ES2308198T3 - Metodos para el uso de un complejo lkb1/strad/mo25. - Google Patents

Abstract

Un método para la identificación de un compuesto para su uso en la modulación, por ejemplo la promoción, la activación o la fosforilación de AMPK (proteína cinasa activada con AMP) o miembro de la subfamilia AMPK en una célula, método que comprende los pasos de: (1) determinación si un compuesto de prueba modula, por ejemplo promueve, la actividad de proteína cinasa de LKB1, y (2) selección de un compuesto que modula, por ejemplo promueve, la actividad de la proteína cinasa de LKB1, en el que el LKB1 está en una preparación con STRAD y MO25 en el que el M025 es recombinante y esta expresado de un ácido nucleico recombinante.

Description

Métodos para el uso de un complejo LKB1/STRAD/MO25.

La presente invención se refiere a las proteinocinasas y su regulación.

LKB1 es una proteinocinasa Ser/Tr no relacionada estrechamente a otras proteinocinasas (revisado en (Yoo et al., 2002)). Se han ligado mutaciones en LKB1 al Síndrome del Cáncer de Peutz Jeghers (SPJ), un trastorno hereditario autosómico dominante (Hemminki et al., 1998; Jenne et al., 1998) caracterizado en aquéllos afectados por el desarrollo de pólipos hamartomatosos gastro-intestinales múltiples así como un espectro ancho de tumores benignos y malignos (Hemminki, 1999), con un riesgo aumentado 15 veces de desarrollar los cánceres malignos en muchos tejidos [20,21]. Hasta la fecha, casi 100 mutaciones diferentes en el gen LKB 1 se han identificado en pacientes de SPJ, la mayoría de los cuales se esperaría que dañe la actividad del LKB 1 [22]. La deleción de ambos alelos del gen LKB 1 en ratones resulta en el letalidad embrionaria a medio gestación surgiendo múltiples defectos (Ylikorkala et al., 2001), indicando que el LKB1 juega un papel esencial en el desarrollo. Pretenciosamente los ratones heterocigotos de LKB1 son viables pero desarrollan el SPJ similar a una enfermedad caracterizada por hamartomas gastrointestinales, aunque es polémico si éstos son causados por haploinosuficiencia o pérdida de heterocigosidad (revisado en [22]). Después en la vida (por ejemplo sobre 50 semanas de edad) estos animales también desarrollan tumores malignos, como el carcinoma hepatocelular, demostrándose que estaba asociado con la pérdida de expresión de LKB 1 (Bardeesy et al., 2002; Jishage et al., 2002; Miyoshi et al., 2002; Nakau et al., 2002; Rossi et al., 2002). La sobre expresión de LKB1 en ciertas células del cáncer resulta en el crecimiento de la supresión debido a la detención del ciclo de la célula de G1, el cual es dependiente de la actividad catalítica del LKB1 (Tiainen et al., 1999) y esto se ha propuesto ser mediado a través de la activación de p21^{WAF1/CIP1} a través de un mecanismo dependiente-p53 (Tiainen et al., 2002). Tomado juntos, estos resultados indican fuertemente que es probable que ese LKB1 funcione como un supresor del tumor. Trabajo reciente ha indicado que el C. elegans (Vatios et al., 2000), Drosophila (Martin y St Johnston, 2003) y Xenopus (Ossipova et al., 2003) homólogos del LKB1 regulan la polaridad celular y, si esta función se conserva en los humanos, la pérdida de polaridad celular en los pacientes de SPJ podría causar el desarrollo de hamartomas. Aunque LKB1 es esencialmente nuclear, cuando está sobre expresado en las células, también se observa frecuentemente un nivel bajo de localización citosólica (Karuman et al., 2001; Smith et al., 1999; Tiainen et al., 1999). Significativamente, mutantes de LKB 1 que están excluidos del núcleo detienen la actividad de supresión de crecimiento completo, sugiriendo que la localización citoplasmática de esta enzima es importante para su función de supresor del tumor (Tiainen et al., 2002). Se encontraron varias formas del mutante de LKB 1 en pacientes de SPJ localizadas solamente en el núcleo y no son detectables en el citoplasma (Boudeau et al., 2003b; Tiainen et al., 2002), haciendo pensar además que la localización citoplasmática del LKB1 es importante.

Se conoce relativamente poco sobre cómo el LKB1 se regula y cómo funciona. El LKB1 es fosforilado en múltiples residuos en vivo y la mutación de ciertos sitios de fosforilación obstaculiza la habilidad del LKB1 de suprimir el crecimiento celular, pero los mecanismos por los cuales estos eventos de fosforilación regulan la función del LKB1 no se han definido todavía (Collins et al., 2000; Sapkota et al., 2002a; Sapkota et al., 2002b; Sapkota et al., 2001). Ha habido también considerable interés en identificar las proteínas interactuando con el LKB1, las cuales pueden regular su función. Hasta la fecha, se han mostrado varias proteínas para ligarse al LKB1, a saber la proteína supresora del tumor p53 (Karuman et al., 2001), el brama-relacionado a la proteína del gen 1(Brg1) que es un componente de los complejos de remodelamiento de la cromatina (Marignani et al., 2001), una proteína nombrada LKB 1 interactuando con la proteína-1 (LIP1) (Smith et al., 2001) y el complejo acompañante específico del cinasa, que consiste en Cdc37 y Hsp90 (Boudeau et al., 2003a). La liga de LKB 1 al p53 fue propuesta por ser esencial para mediar la muerte celular dependiente del p53 (Karuman et al., 2001), mientras que la liga del LKB1 a Brg1 fue sugerida por ser requerida para la detención del crecimiento celular dependiente del Brg1 (Marignani et al., 2001). La interacción de LKB 1 con el LIP 1 fijado al LKB 1 en el citoplasma (Smith et al., 2001), mientras la liga del LKB 1 al Cdc37 y Hsp90 estabilizó la proteína del LKB 1 en las células (Boudeau et al., 2003a).

Recientemente, nosotros hemos demostrado que el LKB 1 está asociado con una seudo cinasa relacionada STE20 nombrada STRAD\alpha (STe20-Relacionado Adaptador a la proteína-\alpha), la cual carece de la actividad catalizadora porque los residuos importantes requeridos para la función de casi todas las proteinocinasas se están perdiendo (Baas et al., 2003). Es más, LKB 1 liga STRAD\alpha a través de su dominio catalizador y esta interacción refuerza LKB 1 en la actividad en vivo así como promoviendo la localización citoplasmática del LKB1 (Baas et al., 2003). LKB1 no es capaz por mucho tiempo de suprimir el crecimiento celular en células en las cuales STRAD\alpha ha sido agotado usando una aproximación del siRNA, sugiriendo que la liga de LKB1 a STRAD\alpha juega un papel importante mediando su función de supresor del tumor. STRAD\alpha también es fosforilado en vitro y en vivo por LKB1, haciendo a STRAD\alpha el primer sustrato fisiológico para LKB1 identificado así lejos (Baas et al., 2003).

La cinasa de proteinocinasa activada-AMP (AMPKK) y la proteinocinasa activada-AMP (AMPK) son los componentes contracorriente y a favor de una cascada de proteinocinasa que actúa como un sensor de la carga de energía celular [1,2]. AMPK se activa por una elevación, en celular 5'-AMP que siempre acompaña una caída en la proporción ATP:ADP debido a la reacción catalizada por el adenilato de cinasa (2ADP↔ ATP + ADP). Esto ocurre durante las tensiones metabólicas como la hipoxia, la isquemia, la suspensión de glucosa y, en el músculo del esqueleto y cardíaco, durante la contracción o el ejercicio [1-3]. Esto se aplica a ambas isoformas de las subunidades catalizadoras del AMPK (AMPK 1 y AMPK 2). Una vez activada por la tensión, el AMPK desvía la captación de glucosa y ácido graso y el metabolismo del óxido de estos combustibles para generar ATP, desconectando mientras las vías biosintéticas que consumen ATP. Este cambio metabólico se logra tanto por la fosforilación directa de enzimas metabólicas como por los efectos un mayor tiempo sobre la expresión del gen [1,2]. El AMPK también se activa por la metformina, uno de los fármacos más ampliamente usados para la diabetes (aunque se requieren altas dosis, esto es >2g por día en los adultos), por un mecanismo desconocido que no involucra la disminución de los niveles celulares de ATP. La activación de AMPK tanto por el agotamiento del ATP como por la fenformina requiere la fosforilación de la subunidad catalizadora (\alpha) del AMPK a su residuo del bucle T (Tr 172 en AMPK\alpha1) por una cinasa contracorriente. Mientras el AMPK es el mejor conocido por sus efectos sobre el metabolismo, el reciente trabajo sugiere que también se regule el crecimiento y la proliferación celular. Primeramente, la activación del cinasa inhibe la síntesis de la proteína por medio de causar la fosforilación de factor de alargamiento -2 [4], y la inhibición de la fosforilación del p70S6K por la vía del mTOR [5,6]. En segundo lugar, tiene en pro ambos efectos, los apoptóticos [7-9] y los anti-apoptóticos [10,11] en células diferentes. En tercer lugar, reduce el nivel del ARN de la proteína ligante HuR en el citoplasma, disminuyendo la estabilidad de mRNAs que pone en código los genes proliferativos como las ciclinas A y B1 [12]. Cuarto, inhibe la proliferación de las células de G2 Hep estabilizando el p53 [13].

En el documento WO 02/06520 se describe la inhibición específica de la vía de transducción señalada Ras/MEK/
ERK por LKB1.

Un método para ensayar la actividad de LKB 1 se describe en el documento WO 2004/113 562.

La regulación de LKB1 y sus actividades conocidas se revisan en Boudeau et al. (Cartas de FEBS (2003) 546:159-165).

Nosotros tenemos con anterioridad parcialmente purificado del hígado de la rata al cinasa contracorriente, el AMPKK, que activa el AMPK por fosforilación, a Tr-172 dentro del bucle de activación del dominio del cinasa [14; Hawley et al (J. Biol. Chem. (1996) 271: 27879-87)].

Sin embargo, nosotros hemos sido incapaces de purificar bastante material para obtener la secuencia del aminoácido e identificar la actividad como un producto del gen definido. Nosotros buscamos los cinasas contracorriente del Saccharomyces cerevisiae homólogo del AMPK (el complejo de SNF1), ensayando la habilidad de una colección de 119 levaduras fusiones de proteinocinasa-glutatión-S-transferasa (GST) para activar cinasas del mamífero y de levadura. Esta aproximación identificó la proteinocinasa Elml como un cinasa contracorriente potencial [15]. Analizando las proteinocinasas que interactuaron con Snf1 por dos análisis híbridos, Schmidt y sus colegas identificaron el Pak1 como otro cinasa contracorriente potencial en la levadura [16]. Ni las tensiones de elm1\Delta ni de pak1\Delta en que solo los genes del cinasa fueron anulados, tenían el mismo fenotipo que la tensión del snf1\Delta. Sin embargo, Elm1 y Pak1 forman una pequeña sub-familia con la proteinocinasa Tos3, y la tensión de un mutante triple de elm1\Delta pak1\Delta tos3\Delta tenía el fenotipo similar al snf1\Delta que fue restaurado al tipo natural por la expresión de uno cualquiera de los tres cinasas [15]. Esto demostró que estas tres proteinocinasas actúan como los cinasas contracorriente para el complejo SNF1 de una manera parcialmente redundante.

Los parientes más cercanos de Elm1, Pak1 y Tos3 codificados por el genoma humano son la isoforma \beta del cinasa de proteinocinasa dependiente de calmodulina (CaMKK). Nosotros hemos mostrado previamente que un CaMKK purificado del cerebro del cerdo podía activar el AMPK en los ensayos de célula-libre, aunque bastante pobremente comparado con la activación de la proteinocinasa dependiente de calmodulina (CAMKI). Sin embargo, el AMPKK purificado previamente del hígado de la rata no fue dependiente de calmodulina [17]. Entre otro menos cercano relacionado a la familia de Elml/Pakl/Tos3 en los humanos está el LKB 1 (vea la alineación en Fig. 1), un cinasa 50kDa del serina/treonina que se descubrió originalmente como el gen mutado en el desorden heredado del síndrome de Peutz-Jeghers (SPJ) [18,19], como fue discutido anteriormente. Varias líneas celulares de tumores humanos, incluso las células de HeLa y G361 (melanoma), falta la expresión de LKB1 mRNA y proteína, y la expresión de tipo natural LKB1 en estas células causó una detención del crecimiento en la fase G1, mientras que la expresión de mutaciones catalíticamente inactivas de LKB1 o varias aisladas de las mutaciones de SPJ no detuvieron el crecimiento celular [23]. La detención del crecimiento inducido por la expresión de LKB1 en las células de G361 también fue informado para ser invertida por la coexpresión de las ciclinas D 1 o E, fue asociada con la inducción del transcripcional del inhibidor de cinasa p21WAF1/CIP1 ciclina-dependiente, y fue mostrado por ser dependiente en el p53 [24]. Tomados juntos, estos resultados muestran que LKB1 actúa como un supresor del tumor y que la actividad catalizadora de LKB1 es esencial para esta función. Sin embargo, el(los) sustrato(s) (a favor de la corriente) que LKB1 fosforila para mediar la supresión del crecimiento celular permaneció desconocido.

Nosotros identificamos MO25\alpha (RAtón proteína 25-\alpha) como un nuevo componente del complejo LKB1-STRAD\alpha y establece que MO25\alpha juega un papel importante en estabilizar este complejo en el citoplasma celular así como reforzando la actividad catalizadora de LKB 1. Para cada uno de STRAD\alpha y MO25\alpha hay también una isoforma estrechamente relacionada (STRAD\beta y MO25\beta) codificado en el genoma humano, que también puede asociarse con LKB1. Nosotros demostramos que MO25 puede funcionar como un componente del andamiaje del complejo de LKB1-STRAD. Aunque STRAD\alpha [30] y STRAD\beta están relacionados a la proteinocinasa Ste20, algunos de los residuos esperados en un proteinocinasa activa no se conservan, y ellos son por consiguiente clasificados como "pseudocinasas". MO25\alpha (por ejemplo) liga al término C de, por ejemplo, STRAD\alpha, y estabiliza la asociación entre STRAD\alpha y LKB1. La asociación de LKB1 con STRAD y MO25 aumenta la actividad del cinasa contra un sustrato artificial (proteína básica de mielina) y también refuerza su localización citoplasmática, la cual fue previamente implicada en la función supresora del tumor del LKB1, ya que mutantes carentes de una señal de localización nuclear aun eran capaces de suprimir el crecimiento celular [24].

Además, nosotros describimos la resolución del hígado de la rata de dos cinasas contracorriente (AMPKK1 y AMPKK2). Nosotros mostramos que ambas, AMPKK1 y AMPKK2, contienen el LKB1 acomplejado con STRAD\alpha y MO25\alpha, y que ambas actividades son inmunoprecipitadas con anticuerpos anti-KB1. Es más, ambos complejos LKB1/STRAD/MO25 endógeno y recombinantes aislados de las células del HEK-293T activan el AMPK por la vía de la fosforilación del Tr-172 en la subunidad \alpha. Nosotros demostramos que la habilidad de LKB1 para fosforilar y activar el AMPK se refuerza dramáticamente por la presencia de las subunidades STRAD y M025, sugiriendo que ambas subunidades son esenciales para la actividad máxima. Finalmente, los fármacos que activan el AMPK en otros tipos de célula (ribosida de AICA y fenformina), no activan el AMPK en células de HeLa que no expresan LKB 1. Sin embargo, la expresión estable del LKB1 tipo natural pero no un mutante catalíticamente-inactivo, restauró la activación del AMPK, por estos fármacos. De acuerdo con esto, nosotros mostramos que el LKB1, en el complejo con STRAD y MO25, es el activador fisiológico del AMPK. Ahora es posible realizar los tamices para identificar los compuestos a fin de modular la activación fisiológica del AMPK.

Un primer aspecto de la invención provee un método para identificar un compuesto para el uso en modular, por ejemplo, promoviendo, la activación o fosforilación de AMPK (proteinocinasa activada-AMP) o AMPK miembro de subfamilia en una célula, el método que comprende los pasos de (1) determinar si un compuesto de la prueba modula, por ejemplo promueve, la actividad de la proteinocinasa del LKB1 y (2) seleccionar un compuesto que modula, por ejemplo promueve, la actividad de la proteinocinasa del LKB1, en donde el LKB1 está en una preparación con STRAD y MO25, en donde el MO25 es el recombinante y se expresa de un recombinante del ácido nucleico.

La actividad de la proteinocinasa del LKB1 que es modulada/evaluada en el método de exploración selectiva puede ser la fosforilación de un sustrato no-fisiológico como la proteína básica de mielina (por ejemplo como se discutió en los Ejemplos).

Alternativamente, la actividad de la proteinocinasa del LKB1 que es modulada/evaluada en el método de exploración selectiva puede ser la fosforilación del AMPK o un miembro de la subfamilia del AMPK, o un fragmento cualquiera de éste, como se discutió más adelante. La fosforilación del AMPK o de un miembro de la subfamilia del AMPK puede evaluarse midiendo la activación o fosforilación del AMPK o de un miembro de la subfamilia del AMPK, como se discutió más adelante debajo y en los Ejemplos. Por ejemplo, sustratos del péptido conveniente para LKB1 se discuten en el Ejemplo 3 y 4 e incluyen el péptido de bucle-NUAK2 T (nombrado LKBtido). La activación del AMPK (por ejemplo) puede evaluarse usando un gen reportero cuya expresión se modula por AMPK. Otras técnicas y reactivos que pueden ser útiles en medir la actividad de la proteinocinasa del LKB y/o fosforilación o activación del AMPK o un miembro de la subfamilia del AMPK (o fragmento de éste) se describen en los Ejemplos, por ejemplo en el Ejemplo 4.

La actividad de la proteinocinasa puede aumentarse o disminuirse por una alteración en el Vmax o el Km (o ambos) del LKB 1 (o AMKP o miembro de la subfamilia, según sea apropiado) para un sustrato particular. Por ejemplo, la actividad puede aumentarse por un Vmax aumentado o Km disminuido. Se apreciará que puede no ser necesario determinar el valor de Vmax o Km para determinar si el LKB1 (o AMKP o miembro de la subfamilia, según sea apropiado) ha sido activado o desactivado. Se apreciará que el AMPK o miembro de la subfamilia defosforilado (desactivado) puede retener alguna actividad enzimática.

La actividad puede medirse como la cantidad de un sustrato fosforilado en un tiempo dado; por consiguiente, un cambio de actividad puede detectarse como un cambio en la cantidad de sustrato (por ejemplo, a una sola concentración) esto es el fosforilado en un tiempo dado. Se prefiere que la actividad se aumente o se disminuya, según sea apropiado, por lo menos 2, preferiblemente 5, 10, 15, 20, 25, 30 o 50- veces.

Se apreciará que puede ser necesario determinar el efecto del compuesto en la actividad del sustrato (por ejemplo el AMPK), midiendo por ejemplo la actividad del sustrato cuando se expone al compuesto (1) después de la exposición del sustrato a LKB1, (2) antes de la exposición del sustrato a LKB1 y/o (3) sin la exposición a LKB1.

Puede medirse la expresión de una proteína codificada por un ARN trascripto desde un promotor regulado (directa o indirectamente) por un sustrato de LKB1 (o producción del propio ARN). La proteína puede ser una que es fisiológicamente regulada por un sustrato de LKB1, por ejemplo AMPK o miembro de la subfamilia, o puede ser una proteína del "reportero", también conocida, por los expertos en la técnica (por ejemplo, puede usarse una estructura del recombinante). Una proteína del reportero puede ser una cuya actividad puede fácilmente ensayarse, por ejemplo \beta-galactosidasa, acetiltransferasa o luciferasa del cloranfenicol (vea, por ejemplo, Tan et al (1996)).

La activación del AMPK, por ejemplo en el hígado, disminuye la expresión de las enzimas de la gluconeogénesis (fosfenolpiruvato carboxilasa y glucosa-6-fosfatasa); vea Lochhead et al. 5-aminoimidazola-4-carboxamida ribosida mímicos de los efectos de la insulina en la expresión de los 2 genes gluconeogénicos importantes del PEPCK y glucosa-6-fosfatasa. Diabetes. 2000 Jun; 49(6):896-903; Yamauchi et al La adiponectina estimula la utilización de glucosa y la oxidación del ácido graso mediante la activación de la proteinocinasa activada-AMP. Nat Med. 2002 Nov; 8(11):1288-95. Otra clase de genes que apagados por el AMPK, por ejemplo en el hígado, son aquellos que ponen en código las enzimas de la biosíntesis del ácido graso (sintasa del ácido graso y AcetilCoa carboxilasa); Vea Woods et al. Caracterización del papel de la proteinocinasa activada-AMP en la regulación de la expresión del gen activado por glucosa que usa formas negativas activas y dominantes del cinasa constitutivamente. Mol Cell Biol. 2000 Sep; 20(18):6704-11. La activación del AMPK también reduce el nivel de 4 factores de la trascripción: elemento respuesta del esterol que liga la proteína-1C (Zhou et al. Papel de la proteinocinasa activada-AMP en el mecanismo de acción de la metformina. J Clin Invest. 2001 Oct; 108(8):1167-74.); el hepatocito nuclear factor-4alfa (Leclerc et al. Hepatocito nuclear factor-4alfa envuelto en el tipo 1 de ataque-a madurez de la diabetes del joven es un nuevo blanco de la proteinocinasa activada-AMP. La diabetes. 2001 Jul; 50 (7):1515-21); C/EBPalfa y PPAR-gamma (Habinowski et al Los efectos de AICAR en la diferenciación del adipocito de células 3T3-L1. Biochem el Biophys Res Commun. 2001 Sep 7; 286(5):852-6). De acuerdo con ellos, tales genes (o genes recombinantes que incorporan secuencias reguladoras desde estos genes) pueden usarse como genes del reportero.

Para la modulación de la actividad de proteinocinasa se incluye la inhibición o un aumento en la actividad de la proteinocinasa.

Se apreciará que en los métodos de la invención en donde la fosforilación de un polipéptido puede ocurrir que la presencia de un donador de fosfato conveniente puede requerirse, como fue descrito por el aspecto anterior de la invención. Los donadores de fosfato convenientes se conocerán por aquellos expertos en la técnica e incluyen el ATP, por ejemplo como la sal del magnesio (MgATP), como se describió en los Ejemplos.

El LKB1 es una preparación con STRAD y MO25. Como se señaló anteriormente, se considera que LKB1 está presente en un complejo con estos polipéptidos en las células y la presencia de estos polipéptidos se considera que refuerza la actividad del LKB1. El LKB1 (y preferentemente también el STRAD) puede, por ejemplo, ser purifique desde las células en las cuales el LKB1 (y preferentemente también el STRAD) se expresa naturalmente, pero puede ser más conveniente para por lo menos uno del LKB1, STRAD ser el recombinante. El MO25 es el recombinante y se expresa desde un recombinante del ácido nucleico.

El término AMPK se conocerá bien por los expertos en la técnica, como se indicó anteriormente. El AMPK (u otro sustrato, por ejemplo la proteína básica de mielina) usado en el experimento puede ser recombinante o no-recombinante. El AMPK puede ser un bacterianamente-expresado AMPK 1 de dominio catalizador (por ejemplo como se describió en [44]) o un complejo heterotrimérico como aquéllos descritos en [45] y en el Ejemplo 2. El AMPK puede tener la secuencia del aminoácido de un AMPK que ocurre naturalmente, o puede ser o puede comprender un polipéptido de fusión (por ejemplo según lo descrito en [45] o el Ejemplo 2), o puede ser un fragmento o variante de AMPK que ocurre naturalmente que retiene la habilidad de ser fosforilado o activado por el LKB1, por ejemplo según lo descrito en el Ejemplo 2. Así, se prefiere que el AMPK sea un AMPK que retiene un residuo de treonina (o serina) en la posición equivalente a la Treonina172 de longitud completa tipo-natural de dominio catalizador humano \alpha1. Se prefiere que el AMPK no sea un mutante en el cual Tr172 es reemplazado por un residuo diferente al de serina, por ejemplo se reemplaza por el alanina. Un fragmento derivable del AMPK (o de un miembro de la subfamilia de AMPK) el cual comprende el residuo de Tr172 y por lo menos parte de la secuencia del bucle-T que incluye este residuo, por ejemplo por lo menos los 2, 3, 4, 5, 6 o 7 residuos de terminal-C y terminal-N de este residuo, es un sustrato conveniente para el uso en el método de exploración selectiva. Un ejemplo de tal sustrato del péptido se describe en el Ejemplo 3.

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Ejemplos de números de Asentimiento G1 para el dominio catalizador de la subunidad alfa 1 del AMPK humano incluye:

>gi|5453964|ref|NP_006242.1|EnlaceLocus info proteinocinasa, subunidad catalizadora alfa 1, activada-AMP; alfa 1 del AMPK; proteinocinasa, activada-AMP, catalizador, alfa-1 [Homosapiens]

gi|20178277|sp|Q13131|AAK1_HUMANO 5'-proteinocinasa activada-AMP, cadena catalítica alfa-1 (cadena alfa-1 AMPK)

gi|4115829|dbj|BAA36547.1|EnlaceLocus info de proteinocinasa activada-AMP alfa-1 [Homosapiens]

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Ejemplos de números de Asentimiento G1 para el dominio catalizador de la subunidad alfa 2 del AMPK humano incluye:

>gi|11493357|emb|CAC17574.1|dJ758N20.1 (proteinocinasa, activada-AMP, subunidad catalítica alfa 2) [Homosapiens]

>gi|5453966|ref|NP_006243.1|EnlaceLocus info proteinocinasa, activada-AMP, subunidad catalítica alfa 2; proteinocinasa, activada-AMP [Homosapiens]

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De forma similar, el término LKB 1 se conocerá bien por los expertos en la técnica. El LKB1 usado en el ensayo puede ser recombinante o no-recombinante. El LKB 1 puede expresarse bacterianamente, pero se prefiere que se exprese en un sistema mamífero y/o expresado junto a STRAD y/o MO25, preferentemente ambos, por ejemplo como se describió en los Ejemplos 1 y 2. El LKB 1 puede tener la secuencia del aminoácido de una ocurrencia natural del LKB1, o puede ser un polipéptido de fusión (por ejemplo como se describió en los Ejemplos), o puede ser un fragmento o variante de una ocurrencia natural del LKB 1 que retiene la habilidad a fosforilar o activar el AMPK, por ejemplo en Tr172 del AMPK, por ejemplo como describió en el Ejemplo 2. Así, el LKB1 es un LKB1 que retiene un dominio del cinasa activo. Un fragmento de LKB 1 que contiene el dominio del cinasa intacto pero no otras regiones del LKB1, puede ser útil; esta región de LKB 1 es suficiente para retener la actividad de la proteinocinasa y para actuar recíprocamente con STRAD. El LKB1 usado en el análisis que no es un mutante de cinasa inerte como se describe en los Ejemplos. Se prefiere que el LKB1 retenga la habilidad de actuar recíprocamente con STRAD y/o M025, como se discutió más adelante debajo.

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Los números de Asentimiento para LKB 1 incluyen lo siguiente:

La proteína del síndrome de Peutz-Jeghers AAC15742 [Homosapiens] i|3063585|gb|AAC15742.1|[3063585]

La proteinocinasa 11 de Serina/Treonina 15831 (proteinocinasa-Serina/Treonina del LKB1) gi|3024670|sp|Q15831|
STKB HUMANO [3024670]

La proteinocinasa 11 de Serina/Treonina NP_000446 [Homosapiens] gi|4507271|ref|NP_000446.1|[4507271]

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Se prefiere particularmente, aunque no es esencial, que el polipéptido de LKB1 tenga por lo menos 30% de la actividad enzimática del LKB1 humano de longitud-completa con respecto a la fosforilación del AMPK 1 humano de longitud-completa en el residuo Tr172 (preferentemente en la presencia de STRAD y MO25) o un sustrato del péptido que abarca esta región, o fosforilación de la proteína básica de mielina. Se prefiere más si el polipéptido de LKB1 tiene por lo menos 50%, preferentemente por lo menos 70% y más preferentemente por lo menos 90% de la actividad enzimática del LKB1 humano de longitud-completa con respecto a la fosforilación del AMPK\alpha1 humano de longitud-completa en el residuo Tr172 (preferentemente en presencia de STRAD y M025) o un sustrato del péptido abarcando esta región.

De forma similar, los términos STRAD o M025 se conocerán bien por los expertos en la técnica. Por ejemplo, un polipéptido de STRAD (STRAD\alpha) se describe en Baas et al (2003) EMBO J 22(12), 3062-3072 y en EMBL/GenBank Asentimiento número AF308302. Las secuencias humanas STRAD\alpha y STRAD\beta (NCBI asentimiento número AAM1914) se muestran en la Figura 10. Los polipéptidos de M025 se describen en Miyamoto et al (1993); Karos y Fisher (1999) y Nozakide et al (1996) y, por ejemplo, en el Asentimiento No NP_057373 (MO25 humano) y Q9H9S4 (MO25 humano). Ejemplos adicionales de polipéptidos de MO25 se muestran en la Figura 2 y los Nos del Asentimiento adicional se dan en la leyenda de la figura. MO25 no lleva la homología de la secuencia a otras proteínas en la base de datos pero los recientes estudios indican que se relaciona estructuralmente al dominio de replicación del Armadillo (Milburn et al., 2003). El STRAD usado en el ensayo puede ser recombinante o no-recombinante pero el MO25 usado en el ensayo es el recombinante. El STRAD o MO25 pueden expresarse bacterianamente, pero se prefiere que ellos estén expresados en un sistema de mamífero y/o expresados a lo largo de LKB1, por ejemplo como se describió en los Ejemplos 1 y 2. El STRAD o MO25 puede tener la secuencia del aminoácido de una ocurrencia natural del STRAD o MO25, o puede ser un polipéptido de fusión (por ejemplo como se describió en los Ejemplos), o puede ser un fragmento o variante de una ocurrencia natural del STRAD o MO25 que retiene la habilidad para el STRAD de ligar al M025 y a LKB1, y para el MO25 de ligar al STRAD o al complejo de LKB1 y STRAD. Por lo menos puede requerirse la región de terminal-C de MO25. En vista de la conservación de la secuencia a lo largo de la longitud de MO25 se considera que puede ser deseable usar la longitud completa de MO25. Se prefiere que el polipéptido de STRAD tenga el terminal-C de la secuencia Trp-Asp/Glu-Phe (la cual se considera que reconoce M025) pero no se considera que esto es esencial, porque MO25 puede ligar a STRAD faltando estos residuos cuando el STRAD está ligado a LKB 1 (vea Ejemplo 1). También se prefiere que el dominio del seudocinasa de STRAD esté presente, ya que esto puede requerirse para el enlace de MO25. Por ejemplo, se prefiere que el STRAD no sea un fragmento carente de los residuos que corresponden a los aminoácidos 88 de terminal-C del STRAD\alpha de longitud completa (que tiene un dominio de seudocinasa truncado y no interactúa con LKB 1 humano o MO25\alpha). Puede ser deseable usar el STRAD de longitud completa.

La capacidad de, por ejemplo, el dicho polipéptido con respecto a actuar recíprocamente con o ligar a, por ejemplo, un polipéptido de STRAD, puede medirse por cualquier método de detección/medición de una interacción proteína/proteína, como se discutió más adelante debajo. Los métodos convenientes incluyen las interacciones de dos-híbridos de la levadura, copurificación, ELISA, coinmunoprecipitación, estudios de enlace-cruzado, estudios estructurales, métodos de transferencia de energía por resonancia y fluorescencia (FRET) y los métodos de resonancia de superficie de plasmón. Así, el dicho MO25 (por ejemplo MO25\alpha humano) puede ser considerado capaz de ligar a o interactuar con un polipéptido de STRAD (por ejemplo STRAD\alpha humano) si una interacción puede detectarse entre el polipéptido de dicho M025 y el polipéptido de dicho STRAD por ELISA, coimmunoprecipitación o métodos de resonancia de superficie de plasmón o por una interacción de dos-híbridos de la levadura o método de copurificación, por ejemplo como se describió en el Ejemplo 1 o Ejemplo 2.

Se prefiere que la interacción pueda detectarse usando un método de resonancia de superficie de plasmón, como el descrito por ejemplo en el documento WO 00/56864. Puede inmovilizarse un polipéptido en la superficie de prueba, por ejemplo éste puede ser acoplado a través de los grupos amino a un Sensor Chip CM5^{TM}, según las instrucciones del fabricante, o un polipéptido biotinilado puede ligarse a un avidina recubierto por el Sensor Chip SA. El otro polipéptido (a concentraciones entre, por ejemplo 0 y entre 10 \muM y 1.0 \muM, por ejemplo 2 \muM) se inyecta entonces encima de la superficie y se determina el enlace del estado estacionario en cada caso. De estas mediciones puede determinarse un Kd. Se prefiere que la interacción tenga un Kd de menos de 8 \muM, más preferentemente menos de 5 \muM, 2 \muM, 1 \muM, 500 nM, 300 nM, 200 nM o 100 nM, por ejemplo aproximadamente 150 nM,. Alternativamente, puede determinarse un Kd para un polipéptido en competición con el polipéptido inmovilizado. Un polipéptido (para el ejemplo a una concentración de 0.5 \muM) se mezcla con el polipéptido libre (por ejemplo, a concentraciones entre 0 y 3 \muM) y la mezcla se inyecta encima del polipéptido inmovilizado. El enlace del estado estacionario se determina en cada caso, desde el cual puede determinarse el Kd de la interacción usando la relación de Cheng-Prescott. Alternativamente, la interacción puede expresarse en términos de una respuesta observada o relativa a respuestas observadas, medida en términos de masa de proteína ligada a la superficie.

Mediante "variantes" de un polipéptido nosotros incluimos inserciones, deleciones y sustituciones, conservadora o no conservadora. En particular nosotros incluimos variantes del polipéptido donde tales cambios no alteran sustancialmente la actividad de la proteinocinasa o la habilidad de ligar a las parejas de enlace particulares, según lo apropiado.

Por medio de "substituciones conservadoras" se intentan combinaciones como Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; y Phe, Tyr.

Se usa aquí el código de aminoácido de tres letras o una letra de la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB, con la excepción del símbolo Zaa, definido anteriormente. En particular, Xaa representa cualquier aminoácido. Se prefiere que al menos los aminoácidos que corresponden a las secuencias del acuerdo general definidos aquí sean amino ácidos-L.

Se prefiere particularmente si la variante del polipéptido tiene una secuencia del aminoácido que tenga por lo menos 65% de actividad de identidad del LKB1 humano de longitud-completa con respecto a la fosforilación del AMPK 1 humano de longitud-completa en el residuo Tr172 (preferentemente en la presencia de STRAD y MO25) o un sustrato del péptido que abarca esta región, o fosforilación de la proteína básica de mielina. Se prefiere más si el polipéptido de LKB1 tiene por lo menos 50%, preferentemente por lo menos 70% y más preferentemente por lo menos 90% de la actividad enzimática del LKB1 humano de longitud-completa con respecto a la fosforilación del AMPK\alpha1 humano de longitud-completa en el residuo Tr172 (preferentemente en la presencia de STRAD y MO25) o un sustrato del péptido que abarca esta región. Con la secuencia del aminoácido del polipéptido humano aplicable, más preferentemente por lo menos 70%, 71%, 72%, 73% o 74%, todavía más preferentemente por lo menos 75%, aun todavía más preferentemente por lo menos 80%, en preferencia adicional por lo menos 85%, todavía más de la preferencia por lo menos 90% y lo más preferentemente por lo menos 95% o 97% de identidad con la secuencia del aminoácido del polipéptido humano aplicable.

Todavía se prefiere más si una variante de proteinocinasa tiene una secuencia del aminoácido que tenga por lo menos 65% de identidad con la secuencia del aminoácido del dominio catalizador del polipéptido humano, más preferiblemente por lo menos 70%, 71%, 72%, 73% o 74%, todavía más preferentemente por lo menos 75%, todavía aun más preferentemente por lo menos 80%, en la preferencia adicional por lo menos 83 u 85%, en preferencia adicional por lo menos 90% y el más preferentemente por lo menos 95% o 97% de identidad con la secuencia humana aplicable del aminoácido.

Se apreciará que el dominio catalizador de un polipéptido relacionado a la proteinocinasa puede identificarse rápidamente por una persona experimentada en la técnica, usando las comparaciones de la secuencia como se describió debajo. Las proteinocinasas muestran un centro catalizador conservado, según revisado en Johnson et al (1996) Célula, 85, 149-158 y Taylor y Radzio-Andzelm (1994) Estructura 2, 345-355. Este centro se pliega dentro de un lóbulo pequeño de Terminal-N que ampliamente comprende una lámina-\beta anti-paralela, y un gran lóbulo de terminal-C que es principalmente helicoidal-\alpha.

El por ciento de la identidad de la secuencia entre dos polipéptidos puede determinarse usando los programas de computación adecuados, por ejemplo el programa GAP del Grupo de Informática de Genética de la Universidad de Wisconsin y se apreciará que el por ciento de identidad se calcula con respecto a los polipéptidos cuya secuencia se ha alineado óptimamente.

La alineación puede llevarse a cabo fuera alternativamente usando el programa Clustal W (Thompson et al., 1994). Los parámetros usados pueden ser como sigue:

Los parámetros de alineación de rápido apareamiento: tamaño K-tuple (aviso); 1, tamaño de ventana; 5, penalidad del hueco; 3, el número de diagonales de la cima; 5. Método de anotación: por ciento de x.

Parámetros de alineación múltiples: penalidad de hueco abierto; 10, penalidad de extensión del hueco; 0.05.

Matriz de anotación: BLOSUM.

Se apreciará que las secuencias de MO25 mostradas en la Figura 2 son ejemplos de variantes de MO25 según lo definido anteriormente.

El residuo equivalente a, por ejemplo, Tr 172 del AMPK 1 humano de longitud-completa puede identificarse por la alineación de la secuencia del polipéptido con que el AMPK 1 humano de longitud-completa maximiza de tal forma el juego entre las secuencias. La alineación puede llevarse a cabo por inspección visual y/o por el uso de programas de computación apropiados, por ejemplo el programa GAP del Grupo de Informática de Genética de la Universidad de Wisconsin, que también permitirá calcular el por ciento de identidad de los polipéptidos. El programa Align (Pearson (1994) en: Métodos en Biología Molecular, Análisis Computarizados de los Datos de la Secuencia, Parte II (Griffin, AM y Griffin, Ediciones HG) Págs. 365-389, Human Press, Clifton). Así, los residuos identificados de esta manera también son "residuos equivalentes".

Se apreciará que en el caso de formas truncadas de AMPK 1 o en las formas donde han ocurrido sustituciones simples de los aminoácidos es fácil identificar el "residuo equivalente".

Se prefiere que los polipéptidos usados en la exploración selectiva sean mamíferos, preferentemente humanos (o unas especies útiles en la agricultura o como un animal doméstico o acompañante, por ejemplo el perro, el gato, el caballo, la vaca), incluyendo la ocurrencia natural de variantes alélicas (incluso las variantes del empalme). Los polipéptidos usados en la exploración selectiva pueden comprender una porción de GST o pueden ser biotinilados o de otra manera unidos, por ejemplo con un 6His, HA, myc u otro apéndice de epítope, como se conoce por los expertos en la
técnica, o según lo descrito en los Ejemplos 1 y 2. Esto puede ser útil en purificar y/o detectar el polipéptido(s). \mu

El efecto del compuesto puede ser determinado comparando la proporción o grado de fosforilación del polipéptido del sustrato por el LBK1 en la presencia de concentraciones diferentes del compuesto, por ejemplo en la ausencia y en la presencia del compuesto, por ejemplo a una concentración de aproximadamente 100 \muM, 30 \muM, 10 \muM, 3 \muM, 1 \muM, 0.1 \muM, 0.01 \muM y/o 0.001 \muM.

El compuesto puede imitar el efecto de la interacción de STRAD y/o M025 con LKB1. Un compuesto que imita el efecto de STRAD y/o M025 en LKB 1 puede aumentar la proporción o magnitud de la fosforilación del polipéptido del sustrato (por ejemplo AMPK o un miembro de la subfamilia o un fragmento cualquiera de éste).

Por "imitar el efecto de la interacción de STRAD y/o MO25 con LKB1" se significa que el compuesto tiene un efecto cuantitativo o cualitativo sobre el LKB1, por ejemplo en su actividad o estabilidad de la proteinocinasa, como se discutió en los Ejemplos 1 y 2. Por ejemplo, se considera que STRAD y M025 incrementan la velocidad a la cual los fosforilatos del LKB1, por ejemplo, AMPK o la proteína básica de la mielina; un imitador de STRAD o MO25 puede aumentar la velocidad a la cual el LKB 1 (en la ausencia de STRAD y/o M025) fosforila un polipéptido del sustrato, por ejemplo el AMPK.

La subfamilia del AMPK se discute en el Ejemplo 2 (y también vea [41]) e incluye los siguientes polipéptidos:

MELK (Heyer et al., 1999 Expresión de Melk, una nueva proteinocinasa, durante el desarrollo temprano del ratón. Dev Dyn, 215, 344-351; Heyer et al., 1997 Nuevo miembro de la familia del cinasa Snf1/AMPK, Melk, se expresa en el huevo del ratón y embrión de la preimplantación. (Mol Reprod Dev, 47, 148-156.)

QIK (Xia et al., 2000 El nuevo cinasa del serina-treonina, Qik, es un objetivo del oncogén de Qin. Biochem Biophys ResCommun, 276, 564-570)

SIK (Coyle et al., 2003 Sam68 refuerza la utilización citoplasmática de ARN conteniendo-intrón y se regula funcionalmente por el cinasa nuclear Sik/BRK. Mol Cell Biol, 23, 92-103; Derry et al., 2003 Localización Alterada y actividad del cinasa de tirosina intracelular BRK/Sik en las células del tumor de próstata. Oncogén, 22, 4212-4220; Derry et al., 2000 Sik (BRK) fosforilatos Sam68 en el núcleo y negativamente regula su habilidad de enlace al ARN. Mol Cell Biol, 20, 6114-6126; Feldman et al., 2000 el cinasa sal-inducible, SIK, es inducido por la despolarización en el cerebro. J Neurochem, 74, 2227-2238; Horike et al., 2002 Papeles de varios dominios identificados en la estructura primaria de cinasa sal-inducible (SIK). Endocr Res, 28, 291-294.; Lin et al., 2000 SIK (cinasa sal-inducible): regulación de la expresión del gen esteroidogénico ACTH-mediado y redistribución nuclear/cito sol. Endocr Res, 26, 995-1002.; Llor et al., 1999 Expresión de BRK/Sikaen el tracto gastrointestinal y en los tumores del colon. Clin Cancer Res, 5, 1767-1777.; Vasioukhin y Tyner, 1997 Un papel para el cinasa de tirosina de célula-epitelial-específica Sik durante la diferenciación del queratinocito. Proc Natl Acad Sci. Estados Unidos, 94, 14477-14482; Wang et al., 1999 Clonación de un nuevo cinasa (SIK) de la familia de SNF1/AMPK desde la rata suprarrenal dieta alta de sal-tratada. FEBS Lett, 453, 135-139).

Otros miembros de la familia incluyen NuaK1, NuaK2, BrsK1, BrsK2 y QSK, sobre los cuales se conoce poco. Nosotros consideramos que el LKB1 puede fosforilar y activar estas otras proteinocinasas en la subfamilia del AMPK. Otros miembros de la familia (los cuales están en una rama del árbol de la cinasa inmediatamente adyacente a los miembros de la familia indicados anteriormente) incluyen MARK1, MARK2, MARK3 y MARK4. Por ejemplo, vea Manning et al (2002) La proteinocinasa complemento del genoma humano. Ciencia 298, 1912-1934. MARK3 también es conocido como PARIA o C-TAK1 (Peng et al. (1998) Crecimiento Celular Diferente 9, 197-208; Spicer et al (2003) Oncogén 22, 4752-4756.

La metformina o sus análogos pueden estar actuando a través de la activación de uno de estos cinasas así como a través del AMPK. Tal miembro de la subfamilia o fragmento de éste o fusión de tal fragmento (por ejemplo un péptido de bucle-T, según lo discutido anteriormente y en el Ejemplo 3) puede ser un sustrato conveniente para el uso en el método de exploración selectiva del primer aspecto de la invención.

Un compuesto identificado por un método de la invención puede modular la habilidad del proteinocinasa para fosforilar diferentes sustratos, por ejemplo diferentes miembros de la subfamilia del AMPK que ocurren de forma natural, a diferentes magnitudes. Así, se prefiere, pero no es esencial, que cuando el método de exploración selectiva para un compuesto para el uso en modular la actividad del AMPK, que el AMPK o un fragmento del mismo se use como el sustrato. De forma similar, se prefiere, pero no es esencial, que cuando el método de exploración selectiva para un compuesto para el uso en modular la actividad de un miembro particular de la subfamilia del AMPK, que ese miembro de la subfamilia o un fragmento de éste se use como el sustrato.

El método es útil en identificar los compuestos que, por ejemplo, promueven la activación del AMPK o de un miembro de la subfamilia. Un compuesto que desencadena la activación del AMPK o de un miembro de la subfamilia del AMPK puede ser útil en el tratamiento de la diabetes y la obesidad. Tal compuesto puede imitar la actividad de la metformina o sus análogos y puede ser de mayor potencia.

LKB 1 también es una proteinocinasa supresora del tumor que inhibe el crecimiento celular y la proliferación. Los resultados presentados aquí indican que las funciones de supresor del tumor del LKB1 pueden mediarse a través de la fosforilación del LKB1 y desencadenar la activación del AMPK y/o uno o más miembros de la subfamilia indicado anteriormente. Así, estos polipéptidos pueden ser nuevas proteinocinasas supresoras del tumor y un compuesto que active una o más de estas proteinocinasas puede ser útil para tratar el cáncer.

Un compuesto que promueve la fosforilación o activación del AMPK o de un miembro de la familia del AMPK puede actuar mediante la estabilización del complejo de LKB1-STRAD-MO25. Puede ser útil tamizar para tal efecto de estabilización (o antes o después o en cambio la selección en base a un ensayo de la actividad de la proteinocinasa según lo descrito anteriormente). Por ejemplo, tal selección podría involucrar evaluar los efectos de un compuesto sobre la formación o estabilidad del complejo, por ejemplo usando los métodos para evaluar las interacciones moleculares, según lo discutido anteriormente. Por ejemplo, pueden usarse métodos de coinmunoprecipitación o copurificación, o un sistema informador de dos híbridos gen/levadura. Un complejo también puede detectarse usando las técnicas de transferencia de energía de resonancia fluorescencia (FRET) (por ejemplo usando proteínas de fusión que comprenden las proteínas fluorescentes por ejemplo, por ejemplo las proteínas fluorescentes, por ejemplo las proteínas fluorescentes verdes, azules o amarillas (GFPs; YFPs, BFPs, bien conocidas por los expertos en la técnica)), por ejemplo en el material de células en las cuales el LKB1 y el STRAD y/o MO25 son coexpresados, según lo descrito en los Ejemplos 1 y 2.

El compuesto puede ser uno que entrelaza o acerca una región de contacto entre dos o más de LKB1, STRAD, y MO25, o quizá uno que entrelaza a otra región y, por ejemplo, induce un cambio conformacional o alostérico que estabiliza (o desestabiliza) el complejo; o promueve (o inhibe) su formación. El compuesto puede ligar a LKB 1 o STRAD o MO25 (o al complejo como un todo) para así incrementar la actividad de la proteinocinasa del LKB1 por un efecto alostérico. Este efecto alostérico puede ser un efecto alostérico que está envuelto en la regulación natural de la actividad del LKB1.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un método para hacer una preparación que comprende LKB1, STRAD y el MO25 recombinante. La preparación puede comprender el LKB1 recombinante y/o STRAD recombinante. La preparación puede ser útil en un ensayo del primer aspecto de la invención.

Por "purificado" se significa que la preparación se ha separado por lo menos parcialmente de otros componentes en presencia de la cual se ha formado H, por ejemplo otros componentes de una célula del recombinante. Ejemplos de métodos de purificación que pueden usarse se describen en los Ejemplos.

La preparación puede ser substancialmente pura. Por "substancialmente pura" nosotros queremos decir que dicho polipéptido(s) está sustancialmente libre de otras proteínas. Así, nosotros incluimos cualquier composición que incluye por lo menos 30% del contenido de la proteína en peso como los dichos polipéptidos, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente por lo menos 70%, todavía más preferentemente por lo menos 90% y el más preferentemente por lo menos 95% del contenido de la proteína son los dichos polipéptidos.

Así, la invención también incluye composiciones que comprenden los dichos polipéptidos y un contaminante en donde el contaminante comprende menos del 70% de la composición por peso, preferentemente menos del 50% de la composición, más preferentemente menos del 30% de la composición, todavía más preferentemente menos del 10% de la composición y la mayoría preferentemente menos de 5% de la composición por peso.

La invención también incluye los dichos polipéptidos substancialmente puros cuando combinados con otros componentes en vivo, dichos otros componentes que no son todos los componentes encontrados en la célula en los cuales se encuentran dichos polipéptidos.

\newpage

Un aspecto adicional de la invención proporciona una célula capaz de expresar LKB1, STRAD y sobre expresados o el M025 recombinante. La célula puede comprender un ácido nucleico recombinante que codifica M025, y/o un ácido nucleico recombinante que codifica LKB1, y/o un ácido nucleico recombinante que codifica STRAD. La célula puede ser capaz de sobre expresar MQ25 desde la secuencia endógena que pone en código MO25, usando por ejemplo las técnicas de secuencia-desencadenamiento específico de activadores de la transcripción. La célula puede ser una célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo puede ser una célula eucariótica, por ejemplo un insecto, levadura o célula de mamífero, por ejemplo una célula humana. Se describen ejemplos de células convenientes, por ejemplo, en los Ejemplos.

El ácido nucleico recombinante es preferentemente conveniente para expresar el polipéptido puesto en código. El ácido nucleico recombinante puede estar en la forma de un vector de expresión. Los polinucleótidos recombinantes convenientes para expresar un polipéptido dado se conocen bien por los expertos en la técnica, y los ejemplos se describen en los Ejemplos 1 y 2.

Un aspecto adicional de la invención proporciona una célula que comprende LKB1, STRAD y sobre expresado o M025 recombinante. La célula puede comprender el LKB1 recombinante y/o STRAD recombinante. La célula puede ser una célula según el aspecto precedente de la invención. La célula puede comprender por lo menos 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 5, 10 o 20-veces más M025 (o LKB1, o STRAD, según sea apropiado) que una célula equivalente que no se ha modificado para sobre expresar M025 o para expresar el M025 recombinante.

Por "conveniente para expresar" se significa que el polinucleótido es un poli nucleótido que puede traducirse para formar el polipéptido, por ejemplo ARN, o que el polinucleótido (que es preferentemente ADN) poniendo en código el polipéptido de la invención se inserta en un vector de expresión, como un plásmido, en orientación apropiada y el marco de lectura correcto para la expresión. El polinucleótido puede unirse a las secuencias transcripcional y traduccional del nucleótido de control regulador apropiado reconocidas por cualquier huésped deseado; tales controles pueden incorporarse en el vector de expresión.

Las características de vectores convenientes para la replicación en las células eucarióticas de mamífero se conocen bien por los expertos en la técnica, y los ejemplos se dan debajo. Se apreciará que un vector puede ser conveniente para la replicación en ambas células tanto procarióticas como eucarióticas.

Se han desarrollado una variedad de métodos para operativamente vincular los polinucleóticos, especialmente el ADN, a los vectores por ejemplo por la vía del término cohesivo complementario. Se describen los métodos convenientes en Sambrook et al (1989) Clonación Molecular, Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, Nueva York.

Una forma deseable para modificar el ADN que pone en código un polipéptido de la invención es usar la reacción en cadena del polimerasa como se describe por Saiki et al (1988) Ciencia 239, 487-491. Este método puede usarse para introducir el ADN en un vector conveniente, por ejemplo diseñando en los sitios de restricción convenientes, o puede usarse para modificar el ADN en otras maneras útiles según lo conocido en la técnica.

En este método el ADN a ser amplificado enzimáticamente se flanquea por dos plantillas específicas que ellos mismos incorporan en el ADN amplificado. Las plantillas específicas pueden contener sitios de reconocimiento de restricción de endonucleasa que pueden usarse para clonar en vectores de expresión que usan métodos conocidos en la técnica.

El ADN (o en el caso de vectores retrovirales, ARN) se expresa entonces en un huésped conveniente para producir un polipéptido que comprende el compuesto de la invención. Así, el ADN que pone en código el polipéptido que constituye el compuesto de la invención puede usarse de acuerdo con las técnicas conocidas, apropiadamente modificadas en vista de las enseñanzas contenidas aquí, para construir un vector de expresión que se usa entonces para transformar una célula del huésped apropiada para la expresión y producción del polipéptido de la invención. Tales técnicas incluyen aquellas descritas en las Patentes americanas Nos. 4.440.859 publicada el 3 de abril de 1984 por Rutter et al, 4.530.901 publicada el 23 de julio de 1985 por Weissman, 4.582.800 publicada el 15 de abril de 1986 por Crowl, 4.677.063 publicada el 30 de junio de 1987 por Mark et al, 4.678.751 publicada el 7 de julio de 1987 por Goeddel, 4.704.362 publicada el 3 noviembre de 1987 por Itakura et al, 4710.463 publicada el 1 de diciembre de 1987 por Murray, 4.757.006 publicada el 12 de julio de 1988 por Toole, Jr et al, 4.766.075 publicada el 23 de agosto de 1988 por Goeddel et al y 4.810.648 publicada el 7 de marzo de 1989 por Stalker, todas incorporadas aquí por referencia.

El ADN (o en el caso de vectores retrovirales, ARN) poniendo en código el polipéptido puede unirse a una amplia variedad de otras secuencias de ADN para la introducción en un huésped apropiado. El ADN de compañía dependerá de la naturaleza del huésped, la manera de la introducción del ADN en el huésped, y si se desea mantenimiento o integración episomático.

Generalmente, el ADN se inserta en un vector de expresión, como un plásmido, en orientación apropiada y el marco de lectura correcto para la expresión. Si es necesario, el ADN puede unirse a las secuencias transcripcional y traduccional del nucleótido de control regulador apropiado reconocidas por cualquier huésped deseado, aunque tales controles están generalmente disponibles en el vector de expresión. El vector se introduce entonces en el huésped a través de las técnicas normalizadas. Generalmente, no todos los huéspedes se transformarán por el vector. Por consiguiente, será necesario seleccionar por las células del huésped transformadas. Una técnica de selección involucra incorporar en el vector de expresión una secuencia de ADN, con cualquiera de los elementos de control necesario, que codifica para un rasgo seleccionable en la célula transformada, como la resistencia a antibióticos. Alternativamente, el gen para tal rasgo seleccionable puede estar en otro vector el cual se usa para cotransformar la célula del huésped deseada.

Las células del huésped que se han transformado por el ADN recombinante de la invención se cultivan entonces por un tiempo suficiente y bajo condiciones apropiadas conocidas por los expertos en la técnica en vista de las enseñanzas descritas aquí para permitir la expresión del polipéptido, la cual puede entonces recuperarse.

Se conocen muchos sistemas de expresión, incluyendo las bacterias (por ejemplo el E. coli y el Bacillus subtilis), levaduras (por ejemplo el Saccharomyces cerevisiae), los hongos filamentosos (por ejemplo el Aspergillus), células de la planta, células de animales y células de insecto.

Los vectores incluyen un replicón del procariota, como el ColE1 ori, para la propagación en un procariota, aun cuando el vector será usado para la expresión en otros tipos celulares, no-procariotas. Los vectores también pueden incluir un promotor apropiado como un promotor del procariota capaz de dirigir la expresión (transcripción y traducción) de los genes en una célula del huésped bacteriana, como el E. coli, transformada con éste.

Un promotor es un elemento de control de la expresión formado por una secuencia de ADN que permite el enlace de polimerasa ARN y que ocurra la transcripción. Las secuencias del promotor compatible con los huéspedes bacterianos ejemplares se proporcionan típicamente en los vectores del plásmido que contienen los sitios de restricción convenientes para la inserción de un segmento de ADN de la presente invención.

Los plásmidos de vector procariota típicos son pUC18, pUC19, pBR322 y pBR329 disponibles de los Laboratorios de Biorad, (Richmond, CA, EE.UU.) y pTrc99A y pKK223-3 disponibles de Farmacia, Piscataway, NJ, EE.UU.

Un plásmido de vector de célula de mamífero típico es el pSVL disponible de Farmacia, Piscataway, NJ, EE.UU. Este vector usa el promotor atrasado SV40 para manejar expresión de genes clonados, el nivel más alto de expresión que se encuentra en las células que producen antígeno T, como las células COS-1.

Un ejemplo de un vector inducible de la expresión del mamífero es el pMSG, también disponible de Farmacia. Este vector usa el promotor glucocorticoide-inducible del virus del tumor mamario del ratón, el término largo se repite para manejar la expresión del gen clonado.

Los vectores útiles del plásmido de levadura son pRS403-406 y pRS413-416 y están generalmente disponibles desde de Sistemas de Clonación de Stratagene, La Jolla, CA 92037, EE.UU. Los plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son Plásmidos que integran la levadura (YIps) e incorporan los marcadores seleccionables de la levadura HIS3, TRP1, LEU2 y URA3. Los plásmidos pRS413-416 son los plásmidos de Levadura de Centromere (YCps).

La célula del huésped puede ser procariota o eucariota. Se prefieren las células bacterianas que son células procariota del huésped y típicamente es una cepa de E. coli como, por ejemplo, las cepas DH5 de E. coli disponibles de los Laboratorios de Investigación de Bethesda Inc., Bethesda, MD, EE.UU., y RR1 disponible de la Colección de Cultura de Tipo Americana (ATCC) de Rockville, MD, EE.UU., (No ATCC 31343). Las células eucariotas del huésped preferido incluyen las células de la levadura, insecto y mamífero, preferentemente las células vertebradas, como aquéllas de un ratón, rata, mono o línea celular fibroblástica humana. Las células del huésped de levadura incluyen YPH499, YPH500 y YPH501 que están generalmente disponibles de Sistemas de Clonación de Stratagene, La Jolla, CA 92037, EE.UU. Las células del huésped del mamífero preferido incluyen células 293 del riñón embrionario humano (vea Ejemplo 1), las células del ovario de la marmota china (CHO) disponibles del ATCC como CCL61, las células de embrión de ratón suizo NIH/3T3 disponibles del ATCC como CRL 1658, y las células del riñón mono -derivadas de COS-1, disponibles del ATCC como CRL 1650. Las células de insecto preferidas son células de Sf9 que pueden ser transfectadas con los vectores de expresión del baculovirus.

La transformación de los huéspedes apropiados de la célula con una estructura de ADN se cumple por los métodos bien conocidos que típicamente dependen del tipo de vector usado. Con respecto a la transformación de las células procariotas del huésped, vea, por ejemplo, Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 69, 2110 y Sambrook et al (1989) Clonación Molecular, Un Manual de Laboratorio, Laboratorio de Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor, NY. La transformación de células de levadura se describe en Sherman et al (1986). También son útiles Métodos en las Genéticas de Levadura, Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor, NY., El método de Beggs (1978), Naturaleza 275, 104-109. Con respecto a las células vertebradas, reactivos útiles en la transfección de tales células, por ejemplo, el fosfato del calcio y DEAE-dextrano o formulaciones del liposoma, están disponibles de Sistemas de Clonación de Stratagene, o Tecnologías de Vida Inc., Gaithersburg, MD 20877, EE.UU..

La electroporación también es útil para transformar y/o transfectar células y es bien conocida en la técnica para transformar células de la levadura, células bacterianas, células de insecto y células de vertebrado.

Por ejemplo, muchas especies bacterianas pueden ser transformadas por los métodos descritos en Luchansky et al (1988) Mol. Microbiol. 2, 637-646 incorporadas aquí para referencia. El número mayor de transformantes se recupera de forma consistente siguiendo la electroporación de la mezcla ADN-célula suspendida en 2.5X PEB que usa 6250V por cm. a 25:FD.

Se describen métodos para la transformación de levadura por electroporación en Becker y Guarente (1990) Métodos Enzimol. 194, 182.

Pueden identificarse células transformadas con éxito por las técnicas bien conocidas, por ejemplo células que contienen una estructura de ADN de la presente invención. Por ejemplo, células que son el resultado de la introducción de una estructura de la expresión de la presente invención pueden crecerse para producir el polipéptido de la invención. Las células pueden cosecharse y ser lisadas y su contenido de ADN ser examinado para la presencia del ADN usando un método como el descrito por Southern (1975) J. Mol. Biol. 98, 503 o Berent et al (1985) Biotech. 3, 208.

Además de ensayar directamente para la presencia de ADN recombinante, la transformación exitosa puede confirmarse por los métodos inmunológicos bien conocidos cuando el ADN recombinante es capaz de dirigir la expresión de la proteína. Por ejemplo, las células transformadas con éxito con un vector de la expresión producen proteínas que despliegan la antigenicidad apropiada. Las muestras de células sospechosas de transformarse se recolectan y se ensayan para la proteína utilizando los anticuerpos convenientes.

Así, además de las células del huésped transformadas a sí mismas, la presente invención también contempla un cultivo de esas células, preferentemente un cultivo monoclonal (clonablemente homogéneo), o un cultivo derivado de un cultivo monoclonal, en un medio nutriente.

Un aspecto adicional del método de la invención para hacer una preparación de la invención, que comprende el paso de purificar la preparación de una célula según la invención. Los métodos de cultivar células del huésped y aislar las proteínas recombinantes son bien conocidos en la técnica. Se describen ejemplos de técnicas de purificación convenientes en los Ejemplos. Por ejemplo, uno o más componentes de la preparación pueden marcarse para ayudar a la purificación usando los reactivos de afinidad, como se conocerá bien por los expertos en la técnica y según lo descrito en los Ejemplos. También pueden utilizarse las técnicas cromatográficas, por ejemplo según lo descrito en los Ejemplos.

La preparación del aspecto precedente de la invención puede comprender, por ejemplo, LKB1, STRAD o MO25 etiquetados. Las proporciones de LKB1:STRAD:MO25 pueden ser 1:1:1, por ejemplo cuando se mide utilizando técnicas como las descritas en los Ejemplos. Se apreciará que la proporción determinada puede variar, en dependencia de los detalles del método usado en proporcionar la preparación. La preparación puede comprender un complejo que comprende LKB1, STRAD y MO25, como se describió en los Ejemplos.

El método del primer aspecto de la invención puede realizarse con LKB1 en la forma de una preparación hecha por el método del segundo aspecto de la invención; o una preparación o complejo obtenido o asequible por el método según lo indicado anteriormente; o en una célula de la invención.

Los polipéptidos anteriores pueden hacerse por métodos bien conocidos en la técnica y según lo descrito debajo y en el Ejemplo 1 ó 2, usando por ejemplo métodos de biología molecular o métodos automatizados de síntesis química del péptido.

Se apreciará que los compuestos péptidos miméticos también pueden ser útiles. Así, por "polipéptido" o "péptido" nosotros no sólo incluimos moléculas en las cuales los residuos del aminoácido están unidos por los vínculos del péptido (-CO-NH-) sino también por las moléculas en las cuales el enlace del péptido se invierte. Pueden hacerse tales péptidos miméticos del retro-inverso usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo como aquéllos descritos en Mézière et al (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237, incorporados aquí para referencia. Este abordaje involucra la fabricación de seudopéptidos que contienen cambios que involucran la espina dorsal, y no la orientación de cadenas colaterales. Mézière et al (1997) muestra que, por lo menos para las respuestas celulares MHC clase II y auxiliador de T, estos seudopéptidos son útiles. Los péptidos retro-inversos que contienen los enlaces NH-CO en lugar de los enlaces CO-NH del péptido, son mucho más resistentes a la proteólisis.

De forma similar, el enlace del péptido puede distribuirse del todo, con tal de que se use una mitad del ligador apropiado que retiene el espacio entre los átomos C\alpha de los residuos del aminoácido; se prefiere particularmente si la mitad del ligador tiene substancialmente la misma distribución de carga y substancialmente la misma planaridad como un enlace del péptido.

Se apreciará que el péptido puede bloquearse convenientemente en su término C Nor para ayudar a reducir la susceptibilidad a la digestión exoproteolítica.

Así, se apreciará que el polipéptido de STRAD o M025 puede ser un compuesto peptidomimético.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un método para identificar un compuesto para modular la actividad celular del LKB1, el método que comprende los pasos de (1) determinar si un compuesto de prueba modula (por ejemplo incrementa) la actividad de la proteinocinasa del LKB1 de una preparación o complejo o célula como se definió respecto a cualquier aspecto precedente de la invención y (2) seleccionar un compuesto que modula la actividad de dicha proteinocinasa del LKB1. La actividad de la proteinocinasa del LKB1 puede medirse usando, por ejemplo, la proteína básica de la mielina como un sustrato, o usando AMPK o un miembro de la subfamilia del AMPK o un fragmento de éste (según lo discutido anteriormente y en el Ejemplo 3) como el sustrato. Un compuesto que modula, por ejemplo que incrementa la actividad de la proteinocinasa del LKB 1, puede ser útil en la medicina, por ejemplo para tratar el cáncer.

Los compuestos identificados en los métodos pueden por sí mismos ser útiles como un fármaco o pueden representar la primacía de los compuestos para el diseño y síntesis de compuestos más eficaces.

El compuesto puede ser un compuesto semejante a fármaco o lleva el compuesto para el desarrollo de un compuesto semejante a fármaco para cada uno de los métodos anteriores de identificar un compuesto. Se apreciará que los métodos pueden ser útiles como ensayos de exploración selectiva en el desarrollo de compuestos farmacéuticos o fármacos, bien conocidos por los expertos en la técnica.

El término "compuesto semejante a fármaco" se conoce bien por los expertos en la técnica, y puede incluir el significado de un compuesto que tiene características que pueden hacerlo conveniente para el uso en la medicina, por ejemplo como el ingrediente activo en un medicamento. Así, por ejemplo, un compuesto semejante a fármaco puede ser una molécula que puede sintetizarse por las técnicas de la química orgánica, menos preferentemente por las técnicas de biología molecular o bioquímica, y es preferentemente una molécula pequeña que puede ser de menos de 5000 daltones. Un compuesto semejante a fármaco puede exhibir adicionalmente los rasgos de interacción selectiva con una proteína particular o proteínas y estar biodisponible y/o capaz de penetrar las membranas celulares, pero se apreciará que estos rasgos no son esenciales.

De forma similar, el término "compuesto de primacía" se conoce bien por aquellos expertos en la técnica, y puede incluir el significado que el compuesto, aunque no conveniente por sí mismo para el uso como un fármaco (por ejemplo porque sólo es débilmente potente contra su objetivo intencional, no-selectivo en su acción, inestable, difícil de sintetizar o tiene pobre biodisponibilidad) puede proporcionar un punto de partida para el diseño de otros compuestos que pueden tener características más deseables.

Se entenderá que será deseable identificar compuestos que pueden modular la actividad de la proteinocinasa in vivo. Así se entenderá que los reactivos y condiciones usadas en el método pueden escogerse de forma tal que las interacciones, por ejemplo, entre el dicho LKB1 y, por ejemplo, los polipéptidos STRAD o MO25, sean substancialmente iguales que entre el LKB1 humano y STRAD humano y/o MO25. Se apreciará que el compuesto puede ligar al LKB1, o pueda ligar al STRAD o M025.

Los compuestos que se prueban en los métodos de exploración selectiva del ensayo o en otros ensayos en los cuales puede medirse la habilidad de un compuesto para modular la actividad de la proteinocinasa de una proteinocinasa, por ejemplo LKB1, pueden ser compuestos que se han seleccionado y/o diseñado (incluyendo modificación) usando las técnicas del modelado molecular, por ejemplo utilizando las técnicas de computación. El compuesto seleccionado o diseñado puede sintetizarse (si no ya sintetizado) y probado para su efecto en el LKLB1, por ejemplo su efecto en la actividad de la proteinocinasa. El compuesto puede probarse en un método de exploración selectiva de la invención.

Se apreciará que los ensayos de exploración selectiva, los cuales son capaces de un funcionamiento alto se preferirán particularmente. Los ejemplos pueden incluir los ensayos descritos basados en la célula y los ensayos del enlace proteína-proteína. Un ejemplo adicional es un sistema basado en SPA (Ensayo de Proximidad de Centelleo; Amersham International), también conocido por los expertos en la técnica. Otros métodos de detectar interacciones polipéptido/polipéptido incluyen la ultra filtración con métodos de espectroscopia de masa por rociado del ión/HPLC u otros métodos físicos y analíticos. Pueden usarse los métodos. de Transferencia de Energía por Resonancia y Fluorescencia (FRET), por ejemplo, bien conocidos por los expertos en la técnica, en los cuales puede medirse el enlace de dos entidades fluorescentes designadas midiendo la interacción de los fluorescentes designados cuando están en proximidad íntima uno a otro.

Un aspecto adicional de la invención es un compuesto identificado o identificable por un método de exploración selectiva de la invención.

Aún un aspecto adicional de la invención es un compuesto de la invención para el uso en la medicina.

El compuesto puede administrarse de cualquier manera conveniente, normalmente parenteralmente, por ejemplo vía intravenosa, intraperitoneal, o intramuscular o intravesical, en el estándar estéril, formulaciones no pirogénicas de los diluentes y portadores. El compuesto también puede administrarse tópicamente. El compuesto también puede administrarse en una manera localizada, por ejemplo por inyección. El tratamiento puede consistir en una sola dosis o una pluralidad de dosis durante un período de tiempo. El compuesto puede ser útil como un agente anticancerígeno o para el tratamiento de, por ejemplo, la diabetes o la obesidad.

Aunque es posible para un compuesto de la invención ser administrado exclusivamente, es preferible presentarlo como una formulación farmacéutica, junto con uno o más portadores aceptables. El portador(s) debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con el compuesto de la invención y no deletéreo a los recipientes de éste. Típicamente, los portadores serán agua o solución salina que serán estériles y libres de pirógeno.

Así, la invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto identificado o identificable por los métodos de exploración selectiva de la invención y un portador aceptable farmacéuticamente.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un juego de partes que comprenden LKB 1 o un polinucleótido recombinante de LKB1 poniendo en código STRAD o un polinucleótido recombinante que pone en código STRAD, o poli nucleótido recombinante poniendo en código MO25. Un aspecto adicional de la invención proporciona un juego de partes que comprenden (1) AMPK o a un miembro de la subfamilia de AMPK, o polinucleótido recombinante que pone en código a AMPK o a un miembro de la subfamilia de AMPK (incluso un fragmento de éste según lo discutido anteriormente o en el Ejemplo 3) y (2) un juego de partes según lo definido respecto al aspecto precedente de la invención, o célula de la invención. Tales juegos pueden ser útiles en formar una preparación o complejo que pueden ser útiles en, por ejemplo un método de exploración selectiva del primer aspecto de la invención. El polinucleótido(s)
recombinante puede estar en un vector de expresión (por ejemplo según lo discutido anteriormente) o (menos deseablemente) útil para la expresión in vitro.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un método de preparar un complejo de LKB1/STRAD/MO25 que comprende los pasos de (1) seleccionar un tipo de célula en la cual sobre expresa LKB1, comprendiendo el paso de determinar si el tipo de célula es uno que expresa STRAD y MO25, y preparar un complejo de LKB1/STRAD/MO25 por medio de la sobre expresión de LKB1 en el tipo celular seleccionado. Los métodos para determinar si el tipo celular expresa a STRAD y MO25 se conocerán bien por los expertos en la técnica, y se describen ejemplos de tales métodos en los Ejemplos. Alternativamente, el tipo de célula puede ser uno que ya se conoce para expresar STRAD\alpha y MO25\alpha. Los ejemplos de tales células incluyen 293, HeLa, G361 y Rat2.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un método para preparar un complejo de LKB1/STRAD/MO25 que comprende los pasos de (1) sobre expresión de LKB1 en una célula usando un método según el aspecto precedente de la invención y (2) preparar dicho complejo desde la célula. Se describen métodos convenientes para preparar el complejo de LKB1/STRAD/MO25 en los Ejemplos.

La sobre expresión de LKB1 puede llevar a la detención del crecimiento, por ejemplo en las células del eucariota. Por consiguiente, puede ser necesario expresar LKB1 usando un sistema de expresión transitorio, por ejemplo según lo descrito en los Ejemplos, o usando un sistema de expresión regulado (inducible), también conocido por los expertos en la técnica.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un método identificando una diferencia genética asociada con SPJ (Síndrome de Peutz-Jeghers) que comprende los pasos de (1) investigar la secuencia de un gen que pone en código un STRAD o una isoforma de MO25 en por lo menos un paciente que tiene SPJ (2) identificar cualquier diferencia entre la secuencia del paciente y la secuencia equivalente de un individuo sin SPJ. La asociación de LKB1 con STRAD y MO25 y la asociación de deficiencia de LKB1 con SPJ sugieren que los defectos en M025 o STRAD también podrían estar involucrados en SPJ. Las técnicas para identificar mutaciones en los genes aspirantes, y para investigar si una mutación está ligada con la enfermedad o no, se conocerá bien por los expertos en la técnica.

Así, la invención proporciona STRAD o MO25 o un polinucleótido recombinante codificando los mismos para el uso en la medicina. Un aspecto adicional de la invención proporciona el uso de STRAD o M025 o un poli nucleótido recombinante codificando los mismos en la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer, el SPJ, la diabetes o la obesidad. El poli nucleótido recombinante puede estar en la forma de un vector de terapia del gen, por ejemplo un vector de terapia del gen viral, también conocido por los expertos en la técnica.

Un aspecto adicional del método de la invención para identificar un compuesto que activa a AMPK o al miembro de la subfamilia de AMPK por un mecanismo similar a la metformina o fenformina o ribosida de AICA, en el cual el efecto de un compuesto de prueba en la activación de AMPK o de un miembro de la subfamilia de AMPK por una preparación o complejo o célula de la invención, se compara con el efecto de la metformina o fenformina o ribosida de AICA en la activación de AMPK o de un miembro de la subfamilia de AMPK, y se selecciona un compuesto con un efecto similar. Tal método puede ser útil en determinar si un compuesto es más potente que la metformina o fenformina o ribosida de AICA.

Por el término "anticuerpo" se incluyen anticuerpos sintéticos y fragmentos y variantes (por ejemplo según lo discutido anteriormente) de anticuerpos enteros que retienen el antígeno en el sitio de enlace. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, pero puede también ser una preparación de anticuerpo policlonal, una parte o parte de éste (por ejemplo un fragmento de Fab o F(ab')2) o un anticuerpo sintético o parte de éste. Los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv, ScFv y dAb pueden todos ser expresados en y segregados del E. coli, permitiendo así la producción fácil de cantidades grandes de dichos fragmentos. Por "moléculas de ScFv" se significa las moléculas en donde los dominios compañeros VH y VL se unen por la vía de un oligopéptido flexible. Se prefieren los anticuerpos
clase IgG.

Los anticuerpos monoclonales convenientes para los antígenos seleccionados pueden ser preparados por las técnicas conocidas, por ejemplo aquéllas descritas en "Anticuerpos Monoclonales": Un manual de técnicas, H. Zola (CRC Press, 1988) y en "Anticuerpos Monoclonales del Hibridoma: Técnicas y Aplicaciones", JGR Hurrell (CRC Press, 1982), modificado según lo indicado anteriormente. Anticuerpos biespecíficos pueden ser preparados por fusión celular, por la reasociación de fragmentos monovalentes o por entrecruzamiento químico de los anticuerpos enteros. Se describen métodos para preparar los anticuerpos biespecíficos en Corvalen et al, (1987) Cancer Immunol. Immunother. 24, 127-132 y 133-137 y 138-143.

Una revisión general de las técnicas involucradas en la síntesis de fragmentos del anticuerpo que retienen los sitios de enlace específicos se encontrarán en Winter y Milstein (1991) Nature 349, 293-299.

La invención se describe ahora además haciendo referencia a las Figuras y Ejemplos siguientes, no limitantes.

Leyendas de las figuras

Figura 1. Asociación de MO25\alpha con LKB1. (A) Los lisados celulares derivados del control parental de células de HeLa o células de HeLa expresando establemente el Terminal-N del epítope Flag-marcado del LKB1 tipo natural (WT) o el cinasa inerte (KD) del LKB1 se pasaron a través de una columna de agarosa por afinidad al anti-Flag M2-, la elución del LKB 1 eluído con los péptidos de Flag, y las muestras se concentraron según lo descrito en Materiales y Métodos. Las muestras fueron sometidas a electroforesis en un gel de poliacrilamida y las bandas de proteína visualizadas siguiendo la mancha azul coloidal. Se indican las bandas de la proteína, únicas para las preparaciones WT y KD del LKB1. (B) Las bandas coloreadas de azul-coloidal designadas según lo indicado en (A) fueron escindidas desde el gel, digeridas las proteínas en el gel con tripsina, y sus identidades fueron determinadas por la huella dactilar de la masa-espectral del péptido tríptico. La identidad de STRAD\alpha y M025\alpha fue confirmada por el análisis de la secuencia LC-MS/MS en un espectrómetro de masa Q-TOF2. Se indican el número de péptidos trípticos, el porcentaje de cobertura de la secuencia y los números gi de NCBI para cada proteína identificada. (C) Las muestras purificadas en (A) fueron inmunotransferidas con los anticuerpos indicados. Resultados idénticos se obtuvieron siguiendo 2 purificaciones independientes del LKB 1 desde las células de HeLa.

Figura 2. Modelos de la secuencia del aminoácido y distribución del tejido de las isoformas de MO25\alpha y MO25\beta. (A) La alineación de la secuencia del aminoácido de las isoformas del MO25\alpha humano (número de acceso NCBI NP_057373) y MO25\beta (número de acceso NCBI Q9H9S4) así como del C. elegans MO25\alpha (NCBI número de acceso CAB 16486) y de MO25\beta (número de acceso NP_508691) y los homólogos putativos de Drosophila MO25 (NCBI número de acceso P91891). Se embalan los residuos conservados en negro, y los residuos homólogos están sombreados en gris. Las alineaciones de la secuencia se realizaron utilizando los programas de CLUSTALW y BOXSHADE en http://www.ch.embnet.org/usando los parámetros estándar. (B) un fragmento 32P-marcado del cADN de MO25 fue usado para sondear una transferencia Northern conteniendo el poliadenilato de ARN aislado de los tejidos humanos indicados. La membrana fue auto radiografiada, y la sonda del MO25\alpha fue observada para hacer híbrido a un mensaje 4.2-kb, idéntico al tamaño predicho por el mensaje de MO25\alpha desde el análisis de la base de datos. Como un control de la carga, la transferencia Northern se hizo híbrida con una sonda \beta-actina. (C y D) Los extractos del tejido del ratón indicado (C) o célula (D) que contienen 20 \mug de la proteína celular total fueron inmunotransferidos con los anticuerpos anti-MO25\alpha y anti-MO25\beta.

Figura 3. El LKB1 endógeno se asocia con MO25\alpha. (A) El LKB1 fue inmunoprecipitado desde 2 mg de los lisados indicados que usan 10 \mug del anticuerpo anti-LKB1 acoplado de forma covalente a la proteína G-Sefarosa, y los inmunoprecipitados fueron inmunotransferidos con los anticuerpos indicados. Como un control, se realizaron también en paralelo las inmunoprecipitaciones en experimentos con los anticuerpos preinmunes IgG acoplados de forma covalente a la proteína G-Sefarosa. En cada gel, unos 20 \mug del lisado total de la célula también fue inmunotransferido en paralelo. (B) MO25\alpha fue inmunoprecipitado como anteriormente, excepto que se emplearon 15 \mug del anticuerpo de MO25\alpha. Los resultados mostrados son de un solo experimento que fue repetido 3 veces con resultados similares.

Figura 4. MO25\alpha se asocia con LKB1 a través de STRAD\alpha. (A) 293 células fueron transfectadas con los plásmidos puestos en código para la expresión de las proteínas de fusión indicadas GST junto con Myc-MO25\alpha. 36 h post transfección, las proteínas designadas GST fueron por afinidad purificadas desde los lisados celulares usando el glutatión-Sefarosa según lo descrito en Materiales y Métodos. Cantidades similares de las proteínas de fusión purificadas-GST se sometieron a electroforesis SDS-gel poliacrilamida y fueron inmunotransferidas con el anticuerpo anti myc para detectar Myc-MO25\alpha copurificado, o con el anticuerpo anti-GST para asegurar que cantidades comparables de las proteínas del GST unido estuvieran presentes en cada senda (paneles superior y medio). También, previo a la purificación por afinidad, se sometieron 5 \mug de los lisados totales de la célula a la inmunotransferencia con el anticuerpo anti myc para asegurar que Myc-MO25\alpha fuera expresado a niveles similares en cada cotransfección (panel más bajo). (B) El LKB1 del GST unido de Terminal-N se expresó en 293 células en la presencia o ausencia de Flag-STRAD\alpha y fue purificado como anteriormente. Las proteínas purificadas se sometieron a electroforesis SDS-gel de poliacrilamida y se visualizaron por la coloración azul coloidal (panel superior). La banda de la proteína débil indicada, que corresponde a una proteína endógena de 40-kDa (marcado *), se identificó por la huella dactilar de la masa-espectral del péptido tríptico como el endógenamente expresado MO25\alpha (con 38% de cobertura de secuencia). Las proteínas purificadas también fueron inmutransferidas con los anticuerpos indicados (paneles inferiores). (C) Como anteriormente, sólo que GST-LKB1 se expresó en 293 células junto con las isoformas indicadas de Flag-STRAD y Myc-M025 y las proteínas visualizadas por la coloración azul coloidal también fueron inmunotransferidas con los anticuerpos indicados. Para todos los paneles, se obtuvieron resultados similares en por lo menos 3 experimentos separados.

Figura 5. MO25\alpha y STRAD\alpha fijan LKB1 en el citoplasma. Las células de HeLa fueron transfectadas con las estructuras indicadas codificando para la expresión de Myc-MO25\alpha, Flag-STRAD\alpha y GFP-LKB1. 24 h post transfecciones las células fueron fijadas en paraformaldehido al 4% (por volumen) e inmunocoloreadas con el anticuerpo anti-MO25\alpha para detectar MO25\alpha (anticuerpo secundario del TR anti-carnero, canal rojo) y anti-Flag para detectar STRAD\alpha (anticuerpo secundario del Cy5n anti-ratón, canal azul). La localización de GFP-LKB1 se visualizó directamente a través de la fluorescencia de GFP (canal verde). Las células fueron retratadas usando un microscopio con focal Zeiss LSM 510 META. Las células mostradas son las imágenes representativas obtenidas en 3 experimentos separados. Las barras de la balanza corresponden a 10 \mum.

Figura 6. MO25 reconoce los 3 residuos de Terminal-C de STRAD\alpha. (A) STRAD\alpha del tipo natural unido al terminal-N de GST o los mutantes indicados de STRAD\alpha se expresaron en 293 células junto con Myc-MO25\alpha, y 36 h post transfección las proteínas de STRAD\alpha fueron purificadas por afinidad desde los lisados celulares usando glutatión-Sefarosa. Cantidades similares de las proteínas purificadas se sometieron a electroforesis SDS-gel de poliacrilamida y fueron inmunotransferidas con el anticuerpo anti myc para detectar Myc-MO25\alpha copurificado, o con el anticuerpo anti-GST para asegurar que cantidades comparables de las proteínas del GST unido estuvieran presentes en cada senda (paneles superior y medio). También, previo a la purificación por afinidad, se sometieron 5 \mug de los lisados totales de la célula a la inmunotransferencia con el anticuerpo anti myc para asegurar que Myc-MO25\alpha fuera expresado a niveles similares en cada condición (panel inferior). (B) 0.5 mg de los lisados celulares indicados se incubó con 5 \mug de un péptido biotinilado de terminal-N que abarca o el terminal-C de 12 residuos de STRAD\alpha conjugado al estreptavidina-Sefarosa (NLEELEVDDWEF, nombrado STRAD\alpha-C12, o mutantes de este péptido en el cual los residuos indicados fueron mutados individualmente a Ala. Seguido al aislamiento y lavado de las cuentas, las muestras se sometieron a electroforesis SDS-gel de poliacrilamida y fueron inmunotransferidas con un anticuerpo anti-MO25. (C) El enlace de MO25\alpha bacterianamente expresado a los péptidos indicados se analizó por la resonancia de superficie de plasmón. El análisis de BiaCore según lo descrito en Materiales y Métodos. El enlace se analizó sobre un rango de concentraciones de MO25 (6.25-3200 nM) y el nivel de respuesta en el estado estacionario del enlace se graficó contra el logaritmo de la concentración del MO25\alpha. El Kd estimado para el péptido de STRAD\alpha -C12 se obtuvo introduciendo los datos en la fórmula [ml X m0/(m0+m2)] usando el software de Kaleidagraph y el Kd fue calculado para ser 850 nM. WEF-C12 corresponde a NLEELEVDDWEF, WEA-C12 corresponde a NLEELEVDDWEA, AEF-C12 corresponde a NLEELEVDDAEF, WAF-C12 corresponde a NLEELEVDDWAF, WEF-C6 corresponde a VDDWEF.

Figura 7. Enlace de LKB1 a STRAD\alpha crea el nuevo sitio de enlace(s) para MO25\alpha. Las formas indicadas de GSTSTRAD\alpha fueron coexpresadas en 293 células junto con Myc-MO25\alpha y/o el tipo natural Flag-LKB 1 o el dominio catalizador de LKB 1 aislado (LKB1 [44-343]. 36 h post-transfección, las proteínas de GST-STRAD fueron purificadas por afinidad, sometidas a electroforesis SDS-gel de poliacrilamida y fueron inmunotransferidas con el anticuerpo anti myc para detectar Myc-MO25, el anticuerpo anti-Flag para detectar copurificado Flag-LKB 1 y Flag-LKB 1 [44-343], o con el anticuerpo anti-GST para detectar formas de STRAD\alpha (paneles superiores). También, previo a la purificación por afinidad, se sometieron 5 \mug de los lisados totales de la célula a la inmunotransferencia con los anticuerpos anti myc y anti-Flag para asegurar que MO25\alpha y LKB fueran expresados a niveles similares en cada cotransfección (paneles inferiores). Resultados similares se obtuvieron en 3 experimentos separados.

Figura 8. Las isoformas de MO25 estabilizan el complejo de LKB10STRAD\alpha. (A) 293 células fueron transfectadas con 3 \mug de la estructura del ADN codificando para la expresión de GST-LKB1, en la presencia o ausencia de 3 \mug de Flag-STRAD\alpha y en la ausencia o presencia de cantidades indicadas de la estructura de Myc-MO25. 36 h post-transfección, GST-LKB1 fue purificado por afinidad desde los lisados celulares e inmunotransferido con los anticuerpos del epítope apropiado para detectar LKB1, STRAD\alpha y MO25\alpha. 5 \mug de lisados totales de la célula, previo a la purificación por afinidad, también fueron inmunotransferidos con los anticuerpos indicados (paneles inferiores). (B) Se realizó como anteriormente sólo que se empleó la estructura de MO25\beta en lugar de la estructura del MO25\alpha. Se obtuvieron resultados similares en 3 experimentos separados.

Figura 9. Activación de LKB1 por asociación con las isoformas de STRAD e MO25. 293 células fueron transfectadas con las estructuras codificando GST-LKB1 en la presencia o ausencia de estructuras que ponen en código las isoformas indicadas de STRAD y MO25. 36 h post-transfección, GST-LKB1 fue purificada por afinidad y ensayada para autofosforilación y transfosforilación de MBP según lo descrito en los materiales y métodos. Las reacciones fueron sometidas a electroforesis y el gel auto radiografiado (panel superior). La fosforilación de MBP por LKB 1 a Tr65 también se supervisó por inmunotransferencia con un anticuerpo fosforoespecífico (T65-P), el cual reconoce el fosforilado de MBP por LKB1 en su residuo. Cada reacción también fue inmunotransferida con los anticuerpos del apéndice del epítope apropiado para supervisar los niveles de LKB1, STRAD, e isoformas de M025. Se obtuvieron resultados similares en 3 experimentos separados.

Figura 10. Alineación de secuencia de aminoácido de isoformas de STRAD con los parientes de STE20-cinasas más próximos. (A) La alineación de secuencia de aminoácido del STRAD\alpha humano (NCBI número de acceso AAG48269) y STRAD (NCBI número de acceso AAM19143) con SPAK humano (número de acceso NCBI AAC72238) y OSR1 humano (NCBI número de acceso NP_005100). Los residuos conservados se embalan en negro, y los residuos homólogos están sombreados en gris. El Asp catalizador (subdominio VI) y Asp-Phe-Gly (subdominio VII) presente en el SPAK activo y en las proteinocinasas del OSR1, pero faltantes en las seudocinasas del STRAD\alpha y del STRAD\beta se embalaron y marcaron con un asterisco. El Terminal-C del Trp-Glu-Phe motivo presente en STRAD y STRAD que corresponde a una secuencia de Phe-Glu-Phe en SPAK y OSR1 son embalados y marcados con triángulos y los sitios de fosforilación de LKB1 en STRAD\alpha (Tr329 y Tr419) (Baas et al., 2003) se marcan con flechas. Se realizaron las alineaciones de la secuencia usando los programas de CLUSTALW y BOXSHADE en http://www.ch.embnet.org/usando los parámetros estándar.

Figura 11. Las isoformas de MO25 incrementan la expresión de STRAD\beta y la formación del complejo de LKB1-STRAD\beta. (A) 293 células fueron transfectadas con 3 \mug de la estructura del ADN codificando para la expresión de GST-LKB1, en la presencia o ausencia de 3 \mug de la estructura de Flag-STRAD\beta y en la ausencia o presencia de cantidades indicadas de la estructura de Myc-MO25\alpha. 36 h post-transfección, GST-LKB1 fue purificado por afinidad desde los lisados celulares e inmunotransferidos con los anticuerpos del epítope apropiado para detectar LKB1, STRAD\beta y MO25\alpha. 5 \mug de los lisados totales de la célula, previo a purificación por afinidad ambién fueron inmunotransferidos con los anticuerpos indicados (paneles inferiores). (B) Se realiza como anteriormente excepto que se empleó la estructura de MO25\beta en lugar de la estructura de MO25\alpha. Se obtuvieron resultados similares en 3 experimentos separados y también cuando STRAD\beta se expresó como una proteína de fusión-GST en el vector del pEBG-2T en lugar del vector del pCMV5 (datos no mostrados).

Figura 12: Alineación de las secuencias del aminoácido de Tos3, Pak1 y Elml desde la levadura y LKB 1 y CaMKK\beta (variante \beta3) desde los humanos. La alineación se creó usando PILEUP desde la serie GCH [49] y la secuencia consenso fue determinada y agregada coloreando usando BOXSHADE v3.2.1 [50]. Los residuos en los cuales son idénticas por lo menos la mitad de las secuencias están coloreados en gris, con los cambios conservadores también en gris. La secuencia consenso está representada por letra mayúscula si el residuo en una posición particular es idéntico en todas las secuencias, y por una letra minúscula si por lo menos se conserva la mitad. Sólo se muestran las regiones centrales conservadas que contienen los dominios del cinasa (residuos 50-310 de LKB 1 aprox.).

Figura 13: Dos AMPKKs pueden resolverse de los extractos del hígado de la rata pero los dos son complejos entre LKB1, STRAD\alpha, y MO25\alpha. (A) Separación de dos actividades que activan el dominio catalizador de GST-AMPK\alpha1 por el cromatógrafo de Q-Sefarosa. El gráfico muestra la actividad de AMPKK en fracciones (círculos abiertos, absorbancia a 280 nm (línea continua) y la conductibilidad en el eluato (línea discontinua). El eje "x" representa el número de la fracción (fracciones de 4.5 ml). B, C, D: examinado los sustratos de fracciones de la columna después de SDS-PAGE (1 \mul por senda) usando el anti-LKB1 (B), anti-STRAD\alpha (C) y anti-MO25\alpha (D). E, F, G: Se concentraron fracciones 26-30 desde 4.5 ml hasta 250 \mul usando concentradores centrífugos Amicon Ultra-4 30,000 MWCO, y 2 \mul fue cargado por senda. Continuando, los geles de SDS-PAGE se transfirieron a nitrocelulosa y las membranas sondeadas con el anti-LKB1 (E), anti-STRAD\alpha (F) y anti-MO25\alpha (G).

Figura 14: La actividad de AMPKK, y los polipéptidos de LKB1, STRAD\alpha y MO25\alpha, pueden ser inmunoprecipitados desde AMPKK1 y AMPKK2 del hígado de la rata usando el anticuerpo anti-LKB 1. (A) Detención de la actividad del AMPKK desde el sobrenadante. El LKB anti-humano de la oveja o la inmunoglobulina de control preinmune (IgG) fue preligado a las cuentas de Proteína G-Sefarosa y entrecruzado con DMP como se describió previamente [51], excepto que se realizó un lavado final de las cuentas con 100 mM de glicina, pH 2.5. Anticuerpos liga-cuenta (40 Pl) se incubaron con la fracción máxima de AMPKK1 (0.04 Unidades), AMPKK2 (0.03 Unidades) o el complejo GST-LKB1:STRAD\alpha:MO25\alpha recombinante (0.06 Unidades) durante 20 minutos y las cuentas fueron removidas en una micro centrífuga (14,000xg, 2 min.). Se determinó la actividad de AMPKK en los sobrenadantes y se expresa como un porcentaje del valor obtenido usando el control IgG. (B) Las pelotillas del experimento en (A) fueron resuspendidas en el volumen original y las muestras de los sobrenadantes y pelotillas analizadas por la prueba de transferencia Western con el anticuerpo anti-LKB1. El LKB1 recombinante emigra a una masa molecular más alta debido al apéndice de GST (C) Como A, sólo que la cantidad de AMPKK1, AMPKK2 y complejo de GST-LKB1:STRAD\alpha:MO25\alpha recombinante se aumentó a 0.44, 0.70 y 1.4 Unidades respectivamente, y las actividades fueron determinadas en las pelotillas resuspendidas. En este experimento la cantidad de anticuerpo fue limitante de modo que solamente una porción de la actividad fue precipitada. (D) Las pelotillas del experimento en (C) fueron resuspendidas y las muestras analizadas por la prueba de transferencia Western con los anticuerpos anti-LKB1, anti-STRAD\alpha y anti-MO25\alpha.

Figura 15: Los complejos recombinantes de LKB1-STRAD-MO25 pueden activar eficazmente el AMPK por la vía de la fosforilación a Tr-172. (1): las combinaciones indicadas del LKB 1 tipo natural GST-apendizado (WT, sendas 1-9), o cinasa inerte (D194A, KD, sendas 10-13) el mutante de LKB1, o GST-solo (senda 14), Flag-apendizado STRAD\alpha o STRAD\beta, y myc-apendizado MO25\alpha o MO25\beta fueron coexpresados en las células de HEK-293T, purificados en glutatión-Sefarosa y probadas para su habilidad para activar el dominio catalizador de GST-AMK\alpha1 (panel superior). Las muestras de cada incubación también se analizaron por la prueba de transferencia Western y sondeadas usando los anticuerpos indicados (de la cima al fondo): anti-pT172, anti-AMPK 1 dominio catalizador (GST-1), anti-GST para detectar GST-LKB1, anti-FLAG para detectar STRAD\alpha y STRAD\beta, y d anti myc para detectar MO25\alpha y MO25\beta. Todas las proteínas emigraron con la movilidad esperada, teniendo en cuenta los apéndices del epítope. Las tres transferencias del fondo fueron conducidas en las reacciones del blanco carente del dominio catalizador del GST-AMPK, ya que el último parecía causar alguna interferencia con la detección. (B): el complejo de GST-LKB1:STRAD\alpha:MO25\alpha recombinante se usó para fosforilar el tipo natural GST-\alpha1 dominio catalizador (GST-1-WT) o un mutante de T172A (GST-\alpha1-T172A) usando [\gamma-32]ATP como se describió en Métodos. La reacción se analizó por SDS-PAGE y auto radiografía. Las flechas muestran la migración de GST-LKB 1 (el cual autofosforila) y GST-\alpha 1 dominio catalizador.

Figura 16: Activación y fosforilación de los complejos heterotriméricos de AMPK por AMPKK1, AMPKK2 y los complejos de GST-LKB1:STRAD\alpha:MO25\alpha recombinantes. Los complejos recombinantes \alpha1\beta1\gamma1 o \alpha2\beta1\gamma1 se incubaron por 10 min. con MgATP y AMPKK1 (2.8 o 1.4 unidades/ml), AMPKK2 (10,3 o 5,15 unidades/ml) o GST-LKB1:STRAD\alpha:MO25\alpha (14,3 o 7,2 unidades/ml), y se determinó la actividad de AMPK. Dos veces tanto cinasa a contracorriente se adicionó cuando el complejo \alpha1\beta1\gamma1 era el sustrato, tal como los experimentos modelos mostraron que éste se activó menos rápidamente. Las imágenes son de las transferencias Western experimentadas con el anticuerpo fosforoespecífico anti-pT172 (panel superior), y con una mezcla de anticuerpos anti-\alpha1 y anti-\alpha2 para demostrar la carga uniforme de los complejos \alpha1\beta1\gamma1 o \alpha2\beta1\gamma1 (note que el anticuerpo anti-\alpha2 siempre da una señal más fuerte que el anti-\alpha1, incluso para cargas iguales de proteína).

Figura 17: La actividad de AMPKK endógeno puede ser inmunoprecipitada de 293 células que usan el anticuerpo LKB 1, pero la actividad puede ser sólo inmunoprecipitada de las células de HeLa si ellas expresan LKB 1 establemente (pero no un mutante catalíticamente-inactivo) desde un promotor inducible. LKB1 fue inmunoprecipitado desde 0.5 mg del extracto celular derivado desde las células no-transfectadas de HEK-293T (sendas 1,2), células de HeLa no-transfectadas (sendas 3,4), o células de HeLa que expresan establemente el LKB1 tipo natural (WT) (sendas 5,6) o un mutante (D194A) del cinasa inerte (KD) del LKB1 (sendas 7,8) de un promotor inducible. La inmunoprecipitación fue con el anti-LKB1 (sendas 1, 3, 5, 7) o una inmunoglobulina de control preinmune (IgG, sendas 2, 4, 6, 8).

Se usaron muestras de cada inmunoprecipitado para ensayar la activación de GST-AMPK\alpha1-dominio catalizador, para analizar la fosforilación de GST-AMPK\alpha1-dominio catalizador en Tr-172 (medio del panel), y para determinar la recuperación de LKB1 (fondo del panel). Las muestras de cada inmunoprecipitado también fueron inmunotransferidas por la presencia de los STRAD\alpha y MO25\alpha endógenos con los anticuerpos apropiados. También mostrada en el tope del panel está la actividad basal obtenida cuando el GST-AMPK\alpha1-dominio catalizador se incubó con MgATP solo (sin adición).

Figura 18: La restauración de la habilidad de AMPK para ser activado por ribosida AICA y fenformina en las células HeLa por expresión de LKB 1. Las células HeLa de control (sendas 1, 2, 3), las células de HeLa que expresan el LKB1 tipo natural (WT) (sendas 4,5,6) y el cinasa inerte (D194A, KD) del mutante de LKB1 (sendas 7, 8, 9) fueron dejados sin estimular o tratados con 2 mM de ribosida AICA o 10 mM de fenformina por 60 min. y lisado. (A) El AMPK endógeno fue inmunoprecipitado desde los extractos de la célula y ensayado. (B) la célula de los lisados fue inmunotransferida con los anticuerpos que reconocen el AMPK\alpha1 fosforilado a Tr172 o AMPK\alpha1 total; los resultados se analizaron usando el procesador de imagen LI-COR IR Odyssesy^{TM} como se describió debajo en Materiales y Métodos, y se expresan como una proporción de las dos señales. (C) La célula de los lisados se analizó por la prueba de transferencia Western y las membranas se examinaron con los anticuerpos que reconocen el ACC fosforilado a Ser-79, o estreptavidina para determinar el AMPK\alpha1 total. Los resultados se analizaron usando el procesador de imagen de IR LI-COR como para (B).

Figura 19: Alineación secuencial de las secuencias del bucle de activación de los cinasas de la subfamilia de AGC (PKA\alpha y PKC\alpha, los cuales se piensa que no son activados por el LKB1) con los residuos del bucle-T de las proteinocinasas de la subfamilia de AMPK/SNF1. Los métodos y representación son según lo descrito en la Figura 1. Los residuos de treonina que corresponden al Tr-172 de AMPK ("P") y otros residuos mencionados en el texto se indican con flechas descendentes. Todas las secuencias son de humanos, excepto AtSnRK1-\alpha1, AtSnRK1-\alpha2 y ScSnf1, los cuales son homólogos de AMPK del Arabidopsis thaliana (AtSnRK1, cinasa-1 de SNF1-relacionado) y del cerevisiae Saccharomyces (ScSnfl). Aunque los homólogos del humano, Arabidopsis, y S. cerevisiae, así como los cinasas el PKA\alpha y de PKC\alpha, se conoce que son activados por la fosforilación del residuo de treonina equivalente a Tr-172, todavía tiene que ser establecido si los otros miembros de la subfamilia de AMPK (NuaK1, NuaK2, BrsK1, BrsK2, SIK, QIK, QSK, MELK) se activan por la fosforilación de este residuo, y si los complejos de LKB1-STRAD-MO25 pueden mediar esta fosforilación.

Figura 20: El Km y Vmax para un sustrato del péptido (denominado AMPKtido). Se describen las condiciones del ensayo en el Ejemplo 3.

Fig. 21. Activación de los cinasas del AMPK-relacionado por LKB1. (A) El dendrograma y las secuencias del bucle-T de las proteinocinasas de la subfamilia de AMPK/SNF1 (Manning et al., 2002). Los residuos idénticos se sombrean en negro y los residuos conservados en gris. Tr y Ser del bucle-T se indican con un asterisco. (B) Los cinasas del AMPK-relacionado indicados fueron incubados con los complejos LKB1:STRAD:MO25 tipo natural (cuadrados abiertos) o LKB1[D194A]:STRAD:MO25 catalíticamente inactivo (círculos abiertos) en la presencia de Mg2+ y ATP. En los tiempos indicados, la actividad de los cinasas del AMPK-relacionado se ensayó con el péptido de AMARA y los resultados se expresan como actividad específica. Los resultados mostrados son los promedios \pm DS de ensayos llevados a cabo por triplicado y representativos de dos experimentos independientes. Las barras del error sólo se muestran cuando son mayores que el tamaño de los cuadrados abiertos.

Fig. 22. La activación eficiente de los cinasas AMPK-relacionado por LKB1 requiere STRAD y subunidades de MO25. Las combinaciones indicadas de LKB1 GST-apendizado tipo natural (WT, sendas 1-9), o LKB1 catalíticamente inactivo (D194A, sendas 10-13), o GST solo (senda 14), STRAD\alpha o STRAD\beta Flag-apendizado, y MO25\alpha o MO25\beta myc-apendizado fueron coexpresados en las células de HEK-293T y purificados en glutatión-Sefarosa. Los complejos se probaron para su habilidad a activar el dominio catalizador de AMPKa1 o de los cinasas de AMPK-relacionados indicados. Los resultados se expresan como actividad específica empleando el péptido de AMARA como sustratos. Los resultados mostrados son los promedios \pm DS de ensayos llevados a cabo por triplicado y representativos de dos experimentos independientes. También se analizaron las muestras de cada incubación por la prueba de transferencia Western y fueron examinadas usando los anticuerpos indicados (del tope al fondo): anti-GST para detectar LKB1; anti-Flag para detectar STRAD\alpha y STRAD\beta; y anti myc para detectar MO25\alpha y MO25\beta. Todas las proteínas emigraron con la movilidad esperada, teniendo en cuenta los apéndices del epítope.

Fig. 23. El Tr del bucle-T es el sitio de mayor fosforilación de LKB1 en los cinasas del AMPK-relacionado. Los mutantes tipo natural (WT) y Tr del bucle-T a Ala (Tr\rightarrowAla) de los cinasas indicados del GST-AMPK-relacionado, se incubaron con el complejo LKB1:STRAD:MO25 en la presencia de Mg2+ y [\gamma32P]ATP. La fosforilación de los sustratos de la proteína fue determinada por electroforesis en un gel de poliacrilamida y el auto radiografía subsiguiente de las bandas coloreadas de azul de Coomassie que corresponden a cada sustrato. Un alícuota de cada incubación también se analizó por la prueba de transferencia Western examinando con un anticuerpo anti-HA para asegurar igual carga de los cinasas de tipo natural y los del mutante de AMPK-relacionado (los cuales todos poseen un apéndice del epítope de HA). Todas las proteínas emigraron con la movilidad esperada, teniendo en cuenta los apéndices del epítope. Se obtuvieron resultados similares en 3 experimentos separados.

Fig. 24. Efecto de la mutación del Tr en el bucle-T sobre la activación de los cinasas del AMPK-relacionado por LKB1. Los cinasas indicados tipo natural (WT) del AMPK-relacionado o mutantes de estas enzimas en las cuales el Tr del bucle-T fue cambiado a Ala (T/A) o Glu (T/E), se incubaron en la ausencia (-) o presencia (+) de LKB1:STRAD:MO25 tipo natural en la presencia de Mg2+ y ATP. Después de 30 min., los cinasas del AMPK-relacionado se ensayaron con el péptido de AMARA y los resultados se expresan como actividad específica. Los resultados mostrados son los promedios \pm DS de ensayos llevados a cabo por triplicado y representativos de dos experimentos independientes. Un alícuota de cada incubación también se analizó por la prueba de transferencia Western examinando con un anticuerpo anti-HA para asegurar igual carga de los cinasas de tipo natural y los del mutante de AMPK-relacionado (los cuales todos poseen un apéndice de HA).

Fig. 25. Análisis de la fosforilación y activación de los cinasas MARK. (A) El MARK3[D196A] catalíticamente inactivo (KI), que no puede autofosforilarse y los mutantes indicados, se incubaron con el complejo LKB1 durante 30 min. con Mg2+ - [\gamma32P]ATP y se separaron por electroforesis en un gel de poliacrilamida, el cual fue después auto-radiografiado. Las proteínas de MARK3 32P-marcado se digirieron con la tripsina y los péptidos 32P-marcados fueron cromatografiados en una columna de C18. Se muestran las fracciones que contienen el péptido del tríptico 32P-marcado del bucle-T (Péptidos PA y PB). (B) Los péptidos PA y PB se sometieron a la secuencia de fase sólida y la 32P-radioactividad fue medida después de cada ciclo de degradación de Edman. En combinación con el espectrómetro de masa MALDI TOF-TOF, esto posibilitó la identificación de los sitios fosforilados en cada péptido. Los péptidos PA comprenden el péptido de MARK3 bucle-T fosforilado a Tr211 y Ser215, y los péptidos PB el péptido de MARK3 bucle-T fosforilado a Tr211. (C a F) El tipo natural indicado (WT) o las formas mutantes de los cinasas MARK en los cuales el Tr o Ser del bucle-T fue mutado a Ala (T/A, S/A) o a Glu (T/E, S/E), se incubaron en la ausencia (-) o presencia (+) de LKB1 tipo natural: STRAD:MO25 en la presencia de Mg2+ y ATP. Después de 30 min., los cinasas de MARK se ensayaron usando el péptido AMARA, y los resultados se expresan como actividad específica. Un alícuota de cada incubación también se analizó por la prueba de transferencia Western sondeando con un anticuerpo anti-HA para asegurar igual carga de los cinasas de tipo natural y los del mutante de MARK (los cuales todos poseen un apéndice del epítope de HA). Los resultados mostrados son los promedios \pm DS de un ensayo triplicado y representativos de por lo menos dos experimentos independientes. (G) MARK4 fue fosforilado con el complejo LKB 1 como en A y el mayor péptido 32P-marcado se analizó por la secuencia fase sólida de Edman como en (B). En combinación con el espectrómetro de masa MALDI TOF-TOF (Fig. 30C), se demostró que este péptido comprende el bucle-T de MARK4 fosforilado sólo en el residuo de Tr.

Fig. 26. Identificación de los sustratos del péptido para LKB1. (A) Se realizó el análisis cinético de la fosforilación del bucle-T indicado para el complejo de LKB1:STRAD:MO25. El residuo de Tr del bucle-T en cada péptido se subraya y en caracteres en negrita y 3 residuos de Arg se agregaron al término C de cada péptido del bucle-T para habilitar su captura en el papel de fósforocelulosa p81. Los valores de Km y Vmax fueron determinados de la regresión no-lineal. (B) Un alícuota de cada péptido fosforilado por el complejo de LKB1 se sometió a la secuencia de la fase sólida de Edman y la 32P-radioactividad se midió después de cada ciclo de degradación de Edman. Una proporción pequeña de cada péptido puede acoplarse a la membrana de arilamina Sequelon a través de los residuos ácidos internos de Asp y Glu en lugar de su terminal-C del grupo carboxilo. Esto se considera por las pequeñas descargas aparentes de 32P-radioactividad que se observa en algunos residuos de Asp y Glu. (C) Las mismas combinaciones de LKB1 GST-apendizado tipo natural (WT, sendas 1-9), LKB1 catalíticamente inactivo (D194A, sendas 10-13), o GST solo (senda 14), STRAD\alpha o STRAD\beta Flag-apendizado, y MO25\alpha o MO25\beta myc-apendizado empleado en la Fig. 22, se probaron para su habilidad a fosforilar los péptidos indicados (concentración del péptido 200 \muM). Los resultados se expresan como la actividad del cinasa del péptido generada por mg de LKB1:STRAD:MO25 agregado al ensayo. Los resultados mostrados son los promedios \pm DS de 3 ensayos y son representativos de por lo menos dos experimentos independientes.

Fig. 27 Actividad de los cinasas AMPK-relacionado en LKB1+/+ y LKB1-/-MEFs. LKB1+/+ o LKB1-/-MEFs fueron dejados sin tratar (barras negras) o estimulados con 10 mM de fenformina (Fen, barras blancas) por 1 h. Los cinasas de AMPK\alpha1 y AMPK-relacionados fueron inmunoprecipitados desde la célula de los lisados, y se midió in vitro la actividad del cinasa hacia el péptido de AMARA según lo descrito en Materiales y Métodos (Ejemplo 4). Para confirmar igual expresión de los cinasas en cada muestra, los lisados celulares (AMPK\alpha1, NUAK2, MARK2/3 y MARK4) o las proteínas inmunoprecipitadas (QIK, QSK, SIK y MARK1) fueron sometidas a SDS-PAGE y al análisis de la prueba de transferencia Western. Todas las cinasas relacionadas con AMPK migraron con la masa molecular esperada. En el caso de AMPK\alpha1, los lisados celulares fueron inmunotransferidos con un anticuerpo de fósforoTr172 (P-AMPK), que reconoce el bucle-T fosforilado. Un control de los niveles de inmunotransferencia del LKB1 en la célula de los lisados también se incluye en el panel B. Los resultados mostrados son los promedios \pm DS de 2-4 ensayos y son representativos por lo menos de dos experimentos independientes.

Fig. 28. El ribosida de AICA no activa los cinasas del AMPK-relacionado. (A) LKB1+/+ MEFs fueron dejados sin tratar o estimulados con las concentraciones indicadas de fenformina (Fen) por 1 h. AMPK\alpha1/\alpha2 y LPKB1 fueron inmunoprecipitados desde la célula de los lisados, y se midió in vitro la actividad del cinasa hacia los péptidos AMARA y LKBtido respectivamente, según lo descrito en Materiales y Métodos (Ejemplo 4). (B) En cada muestra, los lisados celulares se sometieron a SDS-PAGE y al análisis de la prueba de transferencia Western con los anticuerpos indicados. El anticuerpo fósforo pT172 (P-AMPK) reconoce el bucle-T fosforilado de AMPK\alpha1. Los resultados mostrados son el promedio \pm DS para un ensayo triplicado y son representativos de dos experimentos independientes. (C) LKB1+/+ MEFs fueron dejados sin tratar (barras negras) o estimulados con 2 mM de ribosida de AICA (AICAR, barras blancas) por 1 h. Los cinasas de AMPK\alpha1 y los indicados de AMPK-relacionado fueron inmunoprecipitados desde la célula de los lisados, y se midió in vitro la actividad del cinasa hacia el péptido de AMARA según lo descrito en Materiales y Métodos. Los resultados se presentan como % relativo a la actividad observada en las células no-estimuladas, y son los promedios +SEM de dos experimentos independientes. El 100% corresponde a las actividades absolutas siguientes; AMPK\alpha1; 135 mU/mg, NUAK2; 0,25 mU/mg, QIK; 0,76 mU/mg, SIK; 2,73 mU/mg; MARK1; 0,14 mU/mg, MARK2/3; 3,5 mU/mg y MARK4; 1,6 mU/mg. (D) La inmunotransferencia de AMPK se realizó
como en A.

Fig. 29. Actividad de los cinasas AMPK-relacionado en las células de HeLa. La expresión de LKB1 carente (-) de las células de HeLa de control, o las células de HeLa que expresan establemente el tipo natural de LKB 1 (WT) o el cinasa inactivo de LKB 1 (KI), o fueron dejados sin tratar (barras negras) o estimulados con 10 mM de fenformina (Fen, barras blancas) por 1 h. Los cinasas de AMPK\alpha1 y AMPK-relacionado fueron inmunoprecipitados desde la célula de los lisados, y se midió in vitro la actividad del cinasa hacia el péptido de AMARA según lo descrito en Materiales y Métodos (Ejemplo 4). Para confirmar igual expresión de los cinasas en cada muestra, los lisados celulares (AMPK\alpha1, MARK2/3 y MARK4) o las proteínas inmunoprecipitadas (NUAK2, QIK, QSK, SIK y MARK1) fueron sometidas a SDS-PAGE y al análisis de inmunotransferencia Western. Todos los cinasas de AMPK-relacionado emigraron con la masa molecular esperada. En el caso de AMPK\alpha1, los lisados celulares fueron inmunotransferidos con un anticuerpo del pTr172 (PAMPK), que reconoce el bucle-T fosforilado. Los resultados mostrados son los promedios \pm DS de 2-4 ensayos y son representativos de al menos dos experimentos independientes.

Fig. 30. Análisis de la fosforilación de BRSK2, NUAK2 y MARK4 y MELK. (A) Los mutantes catalíticamente inactivos de BRSK2[D159A] y NUAK2[D193A], que son incapaces de autofosforilarse, se incubaron con el complejo LKB1 por 30 min. con Mg2+ - [\gammag32P]ATP y fueron separados por electroforesis en un gel de poliacrilamida que fue después auto radiografiado. Las proteínas 32P-marcadas se digirieron con tripsina y los péptidos resultantes fueron cromatografiados en una columna de C18. Los fragmentos que contienen los péptidos 32P-marcados mayores son marcados. (B) Los Péptidos P1, P2, y P3 se sometieron a secuenciación de fase sólida y la 32P-radioactividad se midió después de cada ciclo de degradación de Edman. Nosotros fuimos incapaces de determinar la identidad del péptido de NUAK2 indicada con "?". (C) Los péptidos indicados fueron analizados por espectrometría de masa MALDI TOF-TOF según lo descrito anteriormente. Se indican la secuencia del aminoácido deducido y el sitio de fosforilación, junto con la masa observada y teórica. El péptido marcado "MARK4" se derivó del fosforilado de MARK4 por LKB 1 según lo descrito en la leyenda para la Fig. 25G. Este péptido abarca el bucle-T del fosforilado de MARK4 sólo en el residuo de Tr. El péptido marcado "MELK" se deriva de un compendio del tríptico del MELK no marcado que se había expresado y se había purificado del E. coli según lo descrito anteriormente. Este péptido abarca el bucle-T del fosforilado de MELK en el residuo de Tr. Las abreviaturas: m, sulfota de metionina; (p) indica el residuo precedente de Tr que es fosforilado.

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Ejemplo 1 Las isoformas de MO25 actúan recíprocamente con las pseudocinasas de STRAD\alpha/\beta STE20-relacionado y refuerzan su habilidad para entrelazar, activar y localizar el LKB1 supresor del tumor en el citoplasma

Las mutaciones en la proteinocinasa del LKB 1 producen el Síndrome del Cáncer de Peutz Jeghers heredado. La investigación hasta la fecha ha indicado que el LKB 1 funciona como una proteína supresora del tumor, pero todavía se conoce poco sobre cómo el LKB1 es regulado. El reciente trabajo reveló que el LKB1 puede activarse a través de su interacción con el STE20-relacionado, la pseudocinasa catalíticamente inactivo denominado STRAD\alpha y que esta interacción se requirió por LKB1 para suprimir el crecimiento celular. En este Ejemplo nosotros hemos encontrado que el complejo de LKB1-STRAD\alpha endógeno inmunoprecipitado desde las células de varios mamíferos también está asociado con una proteína 40 kDa de función desconocida, conteniendo dominios funcionales no identificables, denominados MO25\alpha. Nosotros mostramos que MO25\alpha no liga directamente a LKB1 pero en cambio se asocia con LKB1 a través de su interacción con STRAD\alpha. MO25\alpha reconoce específicamente los últimos 3 residuos de STRAD\alpha (Trp-Glu-Phe) cuando la mutación o truncamiento de estos aminoácidos logra abolir la interacción de STRAD\alpha con MO25\alpha. Los estudios de localización celular indican que MO25\alpha y STRAD\alpha forman un complejo citoplasmático que fija a LKB1 en el citoplasma, excluyéndolo del núcleo. La cantidad de LKB1 asociado con STRAD\alpha en las células se incrementa notablemente por sobre expresión de MO25\alpha, sugiriendo que el MO25\alpha refuerza la formación del complejo LKB1-STRAD\alpha in vivo. Nosotros también establecemos que la asociación de LKB1 con STRAD\alpha y MO25\alpha estimula la actividad catalizadora de LKB1 casi en 10 veces. Es más, nosotros proporcionamos la evidencia de que la isoforma estrechamente relacionada de STRAD\alpha (también conocida como ILPIP o cinasa de PAP), que nosotros nombramos STRAD\beta, y las isoformas de MO25\beta también pueden estabilizar LKB1 en un complejo activo, y nosotros demostramos que es posible aislar los complejos heterotriméricos de LKB 1 ligados a STRAD y a las isoformas de M025, en los cuales las subunidades están presentes en cantidades equimolares. Nuestros resultados indican que el M025 puede funcionar como un componente del andamiaje del complejo LKB1-STRAD y puede jugar un papel crucial en regular la actividad de LKB1 y la localización celular mediados por su interacción con los pseudocinasas de STRAD.

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Resultados Identificación de MO25\alpha en un complejo de LKB1

Para identificar las proteínas asociadas con LKB1, hemos utilizado las células de HeLa previamente descritas, que expresan establemente niveles bajos de LKB1 del tipo natural o catalíticamente inactivo con un apéndice del epítope de Flag de Terminal-N para habilitar la inmuno purificación fácil de las proteínas LKB1-asociadas que emplean el anticuerpo de Flag (Boudeau et al., 2003a). Flag-LKB1 fue inmuno purificado desde un centenar de platos de 10 centímetros del lisado de la célula de HeLa derivado de las células que expresan el LKB1 tipo natural o el cisana inerte de LKB1, o del control parental de la línea celular de HeLa que no expresa LKB1 (vea Materiales y Métodos). Las preparaciones se sometieron a electroforesis en un gel de poliacrilamida, la cual se tiñó con azul coloidal (Fig. 1A). Una muestra de la preparación del cinasa inerte de LKB1 también se concentró más aun para habilitar la visualización de las proteínas menos abundantes. Se observaron varias bandas que estaban presentes en ambas preparaciones de LKB1, la del tipo natural y la del cinasa inerte, pero estaban ausentes en la muestra del control (Fig. 1A). Se estableció la identidad de las bandas coloreadas de azul coloidal marcadas en la Figura 1A, por los procedimientos que toman las huellas dactilares de la masa-espectral del péptido del tríptico (Fig. 1B), y se confirmó por inmunotransferencia con los anticuerpos apropiados (Fig. 1C). Fueron detectadas las proteínas previamente establecidas por estar asociadas con LKB1, incluyendo las proteínas acompañantes Hsp90 y Cdc37 (Boudeau et al., 2003a) y STRAD\alpha (Baas et al., 2003). Además, se identificó una proteína de \sim40 kDa como MO25\alpha coinmuno purificada con ambos LKB1, el tipo natural y el del cinasa inerte, pero no estaba presente en la purificación del control (Fig. 1A y 1C).

MO25\alpha se identificó primero como un gen expresado en la fase de la segmentación temprana de embriogénesis del ratón (Miyamoto et al., 1993) y fue mostrado por ser una proteína conservada muy evolutiva (Karos y Fischer, 1999; Nozaki et al., 1996) para que ninguna función celular se le haya atribuido. Del análisis de la base de datos, hemos identificado una isoforma estrechamente relacionada de MO25\alpha que nosotros denominamos MO25\beta, y una alineación de la secuencia de ambas isoformas de MO25 junto con sus homólogos putativos en Drosophila y C. elegans se muestra en la Figura 2A. El análisis de la prueba de transferencia Northern indicó que MO25\alpha es ampliamente expresado en los tejidos humanos, con los niveles más altos de expresión en el músculo del esqueleto (Fig. 2B). El análisis de inmunotransferencia usando un anticuerpo cultivado contra la proteína de MO25\alpha, la cual no reacciona en cruce con MO25\beta (Fig. 2C y D), y el análisis de la base de datos EST (Tabla 1) confirmó que MO25\alpha se expresa en muchos tejidos y líneas de la célula. Aunque nosotros fuimos incapaces de detectar niveles significantes de MO25\beta ARN por el análisis de la prueba de transferencia Northern, la inmunotransferencia que usa un anticuerpo cultivado contra la proteína de MO25\beta que no reacciona en cruce con MO25\alpha, sugirió que MO25b también se expresa en una variedad de tejidos y líneas de la célula probadas (Fig. 2D). Esto es consistente con la observación de que las secuencias de MO25\beta EST han sido identificadas de varios tejidos humanos (Tabla 1). Sin embargo, la expresión de MO25\beta puede restringirse más que MO25\alpha, ya que él no se detectó en el hígado y varias líneas de la célula incluso las células de HeLa (Fig. 2D), explicando quizás por qué él no se copurificó con el LKB1 expresado en estas
células (Fig. 1).

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TABLA 1 Origen del tejido de ESTs codificando MO25\alpha y MO25\beta humano

1

2

MO25\alpha endógeno está presente en el complejo con LKB1 endógeno. Nosotros luego inmuno precipitamos el LKB endógeno desde 293 células (Fig. 3A, panel izquierdo) o las células Rata-2 (Fig. 3A, panel derecho), seguido por la inmunotransferencia por LKB1, STRAD\alpha y MO25\alpha. Los experimentos mostraron que MO25\alpha, así como STRAD\alpha, fueron coinmuno precipitados con LKB1, pero no con el preinmune IgG. Nosotros también inmuno precipitamos MO25\alpha endógeno desde 293 células (Fig. 3B, panel izquierdo) o las células Rata-2 (Fig. 3B, panel derecho), e inmuno transferimos por la presencia de LKB1, STRAD\alpha y MO25\alpha (Fig. 3B). LKB1 endógeno y STRAD\alpha fueron coinmuno precipitados con MO25\alpha, pero no con el preinmune IgG, consistente con la noción de que estas proteínas forman un complejo.

MO25 actúa recíprocamente con STRAD en lugar de con LKB1

Para verificar qué componente del complejo LKB1-STRAD interactuó con MO25\alpha, nosotros cotransfectamos 293 células con estructuras que expresan MO25\alpha y cualquier Terminal-N de glutatión S-transferasa (GST) apéndice de LKB1, STRAD\alpha o el pseudocinasa de STRAD\beta estrechamente relacionado, así como Cdc37, un acompañante previamente mostrado para ligar LKB1 (Boudeau et al., 2003a). Una alineación de la secuencia de STRAD\alpha y STRAD\beta se muestra en la Figura 10 y a ambos les falta los mismos residuos conservados claves en el subdominio VI y VII en el dominio del cinasa que se requieren para la catálisis. Los GST-apéndices de las proteínas fueron por afinidad purificados e inmunotransferidos para M025\alpha (Fig. 4A). Nosotros encontramos que MO25\alpha sólo actúa recíprocamente con STRAD\alpha y STRAD\beta pero no con LKB 1 o Cdc37.

Nosotros luego expresamos LKB 1 en 293 células en la presencia o ausencia de STRAD\alpha, y la composición de la proteína de la afinidad purificada LKB 1 se analizó llevando a cabo la electroforesis y coloreado con el azul coloidal. Como era esperado, STRAD\alpha se copurificó con LKB1. Sin embargo, además, una banda débilmente coloreada que corresponde a un endógeno de la proteína de \sim40 kDa se observó en el complejo de LKB1-STRAD\alpha, el cual no estaba presente en la preparación de LKB1 no acomplejado. Las huellas dactilares espectrales de los péptidos trípticos revelaron que esta proteína correspondió a MO25\alpha endógeno. Esto fue confirmado por inmunotransferencia con un anticuerpo anti-MO25\alpha (Fig. 4B), sugiriendo además que el MO25\alpha está asociado con LKB1 a través de STRAD\alpha. En la Figura 4C, nosotros demostramos realizando cotransfecciones apropiadas, que es posible purificar un complejo heterotrimérico LKB 1 en el cual están presentes LKB1, STRAD\alpha y MO25\alpha en proporciones equimolares equivalentes. Nosotros también demostramos que es posible formar complejos similares de LKB1-STRAD\alpha-MO25\beta, LKB1-STRAD\beta-MO25\alpha y LKB1-STRAD\beta-MO25\beta (Fig. 4C), indicando que ambas isoformas de STRAD y MO25 pueden ligarse mutuamente, así como LKB1.

MO25\alpha coopera con STRAD\alpha para localizar LKB1 en el citoplasma

Las fracciones citoplasmáticas de LKB1 fue demostrado recientemente para dirigir una detención de la célula G1 (Tiainen et al., 2002). Por consiguiente, nosotros estábamos interesados en estudiar cómo la formación de un complejo de LKB1, STRAD\alpha y MO25\alpha afectaba la localización de estas proteínas. Las células de HeLa fueron transfectadas con las combinaciones de los apéndices de MO25\alpha, STRAD\alpha y LKB1 y estas proteínas se visualizaron en las células por la microscopía de fluorescencia con focal en la cual las proteínas de MO25\alpha, STRAD\alpha y LKB1 podrían detectarse independientemente en la misma célula. MO25\alpha (Fig. 5A) y STRAD\alpha (Fig. 5E) expresado solo fue localizado a lo largo del citoplasma y núcleo. Notablemente sin embargo, cuando se coexpresaron MO25\alpha y STRAD\alpha, ambas proteínas fueron re-localizadas en el citoplasma y se excluyeron del núcleo (Fig. 5G y 5H). Como se informó previamente en las células de COS, el LKB 1 expresado exclusivamente era principalmente nuclear (Fig. 5L) y la coexpresión con STRAD\alpha promovió la localización citoplasmática significante de LKB1, sin embargo niveles significantes de LKB 1 permanecían en el núcleo bajo estas condiciones (Fig. 5O) (Baas et al., 2003). No obstante, en la presencia de ambos, MO25\alpha y STRAD\alpha, LKB 1 estaba esencialmente localizado sólo en el citoplasma y virtualmente excluido del núcleo (Fig. 5R). Estas observaciones indican que MO25\alpha y STRAD\alpha forman un complejo que fija el LKB1 en el citoplasma más eficazmente que el STRAD\alpha exclusivamente.

MO25\alpha reconoce los últimos 3 residuos de STRAD\alpha

Para definir el sitio de enlace de MO25\alpha en STRAD\alpha, una serie de mutaciones de la deleción de STRAD\alpha se probó para su habilidad de actuar recíprocamente con MO25a en un ensayo de enlace por cotransfección. Notablemente, la deleción de sólo los últimos 3 aminoácidos de STRAD\alpha (Trp-Glu-Phe) abolió la liga de MO25\alpha a STRAD\alpha. Es más, mutación del Terminal-C del residuo de Trp a Phe, también redujo inmensamente la liga de MO25\alpha a STRAD\alpha (Fig. 6A). Nosotros probamos entonces si era posible por afinidad purificar que MO25\alpha expresado endógenamente desde los lisados celulares de 3 mamíferos diferentes empleando los péptidos biotinilados que abarcan los residuos del Terminal-C de STRAD\alpha conjugados al estreptavidina-Sefarosa. Nosotros encontramos que un péptido que abarca el Terminal-C de 12 residuos (Fig. 6B) pero no los últimos 6 residuos (datos no mostrados y Fig. 6C) de STRAD\alpha eficazmente purificó MO25\alpha endógeno desde todos los lisados celulares probados (Fig. 6B). Además para delinear el sitio de enlace de MO25\alpha en el péptido de STRAD\alpha, nosotros realizamos un examen de alanina examina, mutando cada residuo del péptido individualmente a Ala y verificando cómo esto afectó la liga a MO25\alpha (Fig. 6B). Consistente con los residuos de Trp-Glu-Phe que se requieren para el reconocimiento de MO25\alpha, la mutación de cualquiera de estos 3 residuos en el péptido de STRAD\alpha de terminal-C abolió o redujo inmensamente la liga de MO25\alpha en 3 lisados celulares diferentes, mientras que la mutación de los otros residuos o no afectó el enlace o sólo tuvo un efecto moderado. Estos resultados también fueron confirmados en ensayo más cuantitativo del enlace de Biacore por una resonancia de plasmón de superficie (Fig. 6C).

La liga de LKB1 a STRAD\alpha crea el nuevo sitio(s) de enlace para MO25\alpha

Nosotros después investigamos cómo la liga de LKB1 a STRAD\alpha afectó la interacción con MO25\alpha usando una coexpresión del ensayo de enlace en 293 células en las cuales la longitud completa llena del tipo natural y los mutantes de la deleción de GST-STRAD\alpha se coexpresaron en la presencia o ausencia de MO25a y LKB1. Consistente con los resultados anteriores, los mutantes de STRAD\alpha que les faltaba o el terminal-C 12 o 48 residuos no ligaron MO25\alpha en la ausencia de LKB1 (Fig. 7, panel 1). Notablemente sin embargo, cuando estos mutantes de STRAD\alpha fueron coexpresados con LKB1, MO25\alpha se recuperó en los complejos purificados (Fig. 7, panel 2), indicando que la liga de LKB1 a STRAD\alpha genera el sitio(s) de enlace adicional para MO25\alpha dentro del complejo de LKB1-STRAD\alpha. Nosotros notamos también de forma consistente que la cantidad de LKB1 recuperado en el tirón de GST-STRAD\alpha baja fue significativamente superior en la presencia de MO25\alpha (Fig. 7, compare paneles 2 y 3), sugiriendo que MO25\alpha podría estabilizar la formación de un complejo heterotrimérico LKB 1. Es más, un fragmento catalizador de LKB1 que abarca sólo el dominio del cinasa (residuos 44-343) actuó recíprocamente mucho más eficazmente con STRAD\alpha en la presencia de MO25\alpha (Fig. 7, compare paneles 4 y 5). Estas observaciones indican que MO25\alpha podría ser el estabilizador del complejo de LKB1-STRAD\alpha generando sitio(s) de enlace adicional de MO25\alpha en STRAD\alpha y/o LKB1. Sin embargo, un mutante de STRAD\alpha que le falta el terminal-C de 88 residuos que truncan una región del dominio del pseudocinasa, fue incapaz de interactuar con LKB 1 o MO25a cuando estas proteínas fueron coexpresadas (Fig. 7). Esto sugirió que o un sitio de enlace secundario de MO25a secundario se localiza hacia el término C de STRAD\alpha o que la integridad del dominio del pseudocinasa, la cual podría romperse por el truncamiento de los 88 residuos de terminal-C de STRAD\alpha, se requiere para habilitar la formación del complejo heterotrimérico de LKB1-STRAD\alpha-MO25\alpha.

Evidencia adicional de que MO25 estabiliza el complejo de LKB1-STRAD

Para obtener evidencia adicional de que M025a pudiera estabilizar la ligazón de LKB1 a STRAD\alpha, 293 células fueron cotransfectadas con estructuras que expresan LKB 1 y STRAD\alpha en la ausencia o presencia de cantidades crecientes la estructura de ADN del MO25\alpha. LKB 1 fue purificado y los niveles de STRAD\alpha asociado y MO25\alpha fueron medidos por inmunotransferencia. Como un control, los niveles de expresión de LKB1, STRAD\alpha y MO25\alpha también fueron medidos en la célula de los lisados previo a la purificación por afinidad de LKB1. En la ausencia de MO25\alpha, una cantidad moderada de STRAD\alpha fue asociada con LKB1, la cual se reforzó notablemente por el incremento de la expresión de MO25\alpha en una manera dependiente de la dosis (Fig. 8A, panel superior). La asociación incrementada de STRAD\alpha con LKB 1 no fue debido a la expresión incrementada de LKB 1 o STRAD\alpha ya que éstos se expresaron en los lisados celulares a niveles similares en la ausencia o presencia de cantidades crecientes de MO25\alpha (Fig. 8A, panel inferior). MO25\beta pudo similarmente reforzar la interacción entre LKB 1 y STRAD\alpha (Figura 8B). Nosotros también investigamos cómo MO25\alpha y MO25b estabilizaron la ligazón de LKB1 a STRAD\beta (Fig. 11). Ninguna asociación perceptible de STRAD\beta a LKB 1 se observó en la ausencia de M025, cuando por el contrario la coexpresión de MO25\alpha o STRAD\beta resultaba en una dosis dependiente del aumento en STRAD\beta ligando a LKB1. Sin embargo, en contraste con STRAD\alpha, los niveles la expresión de STRAD\beta en 293 células fueron bajos en la ausencia de isoformas de M025 y significativamente incrementaron en su presencia, lo cual podría explicar la ligazón incrementada de LKB1 a STRAD\beta en la presencia de isoformas de MO25 (Fig. 2 Suplementario). Se obtuvieron resultados similares cuando STRAD\beta se expresó como una proteína de fusión-GST desde un vector de expresión distinto (datos no mostrados).

Estabilización del complejo de LKB1-STRAD por las isoformas de MO25 correlaciona con la actividad incrementada

Para determinar cómo la ligazón de MO25\alpha y MO25\beta al complejo de LKB1-STRAD\alpha o LKB1-STRAD\beta afectó la actividad de LKB1, 293 células fueron transfectadas con el tipo natural GST-LKB1 en la presencia o ausencia de isoformas de STRAD y/o M025. La actividad de cantidades iguales de GST-LKB1 purificado por afinidad se evaluó midiendo la actividad de la auto fosforilación así como la transfosforilación de la proteína básica de la mielina (MBP), un sustrato exógeno no-específico de LKB1, en la presencia de [\gamma-32P]ATP. Nosotros también supervisamos la fosforilación de MBP usando un anticuerpo fósforo específico que reconoce el sitio de mayor fosforilación de LKB1 en MBP (Tr65) (Baas et al., 2003). Los ensayos de actividad diferente de LKB1 dieron resultados comparables (Fig. 9). En la ausencia de isoformas de STRAD, LKB 1 fue pobremente activo (Fig. 9, senda 1) y, como se mostró previamente (Baas et al., 2003), la coexpresión con STRAD\alpha indujo un aumento de \sim4 veces en la actividad de LKB 1 (Fig. 9, senda 2). En la presencia de STRAD\alpha y MO25\alpha o MO25\beta, la actividad de LKB1 se aumentó \sim unas 2 veces adicional para que LKB1 se volviera \sim9 veces más activo que LKB1 expresado exclusivamente (Fig. 9, sendas 6 ó 7). LKB1 sólo se activó por STRAD\beta en la presencia de isoformas de M025 (Fig. 9, compare sendas 3 con sendas 8 y 9), consistente con la observación de que LKB1 está escasamente asociado con STRAD\beta en la ausencia de MO25 (Fig. 11). LKB 1 se mostró previamente para fosforilar STRAD\alpha (Baas et al., 2003), y nosotros mostramos que el aumento de M025-mediado en la asociación de STRAD\alpha a LKB1 resulta en la fosforilación incrementada de STRAD\alpha (Fig. 9, compare sendas 2 con 6 y 7). En contraste para STRAD\alpha, STRAD\beta no fueron significativamente fosforilados por LKB1 en la presencia de M025 (Fig. 9, sendas 8 y 9). LKB1 fosforila de STRAD\alpha a Tr329 y Tr419 (Baas et al., 2003), sitios que no se conservan en STRAD\beta (Fig. 10). Esto explica por qué STRAD\beta no es fosforilado por LKB1. Nosotros también mostramos que el LKB1 inactivo catalíticamente puede asociarse con ambas isoformas de STRAD en la presencia de cualquier isoforma de M025. Sin embargo, como era esperado, éste es incapaz de autofosforilarse o fosforilar STRAD\alpha o MBP (Fig. 9, sendas 10-13).

Discusión

Uno de los resultados mayores de este estudio es el descubrimiento de que la proteína de MO25\alpha muy conservada se encontró en muchas especies del eucariota a la cual ninguna función se había atribuido previamente, está presente en un complejo con STRAD\alpha y LKB1 en vivo. Interesantemente, en la ausencia de LKB1, MO25\alpha reconoce específicamente los últimos 3 aminoácidos de STRAD\alpha que están en una secuencia de Trp-Glu-Phe, y la mutación de cualquiera de estos 3 residuos a Ala previno esencialmente la ligazón de MO25\alpha a STRAD\alpha. En este aspecto, MO2S\alpha funciona semejantemente a un PDZ del dominio que también reconoce el terminal-C extremo de los residuos de su proteína que liga los acompañantes (Songyang et al., 1997). Sin embargo, no hay ninguna homología entre el PDZ del dominio y MO25\alpha y, por nuestro conocimiento, otros dominios caracterizados de esta manera remotamente no poseen esta propiedad. El terminal-C del dominio del no-pseudocinasa \sim50 residuos de STRAD\alpha y STRAD\beta se conservan pobremente pero, significativamente, ambos terminan con la secuencia de Trp-Glu-Phe (Fig. 10), acentuando que STRAD\alpha y STRAD\beta probablemente han evolucionado para interactuar especialmente con las isoformas de MO25. Las proteínas más estrechamente relacionadas a STRAD\alpha y STRAD\beta son los cinasas del miembro activo de STE20 denominados SPAK (Johnston et al., 2000) y OSR1 (Tamari et al., 1999), que poseen todos los residuos requeridos para la catálisis de la proteinocinasa (Fig. 10) y son por consiguiente enzimas activas. Aunque ni SPAK ni OSR1 terminan en una secuencia de Trp-Glu-Phe, ambos poseen una secuencia de Phe-Glu-Phe en una región similar de su dominio no-catalizador del terminal-C (Fig. 10). Esta observación nos incitó a deformar el terminal-C de la secuencia de Trp-Glu-Phe de STRAD\alpha a Phe-Glu-Phe y nosotros encontramos que esto le impidió a MO25a ligar a STRAD\alpha (Fig. 6A). Esto enfatiza aun más que la presencia de un residuo de Trp de tres residuos del final de la proteína es esencial para la ligazón de STRAD\alpha a MO25\alpha, sugiriendo que MO25\alpha no actuará recíprocamente con SPAK u OSR1.

Nuestros datos indican que uno de los papeles importantes de MO25\alpha es estabilizar la interacción entre LKB1 y STRAD\alpha. Esto está basado en la observación de que la cantidad de STRAD\alpha asociado con LKB1 en las células se refuerza significativamente por la expresión de MO25\alpha (Fig. 8). El hallazgo de que STRAD\alpha carente del terminal-C de los residuos de Trp-Glu-Phe puede formar un complejo con MO25\alpha en la presencia de LKB1 (Fig. 7) indica que la interacción de LKB1 con STRAD\alpha genera nuevo sitio(s) de enlace para MO25\alpha, lo cual podría explicar cómo MO25\alpha estabiliza la asociación de LKB1 con STRAD\alpha. Nuestros resultados no nos permiten diferenciar si los sitio(s) de enlace adicional de MO25\alpha se localizan dentro de STRAD\alpha y/o LKB1. Se requerirán estudios estructurales detallados de este complejo dirigido a este problema. Nuestras observaciones son consistentes con la noción de que MO25\alpha o MO25\beta pueden funcionar como un componente del andamiaje del complejo de LKB1-STRAD.

Se ha mostrado previamente que la coexpresión de STRAD\alpha con LKB1 reforzó LKB1 en la actividad in vitro (Baas et al., 2003) y aquí nosotros demostramos que la asociación de LKB1-STRAD con las isoformas de MO25 reforzó además la actividad de LKB1 en dos veces (Fig. 9). Estos resultados indican que la estabilización del complejo de LKB1-STRAD\alpha por MO25 está acompañada por la activación de LKB1. Pretenciosamente, sin embargo, debe notarse que el complejo de LKB1 y STRAD\alpha purificado desde 293 células del mamífero sobre-expresando los LKB1 y STRAD\alpha apendizados también está asociado con los niveles significantes de MO25\alpha endógeno (Fig. 4B). No es por consiguiente posible medir la actividad del complejo de LKB1-STRAD\alpha en la ausencia de MO25\alpha por la expresión de estas proteínas en las células del mamífero. Por tanto no podemos cuantificar cómo la asociación de STRAD\alpha con LKB 1 en la ausencia total de MO25\alpha afecta la actividad de LKB1. Para superar el problema de la asociación de STRAD\alpha sobre expresado con MO25\alpha endógeno en las células del mamífero, nosotros hemos intentado combinar E. coli expresado de LKB1, STRAD\alpha, y MO25\alpha para ver si nosotros pudiéramos formar un complejo en el cual LKB1 podría activarse. Sin embargo, este acercamiento fue infructuoso (datos de JB no mostrados), lo que indica que la asociación de LKB1 con STRAD\alpha y MO25\alpha es un proceso complicado que puede requerir factores adicionales y/o que este complejo puede necesitar ser congregado en vivo. Nosotros fuimos capaces de aislar desde las células del mamífero un complejo heterotrimérico en el cual están presentes LKB1, STRAD y subunidades de M025 en una estequiometría similar (Fig. 4C), haciéndonos pensar en una afinidad relativamente alta de las subunidades individuales para nosotros.

Nosotros también demostramos que MO25\alpha y STRAD\alpha, cuando se expresaron exclusivamente en las células, están ambos localizados en el citoplasma y el núcleo, pero ellos sólo se localizan en el citoplasma y se excluyeron del núcleo cuando se expresan juntos (Fig. 5). El mecanismo molecular que está detrás de esta observación no se ha investigado. Es posible que la interacción de MO25\alpha y STRAD\alpha lleva al enmascaramiento de una señal de localización nuclear, exposición de una nueva señal de exportación nuclear o citoplasmática fijados al motivo, o que el complejo de STRAD\alpha-MO25\alpha es tan grande para libremente translocarse en el núcleo. Bajo las condiciones nosotros hemos realizado nuestros estudios de localización en las células de HeLa, nosotros encontramos que MO25\alpha significativamente coopera con STRAD\alpha para localizar LKB1 en el citoplasma de las células, excluyéndolo del núcleo, puesto que la exclusión nuclear y localización citoplasmática de LKB1 observados siguiendo la expresión de LKB 1 y STRAD\alpha fue notablemente reforzada en la presencia de MO25\alpha (Fig. 5). Los estudios anteriores en las células de COS también mostraron que STRADa podía localizar LKB1 en el citoplasma de las células (Baas et al., 2003). Sin embargo, como nuestros datos indican que niveles significantes de MO25\alpha endógeno ligará al complejo de LKB1-STRAD\alpha (Fig. 4B), no es posible gobernar fuera que las isoformas de MO25 endógeno puedan contribuir a la localización citoplasmática del LKB1 cuando es cotransfectado con STRAD\alpha. La localización citoplasmática de LKB 1 puede ser importante, cuando los mutantes de LKB 1 que no pueden entrar en el núcleo todavía suprimen el crecimiento celular (Tiainen et al., 2002). También pueden existir mecanismos adicionales para mantener LKB1 en el citoplasma celular. Se ha demostrado que la interacción de LKB 1 con la proteína de LIP 1 induce la localización citoplasmática de LKB (Smith et al., 2001). Tiene que ser probado todavía si LIP1 puede actuar recíprocamente con el complejo heterotrimérico de LKB1-STRAD-MO25, pero no se ha reportado que LIP1 influya sobre la actividad de LKB1. LKB1 también está prenilatado en su término C (Collins et al., 2000; Sapkota et al., 2001), lo cual podría promover las interacciones con las membranas celulares. El reciente trabajo ha indicado que la prenilación del homólogo de LKB1 de Drosophila es importante
para la asociación de LKB 1 con las membranas en controlar la polaridad celular (Martin y St Johnston, 2003).

No sólo se encuentran los homólogos de M025 putativos en los mamíferos, sino Drosophila y C. elegans también se encontraron en la fisión de la levadura (número de acceso NCBI NP_594685, 51% de identidad para MO25\alpha humano), gemación de la levadura (HYM1, número de acceso NCBI P32464, 33% de identidad para MO25\alpha humano) y planta (número de acceso NCBI Q9M0M4, 43% de identidad para MO25\alpha humano). Hasta nuestro conocimiento sólo el homólogo de M025 de la gemación de la levadura putativa nombrado HYM1, se ha investigado y al parecer juega un papel importante en regular el crecimiento celular polarizado y la separación de la célula (Bidlingmaier et al., 2001; Dorland et al., 2000; Jorgensen et al., 2002). Hasta nuestro conocimiento, no se han reportado homólogos de LKB 1 y STRAD en la levadura y por lo tanto no está claro si pudiera haber un eslabón entre LKB1 que regula la polaridad en el C. elegans y Drosophila (Martin y St Johnston, 2003; Watts et al., 2000) y HYM1 que regula la polaridad celular en la levadura.

También es posible que M025 pudiera tener funciones que son independientes de su habilidad para regular LKB1. M025 podría actuar recíprocamente con otras proteínas que terminan en un motivo similar a STRAD\alpha/STRAD\beta y hay sobre 20 proteínas humanas que terminan en un motivo de Trp-Glu/Asp-Phe. Puede ser interesante investigar si cualquiera de éstos liga las isoformas de M025. También es probable que STRAD\alpha y STRAD\beta tengan otras funciones que no sean la de regular LKB1. En este sentido, trabajo reciente ha demostrado que la sobre expresión de STRAD\beta en 293 células las protegió contra el apoptosis por el reforzamiento de la habilidad de la senda de JNK a ser activada por la sobre expresión de XIAP, un componente a contracorriente de la senda de JNK (Sanna et al., 2002). Es más, en otro estudio, se reportó que la sobre expresión de STRAD\beta conduce a la activación de los cinasas de JNK y p38\gammaMAP (Nishigaki et al., 2003). El mecanismo por el cual STRAD\beta reforzó la activación de JNK/p38\gamma no se definió en estos estudios y sería de interés probar si LKB1 y/o M025 está envuelto en estos procesos.

Un número significante de formas heredadas de PJS encontrado en ciertas familias no exhibe las mutaciones en los genes de LKB1 (Buchet-Poyau et al., 2002), indicando que hay un segundo lugar causativo para PJS. El análisis genético hasta la fecha ha excluido LIP1 y no proporcionó evidencia de que otras proteínas reportadas para actuar recíprocamente con LKB 1 sean deformadas en estos pacientes (Buchet-Poyau et al., 2002; Resta et al., 2002). Los resultados en este estudio indican que valdría la pena verificar si las mutaciones en los genes que ponen en código STRAD o las isoformas de MO25 ocurren en cualquiera de las familias de PJS que no tienen mutaciones en el gen de LKB 1.

En conclusión nosotros definimos M025 como un nuevo componente del complejo LKB1 en vivo. Nuestros resultados indican que las isoformas de M025 funcionan para estabilizar la interacción de LKB 1 con las isoformas del pseudocinasa de STRAD catalíticamente inactivo. Esto refuerza notablemente la actividad de LKB1 y su localización citoplasmática. En los estudios futuros para definir además las funciones fisiológicas de los homólogos de M025 y de STRAD en regular la función de LKB1, también sería importante generar ratones carentes de estos genes. La habilidad de expresar formas más activas de complejos heterotriméricos de LKB 1 abre también la oportunidad de emplear los acercamientos bioquímicos para buscar nuevos sustratos de LKB1.

Materiales. Se obtuvieron tabletas del cocktail de inhibidor de proteasa desde Roche. El pimelimidato de dimetilo y el gel de afinidad a anti-Flag M2-agarosa se compró desde Sigma. El suero bovino fetal de tetraciclina -libre (FBS) fue desde Perbio, y otros reactivos de cultivo de tejido fueron desde Biowhittaker a menos que se declaró en otro caso. Los geles premoldeados SDS/4-12% y 10% de poliacrilamida Bis-Tris y la proteína básica de la mielina (MBP) se obtuvieron desde Invitrogen. Los slip sensores SA fueron desde BiaCore AB (Stevenage, Reino Unido). [\gamma-32P]ATP, Glutatión-Sefarosa, Proteína G-Sefarosa, y Estreptavidina-Sefarosa de alta acción se compraron desde Amersham Biosciences.

Péptidos. Los péptidos biotinilados de STRAD\alpha-C12 (Biotin-C6spacer-NLEELEVDDWEF), y STRAD\alpha-C6 (Biotin -C6spacer-VDDWEF) cuyas secuencias abarcan el último 12, y 6 residuos de STRAD\alpha respectivamente, el péptido de Flag (DYKDDDDK), y los péptidos usados para cultivar los anticuerpos fueron sintetizados por Dr G. Bloomberg (Universidad de Bristol, Reino Unido). Los péptidos biotinilados que abarcan los últimos 12 residuos de STRAD\alpha en los cuales cada residuo fue reemplazado individualmente por una Alanina, se sintetizaron usando la metodología previamente descrita (Lizcano et al., 2002).

Anticuerpos. El anticuerpo de LKB1 usado para la inmunotransferencia se cultivó contra la proteína de LKB1 del ratón según lo descrito previamente (Sapkota et al., 2001). Como este anticuerpo no precipita eficazmente la proteína de LKB1 humano, nosotros cultivamos un anticuerpo en la oveja contra la proteína de LKB1 humana expresada como una proteína de fusión GST en el E. coli que eficazmente inmuno precipitó LKB 1 humano y de la rata. Este anticuerpo se usó para todos los experimentos de inmunoprecipitación en este estudio. Se cultivaron los anticuerpos anti-MO25\alpha y anti-MO25\beta en la oveja contra las proteínas del MO25\alpha y MO25\beta humanas expresado en el E. coli según lo descrito debajo. Se purificaron por afinidad los anticuerpos de LKB1 y M025 en el CH-Sefarosa acoplado covalentemente al antígeno de la proteína usado para cultivar el anticuerpo. El anticuerpo monoclonal que reconoce la proteína de STRAD\alpha se ha descrito previamente (Baas et al., 2003). El anticuerpo fósforo-específico que reconoce el fosforilado de MBP a Tr65 (T65-P) se cultivó en la oveja contra el péptido GHHAARTTHYGSLPQ que corresponde a los residuos 58-72 de bovino MBP en el cual el residuo subrayado es fósforotreonina. El anticuerpo se purificó por afinidad en CH-Sefarosa acoplado covalentemente al péptido fosforilado y después pasado a través de una columna de CH-Sefarosa acoplado al péptido no-fosforilado. El anticuerpo que no ligó en la última columna fue seleccionado. Los anticuerpos monoclonales que reconocen los apéndices de GST y del epítope de Flag se obtuvieron desde Sigma, el anticuerpo monoclonal que reconoce el apéndice del epítope de Myc, se compró desde Roche, y los anticuerpos secundarios acoplados a la peroxidasa del rábano picante usado para la inmunotransferencia se obtuvieron por Pierce. El IgG preinmune usado en los experimentos de inmunoprecipitación de control se obtuvo del suero preinmune que emplea la proteína G-Sefarosa.

Métodos generales y tampones. La restricción de la enzima que digiere, las ligaduras de ADN, y otros procedimientos de ADN recombinante se realizaron usando los protocolos estándares. Se purificaron las estructuras de ADN usadas para la transfección desde E. coli de DH5\alpha usando el plásmido de Qiagen del equipo Mega según el protocolo del fabricante. Todas las estructuras de ADN se verificaron por el secuencial de ADN, el cual se realizó por el Servicio de Secuencial, Escuela de Ciencias Naturales, Universidad de Dundee, Escocia, Reino Unido, usando DYEnamic ET terminador de química (Amersham Biosciences) en Applied Biosystems automated ADN sequencers. automatizados. El tampón de lisis contuvo 50 mM de Tris/HCl pH 7.5, 1 mM de EGTA, 1 mM de EDTA, 1% (p/v) de Tritón-X 100, 1 mM de ortovanadato de sodio, 50 mM de fluoruro de sodio, 5 mM de pirofosfato de sodio, 0.27 M de sacarosa, 0.1% (v/v) de 2-mercaptoetanol y el cocktail del inhibidor de proteínasa "completo" (una tableta/50 ml). el tampón A contuvo 50 mM de Tris/HCl pH 7.5, 0.1 mM de EGTA, y 0.1% (v/v) de 2-mercaptoetanol. El tampón de muestra SDS contuvo 50 mM de Tris/HCl pH 6.8, 2% (p/v) de SDS, 10% (v/v) de glicerol, 0.005% (p/v) de bromofenol azul, y 1% (v/v) de 2-mercaptoetanol.

Estructuras de ADN. Se han descrito previamente las estructuras que expresan la longitud completa del LKB1 del tipo natural y del cinasa inerte del LKB1 del ratón (Sapkota et al., 2002a; Sapkota et al., 2002b; Sapkota et al., 2001). Para generar el terminal-N del Myc apendizado del MO25\alpha cADN, un PCR se realizó con los cebadores: 5'-ggatccgc
caccatggagcagaagctgatctctgaagaggacttgccgttcccgtttgggaagtctcacaaa t-3' y 5'-ggatccttaagcttcttgctgagctggtctcttc-3' que usan un Consorcio del clon de IMAGEN EST (IMAGEN clon 4822388, NCBI Acc. BG719459) como una plantilla. El producto resultante PCR fue ligado dentro del vector intermedio de iniciación pCR2.1-TOPO (Invitrogen), y subclonado como un fragmento BamH1-BamH1 dentro de los vectores pEBG-2T (Sánchez et al., 1994), pCMV5 (Anderson et al., 1989) y pGEX-6T (Amersham). Para generar el terminal-N de Myc-apendizado del MO25\beta cADN, un PCR se realizó con los cebadores

5'-caccggatccgccaccatggagcagaagctgatctctgaagaggacttgcctttgtttagtaaatcacacaa aatcc-3' y 5'-ggatcctcaag-gggccgtt
ttcttcaagtctcgg-3' que usan un clon del Consorcio de la IMAGEN EST (IMAGEN 1958217, NCBI Acc. AI252223) como una plantilla. El producto resultante PCR fue ligado dentro del vector intermedio de iniciación pENTR/D-TOPO (Invitrogen), y convertido en los vectores de Iniciación de la expresión de pEBG-2T, pCMV5 y pGEX-6T modificados. Debe notarse que el clon de la IMAGEN del MO25\beta humano que nosotros obtuvimos pone en código para un Ala en lugar de un Val en la posición 153, comparada a la secuencia sometida, (NCBI asentimiento número Q9H9S4). El análisis secuencial de la secuencia del nucleótido de varias secuencias independientes de MO25\beta listadas en la Tabla 1, indicó que todos éstos poseen un Ala en la posición 153. La expresión de las estructuras para Flag-apendizado STRAD\alpha fueron PCR amplificado con los cebadores 5'-gatccgccaccatggactacaaggacgacgatgacaagtcatttcttgtaagtaaaccagagcgaatc-3' y 5'-ggatcctcagaactcccaatcgtccacctccagct-3 que usan un STRAD\alpha cADN humano como una plantilla (Baas et al., 2003). El producto PCR se ligó dentro del vector de pCR2.1-TOPO y fue subclonado como un fragmento de BamH1-Not1 dentro de pEBG-2T o como una inserción de BamH1-Xba1 dentro de pCMV5.

Para duplicar STRAD\beta, dos clones de IMAGEN EST (5301936 y 5501540), los cuales juntos abarcan la secuencia que codifica entera se usó como las plantillas para generar longitud completa Flag-apendizado del STRAD\beta cADN por PCR usando los cebadores 5'-ggatccgccaccatggactacaaggacgacgatgacaagtctcttttggattgcttctgcacttcaag-3' y 5'-ggatccc
tagaattcccagtatgagtctttttcatc-3'. El producto PCR se ligó dentro del vector de pCR2.1-TOPO y fue subclonado como un fragmento BamH1-BamH1 dentro de los vectores pEBG-2T y pCMV5. El fragmento catalizador del LKB1 del ratón (residuos 44-343) que posee un terminal-N del apéndice del epítope de Flag fue PCR amplificado desde el cADN de LKB1 de un ratón (Sapkota et al., 2001) usando los cebadores: 5'-actagtgccaccatggactacaaggacgacgatgacaagaagctcatcggcaagtacctgatgggg-3' y 5'-actagttcagtcctccaggtagggcactacagtcat-3' y fue subclonado dentro del vector del pCMV5 como un fragmento de SpeI-SpeI. La codificación de la estructura para la expresión de GFP apendizada al LKB1 humano sin otro apéndice del epítope fue descrita previamente (Boudeau et al., 2003b). La mutagénesis dirigida al sitio se realizó empleando procedimientos estandarizados que usan el equipo de mutagénesis de Quickchange (Stratagene). Las mutaciones de la deleción fueron generadas introduciendo los codones STOP en las posiciones indicadas.

Condiciones del cultivo celular y lisis celular. La generación de células de HeLa que expresan establemente el LKB 1 tipo natural o el cinasa inerte de LKB 1 se ha descrito previamente (Sapkota et al., 2002b). Las células fueron cultivadas en el Minimum Essential Médium Eagle complementado con 10% (v/v) de tetraciclina-libre de FBS, en la presencia de 1 X solución del aminoácido no-esencial, 1 X solución de Penicilina/Estreptomicina (Invitrogen), 100 \mug/ml de zeocina y 5 \mug/ml de blasticidina (Invitrogen). El riñón humano embrionario (HEK) 293, las células fibroblasto embrionario de Rata-2, y las células de HeLa se mantuvieron en el medio Eagle modificado de Dulbecco complementado con 10% (v/v) de FBS. Para todos los experimentos, las células fueron cultivadas en un plato de 10-centímetros de diámetro y lisadas en 0.5 a 1 ml del Tampón de Lisis congelado. Los lisados fueron clarificados por centrifugación a 4ºC durante 10 min. en 14.000 g.

Inmunotransferencia. Se sometieron las cantidades de proteínas indicadas en las leyendas de la figura a electroforesis SDS-gel de poliacrilamida y fueron transferidas a la nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon durante 1 hora en 50 mM de Tris/HCl (pH 7.5), 0.15 M de NaCl, 0.5% (v/v) de Tween que contiene 10% (p/v) de polvo de leche desnatada por 1 h. Las membranas se incubaron entonces en el mismo tampón que contiene 1 \mug/ml de anticuerpo (anticuerpos de LKB1, MO25\alpha y MO25\beta) ó 0.1 \mug/ml (anticuerpo de STRAD\alpha) por 8 h a 4ºC. La inmunotransferencia con el anticuerpo T65-P se llevó a cabo como se describió anteriormente, excepto que el péptido no-fosforilado que corresponde al antígeno usado para cultivar el anticuerpo, se incluyó en una concentración de 10 \mug/ml. La inmunotransferencia con los anticuerpos GST, Flag, y Myc se llevó a cabo como anteriormente con 0.5 \mug/ml de anticuerpo excepto que el polvo de leche desnatada se reemplazó con 5% (w/v) de BSA. La detección se realizó usando los anticuerpos secundarios apropiados del peroxidasa-conjugado del rábano picante y el reactivo de quimioluminiscencia reforzado (Amersham Pharmacia Biotech).

Inmunoprecipitación de LKB1 endógeno y de MO25\alpha. Los anticuerpos de LKB1 y de MO25\alpha fueron covalentemente acoplados a la proteína G-Sefarosa en una proporción de 1 mg de anticuerpo a 1 ml de resina usando un procedimiento de enlace cruzado del pimelimidato de dimetilo (Harlow y Lane, 1988). Los lisados clarificados de 293 y Rata-2 células, generados como se describió anteriormente excepto que se omitió el 2-mercaptoetanol del tampón del lisis, conteniendo 2 mg de proteína de la célula total, se incubaron a 4ºC por 1 h en una plataforma vibrante con 10 \mul de LKB1-proteína G-Sefarosa conjugada ó 15 \mul del MO25\alpha-proteína G-Sefarosa conjugada. Los inmunoprecipitados se lavaron dos veces con 1 ml del Tampón de Lisis (no conteniendo 2-mercaptoetanol) conteniendo 150 mM de NaCl y dos veces con 1 ml del Tampón A (no conteniendo 2-mercaptoetanol). Las cuentas fueron luego resuspendidas en un volumen de 20 \mul del Tampón A al cual se adicionó 5 \mul del tampón de muestra SDS carente de 2-mercaptoetanol. Las muestras se sometieron a electroforesis y después fueron inmunotransferidas para LKB 1, STRAD\alpha y MO25\alpha como se describió anteriormente.

Expresión de proteínas de fusión-GST en 293 células y purificación por afinidad. Los platos de 10-centímetros de diámetro de 293 células fueron temporalmente transfectados con 3 a 10 \mug de las estructuras del pEBG-2T usando un método de fosfato de calcio modificado (Alessi et al., 1996). 36 h post-transfección, las células fueron lisadas y los lisados clarificados se incubaron por 1 h en una plataforma giratoria con el glutatión-Sefarosa (25 \mul/plato de lisado) previamente equilibrado en el Tampón del lisis. Las cuentas se lavaron 4 veces con Tampón del lisis que contiene 150 mM de NaCl y dos veces con el Tampón A. Para el análisis de inmunotransferencia, las cuentas fueron entonces resuspendidas en el Tampón de prueba SDS después de este paso, para dar un último volumen de lodo de 75 \mul, y las muestras fueron inmunotransferidas según lo descrito anteriormente. Para los ensayos de la proteinocinasa y la electroforesis por gel, las cuentas fueron lavadas adicionalmente dos veces con el Tampón A conteniendo 0.27 M de sacarosa y las proteínas fueron eluidas desde la resina por incubación con el mismo tampón que contiene 20 mM de glutatión. Las cuentas fueron entonces removidas por filtración a través de un filtro de 0.44-\mum y el eluato dividido en alícuotas y guardado a -80ºC.

Expresión y purificación de isoformas de GST-M025 en E. coli . Las estructuras del pGEX-6T codificando el terminal-N GST apendizado de MO25\alpha o GST apendizado de MO25\beta se transformaron dentro de las células BL21 de E. coli. y un cultivo de 0.5-litro creció a 37ºC en el caldo de Luria-Bertani hasta que la absorbancia a 600 nm fue \sim0.7. Después, isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosida se agregó a una concentración de 250 \muM para inducir la expresión de la proteína, y las células se cultivaron por unas 16 h adicionales a 26ºC. Las células fueron recolectadas por centrifugación durante 30 min. en 5. 000 g y resuspendidas en 25 ml del Tampón de Lisis. La lisis se completó por una ronda de congelado/derretido de diez ciclos de 15-seg. de sonicación. El lisado se centrifugó a 4ºC por 30 min. en 20.000 g, los sobrenadantes se filtraron a través de un filtro de 0.44 \mum y se incubaron por 1 h en una plataforma giratoria con 1 ml de glutatión-Sefarosa equilibrado previamente en el Tampón de lisis. Las cuentas se lavaron 4 veces con el Tampón de lisis conteniendo 150 mM de NaCl, dos veces con el Tampón A y dos veces con el Tampón A conteniendo 0.27 M de sacarosa. Para eluir las isoformas de MO25 desde la resina, 15 \mug de proteasa de precorte del GST apendizado fue agregado el cual se pega al terminal-C del apéndice de GST en las proteínas de fusión-GST. La resina se incubó con el proteasa por 16 h a 4ºC en una plataforma giratoria y las proteínas de M025 se recolectaron por filtración a través de un filtro de 0.44-\mum. Las isoformas de M025 eluidas fueron además incubadas con 0.25 ml de glutatión-Sefarosa por 30 min. a 4ºC, para remover cualquier rastro de proteína de fusión-GST no cosechada y del proteasa de precorte de GST. 1 mg de M025 homogéneo fue aislado típicamente, y después congelado en nitrógeno líquido y guardado en los alícuotas a -80ºC.

Purificación de Flag-LKB1 y análisis por espectrometría de masa. Flag-LKB1 se inmuno purificó establemente de las células de HeLa expresando LKB1 tipo natural o el cinasa inerte de LKB1, o las células de HeLa de control que usan el gel de agarosa de M2-afinidad de anti-Flag según lo descrito previamente (Boudeau et al., 2003a). Para cada purificación, se empleó un centenar de platos de 10 centímetros de diámetro de cada línea de la célula de HeLa y rindió 0.4 ml de la solución de LKB1 por afinidad del eluído purificado. 40 \mul de cada muestra (Fig. 1A senda 1-3) fueron sometidos a electroforesis en un gel premoldeado de poliacrilamida 4-12% SDS, y el gel teñido con azul coloidal y fotografiado. Para la muestra concentrada (Fig. 1A, senda 4), 250 \mul de la preparación de KD-LKB1 fue precipitado con metanol, resuspendido en 1X Tampón de Muestra SDS y analizado. Las bandas indicadas en la Figura 1A se cortaron, lavaron y digirieron con tripsina como se describió previamente (Woods et al., 2001). Los péptidos trípticos fueron analizados por espectrometría de masa MALDI-TOF, usando el ácido \alpha-cianocinnámico como la matriz, en un espectrómetro de masa STR Élite PerSeptive Biosystems. Los espectros fueron adquiridos en el modo de reflectron, internamente calibrados y las masas del péptido tríptico se examinaron contra las bases de datos de NCBInr y SwissProt que usan el programa del MS-FIT del Buscador de la Proteína (UCSF, CA) que se corre en un servidor local. La identidad de STRAD\alpha y MO25\alpha también fue confirmada por el análisis de secuencia LC-MS/MS en un espectrómetro de masa Q-TOF2 como se describió previamente (Way et al., 2002).

Purificación por afinidad del MO25\alpha con péptidos. Estreptavidina-Sefarosa equilibrada previamente en PBS se incubó con cada péptido biotinilado en una proporción de 1 \mug del péptido a 1 \mul de resina en una plataforma vibrante por 30 min., y las cuentas se lavaron entonces dos veces con PBS para remover cualquier péptido no conjugado. Los lisados celulares indicados (0,5 mg) se incubaron con el péptido de Estreptavidina-Sefarosa conjugado (5 \mul) por 1 h a 4ºC en una plataforma vibrante. Las cuentas fueron lavadas dos veces con 1 ml de Tampón de Lisis que contiene 150 mM de NaCl y dos veces con 1 ml de Tampón A, y después resuspendidas en un volumen de 20 \mul de Tampón A al cual se agregó 5 \mul de tampón de muestra SDS. Las muestras se sometieron entonces a electroforesis y fueron inmunotransferidas para MO25\alpha según lo descrito anteriormente.

Análisis de Biacore. El enlace se analizó en un sistema BiaCore 3000 (BiaCore AB, Stevenage, Reino Unido). Los péptidos biotinilados indicados se ligaron a un circuito integrado Sensor recubierto de Estreptavidina (SA) (20 unidades de respuesta, RU). Varias concentraciones de M025\alpha bacterianamente expresado previamente dializado en el tampón HBS-EP (10 mM de HEPES pH 7.4, 0.15 M de NaCl, 3 mM de EDTA, 0.005% (v/v) de polisorbato-20, se inyectaron encima de los péptidos inmovilizados a una razón de flujo de 30 \mul/min. Las interacciones entre cada péptido y la proteína de MO25\alpha se analizaron sobre un rango de concentraciones de MO25\alpha de 6,25-3.200 nM y la ligazón del estado estacionario se determinó a cada concentración. La disociación de MO25\alpha desde cada péptido se supervisó durante un período de 1 min. La regeneración de la superficie del circuito integrado Sensor entre cada inyección se realizó con 3 inyecciones consecutivas de 5-\mul de 10 mM de NaOH, 1 M de NaCl.

Autofosforilación de LKB1 y fosforilación de MBP. 0,5 \mug de GSTLKB1 tipo natural o catalíticamente inactivo de los complejos indicados de LKB1 (Figura 8) que había sido purificado por afinidad en glutatión-Sefarosa desde 293 células, se incubó en una mezcla de 30-\mul de la reacción que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7.5), 0.1% de 2-mercaptoetanol, 0.1 mM de EGTA, 10 mM de cloruro de manganeso, 0,5 \muM de microcistina-LR, y 100 \muM de [\gamma-32P]ATP (1.000 cpm/pmol) en la presencia de 3,3 \mug de MBP bovino. Después de la incubación por 40 min. a 30ºC, las reacciones se terminaron por la adición de 8 \mul del Tampón de muestra. 30 \mul fue sometido a electroforesis en los geles de SDS-poliacrilamida, los cuales fueron entonces secados y analizados por auto-radiografía para cuantificar la autofosforilación de LKB 1, MBP y la fosforilación de STRAD\alpha. 5 \mul de cada reacción fue diluido en 45 \mul de 1 X Tampón de Muestra SDS. De la solución resultante, se usaron 10 \mul para la inmunotransferencia con los anticuerpos anti -GST (reconoce LKB1), anti-Flag (reconoce STRAD\alpha y STRAD\beta) y anti myc (reconoce MO25\alpha y MO25\beta). 30 \mul de la muestra se usó para la inmunotransferencia con el anticuerpo de MBP T65-P.

Estudios de localización. Se cultivaron las células de HeLa a 50% de confluencia en los refugios de vidrio (no. 1.5) en los platos de 10 centímetros de diámetro y fueron transfectadas con un total de 2 \mug de una estructura poniendo en código al GFP-LKB1 tipo natural junto con las estructuras indicadas del pCMV5 usando el reactivo de transfección Effectene (Qiagen) según el protocolo del fabricante. Un duplicado del conjunto de platos se usó para cada condición. Las células se lavaron con PBS 20 h post-transfección, y se fijaron por 10 min. en paraformaldehido frescamente preparado al 4% (v/v) en el Tampón PHEM (60 mM de Pipes, 25 mM de Hepes, 10 mM de EGTA y 2 mM de sulfato de magnesio, pH 7.0). Las células se lavaron entonces dos veces con PBS y permeabilizadas con 1% (por Vol.) de NP40 en PBS y bloqueadas con 10% del suero de la cabra normal. Las células fueron inmuno rotuladas con ambos anticuerpos el anticuerpo anti-MO25\alpha y el anticuerpo anti-Flag (para detectar STRAD\alpha Flag-apendizado), lavado en PBS y contador de manchados con la Red de Texas de los anticuerpos de anti-oveja IgG y anti-ratón de lgG Cy5. Las células fueron representadas en imagen usando un microscopio Zeiss LSM 510 META confocal. Cada canal fue examinado independientemente para evitar la charla cruzada (Multirastreo).

Análisis de transferencia Northern. Un cADN que corresponde a MO25\alpha humano (NCBI Acc, N. NM_016289, residuos del nucleótido, 1.550 a 2.500), fue marcado con 32P al azar imprimando usando un equipo que marca el ADN Hi Prime (Roche). Esta sonda se usó para proteger la transferencia Northern de un Tejido Múltiple (Clontech, PT1200-1) usando el Tampón Rapid-Hyb (Amersham Pharmacia) de acuerdo al protocolo proporcionado por el fabricante. Siguiente a la auto-radiografía, la sonda fue despojada y la transferencia fue entonces re-hibridizada como anteriormente con una sonda de \beta-actino proporcionada por el fabricante.

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Ejemplo 2 Complejos entre el supresor del tumor LKB1, Strad\alpha/\beta Mo25\alpha/\beta que son cinasas ascendentes en la cascada de cinasa-proteína AMP activada

La cascada de proteína cinasa de AMP activada (AMPK) es un sensor de la carga de energía celular que actúa como un "encendedor primario metabólico" e impide la proliferación celular. La activación requiere de la fosforilación dentro del lazo de activación (Thr-172) por las cinasas ascendentes (AMPKKs) que no han sido identificadas. Recientemente identificamos tres proteínas cinasas relacionadas que actúan ascendente del homologo de levadura de AMPK, los que no tienen homólogos obvios de mamíferos. Sin embargo, la cinasa de mamífero estrechamente relacionada es LKB1, para la cual ha sido identificado un sustrato no fisiológico. LKB1 actúa como un supresor de tumores y esta mutado en el síndrome de Peutz-Jeghers humano. Mostramos en el Ejemplo 1 que existe como un complejo con dos subunidades no esenciales, STRAD\alpha/\beta y M025 \alpha/\beta.

Hemos reportado que: (i) dos actividades de AMPKK purificados de hígado de rata contienen LKB1, STRAD\alpha y MO25\alpha, y pueden ser inmunoprecipitadas usando anticuerpos anti-LKB1; (ii) ambos complejos recombinantes y endógenos de LKB1 STRAD\alpha y MO25\alpha activan AMPK vía la fosforilación de Thr-172, (iii) LKB1 activo catalíticamente y STRAD\alpha ó STRAD\beta y MO25\alpha ó MO25\beta son requeridos para la actividad total; (IV) los medicamentos AICA ribosida y fenformina no activan AMPK en células HeLa (ya que carecen de LKB1), pero estas pueden ser restituidas expresando LKB1 en estas células de tipo salvaje, pero no catalíticamente inactiva.

Estos resultados proporcionan la primera descripción de un sustrato fisiológico para el represor del tumor LKB1 y sugieren que funciona como un regulador ascendente de AMPK. Nuestras conclusiones indican que la formación de tumores en el síndrome de Peutz-Jeghers podría resultar de la activación deficiente de AMPK como consecuencia de la inactivación de LKB 1.

Resultados Resolución de dos AMPKKs de extractos de hígado de rata

Mientras experimentabamos con diferentes condiciones para optimizar la recuperación del paso de Q-Sepharose de nuestro protocolo de purificación de AMPKK [14], encontramos que podíamos resolver dos picos de actividad máxima (figura 13A). Debido a que el segundo pico parece corresponderse con AMPKK purificado originalmente [14], referimos este como AMPKK1, con el primer pico eluido de la columna denominada como AMPKK2 en la figura 13A, el ensayo AMPKK es dirigido usando como sustrato glutatión-S-transferasa (GST) expresado de una fusión bacteriana del dominio catalítico de AMPK\alpha1 de rata. Esto es más conveniente que el heterotrimero de AMPK usado antes de hígado de rata nativa [14] ya que el dominio catalítico de AMPK\alpha1 esta completamente desfosforilado y por lo tanto inactivo cuando se expresa en bacterias. Es también posible llevar a cabo el ensayo con el sustrato unido a las perlas de glutatión-Sepharose, permitiendo que cualquier AMPK endógeno en la fracción de AMPKK pueda interferir al ser lavado. En la cromatografía de exclusión por tamaño Sephacryl S-200, AMPKK1 y AMPKK2 son eluidos como proteínas grandes pero de tamaños distintos. En comparación con los patrones, los radios de Stokes para AMPKK1 y AMPKK2 fueron calculados como 5,2 y 5,7 nm respectivamente. El Ca^{2+} y la calmodulina no estimularon ni AMPKK1 ni AMPKK2, y son inmunoprecipitados que usan un anticuerpo contra CaMKK (no mostrado).

Ambos AMPKK1 y AMPKK2 contienen LKB1, STRAD\alpha y MO25\alpha

Al examinar si cualquiera de estas dos fracciones podrían contener LKB1, se monitorean las manchas de las fracciones que atraviesan la cromatografía Q-Sepharose usando anticuerpos contra LKB1, STRAD\alpha y MO25\alpha (Figura 13B-D). Esto revela que la actividad de AMPKK2 tiene una correlación con la presencia del polipéptido LKB1 de \sim 50 kDa (\sim 50 kDa) tanto como STRAD\alpha (\sim 45/48 kDa) y MO25\alpha (\sim40 kDa) en 18-22 fracciones. STRAD\alpha es detectado como un doblete como se reportó anteriormente [30]; la razón para este comportamiento no se conoce. No obtuvimos ninguna señal de masa molecular correcta en estas fracciones que usaban el anticuerpo anti-MO25\beta (no mostrado), esto es compatible con nuestras observaciones, la isoforma MO25\beta no esta expresada en hígado de ratón (ejemplo 1). También obtuvimos una señal leve para LKB1 y STRAD\alpha en las fracciones 27-29 que contenían AMPKK1, pero al estas cargarse con MO25\alpha estuvieron por debajo del límite de detección en estas fracciones. Sin embargo, la presencia de LKB1, STRAD\alpha y MO25\alpha en AMPKK1 se confirma analizando las cargas más alta de las fracciones 26-30 (Figura. 12E-G). Una conclusión interesante es que el polipéptido LKB1 migra con una movilidad ligeramente más rápida en AMPKK1 comparado con AMPKK2: esto es evidente por la inspección de la Figura 13B (ver también figuras. 14B y 14D).

Actividad de AMPKK puede ser inmunoprecipitada de AMPKK1 y AMPKK2

Usando el anticuerpo anti-LKB1 pero no un control preinmune de IgG somos capaces de inmunoprecipitar la actividad de AMPKK tanto para AMPKK1 como en AMPKK2. La Figura 14A muestra los resultados de un experimento, donde la cantidad de cinasa estuvo limitada y el anticuerpo estaba en exceso y se muestra que somos capaces de remover más del 80% de la actividad de las fracciones del pico que contiene AMPKK1 y AMPKK2, por inmunoprecipitación con el anticuerpo anti-LKB1 mientras que ninguna actividad fue eliminada usando el control pre-inmune de inmunoglobulina. Podríamos retirar mas del 95% de la actividad de AMPKK de un complejos GST-marcado LKB1-STRAD\alpha-MO25\alpha recombinante (ver próxima sección) bajo las mismas condiciones. La pequeña cantidad de actividad remanente en los sobrenadantes de AMKK1 y las fracciones de AMPKK2 podrían ser explicadas por el hecho de que la inmunoprecipitación no fue cuantitativa en estos casos, con aproximadamente un 20% del polipéptido LKB1 que se queda en el sobrenadante (figura 14B).

Debido a la pequeña cantidad de AMPKK1 y AMPKK2 que es usado en este experimento, es difícil probar al analizar los precipitados la actividad de AMPKK por la presencia de otros polipéptidos. Aunque se repite el experimento con más cinasa y menos anticuerpo (la cantidad de anticuerpo es ahora restrictiva) y se analizan los precipitados solamente. Esto demuestra que podíamos recuperar casi toda la actividad de AMPKK en el precipitado de las fracciones del pico que contenían AMPKK1 y AMPKK2 como desde el complejo LKB1-STRAD\alpha-MO25\alpha recombinante, y ninguna actividad recuperada cuando usamos el control preinmunizado de inmunoglobulina (Figura 14C). Western blottting de los precipitados de AMPKK1 y AMPKK2 muestran que contenían LKB1, STRAD\alpha y MO25\alpha, aunque el STRAD\alpha del doblete es muy leve en el precipitado de AMPKK1 (Figura 14D).

Complejos LKB1-STRAD\alpha-MO25\alpha recombinante activa el dominio catalítico de AMPK\alpha1 en ensayos de células libres

Para examinar sí LKB1 activa AMPK sobre sí mismo o sí las subunidades suplementarias STRAD \alpha/\beta y MO25\alpha/\beta son requeridas, nosotros expresamos GST-LKB1-marcado, FLAG-STRAD\alpha/\beta marcado y myc-MO25\alpha/\beta marcado en varias combinaciones en células HEK-293T, y se purificaron los complejos sobre glutatión-Sepharose. También usamos como una mutante de LKB1 inactiva una cinasa marcada por GST (D194A), y un plámido que expresa sólo GST, como control. Los complejos purificados fueron incubados con el dominio catalítico de AMPK\alpha1 en presencia de MgATP, y se mide la activación del dominio catalítico tanto como la fosforilación de Thr-172 (usando anticuerpo de fosforoespecífico anti-pT172). La Figura 15A muestra que solo LKB1 no incrementó la actividad significativamente, o la fosforilación de Thr172 del dominio catalítico de AMPK\alpha1 de arriba y se observa solamente la actividad base en presencia de GST (comparación carril 1 y 14). El mismo resultado fue obtenido con LKB1 que ha sido expresado con MO25\alpha ó MO25\beta (carriles 4 y 5), lo cual se esperaba ya que estas proteínas no interactúan con LKB1 en ausencia de STRAD\alpha/\beta (ejemplo 1). Un complejo LKB1-STRAD\alpha da una pequeña pero importante activación y fosforilación del dominio catalítico AMPK\alpha1 Thr172 por encima del valor base (comparación carriles 1 y 2). Sin embargo, para producir una activación y fosforilación del dominio catalítico de AMPK\alpha1 grande, se requiere un complejo heterotrimerico que contiene LKB1, STRAD\alpha ó STRAD\beta, y MO25\alpha o MO25\beta (carriles 6 a 9). El orden del grado de activación de los complejos heterotrimerico es LKB1-STRAD\alpha-MO25\alpha > LKB1-STRAD\alpha-MO25\beta \sim LKB1-STRAD\beta-MO25\alpha > LKB1-STRAD\beta-MO25\beta. Importante, es la capacidad de los complejos LKB1-STRAD-MO25 para activar AMPK\alpha1 completamente que es dependiente de la actividad catalítica de LKB1, porque los complejos de una mutante inactiva catalíticamente de LKB1 D194A con varias combinaciones de STRAD\alpha/\beta y MO25\alpha/\beta (carriles 10-13), son capaces de activar AMPK\alpha1 fosforilado. El grado de activación obtenido con estos distintos complejos de LKB1 de tipo salvaje correlaciona bien con la fosforilación de Thr-172. Probando con un anticuerpo contra el dominio catalítico de AMPK\alpha1 entero (GST marcado AMPK\alpha1 en Figura 15A) se confirma que la carga fue uniforme en estas muestras. Los fondos de los tres carriles en la Figura 15A confirman que las subunidades relevantes de STRAD y M025 coprecipitadas con LKB1 cuando habían sido transfectados los ADNs que codifican para estas subunidades. Cuando STRAD\alpha fue expresada con LKB1 en ausencia de una subunidad de M025, la cantidad de la subunidad STRAD\alpha que coprecipita con LKB1 se reduce (carriles 2 y 3). Esto es compatible con las conclusiones previas de que la presencia de una subunidad de M025 estabiliza los complejos LKB1-STRAD (Ejemplo 1).

En la Figura 15B se proporcionan las pruebas que evidencian que Thr-172 fue el único sitio sobre el dominio catalítico de AMPK\alpha1 fosforilado por el complejo LKB1-STRAD\alpha-MO25\alpha. Cuándo las dos proteínas fueron incubadas juntas en presencia de [\gamma^{32}P] ATP, el dominio catalítico de AMPK\alpha1 de tipo salvaje se favorece en ^{32}P marcado, pero no lo hace una mutante Thr172 \rightarrow Ala del dominio catalítico de AMPK\alpha1.

Complejos AMPKK1, AMPKK2 y LKB1-STRAD-MO25 recombinante también activan los complejos de AMPK heterotrimerico

Aunque la mayor parte de los ensayos de AMPKK del estudio fueron dirigidos usando el dominio catalítico AMPK\alpha1 como sustrato, la Figura 16 muestra que AMPKK1, AMPKK2 y el complejo GST-LKB1:STRAD\alpha:MO25\alpha recombinante activa los complejos de AMPK heterotrimerico. Los plámidos que codifican para las subunidades de AMPK \alpha_{1}, \beta_{1} y \gamma_{1} ó \alpha_{2}, \beta_{1} y \gamma_{1} fueron expresadas en células CCL13 y purificados por medio de un myc tag sobre las subunidades \alpha. Los complejos AMPK recombinante ligados a las perlas G-Sepharose y proteína fueron incubadas con MgATP y AMPKK1, AMPKK2 o GST-LKB1:STRAD\alpha:MO25\alpha, las cinasas ascendentes son lavadas y se determina la actividad de los complejos de AMPK. La Figura 16 muestra que ambos complejos \alpha_{1}\beta_{1}\gamma fy 2\beta_{1}\gamma1 fueron activados todos por las tres preparaciones de cinasa ascendente, y esta correlaciona con la fosforilación de Thr-172 sobre las subunidades \alpha, esto demuestra el uso del anticuerpo anti-pT172 (el que reconoce Thr-172 fosforilada tanto sobre \alpha_{1} y \alpha_{2}). El manchón usando los anticuerpos anti-\alpha1 y \alpha_{2} confirma la carga uniforme (indica que la señal más fuerte es obtenida siempre con el anti-\alpha_{2} que con el anticuerpo anti-\alpha_{1}, aún cuando la carga de proteína es la misma). Aunque la actividad de AMPKK2 usada es 3,5 veces mayor que AMPKK1 y solamente el 30% más bajo que GST-LKB1-STRAD\alpha-MO25\alpha en relación con su capacidad de activar el dominio catalítico de AMPK\alpha1, AMPKK2 parecía ser mucho menos efectiva para activar el complejo \alpha_{1}\beta_{1}\gamma. Estas diferencias son menos obvias usando el complejo \alpha2\beta_{1}\gamma como sustrato.

LKB1 endogeno que activa AMPK puede ser inmunoprecipitada de células 293 pero no de células HeLa

La Figura 17 muestra que una actividad del dominio catalítico de AMPK\alpha1 activado y la Thr-172 fosforilada podría ser inmunoprecipitada desde extractos de células HEK 293T no transfectada usando los anticuerpo anti-LKB1 (carril 1), pero no un control preinmune de inmunoglobulina (carril 2). Como esta previamente reportado [30, Ejemplo 1], la inmunoprecipitación de LKB1 endogena resulta en la precipitación de STRAD\alpha y MO25\alpha (carril 1). Como un control adicional, empleamos células HeLa normales ya que se conoce que LKB1 no esta expresado en estas células [23]. Consistente con esto, subunidades no LKB1-STRAD\alpha-MO25\alpha o con actividad AMPKK fueron inmunoprecipitadas desde la misma cantidad de extracto de proteína de célula HeLa usando un anticuerpo anti-LKB1 (carril 3). Sin embargo, la actividad de AMPKK y la fosforilación de Thr-172, tanto en las subunidades STRAD\alpha y MO25\alpha son detectables, y son recuperadas luego de la inmunoprecipitación de LKB1 desde células HeLa [34], que estabilizan la expresión de LKB1 de tipo salvaje [32] (carril 5). En las células que expresan una mutante catalíticamente inactiva de LKB1, los polipéptidos STRAD\alpha y MO25\alpha son recuperados por inmunoprecipitación usando el anticuerpo anti-LKB1, pero no actividad AMPKK (carril 7). Aunque el polipéptido LKB1 fue sobre expresado en gran parte en las células HeLa comparado con los niveles endogenos observados en las células 293 (Figura14, carriles de comparación 1 y 5), es claro que la cantidad de STRAD\alpha y MO25\alpha en las células es limitado en estas células. Existe una baja cantidad de actividad AMPKK y fosforilación de Thr-172, así como STRAD\alpha y MO25\alpha precipitado, en células HeLa expresando LKB1 que en células 293, aunque el mismo LKB1 estaba sobre expresado. La actividad de AMPKK en los inmunoprecipitados de células 293 y células HeLa expresa LKB1 de tipo salvaje que tiene correlación con los niveles de STRAD\alpha y MO25\alpha en el complejo en vez de los niveles de LKB1. Esto enfatiza además la naturaleza esencial de las subunidades STRAD y MO25 en aumentar la actividad de AMPKK de LKB1.

Expresión de LKB1 restituye la activación de AMPK en células HeLa

Previamente hemos encontrado (resultados no publicados), que aunque AMPK se expresa en células HeLa, no es activado por el medicamento ribosida de 5-aminoimidazol-4-carboxamida (AICA) y metformina, que activan la cinasa fácilmente en otros tipos de célula [33, 34]. Como en células HeLa no se expresa LKB1 [23] esto podría proporcionar una explicación potencial para esta anomalía. Para examinar si la expresión de LKB1 recombinante podría restituir la capacidad de células HeLa de responder a estos medicamentos, se han usado células HeLa que expresan establemente LKB1 de tipo salvaje, o la mutante inactiva catalíticamente [32], tanto como el control en línea de células HeLa que no expresan LKB1. En estos experimentos usamos fenformina, que hemos encontrado que activa AMPK más rápidamente y que es más potente que la metformina en otros tipos de célula. La Figura 18A muestra que ni AICA ribosida, ni fenformina, activa AMPK en células HeLa control. Sin embargo, en células que expresan LKB1 de tipo salvaje, pero no en la mutante inactiva de cinasa, ambas AICA ribosida como fenformina causan una activación fuerte de AMPK. Esto tiene correlación con la fosforilación de Thr-172 sobre AMPK\alpha, indicado por el monitoreo con el anticuerpo anti-pT172 (figura 18B), y también con la fosforilación descendente de AMPK, acetil-CoA carboxilasa (ACC), indicado por el monitoreo con un anticuerpo fosforoespecífico contra Ser-79, en el sitio principal sobre esa proteína AMPK (anti-pACC, Figura 18C). Curiosamente la expresión estable de LKB1 tipo salvaje en las células HeLa causó un título pequeño pero reproducible regulando la expresión de AMPK y haciendo la regulación hacia abajo de la expresión de ACC (no indicada). Debido a que la expresión de estas proteínas no es uniforme en estas células, para cuantificar el estado de fosforilación con exactitud simultáneamente se monitorean las manchas de los lisados usando anticuerpos anti-pT172 y anti-\alpha_{1}/\alpha_{2} (detecta la fosforilación de Thr-172 y de AMPK\alpha total), o con anti-pACC y avidina (detecta la fosforilación de Ser-79 y ACC total). Los dos reactivos de monitoreo usados en cada uno de éstos protocolos de doble marcaje fueron identificados con diferentes tinturas fluorescentes que emiten en diferentes regiones del espectro infrarrojo (IR), y los resultados son cuantificados en dos canales distintos usando un escáner de rayo láser de IR. En la Figura 18B y 18C los resultados son expresados como proporciones de la señal obtenida que usa el anticuerpo fosforoespecífico para la proteína total. Este método es correcto para diferentes niveles de expresión de proteínas, y revela que hay una buena correlación entre la activación de AMPK y la fosforilación de Thr-172. También había una correlación con la fosforilación de ACC, aunque en este caso AICA ribosida parecía tener un efecto mayor que la fenformina.

Discusión

Nuestros resultados proporcionan pruebas fehacientes de que los complejos LKB1-STRAD-MO25 representan las principales actividades de cinasa ascendente sobre AMPK. Las pruebas principales se resumen de la siguiente manera:

1.

Durante los extensos esfuerzos anteriores de unos 10 años para purificar los extractos de hígado de rata que activan AMPK defosforilado, no se han detectado algunas actividades aparte de AMPKK1 y AMPKK2, por lo menos bajo las condiciones usadas de los ensayos ([14] y el trabajo no publicado siguiente).

2.

Tanto AMPKK1 como AMPKK2 contenían LKB1, STRAD\alpha y MO25\alpha que son detectable por Western blot y tienen correlación con la actividad (Figura 13).

3.

Crucialmente, la capacidad de las fracciones de AMPKK1 y AMPKK2 de activar el dominio catalítico de AMPK es casi eliminada totalmente por inmunoprecipitación con el anticuerpo anti-LKB1 pero no por una inmunoglobulina control. La actividad es detectada en los inmunoprecipitados anti-LKB1, junto con los polipéptidos LKB1, STRAD\alpha y MO25\alpha, pero no en los inmunoprecipitados control (Figura 14).

4.

La actividad de AMPKK en AMPKK1 y en AMPKK2 no fue un contaminante que precipitó con el anticuerpo anti-LKB1, porque los complejos recombinantes de GST-LKB1, STRAD y MO25 se expresan en células 293 y se purifican en glutatión-Sepharose activado en el dominio catalítico de AMPK\alpha1 y Thr -172 fosforilada eficientemente, (Figura 15). Esta actividad estaba en función de la integridad del dominio catalítico de LKB 1, porque los complejos se formaron de LKB1 inactivo catalíticamente con una subunidad STRAD y MO25 que se deja de activar ó en AMPK fosforilado. La fosforilación del dominio catalítico parecía ocurrir exclusivamente en Thr 172, porque el dominio catalítico de AMPK tipo salvaje, excepto en una mutante T172A, podía ser fosforilado usando [-^{32}P] ATP y el complejo GST-LKB1-STRAD\alpha-MO25\alpha.

5.

Aunque la mayoría de los experimentos en este trabajo fueron dirigidos usando el dominio catalítico de AMPK\alpha1 expresado como sustrato bacteriano, AMPKK1, AMPKK2 y complejo recombinante LKB1-STRAD\alpha-MO25\alpha también se activan los complejos AMPK\alpha_{1} heterotrimerico (\alpha_{1}\beta_{1}\gamma y \alpha2\beta_{1}\gamma_{1}) eficientemente, y fosforilado luego en Thr-172 las subunidades \alpha (Figura 16).

6.

Células HeLa no expresan LKB1 (Figura 17) y aunque represente una línea de célula "Knock-out" natural. El medicamento AICA ribosida y fenformina, activan AMPK en otros tipos de célula vía distintos mecanismos [33,34], no activan AMPK en células HeLa. Sin embargo, en células establemente transfectada con el ADN que expresa LKB1 de tipo salvaje (pero no a una mutante catalíticamente inactiva) un promotor inducible, la capacidad de AICA ribosida y la fenformina activa AMPK, para fosforilar Thr-172 sobre la subunidad AMPK\alpha, y provoca la fosforilación de la diana descendente (ACC) y se restituye (Figura 18). Aunque la fenformina provoca una activación de AMPK y la fosforilación de Thr-172 mayor que AICA ribosida a estas células, por lo contrario es cierto para la fosforilación de ACC. La razón por lo que esto no es conocido, es que da la posibilidad de que los dos agentes esten activando de forma diferente las mezclas distintas de AMPK en diferentes ubicaciones subcelulares.

Aunque el polipéptido LKB1 fue sobre expresado en las células HeLa, el grado de activación de AMPK y la cantidad STRAD\alpha y MO25\alpha que se precipita con LKB1 es en realidad más baja que en células 293 (Figura 17). Esto respalda las conclusiones en la Figura 15 con la demostración de que ambas subunidades suplementarias son necesarias para aumentar la capacidad de LKB1 de activar AMPK, y también de demostrar que la forma activa de LKB1 no está sobre expresada si se compara con las células 293. Los resultados en las células HeLa indican que LKB1 y sus subunidades suplementarias son tan necesarias como suficientes para la activación de AMPK en células intactas. Sin embargo, esto no se demuestra formalmente, porque si hay otras cinasas que actúan ascendente sobre AMPK, es concebible que éstas también sean eliminadas en células HeLa. Nuestros numerosos intentos en la purificación de AMPKKs de los extractos de hígado de rata han sido solamente detectando AMPKK1 y AMPKK2, que parecen representar ambos complejos LKB1-STRAD\alpha-MO25\alpha. Sin embargo, como en cualquier protocolo de purificación de proteína la recuperación de la actividad no es cuantitativa, y no podemos descartar la posibilidad de que otras cinasas ascendentes podrían haber sido reconocidas. Tampoco detectaríamos cualquier cinasa ascendente que no este activa bajo las condiciones usadas en el ensayo. Por ejemplo, el ensayo es dirigido en presencia de EGTA, por eso no se detectaría alguna dependencia de las proteínas cinasas Ca^{2+}. Ya hemos demostrado que una cinasa de las proteínas cinasas dependientes de Ca^{2+}/calmodulina (CaMKK) de cerebro de cerdo puede activar AMPK en ensayos de células libres [17], aunque es mucho más efectiva el activar la proteína cinasa dependiente de calmodulina, y no hay pruebas de AMPK fosforilados in vivo.

Ambos AMPKK1 y AMPKK2 parecen contener LKB1-STRAD\alpha-MO25\alpha, y por lo tanto, no está claro actualmente porque se resuelve sobre la cromatografía de Q-Sepharose. Una diferencia interesante fue que el polipéptido LKB 1 en AMPKK1 pasó significativamente más rápido sobre SDS-PAGE que en AMPKK2 (Figuras 13 y 14). Se conoce que el LKB 1 es fosforilado hasta en ocho sitios, y es también farnesilado en Cys-433 cerca del extremo C-terminal [34-37]. Aunque sospechamos que la diferencia en la activación podría ser atribuible a una diferencia en la modificación covalente. Otra diferencia entre AMPKK1 y AMPKK2 son sus radios Stokes calculados por cromatografía de exclusión de tamaño (5,7 versus 5,2 nm respectivamente). Calculamos el radio de Stokes antes para AMPKK1 es 5,6 nm, y se combina esto con un coeficiente de sedimentación de 8,5 S obtenido por gradiente de centrifugación de glicerina y se ha obtenido un cálculo aproximado para la masa molecular de 95 kDa [14]. Suponiendo que AMPKK1 y AMPKK2 tienen una forma similar, esto produciría una masa molecular de aproximadamente 175 kDa para AMPKK2, que está razonablemente cerca de la masa molecular calculada (sin contar las modificaciones covalentes) 1: 1: 1 de un complejo LKB1-STRAD\alpha-MO25\alpha de 140 kDa. Aunque no podemos descartar la posibilidad de que AMPKK1 contiene una proteína adicional asociada, y es posible que las diferencias en la modificación covalente entre AMPKK1 y AMPKK2 podrían afectar la forma del complejo y por lo tanto el radio de Stokes. Compatible con el comportamiento del AMPKK1 y los complejos de AMPKK2 sobre la cromatografía de exclusión de tamaño molecular, el LKB1 endogeno fue demostrado que migra notable sobre la gel filtración con una masa molecular evidente de 50-250 kDa, por el contrario a LKB1 antes de ser expresado en E. coli, que tiene una masa molecular evidente de 50 kDa [38]. Nuestro resultados confirman que usando un sustrato fisiológico probable en las conclusiones previas que usan un sustrato artificial (proteína mielina básica) una subunidad de STRAD que estimula la actividad cinasa de LKB1 [30], y la subunidad MO25 que estimula posteriormente la actividad, probablemente por estabilización del complejo LKB1-STRAD. (Ejemplo 1). Ninguna actividad de AMPKK fue obtenida con LKB1 recombinante a menos que una subunidad de STRAD también sea expresada, y la actividad fue incrementada considerablemente por la presencia adicional de una subunidad de M025 (Figura 15). Es también perceptible que la cantidad STRAD\alpha y STRAD\beta que precipita con LKB1 fue aumentada enormemente por la expresión de MO25\alpha y MO25\beta (Figura 15) esto es compatible con nuestras conclusiones previas (Ejemplo 1). El mecanismo exacto por el que las subunidades STRAD y las de MO25 activan LKB1 queda poco claro, pero estas subunidades suplementarias introducen el alcance para la regulación adicional de la cinasa. Ya es conocido que LKB1 es fosforilado en 2 sitios distintos STRAD\alpha [30], y que STRAD\alpha y MO25\alpha constituyen un complejo que conserva LKB1 en el citoplasma (Ejemplo 1). Es también interesante notar que tanto AMPK como su cinasa ascendente son heterotrimeros.

¿Se explica la activación de AMPK por la capacidad de LKB 1 de actuar como un supresor de tumor y de detener el crecimiento celular y de la proliferación? Esto parece indudablemente explicable, porque aparte del hecho de que AMPK es un inhibidor general de biosíntesis [1,2], también hay pruebas acumuladas de que se puede regular el progreso a través del ciclo de la célula. Por ejemplo, la activación de AMPK impide la proliferación de células de HepG2 estabilizando p53 [13], y reduce el nivel del ARN que unido a proteína HuR en el citoplasma, reduce la estabilidad de los ARNsm que codifican para las ciclinas A y B1 [12]. Curiosamente, la expresión de LKB1 en células G361 que no expresan la cinasa causan un arresto en la fase G1 que esta relacionada con una inducción de p21 que es dependiente sobre p53 [23,24].

Otra posibilidad excitante es que los complejos de LKB1-STRAD-MO25 también podrían actuar como cinasas ascendentes para otras proteína cinasas, de la misma manera en la que PDK1 fosforilada en residuos treonina en el lazo de activación de varias cinasas de la subfamilia de "AGC" [39]. Un dendrograma indica las relaciones entre las secuencias del dominio catalítico de 518 proteína cinasas de humanos que codifican en el genoma humano [40] donde se muestra que las subunidades de AMPK1 y AMPK2 están tendidas sobre una sub-rama pequeña que también contienen otras ocho proteínas cinasas (NuaK1, NuaK2, BrsK1, BrsK2, SIK, QIK, QSK y MELK; ver [41] para los detalles), la mayoría no ha sido investigada antes o se conoce muy poco. Una alineación de las secuencias del lazo de activación de estas cinasas son mostradas en la Figura 19, junto con aquellas subunidades C\alpha catalítica de la sub-familia "AGC" de proteína cinasa de AMP-dependiente cíclica (PKA\alpha, que puede ser fosforilada en el lazo de activación por autofosforilación) y la isoforma \alpha de la proteína cinasa C (PKC\alpha), que esta activado por fosforilación en el lazo de activación por PDK1. También se incluye en la Figura 19 el lazo de activación de las secuencias del Arabidopsis thaliana (AtSnRK1\alpha_{1}, AtSnRK\alpha_{2}) y de Saccharomyces cerevisiae (ScSnf1) homologas de AMPK, ambas ha sido demostrado anteriormente que son activadas por AMPKK de hígado de rata en el ensayo de células libres [42,43]. Todas en la secuencia están bien conservadas sobre el lado C-terminal del residuo de treonina que es el objetivo de la fosforilación, pero la subfamilia de AMPK/SnfI están más conservadas sobre el lado N-terminal entre el motivo "DFG" invariable y el residuo de treonina. Las carácterísticas de la secuencia que son conservados en la subfamilia de AMPK/SNF1, pero no en la familia "AGC" incluyen pares de residuos hidrofóbicos en posiciones -3, -2 y en las posiciones -9, -8. Las cinasas NuaK1 y NuaK2 y de AMPK/SNF1 de humano, planta y levadura también tienen un motivo "LSN" conservado en las posiciones -12 a la -10. Los restos estan determinados si en otras cinasas humanas de la subfamilia de AMPK son activados por la fosforilación del residuo de treonina del lazo de activación equivalente, y si podrían también ser dianas descendente para los complejos LKB1/STRAD/MO25. Si este es el caso, estas otras cinasas podían mediar algunas de las funciones de supresión del tumor de LKB1. Desde el dominio catalítico en esta subfamilia que está estrechamente relacionado, a las otras regiones que tienden a ser más variables, uno podría especular que estas cinasas pueden ser activada por los diferentes stress o por los otros estímulos vía fosforilación junto a los complejos de LKB1/STRAD/MO25, y pueden mediar los efectos celulares diversos que son provocados por LKB1. Es también posible que pudieran compartir algunas dianas descendentes
comunes con AMPK.

Conclusiones

Nuestros resultados proporcionan pruebas fehacientes, tanto en el ensayo de células libres y en células intactas, como entre los complejos LKB1-STRAD\alpha/\beta y MO25\alpha/\beta, lo que constituye un gran postulado después que las cinasas ascendentes activan AMPK vía fosforilación en el lazo de activación de Thr-172. Debido que ya es conocido que la activación farmacológica de AMPK provoca la inhibición general de la biosíntesis, tanto como el arresto dependiente de p53 en la fase G1, la activación de AMPK por LKB1 podría explicar por lo menos en parte la capacidad del último de actuar como un supresor del tumor. LKB1 también puede actuar como una cinasa ascendente para otros miembros de la subfamilia de proteína cinasas de AMPK/SNF1.

Materiales y Métodos Materiales, proteínas y anticuerpos

La proteína G-Sepharose en columna Q-Sepharose preempaquetada Amersham Pharmacia Biotech, UK. El dominio catalítico GST-AMPK\alpha1 fue expresado en E. coli y purificado como se describe anteriormente [44]. Anticuerpos de carnero contra las subunidades \alpha_{1} y \alpha_{2} de AMPK [45] LKB1 humano, MO25\alpha, MO25\beta (ejemplo 1), y el anticuerpo fosforoespecífico contra el sitio Thr-172 sobre la subunidad AMPK\alpha (anti-pT172) [46] fue descrito antes. El anticuerpo de carnero contra el dominio catalítico AMPK\alpha1 fue elevado contra del péptido CDPMKRATpIKDIRE (cisteína + residuos 252-264 de rata \alpha_{1}, Tp = fosfotreonina) usando el método descrito para el anti-pT172 [46]. Aunque se diseña como un anticuerpo fosforoespecífico, se reconoce el dominio catalítico GST-AMPK expresado en bacterias y el reconocimiento no se afecta por el tratamiento de fosfatasa de proteína. El anticuerpo monoclonal contra STRAD\alpha que fue descrito anteriormente [30]. Fuentes de otros materiales y proteínas fueron descritos antes [14].

Ensayo de la Enzima

Las unidades definidas AMPK [14] y AMPKK [34] fueron ensayados, como se describe previamente. La lisis rápida de células para los ensayos AMPK fue descrito antes [47]. Los ensayos fueron llevados a cabo por triplicado y los resultados son expresados con la media y desviación típica.

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Purificación de AMPKK1 y AMPKK2

AMPKK fue purificado en el paso de Blue-Sepharose como fue descrito antes [14]. El flujo a través de esta columna fue ajustado a 160 mM NaCl por la dilución en tampón A (50 mM Hepes, 10% (p/v) de glicerina de 0,02% (p/v) de Brij-35, 1 mM de EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM de benzamidina, 0,1 mM de PMSF, 1 \mug/ml del inhibidor tripsina soja), y se aplica a una columna de HiLoad 16/10 Q-Sepharose en un tampón A más 160 mM NaCl a 3 ml/minuto. La columna fue lavada en tampón A más 160 mM de NaCl hasta que la absorbancia A_{280} fue < 0,05, y la actividad de AMPKK fue luego eluida con un gradiente lineal (120 ml) de NaCl 160-400 mM tampón A.

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Expresión de complejos LKB1 recombinante en células de HEK-293T

Varias combinaciones de GST-marcado LKB1, FLAG-marcado STRAD\alpha ó STRAD\beta myc - marcado MO25\alpha o MO25\beta se expresan en células HEK-293T y los complejos purificados sobre glutatión-Sepharose como se describe en el Ejemplo 1.

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Fosforilación de dominio catalítico GST-\alpha1 usando [\gamma32P] ATP

El dominio catalítico GST-\alpha_{1} (50 \mug/ml), de cualquier tipo salvaje o de una mutante T172A [44] fueron incubados por 30 minutos y a 30ºC con 5 mM de MgCl_{2} y [\gamma^{32}P] ATP (200 \muM; \sim750 cpm/pmol) en presencia o ausencia del complejo GST-LKB1:STRAD\alpha:MO25\alpha (20 unidades/ml). La reacción fue terminada por la adición de tampón de muestra SDS (Invitrogen), los polipéptidos resueltos por SDS-PAGE y el gel deshidratado es sometido a autoradiografía.

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Preparaciones de heterotrimeros de AMPK recombinante

Los plámidos codifican myc-\alpha_{1}\beta_{1} y \gamma que fueron expresados en células CCL13 [45], y las células cosechadas por el método de lisis rápida [47]. Los lisados fueron inmunoprecipitados con anticuerpo anti myc y resuspendido en
50 mM NaHEPES, 1 mM de ditiotreitol, 0,02% (w/v), Brij-35, pH 7,5.

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Inmunoprecipitación de LKB1 endogeno

Inmunoprecipitación de LKB1 endogeno usando anticuerpo humano y proteína G-Sepharose es descrito en el Ejemplo 1. El ensayo cinasa cinasa fue conducido usando dominio catalítico GST-\alpha_{1} como sustrato en incubadora agitada como se describe antes para el ensayo de inmunoprecipitación de AMPK [47].

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Células HeLa expresa LKB1

La generación de las células HeLa se expresa por inducción (Tet-ON) establemente del tipo salvaje o la mutante LKB1 cinasa inactiva, y en condiciones para su cultivo, han sido descritas anteriormente [32].

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Análisis de proteína y electroforesis

La concentración de proteína fue determinada usando el método de tinción Bradford [48]. SDS-PAGE fue lograda usando geles de poliacrilamida Bis-Tris gradiente 4-12%, en los sistemas tampón MOPS (Invitrogen), excepto para el análisis de acetil-CoA carboxilasa, dónde fue prerepartido en geles de 3-8% Tris-acetato (Invitrogen). Proteínas fueron transferidas a membranas de nitrocelulosa (BioRad) usando el módulo de Blot de XcelI II (Invitrogen).

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Detección de western blot por imágenes de infrarrojos

Para analizar la fosforilación de ACC, las muestras fueron analizadas por SDS-PAGE, transferido a nitrocelulosa (Bio-Rad) e incubada en tampón de bloqueo Odyssey^{TM} que contenía 0,2% Tween-20 para 1 h. El anticuerpo anti-pACC (1,46 \mug/ml en el tampón de bloqueo) fue luego añadido y agitado por 1 h. Las membranas fueron lavadas 6 x 5 minutos con TBS (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M de NaCl) más Tween-20 (0,2%). Las membranas fueron sumergidas en tampón de bloqueo 0,2% Tween-20 que contenía y 1 \mug/ml de conjugado de carnero anti-IgG a IR tinción 680 (molecular Probes, Leiden, The Netherland) y 1 \mug/ml de estreptavidina conjugada para IR Dye 800 (Rockland Inc., Filadelfia, PA) y se deja agitando por 1 h, protegido de la luz. Las membranas se lavan luego 6 x 5 minutos usando TBS-Tween (0,2%) y 1 x 5 minutos en PBS. Las membranas fueron escaneadas en dos canales diferentes usando el imager de IR Odyssey^{TM}, y los resultados cuantificados usando software de Odyssey^{TM} y es expresado como una proporción de la señal obtenida con el anticuerpo pACC al obtenido con estreptavidina. El análisis de fosforilación del dominio catalítico GST-\alpha_{1} es similar, excepto que los geles 4-12% Bis-Tris fueron usados, y las membranas fueron monitoreadas simultáneamente por 1 h con anticuerpos de carnero anti-pT172 y los del dominio catalítico anti-AMPK, directamente marcado con el IR Dye 680 y el IR Dye 800 respectivamente, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

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Ejemplo 3 Sustrato de péptido para LKB1

Un ensayo de cinasa para LKB1 puede ser llevado a cabo usando un péptido como sustrato, por ejemplo usando el péptido AMPK de lazo T cuya secuencia es

LSNMMSDGEFLRTSCGSPNRRR

(residuos 163-181 de AMPK\alpha1 humano 3 residuos de Arg adicionales que se adicionan al C-terminal para ser capaz de unirse a P81). El ensayo puede ser llevado a cabo de la siguiente manera. El otro ensayo usando tal péptido como sustrato puede ser usado, por ejemplo en un formato de salida alto. El ensayo estandar (50 \mul) conteniendo: 0,3 \mug de complejo GST LKB1-STRAD\alpha-MO25\alpha purificado, 50 mM Tris/HCl, pH 7,5 y 0,1 mM EGTA, 0,1% (p/v) 2-mercaptoetanol, 10 mM de acetato de magnesio, 0,1 mM [\gamma^{32}P] ATP (\sim 200 cpm/pmol) y el péptido con lazo T (LSNMMSDGEFLRTSCGSPRRR, 10-2000 \muM). El ensayo se lleva a cabo durante 30 minutos a 30ºC, luego de terminado el pipeteo de la mezcla de reacción en un 1 cm cuadrado de papel p81, es lavada con 6 cambios de 250 ml de 50 mM de ácido fosfórico (2 minutos cada lavado), el papel lavado una vez con 200 ml de acetona se seca. La radiactividad unida al papel p81 fue cuantificada por conteo de Cherenkov. 1 unidad de actividad es la cantidad de enzima que cataliza la fosforilación de nmol de péptido por minuto.

El K_{m} para el péptido fue calculado y es 1,80 \pm 0,48 y los Vmax 23,4 \pm 3,5.

Ejemplo 4 Activación de cinasas AMPK - relacionada por LKB1

Otras 12 proteína cinasas (NUAK1, NUAK2, BRSK1, BRSK2, QIK, QSK, SIK, MARK1, MARK2, MARK3, MARK4 y MELK) están estrechamente relacionada con la proteína cinasa AMP activada (AMPK). Aquí demostramos que LKB1 puede fosforilar el lazo T de todos los miembros de la subfamilia AMPK, (no demostrado para MELK), incrementando su actividad > 50 veces. La actividad catalítica de LKB 1 y la presencia de M025 y STRAD son requeridas para activar todas las cinasas AMPK relacionadas. La mutación del lazo T con Thr fosforilado por LKB1 a Ala previene la activación, mientras que la mutación para Glu causa las formas activas constitutivas de muchas de las cinasas AMPK relacionadas. Los ensayos desarrollados para medir las actividades endogenas de las cinasas NUAK2, QIK, QSK, SIK, MARK1, MARK2/3 y MARK4 en células que expresan LKB1, y que son utilizadas para demostrar que las actividades de estas enzimas son notablemente reducidas en los fibroblastos LKB1 o en células HeLa que no expresan LKB1. Curiosamente, ni la actividad de LKB1, ni la de ninguna de las cinasas AMPK relacionadas son estimuladas por fenformina o AICA ribosida, dos medicamentos que producen la fosforilación y la activación de AMPK. Nuestros resultados indican que las funciones de LKB1 como una proteína cinasa ascendente madre, regula las actividades de cinasas AMPK relacionadas como con AMPK. Entre ellas, estas cinasas pueden mediar algunos de los efectos fisiológicos de LKB1, incluyendo su función de supresor de tumores.

La inspección del quinoma humano indica que hay 12 proteína cinasas (BRSK1, BRSK2, NUAK1, NUAK2, QIK, QSK, SIK, MARK1, MARK2, MARK3, MARK4 y MELK) que están estrechamente relacionadas con AMPK\alpha1 y AMPK\alpha2 (Figura 21A-B). La nomenclatura que empleamos "cinasas AMPK relacionadas " es sobre la base de la empleada por Manning y col. (Manning et al., 2002). MARK3 es también conocida como PAR1A o C-TAK1 (Peng et al., 1998; Spicer et al., 2003), NUAK1 como ARK5 (Suzuki et al., 2003b), NUAK2 como SNARK (Lefebvre et al., 2001) y QIK como SIK2 (Horike et al., 2003). El residuo de Thr con T lazo de AMPK\alpha1 y AMPK\alpha2 que son fosforilado por LKB1, y muchos de los residuos circundantes, son conservados en las cinasas AMPK relacionadas (Figura 21A & B). Esto indica que LKB1 también podría fosforilar lazo T del residuo Thr y regula las cinasas AMPK relacionadas en la misma manera que regula la actividad de PDK1 en un grupo de cinasas AGC relacionadas (Alessi, 2001). Las cinasas de MARK han sido propuestas que juegan un papel clave en el control de la polaridad de la célula y es conocido que esta regulada por la fosforilación de lazo T de su residuo Thr (Lrewes y Nurse, 2003; Spicer et al., 2003). Estudios en Drosophila indicaron que MARK3 podría encontarse LKB1 ascendente (Martin and St Johnston, 2003), pero el reciente trabajo en células de mamíferos refutó esta conclusión y sugirió que LKB 1 se encontrara ascendente de MARK3 y controla su actividad inicialmente (Spicer et al., 2003). Es poco conocido sobre la función o el mecanismo de regulación de AMPK remanente en las enzimas AMPK1 relacionadas. En este ejemplo aunque tratamos de investigar el papel que juega LKB1 en la regulación de la actividad de cinasa AMPK
relacionada.

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Resultados

Activación de cinasas AMPK relacionadas por el complejo LKB1. Se clona y expresa en E. coli las versiones de longitud completa de todas las doce cinasas AMPK relacionadas y el ensayo desarrollado para estas enzimas que empleaban el sustrato de péptido AMARA de AMPK para AMPK (Dale et al., 1995), que no es fosforilado por el complejo de LKB1 (JML, datos no indicados). Encontramos que todas las cinasas AMPK relacionadas purificadas de E. coli, fosforilando este péptido que posee actividad de partida baja < 1 U/mg (1 unidad = 1 nmol de péptido fosforilado por minuto), con la excepción de MELK, que tiene una actividad de \sim 40 U/mg (Figura 21). Luego de la incubación de las cinasas AMPK relacionadas con el complejo LKB1:STRAD:MO25 y MgATP, la actividad de las cinasas relacionadas AMPK, se incrementa de 50 a 200 veces, excepto MELK cuya actividad apenas duramente se incrementa (Figura 21). LKB1 catalíticamente inactivo complica las cinasas relacionadas, que indican que la actividad de cinasa de LKB1 es requerida en STRAD\alpha y MO25\alpha por falla para incrementar la actividad base de AMPK, indicando que es requerida la actividad de LKB1 (Figura 21).

Activación de cinasas relacionadas con AMPK por LKB1 requiere STRAD y MO25. Para determinar la importancia de las subunidades STRAD y de M025 en permitir que LKB1 active cinasas de AMPK relacionadas, expresamos GST - marcado LKB1, FLAG - marcado STRAD\alpha/\beta y myc-marcado MO25\alpha/\beta en varias combinaciones en células 293, y purificado por afinidad los complejos sobre glutatión-Sepharose (Figura 22). Los complejos purificados fueron incubados en presencia de MgATP con cinasas AMPK relacionadas y su activación fue medida. LKB1 sobre sí mismo no activó ninguna cinasa de AMPK relacionada significativamente (Figura 22, comparación de carriles 1 y 14). El mismo resultado fue obtenido con LKB1 que había sido expresado con MO25\alpha ó MO25\beta (Figura 22, carriles 4 y 5). Esto era de esperar, ya que estas proteínas no interactúan con LKB1 en ausencia de STRAD\alpha/\beta (Ejemplo1; Boudeau et al., 2003a). Un complejo LKB1:STRAD\alpha da una activación pequeña (Figura 22, comparación de carriles 1 y 2), pero un complejo heterotrimerico que contiene LKB1, STRAD\alpha ó STRAD\beta, y MO25\alpha o MO25\beta es requerido para obtener una activación grande (Figura 22, carriles 6 a 9). Como previamente fue reportado por AMPK\alpha1 (Figura 22 y Ejemplo 2; Hawley et al., 2003), todas las cinasas de AMPK relacionadas fueron activadas más eficientemente por el complejo LKB1:STRAD\alpha: MO25\alpha, aunque la efectividad relativa de diferentes complejos heterotrimerico variaba de sustrato a sustrato (Figura 22). Los complejos heterotrimerico que contienen una mutante inactiva catalíticamente de LKB1 es capaz de activar cualquier enzima (Figura 22, carriles 10-13). Debe ser indicado que cuando las isoformas de STRAD se expresan con LKB1 en ausencia de MO25, la cantidad de STRAD precipitado con LKB1 es reducido notablemente (Figura 22, comparación de carriles 2 y 3 con carriles 6 y 7), como en M025 es requerido para estabilizar el complejo LKB1:STRAD (ejemplo 1; Boudeau et al., 2003a). El complejo LKB1 fosforilado de cinasas AMPK relacionadas en el lazo de activación. Como el complejo LKB1 fue mostrado previamente para fosforilar específicamente AMPK\alpha1 en su lazo de activación en Thr172, hemos mutados primero el lazo T del residuo equivalente en la cinasa AMPK relacionada (Figura 21A & B) con Ala, y evaluar cómo se afecta la fosforilación de estas enzimas junto al complejo LKB1. Demostramos que las cinasas de AMPK relacionadas tipo salvaje son fosforiladas por el complejo de LKB1 y la mutación hecha en el lazo T del residuo de Thr con Ala abolido o la fosforilación se reduce significativamente (Figura 23). También llevamos a cabo el análisis detallado del sitio de fosforilación de BRSK2 inactivo catalíticamente y la mutante NUAK2 que han sido fosforilada in vitro por el complejo LKB 1 (figura 30). Las proteínasBRSK2 y NUAK2 marcadas conP fueron digeridas con tripsina y los péptidos resultantes separados por cromatografía en una columna C_{18}. Los péptidos más importantes marcados con ^{32}P fueron analizados por espectrometría de masa y por secuenciación de Edman de fase sólida MALDI-TOF-TOF con lo que se demostraba que estas enzimas fueron fosforilada a su lazo T del residuo Thr (Figura 30).

Fosforilación de lazo T activa cinasas relacionadas con AMPK. Para estudiar el papel que tiene la fosforilación del lazo T de BRSK1, BRSK2, NUAK1, NUAK2, QIK, QSK, SIK y MELK, juega en su regulación, el lazo T de los residuos Thr de estas enzimas que fueron mutadas a cualquier Ala para prevenir la fosforilación, o Glu para la fosforilación mímica. En todos los casos, la actividad fundamental de las mutantes de Ala fue baja y su actividad no incrementó el complejo 1 (Figura 24) por incubación con el LKB1. Por el contrario, la actividad base de las mutantes Glu fue similar a la enzima fosforilada por LKB1 de tipo salvaje, y no se incrementa más adelante, luego de la incubación con el complejo LKB1 y MgATP (Figura 24). En el caso de MELK, la mutante Ala posee la actividad baja y la mutante Glu fue de actividad similar a la enzima de tipo salvaje, sugiriendo que MELK de tipo salvaje (de la misma manera que otras cinasas AMPK relacionadas) requiría la fosforilación de lazo T para la actividad. Como MELK de tipo salvaje se expresó activa en E. coli, MELK puede poder catalizar la fosforilación de su propio lazo T del residuo Thr. Consistente con esto, el análisis MALDI TOF-TOF de MELK tipo salvaje que se expresa en E. coli determina que el lazo T es efectivamente fosforilado (Figura 30C).

Fosforilación y activación de cinasa Mark por LKB1. Los estudios previos han revelado que MARK3 y la cinasa MARK3, además de ser fosforilada en el lazo T del residuo Thr, son también fosforilados en un residuo de Ser cercano (Figura 21A y B y (Drewes et al., 1997; Johnson et al., 1996; Timm et al., 2003)). Mapeo péptidico de MARK3 inactivo catalíticamente fosforilado por el complejo de LKB1, reveló que tanto residuos Thr211 como Ser215 dentro del lazo T fueron fosforilados (Figura 25A). Curiosamente, la mutante de MARK3 inactiva catalíticamente [T211A] no esta fosforilando a Ser215 por LKB1, pero la mutante MARK3 inactiva catalíticamente [S215A] todavía esta fosforilado Thr211 (Figura 25A). Investigamos cómo la mutación de lazo T del residuo Ser ó Thr afecta la activación de MARK3 por el complejo LKB1 (Figura 25C). La mutante MARK3 [T211A] no pudo ser activada por el complejo LKB1 pero la mutante de MARK3 [S215A] fue activada en una pequeña extensión. La mutante MARK3 [T211E] posee solamente \sim 15% de la actividad de la enzima de tipo salvaje activada por el complejo LKB1 y no pudo ser activada más adelante por LKB 1. La mutante MARK3 [S215E] esta inactiva y no pudo ser activada por LKB 1 (Figura 25C). Como era de esperar, también descubrimos que la mutación de lazo T de Thr por Ala en MARK1, MARK2 y MARK4 previno su activación por LKB1 (Figura 25D a F). La mutación del lazo T del residuo Thr para Glu en MARK1, MARK2 y MARK3, resultó en ninguna activación o solamente en una pequeña activación de estas enzimas (Figura 25D a F). Por el contrario, la mutación equivalente en MARK4, incrementa la actividad infinitamente (Figura 25F). Estudios de mapeo péptidico y espectrometria de masa MALDI TOF-TOF demuestran que LKB1 fosforila lazo T de MARK4 en solamente el residuo Thr y no en el residuo Ser (Figura 25G y Figura 30C).

Identificación de sustratos de péptido para LKB1. Evaluamos si el complejo LKB1 podía fosforilar los péptidos que rodean el lazo de activación de AMPK, BRSK2, NUAK2, SIK, MARK3 y MELK. Todos los péptidos estan fosforilados, pero con diferentes eficiencia (figura 26A). La secuenciación de Edman en fase sólida confirma que cada péptido fue fosforilado por LKB1 específicamente en el el lazo T del residuo Thr (figura 26B). El péptido sustrato óptimo derivado del lazo T de NUAK2 fue fosforilado por LKB1 con un valor de Km 50 \muM y fue mejor sustrato que el péptido derivado del lazo T de AMPK (Km, 1,4 mM) (figura 26A). El péptido MELK es el sustrato más pobre. También ensayamos las diferentes combinaciones del complejo LKB1 STRAD y MO25 usado en la figura 22, con péptidos con el lazo T como sustrato, y el patrón de actividad de LKB1 se refleja en lo observado cuando se usan proteínas de longitud completa (comparación de la Figura 22 y Figura 26C). Éstos resultados demuestran que los péptidos del lazo T pueden ser sustratos tan auténticos para medir la actividad de LKB1 en un ensayo fácil de un solo paso. El péptido NUAK2 de lazo T fue nombrado LKBtido.

Papel de LKB1 en la regulación de cinasas AMPK relacionadas en fibroblastos. Para investigar el papel de LKB1 en la regulación de las cinasas AMPK relacionadas en células intactas, generamos anticuerpos contra secuencias específicas del péptido en las doce cinasas AMPK relacionadas. La capacidad de estos anticuerpos para inmunoprecipitar la forma activa de cinasa de AMPK relacionada fue ensayada empleando lisados de células HEK-293, en el que las cinasas han sido expresadas y encontradas activas (datos no indicados). Usando este enfoque se pueden desarrollar anticuerpos que inmunoprecipiten de forma selectiva cinasas AMPK relacionadas exceptuando MARK2 y MARK3, cuya actividad fue ensayada usando un anticuerpo comercial que inmunoprecipita ambas cinasas, pero no MARK1 y MARK4 (datos no indicado). Usando los anticuerpos específicos, podíamos inmunoprecipitar y ensayar NUAK2 expresado endógenamente, QIK, QSK, SIK MARK1, MARK2/3 y MARK4 en fibroblastos en estado embrionario de ratón LKB1^{+/+} (MEFs) (Figura 27). Luego comparando las actividades de estas cinasas inmunoprecipitadas de LKB1^{+/+} y LKB1^{-/-} MEFs, descubrimos que la actividad de NUAK2, QIK, QSK, SIK, MARK1 y MARK4 es reducida entre 7 hasta 35 veces en el LKB1^{-/-} MEFs Figura 27). La actividad de MARK2/3 combinada es reducida \sim 3-veces en LKB1^{-/-} MEFs (Figura 27G). La inmunotransferencia demostró que la actividad reducida de cinasas AMPK relacionada en células LKB1^{-/-} no es provocada por un decrecimiento en la expresión de las enzimas, y que tampoco estaban presente a los mismo niveles reducidos ligeramente en las células knockout.

Curiosamente, y por el contrario con AMPK\alpha1 (Figura 27A), las cinasas AMPK relacionadas ensayadas, no son estimulada significativamente con fenformina (Figura 27B a 27H). Esto indica que la fenformina no esta provocando la activación de AMPK por LKB1 activado. Consistente con esto, hemos demostramos que al incrementar la dosis de fenformina se activó progresivamente AMPK (y se incrementa la fosforilación de Thr172), pero no estimulamos la actividad LKB1 (Figura 28A). El medicamento ribosida de 5-aminoimidazol-4-carboxamida (AICA) activa AMPK en células intactas siendo tomada en cinasa de adenosina y cambiada a monofosfato de AICA ribosida, que imita el efecto de AMP sobre el sistema de AMPK (Corton et al., 1995). AICA ribosida activó AMPK en LKB1^{+/+} MEFs, pero se deja de activar cualquiera de las cinasas AMPK relacionadas (Figura 28B).

Expresión de LKB1 restaura la activación de cinasas AMPK relacionadas en células HeLa. Para obtener las pruebas genéticas adicionales de que LKB1 actúa como un regulador ascendente de las cinasas AMPK relacionada, comparamos la actividad de cinasas AMPK relacionada en células HeLa, que no hacen expresar LKB1, con células HeLa que expresan establemente el tipo salvaje o LKB1 inactivo cataliticamente (Ejemplo 2; Hawley et al., 2003; Sapkota et al., 2002). En células HeLa control no se expresa LKB1, o en células que expresan LKB1 inactivo cataliticamente, la actividad de NUAK2, QIK, QSK y SIK sería 20 a 40 veces menor que el observado en células HeLa (Figura 29B a 29E) que expresan LKB1 de tipo salvaje. La actividad de MARK1, MARK2/3 combinada y la actividad de MARK4 en células HeLa control estan aproximadamente \sim2-3 veces menor que en las células que expresan LKB1 (Figura 29F a 29H). Contrario con AMPK\alpha1 (Figura 29A), ninguna de las cinasas AMPK relacionada fue activada significativamente cuando células HeLa estaban estimuladas con fenformina (Figura 29B a 29H).

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Discusión

En este ejemplo proporcionamos las pruebas que funciona LKB1 para regular la actividad de 1 de los 12 miembros de la familia proteína cinasas AMPK relacionadas. En sistemas de células libres determinamos que todas las cinasas AMPK relacionada testadas, con la excepción de MELK, son activados sobre 50 veces seguido de la fosforilación del lazo T de su residuo Thr, junto al complejo de LKB1:STRAD:MO25. En la caso de MELK, nuestros resultados indican que esta enzima requiere fosforilación de lazo T para la actividad, pero que puede fosforilar su lazo T del propio residuo. A nuestro entender ésta es la primera demostración de que BRSK1, lo BRSK2, NUAK1, NUAK2, QIK, QSK, SIK tanto como enzimas MELK que pueden ser activado por fosforilación.

La mutación del residuo T1 de lazo T por Ala previno la activación de todas estas enzimas junto al complejo LKB1, mientras que su mutación para Glu es suficiente para activar BRSK1, BRSK2, NUAK1, NUAK2, SIK, QIK, QSK y MARK4 a las actividades específicas similares que las observadas para las formas fosforiladas por LKB1 de estas enzimas (Figura 24). Esta última conclusión podía ser explotada en el futuro en estudios de sobre expresión o impacto ("knocks-in") para introducir las formas activas constitutivas de estas enzimas en células para examinar su papel celular.

El trabajo previo ha indicado que MARK2 y MARK3 fueron fosforilada en el lazo T del residuo Thr tanto como en un residuo cercano Ser (Drewes et al., 1997; Johnson et al., 1996). El lazo T fosforilado del residuo Ser en MARK2/MARK3 es conservado en AMPK\alpha1, AMPK\alpha2 y todas las cinasas AMPK relacionada (Figura 21A & B), pero por lo menos para AMPK\alpha1 no hay pruebas de que este residuo sea fosforilado in vivo (Woods et al., 2003b). Nuestros análisis (Figura 25A y 25B), tanto como eso en un estudio reciente (Timm et al., 2003), muestra esta fosforilación de la cinasa Mark de lazo T del residuo Thr, hace el papel más importante en regular la actividad de esta clase de cinasa. El complejo LKB1 fosforilado en una mutante MARK3 inactiva cataliticamente tanto del lazo T del residuo Thr como Ser (Figura 25A). Sin embargo, el péptido aislado del lazo T MARK3 es solamente fosforilado por LKB1 en el residuo de Thr (Figura 26), significando que la secuencia principal del péptido no es suficiente para permitir que LKB1 este fosforilado en el residuo Ser. El encontrar esa mutación del Thr-211 a Ala del lazo T sobre MARK3 previene la fosforilación de Ser215 junto al complejo LKB1, lo que indica que la fosforilación de Thr211 es requerida para la fosforilación de Ser215. MARK4 puede ser regulada de manera diferente cuando los estudios de péptido correspondientes indican que MARK4 es solamente fosforilado en el lazo T de Thr por LKB1 (Figura 25G), y esa mutación del lazo T de Thr a la Glu aumenta la actividad mucho más que la observada para otra isoformas MARK (Figura 25F). Antes fue reportado que para MARK2 esa mutación del lazo T para Glu incrementó su actividad específica en 3 veces (Timm et al., 2003) y hemos hecho conclusiones similares con esta mutación de forma que incrementa 2,2 U/mg de actividad MARK2 en 6,7 U/mg (Figura 25D). Sin embargo, por lo contrario TAO1 solamente activa MARK2 en 10 veces (Timm et al., 2003), el complejo LKB1 aumenta 200 veces la activación de MARK2, se establece que la mutación de lazo T MARK2 Thr a Glu no activa notablemente la
cinasa.

Como se observa AMPK\alpha1 y AMPK\alpha2 para la activación de AMPK (Hawley et al., 2003), la presencia de STRAD y subunidades de M025 es esencial para LKB1 que activa todas las cinasas AMPK relacionada en el ensayo de célula libre. Hay pruebas considerables de que muchas cinasas de proteína dependen de los residuos, número de sitios de acoplamiento, que se encuentran en el exterior del núcleo catalítico, para llevar la cinasa y el sustrato junto. Es posible que las subunidades STRAD y M025 tengan un papel facilitador en la interacción, y por tanto en la fosforilación por LKB1. La conclusión de que el complejo de LKB1:STRAD:MO25 fosforilando el péptido de AMPK de lazo T corto y la cinasa AMPK relacionada, en una proporción mayor que LKB1, indicando que las subunidades STRAD y el M025 activan directamente LKB1. Sin embargo, este resultado elimina la posibilidad de que STRAD y MO25 tampoco tienen un papel en el reconocimiento del sustrato.

Empleando MEFs LKB1^{-/-} y/o células HeLa que carecen de LKB1, que fueron capaz de demostrar que las actividades de NUAK1, NUAK2, QIK, QSK, y SIK expresadas endógenamente son 7 a 40 veces menores que en MEFs LKB1^{+/+} ó células HeLa que expresan LKB1 establemente de tipo salvaje. Esto proporciona las pruebas genéticas de que LKB1 esta en proporción limitada en la activación de estas enzimas en células intactas. Sin embargo, nuestros datos no eliminan la posibilidad de que otras cinasas puedan regular la actividad de las cinasas AMPK relacionada in vivo además de LKB1. Recientemente la cinasa TAO1 fue purificada de cerebro de cerdo como la actividad muy importante que fosforila el residuo de lazo T de Thr de MARK2, resultando en su activación (Timm et al., 2003). Aunque TAO1 también activa MARK2 en estudios sobre expresión (Timm et al., 2003), hasta ahora no ha sido reportada prueba genética que demuestre cómo afectó la actividad de la familia cinasa de MARK in vivo en ausencia de TAO1. Tales pruebas pueden ser dura de adquirir, cuando las células mamíferas poseen 3 isoformas de TAO estrechamente relacionadas (Manning et al., 2002). La ausencia de anticuerpos inmunoprecipitados específicos quiere decir que no fueron capaces de establecer como una deficiencia de LKB1 puede afectar las actividades individuales de MARK2 o MARK3. Sin embargo, la conclusión de que la actividad combinada de MARK2 y MARK3 en células HeLa control y LKB1^{-/-} es sólida, implica que otras cinasas, como TAO1, pueden regular las actividades de estas enzimas. Debe ser observado que LKB1 y TAO1 no comparten homología de secuencia de aminoácido y se encuentran en regiones distintas del dendrograma de cinasa humano (Manning et al., 2002). TAO1 pertenece al grupo de cinasas STE20 y aunque no se conoce si esto es importante estan relacionado con STRAD\alpha y STRAD\beta.

La familia de cinasas MARK (MAP, cinasa que regula la afinidad microtubular) es de los miembros de la familia cinasa AMPK relacionada más estudiados y se piensa que tiene un papel clave en establecer la polaridad de la célula. Por ejemplo, los estudios genéticos indican que homologos de MARK controlan partición de zigote de C. elegans (Guo y Kemphues, 1995) y la formación del eje en estado embrionario en Drosophila (Shulman et al. 2000; Tomancak et al., 2000). En células neuronales, cinasas MARK fosforilando las proteínas asociadas al microtubular neuronal Tau, resultan en la desestabilización de microtubulares (Drewes et al.., 1997). Curiosamente, el homólogo de LKB1 de mamífero en C. elegans (Watts et al., 2000), se denomina PAR4, se identifica como un miembro de la familia del gen expresado maternalmente PAR (partición defectuosa), se requiere para establecer la polaridad de la célula durante el primer ciclo de embriogénesis de C. elegans. (Kemphues et al., 1988). Las mutaciones letales maternas en el gen que codifica para PAR4 en C. elegans, ha demostrado que afecta algunos aspectos de la polaridad de la célula (Morton et al., 1992). Éstos resultan en fenotipos similares a ésos observados en mutantes C. elegans del gen PAR1, que codifica al homologo de MARK3 (Guo y Kemphues, 1995). Más reciente, ambos homologos de LKB1 humano en Drosophila (Martin y St Johnston, 2003) como en Xenopus (Ossipova et al., 2003) fueron demostrados que tienen un papel importante en regular la polaridad de la célula.

Originalmente, fue sugerido que LKB1 de Drosophila funciona descendente de PAR1/MARK3, cuando la sobre expresión de LKB1 de Drosophila suprimen la polaridad de mutantes del fenotipo PAR1/MARK3 (Martin y St Johnston, 2003). Sin embargo, en células HeLa que no expresan LKB1, MARK3 se encuentra que existe un estado fosforilado hacia dentro de LKB1 promoviendo la fosforilación de MARK3 en su lazo T (Spicer et al., 2003), esto significa que LKB1 es ascendente a MARK3. Una explicación que conciliaría la discrepancia evidente entre los estudios en Drosophila y mamíferos sería si la sobre expresión de LKB1 en Drosophila suprime el fenotipo de polaridad de las mutantes de PAR1/MARK3, hasta la activación de otras cinasas AMPK relacionada, que pueden compensar la pérdida de la función de PAR1/MARK3.

Mucho menos se conoce respecto a la función de otras cinasas AMPK relacionada, es decir BRSK1, BRSK2, NUAK1, NUAK2, QIK, QSK y SIK. El anterior Northern blotting de NUAK1, NUAK2, QIK y SIK respecto a la función de otros grupos (ver abajo) y análisis de los clones EST (Tabla 2), esto indica que las cinasas AMPK relacionada con la excepción de BRSK1, BRSK2 y MELK son comunmente expresadas en muchos tejidos. Los clones EST de BRSK1 y BRSK2 son principalmente obtenidos de tejidos neuronales, después del análisis immunoblot de una variedad de tejidos de rata, estas enzimas solamente son observadas en el cerebro y en niveles bajos en los testículos (K.Sakamoto, resultados no publicados). Hasta la fecha, MELK (cinasa de cierre de leucina en estado embrionario maternal) ha sido reportado solamente expresado durante embriogenesis en mamíferos, con una expresión más fuerte detectada durante la maduración de los oocitos y solamente en el desarrollo de preimplantación (Heyer et al., 1999; Heyer et al., 1997). Aunque nuestros anticuerpos levantados contra BRSK1, BRSK2 y MELK fácilmente inmunoprecipitan las enzimas recombinantes, estas no son capaces de detectar su actividad en MEFs o células HeLa (OG, datos no demostrados). SIK (cinasa inducible) fue clonado de las glándulas suprarrenales de ratas alimentadas con una dieta alta en sales (Wang et al., 1999). El ARNm de SIK también se produce por despolarisación de la membrana en el cerebro (Feldman et al., 2000) y los estudios recientes han indicado que cuando SIK se sobre expresa en células, podría tener un papel en la esteroidogenesis (Takemori et al., 2003). El ARNm expresando QIK (también denominada SIK2), es mayor en tejido adiposo y, en estudios de sobre expresión, QIK fue reportado para fosforilar IRS1 humano sobre Ser794 (Horike et al., 2003), el residuo equivalente a Ser789 en IRS1 de rata, demostrando que es fosforilado por AMPK (Jakobsen et al., 2001). En otros estudios de sobre expresión, NUAK1 (ARK5) fue demostrado que reprime la apoptosis producida por algunos estímulos, incluyendo la carencia de nutriente (Suzuki et al., 2003a). Además, ha sido reivindicado que Akt/PKB fosforilando NUAK1 en el sitio C-terminal del dominio catalítico, resulta en la activación de 3 veces de la enzima (Suzuki et al., 2003b). NUAK2 (SNARK) es más expresado en el riñón, y su actividad según se reporta estimulada por células en carencia de glucosa (Lefebvre et al., 2001, Susuki et al., 2003b). Para nuestro conocimiento, estudios previos no han estado dirigidos al papel de BRSK1, BRSK2 y QSK.

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TABLA SUPLEMENTARIA Distribución de tejidos de EST's que codifican para las cinasas relacionadas con AMPK indicadas

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Evidentemente un trabajo adicional tiene que ser llevado a cabo para la posterior caracterización del mecanismo de regulación y función de las cinasas AMPK relacionada. Nuestros estudios indican que, por lo menos en MEFs y células HeLa que expresan LKB1 establemente, las cinasas AMPK relacionada no fueron activadas en respuesta al medicamento fenformina o AICA ribosida, contrario con AMPK. Esto indica que los efectos anti-diabético beneficiosos de la fenformina y la metformina pueden estar mediados a través de la activación de AMPK en vez de las cinasas AMPK relacionada. La conclusión de que las cinasas AMPK relacionada no son activados junto a la fenformina o AICA ribosida, es compatible con nuestras conclusiones que estos tratamientos no activan LKB1 directamente en LKB1^{+/+} MEFs (Figura 28A) o en células COS7 (Woods et al., 2003a). En estudios futuros es importante definir los estímulos fisiológicos que causan la activación de las cinasas AMPK relacionada, y de determinar si estas enzimas, de la misma manera que AMPK, poseen subunidades reguladoras que controlan su activación.

Un número importante de las formas heredadas de PJS se encuentran en ciertas familias que no hacen las mutaciones indicadas en el gen de LKB 1 (Buchet-Poyau et al., 2002; Resta et al., 2002), indicando que hay un segundo punto causativo para PJS. Evidentemente ahora es crítico encontrar sí las familias PJS expresan la proteína LKB1 normal que tiene mutaciones en otras cinasas relacionadas con AMPK.

Como conclusión, hemos demostrado que las funciones de LKB1 como una proteína cinasa ascendente activa 11 cinasas de AMPK relacionada y además de AMPK\alpha1 y AMPK\alpha2. Es posible que estas enzimas medien algunos de los efectos fisiológicos anteriormente atribuidos a LKB1 y que una o más de estas cinasas podría ellas mismos funcionar como represores de tumores.

Materiales. Tabletas del cóctel inhibidores de proteasas y tripsina de grado secuenciuador fueron obtenidas de Roche. La N-octilglucosida es de Calbiochem, y los reactivos de cultivo de tejido son de Life Technologies. Los sueros bovinos fetales libre de Tetraciclina (FBS) son de Perbio, y otros reactivos de cultivo de tejido son de Biowhittaker. Geles de 4-12% y 10% de Bis-Tris poliacrilamida que fueron obtenidos de Invitrogen; el papel de fósforocelulosa de P81 era de Whatman; Fenformina de Sigma y AICA ribosida de TorontoXX. [\gamma^{32}P] ATP, Sepharose glutatión, proteína G-Sepharose fue comprada de Amersham Bioscience. Todos los péptidos fueron sintetizados por el Dr. Graham Bloomberg en la universidad de Bristol.

Anticuerpos

Los siguientes anticuerpos fueron cultivados en carneros y purificados por afinidad sobre el péptido antígeno apropiado:

BRSK1 (MVAGLTLGKGPESPDGDVS, residuos 1-20 de humano BRSK1), BRSK2 (LSWGAGLKGQKVATSYESSL, residuos 655-674 de humano BRSK2), NUAK1 (MEGAAAPVAGDRPDLGLGAPG residuos 1-21 de humano NUAK1), NUAK2 (TDCQEVTATYRQALRVCSKLT, residuos 653-673 de humano NUAK2), QIK (MVMADGPRHLQRGPVRVGFYD, residuos 1-21 de humano QIK), SIK (MVIMSEFSADPAGQGQGQQK, residuos 1-20 de humano SIK usado for inmuno precipitación from humano cells), SIK (GDCEMEDLMPCSLGTFVLVQ, residuos 765-784 de humano SIK usado por inmuno precipitación de células de ratón), QSK (TDILLSYKHPEVSFSMEQAGV, residuos 1349-1369 de humano QSK), MARK1 (SGTSIAFKNIASKIANELKL, residuos 776-795 de humano
MARK1), MARK4 (MSSRTVLAPGNDRNSDTHGT, residuos 1-20 de humano MARK4), MELK (MKDYDELLKYYELHETIGTG, residuos 1-20 de humano MELK). El anticuerpo AMPK\alpha1 específico empleado en las Figuras 27, 28B y 29 que fue levantado contra el péptido (CTSPPDSFLDDHHLTR, residuos 344-358 de AMPK\alpha1 de rata) mientras el anticuerpo que reconocía tanto AMPK\alpha1 como AMPK\alpha2 empleado en la Figura 28A, fue levantado contra el péptido (residuos 252 a 264 de CDPMKRATIKDIRE o AMPK\alpha1 de rata). Los anticuerpos contra péptidos MARK2 y MARK3 que levantamos fueron específicos cuando inmunoprecipita a otras isoformas MARK. El anticuerpo de MARK3 Upstate Biotech (anti c-TAK # 05-680), levantado contra la proteína MARK3 humano fue encontrado para inmunoprecipitar MARK2 tan eficientemente como MARK3 pero no inmunoprecipita MARK1 y MARK4 (datos no indicados). Los anticuerpos fosforoespecíficos reconocen AMPK fosforilado en el lazo-T fueron generados como se describió anteriormente contra el péptido (residuos 168 a 180 de KFLRT (P) SCGSPNYA de AMPK\alpha1 de rata) (Sugden et al., 1999). El anticuerpo LKB1 usado por inmmunoblotting fue levantado en carnero contra LKB1 de ratón (Sapkota et al., 2001) y esto por inmunoprecipitación fue levantado en carnero contra la proteína LKB1 humano (Boudeau et al., 2003). El anticuerpo monoclonal que reconoce que el epitope tag de HA es de Roche, el anticuerpo monoclonal que reconoce los epitopes GST y FLAG son de Sigma. Los anticuerpos anti myc fueron preparados por precipitación de sulfato de amonio de medio de células de hibridoma Myc1-9E10 creciendo en RPMI 1640 con medio complementado con 2 mM de glutamina y 15% (v/v) suero bovino fetal. Anticuerpos secundarios acoplados a peroxidasa horseradish usado por inmunotransferencia fueron obtenidos de Pierce.

Métodos generales y tampones. Digestiones con enzimas de restricción, ligandos de ADN, y otros procedimientos de ADN recombinante fueron llevados a cabo usando protocolos estandares. Todas las mutagenesis fueron llevadas a cabo usando el QuikChange dirigido al sitio por el método de mutagenesis (Stratagene). Los conceptos de ADN usados por transfección fueron purificadas de E. coli DH5\alpha usando el conjunto mega plámido Qiagen de acuerdo con el protocolo del fabricante. Todas las construcciones de ADN fueron verificadas por secuenciación de ADN, que fue llevado a cabo por el servicio de secuenciación, la School of Life Sciences, University of Dundee, Scotland, UK, usando DYEnamic ET terminator chemistry (Amersham Biosciences) sobre Secuenciador ADN automatico Applied Biosystems. El tampón de Lisis contiene 50 mM Tris/HCl pH 7,5 1 mM de EGTA, 1 mM EDTA de 1% Triton-X 100 (w/v) , 1 mM ortovanadato de sodio, 50 mM fluoruro de sodio, 5 mM pirofosfato de sodio, 0,27 M de sacarosa, 0,1% (v/v) 2-mercaptoetanol y cóctel inhibidor de proteínasa de "Complete" (una tableta/50 ml). El tampón A contiene 50 mM Tris/HCl pH 7,5. 0,1 mM EGTA, y 0,1% (v/v) 2-mercaptoetanol. El tampón de muestra de SDS contiene 50 mM de Tris/HCl pH 6,8, 2% (w/v) SDS, 10% (v/v) glicerina, 0,005% (w/v color azul bromofenol y 1% (v/v) 2-mercaptoetanol.

Clonación de cinasas relacionadas con AMPK

NUAK1. Para obtener la región que codifica para NUAK1 cADN humanoo (NCBI Acc. NM 014840) una reacción de PCR fue llevada usando una librería de ADNc de cerebro (Clontech) como plantilla y el sense primer 5'-actgcagccctggagcccaggaagc-3' y el sense primer 5'-ctagttgagcttgctgcagatctccagcgc-3'. El producto PCR da como resultado para cubrir la región que codifica para NUAK1 desde los residuos de aminoácido 31-661. El ADNc pierde 31 aminoácidos del N-terminal y fue incluido en la plantilla 5' de otra reacción de PCR, luego HA tag fue añadida por PCR usando el sense primer 5'-ggggccgccgcgcctgtggcgggg-3' y el sense primer 5'-actagtgccaccatgta cccatacgatgtgc
cagattacgccgaa-3' y el sense primer de 5-ctagttgagcttgctgcagatc tccagcgc-3'. El producto PCR da como resultado fue ligado en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen), y subclonado como un fragmento de SpeI-NotI dentro pEBG2T (Sanchez et al., 1994) y como un EcoR1 - inserto EcoR1 en los vectores de expresión de pGEX6P-1 (Amersham).

NUAK2. La región que codifica para ADNc humano NUAK2 (NCBI Acc NP 112214) con un HA tag en el N-terminal, es amplificado por PCR de 6718982 de clon de EST (NCBI Acc CA487493) con plantillas 5'-actagtgccaccatg
tacccatacgatgtgc cagattacgccgagtcgctggttttcgcgcggcgctcc-3' y 5'-tcaggtgagctttgagcagaccctcagtgcctg-3'. El producto de PCR que da como resultado esta ligado en el vector de pCR2.1-TOPO, secuenciado, y clonado como un fragmento SpeI-Spe1 en pEBG2T y como un Inserto de de EcoR1-EcoR1 en vectores de expresión pGEX6P-1.

QIK. La región que codifica ADNc de QIK humano (NCBI Acc XM041314) con un HA tag en el N-terminal es amplificado desde consorcio IMAGEN clon EST 5495545 (NCBI. Acc BM799630) usando plantillas 5'-gcgtcgactacccatacgatgtgccagattacgccgtcat ggcggatggcccgag-3' ó 5'-gcactagttacccatacgatgtgccagattacgccgtcatggcggatggcccgag-3' para clonar en los vectores pGEX6P-3 y pEBG2T respectivamente, y la plantilla antisense primer 5'-gagcggccgctaatt
caccaggacatacccgttgtg-3'. Productos de PCR amplificados fueron ligados en el vector pCR2.1-TOPO, secuenciado, y clonado en un inserto SalI-NotI o SpeI-NotI en pGEX6P-3 ó pEBG2T respectivamente.

SIK. La región que codifica ADNc de SIK humano (NCBI. Acc NM 173354) con con un HA tag en el N-terminal es amplificado desde consorcio IMAGEN clon EST 4831049 (NCBI Acc NM 173354) usando las plantillas 5'-gcggatcc
tacccatacgatgtgcc agattacgccgttatcatgtcggagttcagcgcgg-3' y 5'-gagcggccgctcactgcaccaggacaaacgtgcc-3. Productos de PCR amplificados fueron ligados en el vector de pCR2.1-TOPO, secuenciado, y clonado en un inserto BamH1-Notl en pGEX6P-1 y pEBG2T.

MELK. La región que codifica ADNc de MELK humano (NCBI Acc NM014791) con con un HA tag en el N-terminal es amplificado desde consorcio IMAGEN clon EST 4547136 (NCBI Acc BC014039) usando las plantillas 5'-gcggatcctacccatacgatgtgcca gattacgccaaagattatgatgaacttctcaaatattatgaattacatg-3' y 5'-gtgcggccgcttataccttgcagctaga taggatgtcttcc-3'. El producto de PCR amplificado fue ligado en el vector pCR2.1-TOPO, secuenciado, y clonado en un inserto de BamH1-Not1 en pGEX6P-1 y pEBG2T.

BRSK1. Nucleotides 60-1010 de la región que codifica ADNc de BRSK1 humano (NCBI Acc. NM032430) es amplificado desde consorcio IMAGEN clon EST 6154749 (NCBI Acc BQ434571) usando las plantillas 1. 5'-ccacccc
cacccaccccagcacgc ccaatatgtgggcccctatcggctggagaagacgctgggcaaagg-3' y. 2. 5'-cgatgcagcctctcgcggtccctgaagcagc-3', nucleótidos 60-106 es añadido por plantilla 1. Nucleótidos 980-2337 de BRSK1 fue amplificado del mismo clon EST usando las plantillas 3. 5'-gctgcttcaggg accgcgagaggctgcatcg-3' y 4. 5'-tcagggcagaggggtcccgttggtggcc-3'. Cada producto de PCR fue ligado en el vector PCR2.1-TOPO y secuenciado. Una diferencia simple del nucleótido comparado con la secuencia de BRSK1 NM 032430 que está presente en el clon EST fue "Corregida" por mutagenesis dirigido al sitio en el clon PCR2.1-TOPO que contiene la mitad del 5' de BRSK1. El remanente del 5', 59 nucleótidos de BRSK1 y por la HA tag es añadido a la mitad del 5' de BRSK1 por PCR usando las plantillas 5. 5'-ggtgggggctctcccgcc
taccacctcccccacccccacccccacccaccccagcacgcccaat atg-3' y 6. 5'-ggatcctacccatacgatgtgccagattacgcctcgtccggggccaag
gagggaggtgggggctctc ccg cctacc-3'. El producto final de PCR fue ligado en el vector PCR2.1-TOPO y secuenciado. Superposición de PCR fue efectuado luego usando la mitad 5' y la mitad 3' de BRSK1 como plantillas y primer 7. 5 '-gcggatcctacccatacgatgtgcc-3' y 4 y el producto de PCR ligado en el vector de PCR2.1-TOPO y secuenciado. El ADNc de BRSK1 de longitud completa con el N-terminal HA tag es luego subclonado dentro de pGEX6P-1 y pEBG2T como un inserto de BamHI-BamHI.

BRSK2 La región que codifica ADNc de BRSK2 humano con un HA tag en el N-terminal (NCBI Acc AF533878) es amplificado desde consorcio IMAGEN clon EST 6144640 (NCBI. Acc BU193218) usando las plantillas 5'-ggatccgc
caccatgtacccata cgatgtgccagattacgccacatcgacggggaaggacggcggcgcg-3' y 5'-gcggccgctcagaggctactctcg tagctggtggccac
cttctggcccttaagccca-3'. El producto de PCR da como resultado que fue clonado en vector pCR2.1-TOPO, secuenciado, y clonado en un inserto de BamHI-NotI en vectores de pEBG2T y pGEX6P-1.

QSK. Nucleótidos 55-640 de la región que codifica ADNc de QSK humano (la secuencia obtenida de base de datos Sugen www.cinasa.com (Manning et al., 2002)) es amplificado desde consorcio IMAGEN clon EST 4396995 (NCBI Acc.BF983268) usando las plantillas 1. 5'-ggagccgggcccgcgggccgcctgctgcctccgcccgcgccggggtcccca gccgcccccgctgcc
gtgtcccctgcggccggccagccg-3' y 2.-5' tgaagaggttactgaaaccaaaatctgcta ttttgatattc-3', nucleótidos 55-110 es añadido por el primer 1. Los 54 nucleótidos restantes del 5' y el HA tag fue añadido por PCR usando las plantillas 3. 5'-gat
tacgccgcggcggcggcggcgagcggagctggcggggctgccggggccgggactgggggagccgggcccgcgggccgcctgctg-3' y 4. 5'-gcggatcc
tacccatacgatgtgccagattacgccgcggcggcggcggcga gcgg-3'. El producto de PCR final fue ligado en el vector PCR2.1-TOPO y secuenciado para producir clon QSK de pCR2.1. Los nucleótidos 610-865 de QSK son amplificados desde consorcio IMAGEN clon EST 6247938 (NCBI Acc BQ685213) usando las plantillas 5. 5'-atagcagattttggtttcagtaacctctt
cactcctgggcagctgctgaagacctggtgtggcag ccctcccta tgctgcacctgaactc-3' y 6. 5'-ctgtggacataaaaaatgggatgcggaactttcc-3', los nucleótidos 610-674 son añadidos por primer 5. El producto de PCR fue ligado en el vector de PCR2.1-TOPO y secuenciado. Una simple supresión del nucleótido en QSK por la posición 696 del marco de lectura abierto, que está presente en el clon EST, fue corregido por mutagenesis dirigida en el sitio para producir el clon 2 de QSK pCR2.1. Los productos de PCR de clones 1 y 2 de QSK de pCR2.1 fueron introducidos dentro por superposición en PCR usando las plantillas 4 y 6. Este producto (nucleótidos QSK 4-865 con HA tag) esta ligado en el vector PCR2.1-TOPO y secuenciado para producir el clon 3 QSK pCR2.1 de productos.

Los nucleótidos de QSK 832-4110 son amplificados desde el consorcio IMAGEN clon EST 360441 (NCBI. Acc AA015726) usando las plantillas 7. 5'-ggaaagttccgcatcc cattttttatgtccacag-3' y 8. 5'-gagcggccgcttacacgcctgcctgctc
catgc-3'. El producto de PCR fue ligado en el vector de PCR2.1-TOPO y secuenciado para producir el clon 4 de QSK de pCR2.1. Productos de PCR de clones 3 y 4 de QSK de pCR2.1 son introducidas por PCR usando las plantillas 4 y 8 para generar el ADNc de QSK de longitud completa con el N-terminal HA tag. El producto de PCR fue ligado en el vector PCR2.1-TOPO y secuenciado para producir clon 5 de QSK de pCR2.1. El clon 5 QSK de longitud completa con el N-terminal HA tag fue revelado de pCR2.1 desde el clon 5 QSK como un inserto de BamH1-BamH1 dentro de los vectores pEBG2T y pGEX6P-1. Para generar las mutaciones de lazo T en el QSK, las mutagenesis fueron llevadas a cabo sobre el clon 3 de QSK de pCR2.1, seguida por supeposición en PCR para generar las mutantes de longitud completa de QSK. El producto de PCR superpuesto fue ligado en PCR2.1-TOPO, secuenciado y clonado dentro de pEBG2T y pGEX6P-1, los insertos BamH1-BamH1.

MARK1. Nucleótidos 4-1078 de la región que codifica ADNc MARK1 humano (NCBI. Acc NM 018650) con un HA tag en el N-terminal fue amplificada de una librería de ADNc de cerebro humano que usa las plantillas 5'-gcgaattctacccatacgatgtgc cagattacgcctcggcccggacgccattgc-3' y 5'-catcatacttctgatttattaaggcatcatttatttc-3'. Nucleótidos 1042-2388 de MARK1 fue amplificado desde el clon EST 48109 del consorcio IMAGE (NCBI Acc H11850) usando 5'-gaaataaatgatgccttaataaatcagaag tatgatg-3' y 5'-gagtcgacttacagcttaagctcatttgctatttttgatgc-3'. Los productos PCR amplificados son introducidos por PCR para generar ADNc MARK1 HA identificado de longitud completa. El producto de PCR fue ligado en el vector PCR2.1-TOPO, secuenciado, y subcloned como un Inserto de EcoR1-Salt1 en pGEX6P-1. El MARK1 de HA titulado de longitud completa fue amplificado desde el clon MARK1 vector pCR2.1-TOPO que fue secuencialmente clonada dentro de pEBG2T con un inserto Kpn1-Not1 usando plantillas 5'-gcggtacc
tacccatacgatgtgccagattacgcctcgg cccggacgccattgc-3' y 5'-gagcggccgcttacagcttaagctcatttgctatttttgatgc-3'.

MARK2. La región de codificación de MARK2 ADNc humano (Acc de NCBI. NM 004954) es amplificado desde el clon EST 4591688 del IMAGE (NCBI Acc BG419875) usando las plantillas de detección para los que 5'-gcgtcgactacc
catacgatgtgccagatt acgccattcggggccgcaactcagcc-3' o 5'-gcactagttacccatacgatgtgccagattacg ccattcggggccg caactcagcc-3' por clonación siguiente en los vectores pGEX6P-3 y pEBG2T respectivamente, y la plantilla de antidetección 5'-gagcggccgcttaaagcttcagctc gttgg ctattttgg-3'. Los productos de PCR amplificados son ligados en vector PCR2.1-TOPO, secuenciados, y clonados como un Inserto SalI-NotI o de SpeI-NotI en vectores pGEX6P-3 o pEBG2T respectivamente.

MARK3. La región que codifica ADNc de MARK3 humano (NCBI. Acc NM 002376) con un HA tag en el N-terminal es amplificado con IMAGE desde el clon EST 5104460 (NCBI Acc BI223323) usando las plantillas 5'-gcggccg
cagccaccatg tacccatacgatgtgccagattacgcctccactaggaccccattgccaacggtga-3' y 5'-gcggccgcttacagcttta gct cattggcaattttg
gaagc-3'.

El producto de PCR fue clonado en el vector de pCR2.1-TOPO, secuenciado, y clonado como un Inserto de Not1-Not1 en los vectores pEBG2T y pGEX6P-2.

MARK4. Para obtener la región que codifica para la longitud completa de ADNc de MARK4 humano (NCBI Acc.AK075272) dos clones EST fueron usados como plantillas para las reacciones de PCR. Los primeros 228 aminoácidos HA tag en el N-terminal es amplificado desde consorcio IMAGE clon EST 6301902 (NCBI Acc BQ709130) usando las plantillas 1. 5'-agatctgccaccatgtacccatacgatgtgccagattacgcc tcttcgcggacggtgctggccccggg-3' y 2. 5'-tgccctgaaacagctccggggcggc-3'. La región restante que codifica es amplificada desde el consorcio IMAGE clon EST 5503281 (NCBI. Acc BM467107) con las plantillas 3. 3. 5'-gggatcgaagctggacacgttctgc-3' y 4. 5'-gcggccgctcacactccaggg
gaatcggagcagccgggg-3. Los productos de PCR resultantes fueron usados como plantillas en una reacción de PCR con las plantillas 1 y 4. El producto de PCR esta ligado en pCR2.1-TOPO, secuenciado, clonado y luego más adelante como un Inserto Bgl2-Not1 en el sitio BamH1-Not1 de vectores pEBG2T y pGEX6P-1.

Otras construcciones de ADN. Las construcciones de ADN que codifican para GST-LKB1 de tipo salvaje o GST-LKB1 cataliticamente inactivo [D194A] en el vector pEBG 2T (Sapkota et al., 2001), FLAG-STRAD\alpha, FLAG-STRAD\beta, myc-MO25\alpha, myc-MO25\beta en el vector pCMV5 (ejemplo1; Boudeau et al., 2003) o del dominio cinasa de AMPK\alpha1 [residuos 1-308] en el vector pGEX (Scott et al., 2002) que ha sido descrito antes.

Cultivo de células, estímulación y lisis celular. La generación de células HeLa expresando establemente la tipo salvaje o la cinasa LKB1 ha sido descrita anteriormente (Sapkota et al.,@ 2002). Las células son cultivadas en medio mínimo esencial Eagle complementadas con 10% (v/v) tetraciclina libre de FBS, solución de aminoácido 1 X no esencial, la solución de penicilina/estreptomicina 1X (Invitrogen), 100 \mug/ml de zeocina y 5 \mug/ml de blasticidina (Invitrogen). La producción y el cultivo de LKB1^{+/+} inmortalizado y células de LKB1^{-/-} MEF de embriones de E9.5, fueron descritas anteriormente (ejemplo 2; Hawley et al., 2003). Las células 293 embrionarias de riñón humano son cultivadas en medio Eagle modificado Dulbecco que contiene 10% de FBS. Las células cultivadas sobre una placa de diámetro 10 cm; en 10% (v/v) de suero no son alentadas, estimulada con 10 mM fenformina o 2mM de AICA ribosida por 1 h y lisadas en 1 ml de tampón de lisis en hielo después elevar rapido en PBS. Los lisados de célula de MEF rotas por congelación con nitrógeno líquido, se descongelan antes del uso y se centrifugaron 4ºC durante 30 minutos a 23000 x g y se elimina el debris de célula. Los lisados de célula HeLa fueron centrifugados inmediatamente a 4ºC durante 15 minutos a 13 000 rpm. Las concentraciones de proteína fueron determinadas por el método de Bradford con albúmina de suero bovino como patrón (Bradford, 1976).

Inmunotransferencia. Lisados de célula totales (10-50 \mug) o proteína inmunoprecipitada (mg de lisado de célula) fueron calentada en el tampón de muestra SDS, y sometido a SDS-PAGE y a electrotransferido a membranas de nitrocelulosa. Las membranas fueron bloqueadas luego en 50 mM Tris/HCl pH 7,5, 0,15 M NaCl (TBS), 0.5% (por volumen) Tween contiene 10% (por masa) leche descremada, y monitoreada por 16 h en 4ºC en TBS, 0.5% (por volumen) Tween, 5% (por masa) de leche descremada y 1 \mug/ml de los anticuerpos indicados. La detección de proteínas fue llevada a cabo usando peroxidasa y anticuerpos secundarios conjugados de horse radish y el reactivo quimiluminicente mejorado (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, U.K).

Expresión y purificación de cinasas relacionadas con AMPK en E. coli . Al menos lo demostrado por las demás, construcciones de pGEX que codifican para el tipo salvaje de longitud completa construcciones mutantes de GST-HA marcado con cinasas AMPK relacionada, ó GST-AMPK\alpha1 [1-308], fueron transformados en células E. coli BL21. Los cultivos de un litro fueron crecidos a 37ºC en caldo Luria que contiene 100/de \mug/ml ampicillina hasta que la absorbancia a 600 nm fuera 0.8. Se añaden 100 \muM de Isopropil Galactosida, y las células fueron cultivadas por unas 16 horas adicionales a 26ºC. Para las construcciones de pGEX que codifican el tipo salvaje o la mutante GST-HA-marcado QSK, la inducción de la expresión de la proteína es llevada cabo por cultivo de las células hasta que la absorbancia a 600 nm fuera de 1, y luego fue añadido 1 mM isopropil, D-galactosida y las células más adelante son cultivadas por 1 h a 30ºC. Las células precipitadas son resuspendidas en 35 ml de tampón de lisis congelado y lisadas en un ciclo de congelación/descongelación, y los lisados fueron sonicados para fragmentar el ADN. Los lisados fueron centrifugados durante 30 minutos en 20,000 x g, y las proteínas recombinantes son purificadas por afinidad sobre glutatión-Sepharose y se eluye en tampón A conteniendo 20 mM de glutatión y 0,27 M
sacarosa.

Expresión y purificación de cinasas relacionadas con AMPK en células 293. Veinte placas de diámetro 10 cm; de células 293 son cultivadas y cada placa transfectada con 5 \mug de la construcción pEBG-2T que codifica para la cinasa AMPK relacionada usando el método de fosfato de calcio modificado (Amenosi et al., 1996). A las 36 horas de post-transfección, las células son rotas en 1 ml de tampón de Lisis helado, los lisados se centrifugan a 4ºC durante 10 minutos en 13,000 x g. Las proteínas de fusión-GST fueron purificadas por cromatografía de afinidad sobre glutatión-Sepharose y eluida en tampón A conteniendo 20 mM de glutatión y 0,27 M de sacarosa.

Expresión y purificación del complejo LKB1: STRAD: MO25 en células 293. Combinaciones diferentes de GST-LKB1 marcado, FLAG - marcado STRAD\alpha STRAD\beta, y Myc-marcado MO25\alpha o MO25\beta son expresados en células 293 y los complejos purificados sobre glutatión-Sepharose como se describe anteriormente (Ejemplo 1; Boudeau et al., 2003).

Medición de la activación de cinasas relacionadas con AMPK. Las subunidades catalítica de AMPK\alpha1 y cinasas AMPK relacionada son medidas luego de su fosforilación con LKB1 de la siguiente manera. 1-2 \mug de AMPK\alpha1 con el dominio catalítico o de cinasa AMPK relacionada, son incubados con ó sin 0,1-1 \mug del tipo salvaje del complejo de LKB1 indicado, en tampón A que contiene 5 mM de Acetato de magnesio y 0,1 mM de ATP, en un volumen final de 20 \mul. Después de la incubación a 30ºC por las veces indicadas en la leyenda de la figura, el dominio catalítico de AMPK\alpha1 o actividad de cinasa AMPK relacionada fue determinada añadiendo 30 \mul de 5 mM de acetato de magnesio y 0,1 mM [\gamma^{32}P]-ATP (300 cpm/pmol) y 200 \muM del péptido AMARA (AMARAASAAALARRR (Dale et al., 1995)) como sustrato, después de la incubación durante 5-20 minutos a 30ºC, la incorporación de fosfato ^{32}P dentro del péptido sustrato fue determinado poniendo la mezcla de reacción en papel de fósforocelulosa de P^{81} y contados por centelleo después de lavados los papeles con ácido fosfórico como se describe anteriormente (Amenosi et al., 1995). Una unidad (U) de actividad se define como la que cataliza la incorporación de un nmol de ^{32}P en el sustrato. El tiempo en curso de las reacciones para la segunda etapa del ensayo se lleva a cabo para asegurar que la razón de fosforilación ocurra en linea recta con el tiempo. Los datos cinéticos fueron analizados de acuerdo con la relación Michaelis-Menten para una regresión no lineal usando programa de computadora PRISMA GraphPad (GraphPad Software Inc, San Diego, USA).

Mapeo de los sitios sobre BRSK2, NUAK2 y MARK3 fosforilado por el complejo LKB1. El tipo salvaje y la mutante para las cinasas AMPK relacionada (5 \mug) fueron incubados por 30 minutos con 1-2 \mug de tipo salvaje LKB1:STRAD\alpha: MO25\beta en tampón A conteniendo 5 mM de acetato de magnesio y 100 \muM [\gamma-^{32}P]-ATP (5000 cpm/pmol) en un volumen de reacción total de 30 \mul. Después de 30 minutos, las reacciones fueron terminadas añadiendo SDS a una concentración final de 1% (w/v) y 10 mM ditiotreitol y calentadas a 100ºC durante 1 minuto. Después del enfriamiento, 4-vinilpiridina fue añadido a una concentración de 50 mM, y las muestras fueron dejadas en una plataforma agitada durante 30 minutos a temperatura ambiente a residuos de cisteína alquilados y luego sometido a electroforesis sobre gel de 4-12% Bis-Tris poliacrilamida. Los geles estaban teñidos con Coomasie R250, autoradiografeados y las bandas que se corresponden con las cinasas AMPK relacionada fosforilada se cortan y dividen en partes más pequeñas. Existe un lavado siguiente durante 15 minutos sobre la plataforma agitada con 1 ml de lo siguiente: agua, una mezcla de agua 1: 1 y acetonitrilo, 0,1 M bicarbonato de amonio, una mezcla 1: 1 de 0,2 M bicarbonato de amonio y acetonitrilo y finalmente acetonitrilo. Las piezas de de gel son secadas por evaporación rotatoria e incubados en 0,1 ml de 50 mM bicarbonato de amonio 0,1% (por masa) n-octil-glucosida 1 \mug de tripsina alquilada. Después de 16 h, 0,1 ml de acetonitrilo es añadido y la mezcla se incuba sobre una plataforma agitada durante 10 minutos. El sobrenadante es retirado y las piezas de gel fueron lavadas más adelante durante 10 minutos en 0,3 ml de 50 mM bicarbonato de amonio, y 0,1% (v/v) ácido trifluoroacético Los sobrenadantes combinados, conteniendo > 90% de radiactividad ^{32}P, fueron cromatografiado sobre una columna C18 Vydac 218TP5215 (Separations Group, Hesperia, CA) equilibrado en 0.1% (por volumen) de ácido trifluoroacetico en agua. La columna fue desarrollada con un gradiente lineal de acetonitrilo (la línea diagonal) en una velocidad de flujo de 0,2 ml/minutos y fracciones de 0,1 ml fueron colectados.

Análisis de secuenciación de fosfopéptidos. Fosfopéptidos aislados fueron analizados Applied Biosystems 4700 Proteomics Analyser (MALDI-TOF-TOF) usando 5 mg/ml alfa ácido cianocinamico como matriz. Los espectros fueron adquiridos tanto en modo reflectron como lineales y la secuencia de fosfopéptidos potenciales fueron confirmada por MALDI-MS/MS sobre las masas seleccionadas. La pérdida de característica del ácido fosfórico (M-98 Da) fosfopéptido primario así como la pérdida neutral dehidroalanina (-69) para fosfoserina o ácido dehidroaminobutirico (-83) para fosfotreonina fue usado para asignar la posición del sitio de fosforilación (s). El sitio de fosforilación de todos los péptidos marcado por ^{32}P fue determinado por degradación de Edman fase sólida sobre un Applied Biosystems 494A sequenator el péptido acoplado a membrana Sequelon AA (Milligen) como se describe anteriormente (Campbell y Morrice, 2002).

Identificación del sitio de Fosforilación de lazo-T en MELK. El digestión de triptica de GST-MELK que había sido expresado y purificado de E. coli fue acidificado con 0,25 M de ácido acético en 30% acetonitrilo (v/v) y 2 \mul (volumen colocado) gel de quelato de hierro PHOS - selecto fue añadido (Sigma). La muestra fue agitada durante 30 minutos y la resina colectada ZipTip (Millipore) lavado con 2 x 25 \mul de 0,25 M de ácido acético con 30% acetonitrilo (v/v) y eluido con 25 \mul 0,4 M de NH_{4}OH. El eluato fue analizado por espectrometría de masa MALDI-TOF-TOF y el fosfopéptido de lazo T es identificado y secuenciado por las ms/ms.

Inmunoprecipitación y ensayo de AMPK endógeno y cinasas relacionadas con AMPK

0,1-1 mg de proteína de lisados de Hela o de MEF fueron incubados a 4ºC para 1 h sobre una plataforma agitada con 5 \mul de proteína G-Sepharose conjugada por 5 \mug de anticuerpo LKB1 humano. Los inmunoprecipitados fueron lavados dos veces con 1 ml de tampón de Lisis que contiene 0,5 M NaCl, y dos veces con 1 ml de tampón A. La actividad fosfotransferasa hacia el péptido AMARA fue luego medida en un volumen total de ensayo de 50 \mul como se describe arriba.

Inmunoprecipitación y ensayo de LKB1 endógeno empleando sustrato LKB1tido

Las proteínas de lisados de células Hela o MEF de 0,1-1 mg fue incubada en 4ºC de por 1 h sobre una plataforma agitada con 5 \mul de proteína G-sepharose conjugada con 5 \mug de anticuerpo LKB1 humano. Los inmunoprecipitados fueron lavados dos veces con 1 ml de tampón de Lisis que contiene NaCl 0,5 M, y dos veces con 1 ml de tampón A.

La actividad fosfotransferasa hacia el péptido LKB1tido (residuos 241-260 de NUAK2 humano LSNLYHQGK
FLQTFCGSPLYRRR con 3 residuos de Arg adicionales se adicionan al C-terminal para permitir la unión al papel P81), esta es medida luego en un volumen total de ensayo de 50 \mul que consiste de 50 mM de Tris/HCl pH 7,5, 0,1 mM EGTA, 0.1% (por volumen) 2-mercaptoetanol y 10 mM de acetato de magnesio, 0,1 mM [\gamma^{32}P]-ATP (\sim 200 cpm/pmol) y 200 \muM de péptido LKB1tido.. El ensayo es llevado a 30ºC con agitación continua, para mantener los inmunoprecipitados en suspensión, y se culmina después de 10 minutos aplicando 40 \mul de la mezcla de reacción en membranas p81. Las membranas p81 fueron lavadas en ácido fosfórico, y la radiactividad incorporada fue medida por conteo de centelleo como se describe para cinasa MAP (Amenosi et al., 1995).

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Referencias para la Sección de Materiales y Métodos

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Alessi, D.R., Cohen, P., Ashworth, A., Cowley, S., Leevers, S.J. and Marshall, C.J. (1995) Assay and expression of mitogen-activated protein kinase, MAP kinase kinase, and Raf. Methods Enzymol, 255, 279-290.

Boudeau, J., Baas, A.F., Deak, M., Morrice, N.A., Kieloch, A., Schutkowski, M., Prescott, A.R., Clevers, H.C. and Alessi, D.R. (2003) MO25alpha/beta interact with STRADalpha/beta enhancing their ability to bind, activate and localize LKB 1 in the cytoplasm. EMBO J, 22, 5102-5114.

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Dale, S., Wilson, W.A., Edelman, A.M. and Hardie, D.G. (1995) Similar substrate recognition motifs for mammalian AMP-activated protein kinase, higher plant HMG-CoA reductase kinase-A, yeast SNF1, and mammalian calmodulindependent protein kinase I. FEBS Lett, 361, 191-195.

Hawley, S.A., Boudeau, J., Reid, J.L., Mustard, K.J., Udd, L., Makela, T.P., Alessi, D.R. and Hardie, D.G. (2003) Complexes between the LKB1 tumor suppressor, STRADalpha/beta and MO25alpha/beta are upstream kinases in the AMP-activated protein kinase cascade. J Biol, 2, 28.

Sapkota, G.P., Deak, M., Kieloch, A., Morrice, N., Goodarzi, A.A., Smythe, C., Shiloh, Y., Lees-Miller, S.P. and Alessi, D.R. (2002) Ionizing radiation induces ataxia telangiectasia mutated kinase (ATM)-mediated phosphorylation of LKB1/STK11 at Thr-366. Biochem J, 368,507-516.

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Scott, J.W., Norman, D.G., Hawley, S.A., Kontogiannis, L. and Hardie, D.G. (2002) Protein kinase substrate recognition studied using the recombinant catalytic domain of AMP-activated protein kinase and a model substrate. J Mol Biol, 317, 309-323.

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Referencias

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Referencias citadas en la descripción

Este listado de referencias citadas por el solicitante tiene como único fin la conveniencia del lector. No forma parte del documento de la Patente Europea. Aunque se ha puesto gran cuidado en la compilación de las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP rechaza cualquier responsabilidad en este sentido.

Documentos de patentes citados en la descripción

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<110> Universidad de Dundee

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<120> Métodos

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<130> DUNY/P30950PC

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<160> 158

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<170> Versión Patentin 3.1

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<210> 1

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<211> 550

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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5

6

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<210> 2

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<211> 550

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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8

9

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<210> 3

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<211> 550

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

10

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<210> 4

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<211> 520

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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<210> 5

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<211> 552

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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<210> 6

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<211> 433

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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<210> 7

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<211> 433

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

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19

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<210> 8

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<211> 433

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

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21

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<210> 9

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<211> 431

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

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23

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<210> 10

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<211> 418

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

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25

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<210> 11

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<211> 341

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 11

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27

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<210> 12

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<211> 337

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 12

29

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<210> 13

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<211> 338

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<212> PRT

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<213> Caenorhabditis elegans

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<400> 13

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<210> 14

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<211> 636

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<212> PRT

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<213> Caenorhabditis elegans

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<400> 14

32

33

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<210> 15

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<211> 339

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<212> PRT

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<213> Drosophila melanogaster

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<400> 15

34

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<210> 16

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<211> 20

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> sustrato de LKB1

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<400> 16

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<210> 17

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<211> 20

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> LKB1 sustrato

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<400> 17

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2000

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<210> 18

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<211> 20

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> sustrato de LKB1

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<400> 18

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<210> 19

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<211> 20

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<223> sustrato de LKB1

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<400> 19

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<210> 20

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<211> 20

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<223> sustrato de LKB1

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<400> 20

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<210> 21

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<211> 20

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<213> Artificial

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<223> Sustrato de LKB1

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<210> 22

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<211> 20

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Sustrato de LKB1

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<400> 22

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41

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<210> 23

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<211> 23

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sustrato de LKB1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sustrato de LKB1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sustrato de LKB1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sustrato de LKB1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sustrato de LKB1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sustrato de LKB1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sustrato de LKB1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sustrato de LKB1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sustrato de LKB1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sustrato de LKB1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sustrato de LKB1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sustrato de LKB1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sustrato de LKB1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sustrato de LKB1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sustrato de LKB1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> C-terminal 12 residuos STRAD alpha

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> C-terminal 12 residuos STRAD alpha, último residuo mutado a Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> C-terminal 12 residuos STRAD alpha, último tercer residuo mutado a Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> C-terminal 12 residuos STRAD alpha, último segundo residuo mutado a Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> C-terminal 6 residuos STRAD alpha

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 547

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

75

76

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 527

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

77

78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 560

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharomyces cerevisiae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

79

80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1142

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharomyces cerevisiae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

81

82

83

84

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 640

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharomyces cerevisiae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

85

86

87

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 545

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

88

89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 243

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Consenso para la figura 12

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

90

91

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> saccharomyces cerevisiae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> consenso para la figura 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

121

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

122

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 329

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Schizosaccharomyces pombe

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

123

124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 399

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharomyces cerevisiae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

125

126

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 343

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

127

128

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido FLAG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

129

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento bovino MBP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

130

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

131

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1310

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador PCR

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

132

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1320

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

133

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1330

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

134

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1340

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

135

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1350

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

136

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

137

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus rattus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

138

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1380

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1381

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

139

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1390

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

140

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1391

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1392

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1393

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1394

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1395

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 122

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1396

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 123

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 124

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1410

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 125

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

142

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 126

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1420

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 127

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1421

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 128

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1422

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 129

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

143

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 130

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

144

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 131

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1440

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 132

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 132

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

145

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 133

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1450

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 134

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

146

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 135

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 135

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1460

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 136

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 136

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

147

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 137

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 137

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1470

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 138

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 138

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

148

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 139

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 139

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1480

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 140

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 140

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1481

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 141

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1482

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 142

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1483

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 143

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 143

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1484

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 144

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1485

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 145

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 145

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1486

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 146

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1487

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 147

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 147

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1488

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 148

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 148

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1489

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 149

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 149

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1490

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 150

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 150

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1491

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 151

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 151

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\hskip1cm

149

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 152

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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<400> 152

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\hskip1cm

1492

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 153

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 68

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 153

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\hskip1cm

150

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 154

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 154

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\hskip1cm

1500

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 155

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 155

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\hskip1cm

1501

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 156

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<211> 39

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 156

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\hskip1cm

1502

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 157

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial AMPK sustrato cinasa

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 157

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\hskip1cm

151

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 158

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<211> 23

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 158

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\hskip1cm

152

Claims (26)

1. Un método para la identificación de un compuesto para su uso en la modulación, por ejemplo la promoción, la activación o la fosforilación de AMPK (proteína cinasa activada con AMP) o miembro de la subfamilia AMPK en una célula, método que comprende los pasos de:

(1)

determinación si un compuesto de prueba modula, por ejemplo promueve, la actividad de proteína cinasa de LKB1, y

(2)

selección de un compuesto que modula, por ejemplo promueve, la actividad de la proteína cinasa de LKB1, en el que el LKB1 está en una preparación con STRAD y MO25 en el que el M025 es recombinante y esta expresado de un ácido nucleico recombinante.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el LKB1 ó STRAD es recombinante y se expresa de un ácido nucleico recombinante.

3. Una célula capaz de expresar LKB1, STRAD, y sobre expresado o expresado por MO25 recombinante desde un ácido nucleico recombinante.

4. La célula de la reivindicación 3 que comprende un ácido nucleico recombinante que codifica para M025.

5. La célula de las reivindicaciones 3 ó 4 que comprende un ácido nucleico recombinante que codifica para LKB1.

6. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 que comprende un ácido nucleico recombinante que codifica para STRAD.

7. Una célula que comprende LKB1, STRAD y la sobre expresión ó expresión por MO25 recombinante de un ácido nucleico recombinante.

8. Una célula de acuerdo con la reivindicación 7 que comprende LKB1 recombinante expresado de un ácido nucleico recombinante.

9. Una célula de acuerdo con las reivindicaciones 7 ó 8 que consta de STRAD recombinante expresado de un ácido nucleico recombinante.

10. Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a la 9, en la que la célula es una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a la 6.

11. Un método para hacer las preparaciones que comprenden LKB1, STRAD y M025 recombinante expresados de un ácido nucleico recombinante que comprende el paso de purificación del preparado de una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a la 10.

12. El método de la reivindicación 11 en el que la preparación comprende LKB1 recombinante expresado en un ácido nucleico recombinante.

13. El método de las reivindicaciones 11 ó 12 en el que la preparación comprende STRAD recombinante expresado de un ácido nucleico recombinante.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a la 13, en el que las proporciones de LKB1: STRAD: MO25 en las preparaciones son 1: 1: 1.

15. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que LKB1 está en una preparación obtenida u obtenible por el método de una cualquiera de las reivindicaciones de la 11 a la 14, ó en una célula como se define en una cualquiera de las reivindicaciones de la 3 a la 10.

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, 11 a la 15, en el que la preparación comprende un complejo que consta de LKB1, STRAD y MO25.

17. Un método para identificar un compuesto para modular la actividad celular de LKB1, el método comprende los pasos de (1) determinación si un compuesto de prueba modula la actividad de la proteína cinasa LKB 1 de una preparación o complejo obtenido por el método de una cualquiera de las reivindicaciones de la 11 a 14 ó 16, ó en una célula como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a la 10 y (2) seleccionar un compuesto que modula dicha actividad de proteína cinasa LKB1.

18. El método de la reivindicación 1 ó de la reivindicación 17, en el que la actividad de proteína cinasa LKB1 es medida usando AMPK o un miembro de la subfamilia AMPK o un fragmento de ella, como el sustrato.

19. Un conjunto de partes que consta de LKB1 o un polinucleotido recombinante que codifica para LKB1, STRAD, o un polinucleotido recombinante que codifica para STRAD, y un polinucleotido recombinante que codifica para M025.

20. Un conjunto de partes que comprende (1) AMPK o un miembro de la subfamilia AMPK, o un polinucleotido recombinante que codifica para AMPK o miembro de la subfamilia AMPK o un fragmento de ella y (2) un conjunto de partes como se define en la reivindicación 19 o de una célula como se define en una cualquiera de las reivindicaciones de 3 a la 10.

21. Un método para la preparación de un complejo de LKB1/STRAD/MO25 que comprende los pasos de (1) seleccionar un tipo de célula en la cuál se sobre expresa LKB1, que comprende el paso de determinación si el tipo de célula es una que expresa STRAD y M025 (2) preparar dun complejo LKB1/STRAD/MO25 por la sobre expresión de LKB1 en el tipo de célula seleccionada.

22. Un método para la preparación de un complejo LKB1/STRAD/MO25 que comprende los pasos (1) sobre expresión de LKB1 en una célula usando un método de acuerdo con la reivindicación 21, y (2) preparación de dicho complejo desde la célula.

23. Un método para identificación de una diferencia genética asociada con PJS (síndrome de Peutz-Jeghers) que consta de los pasos de (1) investigación de la secuencia de un gen que codifica para una isoforma M025 en al menos un paciente que tiene PJS (2) identificación de cualquier diferencia entre la secuencia de dicho paciente y la secuencia equivalente de un individuo sin PJS.

24. Un método para identificación de un compuesto, el cual activa AMPK o un miembro de la subfamilia AMPK por un mecanismo semejante a una metformina ó fenformina o AICA ribosido, en el que el efecto de un compuesto de prueba sobre la activación de AMPK o miembro de la subfamilia de AMPK por una preparación o complejo que se obtiene por el método de una cualquiera de las reivindicaciones de la 11 a 14 ó 16, o una célula como se define en una cualquiera de las reivindicaciones de la 3 a 10 se compara con el efecto de metformina ó fenforminas, ó AICA ribosida sobre la activación de AMPK o uno de los miembro subfamilia de AMPK y un compuesto con un efecto semejante al que se selecciona.

25. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 18 ó 24, o un conjunto de partes de la reivindicación 20, en el que el miembro de la subfamilia AMPK es o comprende un polipéptido AMPK\alpha1 ó AMPK\alpha2.

26. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 18 ó 24, o un conjunto de partes de la reivindicación 20, en el que el miembro de la subfamilia AMPK es o comprende un polipéptido NUAK1, NUAK2, BRSK1, BRSK2, SIK, QIK, QSK, MARK1, MARK2, MARK3, MARK4 o MELK.