ES2308809T3 - Agentes preventivos y/o remedios que contienen anticuerpos neutralizantes antireceptores de il-6 para reducir la excrecion de la proteina urinaria en el lupus eritematoso sistemico. - Google Patents
Agentes preventivos y/o remedios que contienen anticuerpos neutralizantes antireceptores de il-6 para reducir la excrecion de la proteina urinaria en el lupus eritematoso sistemico. Download PDFInfo
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Abstract
Uso de un anticuerpo anti-receptor de interleuquina-6 (IL-6) que neutraliza la actividad biológica de la IL-6 en la fabricación de un medicamento para reducir la excreción de proteína urinaria en el lupus eritematoso sistémico.
Description
Agentes preventivos y/o remedios que contienen
anticuerpos neutralizantes antireceptores de IL-6
para reducir la excreción de la proteína urinaria en el lupus
eritematoso sistémico.
La presente invención se refiere a un agente
preventivo y/o terapéutico para la proteína urinaria en el lupus
eritematoso sistémico que comprende un anticuerpo
anti-receptor de interleuquina-6
como ingrediente activo.
La interleuquina-6
(IL-6) es una citoquina también denominada factor de
estimulación 2 de células B (BSF2, del inglés "B cell stimulating
factor 2") o interferón \beta2 (IFN-\beta2).
La IL-6 se descubrió como un factor de
diferenciación implicado en la activación de linfocitos B (Hirano,
T. et al., Nature (1986) 324, 73-76). A
partir de entonces, se descubrió que era una citoquina
multifuncional que tiene influencia sobre varias funciones de las
células (Akira, S. et al., Adv. in Immunology (1993) 54,
1-78).
La IL-6 transmite su actividad
biológica a través de dos tipos de proteínas presentes en la célula.
Una es el receptor de IL-6, una proteína de unión a
ligando a la que se une la IL-6. El receptor de
IL-6 aparece no sólo como un receptor de
IL-6 unido a la membrana, con un peso molecular de
aproximadamente 80 kDa, que penetra a través y se expresa en la
membrana celular, sino también como un receptor de
IL-6 soluble, con un peso molecular de
aproximadamente 40 a 50 kDa, que consiste esencialmente en la región
extracelular.
La otra es una proteína de membrana gp130, con
un peso molecular de aproximadamente 130 kDa, que está implicada en
la transducción de señales sin unión a ligando. La
IL-6 y el receptor de IL-6 forman el
complejo IL-6/receptor de IL-6, que
después de unirse a la gp130 transmite su actividad biológica dentro
de la célula (Taga et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967).
El anticuerpo anti-receptor de
IL-6 se ha descrito en varias publicaciones (Novick
D. et al., Hybridoma (1991) 10, 137-146,
Huang, Y.W. et al., Hybridoma (1993) 12,
621-630, Publicación de Patente Internacional WO
95-09873, Publicación de Patente Francesa FR
2694767, Patente de los Estados Unidos US 521628). Se ha conocido
un anticuerpo PM-1 de ratón (Hirata et al.,
J. Immunology (1989) 143, 2900-2906) que es uno de
los anticuerpos anti-receptor de
interleuquina-6, y el anticuerpo humanizado
PM-1 (Publicación de Patente Internacional WO
92-19759), y este último se obtuvo transplantando la
región determinante de la complementariedad (CDR, del inglés
"complementarity determining region") del mismo a un anticuerpo
humano.
El lupus eritematoso sistémico es una enfermedad
sistémica autoinmune que se produce como resultado de las
reacciones inflamatorias causadas por la deposición de anticuerpo
antinuclear o anticuerpo anti-ADN y sus
inmunocomplejos en varios órganos y tejidos. La deposición de
anticuerpo antinuclear o anticuerpo anti-ADN y sus
inmunocomplejos en los glomérulos renales desencadena la aparición
de la nefritis lúpica. En el lupus eritematoso sistémico, algunos
pacientes muestran un aumento de los niveles de IL-6
en sangre, negando la implicación de la IL-6 en la
patología (Peterson, E. et al., Lupus (1996) 5,
571-576).
Kiberd, J., J. Am. Soc. Nephrol. (1993) 4,
58-61, describe el efecto del anticuerpo
anti-receptor de interleuquina-6
sobre las funciones renales y el daño de los tejidos en ratones
MRL-Ipr/lpr. En el experimento de Kiberd, L., sin
embargo, no se realizaron investigaciones sobre el tiempo de
aparición de proteína urinaria y los días de supervivencia como un
índice de los síntomas clínicos del lupus eritematoso sistémico. Por
tanto, sus resultados no pueden por sí solos afirmar de manera
concluyente que el anticuerpo anti-receptor de
interleuquina-6 sea eficaz para la nefritis
lúpica.
Aunque la patología de los ratones
MRL-Ipr/Ipr usados es similar histológicamente al
lupus eritematoso sistémico, el mecanismo de aparición de la
patología implica un antígeno Fas aberrante. Por otra parte, no se
han observado antígenos Fas aberrantes en el lupus eritematoso
sistémico humano (Watanabe-Fukunaga, R. et
al., Nature, (1992) 356, 314-317).
Resulta por tanto difícil de creer que los
resultados obtenidos en estos ratones puedan aplicarse de forma
inmediata al lupus eritematoso sistémico en humanos. Como modelos de
nefritis lúpica en el lupus eritematoso sistémico, se sabe que los
ratones NZB/WF1 tienen una patología más parecida a la del lupus
eritematoso sistémico en humanos (Howie, J.B. et al., Adv.
Immunol. (1968) 9, 215-266).
Además, puesto que no se observaron diferencias
estadísticamente significativas entre el grupo al que se administró
el anticuerpo anti-receptor de
interleuquina-6 y el grupo de control al que se
administró IgG, no puede concluirse que el anticuerpo
anti-receptor de interleuquina-6
tenga efectos terapéuticos. Por tanto, del artículo anterior de
Kiberd, J., no podrían esperarse los posibles efectos del anticuerpo
anti-receptor de interleuquina-6
sobre el lupus eritematoso sistémico.
\newpage
Finck, B.K. et al., J. Clin. Invest.
(1994) 94, 585-591 describieron el efecto supresor
sobre la excreción de proteína urinaria, los efectos supresores
sobre la producción de anticuerpo anti-ADN en la
sangre y la prolongación de los días de supervivencia en ratones
NZB/NZB F1 tratados con anticuerpo
anti-IL-6.
Sin embargo, la administración de anticuerpo
anti-IL-6 dio como resultado un
aumento del número de ratones que desarrollaron nefritis a partir
de los 7 meses de edad, y es muy probable que el aumento continuara
incluso después de los 9 meses de edad. Se prevé por tanto que el
anticuerpo anti-IL-6 no tiene un
efecto suficiente sobre el lupus eritematoso sistémico.
Hasta la fecha se ha publicado que la
administración de anticuerpo
anti-IL-6 en personas y ratones
causa notables aumentos en los niveles sanguíneos de
IL-6 (Wendling, D. et al., J. Rheumatol.
(1993) 20, 259-262; Heremans, H. et al.,
Eur. J. Immunol. (1992) 22, 2395-2401). Se ha
encontrado también que la administración simultánea de
IL-6 y anticuerpo
anti-IL-6 da como resultado aumentos
notables en la actividad de la IL-6 (Mihara, M.
et al., Immunology (1991) 74, 55-59). Estos
hechos indican la posibilidad de que el uso del anticuerpo
anti-IL-6 causa una intensificación
de la actividad endógena de la IL-6 y el desarrollo
de efectos secundarios. Se sugiere por tanto que pueden surgir
efectos secundarios por la administración de anticuerpo
anti-IL-6 a pacientes con lupus
eritematoso sistémico.
La Publicación de Patente Internacional W0
96-12503 describe que el anticuerpo
anti-receptor de IL-6 es eficaz
para la nefritis, en particular la nefritis proliferativa mesangial.
Sin embargo, la Publicación de Patente Internacional WO
96-12503 describe sólo que la IL-6
producida en grandes cantidades por ingeniería genética inducía el
crecimiento de las células mesangiales, y la nefritis se desarrolló
a partir del crecimiento de las células mesangiales como causa
directa. No describe ni sugiere que la IL-6 esté
implicada en la aparición, ni que el anticuerpo
anti-receptor de IL-6 tenga algún
efecto terapéutico sobre la nefritis autoinmune, por ejemplo la
nefritis lúpica, en el lupus eritematoso sistémico causada por la
deposición en los glomérulos renales de anticuerpo antinuclear o
anticuerpo anti-ADN o sus inmunocomplejos.
Actualmente, el lupus eritematoso sistémico se
ha tratado con fármacos esteroideos o/y fármacos inmunosupresores.
Sin embargo, son terapias sintomáticas, y requieren una
administración a largo plazo y plantean problemas de efectos
secundarios.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención pretende proporcionar un
agente preventivo y/o terapéutico para la proteína urinaria en el
lupus eritematoso sistémico, estando dicho agente libre de las
desventajas mencionadas anteriormente.
La presente invención proporciona el uso de un
anticuerpo anti-receptor de IL-6 que
neutraliza la actividad biológica de la IL-6 en la
fabricación de un medicamento para reducir la excreción de proteína
urinaria en el lupus eritematoso sistémico.
El anticuerpo anti-receptor de
IL-6 puede ser anticuerpo
anti-receptor de IL-6 humano.
El anticuerpo anti-receptor de
IL-6 puede ser anticuerpo monoclonal
anti-receptor de IL-6.
El anticuerpo anti-receptor de
IL-6 puede ser anticuerpo
anti-receptor de IL-6
recombinante.
El anticuerpo
anti-IL-6 puede ser anticuerpo
PM-1.
El anticuerpo anti-receptor de
IL-6 puede ser un anticuerpo que tiene la región
constante de un anticuerpo humano.
El anticuerpo anti-receptor de
IL-6 puede ser un anticuerpo quimérico o un
anticuerpo humanizado dirigido frente al receptor de
IL-6.
El anticuerpo anti-receptor de
IL-6 puede ser anticuerpo PM-1
humanizado.
\vskip1.000000\baselineskip
La Fig. 1 es una gráfica que muestra el efecto
supresor sobre la excreción de proteína urinaria causado por
MR16-1 en ratones NZB/W F1.
La Fig. 2 es una gráfica que muestra el efecto
sobre los días de supervivencia causado por MR16-1
en ratones NZB/W F1.
La Fig. 3 es una gráfica que muestra el efecto
sobre la cantidad de anticuerpo anti-ADN en sangre
causado por MR16-1.
Los anticuerpos anti-receptor de
IL-6 para usar en la presente invención son
anticuerpos que inhiben la unión de IL-6 al
receptor de IL-6 uniéndose al receptor de
IL-6, inhibiendo así la transmisión de la actividad
biológica de la IL-6 dentro de las células. En
consecuencia, los anticuerpos anti-receptor de
IL-6 para usar en la presente invención son
anticuerpos que neutralizan la actividad biológica de la
IL-6.
Los anticuerpos anti-receptor de
IL-6 para usar en la presente invención pueden
obtenerse como anticuerpos policlonales o monoclonales usando un
método conocido. Como anticuerpos anti-receptor de
IL-6 para usar en la presente invención se
prefieren anticuerpos monoclonales. Es más, como anticuerpos
anti-receptor de IL-6 se prefieren
anticuerpos monoclonales, de origen mamífero en particular.
Los anticuerpos monoclonales de origen mamífero
incluyen los producidos por un hibridoma y los producidos por un
hospedante que se ha transformado con un vector de expresión que
contiene genes de anticuerpos obtenidos por ingeniería
genética.
Los ejemplos de tales anticuerpos incluyen el
anticuerpo MR16-1 (Saito, et al., J.
Immunology (1993) 147,168-173), el anticuerpo
PM-1 (Hirata, et al., J. Immunology (1989)
143, 2900-2906), o el anticuerpo
AUK12-20, el anticuerpo AUK64-7 o
el anticuerpo AUK146-15 (Publicación de Patente
Internacional WO 92-19759), y similares. Entre
ellos, el anticuerpo PM-1 es el más preferido.
Casualmente, la línea celular del hibridoma que
produce el anticuerpo PM-1 se ha depositado
internacionalmente, según lo que estipula el Tratado de Budapest,
el 10 de julio de 1990, en el Instituto Nacional de Biociencia y
Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, de
1-3, Higashi 1-chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón, como FERM
BID-2998.
La línea celular del hibridoma que produce el
anticuerpo MR16-1 se ha depositado
internacionalmente, según lo que estipula el Tratado de Budapest,
como MR16-1 el 13 de marzo de 1997, en el Instituto
Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y
Tecnología Industrial, de 1-3, Higashi
1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki,
Japón, como FERM BP-5875.
El receptor de IL-6, que es un
antígeno inmunizante, puede prepararse usando un método
conocido.
Específicamente, el receptor de
IL-6 puede obtenerse de la siguiente manera. Por
ejemplo, el receptor de IL-6 humano puede obtenerse
usando la secuencia génica/secuencia de aminoácidos del receptor de
IL-6 descrita en la Publicación de Patente Europea
EP 325474, y el receptor de IL-6 de ratón puede
obtenerse usando la descrita en la Publicación de Patente Japonesa
no Examinada (Kokai) 3-155795. El receptor de
IL-6 para usar como antígeno inmunizante para
generar el anticuerpo es preferiblemente el receptor de
IL-6 humano.
Existen dos tipos de proteínas receptoras de
IL-6: el receptor de IL-6 expresado
en la membrana celular, y el receptor de IL-6
separado de la membrana celular (Receptor de IL-6
soluble) (Yasukawa et al., J. Biochem. (1990) 108,
673-676). El anticuerpo del receptor de
IL-6 soluble consiste esencialmente en la región
extracelular del receptor de IL-6 unida a la
membrana celular, y se diferencia así del receptor de
IL-6 unido a membrana en que el primero no tiene la
región transmembrana, o ni la región transmembrana ni la región
intracelular. El receptor de IL-6 para usar como
antígeno inmunizante para generar el anticuerpo puede ser cualquiera
de los receptores de IL-6, el unido a membrana o el
soluble, con tal de que se consiga el objetivo.
Después de insertar la secuencia génica del
receptor de IL-6 en un sistema de vector de
expresión conocido para transformar una célula hospedante
apropiada, la proteína receptora de IL-6 deseada
puede purificarse de la célula hospedante o del sobrenadante de un
cultivo de la misma usando un método conocido. La proteína
receptora de IL-6 así purificada puede usarse como
el antígeno inmunizante. Alternativamente, pueden usarse como
antígeno de sensibilización las células que han expresado el
receptor de IL-6 o una proteína de fusión de la
proteína receptora de IL-6 con otra proteína. Puede
usarse una variante del receptor de IL-6 como
antígeno inmunizante para generar el anticuerpo, con tal de que se
consiga el objetivo.
Una cepa de E. coli que tiene un plásmido
pIBIBSF2R que contiene el cADN que codifica el receptor de
IL-6 humano se ha depositado internacionalmente,
según lo que estipula el Tratado de Budapest, como
HB101-pIBIBSF2R el 9 de Enero de 1989, en el
Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de
Ciencia y Tecnología Industrial, de 1-3, Higashi
1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki,
Japón, con número de entrada FERM BP-2232.
Los hibridomas que producen anticuerpos
monoclonales pueden preparase usando un método esencialmente
conocido como sigue: así, el receptor de IL-6 se
usa como antígeno inmunizante en un método inmunizante convencional
para la inmunización. Las células inmunes así obtenidas se fusionan
con células parentales conocidas y a continuación se buscan y
seleccionan las células productoras de anticuerpos usando un método
de escrutinio para generar hibridomas.
Aunque los mamíferos a inmunizar con un antígeno
inmunizante no están específicamente limitados, se seleccionan
preferiblemente teniendo en consideración su compatibilidad con la
célula parental que se va a usar en la fusión celular. Incluyen
generalmente roedores, lagomorfos, y primates. Los roedores incluyen
ratones, ratas, hámsteres, y similares. Los lagomorfos incluyen,
por ejemplo, conejos. Los primates incluyen, por ejemplo, monos.
Como monos, se usan "catarrhines" (monos del viejo mundo) tales
como "cynomolgi" (macaco cangrejero), monos rhesus, papiones
sagrados, chimpancés etc.
La inmunización de los animales con un antígeno
inmunizante se lleva a cabo usando un método conocido. Un método
general, por ejemplo, implica la administración intraperitoneal o
subcutánea de un antígeno inmunizante a un mamífero.
Específicamente, se mezcla, según se desee, un antígeno inmunizante
que se ha diluido y resuspendido en una cantidad apropiada de
solución salina tamponada con fosfato (PBS, del inglés "phosphate
buffered saline") o solución salina fisiológica, etc., con una
cantidad apropiada de un coadyuvante convencional, por ejemplo,
coadyuvante completo de Freund. Después de emulsionarse, se
administra preferiblemente a un mamífero varias veces cada 4 a 21
días. Alternativamente, puede usarse un vehículo adecuado en el
momento de la inmunización con el antígeno inmunizante.
Después de la inmunización y la confirmación del
aumento de los niveles del anticuerpo deseado en suero, se extraen
las células inmunes del mamífero, tales como células linfáticas y
células del bazo, y se someten a fusión celular, en la que las
células inmunes preferidas que se someten a fusión celular incluyen
en particular las células del bazo.
Las células de mieloma de mamífero como las
otras células parentales que se someten a fusión celular con las
células inmunes mencionadas anteriormente, incluyen preferiblemente
varias líneas celulares conocidas tales como P3X63Ag8.653 (J.
Immunol. (1979) 123: 1548-1550), P3X63Ag8U.1
(Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81:
1-7), NS-1 (Kohler, G. y Milstein,
C., Eur. J. Immunol. (1976) 6:511-519),
MPC-11 (Margulies, D.H. et al., Cell (1976)
8:405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature
(1978) 276: 269-270), FO (de St. Groth, S.F. et
al., J. Immunol. Methods (1980) 35: 1-21), S194
(Trowbridge, I.S., J. Exp. Med. (1978) 148:
313-323), R210 (Galfre, G. et al., Nature
(1979) 277:131-133) y similares.
La fusión celular entre las células inmunes
anteriores y las células de mieloma puede llevarse a cabo
esencialmente conforme a un método conocido tal como se describe en
Milstein et al. (Kohler, G. y Milstein, C., Methods Enzymol.
(1981) 73: 3-46) y similares.
Más específicamente, la fusión celular anterior
se lleva a cabo en el medio de nutrientes convencional en presencia
de, por ejemplo, un acelerador de la fusión celular. Como acelerador
de la fusión celular, por ejemplo, puede usarse polietilenglicol
(PEG), virus Sendai (HVJ) y similares, y, adicionalmente, puede
añadirse según se desee un coadyuvante tal como dimetilsulfóxido,
etc. para mejorar la eficiencia de la fusión.
La proporción preferida de células inmunes y
células de mieloma a usar es, por ejemplo, de 1 a 10 veces más
células inmunes que células de mieloma. Los ejemplos de medios de
cultivo a utilizar para la anterior fusión celular incluyen medio
RPMI1640 y medio de cultivo MEM adecuado para el crecimiento de las
anteriores líneas celulares de mieloma, y el medio de cultivo
convencional usado para este tipo de cultivo celular y, además,
puede añadirse un suplemento sérico tal como suero fetal de ternera
(FCS, del inglés "fetal calf serum").
En la fusión celular, se mezclan bien cantidades
predeterminadas de las células inmunes anteriores y las células de
mieloma en el líquido de cultivo anterior, al que se añade una
solución de PEG previamente calentada a aproximadamente 37ºC, por
ejemplo, una solución de PEG con un peso molecular medio de
aproximadamente 1000 a 6000, a una concentración del 30 al 60%
(p/v), y se mezcla para obtener las células fusionadas deseadas
(hibridomas). A continuación, repitiendo la adición secuencial de un
medio de cultivo adecuado y la centrifugación para eliminar el
sobrenadante, pueden eliminarse los agentes de fusión, etc. que no
son deseables para el crecimiento del hibridoma.
Dicho hibridoma se selecciona cultivando en un
medio de selección convencional, por ejemplo, el medio de cultivo
HAT (un líquido de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina, y
timidina). El cultivo en dicho medio de cultivo HAT se continúa
generalmente durante un periodo de tiempo suficiente para efectuar
la destrucción de las células distintas del hibridoma deseado
(células no fusionadas), generalmente desde varios días a varias
semanas. A continuación, se lleva a cabo el método convencional de
dilución limitante en el que se buscan, se seleccionan y se clonan
los hibridomas que producen el anticuerpo deseado.
Además de obtener el hibridoma anterior
inmunizando un animal distinto del ser humano con un antígeno, es
posible también sensibilizar linfocitos humanos in vitro con
la proteína antigénica deseada o las células que expresan el
antígeno deseado, y los linfocitos B sensibilizados resultantes se
fusionan con una célula de mieloma humano, por ejemplo U266, para
obtener el anticuerpo humano deseado que tiene actividad de unión
al antígeno deseado o a las células que expresan el antígeno deseado
(véase la Publicación de Patente Japonesa
Post-examinada (Kokoku) Nº 1-59878).
Además, puede inmunizarse un animal transgénico que tiene un
repertorio de todos los genes de anticuerpos humanos con un
antígeno o células que expresan un antígeno para obtener el
anticuerpo humano deseado en el método descrito anteriormente
(Publicaciones de Patentes Internacionales WO
93-12227, WO 92-03918, WO
94-02602, WO 94-25585, WO
96-34096 y WO 96-33735).
Los hibridomas productores de anticuerpos
monoclonales así construidos pueden subcultivarse en un medio de
cultivo convencional, o pueden almacenarse por un periodo de tiempo
prolongado en nitrógeno líquido.
Para obtener un anticuerpo monoclonal a partir
de dicho hibridoma, puede mencionarse un método en el que dicho
hibridoma se cultiva por un método convencional y se obtiene un
anticuerpo como sobrenadante, o un método en el que el hibridoma se
administra y se hace crecer en un mamífero compatible con dicho
hibridoma y el anticuerpo se obtiene como ascitis. El primer método
es adecuado para obtener anticuerpos de alta pureza, mientras que
el segundo es adecuado para una producción de anticuerpos a gran
escala.
Específicamente, el hibridoma que produce un
anticuerpo anti-receptor de IL-6
puede construirse usando el método descrito en la Publicación de
Patente Japonesa no Examinada (Kokai) 3-139293.
Puede llevarse a cabo por un método en el que el hibridoma que
produce el anticuerpo PM-1 que se depositó
internacionalmente según lo que estipula el Tratado de Budapest
como FERM BP-2998 el 10 de julio de 1990, en el
Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de
Ciencia y Tecnología Industrial, de 1-3, Higashi
1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki,
Japón, se inyecta por vía intraperitoneal a ratones BALB/c
(producidos por CLEA Japón) para obtener la ascitis de la que se
purifica el anticuerpo PM-1, o un método en el que
dicho hibridoma se cultiva en un medio de cultivo apropiado tal
como el medio RPMI1640 que contiene suero bovino fetal al 10% y
MB-Condimed H1 al 5% (fabricado por Boehringer
Mannheim), el medio para hibridomas SFM (fabricado por
GIBCO-BRL), el medio PFHM-II
(fabricado por GIBCO-BRL) y similares, y el
anticuerpo PM-1 puede purificarse del
sobrenadante.
Además de generar un hibridoma para producir
anticuerpo, pueden usarse para obtener el anticuerpo células
inmunes que produzcan el anticuerpo deseado, por ejemplo linfocitos
inmunizados que han sido inmortalizados con un oncogén.
En la presente invención, puede usarse como
anticuerpo monoclonal un anticuerpo recombinante, que se produce
mediante la tecnología de genes recombinantes en la que el gen de un
anticuerpo se clona a partir de un hibridoma y se integra en un
vector adecuado, que a continuación se introdujo en un hospedante
(véase, por ejemplo, Carl, A.K., Borrebaeck, y James, W. Larrick,
THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, publicado en el Reino Unido por
MACMILLAN PUBLISHERS LTD. 1990).
Específicamente, se aísla el mARN que codifica
una región variable (V) de un anticuerpo deseado a partir de un
hibridoma que produce un anticuerpo deseado o de células inmunes que
producen el anticuerpo, por ejemplo los linfocitos inmunizados que
se inmortalizaron con un oncogén. El aislamiento del mARN se lleva a
cabo preparando el ARN total usando, por ejemplo, un método
conocido como el método de ultracentrifugación con guanidina
(Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry (1979) 18,
5294-5299), el método AGPC (Chomczynski, P. et
al., Analytical Biochemistry (1987) 162,
156-159), y a continuación el mARN se purifica a
partir del ARN total usando un Kit de Purificación de mARN
(fabricado por Pharmacia), y similares. Alternativamente, el mARN
puede prepararse directamente usando el Kit Quick Prep de
Purificación de mARN (fabricado por Pharmacia).
El cADN de la región V del anticuerpo puede
sintetizarse a partir del mARN así obtenido usando una transcriptasa
inversa. El cADN puede sintetizarse usando un Kit de
Síntesis de la Primera Hebra del cADN con la Transcriptasa Inversa
AMV, y similares. Alternativamente, para la síntesis y amplificación
del cADN, puede usarse un Kit 5'-Ampli
FINDER RACE (fabricado por Clontech) y el método
5'-RACE (Frohman, M.A. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky,
A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17,
2919-2932) que emplea la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR, del inglés "polymerase chain reaction"). El
fragmento de ADN deseado se purifica del producto de PCR obtenido y
puede ligarse a un vector de ADN. Además, a partir de éste se
construye un vector recombinante y a continuación se introduce en
E. coli etc., de donde se seleccionan colonias para preparar
un vector recombinante deseado. La secuencia de nucleótidos del ADN
deseado puede confirmarse por un método conocido tal como el método
didesoxi.
Una vez que se ha obtenido el ADN que codifica
la región V del anticuerpo deseado, puede ligase a un ADN que
codifica una región constante (región C) del anticuerpo deseado, que
se integra a continuación en un vector de expresión.
Alternativamente, el ADN que codifica la región V del anticuerpo
puede integrarse en un vector de expresión que ya contenga el ADN
que codifica la región C del anticuerpo.
Para producir un anticuerpo para usar en la
presente invención, se integra el gen de un anticuerpo, como se
describe más abajo, en un vector de expresión para expresarse bajo
el control de la región reguladora de la expresión, por ejemplo un
intensificador y/o un promotor. Subsiguientemente, el vector de
expresión puede utilizarse para transformar una célula hospedante y
el anticuerpo puede entonces producirse en ella.
La expresión del gen del anticuerpo puede
llevarse a cabo integrando por separado la cadena pesada (cadena H)
o la cadena ligera (cadena L) en un vector de expresión diferente y
transformando a continuación simultáneamente el hospedante, o
integrando el ADN que codifica la cadena H y la cadena L en un único
vector de expresión y transformando a continuación el hospedante
(véase la Publicación de Patente Internacional WO
94-11523).
Conforme a la presente invención, puede usarse
un anticuerpo recombinante alterado artificialmente tal como un
anticuerpo quimérico y un anticuerpo humanizado, con objeto de
disminuir la antigenicidad heteróloga frente a humanos. Estos
anticuerpos alterados pueden producirse usando métodos
conocidos.
El anticuerpo quimérico puede obtenerse ligando
un ADN así obtenido que codifica una región V de un anticuerpo a un
ADN que codifica una región C de anticuerpo humano, que se integra a
continuación en un vector de expresión y se introduce en un
hospedante para la producción de un anticuerpo en él (véanse la
Publicación de Patente Europea EP 125023, y la Publicación de
Patente Internacional WO 92-19759). Usando este
método conocido, puede obtenerse un anticuerpo quimérico útil para
la presente invención.
Por ejemplo, un plásmido que contiene un ADN que
codifica la región V de una cadena L o la región V de una cadena H
de un anticuerpo quimérico PM-1 se designó como
pPM-k3 ó pPM-h1, respectivamente, y
E. coli que contiene el plásmido se ha depositado
internacionalmente según lo que estipula el Tratado de Budapest como
NCIMB 40366 y NCIMB 40362, respectivamente, el 11 de Febrero de
1991, en las Colecciones Nacionales de Bacterias Industriales y
Marinas Limitadas (véase la Publicación de Patente Internacional
Japonesa WO 92-19759).
El anticuerpo humanizado, también denominado
anticuerpo humano remodelado, se ha preparado transplantando las
regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de un
anticuerpo de un mamífero distinto del humano, por ejemplo
anticuerpo de ratón, a las CDRs de un anticuerpo humano. La
tecnología de ADN recombinante general para la preparación de tales
anticuerpos es también conocida (véanse la Publicación de Patente
Europea EP 125023 y la Publicación de Patente Internacional WO
92-19759).
Específicamente, se sintetiza una secuencia de
ADN en la que las CDRs de un anticuerpo de ratón se ligan con
regiones marco (FRs, del inglés "framework regions") de un
anticuerpo humano a partir de varios oligonucleótidos divididos que
tienen secciones que solapan entre sí en sus extremos. El ADN así
obtenido se liga a un ADN que codifica una región C de un
anticuerpo humano y se integra a continuación en un vector de
expresión, que se introduce seguidamente en un hospedante para la
producción del anticuerpo (véanse la Publicación de Patente Europea
EP 239400 y la Publicación de Patente Internacional WO
92-19759).
Las FRs de un anticuerpo humano unidas a través
de las CDRs se seleccionan para que las CDRs formen un sitio de
unión a antígeno favorable. Cuando así se desee, los aminoácidos en
las FRs de la región V del anticuerpo pueden sustituirse para que
la CDR del anticuerpo humano remodelado pueda formar un sitio de
unión a antígeno apropiado (Sato, K. et al., Cancer Res.
(1993) 53, 851-856).
Para el anticuerpo quimérico o el anticuerpo
humanizado, se usa una región C de anticuerpo humano. Como región C
de anticuerpo humano preferida, puede mencionarse C\gamma, y
pueden usarse por ejemplo, C\gamma1, C\gamma2, C\gamma3, y
C\gamma4. La región C de anticuerpo humano puede modificarse para
mejorar la estabilidad del anticuerpo o su producción.
El anticuerpo quimérico consiste en regiones V
de un anticuerpo derivado de un mamífero distinto del humano y
regiones C derivadas de un anticuerpo humano, mientras que un
anticuerpo humanizado consiste en CDRs de un anticuerpo derivado de
un mamífero distinto del humano y FRs y regiones C derivadas de un
anticuerpo humano. Por consiguiente, la antigenicidad de los mismos
en el cuerpo humano se ha reducido para que sean útiles como
ingrediente activo de los agentes terapéuticos de la presente
invención.
Una realización preferida del anticuerpo
humanizado para usar en la presente invención incluye el anticuerpo
PM-1 humanizado (véase la Publicación de Patente
Internacional WO 92-19759).
Los anticuerpos para usar en la presente
invención pueden ser fragmentos de anticuerpo o anticuerpos
modificados siempre que se usen preferiblemente en la presente
invención. Por ejemplo, como fragmentos de anticuerpo, pueden
mencionarse Fab, F (ab')_{2}, Fv o Fv de cadena sencilla (scFv) en
los que los Fvs de cadena H y de cadena L se ligan a través de un
enlazador adecuado.
Específicamente, el anticuerpo se trata con una
enzima, por ejemplo, papaína o pepsina, para producir fragmentos de
anticuerpo, o se construye un gen que codifica un fragmento de
anticuerpo, y a continuación se introduce en un vector de
expresión, que se expresa seguidamente en una célula hospedante
adecuada (véanse, por ejemplo, Co, M.S. et al., J. Immunol.
(1994) 152, 2968-2976; Better, M. y Horwitz, A.H.,
Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic
Press, Inc.; Pluecktrun, A. y Skerra, A., Methods in Enzymology
(1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc.; Lamoyi,
E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663;
Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology
(1989)121, 663-669; Bird, R.E. et al.,
TIBTECH (1991) 9,132-137).
\newpage
El scFv puede obtenerse ligando una región V de
una cadena H y una región V de una cadena L de un anticuerpo (véase
la Publicación de Patente Internacional WO
88-09344). En un scFv, una región V de una cadena H
y una región V de una cadena L se ligan preferiblemente a través de
un enlazador, preferiblemente un enlazador peptídico (Huston, J.S.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85,
5879-5883). La región V de la cadena H y la región
V de la cadena L en el scFv pueden derivarse de cualquiera de los
anticuerpos mencionados anteriormente. Como enlazador peptídico
para ligar las regiones V, puede usarse cualquier péptido de cadena
sencilla, por ejemplo, uno que comprenda de 12 a 19 restos de
aminoácido (véase la Patente de los Estados Unidos Nº US
5525491).
El ADN que codifica el scFv puede obtenerse
usando el ADN que codifica una cadena H o una región V de una
cadena H del anticuerpo anterior y el ADN que codifica una cadena L
o una región V de una cadena L del anticuerpo anterior como molde,
amplificando la porción de ADN que codifica la secuencia de
aminoácidos deseada entre las secuencias anteriores mediante la
técnica de PCR, con el par de cebadores que especifica ambos
extremos de la misma, y amplificando adicionalmente la combinación
del ADN que codifica la porción de enlazador peptídico y el par de
cebadores que define que ambos extremos de dicho ADN se liguen a la
cadena H y la cadena L, respectivamente.
Una vez construido el ADN que codifica el scFv,
puede obtenerse un vector de expresión que lo contenga y un
hospedante transformado con dicho vector de expresión por métodos
convencionales, y el scFv puede obtenerse usando el hospedante
resultante por métodos convencionales.
Puede producirse un fragmento de anticuerpo
obteniendo un gen del mismo de manera similar a la mencionada
anteriormente y permitiendo que se exprese en un hospedante.
"Anticuerpo", tal como se usa en la reivindicación de la
presente solicitud, engloba estos fragmentos de anticuerpo.
Como anticuerpos modificados, pueden usarse
anticuerpos asociados con varias moléculas tales como
polietilenglicol (PEG). "Anticuerpo", tal como se usa en la
reivindicación de la presente solicitud, engloba estos anticuerpos
modificados. Estos anticuerpos modificados pueden obtenerse
modificando químicamente los anticuerpos así obtenidos. Estos
métodos ya se han establecido en la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
Los genes de anticuerpos construidos como se
describe anteriormente pueden expresase y los anticuerpos se
obtienen por un método conocido. En el caso de células de mamífero,
la expresión puede realizarse usando un vector que contenga un
promotor/intensificador útil usado convencionalmente, el gen de un
anticuerpo a expresar, y ADN en el que se haya enlazado de modo
operable la señal poli-A en posición 3' del mismo, o
un vector que contenga dicho ADN. Ejemplos del
promotor/intensificador incluyen el promotor/intensificador temprano
inmediato de citomegalovirus humano.
Adicionalmente, como promotor/intensificador que
puede usarse para la expresión del anticuerpo para usar en la
presente invención, hay promotores/intensificadores virales tales
como retrovirus, poliomavirus, adenovirus, y virus 40 de simio
(SV40), y promotores/intensificadores derivados de células de
mamífero tales como el factor de elongación humano 1\alpha
(HEF1\alpha, del inglés "human elongation factor
1\alpha)".
Por ejemplo, la expresión puede realizarse
fácilmente por el método de Mulligan et al. (Nature (1979)
277, 108) cuando se usa el promotor/intensificador SV40, o por el
método de Mizushima et al. (Nucleic Acids Res. (1990) 18,
5322) cuando se usa el promotor/intensificador HEF1\alpha.
En el caso de E. coli, la expresión puede
llevarse a cabo enlazando de modo operable un promotor útil usado
convencionalmente, una secuencia señal para la secreción del
anticuerpo, y el gen de un anticuerpo a expresar, expresándolo a
continuación. Como promotor, por ejemplo, puede mencionarse el
promotor lacz y el promotor araB. El método de Ward et al.
(Nature (1098) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6,
2422-2427) puede usarse cuando se usa el promotor
lacz, y el método de Better et al. (Science (1988) 240,
1041-1043) puede usarse cuando se usa el promotor
araB.
Como secuencia señal para la secreción del
anticuerpo, cuando se produce en el periplasma de E. coli,
puede usarse la secuencia señal peIB (Lei, S.P. et al., J.
Bacteriol. (1987) 169, 4379). Después de separar un anticuerpo
producido en el periplasma, la estructura del anticuerpo se repliega
de manera apropiada antes de su uso (véase, por ejemplo, la
Publicación de Patente Internacional WO 96/30394, y la Publicación
de Patente Japonesa Post-examinada (Kokoku) Nº
7-93879).
Como origen de replicación, pueden usarse los
derivados de SV40, poliomavirus, adenovirus, virus de papiloma
bovino (BPV, del inglés "bovine papilloma virus") y similares.
Además, para la amplificación del número de copias del gen en un
sistema de células hospedantes, los vectores de expresión pueden
incluir como marcador de selección un gen de aminoglicósido
transferasa (APH), un gen de timidina quinasa (TK), un gen de
xantina guanina fosforribosil transferasa de E. coli
(Ecogpt), un gen de dihidrofolato reductasa (dhfr), o similares.
Para la producción del anticuerpo para usar en
la presente invención, puede usarse cualquier sistema de producción.
El sistema de producción de la preparación del anticuerpo comprende
un sistema de producción in vitro o in vivo. Como
sistema de producción in vitro, puede mencionarse un sistema
de producción que emplea células eucariotas y el sistema de
producción que emplea células procariotas.
Cuando se usan células eucariotas, están los
sistemas de producción que emplean células de animales, células de
plantas, y células fúngicas. Las células de animal conocidas
incluyen (1) células de mamífero tales como células CHO (J. Exp.
Med. (1995) 108, 945), células COS, células de mieloma, células de
riñón de cría de hámster (BHK, del inglés "baby hamster
kidney"), células HeLa, y células Vero, (2) células de anfibio
tales como oocitos de Xenopus (Valle, et al., Nature
(1981) 291, 358-340), o (3) células de insecto tales
como sf9, sf21, y Tn5. Como células CHO, puede usarse
preferiblemente dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. (1968) 77, 4216-4220), una célula CHO
deficiente en el gen DHFR, y CHO K-1 (Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. (1968) 60, 1275).
Las células de plantas conocidas incluyen, por
ejemplo, las derivadas de Nicotiana tabacum, que se someten
a cultivo de callos. Las células fúngicas conocidas incluyen
levaduras tales como el género Saccharomyces, más
específicamente la especie Saccharomyces cereviceae, u hongos
filamentosos tales como el género Aspergillus, más
específicamente la especie Aspergillus niger.
Cuando se usan células procariotas, hay sistemas
de producción que emplean células bacterianas. Las células
bacterianas conocidas incluyen Escherichia coli (E.
coli), y Bacillus subtilis.
Introduciendo mediante transformación un gen de
un anticuerpo deseado en estas células y cultivando las células
transformadas in vitro, puede obtenerse el anticuerpo. El
cultivo se lleva a cabo por métodos conocidos. Por ejemplo, como
medio de cultivo puede usarse DMEM, MEM, RPMI1640, e IMDM, y pueden
usarse suplementos séricos en combinación, tales como suero fetal
de ternera (FCS). Además, los anticuerpos pueden producirse in
vivo implantando células en las que se ha introducido un gen de
un anticuerpo en la cavidad abdominal de un animal, y
similares.
Como sistemas de producción in vivo,
pueden mencionarse los que emplean animales y los que emplean
plantas. Los genes de anticuerpos se introducen en estos animales o
plantas, y se producen los anticuerpos en tales animales o plantas,
y se recuperan.
Cuando se usan animales, están los sistemas de
producción que emplean mamíferos e insectos.
Como mamíferos, pueden usarse cabras, cerdos,
ratones y reses (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications,
1993). Cuando se usan mamíferos, pueden usarse animales
transgénicos.
Por ejemplo, se inserta un gen de anticuerpo en
medio de un gen que codifica una proteína que se produce
intrínsecamente en la leche, tal como la caseína \beta de cabra,
para preparar genes fusionados. Se inyecta un fragmento de ADN que
contiene un gen fusionado en el que se ha insertado un gen de
anticuerpo en un embrión de cabra, y el embrión se introduce en una
hembra de cabra. El anticuerpo deseado se obtiene de la leche
producida por la cabra transgénica nacida de la cabra que recibió
el embrión, o su descendencia. Para aumentar le cantidad de leche
que contiene el anticuerpo deseado producido por la cabra
transgénica, pueden darse hormonas a la cabra transgénica según sea
apropiado (Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12,
699-702).
Cuando se usan gusanos de seda como insecto, se
infectan los gusanos de seda con un baculovirus en el que se ha
insertado un gen de anticuerpo deseado, y el anticuerpo deseado
puede obtenerse del fluido corporal de los gusanos de seda (Susumu,
M. et al., Nature (1985) 315, 592-594).
Además, pueden usarse plantas, por ejemplo
tabaco. Cuando se usa tabaco, un gen de anticuerpo deseado se
inserta en un vector de expresión para plantas, por ejemplo pMON
530, y a continuación el vector se introduce en una bacteria tal
como Aqrobacterium tumefaciens. La bacteria se usa entonces
para infectar el tabaco tal como Nicotiana tabacum para
obtener el anticuerpo deseado de las hojas del tabaco (Julian, K.-C.
Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24,
131-138).
Cuando el anticuerpo se produce en sistemas de
producción in vitro o in vivo, como se describe
anteriormente, un ADN que codifica una cadena H o una cadena L de
un anticuerpo puede integrarse separadamente en un vector de
expresión y los hospedantes se transforman simultáneamente, o un ADN
que codifica una cadena H y una cadena L puede integrarse en un
único vector de expresión y el hospedante se transforma con él
(véase la Publicación de Patente Internacional WO
94-11523).
Como métodos para introducir un vector de
expresión en un hospedante, puede usarse un método conocido tal
como el método del fosfato de calcio (Virolgoy (1973) 52,
456-467) y el método de electroporación (EMBO J.
(1982) 1, 841-845), y similares.
Los anticuerpos producidos y expresados como se
describe anteriormente pueden separarse del interior o exterior de
la célula hospedante y a continuación pueden purificarse a
homogeneidad. La separación y purificación del anticuerpo para usar
en la presente invención puede realizarse mediante los métodos de
separación y purificación usados convencionalmente para la
purificación de proteínas. Estos métodos incluyen, pero sin
limitarse a ellos, columnas de cromatografía tales como
cromatografía de afinidad, filtración, ultrafiltración,
precipitación por adición de sal, diálisis y similares, de los
cuales pueden seleccionarse y combinarse los métodos según sea
apropiado para la separación y purificación (Antibodies: A
Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor
Laboratory, 1988).
Como columnas para usar en la cromatografía de
afinidad, pueden mencionarse la columna con Proteína A y la columna
con Proteína G. Los ejemplos de portadores usados en la columna con
Proteína A son Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia) y
similares.
Como cromatografía distinta de la cromatografía
de afinidad mencionada anteriormente, puede mencionarse, por
ejemplo, la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de
hidrofobicidad, penetrabilidad en gel, cromatografía de fase
inversa, cromatografía de adsorción, y similares (Strategies for
Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course
Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1986).
Estas cromatografías pueden llevarse a cabo
usando cromatografía de líquidos tal como HPLC, FPLC.
La concentración de anticuerpo obtenido puede
determinarse por medición de la absorbancia o por el ensayo de
inmunosorbente unido a enzima (ELISA, del inglés
"enzyme-linked immunosorbent assay") y
similares. Así, cuando se emplea la medición de la absorbancia, el
anticuerpo para usar en la presente invención o una muestra que
contiene el anticuerpo se diluye apropiadamente con PBS y a
continuación se mide la absorbancia a 280 nm. En el caso del
anticuerpo humano, el cálculo se lleva a cabo usando un valor de OD
de 1,35 a 1 mg/ml.
Cuando se usa el método ELISA, la medición se
lleva a cabo como sigue. Así, se añaden 100 \mul de IgG
anti-humana de cabra (fabricada por TAGO) diluida a
1 mg/ml en tampón bicarbonato 0,1 M, pH 9,6, a un placa de 96
pocillos (fabricada por Nunc), y se incuba durante una noche a 4ºC
para inmovilizar el anticuerpo. Después de bloquear, se añaden 100
\mul a cada pocillo del anticuerpo de la presente invención
diluido apropiadamente o de una muestra que contiene el anticuerpo,
o 100 \mul de IgG humana (fabricada por CAPPEL) como estándar de
concentración, y se incuba a temperatura ambiente durante 1
hora.
Después de lavar, se añaden 100 \mul de IgG
anti-humana marcada con fosfatasa alcalina
(fabricada por BIO SOURCE) diluida 5000 veces, y se incuba a
temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar, se añade la
solución de sustrato y se incuba, y a continuación se mide la
absorbancia a 405 nm usando el MICROPLATE READER Modelo 3550
(fabricado por Bio-Rad) para calcular la
concentración del anticuerpo deseado.
Alternativamente, puede usarse BIAcore
(fabricado por Pharmacia) para medir la concentración del
anticuerpo.
La actividad de unión al antígeno, la actividad
de inhibición de la unión, y la actividad de neutralización de un
anticuerpo del receptor de IL-6 para usar en la
presente invención puede evaluarse usando un método
convencionalmente conocido. Por ejemplo, se añade
IL-6 a una placa en la que se cultivaron células
reactivas frente a IL-6 tales como MH60.BSF2. A
continuación, puede evaluarse la actividad usando la incorporación
de ^{3}H-timidina en las células reactivas frente
a IL-6 en coexistencia con un antagonista de
IL-6 como índice.
Alternativamente, se añaden anticuerpo
anti-receptor de IL-6 e
IL-6 marcada con ^{125}I a una placa en la que se
cultivaron células que expresan el receptor de IL-6,
tales como U266. A continuación, la evaluación puede efectuarse
determinado la IL-6 marcada con ^{125}I unida a
las células que expresan el receptor de IL-6
(Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow y David Lane, Cold
Spring Harbor Laboratory, 1988).
Además, como métodos para determinar la
actividad de unión al antígeno del anticuerpo del receptor de
IL-6 para usar en la presente invención, puede
usarse ELISA, EIA (inmunoensayo enzimático), RIA
(radioinmunoensayo), o el método del anticuerpo fluorescente.
Cuando se emplea el método ELISA, por ejemplo,
se añade receptor de IL-6 a una placa de 96 pocillos
sobre la que se ha inmovilizado un anticuerpo frente al receptor de
IL-6, por ejemplo un anticuerpo frente a la región
C del mismo, y a continuación se añaden las muestras que contienen
el anticuerpo anti-receptor de IL-6
deseado, por ejemplo el sobrenadante de un cultivo de células
productoras de anticuerpo anti-receptor de
IL-6, o anticuerpo purificado.
Se añade un anticuerpo secundario que reconoce
el anticuerpo anti-receptor de IL-6
deseado marcado con una enzima tal como fosfatasa alcalina, y la
placa se incuba, y se lava. A continuación, después de añadir a la
misma un sustrato de la enzima tal como
p-nitrofenilfosfato y determinar la absorbancia,
puede evaluarse la actividad de unión al antígeno. Puede usarse un
receptor de IL-6 soluble como receptor de
IL-6.
Como métodos para medir la actividad inhibidora
de la unión de ligandos al receptor del anticuerpo
anti-receptor de IL-6 para usar el
la presente invención, puede usarse un ELISA celular convencional o
el ensayo de unión de ligandos al receptor.
En el caso del ELISA celular, por ejemplo, se
cultivan células que expresan el receptor de IL-6 en
una placa de 96 pocillos y a continuación se adhieren e inmovilizan
con para-formaldehído, etc. Alternativamente, se
preparan fracciones de membrana de células que expresan el receptor
de IL-6 y se prepara una placa de 96 pocillos sobre
la que se han inmovilizado las fracciones. Se añade a la placa una
muestra que contiene el anticuerpo anti-receptor de
IL-6 deseado, preferiblemente el sobrenadante de un
cultivo de células productoras de anticuerpo
anti-receptor de IL-6, anticuerpo
purificado, y un radioisótopo tal como IL-6 marcada
con ^{125}I.
A continuación la placa se incuba, se lava, y se
mide la radiactividad para determinar la cantidad de
IL-6 unida al receptor de IL-6 y
evaluar así la actividad de inhibición de la unión de ligandos al
receptor del anticuerpo anti-receptor de
IL-6.
En el ensayo de inhibición de la unión de
IL-6 al receptor de IL-6 en las
células, las células que expresan el receptor de
IL-6 se separan por medio de centrifugación, etc.
para preparar una suspensión celular. Se añaden a la suspensión
celular una solución de IL-6 marcada con un
radioisótopo tal como ^{125}I, o una mezcla de
IL-6 sin marcar e IL-6 marcada, y
una solución que contiene el anticuerpo
anti-receptor de IL-6 cuya
concentración se ha ajustado. Después de incubar durante un cierto
periodo de tiempo, las células se separan, y se mide la
radiactividad de la IL-6 marcada unida a las
células.
Para evaluar la actividad del anticuerpo
anterior, puede usarse BlAcore (fabricado por Pharmacia).
\vskip1.000000\baselineskip
La enfermedad a tratar es la proteína urinaria
en el lupus eritematoso sistémico. Para confirmar los efectos
logrados por la presente invención, puede suministrarse el
anticuerpo anti-receptor de IL-6 a
un animal modelo que desarrolle la patología del lupus eritematoso
sistémico humano.
Como animal para usar, se usan los animales
modelo que mejor manifiestan la patología del lupus eritematoso
sistémico humano. Los animales modelo que mejor manifiestan la
patología del lupus eritematoso sistémico humano son los ratones
NZB/WF1. Los ratones NZB/WF1 constituyen un animal modelo conocido y
disponible.
El lupus eritematoso sistémico es una enfermedad
sistémica autoinmune causada por la deposición de anticuerpo
antinuclear o anticuerpo anti-ADN o sus
inmunocomplejos en varios órganos y/o tejidos, lo cual induce
reacciones inflamatorias causando así una enfermedad sistémica
autoinmune. La deposición en los glomérulos renales de anticuerpo
antinuclear o anticuerpo anti-ADN y sus
inmunocomplejos causa nefritis lúpica autoinmune. Algunos pacientes
con lupus eritematoso sistémico muestran un aumento de
IL-6 en sangre, negando así la implicación de la
IL-6 en la patología (Peterson, E. et al.,
Lupus (1996) 5, 571-576).
Se ha publicado que la IL-6
actúa directamente en las células mesangiales presentes en los
glomérulos del riñón y causa así el crecimiento de las células
mesangiales, lo cual induce a su vez la nefritis glomerular
(Suematsu, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1989)
86, 7547-7551). La nefritis lúpica se ocasiona por
el mecanismo en el que el anticuerpo antinuclear de clase IgG o el
anticuerpo anti-ADN se deposita en los glomérulos y
causa así reacciones inflamatorias en los glomérulos, lo cual daña a
su vez los glomérulos conduciendo a la aparición de la nefritis, y
por lo tanto, se distingue de la glomerulonefritis proliferativa
mesangial desde el punto de vista del mecanismo de aparición.
Como se muestra en los Ejemplos que siguen, se
observó la supresión del anticuerpo anti-ADN de
clase IgG o la supresión de la excreción de proteína urinaria
administrando anticuerpo anti-receptor de
IL-6 a ratones NZB/WF1. Puesto que los ratones
NZB/WF1 son el animal modelo que mejor refleja la patología del
lupus eritematoso sistémico humano, se puso de manifiesto que el
anticuerpo anti-receptor de IL-6
tiene un efecto terapéutico sobre el lupus eritematoso
sistémico.
Por tanto, la presente invención prepara un
medicamento para reducir la excreción de proteína urinaria en el
lupus eritematoso sistémico.
\vskip1.000000\baselineskip
Los agentes preventivos y/o terapéuticos pueden
administrarse por vía oral o parenteral, bien sistémicamente o
localmente. La vía parenteral puede seleccionarse entre inyección
intravenosa tal como infiltración por goteo, inyección
intramuscular, inyección intraperitoneal, e inyección subcutánea, y
el método de administración puede seleccionarse, según sea
apropiado, dependiendo de la edad y las afecciones del paciente.
Los agentes preventivos y/o terapéuticos pueden
administrarse en una dosificación que sea suficiente para tratar o
para bloquear al menos parcialmente la afección patológica. Por
ejemplo, la dosificación eficaz se elige del intervalo de 0,01 mg a
100 mg por kg de peso corporal por administración. Alternativamente,
puede elegirse la dosificación en el intervalo de 1 a 1000 mg,
preferiblemente de 5 a 50 mg por paciente. Sin embargo, los agentes
preventivos y/o terapéuticos no están limitados a estas
dosificaciones.
El momento de la administración puede ser
después del desarrollo del lupus eritematoso sistémico, o los
agentes pueden administrarse de manera preventiva cuando se espera
la aparición del lupus eritematoso sistémico para aliviar las
afecciones patológicas después de la aparición.
El periodo de administración puede seleccionarse
según sea apropiado dependiendo de la edad y la afección del
paciente.
Los agentes preventivos o terapéuticos pueden
contener portadores o aditivos farmacéuticamente aceptables
dependiendo de la vía de administración. Ejemplos de tales
portadores o aditivos incluyen agua, un disolvente orgánico
farmacéuticamente aceptable, colágeno, alcohol polivinílico,
polivinilpirrolidona, un polímero carboxivinílico,
carboximetilcelulosa de sodio, poliacrílico de sodio, alginato de
sodio, dextrano soluble en agua, carboximetilalmidón de sodio,
pectina, metilcelulosa, etilcelulosa, goma de xantano, goma arábiga,
caseína, gelatina, agar, diglicerina, propilenglicol,
polietilenglicol, vaselina, parafina, alcohol estearílico, ácido
sérico, seroalbúmina humana (HSA, del inglés "human serum
albumin"), manitol, sorbitol, lactosa, un tensioactivo
farmacéuticamente aceptable, y similares. Los aditivos que se usan
se eligen entre, pero sin litarse a ellos, los anteriores y sus
combinaciones dependiendo de la forma de dosificación.
La presente invención se explicará a
continuación más detalladamente con referencia a los ejemplos de
trabajo, ejemplos de referencia, y experimentos. Debe observarse,
sin embargo, que la presente invención no se limita a ellos en
manera alguna.
Ejemplo de referencia
1
El receptor de IL-6 soluble se
preparó por el método de PCR usando un plásmido pBSF2R.236 que
contenía el cADN que codifica el receptor de IL-6
obtenido según el método de Yamasaki et al., Science (1988)
241, 825-828. El plásmido pBSF2R.236 se digirió con
la enzima de restricción SphI para obtener un cADN del
receptor de IL-6, que se insertó seguidamente en
mp18 (fabricado por Amersham). Usando un oligocebador sintético
diseñado para introducir un codón de terminación en el cADN del
receptor de IL-6, se introdujo una mutación en el
cADN del receptor de IL-6 por el método de PCR
usando un Sistema de Mutagénesis in vitro (fabricado por
Amersham). El procedimiento dio como resultado la introducción de un
codón de terminación en el aminoácido en posición 345, y
proporcionó un cADN que codificaba el receptor de
IL-6 soluble.
Para expresar el cADN del receptor de
IL-6 soluble en las células CHO, se ligó al plásmido
pSV (fabricado por Pharmacia) para obtener el plásmido pSVL344. El
cADN del receptor de IL-6 soluble, que se escindió
con HindIII-SalI, se insertó en el plásmido pECEdhfr
que contenía el cADN de dhfr para obtener el plásmido pECEdhfr344
que puede expresarse en las células CHO.
Se utilizaron 10 \mug del plásmido pECEdhfr344
para transfectar una línea de células dhfr-CHO
DXB-11 (Urland et al., Proc. Natl. Atad. Sci.
U.S.A. (1980) 77, 4216-4220) por el método del
fosfato de calcio (Chen et al., Mol. Cell. Biol. (1987) 7,
2745-2751). Las células CHO transfectadas se
cultivaron en un medio de selección \alpha MEM libre de
nucleósidos que contenía glutamina 1 mM, FCS dializado al 10%, 100
U/ml de penicilina, y 100 \mug/ml de estreptomicina.
Las células CHO seleccionadas se sometieron a
escrutinio por el método de dilución limitante para obtener un
único clon de células CHO. El clon de células CHO se amplificó en
metotrexato (MTX) 20 nM - 200 nM para obtener una línea de células
CHO 5E27 que produce receptor de IL-6 humano
soluble. La línea de células CHO 5E27 se cultivó en un medio Iscov
modificado de Dulbecco (IMDM, del inglés
"Iscov-modified Dulbecco's médium", fabricado
por Gibco) que contenía FBS al 5%. Se recogió el sobrenadante del
cultivo y se determinó la concentración de receptor de
IL-6 soluble en el sobrenadante del cultivo mediante
ELISA.
Ejemplo de referencia
2
Se unió el anticuerpo
anti-IL-6 MT18 preparado por el
método de Hirata et al. (J. Immunol., 143,
2900-2906, 1989) a Sepharose 4B activada con CNBr
(fabricada por Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) según el
régimen adjuntado y se purificó el receptor de IL-6
(Science (1988) 241, 825-8258). Se solubilizó una
línea celular de mieloma humano U266 con hidrocloruro de
p-para-aminofenilmetanosulfonilfluoruro
(fabricado por Wako Chemicals) 1 mM que contenía digitonina
(fabricada por Wako Chemicals) al 1%, trietanolamina 10 mM (pH 7,8)
y NaCI (fabricado por Wako Chemicals) 0,15 M (tampón de
digitonina), y se mezcló con el anticuerpo MT18 unido a perlas de
Sepharose 4B. A continuación, las perlas se lavaron seis veces con
tampón de digitonina, para preparar el receptor de
IL-6 parcialmente purificado.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Se inmunizaron ratones BALB/c cuatro veces cada
diez días con el receptor de IL-6 parcialmente
purificado anterior obtenido de 3 x 10^{9} células U266, y a
continuación se preparó un hibridoma usando un método estándar. El
sobrenadante del cultivo del hibridoma del pocillo de crecimiento
positivo se ensayó con respecto a su actividad de unión al receptor
de IL-6 según el método descrito más abajo. Se
marcaron 5 x 10^{7} células U266 con
^{35}S-metionina (2,5 mCi) y se solubilizaron con
el tampón de digitonina anterior. Las células U266 solubilizadas se
mezclaron con un volumen de 0,04 ml del anticuerpo MT18 unido a
perlas de Sepharose 4B, y a continuación se lavaron seis veces con
tampón de digitonina. El receptor de IL-6 marcado
con ^{35}S-metionina se eluyó con 0,25 ml del
tampón de digitonina (pH 3,4) y se neutralizó en 0,025 ml de Tris 1
M (pH 7,4).
Se mezclaron 0,05 ml de sobrenadante del cultivo
del hibridoma con 0,01 ml de Protein G Sepharose (fabricado por
Pharmacia). Después de lavar, la Sepharose se incubó con 0,005 ml de
solución de receptor de IL-6 marcado con ^{35}S
preparado como se describe anteriormente. El inmunoprecipitado se
analizó por SDS-PAGE para investigar el
sobrenadante del cultivo de hibridoma que reaccionaba con el
receptor de IL-6. Como resultado, se estableció el
clon de hibridoma de reacción positiva PM-1. El
anticuerpo producido a partir del hibridoma PM-1
tiene un subtipo de IgG1\kappa.
La actividad inhibidora de la unión de
IL-6 del anticuerpo producido por el hibridoma
PM-1 al receptor de IL-6 humano se
estudió usando la línea celular de mieloma humano U266. Se preparó
una IL-6 humana recombinante en E. coli
(Hirano et al., Immunol. Lett., 17, 41), y se marcó con
^{125}I usando el reactivo de Bolton-Hunter (New
England Nuclear, Boston, MA) (Taga, T. et al., J. Exp. Med.
(1987) 166, 967-981). Se cultivaron 4 x 10^{5}
células U266 con el sobrenadante del cultivo de hibridoma
PM-1 al 70% (v/v) junto con 14.000 cpm de
IL-6 marcada con ^{125}I en presencia de un exceso
de 100 veces de IL-6 sin marcar durante una hora a
temperatura ambiente. Se extendieron en capa 70 \mul de la muestra
sobre 300 \mul de FCS en un tubo de de microfuga de polietileno
de 400 \mul. Después de centrifugar, se determinó la radiactividad
de la célula.
El resultado reveló que el anticuerpo producido
por el hibridoma PM-1 inhibe la unión de
IL-6 al receptor de IL-6.
Ejemplo de referencia
3
Se preparó un anticuerpo monoclonal dirigido
frente al receptor de IL-6 de ratón según el método
descrito por Saito, et al., J. Immunol. (1993) 147,
168-173.
Las células CHO que producen el receptor de
IL-6 soluble de ratón se cultivaron en el líquido de
cultivo IMDM que contenía FCS al 10%. A partir del sobrenadante del
cultivo, se purificó el receptor de IL-6 soluble de
ratón usando receptor de IL-6 soluble de ratón RS12
(véase Saito, et al., ut supra) y una columna de
afinidad fijada a gel Affigel 10.
El receptor de IL-6 soluble de
ratón (50 \mug) así obtenido se mezcló con coadyuvante completo de
Freund, que se inyectó a continuación en el abdomen de ratas Wistar
(Japan Charles River). A partir de dos semanas después, los
animales se estimularon con coadyuvante incompleto de Freund. En el
día 45, las ratas se sacrificaron, y se fusionaron aproximadamente
2 x 10^{8} células del bazo con 1 x 10^{7} células de mieloma de
ratón P3U1 usando PEG1500 al 50% (fabricado por Boehringer
Mannheim) según el método convencional, y a continuación se
sometieron a escrutinio mediante el medio de cultivo HAT.
Después de añadir el sobrenadante del cultivo a
la placa recubierta con anticuerpo de conejo
anti-IgG de rata (fabricado por Cappel), se hizo
reaccionar el receptor de IL-6 soluble de ratón.
Subsiguientemente, usando anticuerpo de conejo
anti-receptor de IL-6 de ratón e IgG
de oveja anti-conejo marcada con fosfatasa alcalina,
los hibridomas que producían el anticuerpo dirigido frente al
receptor de IL-6 soluble de ratón se sometieron a
escrutinio mediante ELISA. Después de que fuera confirmada la
producción del anticuerpo, los clones de hibridomas se volvieron a
someter dos veces a escrutinio para obtener un único clon de
hibridoma. El clon se designó MR16-1.
La actividad neutralizante del anticuerpo
producido por el hibridoma sobre la transducción de señales de la
IL-6 de ratón se examinó por incorporación de
^{3}H-timidina usando células MH60.BSF2 (Matsuda
et al., J. Immunol. (1988) 18, 951-956). En
una placa de 96 pocillos, las células MH60.BSF2 se prepararon a 1 x
10^{4} células/200 \mul/pocillo. Se añadieron a la placa
IL-6 de ratón y anticuerpo MR16-1 o
anticuerpo RS12 a una concentración de 12,3 a 1000 ng/ml, y a
continuación se cultivó a 37ºC y CO_{2} al 5% durante 44 horas, y
seguidamente se añadió 1 \muCi/pocillo de
^{3}H-timidina. Después de 4 horas, se midió la
incorporación de ^{3}H-timidina. Como resultado,
el anticuerpo MR16-1 suprimió la incorporación de
^{3}H-timidina de las células MH60.BSF2.
Por tanto, se demostró que el anticuerpo
producido por el hibridoma MR16-1 inhibe la unión de
IL-6 al receptor de IL-6.
Ejemplo de referencia
4
El anticuerpo PM-1 humanizado se
obtuvo según el método descrito en la Publicación de Patente
Internacional WO 92-19759. A partir del hibridoma
PM-1 generado en el Ejemplo de referencia 2, se
preparó el ARN total, que se usó a continuación para sintetizar un
cADN de cadena sencilla. Se amplificó el ADN que codifica la región
variable (región V) del anticuerpo PM-1 de ratón por
el método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En la
PCR, se utilizaron los cebadores descritos en Jones, S.T. et
al., Bio/Technology (1991) 9, 88-89.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los fragmentos de ADN amplificados por PCR se
purificaron para obtener un fragmento de ADN que contenía un gen
que codifica la región V de la cadena L de tipo \kappa de ratón y
un fragmento de ADN que contenía un gen que codifica la región V de
la cadena H de tipo \gamma de ratón. Estos fragmentos de ADN se
ligaron al plásmido pUC19, que se introdujo a continuación en
células competentes de E. coli DH5\alpha para obtener un
transformante de E. coli. Se obtuvo el plásmido anterior a
partir de este transformante, y se determinó la secuencia de
nucleótidos de la región codificadora del cADN en el plásmido por un
método convencional, y se determinaron las regiones determinantes
de la complementariedad (CDRs) de cada región V.
Para construir un vector que expresara el
anticuerpo PM-1 quimérico, el cADN que codifica la
región respectiva de la cadena L de tipo \kappa y la cadena H del
anticuerpo PM-1 de ratón se insertó en un vector de
expresión para HCVM. Después de confirmar que el anticuerpo
PM-1 quimérico producido tiene una correcta
actividad de unión al antígeno, se uso el método de inserción de
CDRs para construir el anticuerpo PM-1 humanizado.
Sustituyendo aminoácidos en la región marco (FR), se construyó un
anticuerpo PM-1 humanizado que tenía una actividad
de unión al antígeno prácticamente igual que el anticuerpo
quimérico.
Para expresar el gen que codifica la cadena L y
la cadena H así obtenidas del anticuerpo PM-1
humanizado en células de mamífero, se introdujo cada gen en un
vector que contenía el factor de elongación humano 1\alpha
(HEF-1\alpha). Utilizando simultáneamente estos
vectores para transformar células CHO, se estableció una línea de
células CHO que produce el anticuerpo PM-1
humanizado. Se confirmó que el anticuerpo PM-1
humanizado obtenido tenía actividad de unión al antígeno frente al
receptor de IL-6 humano mediante ELISA. Además, el
anticuerpo PM-1 humanizado inhibía la unión de la
IL-6 humana al receptor de IL-6 en
el mismo grado que el anticuerpo PM-1 de ratón y el
anticuerpo PM-1 quimérico.
MR16-1 y KH-5
(anticuerpo anti-DNP) son IgG de rata y cuando se
administran continuamente es como causar la producción de
anticuerpo frente a IgG de rata y síntomas de choque. La tolerancia
inmunológica frente a estos anticuerpos se indujo usando el método
descrito en Finck, B. K. et al., J. Clin. Invest. (1994) 94,
585-591, antes de comenzar la administración de
MR16-1 y KH-5.
Así, se administró 1 mg de anticuerpo
anti-CD4 (GK1.5) por vía intraperitoneal durante
tres días consecutivos a ratones NZB/W F1 hembra de 13 semanas de
edad (diez ratones por grupo, excepto 9 ratones para administración
del vehículo), y se administraron 0,5 mg de MR16-1 ó
KH5 por vía intraperitoneal simultáneamente a la segunda
administración del anticuerpo anti-CD4. A partir de
ese momento, se administraron por vía intraperitoneal
MR16-1 (0,5 mg), una cantidad igual de
KH-5 como anticuerpo de control, y solución salina
como control del vehículo una vez por semana, hasta que los
animales llegaron a las 64 semanas de edad, con medición regular de
la proteína urinaria excretada y los niveles sanguíneos de
anticuerpo anti-ADN.
Se determinó también la cantidad de
inmunoglobulinas en sangre. La medición de la cantidad de proteína
urinaria se llevó a cabo usando papel Combisticks (fabricado por
Sankyo), y los individuos que tenían más de 100 mg/dl de proteína
se consideraron positivos. Los resultados se muestran en la Figura
1. La cantidad de anticuerpo anti-ADN en sangre se
determinó por el método ELISA. Los resultados (media +/- error
estándar) se muestran en la Figura 3. La cantidad de
inmunoglobulinas en sangre se determinó por el ensayo de
inmmunodifusión radial. Los resultados (media +/- error estándar)
se muestran en la Figura 1.
La Tabla 1 muestra el efecto de
MR16-1 en la cantidad de inmunoglobulinas en sangre.
En la tabla, los resultados para la subclase IgG, IgM e IgA son los
correspondientes a las 32 semanas de edad.
Así, la excreción de proteína urinaria comienza
a observarse a las 28 semanas de edad para el grupo al que se
administró el vehículo, y a las 38 semanas de edad para el grupo al
que se administró KH-5. A las 64 semanas de edad,
momento de finalización del experimento, todos los ratones del grupo
al que se administró el vehículo y un 90% de los ratones del grupo
al que se administró KH-5 eran positivos, mientras
que en el grupo al que se administró MR16-1 el
momento de aparición de la proteína urinaria se vio notablemente
retrasado y la incidencia de la enfermedad se vio también
notablemente suprimida.
Con respecto a los días de supervivencia, el
MR16-1 claramente prolongó los días de supervivencia
y sólo un ratón murió a las 64 semanas de edad. En la cantidad de
anticuerpo anti-ADN, la producción de anticuerpo
anti-ADN de clase IgG se vio notablemente suprimida
en el grupo de administración de MR16-1 pero no se
observaron efectos en el anticuerpo de clase IgM. En la cantidad de
inmunoglobulinas en sangre, las cantidades de IgG1, IgG2, e IgG3
disminuyeron en el grupo de administración de
MR16-1, pero no se observaron efectos en las
cantidades de IgM e IgA.
Los resultados anteriores revelaron que el
anticuerpo anti-receptor de IL-6 es
útil como agente preventivo y/o terapéutico para reducir la
proteína urinaria en el lupus eritematoso sistémico.
Para inhibir la actividad biológica de la
IL-6, se considera el uso de anticuerpo
anti-IL-6 y anticuerpo
anti-receptor de IL-6, pero se cree
que el anticuerpo anti-receptor de
IL-6 tiene un efecto terapéutico más potente que el
anticuerpo anti-IL6 en el lupus eritematoso
sistémico.
Cuando se usó el anticuerpo
anti-receptor de IL-6 en la presente
invención, no se observó aparición de nefritis salvo en un ratón,
mientras que cuando se usó el anticuerpo
anti-IL-6 en el experimento de
Finck, B. K. et al., J. Clin. Invest. (1994) 94,
585-591, el número de ratones que desarrollaron
nefritis crecía desde las 7 semanas de edad, y es probable que la
tendencia continuara después de las 9 semanas de edad. A partir de
estos resultados, se estima que el efecto del anticuerpo
anti-IL-6 es insuficiente en
comparación con el del anticuerpo anti-receptor de
IL-6.
En la publicación de Finck et al., los
cambios en la cantidad de inmunoglobulinas en sangre incluían una
disminución del 2% en IgG1, una disminución del 12% en IgG2a, y un
aumento del 92% en IgG3, y se describió que el anticuerpo
anti-IL-6 no tenía efectos sobre la
cantidad de inmunoglobulinas totales en sangre. Por otra parte, en
el experimento en el que se usó el anticuerpo
anti-receptor de IL-6 usado en la
presente invención, hubo una disminución del 27% en IgGI, una
disminución del 23% en IgG, y una disminución del 32% en IgG3. A
partir de estos resultados también se estima que el anticuerpo
anti-receptor de IL-6 tiene un
efecto más potente.
Hay muchas publicaciones que indican que la
administración de anticuerpo
anti-IL-6 a humanos o ratones causa
un notable aumento en la concentración de IL-6 en
sangre (Wendling, D. et al., J. Rheumatol. (1993) 20,
259-262, Heremans, H. et al., Eur. J.
Immunol. (1992) 22, 2395-2401). Se ha encontrado
también que la administración simultánea de IL-6 y
anticuerpo anti-IL-6 causa un
notable aumento en la actividad de la IL-6 (Mihara,
J. et al., Immunology (1991) 74, 55-59).
Conforme a la presente invención, la
concentración sérica de IL-6 determinada para los
ratones que recibieron anticuerpo anti-receptor de
IL-6 estaba por debajo del límite de detección. Por
tanto, esto sugería la posibilidad de que la administración de
anticuerpo anti-receptor de IL-6 no
aumenta la IL-6 en sangre. A partir de estos
resultados también se cree que el anticuerpo
anti-receptor de IL-6 es mejor que
el anticuerpo anti-IL-6.
Conforme a la presente invención, se demostró
que el anticuerpo anti-receptor de
IL-6 tiene un efecto terapéutico para reducir la
proteína urinaria en el lupus eritematoso sistémico. Por tanto, el
anticuerpo anti-receptor de IL-6 es
útil como agente preventivo y/o terapéutico para reducir la
excreción de proteína urinaria en el lupus eritematoso
sistémico.
Referencia a los microorganismos depositados
según el Tratado de Cooperación en materia de Patentes, Regla
13-2, y el nombre del Instituto Depositario:
Nombre: Instituto Nacional de Biociencia y
Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial
Dirección: 1-3, Higashi
1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki,
Japón
\vskip1.000000\baselineskip
Identificación: Hibridoma de
rata-ratón MR16-1
Número de depósito: FERM
BP-5875
Fecha de depósito: 13 de marzo de 1997
Identificación: HB
101-pIBIBSF2R
Número de depósito: FERM
BP-2232
Fecha de depósito: 9 de enero de 1989
\vskip1.000000\baselineskip
Identificación: PM1
Número de depósito: FERM
BP-2998
Fecha de depósito: 12 de julio de 1989
\vskip1.000000\baselineskip
Nombre: Colección Nacional de Bacterias
Industriales y Marinas Limitada
Dirección: 23 st Machar Drive Aberdeen AB2
IRY
\vskip1.000000\baselineskip
Identificación: Escherichia coli
DH5\alpha-pPM-k3
Número de depósito: NCIMB 40366
Fecha de depósito: 12 de febrero de 1991
\vskip1.000000\baselineskip
Identificación: Escherichia coli
DH5\alpha-pPM-h1
Número de depósito: NCIMB 40362
Fecha de depósito: 12 de febrero de 1991
Claims (8)
1. Uso de un anticuerpo
anti-receptor de interleuquina-6
(IL-6) que neutraliza la actividad biológica de la
IL-6 en la fabricación de un medicamento para
reducir la excreción de proteína urinaria en el lupus eritematoso
sistémico.
2. El uso según la reivindicación 1 en el que el
anticuerpo anti-receptor de
interleuquina-6 (IL-6) es anticuerpo
anti-receptor de IL-6 humano.
3. El uso según la reivindicación 1 ó 2 en el
que el anticuerpo anti-receptor de
interleuquina-6 (IL-6) es
anticuerpo monoclonal anti-receptor de
IL-6.
4. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 en el que el anticuerpo
anti-receptor de interleuquina-6
(IL-6) es un anticuerpo
anti-receptor de IL-6
recombinante.
5. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 en el que el anticuerpo
anti-receptor de interleuquina-6
(IL-6) es anticuerpo PM-1.
6. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 en el que el anticuerpo
anti-receptor de interleuquina-6
(IL-6) es un anticuerpo que tiene la región
constante de un anticuerpo humano.
7. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 en el que el anticuerpo
anti-receptor de interleuquina-6
(IL-6) es un anticuerpo quimérico o humanizado
dirigido frente al receptor de IL-6.
8. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 en el que el anticuerpo
anti-receptor de interleuquina-6
(IL-6) es anticuerpo PM-1
humanizado.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9-220400 | 1997-08-15 | ||
| JP22040097 | 1997-08-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2308809T3 true ES2308809T3 (es) | 2008-12-01 |
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