CN1370076A - Hm1.24抗原的表达增强剂 - Google Patents

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Abstract

以α干扰素或γ干扰素或IRF－2蛋白质为有效成分的增强HM1.24抗原在骨髓瘤细胞中表达的表达增强剂。预想α干扰素或γ干扰素是通过激活编码HM1.24抗原的基因的启动子来增强HM1.24抗原的表达。

Description

HM1.24抗原的表达增强剂
技术领域
本发明涉及作为骨髓瘤中HM1.24抗原表达增强剂的α干扰素和γ干扰素，以及IRF-2蛋白质的使用。
背景技术
骨髓瘤(myeloma)也称之为浆细胞瘤(plasmacytoma)、多发性骨髓瘤(multiple myeloma)，是一种肿瘤疾病，特征为单克隆浆细胞积聚于骨髓内。骨髓瘤是一种产生、分泌免疫球蛋白的末端分化B细胞，即在骨髓内浆细胞主要以单克隆形式增加的疾病，在该患者的血清中可以检测出单克隆的免疫球蛋白或者是其构成成分L链、H链。
到目前为止骨髓瘤的治疗主要使用化疗制剂，还没有找到使肿瘤完全消失、延长骨髓瘤患者生存时间的那样的有效的治疗剂，所以期待着具有治疗骨髓瘤效果的药剂的出现。
Goto，T等人报道了将人骨髓瘤细胞免疫小鼠可获得单克隆抗体(鼠抗HM1.24抗体)(Blood(1994)84，1922-1930)。如果将抗HM1.24抗体用于移植了人骨髓瘤细胞的小鼠，由于该抗体特异地聚集在肿瘤组织(小阪昌明等人，日本临床(1995)53，627-635)，表明抗HM1.24抗体有可能应用于通过放射性同位素标记进行肿瘤部位的诊断，放射免疫疗法等导弹疗法。
另外，Blood(1994)84，1922-1930文献报道说在体外，抗HM1.24抗体对人骨髓瘤细胞株RPM 18226具有细胞毒活性。而且表明嵌合了鼠抗HM1.24抗体的嵌合抗HM1.24抗体以及人源化的再构成抗HM1.24抗体能特异地结合骨髓瘤细胞，而且具有细胞毒活性(Blood(1999)93，3922-3930)。
因此，HM1.24抗原在作为末端分化B细胞的骨髓瘤细胞中特异地高表达，由于识别该抗原的抗HM1.24抗体与细胞表面的HM1.24抗原按比例结合，发挥杀伤细胞活性，所以人们认为使用抗HM1.24抗体的免疫疗法对多发性骨髓瘤是一种有效的疗法。因此，如果能够增强作为抗HM1.24抗体的抗原在细胞表面的表达量的话，有希望通过用更少量的抗体获得同等的细胞毒活性，而且会使副作用进一步降低。
另外。人们已经知道作为表现出抑制病毒增殖活性的物质被发现的干扰素现在在哺乳类动物中分为α、β、γ和ω四类，具有各种各样的生理活性(Pestka，S.，et.al.，Ann.Rev.Biochem.(1987)56，727-777；Langer，J.A.，et.al.，Immunology Today(1988)9，393-400)。然而，有关α干扰素和γ干扰素在骨髓瘤细胞中具有使HM1.24抗原的表达量增加作用的报道还没有见到。
另外，已经证实干扰素调节因子(interferon regulatory factor)(IRF)-1和2是IFN-β基因的转录调节因子。IRF-1和2通常与同一个基因调控序列结合，IRF-1起着转录激活因子的作用，而IRF-2起着转录抑制因子的拮抗作用。另外已经证实可使IRF-2高表达的NIH3T3细胞使细胞饱和密度的上升，在甲基纤维素凝胶中形成菌落，在裸鼠中致瘤性，显然IRF-2起着癌基因的功能。
最近的研究进展表明IRF-2是调节细胞周期的组蛋白H4表达所必需的。而且IRF-2在肌肉细胞中能使血管细胞粘附分子-1(vascular celladhesion molecule-1，VCAM-1)增加，在VCAM-1活化中IRF-2的酸性区域(182至218)在起作用也已经弄清楚了。由此可知IRF-2不仅起着转录抑制因子的作用，而且起着转录激活因子的作用。
但是，IRF-2蛋白质结合HM1.24抗原基因的启动子(HM1.24启动子)，激活该启动子一事还未知。
发明的公开
现在所进行的骨髓瘤治疗就象上面所述，是不完全的治疗，人们期待着导致骨髓瘤完全消失、延长患者生存时间的划时代的治疗剂或治疗方法。利用抗HM1.24抗体治疗骨髓瘤在特异性和有效性方面有可能成为划时代的治疗剂，人们期待着能更有效发挥抗HM1.24抗体作用的治疗方法。
所以本发明的目的就在于提供通过使HM1.24抗原在骨髓瘤细胞的表达量增加，使抗HM1.24抗体的骨髓瘤抑制作用增强的手段。
本发明人按照提供的有关方法，探索使HM1.24抗原表达量增加的药剂，结果发现α干扰素和γ干扰素具有所希望的活性，直至完成本发明。
因此本发明提供以α干扰素和γ干扰素为有效成分的，具有序列2给出的氨基酸序列的蛋白质(HM1.24抗原)的骨髓瘤细胞中表达增强剂。
本发明提供骨髓瘤制剂，含有有效成分
(1)α干扰素或γ干扰素，以及
(2)能特异结合具有序列2给出的氨基酸序列的蛋白质，并且具有细胞毒活性的抗体。
上述的骨髓瘤最典型的是多发性骨髓瘤。
上述的抗体最好是单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体，最理想的是具有细胞毒活性的抗体。
本发明人另外还探索了HM1.24启动子的激活剂，结果发现IRF-2蛋白质具有所希望的活性，直至完成本发明。
因此本发明还提供以IRF-2蛋白质为有效成分的增强具有序列2给出的氨基酸序列的蛋白质(HM1.24抗原)在骨髓瘤细胞中表达的增强剂。
本发明还提供IRF-2蛋白质为有效成分的HM1.24启动子的激活剂。
本发明还提供骨髓瘤制剂，含有有效成分
(1)IRF-2蛋白质，以及
(2)能特异结合具有序列2给出的氨基酸序列的蛋白质，并且具有细胞毒活性的抗体。
上述的骨髓瘤最典型的是多发性骨髓瘤。
上述的抗体最好是单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体，最理想的是具有细胞毒活性的抗体。
因此本发明还提供含有以增强IRF-2蛋白质表达的化合物为有效成分的在骨髓瘤细胞中增强HM1.24抗原表达的表达增强剂。
本发明还提供含有以增强IRF-2蛋白质表达的化合物为有效成分的HM1.24启动子的激活剂。
另外本发明还提供筛选HM1.24抗原表达增强剂的方法。
另外本发明还提供作为治疗骨髓瘤患者的试剂盒，其中包括：
(1)能特异结合具有序列2给出的氨基酸序列的蛋白质，并且具有细胞毒活性的抗体，以及
(2)指导将上述抗体与增强具有序列2给出的氨基酸序列的蛋白质的表达的药剂组合用于患者的指导书。
上述骨髓瘤例如为多发性骨髓瘤。上述抗体最好是人源化抗HM1.24抗体。而上述增强具有序列2给出的氨基酸序列的蛋白质表达的药剂最好是α干扰素或γ干扰素。
本发明还提供含有能特异结合具有序列2给出的氨基酸序列的蛋白质并且具有细胞毒活性的抗体的治疗骨髓瘤患者的药物组合物，用于与增强具有序列2给出的氨基酸序列的蛋白质的表达的药剂组合向患者给药。
上述骨髓瘤为多发性骨髓瘤。上述抗体最好是人源化抗HM1.24抗体。而上述增强具有序列2给出的氨基酸序列的蛋白质表达的药剂最好是α干扰素或γ干扰素。
附图的简单说明
图1表示使用作为标记的IgG(对照)或抗HM1.24抗体通过流式细胞仪对α干扰素不存在(上)、存在下(下)培养的骨髓瘤细胞株U266进行分析的结果。
图2表示使用作为标记的IgG(对照)或抗HM1.24抗体通过流式细胞仪对α干扰素不存在(上)、存在下(下)培养的患者骨髓瘤细胞进行分析的结果。
图3表示通过对经***了编码HM1.24抗原的基因的启动子区域的报道质粒转化的U266细胞在α干扰素不存在或各种α干扰素浓度下培养后荧光素酶活性进行测定的结果。
图4表示通过对经***了编码HM1.24抗原的基因的启动子区域内从转录起始点到上游151bp，或到上游77bp序列的报道质粒转化的U266细胞或HEL细胞在α干扰素(1000U/ml)存在下培养后荧光素酶活性进行测定的结果。
图5表示使用作为标记的IgG(对照)或抗HM1.24抗体通过流式细胞仪对γ干扰素不存在(上)、存在下(下)培养的骨髓瘤细胞株U266进行分析的结果。
图6表示使用作为标记的IgG(对照)或抗HM1.24抗体通过流式细胞仪对γ干扰素不存在(上)、存在下(下)培养的患者骨髓瘤细胞进行分析的结果。
图7是表示通过向U266培养细胞添加IFN-α而产生的结合于HM1.24启动子区域的转录因子的量随时间的变化的电泳照片图。NE(-)代表没有添加核提取物。0h表示添加没有IFN-α刺激的核提取物。0.5～8h代表添加经IFN-α(1000U/ml)刺激后的不同时间段的核提取物，+cold表示添加未标记的ISRE2探针50ng，+cold unrelated表示添加未标记的adp序列50ng。
图8是表示用各种抗体鉴定结合HM1.24启动子的转录因子的电泳照片图。NE(-)代表没有添加核提取物。0h表示添加没有IFN-α刺激的核提取物。8h表示添加IFN-α(1000U/ml)刺激后8h的核提取物。+cold表示添加未标记的ISRE2探针50ng，+cold unrelated表示添加未标记的adp序列50ng。添加的抗体都是2μg。
图9是表示将HM1.24启动子报道质粒和IRF-2表达质粒导入U266细胞，测定报道活性的结果图。
发明实施方案
α干扰素或γ干扰素
本发明使用的α干扰素或γ干扰素只要具有使HM1.24抗原表达量增加的活性也可以使用其变种。在测定HM1.24抗原表达量时，就象实施例记载的那样，可以使用从骨髓瘤细胞株或骨髓瘤患者提取的骨髓瘤细胞，通过流式细胞仪检测。作为变种可以是诸如通过缺失、或置换、或***、或添加1个或数个、或很多个氨基酸残基等手段变异的α干扰素或γ干扰素。
作为将缺失、置换或***导入蛋白的方法可以使用改变对应的基因的部位特异性变异诱变法(Hashimoto-Gotoh，Gene(1995)152，271-275，Zoller，Methods Enzymol.(1983)100，468-500，Kramer，Nucleic Acids Res.(1984)12，9441-8456，Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82，488-492，[新细胞工学实验方法 东京大学医学研究所 制癌研究部(1993)p241-248])。
另外，也可以利用使用了市售PCR的[部位特异性的变异诱变体系(GIBCO-BRL)或[QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit](Stragene公司生产)]。另外，蛋白质中的氨基酸的变异有时在自然界中也会发生。而据Mark，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666文献报道，这样导入变异的蛋白具有与原来蛋白同样的活性。
在氨基酸残基的置换中，最好在性质被保存的氨基酸之间进行。例如，在疏水性氨基酸(A，L，L，M，F，P，W，Y，V)、亲水性氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)、含有脂肪族侧链的氨基酸(G，A，V，L，I，P)、含有羟基侧链的氨基酸(S，T，Y)、含有硫原子侧链的氨基酸(C，M)、含有羧酸和酰胺侧链的氨基酸(D，N，E，Q)、含有碱基侧链的氨基酸(R，K，H)、含有芳香族侧链的氨基酸(H，F，Y，W)之间的置换。
作为变种也可以使用α干扰素或γ干扰素的肽段。最好是含有与α干扰素或γ干扰素受体结合的部位的肽段。理想的是由100个以上，更理想是由130个、150个，最理想的是由160个以上连续的氨基酸残基构成的肽段。
IFR-2蛋白
已经证实干扰素调节因子(interferon regulatory factor)(IRF)-1和2是IFN-β基因的转录调节因子。IRF-1和2通常与同一个基因调控序列结合，IRF-1起着转录激活因子的作用，而IRF-2起着转录抑制因子的拮抗作用。另外已经证实使IRF-2高表达的NIH3T3细胞使细胞饱和密度上升，在甲基纤维素凝胶中形成菌落和使裸鼠长瘤，显然IRF-2起着癌基因的功能。
最近的研究进展表明IRF-2是调节细胞周期的组蛋白H4表达所必需的。而且IRF-2在肌肉细胞中能使血管细胞粘附分子-1(vascular celladhesion molecule-1，VCAM-1)增加，在VCAM-1活化中IRF-2的酸性区域(182至218)在起作用也已经弄清楚了。由此可知IRF-2不仅起着转录抑制因子的作用，有时也表现出作为转录激活因子的作用。
杂交瘤
产生本发明使用的抗体的杂交瘤基本上是使用众所周知的技术按以下过程制作的。即，用HM1.24抗原蛋白质或表达HM1.24抗原的细胞作为致敏抗原，按照通常的免疫方法进行免疫，利用通常的细胞融合方法使获得的免疫细胞与众所周知的亲本细胞融合，通过常规的筛选方法筛选出产生单克隆抗体的细胞。
具体来说，在制作单克隆抗体时，可以按如下方式进行。例如，作为可获得抗体的致敏抗原的表达HM1.24抗原细胞可以使用人多发性骨髓瘤细胞株KPMM2(特开平7-236475)或KPC-32(Goto，T.et.al.，Jpn.J.Clin.Hematol.(1991)32，1400)。另外作为致敏抗原也可以使用含有序列1给出的氨基酸序列的蛋白质、或者含有抗HM1.24抗体识别的(抗原)表位的肽或多肽。
另外作为致敏抗原使用的含有序列1所示氨基酸序列的蛋白质的cDNA***到pUC19载体的XbaI酶切部位之间，制备质粒pRS38-pUC19。含有该质粒pRS38-pUC19的大肠杆菌(E.coli)于平成5年(1993年)10月5日根据布达佩斯条约以Escherichia coli DH5α(pRS38-pUC19)，保藏号为FERM BP-4434保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所(参照特开平7-196694)。使用在质粒pRS38-pUC19含有的cDNA片段通过基因工程操作技术可以制作含有抗HM1.24抗体识别的表位的肽或多肽。
作为致敏抗原免疫的哺乳动物并没有特别限定，但最好是考虑细胞融合中使用的亲本细胞的适配性来选择，通常使用啮齿类动物，例如小鼠、大鼠、田鼠等。
用致敏抗原免疫动物时按照常规方法进行。例如常用的方法是通过将致敏抗原注射到哺乳动物的腹腔内或皮下来进行免疫。
具体来说，将致敏抗原用PBS(Phosphate-Buffered Saline)或生理盐水等稀释到适当的浓度，根据需要，将稀释的悬浊液与通常的佐剂，例如与弗氏(Freund)完全佐剂适量混合，乳化后，最好是每隔4～21天注射几次。另外致敏抗原免疫时可以使用适当的载体。
象上述那样进行免疫，确认血清中所希望的抗体水平上升后，从哺乳动物摘出免疫细胞，用于细胞融合。用于细胞融合用的免疫细胞最好是脾细胞。
作为与上述免疫细胞融合的其它亲本细胞的哺乳动物的杂交瘤细胞，有众所周知的各种细胞，例如，P3X63Ag8.653(J.Immunol.(1979)123：1548-1550)，P3X63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology(1978)81：1-7)，NS-1(Kohler.G.and Milstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6：511-519)，MPC-11(Margulies.D.H.et al.，Cell(1976)8：405-415)，SP2/0(Shulman，M.et al.，Nature(1978)276：269-270)，FO(de St.Groth，S.E.etal.，J.Immunol.Methods(1980)35：1-21)，S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148：313-323)，R210(Galfre，G.et al.，Nature(1979)277：131-133)等。
上述免疫细胞与杂交瘤的细胞融合基本上按照常规方法，例如按照Milstein等人的方法(Kohler.G.and Milstein，C.Methods Enzymol.(1981)73：3-46)进行的。
具体来说，例如上述细胞融合在细胞融合促进剂存在下于通常的营养培养液中进行。作为融合促进剂例如可以使用聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，另外根据需要也可以添加二甲亚砜等辅助剂。
免疫细胞和杂交瘤细胞的使用比例，免疫细胞相对于杂交瘤细胞最好为1～10倍。作为上述细胞融合使用的培养液可以使用适于上述杂交瘤细胞株增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液，以及其它该种细胞培养用的通常的培养液，另外也可以同时使用胎牛血清(FCS)等血清补液。
细胞融合通过将上述按比例的免疫细胞和杂交瘤于上述培养液中充分混合，添加预先在37℃保温的PEG溶液，通常添加平均分子量为1000-6000左右的PEG溶液，浓度为30～60％(w/v)，通过混合形成所希望的融合细胞(杂交瘤)。然后逐次添加适当培养液，反复进行离心、去除上清操作，除去对杂交瘤增殖不利的细胞融合剂等。
该杂交瘤通过用通常的选择培养液，例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液)培养进行选择。在该HAT培养液培养要继续较长时间，通常为数日～数周，为的是使靶杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死掉。然后实施有限稀释法，筛选产生目的抗体的杂交瘤和单一的克隆。
另外，用抗原免疫人以外的动物，除了得到上述杂交瘤外，在体外用HM1.24抗原或HM1.24抗原表达细胞使人淋巴细胞致敏，使致敏淋巴细胞与人杂交瘤细胞，例如U266融合，也可以获得具有与HM1.24抗原或HM1.24抗原表达细胞结合活性的所希望的人抗体(参照特公平1-59878)。另外将HM1.24抗原或HM1.24抗原表达细胞注射到含有人抗体基因整个文库的转基因动物，利用上述方法也可以获得所希望的人抗体(参照国际专利申请公开号WO93/12227，WO92/03918，WO94/02602，WO94/25585，WO96/34096，WO96/33735)。
这样制作的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在通常的培养液中进行继代培养，而且可以在液氮中长期保存。
为了从该杂交瘤获得单克隆抗体，可以采用按照通常的方法培养该杂交瘤取培养上清的方法，或者采用将该杂交瘤注射到与该杂交瘤细胞相适合的哺乳动物中，使其增殖取腹水的方法。前一个方法适于获得高纯度的抗体，而后者适于抗体的大量生产。
单克隆抗体
具体来说，产生抗HM1.24抗体的杂交瘤的制作可以按照Goto，T等人的方法(Blood(1994)84，1922-1930)进行。例如，可以通过将于平成7年4月27日根据布达佩斯条约以保藏号为FERM BP-5233保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所(茨城县筑波市东1丁目1番3号)的产生抗HM1.24抗体的杂交瘤注入BALB/c小鼠(日本kararey制)，取腹水，然后从腹水中纯化抗HM1.24抗体的方法来制备，或者是将该杂交瘤在适当的培养基，例如，含有10％胎牛血清、5％BM-CondimedH1(Boeehringer Mannheim生产)的RPMI1640培养基、杂交瘤SFM培养基(GIBCO-BRL生产)、PFHM-II培养基(GIBCO-BRL生产)中进行培养，从培养上清中纯化抗HM1.24抗体的方法来制备。
重组型抗体
在本发明中作为单克隆抗体可以使用重组型抗体，即从杂交瘤中将抗体基因克隆出来，***到适当的载体，然后将该载体导入宿主，利用基因重组技术制作出重组型抗体。(例如，可参照Carl，A.K.Borrebaeck，James，W.Larrick，THERAPEUTICMONOCLONAL ANTIBODIES，Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERSLTD，1990)
具体来说，从产生目的抗体的杂交瘤分离出编码抗体可变(V)区的mRNA。mRNA的分离可以使用常规的方法，例如胍超离心法(Chirgwin，J.M.等人Biochemistry(1979)18，5294-5299)、AGPC法(Chmczynski，P.等人(1987)162，156-159)来制备总RNA，然后使用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia生产)制备mRNA。另外可以利用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia生产)直接制备mRNA。
使用逆转录酶从得到的mRNA合成抗体V区的cDNA。cDNA的合成可以使用AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA SynthesisKit等进行。在进行cDNA合成和PCR扩增时可采用利用5′-AmpliFINDER RACE kit(Clontech生产)和PCR的5′-RACE法(Frohman，M.A.等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A等人Nucleic Acids Res.(1989)17，2910-2932)。从获得的PCR产物中纯化目的DNA片段，然后与载体DNA连接。由此制作重组载体，导入大肠杆菌等宿主，选择菌落，制备所希望的重组载体。通过常规方法，例如双脱氧法确认目的DNA的碱基序列。
如果获得了编码目的抗体的V区的DNA，把它与所希望的抗体稳定区(C区)的DNA连接，***到表达载体。另外也可以将编码抗体V区的DNA***到含有抗体C区的DNA的表达载体中。
为了制作本发明使用的抗体，可以象后面所叙述的那样，将抗体基因***到在表达调控区，例如增强子、启动子的调控下进行表达那样的表达载体中。然后通过该表达载体转化宿主细胞，使抗体表达。
改变抗体
在本发明中为了使对人的异种抗原性降低使用了人为改变的基因重组型抗体、例如嵌合(Chimeric)抗体、人源化抗体(Humanized)等。这些改变的抗体利用已知的方法都可以制造。
嵌合抗体是通过如下操作获得的：将上面得到的编码抗体V区的DNA与编码人抗体C区的DNA连接，然后***到表达载体，导入宿主来制造(参照欧洲专利申请公开号EP125023、国际专利公开号WO96/02576)。利用该已知方法可以获得本发明中有用的嵌合抗体。
例如，含有嵌合抗HM1.24抗体的L链和H链的质粒的大肠杆菌于平成8年8月29日根据布达佩斯条约分别以Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24L-gκ)和Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24H-gγ1)，保藏号为FERM BP-5646和FERM BP-5644保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所(茨城县筑波市东1丁目1番3号)(参照特开平8-264756)。
人源化抗体也称之为再构成(reshaped)人抗体，是将人以外的哺乳动物，例如鼠抗体的互补决定区(CDR：complementarity determiningregion)移植到人抗体的互补决定区构成的抗体，其一般的基因重组手法也都了解了(参照欧洲专利申请公开号EP125023、国际专利公开号WO96/02576)
具体来说，利用PCR法由制作成末端含有重叠部分那样的数个寡核苷酸合成设计成连接鼠抗体CDR和人抗体框架区(framework-region；FR)的DNA序列。得到的DNA序列与编码人抗体C区的DNA连接，然后***表达载体，导入宿主来生产嵌合抗体(参照欧洲专利申请公开号EP239400、国际专利公开号WO96/02576)。
通过CDR连接的人抗体的FR要选择互补决定区形成良好的抗原结合部位的FR。根据需要，为了使再构成人抗体的互补决定区形成合适的抗原结合部位也可以置换抗体可变区的框架区的氨基酸(Sato，K.etal.，Cancer Res.(1993)53，851-856))
例如，含有人源化抗HM1.24抗体的L链和H链的质粒的大肠杆菌于平成8年8月29日根据布达佩斯条约分别以Escherichia coli DH5α(pUC19-RVLa-AIIM-gκ)和Escherichia coli DH5α(pUC19-RVHr-AHM-gγ1)，保藏号为FERM BP-5645和FERM BP-5643保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所(茨城县筑波市东1丁目1番3号)(参照特开平8-264756)。
在嵌合抗体、人源化抗体中使用人抗体C区，作为表现出细胞毒活性的人抗体C区可以使用人的Cγ区，例如Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4。其中尤其是含有Cγ1，Cγ3的抗体具有很强的细胞毒活性，即具有ADCC活性、CDC活性，适用于本发明。
嵌合抗体是由人以外的哺乳动物抗体的可变区和人抗体的C区构成的，人源化抗体是由人以外的哺乳动物抗体的互补决定区和人抗体的框架区(framework-region；FR)和C区构成的，为了使其在人体内抗原性降低，可用作本发明的治疗剂的有效成分。
在本发明中使用的人源化抗体的理想的具体例子如人源化抗H1.24抗体(参照特愿平8-264756)。
表达和生产
象上述那样构建的抗体基因使用常规的方法使其表达可以得到。如果用哺乳动物，可以通过使常用的启动子、要表达的抗体基因、位于其3′下游聚腺苷酸信号从功能上有机结合形成的DNA来表达或者是通过含有要表达的抗体基因的载体来表达。例如，作为启动子/增强子可以使用人巨细胞病毒早期启动子/增强子(human cytomegaolovirus immediateearly promoter/enhancer)。
另外作为本发明使用的用于抗体表达的启动子/增强子也可以使用逆转录病毒、多型瘤病毒、腺病毒、猿病毒40(SV40)等病毒启动子/增强子和人延伸因子-1α(HEF1α)等来自哺乳动物的启动子/增强子。
例如，使用SV40启动子/增强子时，按照Mulligan等人的方法(Nature(1979)277，108)，而使用HEF1α启动子/增强子时，按照Mizushima等人方法(Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)很容易实施。
如果使用大肠杆菌，可以通过使常用的有用启动子、用于抗体分泌的信号序列、要表达的抗体基因从功能上有机结合使其表达。例如作为启动子，可以使用lacZ启动子、araB启动子。使用lacZ启动子时，按照Ward等人的方法(Nature(1098)341，544-546；FA SEB J.(1992)6，2422-2427)实施，而使用araB启动子时按照Better等人的方法(Science(1988)240，1041-1043)实施。
作为用于抗体分泌的信号肽在使抗体分泌到大肠杆菌的胞质时可以使用pelB信号序列(Lei，S.P.et al J.bacteriol.(1987)169，4379)。在将胞质产生的抗体分离后，再使抗体适当折叠(refold)后再使用(例如，参照WO96/30394)。
作为复制起点可以使用来自SV40、多型瘤病毒、腺病毒、牛***(状)瘤病毒(BPV)等的复制起点。另外为了在宿主细胞系扩增基因拷贝数，表达载体作为选择标记可以含有氨基糖苷转移酶(APH)基因、胸苷酸激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因。
为了制造本发明中使用的抗体可以使用任何一种生产抗体的体系。生产抗体的体系有体外和体内体系。作为体外体系，有使用真核细胞的产生系和使用原核细胞的产生系。使用真核细胞时，有使用动物细胞、植物细胞、真菌细胞的产生系。作为动物细胞已知有(1)哺乳类细胞，例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK(baby hamster kidney)、HeLa，Vero、(2)两栖类细胞，例如非洲爪蛙卵亲本细胞、或(3)昆虫细胞，sf9、sf21、Tn5等。作为植物细胞已知有来自烟草(Nicotiana)属，例如Nicotiana tabacum的细胞，可以对他们进行愈伤组织培养就可以。作为真菌细胞已知有酵母，例如Saccharomyces属中的Saccharomycesserevisiae，线状菌，例如Aspergillus属的Aspergillus niger等。
使用原核细胞时，有利用细菌细胞的生产体系。作为细菌细胞已知有大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌。
通过转化将目的基因导入上述那些细胞，于体外培养转化的细胞就可得到抗体。培养按照常规方法进行。例如，作为培养液可以使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM，也可以同时使用胎牛血清(FCS)等血清补液。通过将导入了抗体基因的细胞移到动物的腹腔中，在体内可以生产抗体。
另外，作为体内的生产体系，有使用动物的和使用植物的生产体系。使用动物时有利用哺乳动物、昆虫的生产体系。
作为哺乳动物可以利用山羊、猪、绵羊、小鼠和牛(VickiGlaser，SPECTRUM Biotechnology Apploication，1993)。作为昆虫可以利用蚕。
使用植物时可利用烟草等。
将抗体基因导入这些动物或植物中，在动物或植物中使抗体产生，回收。例如，将抗体基因***到编码象山羊β酪蛋白那样的在乳汁中固有的蛋白质的基因中，制备成融合基因。将含有***了抗体基因的融合基因的DNA片段注入山羊的胚胎中，然后将该胚胎导入母山羊中。从接受了胚胎的山羊产下的转基因山羊或其后代的乳汁中可获得所希望的抗体。为了增加从转基因山羊含有的所希望的抗体的乳汁量，也可以在转基因山羊中使用适宜的激素(Ebert，K.M.et al.，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
另外使用蚕生产抗体时，用***了目的抗体基因的空泡病毒感染蚕，从蚕的体液中可得到所希望的抗体(Susumu，M.et al.，Nature(1985)315，592-594)。而使用烟草时，将目的抗体基因***植物表达用载体，例如pMON530中，农杆菌属(Agrobacterium tumefaciens)那样的细菌中，然后用该细菌感染烟草，例如Nicotiana tabacum，再从该烟叶中获得所希望的抗体(Julian，K.C.Ma et al.，Eur.J.Immunol.(1994)24，131-138)。
象上述那样在体外或体内的生产体系中生产抗体时，可以将编码重链(H链)或轻链(L链)的DNA分别***表达载体同时转化宿主，也可以将编码H链和L链的DNA***单一的表达载体，然后转化宿主(国际专利申请公开号WO94-11523)。
也可以使上述得到的抗体与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合，作为抗体修饰物来使用。本专利申请的范围中所谓的“抗体”也包含这些抗体修饰物。为了得到这样的抗体修饰物，通过对得到的抗体实施化学修饰就可获得。这些方法已经在本领域建立了。
抗体的分离、纯化
上述那样生产、表达的抗体可以从细胞内外、宿主分离、纯化直至均一为止。本发明使用的抗体的分离、纯化可以通过亲和层析实施。作为亲和层析用的柱子例如可以使用蛋白A柱、蛋白G柱等柱子。蛋白A柱用的载体，例如有Hyper D，POROS，Sepharose F.F.等。
另外也可以使用通常的蛋白质分离、纯化方法，并没有什么限定。例如可以适当使用除了上述的亲和层析以外的层析、过滤、超滤、盐析、透析等方法，也可组合起来分离、纯化本发明中使用的抗体。作为层析，例如有离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤等。
抗体浓度的测定
用上述方法获得的抗体浓度的测定可以通过吸光度的测定或ELISA等进行。即，在进行吸光度测定时，将本发明使用的抗体或含有抗体的样品用PBS(-)适当稀释后，测定280nm的吸光度，以1mg/ml作为35OD就可算出抗体浓度。而利用ELISA测定时，可以象以下那样测定。即，将羊抗人IgG(BIO SOURCE生产)用0.1M碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)稀释到1μg/ml，然后取该稀释液100μl加到96孔板中(Nunc生产)，于4℃温育过夜，使抗体固层化。
封闭后，添加适当稀释的本发明中使用的抗体或含有抗体的样品，或作为标准样品的人IgG(CAPPEL生产)100μl，于室温下温育一小时。洗净后，加入稀释5000倍的碱性磷酸酶标记抗人IgG(BIO SOURCE生产)100μl，室温下温育1小时。洗涤后加底物溶液，经温育后，用MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad生产)测定405nm的吸光度，算出目的抗体的浓度。
FCM解析
骨髓瘤细胞与本发明使用的抗体的反应性可通过FCM(流式细胞仪)解析。作为细胞可以使用建立的细胞株或新分离出的细胞。作为建立的细胞株有来自骨髓瘤的RPMI8226(ATCC CCL 155)、U266(ATCC TIB196)、KPMM2、KPC-32、来自浆细胞瘤的ARH-77(ATCC CRL1621)。
将上述细胞用PBS(-)洗净后，加入用FACS缓冲液(含有2％胎牛血清、0.05％叠氮化钠的PBS(-))稀释成25μg/ml的抗体或对照抗体100μl，于冰水中放置30分钟。用FACS缓冲液洗净后，加入25μg/ml的FITC标记的羊抗鼠抗体(GAM，Becton.Dickinson生产)100μl，于冰水中放置30分钟。然后用FACS缓冲液洗净后，悬浮于600μl或1ml的FACS缓冲液中，用FACScan(Becton Dickinson生产)测定各个细胞的荧光强度。
筛选方法
在对HM1.24抗原的表达增强剂进行筛选时，例如可以使用在无刺激状态下不表达HM1.24抗原，或表达很少的细胞通过FCM解析来测定。例如，将实施例记载的细胞与被检测样品温育1～2天，然后用作为一次抗体使用的鼠抗人HM1.24抗体染色。将细胞洗净后，再用作为二次抗体使用的FITC标记的鼠IgG抗体染色。最后洗净细胞，通过流式细胞仪测定细胞的FITC荧光强度。
另外不通过上述的间接染色法，而是用高浓度的免疫球蛋白处理细胞，封闭Fc受体后，通过用FITC标记的抗HM1.24抗体直接法进行染色分析也可以。
另外通过使用HM1.24启动子序列的报道基因分析也可以筛选HM1.24抗原的表达增强剂。作为报道基因可以使用荧光素酶。构建在报道基因上游含有HM1.24启动子序列的质粒，然后转化细胞，将获得的细胞与被检测物质培养1～2天，回收的细胞经FCM解析，可以筛选增强HM1.24抗原表达的药剂。
细胞毒活性
ADCC活性的测定
本发明使用的抗体是具有细胞毒活性例如ADCC活性的抗体。在本发明中对骨髓瘤细胞的ADCC活性是按如下过程测定的。首先，从人的末梢血或骨髓中通过比重离心法分离出单核细胞，作为效应细胞(Effectorcell：E)。
作为靶细胞(Target cell：T)可以通过用51Cr对RPMI8226(ATCCCCL 155)，U266(ATCC TIB 196)，KPMM2，KPC-32，ARH-77(ATCCCRL 1621)等细胞进行标记来制备。然后向标记的靶细胞加入测定ADCC活性的抗体，温育，然后加入相对靶细胞比例合适的效应细胞进行温育。
取培养后的上清，用γ计数器测定放射性。此时，在最大游离放射能测定中抗原使用1％的NP-40。细胞毒活性(％)可以通过(A-C)/(B-C)×100来计算。其中，A代表在抗体存在下游离的放射活性(cpm)，B代表由于NP-40而引起的放射活性(cpm)、C代表不含有抗体只是在培养液中游离的放射活性(cpm)。
细胞毒活性的增强
为了发挥象ADCC活性那样的细胞毒活性，最好使用作为人抗体稳定区(C区)的Cγ，特别是Cγ1，Cγ3。另外通过附加、改变、修饰一部分抗体C区的氨基酸，可以诱导更高ADCC活性，或CDC活性。
例如，象通过氨基酸置换使得IgG象IgM那样的聚合(Smith，R.I.F.&Morrison，S.L.BIO/TECHNOLOGY(1994)12，683-688)、象通过附加氨基酸使得IgG象IgM那样的聚合(Smith，R.I.F.et al.，J.Immunology(1995)154，2226-2236)、通过编码L链基因的串联连接进行表达(Shuford，W.et al.，Science(1991)252，724-727)或通过氨基酸置换引起的IgG的二聚体化(Caron，P.C.et al.，J.Exp.Med.(1992)176，1191-1195，Shopes，B.，J.Immunology(1992)148，2918-2922)、通过化学修饰引起的IgG的二聚体化(Wolff，E.A.et al.，Cancer Res.(1993)53，2560-2565)、以及通过抗体铰链区的氨基酸的改变引起有效功能的导入(Norderhaug，L.et al.，Eur.J.Immunol.(1991)21，2379-2384)。
这些变化都可以通过利用使用引物在寡聚物特殊位置导入变异的方法，通过利用限制性内切酶酶切部位添加碱基序列，使用引起共价结合的化学修饰剂来实现。
患者的治疗
本发明的内容之一是通过将增强HM1.24抗原表达量的药剂和抗HM1.24抗体用于患者，治疗骨髓瘤，尤其是治疗多发性骨髓瘤的方法。增强HM1.24抗原表达量的药剂最好是α干扰素或γ干扰素。干扰素和抗HM1.24抗体既可以一起用，也可以分别使用。分别投药时，首先使用干扰素，最好在96小时内再使用抗HM1.24抗体。使用干扰素和抗HM1.24抗体的时间间隔只要通过使用干扰素使HM1.24抗原表达量增强并没有限制，最好是在96小时以内，理想的是在72小时以内，最理想的是在48小时以内。根据患者临床反应数次、交替使用干扰素和抗HM1.24抗体也都在本发明范围内。至于给药方式，希望直接注射到血液中，静脉给药或动脉给药也都可以。也可以连续给药，也可以通过静脉点滴给药。
本发明的其它内容是含有α干扰素或γ干扰素和抗HM1.24抗体的骨髓瘤治疗剂。可以含有以往在干扰素和抗体制剂中使用的药学上容许的载体，例如，除了含有通常的稳定剂和赋形剂外，还可同时含有生理盐水或5％葡聚糖。
在本发明的其它内容中，还有治疗骨髓瘤患者的以抗HM1.24抗体为有效成分的药物组合物，以及提供与α干扰素或γ干扰素并用疗法有关的指导书。
在本发明的其它内容中，还有治疗骨髓瘤患者的含有抗HM1.24抗体为有效成分的药物组合物，用于与α干扰素或γ干扰素并用的药物组合物。
实施例1.利用α干扰素使骨髓瘤细胞中的HM1.24抗原表达量增强
对来自人骨髓瘤细胞株U266(ATCC TIB 196)和多发性骨髓瘤患者的骨髓的骨髓瘤细胞使用含有10％胎牛血清(WhittakerBioproducts，Inc，Walkersville，ME，USA)的RPMI1640培养基(Sigma，StLouis，MO，USA)，于37℃下的5％二氧化碳培养箱中进行培养。生产鼠抗HM1.24抗体的杂交瘤保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所(茨城县筑波市东1丁目1番3号)，保藏号为FERM BP-5233(保藏日期1995年4月27日)。
对骨髓瘤细胞(1×105/ml)在1000U/ml的天然型α干扰素(大冢制药，东京)存在下或不存在下培养48小时，通过流式细胞仪测定HM1.24抗原(序列1给出的编码该抗原的碱基序列)的变化。将细胞用添加了0.1％牛血清清蛋白(Sigma，St Louis，MO，USA)和0.02％叠氮化钠的磷酸缓冲液(Gibco BRL，Grand Island，NY，USA)洗净后，悬浮于加有人免疫球蛋白(3mg/ml、绿十字、大阪)的PBS(100μl)中，于4℃下反应15分钟。
然后加入2μl的FITC-人IgG1(1mg/ml)或FITC-抗HM1.24抗体(1mg/ml)，于4℃下染色60分钟。使用患者骨髓瘤细胞时，为了鉴定骨髓瘤细胞加20μl的PE-anti-CD38(Becton Dickinson，SanJose，CA，USA)进行双重染色。染色后，用PBC将细胞洗两次，保存在含有1％仲甲醛(和光纯药，大阪)的PBS中。然后利用流式细胞仪(EPICSXL，Coulter，Hialeah，FL，USA)解析HM1.24抗原的表达。
结果发现骨髓瘤细胞株U266(图1)和患者骨髓瘤细胞(图2)在无刺激状态下表达HM1.24抗原，在α干扰素的刺激下HM1.24抗原的表达量进一步增加。
α干扰素使骨髓瘤细胞的HM1.24抗原的表达进一步增强，使与骨髓瘤细胞结合的抗HM1.24抗体数目增加。由于利用抗HM1.24抗体治疗的抗肿瘤效果与结合的抗HM1.24抗体的数目成比例，所以对于骨髓瘤患者在使用α干扰素后进行抗HM1.24抗体治疗增强抗体的治疗效果，进一步提高治疗的有效性是有希望的。
实施例2.通过解析报道基因解析HM1.24抗原的表达功能
为了研究抗原的诱导表达是否受HM1.24启动子区的调节，对启动子区的报道基因进行了解析。
HM1.24启动子区的基因(序列3)是通过PCR克隆获得的。使用DNAzol reagent(GIBCO)从人末梢血单核细胞制备基因组DNA。以得到的基因组DNA为模板，使用引物HM2k(aaaggtaccagctgtctttctgtctgtcc)(序列4)和BST2B(atagtcatacgaagtagatgccatccag)(序列5)，使用TaKaRa Taq(宝酒造、大津)，利用Thermal Cycler 480(PerkinElmer，CA，USA)进行PCR(94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，30个循环)。
用限制性内切酶KpnI和BgIII(宝酒造)对获得的大约2kb的片段进行处理，然后使用DNAligation kit ver.II(宝酒造)在报道基因质粒pGL3-basic(Promega，WI，USA)的KpnI-BgIII位点进行克隆，转化E.coliJM109感受态细胞(日本基因公司生产)。将转化的大肠杆菌用含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基于37℃下进行培养，使用QIAGENplasmid maxi kit(QIAGEN，Hilden，Germany)制备质粒。
用限制性内切酶KpnI和XhoI对获得的质粒HM-2k/GL3进行处理，再利用kilo-sequence用缺失试剂盒(宝酒造)制作缺失克隆，可获得含有直至转录起始点上游-493bp的质粒HM-493/GL3。用限制性内切酶KpnI和AfIII对质粒HM-2k/GL3进行处理，用上述方法制作缺失克隆，获得分别含有直至转录起始点上游-151bp或-77bp的质粒HM-151/GL3和HM-77/GL3。
向细胞导入质粒使用Polyethylenimine-Transferrinfection Kit(TfPEI-kit)(Bender MedSystems，Vienna，Austria)，荧光素酶分析使用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)。将细胞株用含有50μM Defferrioxamine、10％FBS的RPMI-1640培养过夜。为了使导入的质粒与Tf-PEI成为复合物，制作含有终浓度为20μg/ml的报道基因质粒、0.4μg/ml的pRL-SV40、1μg/mlTf-PEI试剂的混合液，于室温下温育20分钟。加入5×105细胞/ml的细胞，其加入量是Tf-PEI和质粒的混合液的3倍，于37℃下温育4小时，用培养基洗净后，加入到96孔平底板进行培养，每孔100μl(细胞浓度为2×105细胞/ml)。
添加IFN-α，其终浓度分别为0，10，100，或1000U/ml，于37℃下培养2天。细胞用PBS(-)洗净后，溶解于20μl的Passive Lysis Buffer中，取6μl加到C96White Polysorp Fluoronunc plate(Nunc)，用Luminoskan(Labsystems)在底物溶液为30μl，测定时间为10秒的条件下测定Firefly和Renila的各自发光强度。测定值经Firefly/Renila补正后，以对照(培养基)为1，可求出相对活性。
结果可以确认无论是在含有上游2kbp的质粒还是在含有493bp的质粒中报道的荧光素酶活性的上升都依赖于IFN-α的浓度，启动子区的转录活性上升引起抗原的表达诱导(图3)。
另外如果使用转录起始点上游151bp或77bp的报道质粒，结果表明：如果使用上游151bp报道质粒由于IFNα的刺激使得荧光素酶活性上升，而如果用上游77bp的报道质粒，则看不到由于IFNα的刺激使得荧光素酶活性发生的变化(图4)。由于在77bp～151bp区域内存在着与GASelement，ISRE同源性高的序列，该序列是响应IFNα刺激被激活的转录调节因子，表明IRF系列的转录调节因子与荧光素酶活性有关。
实施例3.γ干扰素增强骨髓瘤细胞中HM1.24抗原表达量
利用实施例1记载的方法使用1000U/ml的天然型γ干扰素(R & DSystem公司生产)进行解析。结果表明在骨髓瘤细胞株U266(图5)和患者骨髓瘤细胞(图6)中都可以观察到与α干扰素同样的情况，即HM1.24抗原表达量增大。
实施例4.IRF-2与HM1.24启动子区的结合
为了鉴定与HM1.24启动子区结合的转录因子，象如下所述那样进行以HM1.24启动子区为探针的Electrophoresis Mobility Shift Assay(EMSA)，作为结合因子鉴定IRF-2。
(1)核提取物的制备
将骨髓瘤细胞U266-B1(ATCC-TIB196)用含有10％FBS(HyClone)的RPMI-1640培养基(GIBCO-BRL)于37℃、5％二氧化碳培育箱中进行培养。为了使α干扰素(IFN-α)(Pepro Tech EC)能刺激细胞，在培养基中添加IFN-α，使其终浓度为1000U/ml，收集添加后30分钟、2小时、4小时以及8小时的细胞。将细胞悬浮于冷的PBS(-)中，经1000rpm离心分离去掉上清后悬浮于10mMTris，10mMNaCl，6mMMgCl2溶液中。
然后在冰中静置5分钟再次离心，去掉上清。将细胞悬浮于含有10mMTris、10mM NaCl、6mM MgCl2、1mM DTT、0.4mM PMSF、1mMNa3VO4的溶液中。使用玻璃匀浆器于冰上研磨细胞，然后于6000g下离心3分钟，去掉上清。将细胞悬浮于萃取缓冲液(20％甘油、20mMHEPES、420mM NaCl、1.5mM MgCl2、0.2mM EDTA、0.2mM PMSF、1mM DTT、0.1mM Na3VO4，2mg/ml抑肽酶、5mg/ml亮抑蛋白酶肽)中，然后在冰中静置20分钟于12000g下离心10分钟，收集上清。
(2)标记探针的制备
作为探针是制作在HM1.24启动子区域含有与GAS(IRN-γ活性部位：GAS共有序列ttncnnnaa(序列8))、ISRE(IRN-α刺激应答因子：ISRE共有序列ngaaanngaaact(序列9))有同源性的序列(ttcccagaa(序列10))以及ggaaactgaaact(序列11)的ISRE2。即将寡DNA ISRE-F2(aatttctgggaaactgaaactgaaaacct(序列12))和ISRE-F2(aattaggttttcagtttcagtttcccaga(序列13))混合，使其退火，做成双链DNA探针ISRE2。
另外，将寡DNA adp-1(catggcatctacttcgtatgactattgcagagtgcc(序列14))和adp-2(catgggcactctgcaatagtcatacgaagtagatgc(序列15))混合，使其退火，做成unrelated探针adp。探针的标记是利用Band Shift Kit(Amersham Pharmacia Biotech)，按照其标准的程序进行的。即，在含有[α-32P]dATP(20μCi)(Amersham Pharmacia Biotech)的反应液中对上述制作的双链DNA50ng于37℃下进行1小时Klenow片段聚合酶反应。反应结束后的溶液稀释2倍，加到Nick Spin Column(AmershamPharmacia Biotech)上，经1600rpm离心4分钟，将回收的溶液作为标记探针。
(3)通过IFN-α刺激产生的结合因子随时间的变化
按照Band Shift Kit(Amersham Pharmacia Biotech，NJ，USA)的标准程序进行如下操作。将试剂盒附带的10×结合缓冲液2μl(100mMTris-HCl(pH7.5)、500mM NaCl、5mM DTT)加到上述(1)中经时制备的5μg提取物中，加入50％甘油4μl，1％NP-40 1μl，以及1μl的poly(dI-dC)-poly(dI-dC)，添加上述(2)制备的32P标记ISRE-探针2μl，然后加水使总量配成20μl后，将该反应混合物于室温下温育20分钟，使得可能存在于上述提取物中的结合因子与上述32P标记ISRE-探针结合。
向18μl反应液中加入10×染色液(试剂盒附带的)2μl，于1×Tris-甘氨酸缓冲液(25mM Tris、190mM甘氨酸、1mM EDTA、pH8.1)中在7.5％丙烯酰胺凝胶上进行电泳，电泳后，将凝胶贴到滤纸上，将蛋白质转移到滤纸上。用经干胶器干燥的滤纸使X光片感光，检测信号。
为了进行比较，配制没有加提取物的反应液[(NEC-)]、添加了来自没有用α干扰素刺激而培养的细胞培养物的提取物的反应液[0h]、在8小时的培养液的提取物中加入未标记ISRE2探针50ng代替标记探针的反应液[8h(+cold)]，以及在8小时培养后的提取液中加入unrelated探针adp 50ng的反应液[8h(+cold unrelated)]，同样进行上述处理，检测信息。
结果如图7所示。就象图7表明的那样，在用干扰素刺激下培养的U266-B1细胞中，与相当于一部分HM1.24启动子的双链DNA结合的物质的量经时增加。
(4)通过与各种抗体的反应鉴定转录因子
象上述(1)记载的那样将骨髓瘤细胞U266-B1(ATCC-TIB196)在有1000U/ml的α干扰素存在下培养8小时，制备提取物。按照Band ShiftKit(Amersham Pharmacia Biotech)的标准程序进行如下操作。即向5μg的提取物中加入2μg抗体，于室温下温育15分钟，得到提取液/抗体反应液。将2μl提取液/抗体反应液和上述(2)制备的标记探针2μl添加到上述试剂盒附带的10×结合缓冲液2μl、50％甘油4μl、1％NP-401μl和1μl的Poly(dI-dC)·Poly(dI-dC)中，然后加水使总量为20μl，将该反应混合物于室温下温育20分钟。
将该反应混合物象前面(3)记载的那样进行电泳，检测其信号。
作为上述的抗体可以使用下面的抗体(无论那一个都是来自SantaCruz Biotechnology)。
抗-人STAT1 p84/p91(E-23)：(说明)兔多克隆抗体(SC-346X)
抗-人STAT2(C-20)：兔多克隆抗体(SC-476X)
抗-鼠STAT3(K-15)：兔多克隆抗体(SC-483X)
抗-人ISGF-3γp48(C-20)：兔多克隆抗体(SC-496X)
抗-人IRF-1(C-20)：兔多克隆抗体(SC-497X)
抗-人IRF-2(C-19)：兔多克隆抗体(SC-498X)
抗-鼠ICSAT(M-17)：山羊多克隆抗体(SC-6059X)
另外作为对照，配制使用了没有α干扰素刺激下培养的细胞的提取物的反应液[0h]；添加了在有1000U/ml的α干扰素刺激下培养了8小时的细胞的提取物、而没有添加抗体的反应液[8h]；添加了未标记的ISRE2探针50ng取代标记ISRE2探针的反应液[8h(+cold)]；以及添加了未标记的dp探针50ng取代标记的ISRE2探针的反应液[8h(+unrelatedcold)]，象上述同样进行处理。
结果如图8所示。就象图8表明的那样，与取自在α干扰素刺激下培养的细胞的提取物中的标记ISRE2探针结合的成分只与抗-IRF-2抗体结合，与HM1.24启动子结合并激活它的因子是转录因子IRF-2。
实施例5.确认IRF-2激活HM1.24启动子的作用
通过使用了U266细胞的报道基因分析测定由于IRF-2共表达对HM1.24启动子活性的影响，表明实际上IRF-2具有HM1.24启动子的转录激活作用。在以下实验中使用了骨髓瘤细胞株U266-B1(ATCCTIB196)。细胞用含有10％FBS(GIBCO BRL)的RPMI-1640培养基(GIBCO)(以下称为培养基)于37℃、5％二氧化碳培育箱中进行培养。
(1)含有HM1.24启动子区的质粒的构建
HM1.24启动子区的基因通过PCR cloning可以获得。使用DNAzolreagent(GIBCO)从人末梢血单核细胞制备基因组DNA。以得到的基因组DNA为模板，使用引物HM2k(aaaggtaccagctgtctttctgtctgtcc)(序列16)和BST2B(atagtcatacgaagtagatgccatccag)(序列17)，利用TaKaRaTaq(宝酒造，大津)，利用Thermal Cycler 480(Perkin Elmer，CA，USA)进行PCR(94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，30个循环)。
用限制性内切酶KpnI和BgIII(宝酒造)对获得的大约2kb的片段进行处理，然后使用DNA ligation kit ver.II(宝酒造)在报道基因质粒pGL3-basic(Promega，WI，USA)的KpnI-BgIII位点进行克隆，转化E.coliJM109感受态细胞(日本基因公司生产)。将转化的大肠杆菌用含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基于37℃下进行培养，使用QIAGENplasmid maxi kit(QIAGEN，Hilden，Germany)制备质粒。
用限制性内切酶KpnI和XhoI对获得的质粒HM-2k/GL3进行处理，再利用kilo-sequence用缺失试剂盒(宝酒造)制作缺失克隆，可获得含有直至转录起始点上游-493bp的质粒HM-493/GL3。用限制性内切酶KpnI和AfIII对HM-2k/GL3进行处理，用上述方法制作缺失克隆，可获得含有直至转录起始点上游-151bp的HM-151/GL3。
再以HM-2k/GL3为模板，使用引物10S(tttcggtacctaattaatcctctgcctg)(序列18)和GL引物2(ctttatgtttttggcgtcttcca)(序列19)，利用TaKaRaTaq(宝酒造，大津)，使用Thermal Cycler 480(Perkin Elmer，CA，USA)进行PCR(94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，30个循环)。用限制性内切酶KpnI和BgIII(宝酒造)对获得的片段进行处理，然后使用ligation high(东洋纺)在报道基因质粒pGL3-basic(Promega，WI，USA)的KpnI，BgIII位点进行克隆，转化E.coli JM109感受态细胞(日本基因公司生产)。
将转化的大肠杆菌用含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基于37℃下进行培养，使用QIAGEN plasmid maxi kit(QIAGEN，Hilden，Germany)制备质粒。可获得含有直至转录起始点上游125bp的质粒HM-125/GL3。再以HM-2k/GL3为模板，使用引物HMP700(aaaggtaccagagtttacctggtatcctgg)(序列20)和GL引物2，按照同样的过程进行PCR，通过在pGL3-basic的KpnI，BgIII位点导入片段，可获得含有直至转录起始点上游约700bp的质粒HM-700/GL3。
再以HM-2k/GL3为模板，使用引物HMP700和11A′(cagaggattaattaggtaccgaaagagaggtgggctttt)(序列21)，使用KOD聚合酶(东洋纺)，利用Thermal Cycler 480(Perkin Elmer，CA，USA)进行PCR(98℃15秒，65℃2秒，74℃30秒，25个循环)。用Zero BluntTOPO PCR cloning kit for sequencing ver.B(Invitrogen)将获得的片段***到pCR4 Blunt-TOPO载体中。用限制性内切酶KpnI处理获得的质粒，回收大约550bp的片段，然后使用ligation high将片段导入到HM-125/GL3的KpnI位点。这样就可得到缺失了转录起始点上游-125～-145附近片段的dISRE/GL3。
(2)IRF-2表达质粒的构建
IRF-2表达质粒制作如下。用TRIzol试剂(GIBCO BRL)从在α干扰素(1000U/ml)刺激后经过8小时的U266细胞提取总RNA。使用First-strand cDNA Synthesis kit(phamacia)，以得到的RNA为模板，NotI-d(T)18为引物，于37℃下进行1小时逆转录反应。以得到的cDNA为模板，以IRF2-F2(ttgtattggtagcgtgaaaaaagc)(序列22)、IRF2-R2(cagctagttcacattatctcgtcc)(序列23)为引物，使用LA-Taq(宝酒造)，进行PCR(94℃45秒，60℃45秒，72℃60秒，40个循环)。
以得到的PCR反应液为模板，IRF2-F1(agagggtaccatgccggtggaaaggatgcg)(序列24)和IRF2-R1(agtcggtaccttaactgctcttgacgcggg)(序列25)为引物，使用KOD聚合酶(东洋纺)，再次进行PCR(94℃45秒，60℃45秒，72℃60秒，30个循环)。用限制性内切酶KpnI处理得到的片段，然后使用ligation high(东洋纺)导入到表达质粒pTracer-CMV(Invitrogen)的KpnI位点，获得IRF-2表达质粒pIRF-2/Tracer。
(3)报道基因活性的测定
向细胞导入质粒使用Polyethylenimine-Transferrinfection Kit(TfPEI-kit)(Bender MedSystems，Vienna，Austria)，荧光素酶分析使用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)。将细胞株用含有50μM Defferrioxamine、10％FBS的RPMI-1640培养过夜。为了使导入的质粒与Tf-PEI成为复合物，制作含有终浓度为20μg/ml的报道基因质粒、20μg/ml的pIRF-2/Tracer或pTracer-CMV、0.4μg/ml的pRL-SV40、1μg/mlTf-PEI试剂的混合液，于室温下温育20分钟。
加入5×105细胞/ml的细胞，其加入量是Tf-PEI和质粒的混合液的3倍，于37℃下温育4小时，用培养基洗净后，加入到96孔平底板进行培养，每孔100μl(细胞浓度为2×105细胞/ml)。添加IFN-α，其终浓度分别为0，1000U/ml，于37℃下培养2天。细胞用PBS(-)洗净后，溶解于20μl的Passive Lysis Buffer中，取6μl加到C96 White PolysorpFluoronunc plate(Nunc)上，用Luminoskan(Labsystems)在基质溶液为30μl，测定时间为10秒的条件下分别测定Firefly和Renila的发光强度。测定值用Firefly/Renila对转染效率进行补正后，可求出相对活性。
(4)结果
将HM1.24启动子报道质粒和IRF-2表达质粒导入U266细胞，测定报道活性(图9)。结果表明使用含有作为IRF-2结合部位的ISRE基元序列的-700和-151的质粒通过IRF-2共表达使得荧光素酶活性上升。另外使用缺失了ISRE序列的dISRE/GL3并没有看到由于IRF-2共表达使得荧光素酶活性发生的变化。以上结果表明IRF-2结合于HM1.24启动子的ISRE区，并增强其转录活性。
(5)确认由于IRF-2的强制表达使得HM1.24抗原的表达增强
由于IRF-2引起的HM1.24抗原表达量的变化可以通过用上述方法将IRF-2表达质粒(pIRF-2/Tracer)或对照质粒(pTracer/CMV)导入U266细胞，培养1～2天后，收集细胞，用作为一次抗体使用的鼠抗人HM1.24抗体染色。将细胞洗净，再用作为二次抗体使用的FITC标记的抗鼠IgG抗体染色。将细胞洗净后，利用流式细胞仪测定细胞的FITC荧光强度。可以确认在导入IRF-2表达质粒的细胞中存在的FITC强度高的细胞要比导入对照质粒的细胞中的多。
根据专利合作条约第13规则的2的保藏微生物的保藏机构
保藏机构  名称：工业技术院生命工学工业技术研究所
                地址：茨城县筑波市东1丁目1番3号
微生物(1)表示：Escherichia coli DH5α(pRS38-pUC19)
保藏号：FERM BP-4434保藏日：1993年10月5日(2)表示：Mouse-mouse hybridoma HM1.24保藏号：FERM BP-5233保藏日：1995年4月27日(3)表示：Escherichia coli DH5α(pUC19-RVHr-AHM-gγ1)保藏号：FERM BP-5643保藏日：1996年8月29日(4)表示：Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24H-gγ1)保藏号：FERM BP-5644保藏日：1996年8月29日(5)表示：Escherichia coli DH5α(pUC19-RVLa-AHM-gκ)保藏号：FERM BP-5645保藏日：1996年8月29日(6)表示：Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24L-gκ)保藏号：FERM BP-5646保藏日：1996年8月29日
                    序列表<110>CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA<120>以α干扰素为有效成分的增强HM1.24表达的药剂<130>H757<160>5<210>1<211>1073<212>DNA<213>Homosapiens<223>编码HM1.24蛋白质抗原的核苷酸序列<400>1gaattcggca cgagggatct gg atg gca tct act tcg tat gac tat tgc        49
                     Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys
                       1               5aga gtg ccc atg gaa gac ggg gat aag cgc tgt aag ctt ctg ctg ggg     97Arg Val Pro Met Glu Asp Gly Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly10                  15                  20                  25ata gga att ctg gtg ctc ctg atc atc gtg att ctg ggg gtg ccc ttg    145Ile Gly Ile Leu Val Leu Leu Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu
             30                  35                  40att atc ttc acc atc aag gcc aac agc gag gcc tgc cgg gac ggc ctt    193Ile Ile Phe Thr Ile Lys Ala Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu
         45                  50                  55cgg gca gtg atg gag tgt cgc aat gtc acc cat ctc ctg caa caa gag    241Arg Ala Val Met Glu Cys Arg Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu
     60                  65                  70ctg acc gag gcc cag aag ggc ttt cag gat gtg gag gcc cag gcc gcc    289Leu Thr Glu Ala Gln Lys Gly Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala
 75                  80                  85acc tgc aac cac act gtg atg gcc cta atg gct tcc ctg gat gca gag    337Thr Cys Asn His Thr Val Met Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu90                  95                 100                 105aag gcc caa gga caa aag aaa gtg gag gag ctt gag gga gag atc act    385Lys Ala Gln Gly Gln Lys Lys Val Glu Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr
            110                 115                 120aca tta aac cat aag ctt cag gac gcg tct gca gag gtg gag cga ctg    433Thr Leu Asn His Lys Leu Gln Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu
        125                 130                 135aga aga gaa aac cag gtc tta agc gtg aga atc gcg gac aag aag tac    481Arg Arg Glu Asn Gln Val Leu Ser Val Arg Ile Ala Asp Lys Lys Tyr
    140                 145                 150tac ccc agc tcc cag gac tcc agc tcc gct gcg gcg ccc cag ctg ctg    529Tyr Pro Ser Ser Gln Asp Ser Ser Ser Ala Ala Ala Pro Gln Leu Leu
155                 160                 165att gtg ctg ctg ggc ctc agc gct ctg ctg cag tga gatcccagga         575Ile Val Leu Leu Gly Leu Ser Ala Leu Leu Gln170                 175                 180agctggcaca tcttggaagg tccgtcctgc tcggcttttc gcttgaacat tcccttgatc  635tcatcagttc tgagcgggtc atggggcaac acggttagcg gggagagcac ggggtagccg  695gagaagggcc tctggagcag gtctggaggg gccatggggc agtcctgggt ctggggacac  755agtcgggttg acccagggct gtctccctcc agagcctccc tccggacaat gagtcccccc  815tcttgtctcc caccctgaga ttgggcatgg ggtgcggtgt ggggggcatg tgctgcctgt  875tgttatgggt tttttttgcg gggggggttg cttttttctg gggtctttga gctccaaaaa  935aataaacact tcctttgagg gagagcacac cttaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa  995aaaattcggg cggccgcc                                               1013<210>2<211>180<212>PRT<213>Homosapiens<223>HM1.24蛋白质抗原的氨基酸序列<400>2Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys Arg Val Pro Met Glu Asp Gly1               5                  10                  15Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly Ile Gly Ile Leu Val Leu Leu
         20                  25                  30Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu Ile Ile Phe Thr Ile Lys Ala
     35                  40                  45Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg Ala Val Met Glu Cys Arg
 50                  55                  60Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu Leu Thr Glu Ala Gln Lys Gly65                  70                  75                  80Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Val Met
             85                  90                  95Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu Lys Ala Gln Gly Gln Lys Lys
        100                 105                 110Val Glu Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr Thr Leu Asn His Lys Leu Gln
    115                 120                 125Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Arg Glu Asn Gln Val Leu
130                 135                 140Ser Val Arg Ile Ala Asp Lys Lys Tyr Tyr Pro Ser Ser Gln Asp Ser145                 150                 155                 160Ser Ser Ala Ala Ala Pro Gln Leu Leu Ile Val Leu Leu Gly Leu Ser
            165                 170                 175Ala Leu Leu Gln
        180<210>3<211>2016<212>DNA<213>Homosapiens<223>编码HM1.24蛋白质抗原的基因的启动子核苷酸序列<400>3actaaaagtc tctgatatgc agaaataatg gcataagctg tctttctgtc tgtcccctct   60ctctctctct gcctcggctg ccaggcaggg aagggccccc tgtccagtgg acacgtgacc  120cacatgacct tacctatcat tggagatgac tcacactctt taccctgccc cttttgcttt  180gtatccaata aataacagca cagccagaca ttcggggcca ctaccagtct ccgcgcattg  240ctggtagtgg tcccccgggc ccagctgtct tttcttttat ctcttcgtct tgtgtcttta  300tttctacact ctctcgtcgc cgcacacagg gagagaccca ctgaccctgt ggggctggtc  360cctacagtaa ttttaaaggg aagagcaaca aactttcggt ttgcagggct gggactgttt  420acagctgcaa aatttagaga ggacatcaat ctattattat ccacatttta cagctgggga  480aatcaatgct aagagaggaa attcatttgc ccagaggtgc accaccctgg cctccaatgt  540gcaattcatg caattgtgat ttccgacctg gtcccaaact aaccctaaag ttagcaggcc  600agaacagtgc tgctcaaata agtcagctta gtcaaataag tcaggcaaag gtcgtgtctt  660tgcacctgga gtcctggcca ggctggtagg tccctcctcc tgggacaagt tcaccctcag  720aattttcagc aagatcatct cccacagctt gttaattggt tcttggttct aagtgatttt  780tttgtttatt ggtttaagag atgggatccc actctatcac ccaggcttga gtgccgtggc  840acaatcatag ctcgctgcag cctcaaactc ctgggctcga gtgatcctcc tgcctcagcc  900tcccagcctc agcctgggac cacaggcatg taccaccatg cctggctcta agtggcttta  960atggggtcct tctgagggat gttggagtca gggcctgggg ggagttcccc aggccttctg 1020ggaggcctgg gctctggact tgacctcgcc tactgtctgg ccctgctgaa aagaaaaaaa 1080aacatggaaa tggcagacct aacagaatct gggctgtggt caggatgtgg ctgaagaagc 1140cacaagaaaa acatgcagtc ccctttcagc ggtcatgccc agcagttggg tgccgataat 1200gggcctgatt tcctgtagga agccctggct ctcttggcca catggacagt gtctgaggct 1260ggccctgtta ttcccctttg cagatgaaga aacaggctca gagagtttac ctggtatcct 1320ggagtcccag gagcactttt tctggaagta ggagcttgtt tcctgcaggt gccaagacag 1380agaccgacat tgtttgttgg ctgggtcggt ctcccagttt tcagctggct ccagtctcac 1440ctgttgctca cacaccctcc atgtctccca tagtcccctc ggtggggaca gaggcactgg 1500atgaagccct gctcgtcacc acagagacac ctgaacacaa aaaccagtcc ctggggtcag 1560acccaggccc cgcccccaga cccaggccct gccctcactc caccacgcaa ctgtgcaacc 1620tcagtttccc caggtggaga ccggaccaac aatgatggcc tctgcctctt caggtcatag 1680tacagatgaa tacaggctgg cacggcctag gcactcagta acacacggca gaggcacagg 1740gacttaagat ggagtgtccc aggcagccac agttggctgg cacccagttg ggaagggccc 1800aagggctttt aaagcagggt gaaaaaaaaa gcccacctcc tttctgggaa actgaaactg 1860aaaacctaat taatcctctg cctgtaggtg cctcatgcaa gagctgctgg tcagagcact 1920tcctggaact tgctattggt caggacgttt cctatgctaa taaaggggtg gcccgtagaa 1980gattccagca ccctccccta actccaggcc agactccttt cagctaaagg ggagatctgg 2040atg gca tct act tcg tat gac                                       2061Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp
              5<210>4<211>29<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>引物HM2K<400>4aaaggtacca gctgtctttc tgtctgtcc                                     29<210>5<211>78<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>引物BST2B<400>5atagtcatac gaagtagatg ccatccag                                      28<210>6<211>2144<212>DNA<213>Homosapiens<223>编码IRF-2蛋白质的核苷酸序列<400>6aactgacggg ctttcatttc catttcacac accctagcaa cacttatacc ttgcggaatt   60gtattggtag cgtgaaaaaa gcacactgag agggcaccat gccggtggaa aggatgcgca  120tgcgcccgtg gctggaggag cagataaact ccaacacgat cccggggctc aagtggctta  180acaaggaaaa gaagattttt cagatcccct ggatgcatgc ggctagacat gggtgggatg  240tggaaaaaga tgcaccactc tttagaaacc gggcaatcca tacaggaaag catcaaccag  300gagtagataa acctgatccc aaaacatgga aggcgaattt cagatgcgcc atgaattcct  360tgcctgatat tgaagaagtc aaggataaaa gcataaagaa aggaaataat gccttcaggg  420tctaccgaat gctgccccta tcagaacggc cttctaagaa aggaaagaaa ccaaagacag  480aaaaagaaga caaagttaag cacatcaagc aagaaccagt tgagtcatct ctggggctta  540gtaatggagt aagtgatctt tctcctgagt atgcggtcct gacttcaact ataaaaaatg  600aagtggatag tacggtgaac atcatagttg taggacagtc ccatctggac agcaacattg  660agaatcaaga gattgtcacc aatccgccag acatttgcca agttgtagag gtgaccactg  720agagcgacga gcagccggtc agcatgagcg agctctaccc tctgcagatc tcccccgtgt  780cttcctatgc agaaagcgaa acgactgata gtgtgcccag cgatgaagag agtgccgagg  840ggcggccaca ctggcggaag aggaatattg aaggcaaaca gtacctcagc aacatgggga  900ctcgaggctc ctacctgctg cccggcatgg cgtccttcgt cacttccaac aaaccggacc  960tccaggtcac catcaaagag gagagcaatc cggtgcctta caacagctcc tggccccctt 1020ttcaagacct ccccctttct tcctccatga ccccagcatc cagcagcagt cggccagacc 1080gggagacccg ggccagcgtc atcaagaaaa catcggatat cacccaggcc cgcgtcaaga 1140gctgttaagc ctctgactct ccgcggtggt tgttggggct tcttggcttt gttttgttgt 1200ttgtttgtat tttatttttt tctctctgac acctatttta gacaaatcta agggaaaaag 1260ccttgacaat agaacattga ttgctgtgtc caactccagt acctggagct tctctttaac 1320tcaggactcc agcccattgg tagacgtgtg tttctagagc ctgctggatc tcccagggct 1380actcactcaa gttcaaggac caacaagggc agtggaggtg ctgcattgcc tgcggtcaag 1440gccagcaagg tggagtggat gcctcagaac ggacgagata atgtgaacta gctggaattt 1500tttattcttg tgaatatgta cataggcagc actagcgaca ttgcagtctg cttctgcacc 1560ttatcttaaa gcacttacag ataggccttc ttgtgatctt gctctatctc acagcacact 1620cagcaccccc ttctctgccc attccccagc ctctcttcct atcccatccc atcccatccc 1680atcccatccc atcccatccc gctcttttcc tacttttcct tccctcaaag cttccattcc 1740acatccggag gagaagaagg aaatgaattt ctctacagat gtcccatttt cagactgctt 1800taaaaaaaat ccttctaatc tgctatgctt gaatgccacg cggtacaaag gaaaaagtat 1860catggaaata ttatgcaaat tcccagattt gaagacaaaa atactctaat tctaaccaga 1920gcaagctttt ttatttttta tacaggggaa tattttattc aaggtaaaat tctaaataaa 1980atataattgt tttttatctt ttctacagca aatttataat tttaagattc cttttcttgt 2040ttatcagcag ttgttattac atccttgtgg cacatttttt tttaattttg taaaggtgaa 2100aaaagctttt atgagctcat ctagcaatca gattttcctg tgga                  2144<210>7<211>349<212>PRT<213>Homosapiens<223>IRF-2蛋白质的氨基酸序列<400>7Met Pro Val Glu Arg Met Arg Met Arg Pro Trp Leu Glu Glu Gln Ile1               5                  10                  15Asn Ser Asn Thr Ile Pro Gly Leu Lys Trp Leu Asn Lys Glu Lys Lys
         20                  25                  30Ile Phe Gln Ile Pro Trp Met His Ala Ala Arg His Gly Trp Asp Val
     35                  40                  45Glu Lys Asp Ala Pro Leu Phe Arg Asn Arg Ala Ile His Thr Gly Lys
 50                  55                  60His Gln Pro Gly Val Asp Lys Pro Asp Pro Lys Thr Trp Lys Ala Asn65                  70                  75                  80Phe Arg Cys Ala Met Asn Ser Leu Pro Asp Ile Glu Glu Val Lys Asp
             85                  90                  95Lys Ser Ile Lys Lys Gly Asn Asn Ala Phe Arg Val Tyr Arg Met Leu
        100                 105                 110Pro Leu Ser Glu Arg Pro Ser Lys Lys Gly Lys Lys Pro Lys Thr Glu
    115                 120                 125Lys Glu Asp Lys Val Lys His Ile Lys Gln Glu Pro Val Glu Ser Ser
130                 135                 140Leu Gly Leu Ser Asn Gly Val Ser Asp Leu Ser Pro Glu Tyr Ala Val145                 150                 155                 160Leu Thr Ser Thr Ile Lys Asn Glu Val Asp Ser Thr Val Asn Ile Ile
            165                 170                 175Val Val Gly Gln Ser His Leu Asp Ser Asn Ile Glu Asn Gln Glu Ile
        180                 185                 190Val Thr Asn Pro Pro Asp Ile Cys Gln Val Val Glu Val Thr Thr Glu
    195                 200                 205Ser Asp Glu Gln Pro Val Ser Met Ser Glu Leu Tyr Pro Leu Gln Ile
210                 215                 220Ser Pro Val Ser Ser Tyr Ala Glu Ser Glu Thr Thr Asp Ser Val Pro225                 230                 235                 240Ser Asp Glu Glu Ser Ala Glu Gly Arg Pro His Trp Arg Lys Arg Asn
            245                 250                 255Ile Glu Gly Lys Gln Tyr Leu Ser Asn Met Gly Thr Arg Gly Ser Tyr
        260                 265                 270Leu Leu Pro Gly Met Ala Ser Phe Val Thr Ser Asn Lys Pro Asp Leu
    275                 280                 285Gln Val Thr Ile Lys Glu Glu Ser Asn Pro Val Pro Tyr Asn Ser Ser
290                 295                 300Trp Pro Pro Phe Gln Asp Leu Pro Leu Ser Ser Ser Met Thr Pro Ala305                 310                 315                 320Ser Ser Ser Ser Arg Pro Asp Arg Glu Thr Arg Ala Ser Val Ile Lys
            325                 330                 335Lys Thr Ser Asp Ile Thr Gln Ala Arg Val Lys Ser Cys
        340                 345<210>8<211>9<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>IFN-γ激活部位(GAS)共有序列<400>8ttncnnnaa                                                           9<210>9<211>13<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>IFN-α刺激应答元件(ISRE)共有序列<400>9ngaaanngaa act                                                     13<210>10<211>9<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223><400>10ttcccagaa                                                               9<210>11<211>13<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223><400>11ggaaactgaa act                                                     13<210>12<211>29<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>ISRE-F2 probe<400>12aatttctggg aaactgaaae tgaaaacct                                     29<210>13<211>29<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>ISRE-F2 probe<400>13aattaggttt tcagtttcag tttcccaga                                     29<210>14<211>37<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>adp-1 probe<400>14catggcatct acttcgtatg actattgcag agtgcc                             37<210>15<211>36<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>adp-2 probe<400>15catgggcact ctgcaatagt catacgaagt agatgc                            36<210>16<211>29<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>引物HM2k<400>16aaaggtacca gctgtctttc tgtctgtcc                                    29<210>17<211>28<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>BST2B<400>17atagtcatac gaagtagatg ccatccag                                     28<210>18<211>28<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>引物10S<400>18tttcggtacc taattaatcc tctgcctg                                   28<210>19<211>23<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>GL引物2<400>19ctttatgttt ttggcgtctt cca                                          23<210>20<211>30<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>引物HMP700<400>20aaaggtacca gagtttacct ggtatcctgg                                   30<210>21<211>39<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>引物11A’<400>21cagaggatta attaggtacc gaaagagagg tgggctttt                         39<210>22<211>24<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>引物IRF2-F2<400>22ttgtattggt agcgtgaaaa aagc                                          24<210>23<211>24<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>引物IRF2-R2<400>23cagctagttc acattatctc gtcc                                         24<210>24<211>30<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>引物IRF2-F1<400>24agagggtacc atgccggtgg aaaggatgcg                                    30<210>25<211>30<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>引物IRF2-R1<400>25agtcggtacc ttaactgctc ttgacgcggg                                    30

Claims (28)

1.具有序列2给出的氨基酸序列的蛋白质(HM1.24抗原)的骨髓瘤细胞中的表达增强剂，以α干扰素或γ干扰素为有效成分。
2.骨髓瘤治疗剂，含有作为有效成分的
(1)α干扰素或γ干扰素，以及
(2)能特异结合具有序列2给出的氨基酸序列的蛋白质，并且具有细胞毒活性的抗体。
3.权利要求2记载的治疗剂，其中的骨髓瘤是多发性骨髓瘤。
4.权利要求2或3记载的治疗剂，其中的抗体是单克隆抗体
5.权利要求4记载的治疗剂，其中的抗体是具有细胞毒活性的抗体。
6.权利要求2记载的治疗剂，其中的抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
7.权利要求5记载的治疗剂，其中的抗体是抗HM1.24抗体。
8.权利要求6记载的治疗剂，其中的嵌合抗体或人源化抗体是嵌合抗HM1.24抗体或人源化抗HM1.24抗体。
9.具有序列2给出的氨基酸序列的蛋白质(HM1.24抗原)的骨髓瘤细胞中的表达增强剂，以IRF-2蛋白质为有效成分。
10.以IRF-2蛋白质为有效成分的HM1.24启动子的激活剂。
11.骨髓瘤治疗剂，含有作为有效成分的
(1)IRF-2蛋白质，以及
(2)能特异结合具有序列2给出的氨基酸序列的蛋白质，并且具有细胞毒活性的抗体。
12.权利要求11记载的治疗剂，其中的骨髓瘤是多发性骨髓瘤。
13.权利要求11或12记载的治疗剂，其中的抗体是单克隆抗体
14.权利要求13记载的治疗剂，其中的抗体是具有细胞毒活性的抗体。
15.权利要求11记载的治疗剂，其中的抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
16.权利要求14记载的治疗剂，其中的抗体是抗HM1.24抗体。
17.权利要求15记载的治疗剂，其中的嵌合抗体或人源化抗体是嵌合抗HM1.24抗体或人源化抗HM1.24抗体。
18.HM1.24抗原的骨髓瘤细胞中的表达增强剂，含有以增强IRF-2蛋白质表达的化合物为有效成分。
19.HM1.24启动子的激活剂，含有以增强IRF-2蛋白质表达的化合物为有效成分。
20.筛选HM1.24抗原表达增强剂的方法。
21.用于治疗骨髓瘤患者的试剂盒，包含：
(1)能特异结合具有序列2给出的氨基酸序列的蛋白质，并且具有细胞毒活性的抗体；以及
(2)指导将上述抗体与增强具有序列2给出的氨基酸序列的蛋白质的表达的药剂组合用于患者的指导书。
22.权利要求21记载的试剂盒，其中上述骨髓瘤是多发性骨髓瘤。
23.权利要求21记载的试剂盒，其中上述抗体是人源化抗HM1.24抗体。
24.权利要求21记载的试剂盒，其中上述增强具有序列2给出的氨基酸序列的蛋白质表达的药剂是α干扰素或γ干扰素。
25.含有能特异结合具有序列2给出的氨基酸序列的蛋白质并且具有细胞毒活性的抗体的治疗骨髓瘤患者的药物组合物，用于与增强具有序列2给出的氨基酸序列的蛋白质的表达的药剂组合向患者给药。
26.权利要求25记载的药物组合物，其中上述骨髓瘤是多发性骨髓瘤。
27.权利要求25记载的药物组合物，其中上述抗体是人源化抗HM1.24抗体。
28.权利要求25记载的药物组合物，其中上述增强具有序列2给出的氨基酸序列的蛋白质的表达的药剂是α干扰素或γ干扰素。
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