CN101928786B

CN101928786B - 一种辅助鉴定李痘病毒的试剂盒及其应用

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Publication number: CN101928786B
Application number: CN2010102541742A
Authority: CN
Inventors: 李明福; 高雅红; 王进忠; 李桂芬; 张永江
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2010-08-13
Filing date: 2010-08-13
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2030-08-13
Also published as: CN101928786A

Abstract

本发明公开了一种辅助鉴定李痘病毒的试剂盒及其应用。本发明提供的试剂盒，包括特异引物对和/或特异探针；特异引物对为序列1和序列2所示DNA组成的引物对；所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列3所示。本发明提供的试剂盒，可以快速、准确、稳定、定量检测出李痘病毒，根据是否产生荧光信号，可以判断样品中是否含有李痘病毒，根据产生荧光信号值的大小，即可判断样品中李痘病毒含量的高低。本发明的试剂盒具有特异性强、准确性高、检测过程操作简便、检测所需时间短等优点，适合农业部门的各检疫检查站、各口岸检验检疫局、植物病毒研究机构等应用。

Description

一种辅助鉴定李痘病毒的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种辅助鉴定李痘病毒的试剂盒及其应用。

背景技术

李痘病毒(Plum pox virus，PPV)是马铃薯Y病毒属成员，病毒粒子呈弯曲杆状，大小为700nm×11nm，是我国的检疫性有害生物。自然条件下，PPV寄主范围广，可侵染46种木本植物和150种草本植物，李、桃、杏和樱桃等多种核果类果树均可受害。李痘病毒分布范围极广，在美国、加拿大、日本、埃及、印度、叙利亚、土耳其、智利、及欧洲许多国家均有报道。李痘病毒可经蚜虫以非持久性方式传播，扩散速度快，在短时间内即可能给国内整个核果类产业的发展带来灾难性后果。加强该病毒的检疫监测，对于防止PPV传入具有极为重要的意义。

目前，检测PPV的常用方法主要是ELISA、普通RT-PCR、多重PCR等方法，但这些方法有的存在假阳性问题，有的难以确定起始模板的拷贝数。本领域迫切需要特异性更强、灵敏度更高、方便准确的检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种辅助鉴定李痘病毒的试剂盒及其应用。

本发明提供的辅助鉴定李痘病毒的试剂盒，包括特异引物对；所述特异引物对为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对。

所述试剂盒还可包括特异探针；所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列3所示。所述特异探针可为TaqMan探针，核苷酸序列如序列表的序列3所示，5’末端连接有荧光报告基团FAM，3’末端连接有荧光淬灭基团Eclipse。

特异引物对如下：

上游引物(F)：5’-ACTACAGCCTCGCCAGATATG-3’(序列表的序列1)；

下游引物(R)：5’-TTTCCATCCAAGCCAAATAAACG-3’(序列表的序列2)。

特异探针(TaqMan探针)(核苷酸序列为序列表的序列3)如下：

5’-(FAM)CTCAATGCTGCTGCCTTCATCTGGA(Eclipse)-3’。

所述试剂盒还可以包括其它PCR常规试剂、RNA提取试剂和反转录常规试剂等。

所述试剂盒可用于辅助鉴定李痘病毒。

本发明还保护一种辅助鉴定李痘病毒的方法，包括如下步骤：以待测病毒的cDNA为模板，用特异引物对进行PCR，检测PCR产物；如果得到139bp的PCR产物，则待测病毒为候选的李痘病毒；如果没有得到139bp的PCR产物，则待测病毒为候选的非李痘病毒；所述特异引物对为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对。所述待测病毒可为李痘病毒(PPV)、马铃薯X病毒(PVX)或马铃薯Y病毒(PVY)

本发明还保护一种检测待测样本中是否含有李痘病毒的方法，包括如下步骤：以待测样本的cDNA为模板，用特异引物对进行PCR，检测PCR产物；如果得到139bp的PCR产物，则待测样本中含有李痘病毒；如果没有得到139bp的PCR产物，则待测样本中不含有李痘病毒；所述特异引物对为序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列组成的引物对。

本发明还提供另一种检测待测样本中是否含有李痘病毒的方法，包括如下步骤：以待测样本的cDNA为模板，用特异引物对和特异探针进行实时荧光PCR，根据扩增曲线判断待测样本中是否含有李痘病毒；所述特异引物对为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述特异探针为TaqMan探针，核苷酸序列如序列表的序列3所示，5’末端标记有荧光报告基团FAM，3’末端标记有荧光淬灭基团Eclipse。实时荧光定量PCR技术具有定量、高特异性、高敏感性、高通量等优点，非常适用于病毒的检测。如果扩增曲线均处于阈值以下，待测样本不含有李痘病毒；如果部分扩增曲线处于阈值以上，待测样本含有李痘病毒。

本发明还保护一种辅助检测李痘病毒的特异引物对，为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对。

本发明还保护一种辅助检测李痘病毒的特异探针，所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列3所示。所述探针具体可为TaqMan探针。

采用本发明提供的试剂盒，用引物对与特异性TaqMan探针进行实时荧光PCR检测，根据是否产生荧光信号，可以判断样品中是否含有李痘病毒，根据产生荧光信号值的大小，即可判断样品中李痘病毒含量的高低。

与现有技术比较，本发明的优点如下：

1)检测结果准确性高。在开发与检验特异引物对与特异探针的过程中，检测准确率达95％以上。

2)检测灵敏度高。至少能检测到160个拷贝的病毒RNA。

3)可以定量检测。在定性检测李痘病毒的基础上，可以得到样本中病毒的准确含量。

4)检测方法安全。不需要进行电泳检测，避免了溴化乙啶以及一些染料对环境的污染与人体的损害。

5)检测结果易于判读。用引物对与特异性TaqMan探针进行实时荧光PCR检测，根据是否产生荧光信号，可以判断样品中是否含有李痘病毒；根据产生荧光信号值的大小，即可判断样品中李痘病毒含量的高低。

6)检测仪器简便。仅需实时荧光PCR仪，无需电泳仪。适合在口岸检验检疫局进行推广。

本发明公开了一种含有特异引物对和特异探针的试剂盒，可以快速、准确、稳定、定量鉴定出李痘病毒。根据是否产生荧光信号，可以判断样品中是否含有李痘病毒，根据产生荧光信号值的大小(扩增曲线)，即可判断样品中李痘病毒含量的高低。本发明的试剂盒具有特异性强、准确性高、检测过程操作简便(仅需一台实时荧光PCR仪即可进行检测，无需进行电泳操作)、检测所需时间短(从李痘病毒的提取到检测结果出现仅需3个小时)等优点，适合农业部门的各检疫检查站、各口岸检验检疫局、植物病毒研究机构等应用。

附图说明

图1为PPV荧光定量的灵敏度；1-6依次为：1.6×10⁷，1.6×10⁶，1.6×10⁵，1.6×10⁴，1.6×10³，1.6×10²。

图2为PPV荧光定量的特异性；A：PPV；B：PVY、PVX和空白对照的叠加。

图3为PPV荧光定量的重复性；1-5依次为：1.6×10⁷，1.6×10⁶，1.6×10⁵，1.6×10⁴，1.6×10³。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实时荧光PCR仪为Rotor-Gene 3000PCR扩增仪；Reverse Transcription SystemA3500和dNTPs购于Promega公司；实时荧光PCR所用试剂、RNA提取试剂盒购自天根公司；Taq酶、连接酶、pMD18-T载体、大肠杆菌DH5α和DNA Marker DL2000购自TaKaRa；引物与探针由大连宝生物技术公司合成。李痘病毒(PPV)：购自ATCC，产品目录号为PVAS-709；马铃薯X病毒(PVX)：购自ATCC，产品目录号为PV-197；马铃薯Y病毒(PVY)：购自ATCC，产品目录号为PV-50；ATCC即美国标准菌种收藏所(http://www.atcc.org/)。

实施例1、试剂盒的制备

试剂盒由特异引物对和特异探针组成。

特异引物对如下：

上游引物(F)：5’-ACTACAGCCTCGCCAGATATG-3’(序列表的序列1)；

下游引物(R)：5’-TTTCCATCCAAGCCAAATAAACG-3’(序列表的序列2)。

该特异引物对针对序列表的序列4或序列5所示李痘病毒CP基因自5’末端第677-815位核苷酸(139bp)。

特异探针(TaqMan探针)(核苷酸序列为序列表的序列3)如下：

5’-(FAM)CTCAATGCTGCTGCCTTCATCTGGA(Eclipse)-3’。

用实施例1的试剂盒进行实施例2、实施例3和实施例4的测定。

实施例2、试剂盒的灵敏度测定

一、标准曲线的制作

1、以PPV的总RNA为模板，用PPV-F和PPV-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PPV-F：5’-CCACCTCCAGTCATACAG-3’；

PPV-R：5’-AGATACCGAGACCACTACAC-3’。

PPV-F和PPV-R的靶标序列为序列表的序列4所示的李痘病毒CP基因全序列DNA。

2、将步骤1的PCR扩增产物进行电泳，切胶回收，得到纯化后DNA。

3、将纯化的DNA连接到pMD18-T载体上，得到连接产物。

4、将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选重组子，提取质粒进行PCR鉴定和测序，结果表明得到了含有序列4所示DNA的重组质粒以及含有重组质粒的重组菌。

5、用分光光度计测定重组菌菌液的OD260nm值，并换算质粒浓度(拷贝数/μL)，-20℃保存作为质粒标准品备用。

6、将质粒标准品进行10倍梯度稀释，各个稀释液分别作为模板，用实施例1制备的试剂盒进行实时荧光PCR。实时荧光PCR反应体系：2.5×real Master Mix 10μl，20×Probe Enhancer solution 1.25μl，10mmol/L上、下游引物各0.5μL，20mmol/L特异探针0.25μL，模板2μL，加ddH₂O至总体积为25μL。PCR程序：94℃15min；55℃20s，68℃30s，循环40次。

7、根据各个稀释度的稀释液的扩增曲线制作标准曲线，标准曲线的函数为y＝-3.643x+37.576；y为-log₁₀基因拷贝数，x为Ct值，Ct值即每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。

二、试剂盒的灵敏度测定

1、病毒RNA的提取

称取0.1g发病本生烟叶片，采用植物病毒核酸Trizol提取试剂盒提取病毒RNA，得到病毒RNA液。用NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer定量分析仪测定其浓度。

2、cDNA的合成

将病毒RNA进行10倍梯度稀释，分别合成cDNA，每个梯度重复3次。

cDNA的合成体系(20.0μL)如下：

DEPC-H₂O 7.8μL

10×buffer 2.0μL

MgCl₂(25mmol/L) 4.0μL

dNTP(10mmol/L) 1.0μL

随机六聚体引物 2.0μL

RNasin(44U/μL) 0.5μL

病毒RNA 2.0μL

AMV Reverse Transcriptase(22U/μL) 0.7μL

合成体系混匀后42℃水浴1h，95℃灭活5min，冰上放置待用。

3、灵敏度测定

将步骤2的cDNA液作为模板，用实施例1的试剂盒进行实时荧光PCR。实时荧光PCR反应体系和PCR程序同步骤一的6。

结果如图1所示。结果表明，实施例1的试剂盒稳定性强，灵敏度高，至少可以检测到160个病毒拷贝。

实施例3、试剂盒的特异性测定

一、病毒RNA的提取

分别提取三种病毒(PPV，PVX，PVY)的总RNA：采用RNA提取试剂盒(植物病毒核酸Trizol提取试剂盒)提取病毒总RNA，得到病毒RNA液；用NanoDrop ND-2000Spectrophotometer定量分析仪测定其浓度，最终浓度均统一为1000ng/ul。

二、cDNA的合成

分别合成各个病毒的cDNA，cDNA的合成体系同实施例2的步骤二的2。

三、实时荧光PCR扩增

将步骤二的cDNA液作为模板，用实施例1的试剂盒进行实时荧光PCR。实时荧光PCR反应体系和PCR程序同实施例1的步骤一的6。

结果见图2。PPV出现典型的扩增曲线，Ct值读数为17.25，判为阳性。PVX和PVY的扩增曲线均在所设定的阈值线之下，判为阴性。可见，采用本发明的试剂盒进行检测具有很强的检测特异性。

实施例4、试剂盒的重复性测定

一、病毒RNA的提取

分别将实施例2的步骤二得到的10倍梯度稀释的各浓度的cDNA液(分别含有1.6×10⁷个拷贝数、1.6×10⁶个拷贝数、1.6×10⁵个拷贝数、1.6×10⁴个拷贝数、1.6×10³个拷贝数；每个浓度3次重复)作为模板，用实施例1的试剂盒进行实时荧光PCR。实时荧光PCR反应体系和PCR程序同实施例1的步骤一的6。

结果见图3。结果显示，表明该方法各梯度的变异系数均小于0.6％；具有较好的组内重复性。

Claims

1.一种辅助鉴定李痘病毒的试剂盒，包括特异引物对；所述特异引物对为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括特异探针；所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列3所示。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述特异探针为TaqMan探针，其5’末端连接有荧光报告基团FAM，其3’末端连接有荧光淬灭基团Eclipse。

4.权利要求1至3中任一所述的试剂盒在辅助鉴定李痘病毒中的应用。

5.一种辅助鉴定李痘病毒的方法，包括如下步骤：以待测病毒的cDNA为模板，用特异引物对进行PCR，检测PCR产物；如果得到139bp的PCR产物，则待测病毒为候选的李痘病毒；如果没有得到139bp的PCR产物，则待测病毒为候选的非李痘病毒；所述特异引物对为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述待测病毒为李痘病毒、马铃薯X病毒或马铃薯Y病毒。

7.一种检测待测样本中是否含有李痘病毒的方法，包括如下步骤：

以待测样本的cDNA为模板，用特异引物对进行PCR，检测PCR产物；如果得到139bp的PCR产物，则待测样本中含有李痘病毒；如果没有得到139bp的PCR产物，则待测样本中不含有李痘病毒；所述特异引物对为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对。

8.一种检测待测样本中是否含有李痘病毒的方法，包括如下步骤：以待测样本的cDNA为模板，用特异引物对和特异探针进行实时荧光PCR，根据扩增曲线判断待测样本中是否含有李痘病毒；所述特异引物对为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述特异探针为TaqMan探针，核苷酸序列如序列表的序列3所示，5’末端连接有荧光报告基团FAM，3’末端连接有荧光淬灭基团Eclipse。

9.一种辅助检测李痘病毒的特异引物对，为序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列组成的引物对。