantation, inflammation chronic, pulmonary inflammation, nephrotic syndrome, preeclampsia, ascites, pericardial effusion (such as that associated with pericarditis)  and pleural effusion.

Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, aproximadamente de 1 \mug/kg a 15 mg/kg de antagonista es una posible posología inicial para administrar al paciente, bien, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Una posología diaria habitual oscilaría entre aproximadamente 1 \mug/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En el caso de administraciones repetidas a lo largo de varios días o más, dependiendo de la enfermedad, se repite el tratamiento hasta que tiene lugar la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. No obstante, pueden ser útiles otras pautas. El progreso de este tratamiento se controla fácilmente mediante técnicas y análisis convencionales.Depending on the type and severity of the disease, approximately 1 µg / kg to 15 mg / kg antagonist  it is a possible initial dosage to administer to the patient, either, for example, by one or more separate administrations, or by continuous infusion. A usual daily dosage would oscillate between about 1 µg / kg to 100 mg / kg or more, depending on The factors mentioned above. In the case of repeated administrations over several days or more, depending on the disease, the treatment is repeated until the desired suppression of the symptoms of the disease takes place. However, other guidelines may be useful. The progress of this treatment is easily controlled by techniques and analysis conventional.

Según otra realización de la invención, la eficacia del antagonista para prevenir o tratar la enfermedad puede mejorarse administrando el antagonista serialmente o en combinación con otro agente que sea eficaz para estos propósitos, tales como el factor de necrosis tumoral (TNF), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar la actividad angiogénica del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) ácidos o básicos o el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar las actividades coagulantes del factor tisular, la proteína C, o la proteína S (véase Esmon y otros, publicación de patente PCT n.º WO 91/01753, publicada el 21 de febrero de 1991), o uno o más agentes terapéuticos convencionales tales como, por ejemplo, agentes alquilantes, antagonistas del ácido fólico, anti-metabolitos del metabolismo del ácido nucleico, antibióticos, análogos de la pirimidina, 5-fluorouracilo, nucleósidos de purina, aminas, aminoácidos, nucleósidos de triazol, o corticosteroides. Estos agentes pueden estar presentes en la composición administrada o pueden administrarse por separado. Asimismo, el antagonista se administra de manera adecuada serialmente o en combinación con tratamientos radiológicos, bien implicando la irradiación o la administración de sustancias radioactivas.According to another embodiment of the invention, the effectiveness of the antagonist to prevent or treat the disease can be improved by administering the antagonist serially or in combination with another agent that is effective for these purposes, such as the tumor necrosis factor (TNF), an antibody capable of inhibiting or neutralize the angiogenic activity of the growth factor of acidic or basic fibroblasts (FGF) or the growth factor of hepatocytes (HGF), an antibody capable of inhibiting or neutralizing coagulant activities of tissue factor, protein C, or S protein (see Esmon et al., PCT Patent Publication No. WO 91/01753, published February 21, 1991), or one or more agents conventional therapeutics such as, for example, agents alkylating agents, folic acid antagonists, anti-metabolites of nucleic acid metabolism,  antibiotics, pyrimidine analogues, 5-fluorouracil, purine nucleosides, amines, amino acids, triazole nucleosides, or corticosteroids. These agents may be present in the administered composition or They can be administered separately. Also, the antagonist will properly manage serially or in combination with radiological treatments, either involving irradiation or administration of radioactive substances.

El tratamiento con antagonistas del hVEGF puede suspenderse de manera óptima durante períodos de curación de heridas o de neovascularización deseable.Treatment with hVEGF antagonists may be suspended optimally during healing periods of wounds or desirable neovascularization.

Los siguientes ejemplos se ofrecen únicamente con propósitos ilustrativos, y de ningún modo pretenden limitar el alcance de la invención.The following examples are offered only for illustrative purposes, and in no way intend to limit the scope of the invention.

       \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
    

Ejemplo 1Example one

Preparación de anticuerpos monoclonales anti-hVEGFPreparation of monoclonal antibodies anti-hVEGF

Para obtener hVEGF conjugado con hemocianina de lapa (KLH) para inmunización, se mezcló hVEGF recombinante (165 aminoácidos), Leung y otros, Science 246: 1.306 (1989), con KLH a una proporción 4:1 en presencia de glutaraldehído al 0,05% y se incubó la mezcla a temperatura ambiente durante 3 horas removiendo suavemente. A continuación se dializó la mezcla frente a solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4ºC durante toda la noche.To obtain hVEGF conjugated with hemocyanin from limpet (KLH) for immunization, recombinant hVEGF (165 amino acids), Leung et al., Science 246: 1,306 (1989), with KLH a a 4: 1 ratio in the presence of 0.05% glutaraldehyde and incubated the mixture at room temperature for 3 hours stirring gently. The mixture was then dialyzed against solution phosphate buffered saline (PBS) at 4 ° C overnight.

Se inmunizó a ratones Balb/c cuatro veces cada dos semanas mediante inyecciones intraperitoneales con 5 \mug de hVEGF conjugado con 20 \mug de KLH, y se volvieron a inmunizar con la misma dosis de hVEGF conjugado con KLH cuatro días antes de la fusión celular.Balb / c mice were immunized four times each two weeks by intraperitoneal injections with 5 µg of hVEGF conjugated with 20 µg of KLH, and were again immunized with the same dose of hVEGF conjugated with KLH four days before the cell fusion

Las células del bazo de los ratones inmunizados se fusionaron con células de mieloma P3X63Ag8U.1 Yelton y otros, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81: 1 (1978), utilizando polietilenglicol (PEG) al 35% tal como se describe en Yarmush y otros, Proc. Nat. Acad. Sci. 77: 2.899 (1980). Los hibridomas se seleccionaron en medio HAT.Spleen cells of immunized mice merged with myeloma cells P3X63Ag8U.1 Yelton and others, Curr. Top. Microbiol Immunol 81: 1 (1978), using 35% polyethylene glycol (PEG) as described in Yarmush and others, Proc. Nat. Acad. Sci. 77: 2,899 (1980). The hybridomas are selected in HAT medium.

Se cribaron los sobrenadantes de los cultivos celulares de hibridoma para la producción de anticuerpos anti-hVEGF mediante análisis ELISA utilizando placas de microtitulación recubiertas con hVEGF. Se determinó el anticuerpo que se había unido al hVEGF en cada uno de los pocillos utilizando inmunoglobulina IgG de cabra anti-murina conjugada con fosfatasa alcalina y el sustrato p-nitrofenil fosfato. Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, pág. 597 (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Las células de hibridoma determinadas de este modo para producir anticuerpos anti-hVEGF se subclonaron mediante dilución limitante, y se eligieron dos de estos clones, designados A4.6.1 y B2.6.2, para posteriores estudios.Crop supernatants were screened hybridoma cells for antibody production anti-hVEGF by ELISA analysis using plates of microtiter coated with hVEGF. The antibody that had bound to hVEGF in each of the wells using goat anti-murine goat IgG immunoglobulin conjugated with alkaline phosphatase and the substrate p-nitrophenyl phosphate. Harlow & Lane, Antibodies:  A Laboratory Manual, p. 597 (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). The hybridoma cells determined in this way to produce anti-hVEGF antibodies were subcloned by limiting dilution, and two of these clones were chosen, designated A4.6.1 and B2.6.2, for further studies.

Ejemplo 2Example 2

Caracterización de anticuerpos monoclonales anti-hVEGFCharacterization of monoclonal antibodies anti-hVEGF A. Especificidad de antígenosA. Specificity of antigens

Las especificidades de unión de los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se determinaron mediante ELISA. Los anticuerpos monoclonales se añadieron a los pocillos de las placas de microtitulación que anteriormente habían sido recubiertas con hVEGF, FGF, HGF o con factor de crecimiento epidérmico. El anticuerpo unido se detectó con peroxidasa conjugada con inmunoglobulinas IgG de cabra anti-murinas. Los resultados de estos análisis confirmaron que los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se unen al hVEGF, pero no de forma detectable a aquellos otros factores de crecimiento de proteínas.The binding specificities of the antibodies monoclonal anti-hVEGF produced by A4.6.1 and B2.6.2 hybridomas were determined by ELISA. The monoclonal antibodies were added to the wells of the plates of microtiter that had previously been coated with hVEGF, FGF, HGF or with epidermal growth factor. He bound antibody was detected with peroxidase conjugated with Goat anti-murine IgG immunoglobulins. The results of these analyzes confirmed that the antibodies monoclonal produced by hybridomas A4.6.1 and B2.6.2 bind to hVEGF, but not detectably to those other factors of protein growth

B. Mapeo de epítoposB. Epitope mapping

Se utilizó un análisis ELISA de unión competitiva para determinar si los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se unen a los mismos epítopos (sitios) o a epítopos distintos en el hVEGF. Kim y otros, Infect. Immun. 57: 944 (1989). Se añadió cada uno de los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF sin marcar (A4.6.1 o B2.6.2) o el anticuerpo irrelevante anti-HGF (isotipo IgG1) a los pocillos de placas de microtitulación que anteriormente habían sido recubiertos con hVEGF. A continuación se añadieron anticuerpos monoclonales anti-hVEGF biotinilados (BIO-A4.6.1 o BIO-B2.6.2). La proporción de anticuerpo biotinilado frente a anticuerpo sin marcar era 1:1.000. La unión de los anticuerpos biotinilados se visualizó mediante la adición de peroxidasa conjugada con avidina, seguido de o-fenilenodiamina dihidrocloruro y peróxido de hidrógeno El cambio de color en la reacción, que indica la cantidad de anticuerpo biotinilado unido, se determinó midiendo la densidad óptica (DO) a 495 nm de longitud de onda.A binding ELISA analysis was used competitive to determine if monoclonal antibodies produced by hybridomas A4.6.1 and B2.6.2 bind to them epitopes (sites) or different epitopes in the hVEGF. Kim and others, Infect Immun 57: 944 (1989). Each antibody was added unmarked anti-hVEGF monoclonal (A4.6.1 or B2.6.2) or the irrelevant anti-HGF antibody (IgG1 isotype) to microtiter plate wells that They had previously been coated with hVEGF. Then you added anti-hVEGF monoclonal antibodies biotinylated (BIO-A4.6.1 or BIO-B2.6.2). The proportion of biotinylated antibody vs. unlabeled antibody was 1: 1,000. The union of biotinylated antibodies was visualized by adding Avidin-conjugated peroxidase, followed by o-phenylenediamine dihydrochloride and peroxide hydrogen The color change in the reaction, which indicates the amount of bound biotinylated antibody, was determined by measuring the density optical (OD) at 495 nm wavelength.

Tal como se muestra en la figura 1, en cada caso, la unión de anticuerpo anti-hVEGF biotinilado fue inhibida por el anticuerpo sin marcar correspondiente, pero no por el otro anticuerpo anti-hVEGF sin marcar o el anticuerpo anti-HGF. Estos resultados indican que los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se unen a distintos epítopos en el hVEGF.As shown in figure 1, in each case, biotinylated anti-hVEGF antibody binding was inhibited by the corresponding unlabeled antibody, but not by the other unlabeled anti-hVEGF antibody or the anti-HGF antibody. These results indicate that monoclonal antibodies produced by A4.6.1 hybridomas and B2.6.2 bind to different epitopes in the hVEGF.

C. IsotipadoC. Isotyped

Los isotipos de los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se determinaron mediante ELISA. Se añadieron muestras del medio de cultivo (sobrenadante) en las cuales crecía cada uno de los hibridomas a las placas de pocillos de microtitulación que anteriormente se habían recubierto con hVEGF. Los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF capturados se incubaron con distintas inmunoglobulinas de cabra anti-murinas conjugadas con fosfatasa alcalina específica del isotipo y se determinó la unión de los anticuerpos conjugados a los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF mediante la adición de p-nitrofenilo fosfato. Se midió el cambio de color en la reacción a 405 nm con un lector de placas ELISA.Isotypes of monoclonal antibodies anti-hVEGF produced by A4.6.1 hybridomas and B2.6.2 were determined by ELISA. Samples of the culture medium (supernatant) in which each of them grew hybridomas to microtiter well plates that They had previously been coated with hVEGF. Antibodies captured anti-hVEGF monoclonal cells were incubated with different goat anti-murine immunoglobulins conjugated to isotype specific alkaline phosphatase and it determined the binding of antibodies conjugated to antibodies monoclonal anti-hVEGF by adding p-nitrophenyl phosphate. The color change was measured in the reaction at 405 nm with an ELISA plate reader.

Mediante este procedimiento, se determinó que el isotipo de los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 era una IgG1.Through this procedure, it was determined that the Isotype of the monoclonal antibodies produced by the A4.6.1 and B2.6.2 hybridomas was an IgG1.

D. Afinidad de uniónD. Affinity of union

Las afinidades de los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 por hVEGF se determinaron mediante análisis de unión competitiva. Se añadió una concentración subóptima predeterminada de anticuerpo monoclonal a las muestras que contenían 20.000-40.000 cpm de hVEGF marcado con ^{126}I (1-2 ng) y varias cantidades conocidas de hVEGF sin marcar (1-1.000 ng). Tras 1 hora a temperatura ambiente, se añadieron 100 \mul de antisuero Ig de cabra anti-murino (Pel-Freez, Rogers, AR USA) y se incubaron las mezclas durante otra hora a temperatura ambiente. Se precipitaron los complejos de anticuerpo y proteína unida (complejos inmunes) mediante la adición de 500 \mul de polietilenglicol al 6% (PEG, % en peso molecular} 8.000) a 4ºC., seguido de centrifugación a 2.000 x G. Durante 20 minutos a 4ºC. Se determinó la cantidad de ^{125}I-hVEGF unido al anticuerpo monoclonal anti-hVEGF en cada muestra contando el material sedimentado en un contador gamma.The affinities of monoclonal antibodies anti-hVEGF produced by A4.6.1 hybridomas and B2.6.2 by hVEGF were determined by binding analysis competitive A predetermined suboptimal concentration was added of monoclonal antibody to samples containing 20,000-40,000 cpm of hVEGF labeled with 126 I (1-2 ng) and several known amounts of hVEGF without dial (1-1,000 ng). After 1 hour at temperature ambient, 100 µl of goat Ig antiserum was added anti-murine (Pel-Freez, Rogers, AR USA) and the mixtures were incubated for another hour at temperature ambient. The antibody and protein complexes were precipitated bound (immune complexes) by adding 500 µl of 6% polyethylene glycol (PEG, 8% molecular weight} 8,000) at 4 ° C., followed by centrifugation at 2,000 x G. For 20 minutes at 4 ° C. Be determined the amount of125I-hVEGF bound to the anti-hVEGF monoclonal antibody in each sample counting the sedimented material in a gamma counter.

Las constantes de afinidad se calcularon a partir de los datos obtenidos mediante análisis Scatchard. Se calculó que la afinidad del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por el hibridoma A4.6.1 era de 1,2 x 10^{9} litros/mol. Se calculó que la afinidad del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por el hibridoma B2.6.2 era de 2,5 x 10^{9} litros/mol.Affinity constants were calculated at from the data obtained through Scatchard analysis. Be calculated that the affinity of the monoclonal antibody anti-hVEGF produced by hybridoma A4.6.1 era of 1.2 x 10 9 liters / mol. It was calculated that the affinity of anti-hVEGF monoclonal antibody produced by the B2.6.2 hybridoma was 2.5 x 10 9 liters / mol.

E. Inhibición de la actividad mitógena hVEGFE. Inhibition of hVEGF mitogenic activity

Se sembraron células endoteliales de capilares (ACE) de corteza suprarrenal bovina, Ferrara y otros, Proc. Nat. Acad. Sci. 84: 5.773 (1987), a una densidad de 10^{4} células/ml en 12 placas de múltiples pocillos, y se añadieron 2,5 ng/ml del hVEGF a cada pocillo en presencia o ausencia de varias concentraciones de los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 o B2.6.2, o un anticuerpo monoclonal irrelevante anti-HGF. Tras cultivo de 5 días, se contaron las células de cada pocillo en un contador Coulter. Como control, se cultivaron células ACE en ausencia de hVEGF añadido.Capillary endothelial cells were seeded (ACE) of bovine adrenal cortex, Ferrara and others, Proc. Nat. Acad. Sci. 84: 5,773 (1987), at a density of 10 4 cells / ml in 12 multiwell plates, and 2.5 ng / ml of the hVEGF to each well in the presence or absence of several monoclonal antibody concentrations anti-hVEGF produced by A4.6.1 hybridomas or B2.6.2, or an irrelevant monoclonal antibody anti-HGF. After 5-day culture, the cells of each well in a Coulter counter. As a control, it they cultured ACE cells in the absence of added hVEGF.

Tal como se muestra en la figura 2, ambos anticuerpos monoclonales anti-HVEGF inhibieron la capacidad del hVEGF añadido para soportar el crecimiento o la supervivencia de las células ACE bovinas. El anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A4.6.1 inhibió por completo la actividad mitógena del hVEGF (en más de aproximadamente un 90% de inhibición), mientras que el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma B2.6.2 sólo inhibió parcialmente la actividad mitógena del hVEGF.As shown in Figure 2, both anti-HVEGF monoclonal antibodies inhibited the added hVEGF capacity to support growth or survival of bovine ACE cells. Monoclonal antibody produced by hybridoma A4.6.1 completely inhibited activity mitogenic hVEGF (in more than about 90% of inhibition), while the monoclonal antibody produced by the B2.6.2 hybridoma only partially inhibited mitogenic activity from hVEGF.

F. Inhibición de la unión al hVEGFF. Inhibition of hVEGF binding

Las células ACE bovinas se sembraron a una densidad de 2,5 x 10^{4} células/0,5 ml/pocillo en 24 placas de pocillos de microtitulación en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía suero de ternera al 10%, glutamina 2 mM y 1 ng/ml de factor básico de crecimiento de fibroblastos. Tras cultivar durante toda la noche, se lavaron las células una vez en tampón de unión (volúmenes iguales de DMEM y medio F12 más HEPES 25 mM y albúmina sérica bovina al 1%) a 4ºC.Bovine ACE cells were seeded at density of 2.5 x 10 4 cells / 0.5 ml / well in 24 plates of microtiter wells in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) containing 10% calf serum, 2 mM glutamine and 1 ng / ml of basic fibroblast growth factor. After cultivating overnight, the cells were washed once in a buffer of binding (equal volumes of DMEM and medium F12 plus 25 mM HEPES and 1% bovine serum albumin) at 4 ° C.

Se preincubaron 12.000 cpm de ^{126}I-hVEGF (aproximadamente 5 x 10^{4} cpm/ng/ml) durante 30 minutos con 5 \mug del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por los hibridomas A4.6.1, B2.6.2 o A2.6.1 (250 \mul del volumen total), y a continuación se añadieron las mezclas a las células ACE bovinas en las placas de microtitulación. Tras incubar las células durante 3 horas a 4ºC, se lavaron las células tres veces con tampón de unión a 4ºC, se solubilizaron mediante la adición de 0,5 ml de NaOH 0,2 N y se contaron en un contador gamma.12,000 cpm of pre-incubated 126 I-hVEGF (approximately 5 x 10 4 cpm / ng / ml) for 30 minutes with 5 µg of the antibody monoclonal anti-hVEGF produced by hybridomas A4.6.1, B2.6.2 or A2.6.1 (250 µl of total volume), and a the mixtures were then added to the bovine ACE cells in microtiter plates. After incubating the cells for 3 hours at 4 ° C, the cells were washed three times with binding buffer at 4 ° C, they were solubilized by the addition of 0.5 ml of 0.2 N NaOH and they were counted in a gamma counter.

Tal como se muestra en la figura 3 (arriba), los anticuerpos monoclonales anti-HVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 inhibieron la unión del hVEGF a las células ACE bovinas. Por el contrario, los anticuerpos monoclonales anti-HVEGF producidos por el hibridoma A2.6.1 no tuvieron al parecer ningún efecto en la unión del hVEGF a las células ACE bovinas. Coincidente con los resultados obtenidos en el análisis de proliferación celular descrito anteriormente, el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A4.6.1 inhibió la unión del hVEGF a una mayor cantidad de anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma B2.6.2.As shown in Figure 3 (above), the anti-HVEGF monoclonal antibodies produced by hybridomas A4.6.1 and B2.6.2 inhibited hVEGF binding to bovine ACE cells. On the contrary, monoclonal antibodies anti-HVEGF produced by hybridoma A2.6.1 no apparently had no effect on hVEGF binding to bovine ACE cells. Coincident with the results obtained in the cell proliferation analysis described above, the monoclonal antibody produced by hybridoma A4.6.1 inhibited the hVEGF binding to a larger amount of monoclonal antibody produced by hybridoma B2.6.2.

Tal como se muestra en la figura 3 (abajo), el anticuerpo monoclonal anti-HVEGF producido por el hibridoma A4.6.1 inhibió por completo la unión del hVEGF a las células ACE bovinas en una proporción molar 1:250 del hVEGF frente al anticuerpo.As shown in Figure 3 (below), the anti-HVEGF monoclonal antibody produced by the A4.6.1 hybridoma completely inhibited hVEGF binding to bovine ACE cells in a 1: 250 molar ratio of the hVEGF versus to the antibody.

       \newpage\ newpage
    

G. Reactividad cruzada con otras isoformas VEGFG. Cross-reactivity with other VEGF isoforms

Para determinar si el anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por el hibridoma A4.6.1 reacciona con las formas del hVEGF de 121 y 189 aminoácidos, se analizó el anticuerpo para conocer su capacidad para inmunoprecipitar aquellos polipéptidos.To determine if the monoclonal antibody anti-hVEGF produced by hybridoma A4.6.1 reacts with the hVEGF forms of 121 and 189 amino acids, it analyzed the antibody to know its ability to immunoprecipitate those polypeptides.

Las células humanas 293 se transfectaron con vectores que comprenden la secuencia codificante de nucleótidos de los polipéptidos hVEGF de 121 y 189 aminoácidos, tal como se ha descrito. Leung y otros, Science 246: 1.306 (1989). Dos días después de la transfección, se transfirieron las células a un medio que carecía de cisteína y de metionina. Se incubaron las células 30 minutos en aquel medio, a continuación se añadieron 100 \muCi/ml de ^{36}S-metionina y ^{36}S-cisteína al medio y se incubaron las células durante otras dos horas. El marcado se averiguó transfiriendo las células a un medio sin suero e incubando durante tres horas. Se recogieron los medios de cultivo y se lisaron las células incubando durante 30 minutos en tampón de lisis (NaCl 150 mM, NP40 al 1%, desoxicolato al 0,5%, dodecil sulfato sódico (SDS) al 0,1%, Tris 50 mM, pH 8,0). Los residuos celulares se eliminaron de los lisados mediante centrifugación a 200 x G durante 30 minutos.Human 293 cells were transfected with vectors comprising the nucleotide coding sequence of hVEGF polypeptides of 121 and 189 amino acids, as has been described Leung et al., Science 246: 1,306 (1989). Two days after transfection, the cells were transferred to a medium that lacked cysteine and methionine. The cells were incubated 30 minutes in that medium, then 100 µCi / ml was added of 36 S-methionine and 36 S-cysteine in the medium and the cells for another two hours. The marking was found transferring the cells to a serum-free medium and incubating for three hours. Culture media were collected and the lysates were lysed cells incubating for 30 minutes in lysis buffer (150 NaCl mM, 1% NP40, 0.5% deoxycholate, sodium dodecyl sulfate (SDS) 0.1%, 50 mM Tris, pH 8.0). Cellular debris was removed of the lysates by centrifugation at 200 x G for 30 minutes

Se incubaron muestras de 500 \mul de cultivo celular y se incubaron los lisados celulares con 2 \mul de anticuerpo de hibridoma A4.6.1 (2,4 mg/ml) durante 1 hora a 4ºC, y a continuación se incubaron con 5 \mul de inmunoglobulina IgG de conejo anti-murina IgG durante 1 hora a 4ºC. Se precipitaron los complejos inmunes de hVEGF marcado con ^{35}S y anticuerpo monoclonal anti-hVEGF con proteína A-sefarosa (Pharmacia), a continuación se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida al 12%-SDS en condiciones de reducción. El gel se expuso a película radiográfica para analizar proteínas radiomarcadas inmunoprecipitadas mediante autorradiografía.Samples of 500 µl of culture were incubated cell and cell lysates were incubated with 2 µl of A4.6.1 hybridoma antibody (2.4 mg / ml) for 1 hour at 4 ° C, and at then incubated with 5 µl of IgG immunoglobulin of rabbit anti-murine IgG for 1 hour at 4 ° C. Be immune complexes of 35 S-labeled hVEGF precipitated and anti-hVEGF monoclonal antibody with protein A-sepharose (Pharmacia), then subjected to 12% polyacrylamide gel electrophoresis -SDS in reduction conditions. The gel was exposed to radiographic film to analyze radiolabelled proteins immunoprecipitated by autoradiography

Los resultados de aquel análisis indicaron que el anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por el hibridoma A4.6.1 presentaba reactividad cruzada con ambas formas del hVEGF de 121 y 189 aminoácidos.The results of that analysis indicated that the anti-hVEGF monoclonal antibody produced by the  A4.6.1 hybridoma presented cross-reactivity with both forms of hVEGF of 121 and 189 amino acids.

Ejemplo 3Example 3

Preparación de receptor hVEGF-proteína de fusión IgGPreparation of hVEGF-fusion protein receptor IgG

Las secuencias codificantes de nucleótidos y de aminoácidos del receptor hVEGF flt se describen en Shibuya y otros, Oncogene 5: 519-524 (1990) La secuencia codificante del dominio extracelular del receptor hVEGF flt se fusionó con la secuencia codificante de una cadena pesada de IgG1 humana en un proceso de dos fases.The nucleotide coding sequences and of hVEGF flt receptor amino acids are described in Shibuya and others, Oncogene 5: 519-524 (1990) The coding sequence of the extracellular domain of the hVEGF flt receptor was fused with the coding sequence of a heavy chain of human IgG1 in a two phase process.

Se utilizó mutagénesis dirigida para introducir una restricción BstBI en el ADN que codifica flt en el sitio 5' del codón para el aminoácido 759 de flt, y para convertir el único sitio de restricción BstEII del plásmido pBSSK.FC, Bennett y otros, Biol. Chem. 266: 23.060-23.067 (1991), en un sitio BstBI. El plásmido modificado se digirió con EcoRI y BstBI y el gran fragmento resultante del ADN plásmido se unió junto con un fragmento EcoRI-BstBI del ADN flt que codifica el dominio extracelular (1-758 aminoácidos) del receptor hVEGF flt.Targeted mutagenesis was used to introduce a BstBI restriction in the DNA encoding flt at the 5 'site of the codon for amino acid 759 of flt, and to convert the only site BstEII restriction plasmid pBSSK.FC, Bennett et al., Biol. Chem. 266: 23.060-23.067 (1991), in a BstBI site. The modified plasmid was digested with EcoRI and BstBI and the large resulting fragment of plasmid DNA bound together with a EcoRI-BstBI fragment of the flt DNA encoding the extracellular domain (1-758 amino acids) of hVEGF receiver flt.

La construcción resultante se digirió con Clal y Notl para generar un fragmento de aproximadamente 3,3 kb, que a continuación se insertó en el sitio de clonación múltiple del vector de expresión de mamíferos pHEBO2 (Leung y otros, Neuron 8: 1.045 (1992) mediante ligación. Los extremos del fragmento de 3,3 kb se modifican, por ejemplo, mediante la adición de enlazadores, para obtener inserción del fragmento en el vector en la orientación correcta para la expresión.The resulting construction was digested with Clal and Notl to generate a fragment of approximately 3.3 kb, which at then it was inserted into the multiple cloning site of the vector of mammalian expression pHEBO2 (Leung et al., Neuron 8: 1,045 (1992) through ligation. The ends of the 3.3 kb fragment are modify, for example, by adding linkers, to get insertion of fragment into vector in orientation correct for the expression.

Las células huésped de mamíferos (por ejemplo, células CEN4; Leung y otros, supra) son transfectadas con el plásmido pHEBO2 que contiene el inserto flt mediante electroporación. Las células transfectadas son cultivadas en un medio que contiene aproximadamente suero bovino fetal al 10%, glutamina 2 mM y antibióticos, y cuando se alcanza aproximadamente una confluencia del 75% son transferidas al medio sin suero. El medio es condicionado durante 3-4 días antes de la recogida y la proteína de fusión flt-IgG es purificada del medio condicionado mediante cromatografía en una matriz de afinidad de proteína A esencialmente tal como se describe en Bennett y otros, J. Biol. Chem. 266: 23.060-23.067 (1991).Mammalian host cells (eg, CEN4 cells; Leung et al., Supra ) are transfected with the plasmid pHEBO2 containing the insert flt by electroporation. Transfected cells are cultured in a medium containing approximately 10% fetal bovine serum, 2 mM glutamine and antibiotics, and when approximately 75% confluence is reached they are transferred to the serum-free medium. The medium is conditioned for 3-4 days before collection and the flt-IgG fusion protein is purified from the conditioned medium by chromatography on an affinity matrix of protein A essentially as described in Bennett et al., J. Biol. Chem. 266: 23.060-23.067 (1991).

Ejemplo 4Example 4

(Ejemplo de referencia)(Example of reference)

Inhibición de la formación de tumores con antagonistas hVEGFInhibition of tumor formation with antagonists hVEGF

Varias estirpes celulares de tumor humano que crecían en cultivo fueron analizadas para comprobar la producción de hVEGF mediante ELISA. Se observó que las estirpes celulares de tumor de ovario, pulmón, colon, gástrico, mama y cerebro producían hVEGF. Para posteriores estudios se utilizaron tres estirpes celulares que producían hVEGF, NEG 55 (al que también se hace referencia como G55) (estirpe celular de glioma humano obtenida del Dr. M. Westphal, Departamento de Neurocirugía, Hospital Universitario Eppendorf, Hamburgo, Alemania, a la que también se hace referencia como G55), A-673 (estirpe celular de rabdomiosarcoma humano obtenida de la American Type Culture Collection (ATCC)), Rockville, Maryland EE.UU. 20852 con el número de estirpe celular CRL 1598) y SK-LMS-1 (estirpe celular de leiomiosarcoma obtenida de la ATCC con el número de estirpe celular HTB 88).Several human tumor cell lines that they grew in culture were analyzed to check the production of hVEGF by ELISA. It was observed that the cell lines of Ovarian, lung, colon, gastric, breast and brain tumor produced hVEGF For subsequent studies three strains were used Cells that produced hVEGF, NEG 55 (which is also made reference as G55) (human glioma cell line obtained from Dr. M. Westphal, Department of Neurosurgery, Hospital University Eppendorf, Hamburg, Germany, which is also referenced as G55), A-673 (cell line of Human rhabdomyosarcoma obtained from the American Type Culture Collection (ATCC)), Rockville, Maryland USA 20852 with the number of cell line CRL 1598) and SK-LMS-1 (cell line of leiomyosarcoma obtained from the ATCC with the cell line number HTB 88).

Se inyectó a ratones hembra Beige/nude de seis a diez semanas de vida (Charles River Laboratory, Wilmington, Massachusetts EE.UU.) con una inyección por vía subcutánea de 1-5 x 10^{8} células tumorales en 100-200 \mul de PBS En distintos momentos después de que se hubiera establecido la formación de tumor, se inyectó a los ratones por vía intraperitoneal una o dos veces por semana con diversas dosis de anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1, de un anticuerpo monoclonal anti-gp 120 irrelevante o de PBS. Se determinó el tamaño del tumor cada semana y al final del estudio se extirparon los tumores y se pesaron.Six to six female Beige / nude mice were injected ten weeks of life (Charles River Laboratory, Wilmington, Massachusetts USA) with a subcutaneous injection of 1-5 x 10 8 tumor cells in 100-200 µl of PBS At different times after that the tumor formation had been established, it was injected into mice intraperitoneally once or twice a week with various doses of anti-hVEGF monoclonal antibody A4.6.1, of an anti-gp 120 monoclonal antibody irrelevant or PBS. Tumor size was determined every week. and at the end of the study the tumors were removed and weighed.

El efecto de varias cantidades de anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 en la formación de tumores NEG 55 en ratones se muestra en las figuras 4 y 5. La figura 4 muestra que en los ratones tratados con 25 \mug o 100 \mug de anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 empezando una semana después de la inoculación de células NEG 55 era sustancialmente inferior el índice de formación de tumores en comparación con los ratones tratados con el anticuerpo irrelevante o el PBS. La figura 5 muestra que cinco semanas después de la inoculación de las células NEG 55, el tamaño de los tumores en los ratones tratados con anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 era de aproximadamente un 50% (en el caso de ratones tratados con dosis de 25 \mug del anticuerpo) a un 85% (en el caso de ratones tratados con dosis de 100 \mug del anticuerpo) inferior al tamaño de los tumores tratados con anticuerpo irrelevante o PBS.The effect of various amounts of antibody monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 in the formation of NEG 55 tumors in mice are shown in Figures 4 and 5. The Figure 4 shows that in mice treated with 25 µg or 100 anti-hVEGF A4.6.1 monoclonal antibody starting one week after inoculation of NEG 55 cells the rate of tumor formation was substantially lower in comparison with mice treated with irrelevant antibody or the PBS. Figure 5 shows that five weeks after the inoculation of NEG 55 cells, the size of tumors in the mice treated with anti-hVEGF A4.6.1 antibody it was about 50% (in the case of mice treated with 25 µg dose of the antibody) at 85% (in the case of mice treated with doses of 100 µg of the antibody) smaller than the size of tumors treated with irrelevant antibody or PBS.

El efecto del tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 en la formación de tumores SK-LMS-1 en ratones se muestra en la figura 6. Cinco semanas después de la inoculación de las células SK-LMS-1, el tamaño medio de los tumores en ratones tratados con el anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 era aproximadamente un 75% inferior al tamaño de los tumores en ratones tratados con anticuerpo irrelevante o PBS.The effect of antibody treatment monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 in the formation of SK-LMS-1 tumors in mice were shown in figure 6. Five weeks after inoculation of SK-LMS-1 cells, size tumor medium in mice treated with the antibody anti-hVEGF A4.6.1 was approximately 75% smaller than the size of tumors in mice treated with antibody irrelevant or PBS.

El efecto del tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 en la formación de tumores A673 en ratones se muestra en la figura 7. Cuatro semanas después de la inoculación de las células A673, el tamaño medio de los tumores en ratones tratados con el anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 era aproximadamente de un 60% (en el caso de ratones tratados con dosis de 10 \mug del anticuerpo) a más de un 90% (en el caso de ratones tratados con dosis de 50-400 \mug del anticuerpo) inferior al tamaño de los tumores en ratones tratados con anticuerpo irrelevante o PBS.The effect of antibody treatment monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 in the formation of A673 tumors in mice are shown in Figure 7. Four weeks after inoculation of A673 cells, the average size of tumors in mice treated with the antibody anti-hVEGF A4.6.1 was approximately 60% (in the case of mice treated with 10 µg dose of the antibody) a more than 90% (in the case of mice treated with doses of 50-400 µg of antibody) smaller than the size of tumors in mice treated with irrelevant antibody or PBS

Ejemplo 5Example 5

Análisis del efecto directo del anticuerpo anti-hVEGF en la formación de células tumorales en cultivoAnalysis of the direct effect of the antibody anti-hVEGF in the formation of tumor cells in culture

Se sembraron células de glioblastoma humano NEG55 o células de rabdomiosarcoma A673 a una densidad de 7 x 10^{3} células/pocillo en placas de multipocillos (12 pocillos/placa) en medio F12/DMEM que contenía suero fetal de ternero al 10%, glutamina al 2 mM y antibióticos. A continuación se añadió anticuerpo anti-hVGEF A4.6.1 a los cultivos celulares hasta una concentración final de 0-20,0 \mug anticuerpo/ml. Al cabo de 5 días, las células cultivadas en los pocillos se disociaron mediante exposición a tripsina y se contaron en un contador Coulter.Human glioblastoma cells were seeded NEG55 or A673 rhabdomyosarcoma cells at a density of 7 x 10 3 cells / well in multiwell plates (12 wells / plate) in F12 / DMEM medium containing fetal serum of 10% calf, 2 mM glutamine and antibiotics. Then you added anti-hVGEF A4.6.1 antibody to cultures cell phones up to a final concentration of 0-20.0 anticuerpo antibody / ml. After 5 days, cells grown in the wells were dissociated by trypsin exposure and were They counted on a Coulter counter.

Las figuras 8 y 9 muestran los resultados de aquellos estudios. Al parecer, el anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 no tiene ningún efecto significativo en el crecimiento de las células NEG55 o A673 en cultivo. Estos resultados indican que el anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 no es citotóxico y sugieren claramente que los efectos antitumorales del anticuerpo observados son debidos a la inhibición de la neovascularización mediada por VEGF.Figures 8 and 9 show the results of those studies. Apparently the antibody anti-hVEGF A4.6.1 has no effect significant in the growth of NEG55 or A673 cells in culture. These results indicate that the antibody anti-hVEGF A4.6.1 is not cytotoxic and suggest clearly that the antitumor effects of the antibody observed are due to inhibition of neovascularization mediated by VEGF

Ejemplo 6Example 6

Efecto del anticuerpo anti-hVEGF en la quimiotaxis celular endotelialEffect of the anti-hVEGF antibody on endothelial cell chemotaxis

La quimiotaxis de células endoteliales y otras células, entre las cuales monocitos y linfocitos, desempeñan una función importante en la patogenia de artritis reumatoide. La migración y proliferación de células endoteliales acompaña la angiogénesis que tiene lugar en la membrana sinovial reumatoide. El tejido vascularizado (tejido de granulación sinovial o paño sinovial) invade y destruye el cartílago articular.Chemotaxis of endothelial cells and others cells, among which monocytes and lymphocytes, play a important role in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. The Migration and proliferation of endothelial cells accompanies the angiogenesis that takes place in the rheumatoid synovial membrane. He vascularized tissue (synovial granulation tissue or cloth synovial) invades and destroys the articular cartilage.

Para determinar si los antagonistas hVEGF interfieren en este proceso, analizamos el efecto del anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 en la quimiotaxis de células endoteliales estimulada por líquido sinovial de pacientes que sufren artritis reumatoide. Como control, también analizamos el efecto del anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 en la quimiotaxis de células endoteliales estimulada por líquido sinovial de pacientes que sufren artrosis (la angiogénesis que tiene lugar en la artritis reumatoide no tiene lugar en la artrosis).To determine if hVEGF antagonists interfere with this process, we analyze the effect of the antibody anti-hVEGF A4.6.1 in cell chemotaxis endothelial stimulated by synovial fluid of patients who They suffer from rheumatoid arthritis. As a control, we also analyze the effect of anti-hVEGF A4.6.1 antibody on the endothelial cell chemotaxis stimulated by synovial fluid of patients suffering from osteoarthritis (the angiogenesis that takes place in rheumatoid arthritis it has no place in osteoarthritis).

La quimiotaxis de células endoteliales se analizó utilizando cámaras de Boyden modificadas según procedimientos establecidos. Thompson y otros, Cancer Res. 51: 2.670 (1991); Phillips y otros, Proc. Exp. Biol. Med. 197: 458 (1991). Se dejó que aproximadamente 10^{4} células endoteliales de vena umbilical se adhirieran a filtros recubiertos con gelatina (tamaño del poro de 0,8 \mum) en microcámaras multipocillo de 48 pocillos en medio de cultivo que contenía suero fetal bovino al 0,1%. Al cabo de dos horas, se invirtieron las cámaras y se añadieron las muestras de prueba (líquido sinovial de artritis reumatoide, líquido sinovial de artrosis, FGF básico (bFGF) (hasta una concentración final de 1 \mug/ml), o PBS) y anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 (hasta una concentración final de 10 \mug/ml) a los pocillos. Al cabo de cuatro horas, se tiñieron y contaron las células que habían migrado.Endothelial cell chemotaxis is analyzed using modified Boyden cameras according to established procedures Thompson et al., Cancer Res. 51: 2,670 (1991); Phillips and others, Proc. Exp. Biol. Med. 197: 458 (1991). Approximately 10 4 endothelial cells were allowed to umbilical vein adhere to gelatin coated filters (0.8 µm pore size) in 48 multi-well micro cameras wells in culture medium containing fetal bovine serum at 0.1% After two hours, the cameras were reversed and added test samples (synovial fluid of arthritis rheumatoid, synovial fluid of osteoarthritis, basic FGF (bFGF) (up to a final concentration of 1 µg / ml), or PBS) and antibody monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 (up to one final concentration of 10 µg / ml) to the wells. After four hours, they stained and counted the cells that had my degree.

La figura 10 muestra los resultados promedio de aquellos estudios. Los valores que se muestran en la columna "Líquido sinovial" y al final de la página para los controles representan el número medio de células endoteliales que migraron en presencia de líquido sinovial, bFGF o PBS solo. Los valores de la columna "Líquido sinovial + mAB VEGF" representan el número medio de células endoteliales que migraron en presencia de líquido sinovial más el anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 añadido. Los valores de la columna "% de supresión" indican el porcentaje de reducción en la migración de células endoteliales inducida por líquido sinovial resultante de la adición de anticuerpo anti-hVEGF. Tal como se ha indicado, el anticuerpo anti-hVEGF inhibió considerablemente la capacidad del líquido sinovial de artritis reumatoide (inhibición media en porcentaje 53,40) pero no el líquido sinovial de artrosis (inhibición media en porcentaje 13,64) para inducir la migración de celulas endoteliales.Figure 10 shows the average results of those studies. The values shown in the column "Synovial fluid" and at the bottom of the page for controls represent the average number of endothelial cells that migrated in presence of synovial fluid, bFGF or PBS alone. The values of the column "Synovial fluid + mAB VEGF" represent the number endothelial cell medium that migrated in the presence of fluid synovial plus anti-hVEGF A4.6.1 antibody added. The values in the "% suppression" column indicate the percentage reduction in endothelial cell migration induced by synovial fluid resulting from the addition of anti-hVEGF antibody. As indicated, the anti-hVEGF antibody significantly inhibited the synovial fluid capacity of rheumatoid arthritis (inhibition mean in percentage 53.40) but not synovial fluid of osteoarthritis (average inhibition in percentage 13.64) to induce the migration of endothelial cells

       \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
    

Referencias citadas en la descripciónReferences cited in the description

Esta lista de referencias bibliográficas mencionada por el solicitante se muestra únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido una gran precaución al recopilar las referencias bibliográficas, no se pueden excluir errores u omisiones y la Oficina Europea de Patentes declina cualquier responsabilidad al respecto.This list of bibliographic references mentioned by the applicant is shown only for reader convenience. It is not part of the patent document European Although great caution has been taken when collecting bibliographic references, errors or omissions cannot be excluded and the European Patent Office declines any responsibility about.

Documentos de patente citados en la descripciónPatent documents cited in the description

\bullet WO 9013649 A [0003]WO 9013649 A [0003]

\bullet US 360229 A [0003]US 360229 A [0003]

\bullet EP 0370989 A, Keck [0006]EP 0370989 A, Keck [0006]

\bullet US 4179337 A, Davis [0020]US 4179337 A, Davis [0020]

\bullet US 4816567 A [0025] [0035]US 4816567 A [0025] [0035]

\bullet US 4376110 A, David y Greene [0055]US 4376110 A, David and Greene [0055]

\bullet US 3773919 A [0068]US 3773919 A [0068]

\bullet US 4485045 A [0069]US 4485045 A [0069]

\bullet US 4544545 A [0069]US 4544545 A [0069]

\bullet US 5013556 A [0069]US 5013556 A [0069]

\bullet WO 9101753 A, Esmon [0075].WO 9101753 A, Esmon [0075].

       \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
    

Bibliografía que no constituye una patente citada en la descripciónBibliography that does not constitute a patent cited in the description

\bulletBURGESS; MACIAG. Annual Rev. Biochem., 1989, vol. 58, 575 [0003] BURGESS ; MACIAG Annual Rev. Biochem ., 1989 , vol. 58, 575 [0003]

\bulletISHIKAWA y otros. Nature, 1989, vol. 338, 557 [0003] ISHIKAWA and others. Nature , 1989 , vol. 338, 557 [0003]

\bulletLEUNG y otros. Science, 1989, vol. 246, 1.306 [0003] [0005] [0015] [0097] LEUNG and others. Science , 1989 , vol. 246, 1,306 [0003] [0005] [0015] [0097]

\bulletFERRARA; HENZEL. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1989, vol. 161, 851 [0003] FERRARA ; HENZEL Biochem Biophys Res. Commun ., 1989 , vol. 161, 851 [0003]

\bulletTISCHER y otros. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1989, vol. 165, 1.198 [0003] TISCHER and others. Biochem Biophys Res. Commun ., 1989 , vol. 165, 1,198 [0003]

\bulletHOUCK y otros. Mol. Endocrin., 1991, vol. 5, 1.806 [0006] [0015] HOUCK et al. Mol. Endocrin ., 1991 , vol. 5, 1,806 [0006] [0015]

\bulletFERRARA y otros. J. Cell. Biochem., 1991, vol. 47, 211 [0006] FERRARA and others. J. Cell. Biochem ., 1991 , vol. 47, 211 [0006]

\bulletFERRARA y otros. Endocrine Reviews, 1992, vol. 13, 18 [0006] FERRARA and others. Endocrine Reviews , 1992 , vol. 13, 18 [0006]

\bulletKECK y otros. Science, 1989, vol. 246, 1.309 [0006] KECK and others. Science , 1989 , vol. 246, 1,309 [0006]

\bulletCONNOLLY y otros. J. Biol. Chem., 1989, vol. 264, 20.017 [0006] CONNOLLY and others. J. Biol. Chem ., 1989 , vol. 264, 20,017 [0006]

\bulletFOLKMAN y otros. Nature, 1989, vol. 339, 58 [0008] FOLKMAN and others. Nature , 1989 , vol. 339, 58 [0008]

\bulletWEIDNER y otros. New Engl. J. Med., 1991, vol. 324, 1 [0008] WEIDNER and others. New Engl. J. Med ., 1991 , vol. 324, 1 [0008]

\bulletDEVRIES y otros. Science, 1992, vol. 255, 989 [0017] DEVRIES and others. Science , 1992 , vol. 255, 989 [0017]

\bulletSHIBUYA y otros. Oncogene, 1990, vol. 5, 519 [0017] SHIBUYA and others. Oncogene , 1990 , vol. 5, 519 [0017]

\bulletMATTHEWS y otros. Proc. Nat. Acad. Sci., 1991, vol. 88, 9.026 [0018] MATTHEWS and others. Proc. Nat. Acad. Sci ., 1991 , vol. 88, 9,026 [0018]

\bulletTERMAN y otros. Oncogene, 1991, vol. 6, 1.677 [0018] TERMAN and others. Oncogene , 1991 , vol. 6, 1,677 [0018]

\bulletTERMAN y otros. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1992, vol. 187, 1.579 [0018] TERMAN and others. Biochem Biophys Res. Commun ., 1992 , vol. 187, 1,579 [0018]

\bulletGASCOIGNE y otros. Proc. Nat. Acad. Sci., 1987, vol. 84, 2.936 [0020] GASCOIGNE and others. Proc. Nat. Acad. Sci ., 1987 , vol. 84, 2,936 [0020]

\bulletCAPON y otros. Nature, 1989, vol. 337, 525 [0020] CAPON et al. Nature , 1989 , vol. 337, 525 [0020]

\bulletARUFFO y otros. Cell, 1990, vol. 61, 1.303 [0020] ARUFFO and others. Cell , 1990 , vol. 61, 1,303 [0020]

\bulletASHKENAZI y otros. Proc. Nat. Acad. Sci., 1991, vol. 88, 10.535 [0020] ASHKENAZI et al. Proc. Nat. Acad. Sci ., 1991 , vol. 88, 10,535 [0020]

\bulletBENNETT y otros. J. Biol. Chem., 1991, vol. 266, 23.060 [0020] BENNETT and others. J. Biol. Chem ., 1991 , vol. 266, 23,060 [0020]

\bulletGOODSON y otros. BioTechnology, 1990, vol. 8, 343-346 [0020] GOODSON and others. BioTechnology , 1990 , vol. 8, 343-346 [0020]

\bulletABUCHOWSKI y otros. J. Biol. Chem., 1977, vol. 252, 3.578 [0020] ABUCHOWSKI and others. J. Biol. Chem ., 1977 , vol. 252, 3,578 [0020]

\bulletABUCHOWSKI y otros. J. Biol. Chem., 1977, vol. 252, 3.582 [0020] ABUCHOWSKI and others. J. Biol. Chem ., 1977 , vol. 252, 3,582 [0020]

\bulletMARSHALL y otros. Arch. Biochem. Biophys., 1975, vol. 167, 77 [0020] MARSHALL and others. Arch. Biochem. Biophys ., 1975 , vol. 167, 77 [0020]

\bulletKOHLER; MILSTEIN. Nature, 1975, vol. 256, 495 [0025] KOHLER ; MILSTEIN Nature , 1975 , vol. 256, 495 [0025]

\bulletGODING. Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. Academic Press, 1986, 59-103 [0026] GODING . Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. Academic Press , 1986 , 59-103 [0026]

\bulletYELTON y otros. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 1978, vol. 81, 1 [0030] [0081] YELTON et al. Curr. Top. Microbiol Immunol ., 1978 , vol. 81, 1 [0030] [0081]

\bulletKOZBOR. J. Immunol., 1984, vol. 133, 3.001 [0030] KOZBOR . J. Immunol ., 1984 , vol. 133, 3,001 [0030]

\bulletBRODEUR y otros. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications. Marcel Dekker, Inc, 1987, 51-63 [0030] BRODEUR and others. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications. Marcel Dekker, Inc, 1987 , 51-63 [0030]

\bulletGODING. Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. Academic Press, 1986, 59-104 [0032] GODING . Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. Academic Press , 1986 , 59-104 [0032]

\bulletCARTER y otros. Proc. Nat. Acad. Sci., 1992, vol. 89, 4.285 [0035] CARTER and others. Proc. Nat. Acad. Sci ., 1992 , vol. 89, 4,285 [0035]

\bulletCARTER y otros. BioTechnology, 1992, vol. 10, 163 [0035] CARTER and others. BioTechnology , 1992 , vol. 10, 163 [0035]

\bulletMORRISON y otros. Proc. Nat. Acad. Sci., 1984, vol. 81, 6.851 [0035] MORRISON et al. Proc. Nat. Acad. Sci ., 1984 , vol. 81, 6,851 [0035]

\bulletMUNSON; POLLARD. Anal. Biochem., 1980, vol. 107, 220 [0038] MUNSON ; POLLARD Anal. Biochem ., 1980 , vol. 107, 220 [0038]

\bulletBENNETT y otros. J. Biol. Chem., 1991, vol. 266, 23.060-23.067 [0045] [0101] [0103] BENNETT and others. J. Biol. Chem ., 1991 , vol. 266, 23.060-23.067 [0045] [0101] [0103]

\bulletMADDON y otros. Cell, 1985, vol. 42, 93 [0047] MADDON et al. Cell , 1985 , vol. 42, 93 [0047]

\bulletCOUSSENS y otros. Science, 1985, vol. 230, 1.137 [0047] COUSSENS et al. Science , 1985 , vol. 230, 1,137 [0047]

\bulletHUNTER y otros. Nature, 1962, vol. 144, 945 [0052] HUNTER and others. Nature , 1962 , vol. 144, 945 [0052]

\bulletDAVID y otros. Biochemistry, 1974, vol. 13, 1.014 [0052] DAVID and others. Biochemistry , 1974 , vol. 13, 1,014 [0052]

\bulletPAIN y otros. J. Immunol. Meth., 1981, vol. 40, 219 [0052] PAIN and others. J. Immunol. Meth ., 1981 , vol. 40, 219 [0052]

\bulletNYGREN. J. Histochem. and Cytochem., 1982, vol. 30, 407 [0052] NYGREN . J. Histochem. and Cytochem ., 1982 , vol. 30, 407 [0052]

\bulletZOLA. Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques. CRC Press, Inc, 1987, 147-158 [0053] ZOLA . Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques. CRC Press , Inc, 1987 , 147-158 [0053]

\bulletCUNNINGHAM y otros. Science, 1991, vol. 254, 821 [0058] CUNNINGHAM and others. Science , 1991 , vol. 254, 821 [0058]

\bulletDEVOS y otros. Science, 1992, vol. 255, 306 [0058] DEVOS and others. Science , 1992 , vol. 255, 306 [0058]

\bulletFUH y otros. Science, 1992, vol. 256, 1.677 [0058] FUH et al. Science , 1992 , vol. 256, 1,677 [0058]

\bulletCUNNINGHAM y otros. Science, 1989, vol. 244, 1.081-1.985 [0059] CUNNINGHAM and others. Science , 1989 , vol. 244, 1,081-1,985 [0059]

\bulletKIM y otros. Growth Factors, 1992, vol. 7, 53 [0059] KIM and others. Growth Factors , 1992 , vol. 7, 53 [0059]

\bulletMERRIFIELD. J. Am. Chem. Soc., 1963, vol. 85, 2.149 [0065] MERRIFIELD . J. Am. Chem. Soc ., 1963 , vol. 85, 2,149 [0065]

\bulletLANGER y otros. J. Biomed. Mater. Res., 1981, vol. 15, 167 [0068] LANGER and others. J. Biomed. Mater. Res ., 1981 , vol. 15, 167 [0068]

\bulletLANGER. Chem. Tech., 1982, vol. 12, 98-105 [0068] LANGER . Chem. Tech ., 1982 , vol. 12, 98-105 [0068]

\bulletSIDMAN y otros. Biopolymers, 1983, vol. 22, 547 [0068] SIDMAN and others. Biopolymers , 1983 , vol. 22, 547 [0068]

\bulletEPSTEIN y otros. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, vol. 82, 3.688 [0069] EPSTEIN and others. Proc. Natl Acad. Sci. USA , 1985 , vol. 82, 3,688 [0069]

\bulletHWANG y otros. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, 4.030 [0069] HWANG et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA , 1980 , vol. 77, 4,030 [0069]

\bulletYARMUSH y otros. Proc. Nat. Acad. Sci., 1980, vol. 77, 2.899 [0081] YARMUSH et al. Proc. Nat. Acad. Sci ., 1980 , vol. 77, 2,899 [0081]

\bulletHARLOW; LANE. Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, 597 [0082] HARLOW ; LANE Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory , 1988 , 597 [0082]

\bulletKIM y otros. Infect. Immun., 1989, vol. 57, 944 [0084] KIM and others. Infect Immun ., 1989 , vol. 57, 944 [0084]

\bulletFERRARA y otros. Proc. Nat. Acad. Sci., 1987, vol. 84 5.773 [0090] FERRARA and others. Proc. Nat. Acad. Sci ., 1987 , vol. 84 5,773 [0090]

\bulletSHIBUYA y otros. Oncogene, 1990, vol. 5, 519-524 [0100] SHIBUYA and others. Oncogene , 1990 , vol. 5, 519-524 [0100]

\bulletTHOMPSON y otros. Cancer Res., 1991, vol. 51, 2.670 [0113] THOMPSON et al. Cancer Res ., 1991 , vol. 51, 2,670 [0113]

\bulletPHILLIPS y otros. Proc. Exp. Biol. Med., 1991, vol. 197, 458 [0113]. PHILLIPS et al. Proc. Exp. Biol. Med ., 1991 , vol. 197, 458 [0113].

Claims (26)

1. Uso de un antagonista hVEGF en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno no neoplásico caracterizado por exceso de neovascularización no deseable, en el que el antagonista de hVEGF es:1. Use of an hVEGF antagonist in the preparation of a medicament for the treatment of a non-neoplastic disease or disorder characterized by undesirable neovascularization excess, in which the hVEGF antagonist is:

(a)(to)

un anticuerpo anti-VEGF o un fragmento de anticuerpo;a anti-VEGF antibody or a fragment of antibody;

(b)(b)

un anticuerpo receptor anti-VEGF o un fragmento de anticuerpo; oa anti-VEGF receptor antibody or a fragment of antibody; or

(c)(C)

un receptor hVEGF aislado.a hVEGF receiver isolated.

2. Uso según la reivindicación 1 en el que la enfermedad o trastorno es artritis reumatoide, soriasis, aterosclerosis, retinopatía diabética u otra, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, hiperplasia tiroidea (incluida enfermedad de Grave), trasplante de córnea o de otro tejido o inflamación crónica.2. Use according to claim 1 wherein the disease or disorder is rheumatoid arthritis, psoriasis, atherosclerosis, diabetic or other retinopathy, fibroplasia retrolental, neovascular glaucoma, thyroid hyperplasia (included Grave disease), corneal or other tissue transplant or Chronic inflamation. 3. Uso según la reivindicación 2 en el que la enfermedad o trastorno es artritis reumatoide.3. Use according to claim 2 wherein the disease or disorder is rheumatoid arthritis. 4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el anticuerpo anti-VEGF es un anticuerpo anti-hVEGF.4. Use according to any of the claims above in which the anti-VEGF antibody is a anti-hVEGF antibody. 5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.5. Use according to any of the claims above in which the antibody is a monoclonal antibody. 6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el anticuerpo es humanizado.6. Use according to any of the claims above in which the antibody is humanized. 7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que el receptor hVEGF aislado consiste en el dominio extracelular de un receptor hVEGF.7. Use according to any of the claims 1 to 3 in which the isolated hVEGF receptor consists of the domain extracellular of an hVEGF receptor. 8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 7 en el que el receptor hVEGF es el receptor flt.8. Use according to any of the claims 1 to 3 and 7 in which the hVEGF receiver is the flt receptor. 9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 7 en el que el receptor hVEGF es el receptor KDR.9. Use according to any of the claims 1 to 3 and 7 in which the hVEGF receiver is the KDR receiver. 10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 7 a 9 en el que el receptor hVEGF se fusiona con un polipéptido portador.10. Use according to any of the claims 1 to 3 and 7 to 9 in which the hVEGF receiver merges with a carrier polypeptide. 11. Uso según la reivindicación 10 en el que el polipéptido portador es un polipéptido de inmunoglobulina.11. Use according to claim 10 wherein the Carrier polypeptide is an immunoglobulin polypeptide. 12. Uso según la reivindicación 11 en el que la inmunoglobulina es IgG.12. Use according to claim 11 wherein the Immunoglobulin is IgG. 13. Uso según la reivindicación 12 en el que el antagonista hVEGF es una proteína de fusión flt-IgG.13. Use according to claim 12 wherein the hVEGF antagonist is a fusion protein flt-IgG. 14. Antagonista hVEGF de uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno no neoplásico caracterizado por exceso de neovascularización no deseable, en el que el antagonista de hVEGF es:14. hVEGF antagonist for use in the treatment of a non-neoplastic disease or disorder characterized by undesirable neovascularization excess, in which the hVEGF antagonist is:

(a)(to)

un anticuerpo anti-VEGF o un fragmento de anticuerpo;a anti-VEGF antibody or a fragment of antibody;

(b)(b)

un anticuerpo receptor anti-VEGF o un fragmento de anticuerpo; oa anti-VEGF receptor antibody or a fragment of antibody; or

(c)(C)

un receptor hVEGF aislado.a hVEGF receiver isolated.

15. Antagonista de hVEGF según la reivindicación 14 en el que la enfermedad o trastorno es artritis reumatoide, soriasis, aterosclerosis, retinopatía diabética u otra, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, hiperplasia tiroidea (incluida enfermedad de Grave), trasplante de córnea o de otro tejido o inflamación crónica.15. hVEGF antagonist according to claim 14 in which the disease or disorder is rheumatoid arthritis, psoriasis, atherosclerosis, diabetic or other retinopathy, fibroplasia retrolental, neovascular glaucoma, thyroid hyperplasia (included Grave disease), corneal or other tissue transplant or Chronic inflamation. 16. Antagonista de hVEGF según la reivindicación 15 en el que la enfermedad o trastorno es artritis reumatoide.16. hVEGF antagonist according to claim 15 in which the disease or disorder is rheumatoid arthritis. 17. Antagonista de hVEGF según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 en el que el anticuerpo anti-VEGF es un anticuerpo anti-hVEGF.17. hVEGF antagonist according to any of the claims 14 to 16 wherein the antibody anti-VEGF is an antibody anti-hVEGF. 18. Antagonista de hVEGF según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17 en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.18. hVEGF antagonist according to any of the claims 14 to 17 wherein the antibody is an antibody monoclonal 19. Antagonista de hVEGF según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18 en el que el anticuerpo es humanizado.19. hVEGF antagonist according to any of the claims 14 to 18 wherein the antibody is humanized. 20. Antagonista de hVEGF según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 en el que el receptor hVEGF aislado consiste en el dominio extracelular de un receptor hVEGF.20. hVEGF antagonist according to any of the claims 14 to 16 wherein the isolated hVEGF receptor It consists of the extracellular domain of an hVEGF receptor. 21. Antagonista de hVEGF según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 y 20 en el que el receptor hVEGF es el receptor flt.21. hVEGF antagonist according to any of the claims 14 to 16 and 20 wherein the hVEGF receptor is the receiver flt. 22. Antagonista de hVEGF según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 y 20 en el que el receptor hVEGF es el receptor KDR.22. hVEGF antagonist according to any of the claims 14 to 16 and 20 wherein the hVEGF receptor is the KDR receiver 23. Antagonista de hVEGF según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 y 20 a 22 en el que el receptor hVEGF se fusiona con un polipéptido portador.23. hVEGF antagonist according to any of the claims 14 to 16 and 20 to 22 wherein the hVEGF receptor is fuses with a carrier polypeptide. 24. Antagonista de hVEGF según la reivindicación 23 en el que el polipéptido portador es un polipéptido de inmunoglobulina.24. hVEGF antagonist according to claim 23 in which the carrier polypeptide is a polypeptide of immunoglobulin 25. Antagonista de hVEGF según la reivindicación 24 en el que la inmunoglobulina es IgG.25. hVEGF antagonist according to claim 24 in which the immunoglobulin is IgG. 26. Antagonista de hVEGF según la reivindicación 25 en el que el antagonista hVEGF es una proteína de fusión flt-IgG.26. hVEGF antagonist according to claim 25 in which the hVEGF antagonist is a fusion protein flt-IgG.