ES2308867B1 - Procedimiento para la deteccion simultanea de secuencias de acidos nucleicos mediante el uso de polisondas. - Google Patents
Procedimiento para la deteccion simultanea de secuencias de acidos nucleicos mediante el uso de polisondas. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para la detección simultánea de
secuencias de ácidos nucleicos mediante el uso de polisondas.
La patente consiste en la utilización de una
polisonda para la detección de un número variable de secuencias
nucleotídicas, mediante hibridación molecular. El sistema supone la
clonación en tandem de varios fragmentos genómicos distintos en un
mismo vector plasmídico lo cual permite la síntesis en la misma
reacción de transcripción, de una única sonda de RNA o DNA. La
invención reúne por un lado, la sensibilidad que confiere la
hibridación molecular y por otro, permite disminuir los costes y el
tiempo necesarios para la realización de los análisis. Es de
aplicación principalmente en el campo del Fitodiagnóstico y en la
detección de organismos modificados genéticamente.
Description
Procedimiento para la detección simultánea de
secuencias de ácidos nucleicos mediante el uso de polisondas.
La técnica se englobaría dentro del sector
Agroalimentario y Biotecnológico con aplicaciones principalmente en
el campo del Fitodiagnóstico y en la utilización de herramientas
moleculares para la detección de organismos modificados
genéticamente.
Las especies cultivadas son susceptibles de
sufrir un gran número de enfermedades virales que repercuten en su
rendimiento y producción y que por tanto ocasionan importantes
pérdidas económicas. En las infecciones ocasionadas por hongos y
bacterias es posible un control de tipo químico para la
erradicación de la enfermedad, pero en virus y viroides la principal
estrategia de lucha contra el patógeno es el diagnóstico precoz;
por lo que resulta de especial relevancia el desarrollo de métodos
de detección sensibles, económicos y rápidos que permitan un
diagnóstico fiable de la infección.
Los árboles frutales constituyen un cultivo de
especial relevancia dentro del sector agroalimentario. Se conocen
al menos 10 virus que afectan de manera significativa a estos
cultivos y que pueden detectarse de manera individualizada por
métodos serológicos y/o moleculares.
Uno de los principales objetivos actuales en el
campo del Diagnóstico Molecular consiste en economizar en la medida
de lo posible el análisis rutinario de gran número de muestras.
Esto es válido tanto para el fitodiagnóstico de virus vegetales
como en la detección de genes o transgenes en productos de
alimentos.
Así, sería aconsejable encontrar un método de
detección lo suficientemente sensible, rápido, económico y
susceptible de automatización, que permita la detección simultánea
del mayor número de virus posible y facilite por tanto el trabajo
en los programas de certificación de frutales y de otras plantas
cultivadas en general y por otro el control de las partidas en el
caso de alimentos.
Los virus de plantas se componen de dos tipos de
moléculas: informativas (ácidos nucleicos) y funcionales
(proteínas) y los métodos de diagnosis se han ido desarrollando en
base al progreso obtenido en la detección de ambos tipos de
moléculas. Hasta hace relativamente poco tiempo, para la detección
de virus de plantas, sólo se utilizaban de forma rutinaria los
métodos basados en el componente proteico. Entre ellos, la técnica
serológica más utilizada por su sencillez, sensibilidad y fácil
automatización, ha sido el ensayo tipo ELISA. Sin embargo y en
detrimento de su sensibilidad, este método presenta la desventaja
de que sólo un 2-5% de la secuencia del virus actúa
como determinante antigénico (Hull, R.; The potential for using
dot-blot hybridisation in the detection of plant
viruses. In Developments and applications of virus testing, ed.
R.A.C. Jones, L. Torrance. pp. 3-12, Suffok,
Lavenham, 1986).
Durante los últimos años y gracias a la
incorporación de la tecnología del DNA recombinante a la Virología
Vegetal, ha sido posible el desarrollo de métodos de diagnóstico
basados en el componente genómico de los virus, entre los que cabe
destacar dos técnicas: la hibridación molecular y la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR). Esta técnica es también la base de
los sistemas de detección de plantas o alimentos transgénicos. En
este último caso los métodos de diagnóstico pueden estar basados en
la detección de la secuencia del transgen introducido y en el caso
de mezclas o alimentos elaborados, de la presencia o no de
secuencias de nucleótidos que controlan la expresión y selección de
transgenes, siendo las más habituales las secuencias
representativas del promotor 35S del virus del mosaico de la
coliflor, la secuencia de poliadenilación del gen de la síntesis de
nopalina y los genes de resistencia a ampicilina, kanamicina y
tetraciclina. También sería útil en sistemas de discriminación de
muestras en procesos de mejora genética por identificación de genes
o marcadores, en identificación varietal o de especies, etc.
La hibridación molecular como método de
diagnóstico en Virología Vegetal fue utilizada por primera vez para
la detección de viroides (Owens, R.A. and Diener, T.O. (1981)
Sensitive and rapid diagnosis of Potato spindle tuber viroid
disease by nucleic acid hybridization. Science 213,
670-672.) y posteriormente para la de virus
vegetales (Maule A.J., Hull R, Donson J. (1983) The application of
spot hybridization to the detection of DNA and RNA viruses in plant
tissues. J. Virol. Methods. 6, 215-24.;
Garger S.J., Turpen, T., Carrington, J.C., Morris, T.J., Dodds,
J.A., Jordan, R.L. and Grill, L.K. (1983). Rapid detection of plant
RNA viruses by dot blot hybridization. Plant. Mol. Biol.
Rep. 1, 21-25.). Esta técnica se basa en la
complementariedad de las dos cadenas constituyentes de un ácido
nucleico bicatenario y el resultado es la formación de un híbrido
entre la secuencia de nucleótidos del virus a detectar y una
secuencia complementaria marcada a la que se denomina sonda
(Pallás, V., Más, P. and Sánchez-Navarro, J.A.,
(1998a). Detection of plant RNA viruses by
non-isotopic dot-blot
hybridization. In: Plant virus protocols: from virus
isolation to transgenic resistance. Methods in Molecular
Virology. Humana Press, Totowa. 81, 461-468).
Para la síntesis de la sonda, el RNA viral es retrotranscrito y
amplificado por PCR obteniéndose un DNA de doble cadena copia del
genoma viral. Dicho fragmento se clona en un plásmido que contiene
los promotores de dos RNA polimerasas, una permitirá la síntesis de
RNA viral de polaridad positiva y la otra la del de polaridad
negativa. Para el marcaje de la sonda se pueden utilizar
precursores radiactivos o no radiactivos en la reacción de
transcripción. Los últimos hacen de la hibridación molecular una
técnica más accesible facilitando en gran medida su manejo. Entre
los precursores no radiactivos los más comunes son los derivados de
la biotina y de la digoxigenina. En la presente propuesta se ha
utilizado la digoxigenina, un hapteno que se incorpora a los
residuos de uridina mediante métodos enzimáticos convencionales y
cuya detección se lleva a cabo con un anticuerpo específico.
La variante que más comúnmente se utiliza en
hibridación molecular es la de "dot-blot" en
la que la solución de ácidos nucleicos es aplicada directamente
sobre un soporte sólido, como por ejemplo una membrana de
nitrocelulosa o nylon, y detectada con una sonda específica
marcada.
La segunda técnica, el PCR, utiliza un
enzima con capacidad para amplificar de forma exponencial
secuencias específicas de DNA, lo cual requiere de un paso previo
de retrotranscripción reversa (RT) en los virus de RNA, para la
obtención de un DNA copia del genoma viral (Pallás, V.,
Sánchez-Navarro, J.A., Más, P., Cañizares, M. C.,
Aparicio, F., and Marcos, J. F. (1998b). Molecular diagnostic
techniques and their potential role in stone fruit certification
schemes. Options Méditerr. 19, 191-208),
mientras que en alimentos esta paso no es necesario pues lo que se
detecta directamente es el DNA genómico presente en la muestra. Se
trata de un método extremadamente sensible y que por tanto permite
detectar concentraciones extraordinariamente bajas del patógeno o
del transgen. Esta alta sensibilidad hace que se sobredimensionen
las pequeñas contaminaciones y que por tanto se requieran unas
condiciones de trabajo muy estrictas no disponibles en laboratorios
poco especializados.
La incorporación de los métodos moleculares ha
supuesto una espectacular mejora de la sensibilidad. La elección de
uno u otro método dependerá del tipo de análisis. No obstante, en
los programas de certificación de frutales podría aceptarse como
norma general el uso de métodos serológicos o la hibridación
molecular no radiactiva, mientras que el PCR sería utilizado en
análisis que requieran de una mayor sensibilidad como es el caso de
las plantas madre, material prebásico, material importado, yemas
durmientes durante el periodo de cuarentena o para fines
sanitarios. En el caso de alimentos, en el control de materias
primas en la recepción de fábrica o en pequeños laboratorios de
análisis que confirmen la presencia o no de transgenes, mezcla de
diferentes productos o especies, o la presencia o no de bacterias y
hongos productores de toxinas o contaminantes, para asegurar la
trazabilidad del alimento como libre de transgénicos, o de
contaminantes o que no se trata de un sucedáneo o una mezcla de
productos de inferior calidad, se utilizará la hibridación
molecular. Sin embargo cuando se requiera un análisis más fino o de
confirmación para detectar la presencia de un transgen concreto o
determinar cual puede ser su origen se recurrirá a técnicas basadas
en PCR.
Los mayores esfuerzos en los últimos años han
ido encaminados a contribuir al desarrollo de métodos de
diagnóstico más rápidos y económicos, mediante la detección
simultánea del mayor número de secuencias posible (transgenes, sus
secuencias de control, genes o marcadores específicos o patógenos
como virus, viroides, bacterias u hongos sean patógenos para la
planta, productores de toxinas o contaminantes en alimentos), ya sea
incluyendo en la reacción de amplificación un cóctel con los
cebadores específicos o mezclando las sondas individuales de cada
uno de ellos detectando simultáneamente varias secuencias. Como
ejemplos de la primera estrategia cabe destacar la detección
mediante RT-PCR múltiple de los tres principales
Ilarvirus que afectan a frutales de hueso (Saade, M., Aparicio, F.,
Sánchez-Navarro, J.A., Herranz, M.C., Myrta, A., Di
Terlizzi, B., Pállas, V. (2000). Simultaneous detection of the
three Ilarviruses affecting stone fruits by
non-isotopic molecular hybridization and
multiplexRT-PCR. Phytopathology 90,
1330-1336), la de seis virus que afectan al olivo
(Bertolini, E., Olmos, A., Martinez, M.C., Gorris, M.T., Cambra, M.
(2001). Single-step multiplex RT-PCR
for simultaneous and colourimetric detection of six RNA viruses in
olive trees. J. Virol. Methods 96, 33-41.) y
los cuatro virus que afectan a fresa (Thompson, 2003). La
hibridación molecular múltiple se ha utilizado con éxito para la
detección simultánea de los principales virus que afectan a cultivos
ornamentales (Sánchez-Navarro, J. A., Cañizares,
M.C., Cano, E.A., Pallás, V. (1999). Simultaneous detection of five
carnation viruses by non-iostopic molecular
hybridisation. J. Virol. Methods 82, 167-75),
hortícolas (Saldarelli, P., Barbarossa, L., Grieco, F., and
Gallitelli, D. (1996). Digoxigenin-labelled
riboprobes applied to phytosanitary certification of tomato in
Italy. Plant Dis. 80, 1343-1346) y leñosas
(Saade, M., Aparicio, F., Sánchez-Navarro, J.A.,
Herranz, M.C., Myrta, A., Di Terlizzi, B., Pállas, V. (2000).
Simultaneous detection of the three Ilarviruses affecting stone
fruits by non-isotopic molecular hybridization and
multiplex RT-PCR. Phytopathology 90,
1330-1336.).
En la presente invención se ha desarrollado una
estrategia que ha permitido en primer lugar la detección simultánea
de virus, viroides, pues se contaba con más experiencia en este
ámbito y en un segundo paso se ha extendido a la detección de
transgenes, o marcadores génicos y todo ello de una forma más
económica y rápida. De este modo, además de mantener las ventajas
de la hibridación molecular individualizada, permite disminuir los
costes y el tiempo necesarios para el diagnóstico, así como
normalizar la cantidad de sonda que reconoce a cada virus. Esta
estrategia constituye un nuevo concepto en el campo de la detección
de ácidos nucleicos al ser necesario una única síntesis de sonda
para la detección de un número variable de secuencias
nucleotídicas.
La técnica que aquí se describe consiste en la
clonación en tandem de varios fragmentos genómicos distintos en un
mismo vector plasmídico lo cual permite la síntesis en la misma
reacción de transcripción, de una única sonda de RNA o DNA a la que
hemos denominado "polisonda", que reconoce a todas las
secuencias clonadas. La invención reúne por un lado, la sensibilidad
que confiere la hibridación molecular y por otro, permite disminuir
los costes y el tiempo necesarios para la realización de los
análisis.
Para la obtención de la polisonda se amplifican
mediante PCR fragmentos genómicos representativos de la secuencia
que se quiera detectar. El tamaño mínimo de los mismos puede ser de
50 pares de bases aunque para tener una mayor sensibilidad es
recomendable utilizar fragmentos de alrededor de unas 200 pares de
bases (pb). Para la realización de cada PCR se diseñan cebadores
específicos de las secuencias a detectar, con los sitios de
restricción correspondientes compatibles con el vector que se vaya
a utilizar para la realización de la clonación. Tras realizar las
subclonaciones necesarias se obtiene un clon con los fragmentos
genómicos en tandem o con secuencias específicas de separación para
facilitar que no existan impedimentos estéricos que compliquen la
hibridación con fragmentos adyacentes. El número de sondas
individuales que se pueden incluir en la polisonda depende por un
lado del tamaño de las sondas individuales y del tamaño del inserto
máximo que permita el vector escogido. Se han utilizado sin
problemas 1200 bases. Una vez obtenido el clon se genera la
polisonda. Dependiendo de si se trata de polisondas de RNA o de DNA
se utilizará un enzima u otro y un sistema de detección basado en
marcaje con oligonucleótidos radiactivos, digoxigenina, biotina o
cualquier otro método de marcaje estándar que se escoja. En
principio la técnica radiactiva requiere instalación autorizada y
tendría menor aplicabilidad industrial, pero sería factible.
Se realiza la extracción de RNA/DNA en función
de la estrategia elegida, utilizando un protocolo estándar o el
específico descrito en los ejemplos. El tipo de material de origen
puede obligar a modificar levemente los protocolos para obtener
mayor rendimiento. Una vez extraída la muestra es necesario
desnaturalizarla.
El método descrito es un dot blot que utiliza
membranas de nylon, sería factible adaptarlo a nitrocelulosa, pero
también sería aplicable, en pocillos (titer, microtiter) o en
vidrio (microchips) o cualquier otro método colorimétrico. Para
ello, se fija o bien la muestra en el caso de que se añada la sonda
al tampón de hibridación, o la sonda si lo que se añade a la
solución de hibridación es la muestra desnaturalizada. Se procede a
realizar la hibridación a la temperatura adecuada según se trate de
una hibridación RNA/RNA; DNA/RNA o DNA/DNA. Una vez transcurrido el
tiempo determinado de hibridación, el cual depende del tamaño de
pares de bases de la sonda, se procede al lavado cuyas condiciones
son variables según los condicionantes anteriores. A continuación se
realizaría la detección utilizando para ello un método radiactivo,
colorimétrico o por emisión de luz dependiendo del sistema de
marcaje de la polisonda escogido.
Fig. 1: Secuencias (5'\rightarrow3') de los
cebadores específicos utilizados para la obtención de los productos
de PCR que sirvieron para la obtención de los clones parciales
necesarios para la posterior síntesis de la polisonda. En negrita
aparecen los sitios de restricción utilizados en cada caso para
clonar los fragmentos.
Fig. 2: Clon que contiene los seis fragmentos
genómicos en tandem. Para la síntesis de la polisonda no radiactiva
se lineariza el plásmido con el enzima de restricción XhoI y
se transcribe con la T7 RNA polimerasa que incorporará uridina
marcada con digoxigenina. La transcripción se llevó a cabo según la
descripción previa de Más, P., Sánchez-Navarro,
J.A., Sánchez-Pina, M.A., and Pallás, V. (1993).
Chemiluminescent and colorigenic detection of Cherry leaf roll
virus with digoxigenin-labeled RNA probes. J.
Virol. Methods 45, 93-102. y Pallás, V., Más,
P. and Sánchez-Navarro, J.A., (1998a). Detection of
plant RNA viruses by non-isotopic
dot-blot hybridization. In: Plant virus
protocols: from virus isolation to transgenic resistance.
Methods in Molecular Virology. Humana Press, Totowa. 81,
461-468.
Fig. 3: Análisis de la sensibilidad de la
polisonda mediante un ensayo tipo dot-blot. Se
realizaron tres diluciones de extractos de RNA total infectados con
cada uno de los virus y se prepararon siete membranas de las cuales
seis fueron hibridadas con las sondas individuales y una con la
polisonda. Tal y como aparece en la figura, la sensibilidad es la
misma tanto en la detección individualizada como en la detección
múltiple.
Fig. 4: Análisis tipo dot-blot
realizado con muestras de campo en el que ha sido utilizada la
polisonda para la evaluación de su estado sanitario.
Ejemplo
1
Se clonaron en tandem en un mismo vector
plasmídico fragmentos del genoma de seis virus diferentes que
afectan a los frutales de hueso; el virus de los anillos
necróticos de los Prunus (PNRSV), el virus del mosaico del
manzano (ApMV), el virus del enanismo del ciruelo (PDV)
el virus de los arabescos del ciruelo americano (APLPV),
el virus de las manchas cloróticas del manzano (ACLSV) y el
virus de la sharka (PPV). Esta estrategia novedosa requiere
una única reacción de transcripción que posibilita la síntesis a
partir de dicho clon de lo que hemos denominado "polisonda"
que permite la detección simultánea de todos los virus cuya
secuencia está en ella representada.
Para la obtención de la polisonda se
amplificaron mediante PCR fragmentos genómicos de alrededor de 200
pares de bases correspondientes a la región
amino-terminal de la proteína de cubierta de los
seis virus principales que afectan a frutales de hueso: cuatro
correspondientes al género de los Ilarvirus; el virus de los
anillos necróticos de los Prunus (PNRSV), el virus del
mosaico del manzano (ApMV), el virus del enanismo del
ciruelo (PDV) y el virus del los arabescos del ciruelo
americano (APLPV); uno del género de los Trichovirus; el
virus de las manchas cloróticas del manzano (ACLSV) y el virus
de la sharka (PPV) perteneciente al género de los
Potyvirus.
Para la realización de cada PCR se diseñaron
cebadores específicos de los virus a analizar, con los sitios de
restricción correspondientes que aparecen detallados en la Fig. 1,
SEQ ID 27 a 38. Tras realizar las subclonaciones necesarias se
obtuvo un clon con los seis fragmentos genómicos en tandem (Fig.
2). El primero correspondería a 178 pares de bases (pb) del PNRSV
(SEQ ID 1), el segundo a 174 pb del ApMV (SEQ ID 2), el tercero a
221 pb del PDV (SEQ ID 3), el cuarto a 490 pb del ACLSV (SEQ ID 4),
el quinto a 175 pb del PPV (SEQ ID 5) y el último a 137 pb del
APLPV (SEQ ID 6).
Para la síntesis de la polisonda, dicho clon fue
linearizado con el enzima de restricción XhoI y transcrito
con la T7 RNA polimerasa utilizándose uridina marcada con
digoxigenina. La transcripción se llevó a cabo según la descripción
previa de Más, P., Sánchez-Navarro, J.A.,
Sánchez-Pina, M.A., and Pallás, V. (1993).
Chemiluminescent and colorigenic detection of Cherry leaf roll
virus with digoxigenin-labeled RNA probes.
J. Virol. Methods 45, 93-102. y Pallás, V.,
Más, P. and Sánchez-Navarro, J.A., (1998a).
Detection of plant RNA viruses by non-isotopic
dot-blot hybridization. In: Plant virus
protocols: from virus isolation to transgenic resistance.
Methods in Molecular Virology. Humana Press, Totowa. 81,
461-468. Alternativamente, se pueden sintetizar
sondas DNA mediante una reacción de PCR utilizando los oligos
universal y reverso y uridina marcada con digoxigenina, tal y como
indica el protocolo del fabricante del marcador.
El proceso de extracción de RNAs de la planta
así como la detección de la infección viral mediante el uso de la
polisonda es común en todos los ejemplos.
Para la extracción de los RNAs de la planta
existen muchos métodos que utilizan disolventes orgánicos tóxicos
como por ejemplo el fenol, lo que resulta un inconveniente para los
laboratorios de diagnosis en los que se procesan un gran número de
muestras. En nuestro laboratorio utilizamos para la preparación de
los extractos a analizar un método que fue descrito en principio
para la extracción de DNA genómico (Dellaporta, S., Woods, H. and
Hicks, J. (1983). A plant DNA mini-preparation:
version II. Plant Mol. Biol. Rep. 1, 19-21), más
tarde fue puesto a punto para la obtención de extractos ricos en
RNAs viroidales (Pallas, V., Navarro, A. y Flores, R. (1987).
Isolation of viroid-like RNA from hop different
from hop stunt viroid. J. Gen. Virol. 68,
3201-3205.), purificación de RNAs de doble cadena
(De Paulo, J. and Powell, C. (1995) Extraction of double stranded
RNA from plant tissues without the use of organic solvents. Plant.
Dis. 79, 246-248.) y finalmente para la detección
de viroides (Astruc, N., Marcos, J.F., Macquaire, G., Candresse,
T., Pallás, V. (1996). Studies on the diagnosis of Hop stunt viroid
in fruit trees: Identification of new hosts and application of a
nucleic acid extraction procedure based on
non-organic solvents. Eur. J. Plant Pathol. 102,
837-846.; Cañizares, M.C., Marcos, J.F. and Pallás,
V. (1998). Studies on the incidence of Hop stund viroid in apricot
trees (Prunus armeniaca) by using an easy and short
extraction method to analyze a large number of samples. Acta
Hortic. 472, 581-585).
Se homogenizaron 0.5 gramos de hoja o fruto en 5
ml de tampón de extracción (100 mM Tris-HCI pH8.0,
50 mM EDTA pH 7.0, 500 mM NaCl, 10 mM
2-mercaptoetanol). A l ml de homogenado se le
añadieron 50 \mul de SDS 20% y se incubaron 20 minutos a 65°C. A
continuación se añadieron 250 \mul de acetato potásico 5 M y se
incubó 20 minutos a 0°C. Seguidamente se centrifuga 15 minutos a
12000 g y el sobrenadante se precipitó con 2.5 volúmenes de etanol a
-20°C. Se centrifugó de nuevo 15 minutos a 12000 g y el pellet se
resuspendió en 40-50 \mul de agua estéril.
Antes de aplicar la muestra en la membrana es
necesario desnaturalizarla. Para ello, a 5 \mul de muestra se le
añadieron 3 \mul de SSC 20x y 2 \mul de formaldehído 37% y se
incubó a 60°C durante 15 minutos. Se aplicaron 5 \mul en la
membrana de nylon y los RNAs se fijaron con un UV crosslinker (700 x
100 \muJ/cm^{2}). A continuación se incubó la membrana
inicialmente con un tampón de hibridación (50% formamida, SSC 5x,
0.1% N-Laurosylsarcosine, 0.02% SDS, Blocking
reagent solution) a 68°C durante 1 hora y posteriormente con la
sonda diluida en dicho tampón a 68°C (sonda RNA) o 50°C (sonda DNA)
y durante 5 horas mínimo. Transcurrido este tiempo la membrana se
lavó dos veces durante 5 minutos en SSC 2X/SDS 0.1% a temperatura
ambiente seguido de dos lavados de 15 minutos a 68°C en SSC
0.1X/SDS 0.1%. El resto del proceso se realizó a temperatura
ambiente. A continuación la membrana se incubó 5 minutos en tampón
de lavado (TL: 0.1 M ácido maleico pH 7.5, 0.15 M cloruro
sódico, 0.3% Tween 20). Seguidamente se bloqueó la membrana durante
30 minutos con 0.1 M ácido maleico pH 7.5, 0.15 M cloruro sódico +
Blocking 1X y luego se incubó con el anticuerpo durante 30 minutos
(Anti digoxigenin-AP Fab fragments (1:10000)).
Finalmente la membrana se lavó con TL dos
veces durante 15 minutos, 5 minutos con un tampón que contenía 0.1
M Tris pH 9.5, 0.1 M NaCl y se incubó con el sustrato disuelto en
este mismo tampón 5 minutos, se eliminó el exceso de líquido y la
membrana se expuso frente a una película autorradiográfica durante
15-25 minutos.
Seguidamente se realizaron las pruebas
pertinentes para comprobar que nuestra polisonda era al menos igual
de sensible que cada una de las sondas individuales. Para ello, se
llevaron a cabo análisis tipo dot-blot utilizando
muestras infectadas de manera individual con cada uno de los virus a
detectar. Los resultados mostrados en la Fig. 3 ponen claramente de
manifiesto que la polisonda obtenida como resultado de la presente
invención es capaz de reconocer todos y cada uno de los seis virus
representados en ella tras el análisis de una infección múltiple
simulada. El análisis de muestras de albaricoquero recogidas al
azar de plantaciones comerciales (Fig. 4) demuestra la utilidad de
la polisonda en la detección de cualquiera de los virus
representados en ella.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El mantenimiento de la biodiversidad es un
problema importante que ha ido adquiriendo relevancia de forma
progresiva en nuestra sociedad. La conservación de la
biodiversidad, puede aplicarse a tres niveles de organización:
génica, organísmica y ecológica. Sin embargo, y a pesar de los
avances de la ingeniería genética, de momento los genes no se
conservan de forma individual sino formando parte de organismos,
poblaciones o ecosistemas.
A pesar de que se asume de forma universal que
el método más efectivo y eficiente para la conservación es la
protección de los habitats también está reconocido que las técnicas
de conservación ex situ complementan a las anteriores
almacenando germoplasma representativo de las poblaciones a largo
plazo y aportando una serie de ventajas claras tales como el control
directo sobre el material, fácil accesibilidad y
disponibilidad.
Una componente fundamental de la conservación
ex situ serían los métodos de propagación y cultivo en los
que el material almacenado se utiliza en operaciones de
conservación in vivo. Es muy importante por esto un
seguimiento del estado sanitario de los bancos de germoplasma y para
ello es necesario tener puesto a punto métodos de detección
sensibles, rápidos y económicos. Es obvio para todo aquel experto
en el área de la presente invención que la evaluación del estado
sanitario de los bancos de germoplasma de árboles frutales podría
llevarse a cabo mediante el uso de la polisonda descrita en el
ejemplo anterior. Para otros virus el diseño sería específico para
las secuencias de interés en cada caso, pero las condiciones de
hibridación y detección serían equivalentes.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
La detección de OGM en cultivos comerciales
representa una de las principales inquietudes tanto en la cadena de
producción alimenticia como en los diferentes organismos de control
fitosanitario (patentes, legalidad, etc). La incorporación de
transgenes en tejidos vegetales se ha venido realizando mediante el
uso de tanto unas pocas secuencias
promotoras-terminadoras así como de un reducido
número de genes de resistencia a antibióticos.
La utilización de POLISONDAS permite detectar
potencialmente todos los organismos transgénicos al incorporar en
un solo vector plasmídico las diferentes secuencias de ácidos
nucleicos utilizadas en el proceso de generación de OGM.
Para la realización de la POLISONDA se clonarían
en tandem varios fragmentos genómicos correspondientes al promotor
35S del virus de mosaico de la coliflor (SEQ ID 7). Oligo sentido:
5' TTGAAGATGCCTCTGCCGAC 3' (SEQ ID 15); oligo antisentido:
5'-GTCCTCTCCAAATGAAATG-3' (SEQ ID
15)), la secuencia de poliadenilación del gen de la síntesis de
nopalina (Terminador NOS, SEQ ID 8). oligo sentido:
5'-GATCGTTCAAACATTTGGCA-3' SEQ ID
17; Oligo antisentido:
5'-GATCTACTAACATAGATG-3', SEQ ID 18)
y los genes de resistencia a ampicilina
(beta-lactamasa, SEQ ID 9. Oligo sentido;
5'-GTTGAGTACTCACCAGTCAC-3' SEQ ID
19; oligo antisentido: 5'-AGCTCCGGTTCCC
AACGATC-3', SEQ ID 20), kanamicina/neomicina (SEQ
ID 10. Oligo sentido: 5'-CAA
GACGAGGCAGCGCGGCT-3'SEQ ID 21; oligo antisentido: 5'-TCAAGCGTATGCAGCCGCCG-3', SEQ ID 22) y tetraciclina (SEQ ID 11 y SEQ ID 12. Oligo sentido: 5'-ATGCAGGAGTCGCATAAGGG-3' SEQ ID 39; oligo antisentido: 5'-ATCGTCGCGCTCCAG CGAAA-3' SEQ ID 40). Los fragmentos amplificados por PCR se introducirían en un mismo vector plasmídico utilizando sitios de restricción apropiados permitiendo, una vez fusionados directa o indirectamente todos los fragmentos, la síntesis de una única sonda de RNA o DNA.
GACGAGGCAGCGCGGCT-3'SEQ ID 21; oligo antisentido: 5'-TCAAGCGTATGCAGCCGCCG-3', SEQ ID 22) y tetraciclina (SEQ ID 11 y SEQ ID 12. Oligo sentido: 5'-ATGCAGGAGTCGCATAAGGG-3' SEQ ID 39; oligo antisentido: 5'-ATCGTCGCGCTCCAG CGAAA-3' SEQ ID 40). Los fragmentos amplificados por PCR se introducirían en un mismo vector plasmídico utilizando sitios de restricción apropiados permitiendo, una vez fusionados directa o indirectamente todos los fragmentos, la síntesis de una única sonda de RNA o DNA.
La síntesis de la polisonda se realizaría
linearizando con el enzima de restricción adecuada y transcribiendo
con la T7 o T3 RNA polimerasa (sondas RNA) o mediante una reacción
de PCR utilizando los oligos directo y reverso (sonda DNA)
utilizándose en ambos casos, uridina marcada con digoxigenina. La
transcripción o reacción de PCR, procesado de muestras, hibridación
y revelado de las membranas se llevó a cabo según la descripción
hecha en el ejemplo 1: "Detección de los seis principales
virus que afectan a frutales de hueso en cultivos
comerciales".
Los viroides son los patógenos de plantas más
pequeños que se conocen. Su genoma está constituido por una única
cadena de RNA de doble cadena con un tamaño comprendido entre 246 y
399 residuos de nucleótidos que no codifican para ninguna proteína.
La incapacidad de expresar componentes proteicos ha condicionado
significativamente los métodos de detección, impidiendo la
utilización de las tecnologías de análisis serológicas. En este
sentido, la detección de patologías de naturaleza viroidal se han
realizado mediante bioensayos y métodos moleculares tales como la
RT-PCR o la hibridación molecular. Esta última
tecnología se está implantando como técnica rutinaria de análisis
de viroides dada su fiabilidad, economía, sensibilidad y capacidad
de análisis (referencia).
En la presente invención, se propone incorporar
el concepto de POLISONDA para la detección de los principales
viroides de frutales: el viroide del mosaico latente del
melocotonero (Peach latent mosaic viroid, PLMVd) y el
viroide del enanismo del lúpulo (Hop stunt viroid, HSVd).
Para la realización de la POLISONDA se clonarían
en tandem los fragmentos genómicos correspondientes al PLMVd (SEQ
ID 13. Oligo sentido:
5'-ATTAAAGACCTCTCAGCCCC-3', SEQ ID
23; oligo antisentido: 5'-CA
CACCCCCCTCG GAACCAA-3' SEQ ID 24) y el HSVd (SEQ ID 14. Oligo sentido: 5'-TTACCTGAGAAAG
GAGCCCC-3' SEQ ID 25; oligo antisentido: 5'-CCAGGAGAAGGTAAAAGAAG-3'SEQ ID 26) en un mismo vector plasmídico utilizando sitios de restricción apropiados.
CACCCCCCTCG GAACCAA-3' SEQ ID 24) y el HSVd (SEQ ID 14. Oligo sentido: 5'-TTACCTGAGAAAG
GAGCCCC-3' SEQ ID 25; oligo antisentido: 5'-CCAGGAGAAGGTAAAAGAAG-3'SEQ ID 26) en un mismo vector plasmídico utilizando sitios de restricción apropiados.
La síntesis de la polisonda se realizaría
linearizando con el enzima de restricción adecuado y transcribiendo
con la T7 o T3 RNA polimerasa (sondas RNA) o mediante una reacción
de PCR utilizando los oligos directo y reverso (sonda DNA)
utilizándose en ambos casos, uridina marcada con digoxigenina. La
transcripción o reacción de PCR, procesado de muestras, hibridación
y revelado de las membranas se llevó a cabo según la descripción
hecha en la sección de "Detección de los seis principales virus
que afectan a frutales de hueso en cultivos comerciales".
<110> Consejo Superior de Investigaciones
Científicas
\hskip1cmPALLÁS BENET, VICENTE
\hskip1cmHERRANZ GORDO, Mª CARMEN
\hskip1cmAPARICIO HERRERO, FREDERIC
\hskip1cmSÁNCHEZ-NAVARRO, JESÚS ANGEL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTO PARA LA DETECCIÓN
SIMULTÁNEA DE SECUENCIAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS MEDIANTE EL USO DE
POLISONDAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> polisonda2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 835
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cauliflower mosaic virus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 253
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Poliadeninalition signal of nopaline
synthase gene
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> polyA_signal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(253)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> poli adenilation signal of nopaline
synthase
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 861
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> beta lactamase, ampicillin
resistance gene
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 795
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Kanamicine resitance gene
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1920
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Tetracycline resistance gene (O)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1920
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Tetracycline resistance gene (M)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cauliflower mosaic virus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sense primer for 35S promoter
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cauliflower mosaic virus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> antisense primer for 35S
promoter
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer of poliadeninalition signal
of nopaline synthase gene
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sense primer of poliadeninalition
signal of nopaline synthase gene (NOS terminator)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer of poliadeninalition signal
of nopaline synthase gene
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> antisense primer of
poliadeninalition signal of nopaline synth gene (NOS
terminator)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer of beta lactamase, ampicillin
resistance gene
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sense primer of beta lactamase,
ampicillin resistance gene
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer of beta lactamase, ampicillin
resistance gene
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antisense primer of beta lactamase,
ampicillin resistance gene
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer of Kanamicine resitance
gene
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sense primer of Kanamicine resitance
gene
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer of Kanamicine resitance
gene
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antisense primer of Kanamicine
resitance gene
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Tetracycline resistance gene
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sense primer for Tetracycline
resistance gene
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<400> 15
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\hskip0.8cm
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<210> 16
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Artificial sequence
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<220>
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<223> Tetracycline resistance gene
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<222> (1)..(20)
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<223> Antisense primer for Tetracycline
resistance gene
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<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.8cm
Claims (15)
1. Procedimiento para la detección simultánea de
diferentes secuencias de ácidos nucleicos caracterizado por
el uso de polisondas con las siguientes características:
- a.
- comprenden más de un fragmento de DNA/RNA (al menos dos),
- b.
- los fragmentos de a) se hayan fusionados en tandem o flanqueados por ciertas secuencias separadora
- c.
- sintetizadas en una única sonda de DNA o RNA, a partir de un único vector plasmídico, y
- d.
- su detección se realiza mediante hibridación complementaria con secuencias de ácidos nucleicos corresponden a transgenes, sus secuencias de control, genes o marcadores específicos.
2. Procedimiento para la detección simultánea de
diferentes secuencias de ácidos nucleicos según la reivindicación 1
caracterizado porque los fragmentos de DNA/RNA fusionados
tienen cada uno al menos 50 pares de bases, preferentemente aunque
200 pares de bases para obtener una mayor sensibilidad.
3. Procedimiento para la detección simultánea de
diferentes secuencias de ácidos nucleicos según las
reivindicaciones 1 y 2 caracterizado porque la polisonda es
capaz de detectar las secuencias representativas de más de un virus
presente en un grupo de plantas.
4. Procedimiento para la detección simultánea de
diferentes secuencias de ácidos nucleicos según la reivindicación 3
caracterizado porque la polisonda es capaz de detectar las
secuencias representativas de los principales virus que afectan a
frutales de hueso en cultivos comerciales.
5. Procedimiento para la detección simultánea de
diferentes secuencias de ácidos nucleicos según las
reivindicaciones 1 y 2 caracterizado porque la polisonda
detecta secuencias de nucleótidos que controlan la expresión o
selección de transgenes, los propios trasgenes o marcadores o genes
de específicos que permitan la autentificación o identificación
específica.
6. Procedimiento para la detección simultánea de
diferentes secuencias de ácidos nucleicos según las
reivindicaciones 1 a 5 caracterizado porque la polisonda es
capaz de detectar un transgen mediante la detección de la presencia
de las secuencias necesarias para su expresión o selección como por
ejemplo las secuencias representativas del promotor 35S del virus
del mosaico de la coliflor (SEQ ID 1), la secuencia de
poliadenilación del gen de la síntesis de nopalina (SEQ ID 2) o los
genes de resistencia a ampicilina (SEQ ID 3), kanamicina (SEQ ID 4)
y tetraciclina (SEQ ID 5 Y SEQ ID 6).
7. Procedimiento para la detección simultánea de
diferentes secuencias de ácidos nucleicos según la reivindicación 8
caracterizado porque la polisonda se realiza a partir de la
pareja de oligonucleótidos específicos del promotor 35S del virus
del mosaico de la coliflor SEQ ID 7 y 8, la pareja de
oligonucleótidos específicos del la secuencia de poliadenilación
del gen de la síntesis de nopalina SEQ ID 9 y 10, la pareja de
oligonucleótidos específicos de los genes de resistencia a
ampicilina SEQ ID 17 y 18, kanamicina SEQ ID 19 y 20 y tetraciclina
SEQ ID 39 y 40.
8. Secuencia de nucleótidos denominada polisonda
caracterizada porque según las reivindicaciones 1 a 7 está
constituida por más de un fragmento de DNA/RNA (sonda individual)
fusionados en tandem o flanqueados por ciertas secuencias
separadoras, en un único vector plasmídico, que mediante
hibridación complementaria detectan al menos una secuencia de
ácidos nucleicos correspondiente a transgenes, sus secuencias de
control, genes o marcadores específicos.
9. Secuencia de nucleótidos denominada polisonda
según la reivindicación 8 caracterizada porque está
constituida por fragmentos fusionados de DNA/RNA, cada uno con un
tamaño mínimo de 50 pares de bases, preferentemente 200 pares de
bases para obtener una mayor sensibilidad.
10. Secuencia de nucleótidos denominada
polisonda según las reivindicaciones 8 a 9 caracterizada
porque incluye las secuencias capaces de detectar al promotor 35S
del virus del mosaico de la coliflor, la secuencia de
poliadenilación del gen de la síntesis de nopalina y los genes de
resistencia a ampicilina, kanamicina y tetraciclina.
11. Secuencia de nucleótidos denominada
polisonda según las reivindicaciones 8 a 10 caracterizada
porque incluye las secuencias capaces de detectar al promotor 35S
del virus del mosaico de la coliflor (SEQ ID 1), la secuencia de
poliadenilación del gen de la síntesis de nopalina (SEQ ID 2) y los
genes de resistencia a ampicilina (SEQ ID 3), kanamicina (SEQ ID 4)
y tetraciclina (SEQ ID 5 y SEQ ID 6).
12. Kit de detección de secuencias de
nucleótidos de muestras vegetales o animales caracterizado
por contener las secuencias y realizarse mediante el procedimiento
indicados en las reivindicaciones 1 a 11.
\newpage
13. Uso del procedimiento según la
reivindicaciones 1 a 12 para el control de contaminaciones por
transgenes que contenga secuencias de ácidos nucléicos
diferenciadoras tanto en muestras vegetales como animales.
14. Uso del procedimiento según las
reivindicaciones 1 a 13 para el control de contaminaciones por
transgenes de plantas en viveros, empresas productoras de plantas
madre y centros de certificación alimentaria o sanitaria.
15. Uso del procedimiento según la
reivindicaciones 1 a 14 para el control de organismos genéticamente
modificados en empresas productoras y centros de certificación.
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GERMINI A. et al. "{}Development of a seven-target multiplex PCR for the simultaneous detection of transgenic soybean and maize in feeds and foods"{}. J. Agric. Food. Chem. 02.06. 2004; Vol. 52, N$^{o}$. 11, páginas 3275-80. * |
MAKSIMOVIC V. et al. "{}PCR detection of genetically modified soybean and maize in food/feed stuffs"{}. Acta Veterinaria. 2002. Vol. 52; N$^{o}$. 4; páginas 201-210. * |
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