ES2308467T3

ES2308467T3 - Reparacion tisular con celulas multipotentes.

Info

Publication number: ES2308467T3
Application number: ES05722061T
Authority: ES
Inventors: Jeanine Anna Alphonse Hendriks; Mark Ewart De Bruijn; Jens Uwe Riesle
Original assignee: Cellcotec BV
Current assignee: Cellcotec BV
Priority date: 2004-03-18
Filing date: 2005-03-18
Publication date: 2008-12-01
Anticipated expiration: 2025-03-18
Also published as: EP1970068A1; DE602005006990D1; AU2005221582A1; AU2005221582B8; US8048671B2; CA2560209A1; AU2005221582A8; ES2676772T3; US20120053558A1; WO2005087239A1; AU2005221582B2; PL1970068T3; EP1727552A1; SI1970068T1; US8796019B2; US20070224172A1; TR201809744T4; US20140329316A1; EP1727552B1; ATE395924T1

Abstract

Uso de una composición que comprende una población de células multipotentes, excluyendo células de origen embrionario humano y una población de condrocitos para la fabricación de un medicamento para la reparación de tejido de cartílago en un paciente humano o animal, en el que la relación del número de células en la población de células condrocitos respecto al número de células en la población de células multipotentes es de 1:200 a 2:3.

Description

Reparación tisular con células multipotentes.

Esta invención se refiere al campo de la ciencia médica, en particular a la tecnología dirigida a reparar defectos en tejidos vivos, preferentemente humanos.

Las células primarias son células altamente especializadas presentes en los variados tipos específicos de tejidos en un organismo. Están implicados en mantener, reparar y soportar la función de dicho tejido.

En muchas situaciones donde ocurre un defecto en el tejido vivo, se desencadena alguna reacción intrínseca o extrínseca. Las células primarias que están presentes en el tejido dañado pueden producir un crecimiento específico y otros factores que será ocultado por el entorno del defecto. Esto lleva a una proliferación desencadenada de las células todavía viables según la que el defecto puede rellenarse. Luego, si es necesario, las células pueden diferenciarse en el tipo de célula requerido para producir y mantener el tejido especializado totalmente funcio-
nal.

En muchos casos, sin embargo, la reacción de reparación del cuerpo no está conducida o totalmente conducida hacia un tejido funcional. Esto puede deberse a una variedad de razones, tal como el tamaño del defecto, la pobre disponibilidad de células primarias en el sitio del defecto para soportar la función de reparación, o la falta de entrada de células multipotentes, que pueden diferenciarse hacia el tipo de célula requerida, p.ej. vía el corriente
sanguíneo.

El cartílago articular cubre el final de los huesos largos de las juntas sinoviales y consiste en aproximadamente 30% de las proteínas de matriz extracelular y aproximadamente 70% de agua. Los condrocitos son el único tipo de célula encontrado en el cartílago articular normal pero contribuye menos del 2% del peso húmedo en tejido adulto sano de ser humano. La matriz extracelular consiste predominantemente en moléculas proteoglicano específicas de cartílago con glicosaminoglicano sulfatado altamente cargado negativamente (cadenas laterales GAG, al igual que fibrillas de colágeno de tipo II). Las cadenas laterales GAG son capaces de unirse a moléculas de agua, de ese modo secuestrar agua y generar una presión interna por hinchazón dentro de la matriz del cartílago. Estas propiedades similares a un hidrogel son esenciales para las características de flujo del fluido intersticial observado dentro de la matriz durante el carga funcional del cartílago, punto en el que el agua está forzada hacia fuera del tejido en una cantidad que permite que las cadenas de GAG cargadas negativamente se repelan las unas a las otras. Sobre la liberación de la carga compresiva, el agua está imbuida hacia la matriz del tejido. La red de colágeno, junto con el agua unida a GAG, capacita el cartílago articular a soportar grandes cargas compresivas que dan al tejido su única función en las juntas sinoviales: articulación suave y libre de dolor, difundiendo la carga aplicada sobre el hueso subcondral y absorbiendo los choques
mecánicos.

La matriz de cartílago articular madura no está ni vascularizada ni inervada, conteniendo condrocitos en un número bajo que no se dividen después de la madurez esquelética. En parte es por esta razón que el cartílago articular no repara espontáneamente o solamente en una extensión muy limitada. Las aproximaciones habituales para la reparación del cartílago dependen de la retirada de deshechos tisulares, acceso al sistema de curación de la herida del hueso al penetrar la placa del hueso subcondral, y terapias basadas en células y la trasplantación de tejido. Las terapias clínicas habituales están limitadas a terapias basadas en células autólogas, tal como la implantación de condrocitos autólogos (denominado abreviadamente ACI por sus iniciales en inglés) y mosaicoplastia (también conocido como injertos osteocondrales autólogos). Debido a serios inconvenientes, ambas terapias pueden dirigirse habitualmente solo a una parte limitada del mercado de reparación de cartílago.

Para la mosaicoplastia, una mayor desventaja es la limitación a pequeños defectos debido a una disponibilidad limitada de tejidos donantes para trasplantación. Para la ACI, los inconvenientes incluyen la necesidad de realizar dos operaciones quirúrgicas, altos costes debido al cultivo requerido de células in vitro, y la pérdida del fenotipo de las células del cartílago. Las células del cartílago se dediferencian por encima de la expansión celular, lo que es parte del procedimiento de la ACI. Por lo tanto, requiere varios meses después de la operación antes de que alcance su fenotipo original. Solo entonces la reparación del cartílago real puede empezar.

Recientemente, una ACI de segunda generación ha sido desarrollada implicando condrocitos autólogos en una matriz de biomaterial. Esta técnica resuelve algunos de los problemas de la ACI, particularmente el procedimiento largo y de operación abierta que se requería en la ACI. Sin embargo, quedan tres inconvenientes importantes: se tienen que levar a cabo dos procedimientos quirúrgicos, costes elevados y larga rehabilitación.

De acuerdo con esto, hay una necesidad de más mejoras en el campo de la reparación de defectos tisulares, en particular para defectos que no están, o no suficientemente reparados de una manera espontánea.

De acuerdo con la invención se ha encontrado que la diferenciación de células multipotentes puede ser inducida al exponerlas a células primarias. Este efecto ha sido observado incluso cuando las células primarias son diluidas con células multipotentes en una extensión considerable. Incluso a un número muy bajo de células primarias respecto del número de células multipotentes, todavía tiene lugar la diferenciación de las células multipotentes en una línea específica. De hecho, se ha encontrado que la reparación tisular procede más rápidamente cuando se usa una población de células primarias y multipotentes que comprende 75% en volumen de células multipotentes, que cuando se usa solamente una población de células primarias.

Basado en este descubrimiento, se ha desarrollado un método para reparar defectos tisulares que es altamente efectivo en coste y no sufre las desventajas señaladas anteriormente de los métodos de la técnica anterior. La invención se define en las reivindicaciones anexas.

En particular, un uso para reparar un defecto tisular de acuerdo con la invención preferentemente ya no requiere múltiples procesos quirúrgicos. En un procedimiento, se pueden recoger ambas células primarias y multipotentes y se pueden aplicar al defecto tisular durante el mismo procedimiento. Consecuentemente, el tratamiento de un paciente requiere menos recursos en términos de tiempo en instalaciones quirúrgicas y en términos de equipo médico. Esto hará posible tratar un mayor número de pacientes por año con el mismo equipo médico e instalaciones quirúrgicas que antes. También, el hecho de que solo un procedimiento quirúrgico basta reducirá significantemente el dolor y el sufrimiento encontrado por los pacientes, al igual que el riesgo de infecciones y otras complicaciones durante la operación, y al mismo tiempo acelera el proceso de recuperación y rehabilitación.

Hay que notar que, en principio, se sabe de usar células multipotentes, tal como células madre mesenquimales, para la reparación tisular. Se puede hacer referencia respecto a esto a Mary Murphy et al., Arthritis & Rheumatism, 48(12), December 2003, pp. 3464-3474, y Körbling et al., N. Engl. J. Med., 349(6), August 2003, pp. 570-582. Los estudios descritos en estos artículos exploran el papel que pueden desempeñar las células madre implantadas en la reparación o regeneración tisular al entregar una preparación de células madre en un defecto. En estos estudios, sin embargo, las células madre son implantadas ellas mismas, es decir, sin células primarias.

La solicitud de patente internacional WO 03/078609 describe un método para inducir la diferenciación de células madre en una línea celular específica. A diferencia de la presente invención, el método descrito siempre requiere de una etapa de cultivo de células madre en presencia de una muestra tisular en un medio adecuado. En el método descrito en dicha solicitud de patente internacional, las células madre se diferencian en una línea celular preferentemente elegida entre el grupo de líneas celulares respiratoria, prostática, pancreática, mamaria, renal, intestinal, neural, ósea, vascular, hepática, hematopoyética, muscular o cardíaca. La diferenciación de células madre en condrocitos para formar tejido de cartílago no está descrita. Además, no se describe nada sobre relaciones adecuadas entre células madre y células en la muestra de tejido.

El documento WO-00/27999 describe la producción de células específicas de línea linfática al co-cultivar células progenitor hematopoyéticas con células estromal linforeticulares en una matriz sólida porosa. El documento no enseña nada sobre reparar tejido de cartílago las relaciones específicas de condrocitos entre células multipotentes como se reclama en este momento.

El documento WO-02/46401 se preocupa primeramente de inducir la inmunotolerancia para la trasplantación. Este documento no proporciona una orientación sobre el tema de la reparación de tejido de cartílago.

El documento US 5 851 832 trata principalmente del enriquecimiento y proliferación de células madre neuronales, más que sobre su diferenciación. No hay descripción de la reparación de tejido de cartílago.

De acuerdo con la invención, la expresión "células multipotentes" tiene la intención de referirse a células que pueden diferenciarse todavía en varios tipos especializados de elementos tisulares. Ejemplos de células multipotentes son células madre, que incluyen células madre embrionarias no humanas, células progenitor, células madre mesenquimales, células de médulas espinal, o células satélite. De acuerdo con la invención, los fibroblastos también se considera que están incluidos dentro de la expresión células multipotentes, ya que tienen una capacidad de diferenciarse en otros tipos de células. Se usan preferentemente células de médula espinal.

De acuerdo con la invención, la expresión "células primarias" tiene la intención de referirse a células que son células especializadas y que han perdido la capacidad de más diferenciación en (otro) tipo de células. Hay numerosos ejemplos de tipos diferentes de células primarias en el cuerpo humano o animal. La invención está dirigida a una reparación de cartílago y las células primarias son condrocitos.

La invención implica la recogida de una muestra de células multipotentes y de una muestra de células primarias. Típicamente, estas muestras se obtendrán en un procedimiento referido como biopsia. Este procedimiento se conoce per se y puede adaptarse al tipo específico de tejido del que se va a tomar la muestra de células. Por medio de ejemplos, se puede tomar una biopsia de tejido de cartílago, que contiene condrocitos, de al menos 100 mg (que implica 5 a 6 biopsias con un diámetro de 4 mm), preferentemente de una zona de baja carga no implicada, área de una rodilla herida durante una artroscopia y colectada en un tubo que contiene un medio adecuado, o directamente sometida a un protocolo perioperativo de aislamiento de células. Las autopsias de médula espinal puede obtenerse a partir de cualquier hueso pélvico (cresta ilíaca) o cualquier parte proximal o distal del fémur. Todas las biopsias se toman preferentemente de áreas en las que, o cerca de, tiene lugar la operación pretendida. Cuando se crean aperturas en el hueso como parte del procedimiento, se puede insertar una aguja de biopsia 8 gauge y se pueden aspirar 2-50 cc de médula espinal. Preferentemente, se tiran la aguja y la jeringa usadas antes usando una solución de heparina al 1% para prevenir la médula de la coagulación. En el caso en el que se usa toda la médula espinal, se aspira preferentemente sin heparina. Después de la aspiración, la médula espinal puede ser inyectada bajo condicione estériles en un tubo heparinizado, p. ej. por cada 10 ml de médula espinal.

En una realización alternativa, una biopsia, particularmente una biopsia de células multipotentes, implica preparar células multipotentes disponibles durante la operación en el sitio del defecto. De acuerdo con esta realización, se usan las células multipotentes que están presentes en o cerca del defecto tisular. Ventajosamente, esta realización no requiere aislar las células multipotentes del cuerpo del paciente; se hacen simplemente disponibles a las células primarias en el sitio del defecto. Esto puede hacerse, por ejemplo, al reclutar células multipotentes in situ por penetración de la placa del hueso subcondral, o al aplicar atrayentes químicos para atraer células multipotentes de origen sinovial al
defecto.

El tipo y fuente de células primarias se elegirán dependiendo del tipo de tejido que pretende ser reparado. Preferentemente, las células primarias son de un tipo de célula que ocurre naturalmente en el tejido que será reparado. De acuerdo con la invención, los condrocitos se recogen para reparar defectos del cartílago. El tipo y fuente de células multipotentes también se elige preferentemente dependiendo del tipo de tejido que se pretende reparar.

La siguiente visión general da ejemplos de cómo tipos de células de células primarias y multipotentes pueden elegirse con vista a reparar un tipo de tejido específico.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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En una realización preferida, las células recogidas se aíslan de las muestras obtenidas en la biopsia. Esto puede hacerse para células en un fluido por separación por flujo magnético, separación de células activadas por fluorescencia (denominado abreviadamente FACS por sus iniciales en inglés), filtración por columna, centrifugación, separación por percolación, o unión a plástico para cultivo tisular. Para células en tejido esto puede hacerse por trituración, es decir dispersión de células a través de una acción de medio bombeo, seguido por disección y digestión enzimática de tejido, y aislamiento vías filtración por columna, centrifugación, separación por membrana, o separación por gel. Los ejemplos adecuados de enzimas a usar en este aspecto incluyen, pero no son limitantes, colagenasa, dispasa, tripsina, elastasa, hialuronidasa, y papaína.

También es posible usar células recogidas sin aislarlas. Por ejemplo, se pueden usar fracciones de médula espinal o toda la médula espinal directamente para proporcionar células multipotentes. También, se puede usar tejido triturado o troceado (trocitos de tejido) sin más aislamiento de células como componente de células primarias.

De acuerdo con la invención, las poblaciones obtenidas de células primarias y multipotentes se combinan in vitro, in vivo o in situ con el fin de inducir la diferenciación de las células multipotentes. Ambas células primarias y multipotentes pueden combinarse unas con otras con o sin componentes de tejido que podría rodearlas en su entorno natural. Ejemplos de tales componentes incluyen médula espinal y sangre. Ventajosamente, las células multipotentes se diferenciarán en el tipo de células de las células primarias. Sorprendentemente, se ha encontrado que solo un número pequeño de células primarias, respecto al número de células multipotentes, es necesario para conseguir el efecto deseado de inducción. La relación del número de células en la población de células primarias respecto al número de células en la población de células multipotentes, las dos poblaciones que van a ser combinadas, es de 1:200 a 2:3, preferentemente de 1:100 a 1:3, más preferentemente de 1:50 a 1:5.

En J. Thorac. Cardiovasc. Surg., June 2003, 125(6), pp. 1470-1480, y J. Thorac. Cardiovasc. Surg., August 2002, 50(8), pp. 321-324, Fukuhara et al. han descrito que las células de estroma de médula espinal pueden entrar en una línea cardíaca in vitro cuando se co-cultivan junto con cardiomiocitos en una relación de 1:1 para siete días. Sorprendentemente, de acuerdo con la invención se ha encontrado que bastan números de células primarias más pequeños respecto al número de células multipotentes con el fin de inducir la diferenciación de las células multipotentes. También, de acuerdo con la invención, no es necesario co-cultivar in vitro las poblaciones de células combinadas. De hecho, se prefiere que las poblaciones de células combinadas se apliquen a un defecto tisular sin cultivar in vitro, haciéndose antes o después de combinar las dos poblaciones de células.

Las aproximaciones convencionales a la ingeniería tisular que empieza a partir de células multipotentes dependían de factores químicos, tal como factores de crecimiento, con el fin de estimular y conseguir la diferenciación de células multipotentes. En estas aproximaciones, las células multipotentes se someten a la acción de los factores químicos in vitro para ser implantadas solo después de la diferenciación. Como ya se ha mencionado, como consecuencia no es necesario el cultivo in vitro. En lugar de ello las células multipotentes recogidas pueden aplicarse a un defecto tisular en un estado no diferenciado. También, de acuerdo con la invención, el uso de factores químicos con el fin de conseguir la diferenciación de células multipotentes no es necesario. No obstante, la diferenciación puede aumentarse más al hacer uso de tales factores, que también son abarcados por la invención. Algunos ejemplos de factores químicos que se pueden usar incluyen factores de adhesión celular tal como vitronectina, tenascina, péptidos RGD, hialuronán, laminina, pronectina, o fibronectina o sus fragmentos, p. ej. arginina-glicina-aspartato, y citoquinas u otros factores de estimulación de células liberables tal como factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento tipo insulina 1 (IGF-1), hormona de crecimiento (GH), actividad estimulante de la multiplicación (MSA), factor derivado de cartílago (CDF), proteínas morfogenéticas de hueso (BMPs), factor de diferenciación de crecimiento 5 (GDF-5), dexametasona (dex), u otros factores osteogénicos, factores anti-angiogénesis (angiostatina), y factor de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF).

Para la inducción de la diferenciación de células multipotentes en condrocitos, se ha encontrado que el uso de fibronectina es particularmente ventajoso. La fibronectina es conocida generalmente por inhibir la condrogénisis (West, C. M., R. Lanza, J. Rosenbloom, M. Lowe, H. Holtzer, and N. Avdalovic, Fibronectin alters the phenotypic properties of cultured chick embryo chondroblasts. Cell, 1979, 17(3): 491-501, Pennypacker, J. P., J. R. Hassell, K. M. Yamada, and R. M. Pratt, The influence of an adhesive cell surface protein on chondrogenic expression in vitro. Exp. Cell Res, 1979, 121(2): p.411-5). En contraste y sorprendentemente, ahora se ha encontrado que la fibronectina mejora la formación del cartílago (Figura 4) en un método de acuerdo con la invención. Sin el deseo de ser estar ligado por la teoría, se ha postulado que las causas para esta mejora de la formación del cartílago puede ser porque la fibronectina permite mantener a los condrocitos su morfología redondeada.

Antes o después de combinar las poblaciones de células primarias y multipotentes, se pueden sembrar sobre un soporte biocompatible. Preferentemente, las poblaciones se combinan de manera adecuada para asegurar una distribución homogénea de los tipos de células sobre la población de células. En este sentido, se prefiere que las poblaciones se combinen antes de sembrarse sobre el soporte. Por otro lado, también es factible, y bajo ciertas condiciones ventajosas, distribuir los dos tipos de células de una manera compartimentada sobre el soporte, tal que distintos compartimentos comprendan predominantemente, o incluso exclusivamente células de un solo tipo de célula.

Si es deseable o no usar un soporte biocompatible en una cierta situación puede determinarse rápidamente por el experto en la técnica dependiendo del tipo de tejido que es necesario reparar y del tamaño del defecto. Particularmente para reparar grandes defectos en tejidos, tal como hueso o cartílago, que tienen una función mecánica, p.ej. de apoyo, el uso de un soporte, es beneficioso. La elección del material para el soporte también dependerá del tipo de tejido implicado. Ejemplos adecuados de materiales incluyen metales y aleaciones de metales, cerámicas, (bio)cristales y materiales poliméricos. Por supuesto es importante que el material sea biocompatible, que significa que el material puede ser incorporado en un cuerpo humano o animal sustancialmente sin respuestas inaceptables del ser humano o animal.

Los materiales preferidos usados en la fabricación de un soporte son biocompatibles, bioabsorbibles durante períodos de semanas o más, y generalmente fomenta la unión celular. El término "bioabsorbible" se usa en este texto para significar que el material se degrada en componentes que pueden ser absorbidos por el cuerpo y que pueden ser posteriormente biodegradables. Los materiales biodegradables son capaces de ser degradados por procesos biológicos activos tal como rotura enzimática. Otras propiedades deseables para materiales a ser usados en la fabricación de dispositivos descritos en este texto incluyen solubilidad en un disolvente aceptable biológicamente que puede ser retirado hasta niveles seguros generalmente aceptables, y fuerza de elasticidad y comprensiva y de tensión.

Los polímeros naturales que son adecuados incluyen polisacáridos tal como celulosa, dextranos, quitina, quitosano, glicosaminoglicanos; ácidos o ésteres hialurónicos, sulfato de condroitina, y heparina; y proteínas naturales o sintéticas o proteinoideos tal como elastina, colágeno, agarosa, alginato de calcio, fibronectina, fibrina, laminina, gelatina, albúmina, caseína, proteína de seda, proteinoglicanos, prolastina, pronectina, o BetaSilk. También se pueden usar mezclas de cualquier combinación de polímeros, al igual que derivados modificados químicamente de los polímeros mencionados.

Los polímeros sintéticos que se ha encontrado que son particularmente adecuados para preparar un soporte incluye copolímeros o polialquilenglicol y ésteres aromáticos y poli(alfa)ésteres, tal como: poli(ácido láctico) (PLA) y poli(DL-ácidoláctico-coglicólico) (PLGA). Otros materiales adecuados incluyen: geles termoreversibles o fotocurables, tal como pluronic o copolímeros bloque de poli(D-lactida) y poli(L-lactida) injertado a dextrano, preferentemente que comprende un poliéster o un esqueleto de poli-\alpha-aminoácido, y/o heparina, poli(epsilon-caprolactona) (PCL), polianhídridos, poliarilatos, y polifosfaceno. Los polímeros sintéticos preferidos incluyen: poli(hidroxialcanoatos), polidioxanona, poliaminoácidos, poli(gamma-ácido glutámico), poli(acetatos de vinilo), poli(alcoholes de vinilo), poli(etileniminas), poli(ortoésteres), polifosfoésteres, poli(tirosina-carbonatos), poli(etilenglicoles), poli(trimetilen carbonato), poliminocarbonatos, poli(oxietilen-poli-oxipropileno), poli(alfa-hidroxi-ácido carboxílico/polioxialquileno), poliacetales, poli(fumaratos de propileno), y carboximetilcelulosa.

En una realización altamente preferida, el soporte se prepara a partir de un clase específica de materiales poliméricos que tienen propiedades de hidrogel. Esta es la clase de copolímeros de un polialquilenglicol y un poliéster aromático. Preferentemente, estos copolímeros comprenden 40-80% en peso, más preferentemente 50-70% en peso del polialquilenglicol, y 60-20% en peso, más preferentemente 50-30% en peso del poliéster aromático. Un tipo preferido de copolímeros de acuerdo con la invención está formado por el grupo de los copolímeros bloque. Los polialquenglicoles preferidos se eligen entre el grupo de poletilenglicol, polipropilenglicol, y polibutilenglicol y sus copolímeros, tal como poloxámeros. Un polialquenglicol altamente preferido es poletilenglicol. Los poliésteres preferidos se eligen entre el grupo de poli(tereftalato de polietileno), poli(tereftalato de propileno), y poli(tereftalato de butileno). Un poliéster altamente preferido es poli(tereftalato de butileno).

Preferentemente, el polialquilenglicol tiene un peso molecular medio en peso de 150 a 10000, más presentemente de 200 a 1500. El poliéster aromático tiene preferentemente un peso molecular medio en peso de 200 a 5000, más preferentemente de 250 a 4000. El peso molecular medio en peso del copolímero preferentemente se halla entre 20000 y 200000, más preferentemente entre 50000 y 120000. El peso molecular medio en peso puede determinarse adecuadamente mediante cromatografía de permeabilidad en gel (denominado abreviadamente GPC por sus iniciales en inglés). Esta técnica, que se conoce per se, puede mejorarse por ejemplo al usar tetrahidrofurano como disolvente y poliestireno como estándar externo.

El soporte se construirá para conseguir una estabilidad mecánica y una proliferación y diferenciación favorables. (ambas in vivo). Por supuesto, el soporte podría también ser de un tamaño y forma para encajar en el defecto que va a ser reparado. Se prevé que se suministran un tamaño y forma estándar, o una combinación de tamaños y formas estándares a un cirujano que pude moldear o adaptar la forma y el tamaño a los requerimientos del defecto a tratar. También es posible que el soporte no tenga una forma particular pero permita que las poblaciones combinadas de células multipotentes y primarias sea inyectadas, p.ej. en la forma de un gel inyectable. Las variables que pueden manipularse para conseguir un efecto deseado son inter alia la fabricación, composición química, microestructura incluida la porosidad, tamaño de poro (diámetro), modificaciones superficiales tal como tensioactivos y péptidos de unión celular, incorporación de agentes bioactivos, propiedades de flujo (p.ej. canales que dirigen y controlan el flujo del fluido a través y dentro del soporte), y elementos estructurales sobre o en el soporte.

A menudo, el soporte tendrá una estructura porosa o fibrosa con el fin de facilitar el transporte de nutrientes a las células sembradas en él, y de materiales de deshecho de las células sembradas sobre y/o en él. Se puede obtener una estructura porosa de un material polimérico mediante cualquier método conocido, tal como lixiviación con sales o sinterización. En principio, se pueden usar cualquier combinación de técnicas, tal como una inversión de fase, secado por congelación y lixiviación con sales. También es posible emplear un soporte que se fabrica de una manera libre, prototipado rápido o procedimiento de impresión 3D.

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En una realización preferida, la superficie externa del soporte se proporciona parcialmente o completamente con un recubrimiento cerámico. Preferentemente, el recubrimiento cerámico es un recubrimiento de fosfato de calcio, p.ej. un recubrimiento que comprende fosfato de octocalcio, una apatita, tal como hidroxiapatita o apatita de carbonato, whitlockite, tal como fosfato de \alpha-tricalcio, fosfato de \beta-tricalcio, fosfato de calcio y sodio, o una de sus combinaciones. También es posible usar un soporte que es una estructura composite bifásica de un material cerámico y un material polimérico. Se ha encontrado que la presencia de material cerámico es altamente beneficiosa ya que puede usarse para imitar las propiedades del hueso.

El sembrado de las poblaciones de células puede llevarse a cabo de cualquier manera conocida, por ejemplo al usar un vehículo de sembrado, sembrado estático, dinámico o por perfusión, o una de sus combinaciones.

Después de combinar las poblaciones de células primarias y multipotentes, se aplican al defecto. Esta es una de las ventajas de la invención que no está implicada ninguna expansión vía cultivo de células in vitro. Las células primarias y multipotentes pueden hacerse disponibles en el sitio del defecto para inducir y soportar la reacción de reparación natural del cuerpo. Sin desear estar atado por la teoría, se cree que las células primarias producen y segregan factores específicos como una respuesta a su entorno natural, factores que mejorarán o inducirán la diferenciación de las células multipotentes en una línea específica tisular. De este modo, al aplicar células primarias, la población de células multipotentes se proporciona con una "fábrica" que establece una cascada natural de crecimiento y otros factores envueltos en la reparación tisular.

Como ya se ha indicado anteriormente, se prefiere que las dos poblaciones de células se distribuyan sustancialmente homogéneamente totalmente la una en la otra antes de la aplicación en el defecto. Esto puede llevarse a cabo mediante resuspensión de la mezcla de las dos poblaciones de células por rotación o decantación, preferentemente justo antes de la aplicación. En el caso de que las poblaciones combinadas de células sean aplicadas al defecto junto con un soporte, se combinan preferentemente primero y luego se siembran sobre el soporte. El soporte que comprende las poblaciones de células combinadas puede aplicarse luego al defecto.

La manera en la que las poblaciones de células combinadas serán aplicadas al defecto dependerá del tipo de tejido en el que el defecto existe y si se usa o no un soporte. Las maneras adecuadas de aplicar las células incluyen netas (es decir células solamente), directas en gel o pegamento tisular para aplicar en los sitios que no requieren una estabilidad mecánica inmediata, o por sembrado en gel o pegamento tisular sobre un soporte para aplicación en sitios que lo requieren. El sembrado de células sobre el soporte, o su aplicación en el sitio del tejido a reparar, puede ser ayudado usando un factor de agregación, tal como fibronectina o vitronectina. Las células también pueden aplicarse bajo el periosteo suturado sobre el defecto tisular y cerrado con pegamento de fibrina. Los factores tal como hialuronán, glicosaminoglicanos, o inhibidores de la apoptosis celular pueden añadirse para mejorar la supervivencia celular después de la implantación, cuando se considera útil.

También se ha descrito un kit para llevar a cabo un método tal como se ha descrito anteriormente. El kit proporciona preferentemente al equipo médico todos los materiales y equipo necesario para llevar a cabo el procedimiento presente para la reparación tisular. De este modo, el kit comprende medios para tomar una biopsia de una población de células primarias, medios para tomar una biopsia de una población de células multipotentes, y medios para aplicar una combinación de ambas poblaciones a un defecto tisular. En una realización preferida, el kit comprende además un soporte biocompatible, tal como se ha descrito anteriormente, y medios para sembrar las poblaciones combinadas de células multipotentes y primarias sobre el soporte. Se prefiere más aún que el kit comprenda medios para el aislamiento de células multipotentes de una biopsia.

Los ejemplos de dispositivos o equipo para tomar una biopsia de una población de células multipotentes incluye agujas y jeringas para aspirar, preferentemente que incluyen una aguja para biopsia 8 gauge para biopsias de médula espinal.

Los ejemplos de dispositivos o equipo para tomar una biopsia de una población de células primarias incluyen, dependiendo del tipo de células primarias, una cureta con anillo de diámetro pequeño (preferiblemente a lo sumo 6 mm), o un escalpelo Notchplasty.

Los medios o instrumentos adecuados para aislar células, es decir células multipotentes o primarias, a partir de una biopsia son inter alia enzimas, tal como colagenasa, hialuronidasa, elastasa, papína, tripsina, o dispasa.

El kit comprende preferentemente medios para combinar y mezclar las poblaciones de células multipotentes y primarias. Al final, pueden estar presentes instrumentos tal como un colador celular, un objeto de plástico para procesado de células, un sistema de filtro celular y una o más pipetas.

Los medios adecuados para sembrar células sobre un soporte que pueden estar presentes en un kit de acuerdo con la invención incluyen dispositivos de sembrado simple tal como una cámara confinada o no confinada, o un sistema de perfusión.

Los ejemplos de medios para aplicar las poblaciones combinadas de células multipotentes y primarias, o el soporte con las poblaciones combinadas de células multipotentes y primarias sembradas encima de un defecto tisular, que pueden estar presentes en un kit de acuerdo con la invención incluyen pegamento tisular, geles, factores de agregación celular y una o más jeringas.

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Ahora será más aclarada la invención mediante los ejemplos siguientes.

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Ejemplo 1

Inducción de la diferenciación al mezclar condrocitos primarios y expandidos en ensayo de cultivo en pelet bajo diferentes condiciones

Los condrocitos se aislaron de cartílago bovino adulto de la tibia por medio de digestión de colagenasa tipo II (Worthington). Las células aisladas se sembraron a una densidad de 3500 células/cm^{2} y subcultivadas con 3 pases en un medio que contenía DMEM, HEPES 10 mM, 1 x aminoácidos no esenciales, AsAP 0,2 mM, 100 U de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina, prolina 0,4 mM y FBS al 10% a 37ºC/5% de CO_{2}. Las células primarias y expandidas se cultivaron en ensayo en pelet bajo las condiciones siguientes; los pelets de células expandidas compartieron medio con los pelets de células primarias (A) pelet de células expandidas cultivadas en medio acondicionado por pelet de células primarias (B). Los pelets de una mezcla 50/50 de células primaris y expandidas (C) + control; pelet de células primarias (D) - control; pelet de células expandidas (E). Después de 2 semanas de cultivo, los pelets se fijaron con aldehído glutárico al 1,5% en tampón de cacodilato (0,14 M/pH 7,2-7,4) para tinción con safraninO, embebido y congelado en compuesto OCT (Tissue-Tek) para inmunotinción o congelado a -80ºC para ensayo de GAG y ADN cuantitativos. Los glicosaminoglicanos sulfatados (GAG) se tiñeron con safraninO y se recontaron por colorimetría con hematoxilina y Verde Rápido respectivamente para núcleos y citoplasma. Las criosecciones se fijaron con acetona y se tiñeron para colágeno tipo II (1:100, DSHB II-II6B3) o colágeno tipo I (1:1000, Ab-1, Calbiochem). El bloqueo se hizo con suero humano al 10% y se usó anticuerpo secundario de chivo-antiratón (1:100, DAKO). La tinción se visualizó con solución DAB (DAKO) durante 10 minutos.

Los resultados de safracinO y colágeno tipo II muestran que las células del grupo C y D producen GAG específico de cartílago en todo el pelet mientras que los pelets del grupo A, B y E no producen ningún GAG. Los resultados de inmunoquímica también muestran que solamente las células en el anillo externo de un pelet del grupo C y D expresan colágeno tipo I, confirmando la diferenciación de células en pelet de células mezcladas (C) para estar a niveles comparables como en pelet de células primarias solamente. Mientras que la tinción para colágeno tipo I de pelets en los grupos A, B y E se encuentra en todos los pelets, no se puede encontrar colágeno tipo II específico en pelet de estos grupos. De este modo, se concluye que los condrocitos expandidos no se estimulan para diferenciarse, de ahí que produzcan una matriz extracelular específica de cartílago, al cultivar en cualquier medio compartido con células primarias o medio acondicionado de células primarias. Sin embargo cuando en contacto célula-célula con células primarias estos resultados muestran que se estimula la diferenciación y los GAG se producen a niveles comparables en pelets de células primarias y expandidas mezcladas a células primarias solamente. Con estos resultados se muestra que el contacto célula-célula induce diferenciación.

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Ejemplo 2

Diferenciación en pelets que consisten en una mezcla de células primarias y expandidas a varias relaciones

El experimento se diseñó para examinar la capacidad de diferenciación de diferentes relaciones primarias/expandi-
das en ensayo de pelet.

Los condrocitos se aislaron de cartílago bovino adulto de la tibia por medio de digestión de colagenasa tipo II (Worthington). Las células aisladas se sembraron a una densidad de 3500 células/cm^{2} y se subcultivaron con 3 pases en un medio que contenía DMEM, HEPES 10 mM, 1 x aminoácidos no esenciales, AsAP 0,2 mM, 100 U de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina, prolina 0,4 mM y FBS al 10% a 37ºC/5% de CO_{2}. Los pelets de una mezcla 50/50 de células primarias y expandidas se cultivaron en el medio descrito anteriormente. Después de 2 semanas en cultivo, los pelets se fijaron con glutaraldehido al 1,5% en tampón cacodilato (0,14 M/pH 7,2-7,4) para tinción con safraninO, embebido y congelado en compuesto OCT (Tissue-Tek) para inmunotinción o congelado a -80ºC para ensayo de GAG y de ADN cuantitativos. Los glicosaminoglicanos sulfatados (GAG) se tiñeron de rosa con safraninO y se recontaron por colorimetría con hematoxilina y Verde Rápido respectivamente para núcleos (marrón) y citoplasma (azul). Las criosecciones se fijaron con acetona y se tiñeron para colágeno tipo II (1:100, DSHB II-II6B3) o colágeno tipo I (1:1000, Ab-1, Calbiochem). El bloqueo se hizo con suero humano al 10% y se usó anticuerpo secundario de chivo-antiratón (1:100, DAKO). La tinción se visualizó con solución DAB (DAKO) durante 10 minutos. Los ejemplos para ensayo de GAG y de ADN cuantitativos fueron digeridos con 50 mg/ml de proteinasa K (SIGMA) durante >16 horas a 56ºC. El contenido de GAG se determinó espectrofotométricamente con colorante cloruro de azul de 9-dimetilmetileno (DMMB) en tampón PBE (14,2 g/l Na_{2}HPO_{4} y 3,72 g/l Na_{2}EDTA, pH 6,5) y el ensayo de ADN se realizó con el ensayo de ADN con CyQuant de acuerdo con la descripción del fabricante.

Con referencia a la figura 2 las células primarias/expandidas se mezclaron en las relaciones indicadas y se cultivaron en ensayo de pelet (500000 células/pelet) durante 2 semanas. Los resultados del GAG cualitativo y colágeno de tipo II muestran que solamente en pelets con 0/100 células primarias/expandidas no se pueden encontrar GAG o colágeno de tipo II mientras solamente en pelets con 100/0 células primarias/expandidas está presente colágeno de tipo I. Con estos resultados que con cantidades decrecientes de células primarias el nivel de diferenciación se mantiene en los pelets (A). Además, los resultados de GAG/ADN cuantitativos (B) muestran que cuando la cantidad de células primarias decrece hasta 10%, la diferenciación todavía está en niveles comparables a los de con células primarias solo en ensayo de cultivo con pelet. Además, cuando el número de células primarias decrece más hasta 2% la cantidad de GAG/ADN es aproximadamente 25 x más alta de los esperado a partir de la misma cantidad de células primarias solamente. Sorprendentemente, los resultados del número de células muestran que solamente cuando la cantidad de células primarias en el pelet crece por encima de 25%, ocurre la proliferación.

Con estos resultados se muestra que en la mezcla de células de condrocitos primarios/expandidos se estimula la diferenciación incluso cuando la cantidad de células primarias decrece hasta el 2% del total de la población celular. Los resultados de GAG/ADN cuantitativo muestran en realidad que la cantidad de GAG en pelets que contienen 2% de células primarias es aproximadamente 25 x más alto que pueda esperarse de la misma cantidad de células primarias solamente. Con estos datos se muestra que la diferenciación se mejora fuertemente con una pequeña cantidad de células primarias en presencia de una gran cantidad de células dediferenciadas tal como condrocitos cultivados.

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Ejemplo 3

Diferenciación de condrocitos fibroblastos/primarios respectivamente y condrocitos células de médula espinal/prima- rios en ensayo de pelet

El experimento se diseñó para examinar la capacidad de diferenciación de diferentes tipos de células de médula espinal mezclados con condrocitos primarios en ensayo de pelet. Los fibroblastos eran de una línea de células de fibroblastos 3T3 cultivados en DMEM/BioWhitakker #BE12-604F), 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina, y FBS al 5%y células de médula espinal aisladas de una biopsia de médula espinal humana y cultivadas en \alphaMEM (Gibco #22571-020) que contenía FBS al 10%, 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina, y AsAP 10 mM y 1 ng/ml de bFGF. Los condrocitos se aislaron de una biopsia de cartílago articular humano de la rodilla. Después de mezclar los pelets se cultivaron a 37ºC/5% de CO_{2} en un medio que contenía DMEM (Gibco #41965-039), HEPES 10 mM, 1 x aminoácidos no esenciales, AsAP 0,2 mM, 100 U de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina, prolina 0,4 mM y FBS al 10%. Con referencia a la figura 3 las mezclas de células de 50% de células primarias y 50% de fibroblastos o células de médula espinal respectivamente se centrifugaron para formar pelets y se cultivaron durante 3 semanas. Las secciones de pelets se tiñeron para glicosaminoglicanos sulfatados (GAGs) con safracinO (rosa). Los resultados muestran la producción de GAGs en todos los pelets cuando los condrocitos se mezclan con cualquiera fibroblasto 3T3 o células de médula espinal pero no en pelets de fibroblastos o células de médula espinal solos. Los que indica la estimulación de la diferenciación en la línea de cartílago con cualquier fibroblastos o células de médula espinal (células multipotentes) cuando se mezclan con condrocitos primarios.

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Ejemplos 4 & 5

Diferenciación de mezcla de células primarias/expandidas sobre soportes PEGT/PBT 300/55/45 in vivo

El experimento se diseñó para examinar la capacidad de diferenciación de mezclas de células primarias/expandidas sobre un soporte poroso in vivo en presencia o no de un factor implicado en agregación de células (fibronectina).

Los condrocitos se aislaron a partir de una biopsia de un cartílago articular humano de rodilla por medio de digestión de colagenasa tipo II (Worthington). Las células aisladas se sembraron a una densidad de 3500 células/cm^{2} y se subcultivaron con 3 pases en un medio que contenía DMEM, HEPES 10 mM, 1 x aminoácidos no esenciales, AsAP 0,2 mM, 100 U de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina, prolina 0,4 mM y FBS al 10% a 37ºC/CO_{2} 5%. Las células primarias se aislaron de cartílago bovino maduro y se combinaron con células expandidas en las relaciones siguientes: 0/100, 100/0, y 2/98, 20/80 y 50/50. Las mezclas de células se incubaron durante 1 h con 300 \mug/ml de fibronectina para formar agregados y se sembraron dinámicamente sobre soportes porosos durante 24 h en tubos eppendorf con un filtro de intercambio gaseoso a 37ºC/5% de CO_{2} en medio de cultivo. Los soportes porosos se fabricaron con copolímeros segmentados de poli(tereftalato de etilenglicol) (PEGT) y poli(tereftatalato de butileno) (PBT) con la composición de una relación en peso de 55/45 PEGT/PBT y un peso molecular de 300 de PEG. Después de 7 días de cultivo estático en el medio de cultivo descrito anteriormente, los soportes sembrados se implantaron subcutáneamente en ratón atímico. Por cada grupo experimental se implantaron 8 soportes y 6 para los controles. Después de 4 semanas los soportes se extrajeron y se determinó la relación en peso de todo y ½ de cada soporte para el análisis de glicosaminoglicano (GAG) y ADN cuantitativo. La mitad del soporte se digirió con 50 mg/ml de proteínasa K (SIGMA) durante >16 h a 56ºC. El contenido de GAG se determinó con colorante cloruro de azul de 9-dimetilmetileno (DMMB) en tampón PBE (14,2 g/l Na_{2}HPO_{4} y 3,72 g/l Na_{2}EDTA, pH 6,5) en un espectrofotómetro (540 nm) y el ensayo de ADN se realizó con el ensayo de ADN con CyQuant de acuerdo con la descripción del fabricante.

Con referencia a la figura 4 las mezclas de células con una relación 50/50 primarias*/expandidas se sembraron sobre soportes porosos (Pm PEG)/(p/p PEGT/PBT) 300/55/45. La mezcla de células no tratadas se sembró sobre un soporte no tratado (control). La mezcla de células no tratadas se sembró sobre un soporte recubierto de fibronectina (300 \mug/ml) (soporte recubierto FN) o mezcla de células tratadas con fibronectina (300 \mug/ml) se sembraron sobre soportes no tratados (células agregadas FN). Los soportes se implantaron subcutáneamente en ratón atímico y después de 4 semanas los ejemplos se extrajeron y se cuantificó GAG/soporte. Los resultados muestran que la agregación de células en presencia de fibronectina aumenta la

\hbox{producción de GAG/ADN de mezcla  de células
primarias/expandidas 50/50.}

Con referencia a la figura 5 se agregaron mezclas de células con diferentes relaciones primarias/expandidas en presencia de 300 \mug/ml de fibronectina y se sembraron sobre soportes porosos (Pm PEG)/(p/p PEGT/PBT) 300/55/45. Los soportes se implantaron subcutáneamente en ratón atímico y después de 4 semanas los ejemplos se extrajeron y se cuantificó GAG/soporte. Los resultados muestran que en presencia de 20% de células primarias el contenido GAG/soporte es igual a soportes con 100% de células primarias. Más aún cuando el 50% de células primarias se mezclaron con 50% de células expandidas el contenido GAG/soporte aumentó >1,5.

En la figura 5, los \mug GAG/soporte mostrado se normaliza a una relación de células 0/100 sustrayendo un valor constante. Los medios acondicionados por células primarias se mostraron inefectivos para inducir condrogénesis en células multipotentes.

La fibronectina se conoce generalmente por inhibir la condrogénesis. En contraste y sorprendentemente, se encontró que la fibronectina mejoraba la formación de cartílago (figura 4) en dicho sistema de inducción.

Para retener las células en el sitio del defecto, en particular para un procedimiento interoperativo y autólogo, preferentemente, se toman o se requieren medidas específicas, es decir usando geles u otros medios para inmovilizar células sin depender de la unión celular sobre un sustrato que requiera un período de tiempo sustancial.

Para proteger las células del postoperatorio de la carga sobre la articulación, preferentemente, las células estarán rodeadas por un soporte o gel u otros medios que proporcionan algún o completo soporte mecánico. Para la reparación del cartílago, preferentemente, el soporte usado es funcional mecánicamente, es decir muestra similitudes a las propiedades mecánicas del cartílago.

A partir de estos resultados está claro que la capacidad de diferenciación de mezclas de células primarias/expandidas de 20/80 en soportes porosos in vivo es igual a células primarias solas.

En estos ejemplos, las células se trataron con fibronectina para ilustrar que la diferenciación puede ser soportada por agregación de células. Para agregar células se pueden usar otros factores específicos de tejidos como vitronectina, laminina, hialuronán. El soporte elegido para este estudio es un ejemplo de un soporte adecuado para soportar propiedades mecánicas de un tejido específico, en este caso cartílago, inmediatamente después de la implantación. En este ejemplo el soporte elegido se usa también como un vehículo para aplicar una mezcla celular en el defecto.

Claims

1. Uso de una composición que comprende una población de células multipotentes, excluyendo células de origen embrionario humano y una población de condrocitos para la fabricación de un medicamento para la reparación de tejido de cartílago en un paciente humano o animal, en el que la relación del número de células en la población de células condrocitos respecto al número de células en la población de células multipotentes es de 1:200 a 2:3.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el paciente es un paciente humano, y en el que las células multipotentes y los condrocitos son células humanas.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que la población de células multipotentes y/o la población de condrocitos se aíslan de una biopsia.

4. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la población de células multipotentes y la población de condrocitos se combinan sin haber sido cultivadas in vitro.

5. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las poblaciones combinadas de condrocitos multipotentes y condrocitos se aplican a un defecto de tejido de cartílago sin haber sido cultivados in vitro.

6. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las células multipotentes son células madre, células progenitor, células madre mesenquimales, células de médula espinal, fibroblastos, o células satélite.

7. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que las células multipotentes son células de médula espinal.

8. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la relación del número de células en la población de condrocitos entre el número de células en la población de células multipotentes es de 1:0 a 1:5.

9. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la población de células multipotentes y la población de condrocitos se proporciona en un soporte biocompatible.

10. Uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el soporte biocompatible se fabrica de un material elegido entre el grupo de metales y aleaciones de metales, cerámicas, (bio)cristales, materiales poliméricos naturales y sintéticos, y sus combinaciones.

11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el soporte biocompatible se fabrica de un copolímero de un polietilenglicol y un poli(tereftalato de polibutileno).

12. Uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el soporte biocompatible está recubierto parcialmente o completamente por un recubrimiento de fosfato de calcio.