ES2307505T3 - Utilizacion de ligandos receptores de erbb en el tratamiento de la diabetes. - Google Patents
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Abstract
Utilización de heregulina en la preparación de un medicamento para tratar la disfunción pancreática en un mamífero, mediante la inducción o estimulación de la diferenciación o proliferación de las células precursoras beta o la proliferación de las células beta maduras.
Description
Utilización de ligandos receptores de ErbB en el
tratamiento de la diabetes.
La presente invención se refiere a la
utilización de heregulina en medicamentos para tratar la diabetes y
otras condiciones asociadas a la disfunción pancreática.
La transducción de señales que regulan el
crecimiento y diferenciación celular se encuentra regulada en parte
por la fosforilación de diversas proteínas celulares. Las proteína
tirosina quinasas son enzimas que catalizan dicho proceso. Los
receptores proteína tirosina quinasa se cree que dirigen el
crecimiento celular mediante la fosforilación de tirosinas
estimulada por ligando de sustratos intracelulares. La familia de
receptores de ErbB pertenece a la superfamilia de receptores de
tirosina quinasa subclase I e incluye cuatro receptores diferentes,
incluyendo el receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR o
ErbB1), ErbB2 (HER2 o p185 neu), ErbB3 (HER3) y ErbB4 (HER4 o
tiro2).
Se ha implicado causalmente EGFR o ErbB1 en
tumores malignos humanos y, en particular, se ha observado la
expresión incrementada de este gen en carcinomas más agresivos de
mama, vejiga, pulmón y estómago. Se ha informado de que la
expresión incrementada de EGFR con frecuencia se asocia a la
producción incrementada de ligando de EGFR, factor alfa de
crecimiento transformante (TGF-alfa), por parte de
las mismas células tumorales, resultando en la activación del
receptor a través de una ruta estimuladora autocrina [Baselga et
al., Pharmac. Ther. 64:127-154, 1994]. Los
anticuerpos monoclonales dirigidos contra el EGFR, o los ligandos
del mismo TGF-alfa y EGF, han sido evaluados como
agentes terapéuticos en el tratamiento de dichos tumores malignos
[ver, por ejemplo, Baselga et al., supra; Masui et
al., Cancer Research 44:1002-1007, 1984; Wu
et al., J. Clin. Invest. 95:1897-1905,
1995].
El segundo miembro de la subfamilia de clase I,
p185^{neu}, fue identificado originalmente como el producto del
gen transformante de neuroblastomas de ratas tratados químicamente.
El gen neu (también denominado erbB2 y HER2) codifica un receptor
proteína tirosina quinasa de 185 kDa. La amplificación y/o
sobreexpresión del gen ErbB2 humano se correlaciona con un mal
pronóstico en cánceres de mama y ováricos [Slamon et al.,
Science 235:177-182, 1987; y Slamon et al.,
Science 244:707-712, 1989; patente US nº 4.968.603].
La sobreexpresión de ErbB2 ha sido observada en muchos carcinomas,
incluyendo carcinomas de estómago, endometrio, glándula salivar,
pulmón, riñón, colon y vejiga. De acuerdo con lo anterior, Slamon
et al., en la patente US nº 4.968.603, describen y
reivindican diversos ensayos diagnósticos para determinar la
amplificación o expresión de gen ErbB2 en células tumorales.
Los anticuerpos dirigidos contra los productos
de los genes p185^{neu} de rata y ErbB2 humano han sido
descritos. Por ejemplo, Drebin et al., Cell
41:695-706, 1985; Meyers et al., Methods
Enzym. 198:277-290, 1991; y patente WO nº 94/22478
describe anticuerpos dirigidos contra el producto génico de rata
p185^{neu}. Hudziak et al., Mol. Cell. Biol.
9:1165-1172, 1989, describen la generación de un
panel de anticuerpos anti-ErbB2 que se
caracterizaron utilizando la línea de células de tumor mamario
humano SKBR3. También se ha informado de otros anticuerpos
anti-ErbB2 en la literatura [ver, por ejemplo,
patentes US nº 5.821.337 y nº 5.783.186, patente WO nº 94/00136;
Tagliabue et al., Int. J. Cancer 47:933-937,
1991; McKenzie et al., Oncogene 4:543-548,
1989; Maier et al., Cancer Res. 51:5361-5369,
1991; Bacus et al., Molecular Carcinogenesis
3:350-362, 1990; Xu et al., Int. J. Cancer
53:401-408, 1993; Kasprzyk et al., Cancer
Research 52:2771-2776, 1992; Hancock et al.,
Cancer Research 51:4575-4580, 1991; Shawver et
al., Cancer Research 54:1367-1373, 1994;
Arteaga et al., Cancer Research 54:3758-3765,
1994; Harwerth et al., J. Biol. Chem.
267:15160-15167, 1992].
También se ha descrito un gen relacionado
adicional, denominado erbB3 o HER3 (ver la patente US nº 5.183.884
y nº 5.480.968; Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86:9193-9197, 1989; solicitud de patente EP nº
44.961A1, y Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90:2900-2904, 1993). Kraus et al. (1989)
descubrieron la presencia de niveles marcadamente elevados de ARNm
de erbB3 en determinadas líneas de células de tumor mamario humano,
indicando que erbB3, al igual que erbB1 y erbB2, podrían desempeñar
un papel en tumores malignos humanos. Además, Kraus et al.,
supra (1993) han demostrado que la activación dependiente de
EGF del dominio catalítico de ErbB3 de un receptor quimérico
EGFR/ErbB3 resultó en una respuesta proliferativa en células
NIH-3T3 transfectadas. En la actualidad se cree que
ello es el resultado de ErbB1 o ErbB2 endógenos en las
NIH-3T3. Además, dichos investigadores demostraron
que algunas líneas de células de tumor mamario humano muestran una
elevación significativa de la fosforilación de tirosinas de ErbB3 de
estado estable, indicando también que este receptor podría
desempeñar un papel en los tumores malignos humanos. Otros han
explorado el papel de erbB3 en el cáncer. Se ha encontrado que se
encuentra sobreexpresado en los cánceres de mama [Lemoine et
al., Br. J. Cancer 66:1116-1121, 1992],
gastrointestinal [Poller et al., J. Pathol.
168:275-280, 1992; Raj-kumer et
al., J. Pathol. 170:271-278, 1993, y Sanidas
et al., Int. J. Cancer 54:935-940, 1993] y
pancreático [Lemoine et al., J. Pathol.
168:269-273, 1992; Friess et al., Clinical
Cancer Research 1:1413-1420, 1995].
\newpage
La subfamilia de clase I de receptores proteína
tirosina quinasa de factor de crecimiento epidérmico se ha
extendido adicionalmente para incluir el receptor ErbB4 [ver la
solicitud de patente EP nº 599.274; Plowman et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90:1746-1750, 1993, y Plowman
et al., Nature 366:473-475, 1993]. Plowman
et al. encontraron que la expresión incrementada de ErbB4 se
encontraba estrechamente correlacionada con determinados carcinomas
de origen epitelial, incluyendo los adenocarcinomas mamarios. Los
procedimientos diagnósticos para la detección de las condiciones
neoplásicas humanas (especialmente los cánceres de mama) que
evalúan la expresión de ErbB4 se describen en la solicitud de
patente EP nº 599.274.
Se han descrito en la literatura diversos
ligandos que se unen y/o activan dichos receptores ErbB. Entre los
ligandos se incluyen los polipéptidos denominados EGF [Savage et
al., J. Biol. Chem. 247:7612-7621, 1972],
TGF-alfa [Marquardt et al., Science
223:1079-1082, 1984], anfiregulina [Shoyab et
al., Science 243:1074-1076, 1989; Kimura et
al., Nature 348:257-260, 1990; Cook et
al., Mol. Cell. Biol. 11:2547-2557, 1991], EGF
ligante de heparina (HB-EGF) [Higashiyama et
al., Science 251:936-939, 1991], betacelulina
[Shing et al., Science 259:1604-1607, 1993] y
epiregulina [Toyoda et al., J. Biol. Chem.
270:7495-7500, 1995]. ErbB1 se une a seis ligandos
diferentes: factor de crecimiento epidérmico (EGF),
TGF-alfa, anfiregulina, HB-EGF,
betacelulina y epiregulina [ver también, por ejemplo, Groenen et
al., Growth Factors 11:235-257, 1994].
Una familia de proteínas heregulina resultante
del procesamiento de un único gen son los ligandos de ErbB3 y de
ErbB4. Tal como se comenta adicionalmente después, la familia de la
heregulina incluye NDFs, GGFs y ARIA [Groenen et al., Growth
Factors 11:235-257, 1994; Lemke, Molec. & Cell.
Neurosc. 7:247-257, 1994; Lee et al., Pharm.
Rev. 47:51-85, 1995]. Se han identificado ligandos
adicionales de ErbB: la neuregulina-2
(NRG-2), que se informa que se une a ErbB3 o a ErbB4
[Chang et al., Nature 387:509-512, 1997;
Carraway et al., Nature 387:512-516, 1997] y
la neuregulina-3, que se une a ErbB4 [Zhang et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:9562-9567,
1997]. HB-EGF, betacelulina y epiregulina también se
unen a ErbB4.
Aunque EGF y TGF-alfa no se unen
a ErbB2, EGF estimula ErbB1 y ErbB2 para formar un heterodímero, que
activa a ErbB1 y resulta en la transfosforilacion de ErbB2 en el
heterodímero. La dimerización y/o transfosforilación aparentemente
activa la ErbB2 tirosina quinasa. De manera similar, cuando ErbB3 se
coexpresa con ErbB2, se forma un complejo de señalización activo y
los anticuerpos dirigidos contra ErbB2 son capaces de romper el
complejo [Sliwkowsky et al., J. Biol. Chem.
269:14661-14665, 1994]. Además, la afinidad de ErbB3
para la heregulina se incrementa a un estado de afinidad superior
cuando se coexpresa con ErbB2 [Levi et al., J. Neuroscience
15:1329-1340, 1995; Morrisey et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. 92:1431-1435, 1995, y Lewis et
al., Cancer Research 56:1457-1465, 1996 con
respecto al complejo proteico ErbB2-ErbB3]. ErbB4,
al igual que ErbB3, forma un complejo de señalización activo con
ErbB2 [Carraway et al., Cell 78:5-8,
1994].
Holmes et al. aislaron y clonaron una
familia de activadores polipéptido del receptor ErbB2 que
denominaron heregulina-alfa
(HRG-alfa), heregulina-betaI
(HRG-betaI), heregulina-beta2
(HRG-beta2),
heregulina-beta2-oide
(HRG-beta2-oide) y
heregulina-beta3 (HRG-beta3) [ver
Holmes et al., Science 256:1205-1210, 1992;
patentes WO nº 92/20798 y US nº 5.367.060]. El polipéptido de 45
kDa, HRG-alfa, fue purificado del medio condicionado
de la línea celular de cáncer mamario humano
MDA-MB-231. Estos investigadores
demostraron la capacidad de los polipéptidos heregulina purificados
de activar la fosforilación de tirosinas del receptor ErbB2 en
células de tumor mamario MCF7. Además, se ilustró la actividad
mitogénica de los polipéptidos heregulina sobre las células
SK-BR-3 (que expresan niveles
elevados del receptor ErbB2).
Aunque las heregulinas son sustancialmente
idénticas en los primeros 213 residuos aminoácidos, se clasifican
en dos tipos principales, alfa y beta, basándose en dos dominios
variantes similares a EGF que difieren en las partes
C-terminales de los mismos. Sin embargo, estos
dominios similares a EGF son idénticos en el espaciado de los seis
residuos cisteína contenidos en los mismos. Basándose en la
comparación de las secuencias de aminoácidos, Holmes et al.
encontraron que, entre la primera y la sexta cisteínas en el dominio
similar a EGF, HRGs eran similares al 45% al factor de crecimiento
similar a EGF ligante de heparina (HB-EGF),
idénticos al 35% a la anfiregulina (AR), idénticos al 32% a
TGF-alfa e idénticos al 27% a EGF.
El factor de diferenciación neu de 44 kDa (NDF),
que es el equivalente en la rata de la HRG humana, fue descrito por
primera vez por Peles et al., Cell
69:205-216, 1992, y Wen et al., Cell
69:559-572, 1992. Al igual que los polipéptidos
HRG, NDF presenta un dominio de homología de inmunoglobulina (Ig)
seguido de un dominio similar a EGF y carece de un péptido de señal
N-terminal. Posteriormente, Wen et al., Mol.
Cell. Biol. 14(3):1909-1919, 1994, llevaron a
cabo la "clonación exhaustiva" para extender la familia de
NDFs. Este trabajo reveló seis pro-NDFs
fibroblásticos diferentes. Adoptando la nomenclatura de Holmes et
al., los NDFs se clasifican como polipéptidos alfa o beta
basándose en las secuencias de los dominios similares a EGF. Estos
investigadores concluyeron que se generan diferentes isoformas de
NDF mediante procesamiento alternativo y llevan a cabo diferentes
funciones específicas de tejido. Ver también las patentes EP nº
505.148, WO nº 93/22424, y WO nº 94/28133 referentes a
NDF.
NDF.
Falls et al., Cell
72:801-815, 1993, describen otro miembro de la
familia de la heregulina que denominan polipéptido de actividad
inductora de receptor acetilcolina (ARIA). El polipéptido ARIA
derivado de pollo estimula la síntesis de receptores acetilcolina
musculares. Ver también la patente WO nº 94/08007. ARIA es una
heregulina de tipo I con un dominio EGF de tipo beta.
Marchionni et al., Nature
362:312-318, 1993, identificaron varias proteínas
derivadas de bovino que se denominan factores de crecimiento glial
(GGFs). Estos GGFs comparten el dominio similar a Ig y el dominio
similar a EGF con las demás proteínas heregulina indicadas
anteriormente, aunque también presentan un dominio kringle
aminoterminal. Los GGFs generalmente no presentan la región
espaciadora glucosilada completa entre el dominio similar a Ig y el
dominio similar a EGF. Únicamente uno de los GGFs, GGFII, posee un
péptido de señal N-terminal. Ver también las
patentes WO nº 92/18625, nº 94/00140, nº 94/04560, nº 94/26298 y nº
95/32724, referentes a los GGFs y a los usos de los mismos.
Ho et al., J. Biol. Chem.
270(4):14523-14532, 1995, describen otro
miembro de la familia de la heregulina denominado factor derivado
de neurona sensorial y motora (SMDF). Esta proteína presenta un
dominio similar a EGF característico de todos los polipéptidos
heregulina aunque un dominio N-terminal diferente.
La diferencia estructural principal entre SMDF y los demás
polipéptidos heregulina es que SMDF carece de dominio similar a Ig
y del espaciador "gluco" característico de todos los demás
polipéptidos heregulina. Otra característica del SMDF es la
presencia de dos tramos de aminoácidos hidrofóbicos próximos al
extremo N-terminal.
Aunque los polipéptidos heregulina se
identificaron por primera vez basándose en su capacidad de activar
el receptor ErbB2 (ver Holmes et al., supra), se ha
descubierto que determinadas células ováricas que expresan neu y
fibroblastos transfectados por neu, no se unen ni se entrecruzan con
NDF, ni responden a NDF, experimentando entonces la fosforilación
de las tirosinas (Peles et al., EMBO J.
12:961-971, 1993). Lo anterior indica que otro
componente celular resultaba necesario para proporcionar una
capacidad de respuesta completa frente a la heregulina. Carraway
et al. demostraron posteriormente que
^{125}I-rHRG \beta
1_{177-244} se unía a fibroblastos
NIH-3T3 transfectados establemente con ErbB3 bovino
y no a células parentales no transfectadas. Por consiguiente, los
investigadores sugirieron que ErbB3 es un receptor de HRG y que
media en la fosforilación de residuos tirosina intrínsecos, así
como en la fosforilación del receptor ErbB2 en células que expresan
ambos receptores. Carraway et al., J. Biol. Chem.
269(19):14303-14306, 1994, Sliwkowski et
al., J. Biol. Chem. 269(20):14661-14665,
1994, encontraron que las células transfectadas únicamente con
ErbB3 mostraban afinidades reducidas para la heregulina, mientras
que las células transfectadas con ErbB2 y ErbB3 mostraban
afinidades más elevadas.
Dicha observación se correlaciona con la
"comunicación cruzada de receptores" descrita anteriormente
por Kokai et al., Cell 58:287-292, 1989; Stem
et al., EMBO J. 7:995-1001, 1988, y King
et al., 4:13-18, 1989. Estos investigadores
encontraron que la unión de EGF a ErbB1 resultaba en la activación
del dominio de quinasa de ErbB1 y la fosforilación cruzada de
p185^{HER2}. Se cree que lo anterior es el resultado de la
heterodimerización del receptor inducida por ligando y la
fosforilación cruzada concomitante de los receptores en el
heterodímero [Wada et al., Cell 61:1339-1347,
1990].
De manera similar, Plowman y colaboradores han
estudiado la activación de p185^{HER4}/p185^{HER2}.
Expresaron
p185^{HER2} solo, p185^{HER4} solo o los dos receptores conjuntamente en linfocitos T humanos y demostraron que la heregulina era capaz de estimular la fosforilación de tirosinas de p185^{HER4}, aunque sólo podía estimular la fosforilación de p185^{HER2} en células que expresaban ambos receptores [Plowman et al., Nature 336:473-475, 1993].
p185^{HER2} solo, p185^{HER4} solo o los dos receptores conjuntamente en linfocitos T humanos y demostraron que la heregulina era capaz de estimular la fosforilación de tirosinas de p185^{HER4}, aunque sólo podía estimular la fosforilación de p185^{HER2} en células que expresaban ambos receptores [Plowman et al., Nature 336:473-475, 1993].
Varios grupos han investigado otro papel o
papeles biológicos de diversos ligandos de ErbB. Por ejemplo, se ha
informado que la betacelulina muestra actividad estimuladora del
crecimiento en células vasculares de músculo liso y en células
epiteliales de pigmento retiniano [Shing et al.,
supra]. Falls et al., supra, encontraron que
ARIA desempeña un papel en la diferenciación de miotubos, afectando
a la síntesis y a la concentración de los receptores
neurotransmisores en las células musculares
post-sinápticas de neuronas motoras. Corfas y
Fischbach demostraron que ARI también incrementa el número de
canales del sodio en el músculo [Corfas y Fischbach, J.
Neuroscience 13(5):2118-2125, 1993]. También
se ha demostrado que GGFII es mitogénico para los mioblastos
humanos quiescentes subconfluyentes y que la diferenciación de
mioblastos humanos clonales en la presencia continua de GGFII
resulta en un mayor número de miotubos tras seis días de
diferenciación [Sklar et al., J. Cell Biochem., Abst. W462,
18D. 540, 1994]. Ver también la patente WO nº 94/26298, publicada
el 24 de noviembre de 1994.
Holmes et al., supra, encontraron
que HRG ejerce un efecto mitogénico sobre las líneas celulares
mamarias (tales como SK-BR-3 y
MCF-7). También se ha informado de la actividad
mitogénica de GGFs sobre las células de Schwann [ver, por ejemplo,
Brockes et al., J. Biol. Chem.
255(18):8374-8377, 1980; Lemke y Brockes, J.
Neurosci. 4:75-83, 1984; Brockes et al., J.
Neuroscience 4(1):75-83, 1984; Brockes et
al., Ann. Neurol. 20(3):317-322, 1986;
Brockes, J., Methods in Enzym. 147:217-225, 1987, y
Marchionni et al., supra].
Pinkas-Kramarski et al.
encontraron que NDF aparentemente se expresa en neuronas y en
células gliales en cultivos embrionarios y adultos de cerebro de
rata y en cultivos primarios de células cerebrales de rata, y
sugirieron que podría actuar como factor de supervivencia y de
maduración para los astrocitos [Pinkas-Kramarski
et al., PNAS USA 91:9387-9391, 1994]. Meyer y
Birchmeier, PNAS, USA 91:1064-1068, 1994, analizaron
la expresión de la heregulina durante la embriogénesis del ratón y
en el animal perinatal utilizando la hibridación in situ y
experimentos de protección frente a ARNasa. Ver también Meyer et
al., Development 124(18):3575-3586,
1997. De manera similar, Danilenko et al., Resumen 3101,
FASEB 8(4-5):A535, 1994, y Danilenko et
al., Journal of Clinical Investigation
95(2):842-851, 1995, encontraron que la
interacción de NDF y del receptor ErbB2 resulta importante en la
dirección de la migración epidérmica y en la diferenciación durante
la reparación de heridas.
Ram et al., Journal of Cellular
Physiology 163:589-596, 1995, evaluaron la actividad
mitogénica de NDF sobre la línea celular epitelial mamaria humana
inmortalizada MCF-10A. Danilenko et al., J.
Clin. Invest. 95:842-851, 1995, investigaron si NDF
influía sobre la migración epidérmica en un modelo in vivo
de reparación de herida de grosor parcial profunda por excisión. Se
informó que no se habían producido diferencias estadísticamente
significativas en los queratinocitos basales y superbasales
proliferantes entre las heridas de control y las heridas tratadas
con rhNDF-\alpha_{2}. Marikovsky et al.,
Oncogene 10:1403-141, 1995, estudiaron las
respuestas proliferativas de una línea celular continua aneuploide
de BALB/MK de queratinocitos y evaluaron los efectos de las
isoformas \alpha y \beta de NDF sobre los queratinocitos
epidérmicos.
El papel o papeles potenciales que los diversos
ligandos de ErbB podrían desempeñar en la proliferación y
diferenciación de las células pancreáticas también ha sido informada
por diversos investigadores. Las células de islotes (también
denominados islotes de Langerhans) en el páncreas es conocido que
producen las hormonas insulina y glucagón. Dichas células de
islotes se cree que derivan de células madre en el endotelio
pancreático ductular fetal [Pictet y Rutter, "Development of the
embryonic pancreas", Endocrinology, Handbook of Physiology,
1972. American Physiological Society, Washington D.C., páginas 25 a
66]. En particular, durante el desarrollo, el páncreas forma un
sistema de túbulos compuesto de una única capa de células no
diferenciadas, que después podría diferenciarse en células
ductales, células acinares o células de islotes [ver, por ejemplo,
LeDouarin, Cell 53:169-171, 1998; Teitelman, Recent
Prog. Hormone Res. 47:259-297, 1991].
Existen varios tipos diferentes de células de
islotes que pueden identificarse histológicamente, incluyendo
células denominadas células alfa y células betal. La insulina es
sintetizada en el islote pancreático por las células beta. En
diversas circunstancias, las células de islotes beta pueden segregar
cantidades insuficientes de insulina, conduciendo finalmente a
niveles anormalmente elevados de glucosa en la sangre (una condición
con frecuencia denominada hiperglucemia). Se consigue el control de
la producción de insulina a nivel celular en las célula beta
mediante mecanismos reguladores que operan a los niveles
transcripcional, traduccional y post-traduccional
[Sjoholm, J. Int. Med. 239:211-220, 1996]. La
insulina presenta una diversidad de actividades biológicas en
mamíferos, algunos específicos de tejido. Por ejemplo, la insulina
puede incrementar la producción de leche en la glándula mamaria,
estimular la síntesis de grasa en el hígado, estimular el transporte
de la glucosa al tejido muscular y estimular el crecimiento de los
tejidos conectivos.
La deficiencia de insulina en mamíferos puede
resultar en condiciones patológicas graves. Por ejemplo, en la
diabetes de tipo I, el páncreas típicamente produce poco o nada de
insulina. La diabetes de tipo I se caracteriza de manera general
como una enfermedad autoinmunológica mediada por células T en la que
las células beta pancreáticas típicamente se han destruido. La
enfermedad habitualmente afecta a niños y adolescentes, pero puede
producirse a cualquier edad. Se han propuesto diversos
desencadenantes ambientales, por ejemplo determinados virus o
componentes de la dieta, que inician el proceso autoinmunológico
[Akerblom et al., Diabetes/Metabolism Review
14:31-67, 1998]. La susceptibilidad o resistencia a
la diabetes de tipo 1 también puede depender de la constitución
genética del individuo [Tisch et al., Cell
85:291-297, 1996]. Para una revisión general, ver
Rabinovitch et al., Prevention and Treatment of Diabetes and
Its Complications 82:739-755, 1998.
En la condición conocida como diabetes de tipo
II, el páncreas generalmente produce algo de insulina, pero la
cantidad secretada resulta insuficiente para que el mamífero
mantenga niveles de glucosa fisiológicamente aceptables. La
diabetes de tipo II es el tipo más común de diabetes y afecta a
millones de individuos, muchos de los cuales no son conscientes de
que presentan la condición. Este tipo de diabetes se caracteriza
habitualmente por tres defectos separados aunque interrelacionados.
Un individuo afectado puede presentar uno o la totalidad de estos
defectos y diversos grados. Estos defectos son la resistencia a la
insulina, la secreción alterada de insulina y la liberación
inapropiada de glucosa por parte del hígado.
Todavía otra forma de diabetes se denomina
diabetes gestacional. Este tipo de diabetes es típicamente una
condición diabética que se diagnostica inicialmente en el individuo
durante el embarazo y que se resuelve tras el parto.
Las complicaciones adicionales de dichas
condiciones diabéticas son diversas y entre ellas se incluyen daños
de pequeño calibre y de gran calibre de los vasos sanguíneos y daños
a nervios periféricos, que a su vez pueden incrementar los riesgos
de ataque cardíaco, ictus, ceguera e insuficiencia renal.
Diversos investigadores han informado sobre los
efectos de polipéptidos particulares EGF, heregulina y relacionados
con la heregulina, sobre las células de los islotes. En la patente
WO nº 95/19785, publicada el 27 de julio de 1995, se describen
procedimientos para tratar la diabetes mellitus, en la que se
administra una combinación de ligando de receptor gastrina/CCK y
ligando de receptor EGF (por ejemplo TGF-alfa) en
cantidades suficientes para producir la diferenciación de células
precursoras de los islotes pancreáticos en células secretoras de
insulina maduras. La patente WO nº 95/19785 enseña que el
polipéptido TGF-alfa no es capaz de estimular la
diferenciación de las células precursoras de islotes al
administrarlo solo.
En la patente WO nº 97/17086, publicada el 15 de
mayo de 1997, se informa que proteínas betacelulina particulares
eran capaces de estimular la diferenciación de una línea celular
pancreática, AR42J (células de rata derivadas de un tumor
pancreático inducido químicamente) en células beta productoras de
insulina. En la solicitud de patente WO nº 97/17086, también se
informa que otros miembros de la familia de la heregulina, tales
como EGF, TGF-alfa y FGF, no consiguen inducir
eficazmente dicha diferenciación en las células AR42J [ver también
Ishiyama et al., Diabetologia 41:623-628,
1998; Mashima et al., J. Clin. Invest.
97:1647-1654, 1996]. Las proteínas betacelulina
sometidas a ensayo en dichos experimentos, aunque mostraban cierta
actividad de diferenciación en las células AR42J, no presentaban
actividad (proliferativa) de factor de crecimiento [Ishiyama et
al., supra].
Los efectos de dichos ligandos sobre otras
líneas celulares de insulinoma pancreático también se han descrito
en la literatura. Huotari et al. informaron de que la
betacelulina mostraba un efecto mitogénico sobre las células
INS-1 in vitro, mientras que EGF-
TGF-alfa y TGF-beta eran inactivos
[Huotari et al., Endocrinology
139:1494-1499, 1998]. Se informó además que ni la
betacelulina, ni EGF, ni TGF-alfa ni
TGF-beta afectaban al contenido de insulina de las
células INS-1. La betacelulina no presentaba ningún
efecto mitogénico sobre las células RINm5F, mientras que EGF y
TGF-alfa eran ligeramente mitogénicos [Huotari et
al., supra].
Watada et al. han investigado algunos de
los factores de transcripción que se cree que resultan importantes
para la expresión de genes de la insulina en las células de los
islotes [Watada et al., Diabetes
45:1826-1831, 1996]. En particular, Watada et
al. examinaron el factor de transcripción PDX-1,
un factor que se ha encontrado que aparece antes de la insulina
durante la ontogenia del páncreas del ratón, y la expresión del
cual se limita a las células beta pancreáticas en el animal adulto.
Se introdujo el gen PDX-1 en células \alphaTC1.6
y se observaron los cambios en el patrón de expresión génica al
tratar las células con diversos factores de crecimiento. Watada
et al. informaron de que la betacelulina era capaz de inducir
las expresiones endógenas de insulina y de glucoquinasa en las
células \alphaTC1.6 que expresaban PDX-1, pero que
los factores de crecimiento TFG-alfa,
TFG-\beta, EGF, IGF-I y bFGF no
presentaban dicho efecto.
La patente WO nº 96/30403 sugirieron que la
neuregulina podría desempeñar un papel en la supervivencia y
funcionamiento de las células retinianas, y propone la utilización
de la neuregulina en el tratamiento de la retinopatía
diabética.
La presente invención se refiere a composiciones
y usos para tratar la disfunción pancreática, particularmente la
diabetes, en mamíferos. La invención se basa, en parte, en la
identificación de los ligandos del receptor ErbB positivos en
diversos ensayos para la expresión o secreción de insulina o la
expresión de factores de transcripción o marcadores únicos para
células beta pancreáticas. De esta manera, los ligandos del receptor
ErbB indicados en la presente invención se cree que resultan
fármacos útiles para el tratamiento de condiciones asociadas a la
deficiencia de insulina.
En una realización, la invención proporciona un
uso para tratar condiciones en mamíferos asociadas con la
disfunción pancreática, y particularmente para tratar condiciones en
mamíferos asociadas con el funcionamiento alterado de las células
beta. En una realización preferente, la condición bajo tratamiento
es la diabetes, y todavía más preferentemente, la diabetes de tipo
I. El uso incluye administrar en un mamífero que necesita dicho
tratamiento una cantidad eficaz de heregulina. Opcionalmente, los
procedimientos de tratamiento comprenden exponer células beta
madura o células precursoras beta a una cantidad eficaz de ligando
de receptor ErbB ex vivo. Las células tratadas ex
vivo seguidamente pueden administrarse en el mamífero utilizando
técnicas de trasplante adecuadas.
En otra realización, la invención proporciona
procedimientos para inducir o estimular la proliferación de células
beta precursoras o maduras. Entre los procedimientos se incluyen
exponer células precursoras beta o células beta maduras a una
cantidad eficaz de heregulina.
La invención proporciona además procedimientos
para inducir o estimular la diferenciación de células precursoras
beta. En los procedimientos, las células precursoras beta o los
tejidos no diferenciados que contienen dichas células precursoras
se exponen a una cantidad eficaz de heregulina.
La invención también proporciona una composición
que comprende heregulina, betacelulina y un portador.
Preferentemente, el portador es un portador farmacéuticamente
aceptable. Se proporcionan procedimientos para preparar dichas
composiciones e incluyen mezclar una cantidad eficaz del ligando de
receptor ErbB con el portador.
La figura 1 muestra los resultados del ensayo
descrito en el Ejemplo 1, que examina el efecto de los ligandos del
receptor ErbB, HB-EGF
("rh.HB-EGF"), heregulina ("rh.HRG"),
anfiregulina ("rh.AR"), EGF ("rh.EGF"),
TGF-alfa ("rh.TGF-a") y
betacelulina ("rh.BTC") sobre la expresión de diversos
marcadores (señalados en la figura) en cultivo de células
pancreáticas fetales murinas primarias.
La figura 2 muestra un diagrama de columnas que
ilustra el efecto (medido como factor de cambio de la expresión) de
HB-EGF sobre la expresión de los marcadores RPL19,
NeuroD, Pax4, PDX-1, insulina, Glut2, GLK, Pax6,
glucagón, ISL-1, amilasa, somatostatina y Cytoker
19.
La figura 3 muestra un diagrama de columnas que
ilustra el efecto (medido como factor de cambio de la expresión) de
la heregulina sobre la expresión de los marcadores RPL19, NeuroD,
Pax4, PDX-1, insulina, Glut2, GLK, Pax6, glucagón,
ISL-1, amilasa, somatostatina y Cytoker 19.
La figura 4 muestra un diagrama de columnas que
ilustra el efecto (medido como factor de cambio de la expresión) de
la anfiregulina sobre la expresión de los marcadores RPL19, NeuroD,
Pax4, PDX-1, insulina, Glut2, GLK, Pax6, glucagón,
ISL-1, amilasa, somatostatina y Cytoker 19.
La figura 5 muestra un diagrama de columnas que
ilustra el efecto (medido como factor de cambio de la expresión) de
EGF sobre la expresión de los marcadores RPL19, NeuroD, Pax4,
PDX-1, insulina, Glut2, GLK, Pax6, glucagón,
ISL-1, amilasa, somatostatina y Cytoker 19.
La figura 6 muestra un diagrama de columnas que
ilustra el efecto (medido como factor de cambio de la expresión) de
TGF-alfa sobre la expresión de los marcadores RPL19,
NeuroD, Pax4, PDX-1, insulina, Glut2, GLK, Pax6,
glucagón, ISL-1, amilasa, somatostatina y Cytoker
19.
La figura 7 muestra un diagrama de columnas que
ilustra el efecto (medido como factor de cambio de la expresión) de
la betacelulina sobre la expresión de los marcadores RPL19, NeuroD,
Pax4, PDX-1, insulina, Glut2, GLK, Pax6, glucagón,
ISL-1, amilasa, somatostatina y Cytoker 19.
La figura 8 muestra secciones representativas (a
20X) a través del tejido pancreático de un animal de tipo salvaje
no tratado (a) y de un animal de tipo salvaje (b), heregulina (+/c)
(c), ErbB2 (+/-) (d) y ErbB3 (+/-) que había recibido tratamiento
de heregulina. Las secciones proceden de animales que habían
recibido tratamiento de heregulina durante 14 días excepto en el
caso del animal tratado con heregulina (-/-), que se dosificó
únicamente durante 5 a 6 días. La presencia de hiperplasia ductal
(mostrada con flechas) era más evidente en los grupos de animales
de tipo salvaje y ErbB2 y ErbB3 (+/-), posiblemente reflejando la
exposición más larga a la heregulina.
La expresión "receptor ErbB" tal como se
utiliza en la presente invención se refiere a un receptor proteína
quinasa que pertenece a la familia del receptor ErbB y típicamente,
en su forma de secuencia nativa, comprende un dominio extracelular,
que puede unirse a uno o más ligandos de ErbB (definidos
posteriormente), un dominio transmembranal lipofílico, un dominio
intracelular tirosina quinasa y un dominio de señalización
carboxilo-terminal que presenta uno o más residuos
tirosina que pueden encontrarse fosforilados. La expresión
"receptor ErbB" incluye receptores polipéptido de secuencia
nativa y variantes de secuencia de aminoácidos de los mismos. El
receptor ErbB puede aislarse a partir de una diversidad de fuentes,
tales como de tipos de tejido humano o de otra fuente, o pueden
prepararse mediante procedimientos recombinantes y/o sintéticos.
Entre los receptores ErbB contemplados por la invención sin
incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los receptores EGFR, ErbB2,
ErbB3 y ErbB4.
Los términos "ErbB1" y "EGFR" se
refieren al receptor que se da a conocer en, por ejemplo, Carpenter
et al., Ann. Rev. Biochem. 56:881-914, 1987,
incluyendo formas mutantes de origen natural del mismo, tales como
el mutante por deleción mencionado en Humphrey et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. 87:4207-4211, 1990. ErbB1 se
refiere al gen codificante de la proteína ErbB1.
Los términos "ErbB2" y "HER2" se
refieren al receptor mencionado, por ejemplo, en Semba et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82:6497-6501, 1985,
y Yamamoto et al., Nature 319:230-234, 1986
(número de acceso X03363 de GenBank). El término erbB2 se refiere
al gen codificante de ErbB2 humano y neu se refiere al gen
codificante de p185^{neu} de rata.
Los términos "ErbB3" y "HER3" se
refiere al receptor dado a conocer, por ejemplo, en las patentes US
nº 5.183.884 y nº 5.480.968, así como Kraus et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. 86:9193-9197, 1989.
Los términos "ErbB4" y "HER4" se
refieren al receptor que se da a conocer, por ejemplo, en la
solicitud de patente EP nº 599.274, Plowman et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. 90:1746-1750, 1993, y Plowman et
al., Nature 366:473-475, 1993.
La expresión "heterodímero ErbB" tal como
se utiliza en la presente invención se refiere a un oligómero
asociado no covalentemente que comprende por lo menos dos receptores
ErbB diferentes. Dichos complejos pueden formarse en el caso de que
una célula que expresa los dos receptores se expone a uno o más
ligandos de ErbB y puede aislarse mediante inmunoprecipitación y
analizarse mediante SDS-PAGE, tal como se describe
en Sliwkowski et al., J. Biol. Chem.
269:14661-14665, 1994. Entre los ejemplos de dichos
heterodímeros se incluyen los complejos EGFR-ErbB2,
ErbB2-ErbB3 y ErbB3-ErbB4.
Las expresiones "ligando de receptor ErbB"
y "ligando de ErbB" se refiere a un polipéptido que se une a
uno o más receptores ErbB y/o que activa los mismos. La expresión
"ligando de ErbB" incluye ligandos polipéptidos de secuencia
nativa y variantes de secuencia de aminoácidos de los mismos. El
ligando de ErbB puede aislarse a partir de una diversidad de
fuentes, tales como de tipos de tejidos humanos o de otra fuente, o
pueden prepararse mediante procedimientos recombinantes y/o
sintéticos. Preferentemente, para la utilización en los
procedimientos dados a conocer en la presente invención, el ligando
de ErbB se prepara mediante procedimientos recombinantes. La unión
de un ligando de ErbB candidato a uno o más receptores ErbB puede
determinarse con facilidad utilizando ensayos conocidos, tales como
aquellos descritos en la patente WO nº 98/35036, publicada el 13 de
agosto de 1998. La activación de un receptor ErbB se refiere a la
transducción de señales (por ejemplo, la causada por un dominio de
quinasa intracelular de un receptor ErbB que fosforila residuos
tirosina en el receptor ErbB o en un sustrato polipéptido) mediada
por la unión de ligando de ErbB a un heterodímero ErbB que comprende
el receptor ErbB de interés. Generalmente, lo anterior implica la
unión de un ligando de ErbB a un heterodímero ErbB que activa un
dominio quinasa de uno o más de los receptores ErbB en el
heterodímero y resulta de esta manera en la fosforilación de
residuos tirosina en uno o más de los receptores, y/o la
fosforilación de residuos tirosina en uno o más polipéptidos
sustrato adicionales. La fosforilación de los receptores ErbB puede
cuantificarse utilizando diversos ensayos de fosforilación de
tirosinas, incluyendo aquellos descritos en la patente WO nº
98/35036, publicada el 13 de agosto de 1998.
Los ligandos de ErbB contemplados por la
invención incluyen los polipéptidos a los que se hace referencia
posteriormente y que se mencionan en, por ejemplo, las revistas y
patentes siguientes:
- betacelulina [Shing et al., Science 259:1604-1607, 1993; Sasada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173, 1993];
- heregulina (HRG), un polipéptido ligando de ErbB codificado por el producto del gen heregulina tal como se da a conocer en la patente US nº 5.641.689 o Marchionni et al., Nature 362:312-318, 1993. Se encuentra comprendido dentro del alcance de HRG tal como se utiliza dicho término en la presente invención: heregulina-alfa, heregulina-beta1, heregulina-beta2 y heregulina-beta3 [Holmes et al., Science 256:1205-1210, 1992; patente US nº 5.641.869], NDF [Peles et al., Cell 69:205-216, 1992], ARIA [Falls et al., Cell 72:801-815, 1993], proteínas de factor de crecimiento GGF [Marchionni et al., Nature 362:312-318, 1993; SMDF [Ho et al., J. Biol. Chem. 270:14523-14532, 1995, y gamma-heregulina [Schaefer et al., Oncogene 15:1385-1394, 1997].
Un polipéptido "de secuencia nativa" se
refiere a un polipéptido que presenta la misma secuencia de
aminoácidos que el polipéptido de origen natural. Dicho polipéptido
de secuencia nativa puede aislarse de la naturaleza o puede
producirse mediante procedimientos recombinantes y/o sintéticos. La
expresión "secuencia nativa" abarca específicamente formas
truncadas o secretadas de origen natural (por ejemplo una secuencia
de dominio extracelular), formas variantes de origen natural (por
ejemplo formas procesadas alternativamente) y variantes alélicas de
origen natural.
La expresión "variante de ligando de ErbB"
o "variante de ligando de receptor ErbB" se refiere a un
polipéptido ligando diferente del ligando de ErbB de secuencia
nativa que se une a uno o más receptores ErbB y/o que activa uno o
más receptores ErbB, y que presenta una identidad de secuencia de
aminoácidos de por lo menos aproximadamente 80% con el polipéptido
de secuencia nativa respectiva, más preferentemente de por lo menos
90%, y todavía más preferentemente una identidad de secuencia de
aminoácidos de por lo menos 95%. Entre las variantes de ligando de
receptor ErbB se incluyen fragmentos del ligando de secuencia nativa
y que presentan una secuencia consecutiva de por lo menos 5, 10,
15, 20, 25, 30 ó 40 residuos aminoácidos de la secuencia nativa del
ligando, variantes de secuencia de aminoácidos en las que se ha
insertado un residuo aminoácido en posición
N-terminal o C-terminal respecto a
la secuencia, o en el interior de la misma, o de un fragmento de la
misma tal como se ha definido anteriormente, y variantes de
secuencia de aminoácidos en las que uno o más residuos han sido
sustituidos por otro residuo. Entre las variantes de ligando de ErbB
de incluyen aquéllas que contienen mutaciones predeterminadas
mediante, por ejemplo, mutagénesis sitio-dirigida o
por PCR, y derivadas de diversas especies animales, tales como el
conejo, la rata, porcinos, primates no humanos, equinos, murinos y
ovinos.
La expresión "porcentaje (%) de identidad de
secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias
identificadas en la presente invención se define como el porcentaje
de residuos aminoácidos en una secuencia candidata que son
idénticos a los residuos aminoácidos en la secuencia del polipéptido
ligando ErbB, tras alinear las secuencias e introducir huecos, en
caso necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de
secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como
parte de la identidad de secuencia. Son conocidos por el experto en
la materia. Los procedimientos de alineación de secuencias y de
determinación de la identidad de secuencias conocidos por el
experto en la materia pueden llevarse a cabo sin experimentación
innecesaria, y puede realizarse el cálculo de los valores de % de
identidad con certidumbre. Por ejemplo, la alineación puede
llevarse a cabo utilizando programas informáticos disponibles, tales
como WU-BLAST-2 [Altschul et
al., Methods in Enzymology 266:460-480, 1996] y
Align 2 [de autor Genentech Inc., y presentado en la US Copyright
Office el 10 de diciembre de 1991]. Puede llevarse opcionalmente la
alineación utilizando parámetros por defecto fijados en los
programas de software informático.
La expresión "polipéptido aislado" se
refiere a un polipéptido tal como HRG que ha sido identificado y
separado y/o recuperado a partir de un componente del ambiente
natural del mismo. Son componentes contaminantes del ambiente
natural del mismo materiales que interferirían con los usos
diagnósticos o terapéuticos del polipéptido, y entre dichos
materiales pueden incluirse proteínas, hormonas y otras sustancias.
En las realizaciones preferentes, el polipéptido se purifica (1)
hasta más de 95% en peso de proteína según determinación mediante el
procedimiento de Lowry u otro procedimiento validado de
determinación de proteínas, y más preferentemente más de 99% en
peso, (2) en un grado suficiente para obtener por lo menos 15
residuos de secuencia N-terminal o interna de
aminoácidos mediante la utilización del mejor secuenciador de
aminoácidos disponible comercialmente hasta la fecha de
presentación de la presente solicitud, o (3) hasta la homogeneidad
mediante SDS-PAGE utilizando azul de Coomassie o,
preferentemente, tinción de plata. El polipéptido aislado incluye el
polipéptido in situ dentro de células recombinantes debido a
que por lo menos un componente del ambiente natural del polipéptido
no se encontrará presente. Entre los polipéptidos aislados se
incluyen un polipéptido de una especie en un cultivo celular
recombinante de una especie diferente, debido a que el polipéptido
en estas circunstancias carecerá de polipéptidos de la fuente. Sin
embargo, habitualmente el polipéptido aislado se prepara mediante
por lo menos una etapa de purificación.
Los "anticuerpos" (Abs) e
"inmunoglobulinas" (Igs) son glucoproteínas que presentan las
mismas características estructurales. Mientras los anticuerpos
muestran especificidad de unión a un antígeno especifico, las
inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas
similares a anticuerpos que carecen de especificidad de antígeno.
Los polipéptidos de este último tipo son producidas, por ejemplo, a
niveles reducidos por el sistema linfático y a niveles
incrementados por lo mielomas.
La digestión con papaína de los anticuerpos
produce dos fragmentos ligantes de antígeno idénticos denominados
fragmentos "Fab", cada uno de los cuales presenta un único
sitio de unión de antígeno y un fragmento "Fc" residual, el
nombre del cual refleja la capacidad del mismo de cristalizar con
facilidad. El tratamiento con pepsina proporciona un fragmento
F(ab')_{2} que presenta dos sitios de unión de antígeno y
todavía es capaz de entrecruzarse con antígeno.
"Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpo
que contiene un sitio completo de reconocimiento y de unión de
antígeno. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable
de cadena pesada y uno de cadena ligera en estrecha asociación no
covalente. En esta configuración las tres regiones hipervariables de
cada dominio variable interaccionan, definiendo un sitio de unión
de antígeno sobre la superficie del dímero
V_{H}-V_{L}. Colectivamente las seis regiones
hipervariables proporcionan especificidad de unión de antígeno al
anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o medio
Fv que comprenda únicamente tres regiones hipervariables
específicas de un antígeno) presenta la capacidad de reconocer y
unirse a un antígeno, aunque con menor afinidad que el sitio de
unión completo.
El fragmento Fab también contiene el dominio
constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1)
de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos
Fab' en la adición de unos cuantos residuos del extremo
carboxi-terminal del dominio CH1 de cadena pesada,
incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo.
Los fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} originalmente se
produjeron en forma de pares de fragmentos Fab' que presentaban
cisteínas de bisagra entre los mismos. También se conocen otros
acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos
(inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden
clasificarse en dos tipos claramente diferenciados denominados
kappa y lambda basándose en las secuencias de aminoácidos de los
dominios constantes de los mismos.
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del
dominio constante de las cadenas pesadas, las inmunoglobulinas
pueden asignarse a diferentes clases. Existen cinco clases
principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias
de ellas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos),
por ejemplo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Las estructuras de
subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes
clases de inmunoglobulinas son bien conocidos.
El término "anticuerpo" en la presente
invención se utiliza en el sentido más amplio y específicamente
abarca a los anticuerpos monoclonales (incluyendo los anticuerpos
monoclonales de longitud completa), los anticuerpos policlonales,
los anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo los anticuerpos
biespecíficos) y los fragmentos de anticuerpos con la condición de
que muestren la actividad agonística deseada que se comenta en la
presente solicitud.
La expresión "fragmentos de anticuerpo"
comprende una parte de un anticuerpo de longitud completa,
generalmente el dominio de unión de antígeno o dominio variable del
mismo. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpo se incluyen
los fragmentos Fab, Fab', F(ab')_{2} y Fv: diacuerpos,
anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de una cadena y
anticuerpos multiespecíficos formadas a partir de fragmentos de
anticuerpo.
La expresión "anticuerpo monoclonal" tal
como se utiliza en la presente invención se refiere a un anticuerpo
obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente
homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la
población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen
natural que pueden encontrarse presentes en cantidades menores. Los
anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose
contra un único sitio antigénico. Además, en contraste con las
preparaciones de anticuerpos (policlonales) convencionales, que
típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra
diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se
dirige contra un único determinante en el antígeno. El modificador
"monoclonal" indica el carácter del anticuerpo, como obtenido
a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpo,
y no debe interpretarse que requiere la producción del anticuerpo
mediante cualquier procedimiento particular. Por ejemplo, los
anticuerpos monoclonales que deben utilizarse de acuerdo con la
presente invención pueden prepararse mediante el procedimiento del
hibridoma, descrito por primera vez por Kohler et al., Nature
256:495, 1975, o pueden prepararse mediante procedimientos de ADN
recombinante (ver, por ejemplo, la patente US nº 4.816.567). Los
"anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse a partir de
bibliotecas fágicas de anticuerpos utilizando las técnicas
descritas en Clackson et al., Nature
352:624-628, 1991 y en Marks et al., J. Mol.
Biol. 222:581-597, 1991, por ejemplo.
Los anticuerpos monoclonales de la presente
invención específicamente incluyen anticuerpos "quiméricos"
(inmunoglobulinas) en los que una parte de la cadena pesada y/o
ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en
anticuerpos derivados de una especie particular o perteneciente a
una clase o subclase particular de anticuerpos, mientras que el
resto de la cadena o cadenas es idéntica u homóloga a las secuencias
correspondientes de anticuerpos derivados de otra especie o
pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como de
fragmentos de dichos anticuerpos, con la condición de que muestren
la actividad agonística deseada [patente US nº 4.816.567, y
Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
81:6851-6855, 1984].
Los formas "humanizadas de anticuerpos no
humanos" (por ejemplo murinos) que contienen una secuencia
mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. Mayoritariamente
los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas
(anticuerpo receptor) en las que los residuos de la región
hipervariable del receptor son sustituidas por residuos de la
región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador),
tal como ratón, rata, conejo o primate no humano, que presenta la
especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los
residuos de la región marco (FR) de la inmunoglobulina humana se
sustituyen con los residuos no humanos correspondientes. Además,
los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se
encuentran en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donador.
Estas modificaciones se llevan a cabo para refinar adicionalmente
el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado
comprende sustancialmente la totalidad de por lo menos uno, y
típicamente de dos dominios variables, en los que la totalidad, o
sustancialmente la totalidad de las regiones hipervariables
corresponden a aquéllas de una inmunoglobulina no humana y la
totalidad o sustancialmente la totalidad de los FRs son aquellos de
una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado
opcionalmente también comprende por lo menos una parte de una región
constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una
inmunoglobulina humana. Para más detalles, ver Jones et al.,
Nature 321:522-525, 1986, Reichmann et al.,
Nature 332:323-329, 1988, y Presta, Curr. Op.
Struct. Bio. 2:593-596, 1992.
Los fragmentos de anticuerpo "Fv de una
cadena" o "sFv" comprenden los dominios V_{H} y V_{L} de
anticuerpo, en los que estos dominios se encuentran presentes en
una sola cadena polipeptídica. Generalmente, el polipéptido Fv
comprende además un línker polipéptido entre los dominios V_{H} y
V_{L}, que permite que sFv forme la estructura deseada para la
unión de antígeno. Para una revisión de sFv, ver Pluckthun, en: The
Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore,
editores, Springer-Verlag, New York, páginas
269-315, 1994.
El término "diacuerpos" se refiere a
fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de unión de
antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de cadena
pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera
(V_{L}) en la misma cadena polipeptídica
(V_{H}-V_{L}). Mediante la utilización de un
línker excesivamente corto para permitir el apareamiento entre los
dos dominios en la misma cadena, se fuerza el apareamiento de los
dominios con dominios complementarios en otra cadena y la creación
de dos sitios de unión de antígeno. Se describen diacuerpos más
completamente en, por ejemplo, las patentes EP nº 404.097 y WO nº
93/11161, y en Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90:6444-6448, 1993.
La expresión "anticuerpos lineales", tal
como se utiliza en toda la presente solicitud, se refiere a los
anticuerpos descritos en Zapata et al., Protein Eng.
8(10):1057-1062, 1995. Brevemente, estos
anticuerpos comprenden un par de segmentos F_{v} en tándem
(V_{H}-C_{H}1-V_{H}-C_{H}1)
que forman un par de regiones de unión de antígeno. Los anticuerpos
lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.
La expresión "anticuerpo agonista de receptor
ErbB" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a
un anticuerpo contra uno o más receptores ErbB que se une y/o activa
uno o más receptores ErbB. La unión y/o activación de un receptor
ErbB puede determinarse utilizando ensayos conocidos, tal como se
describe en la presente invención.
La expresión "célula beta madura" se
refiere a una célula epitelial diferenciada que, en un estado
fisiológico normal, es capaz de responder a cambios en la
concentración de glucosa (entre aproximadamente 2 mM y 20 mM)
mediante la secreción de insulina. La célula beta madura puede
caracterizarse adicionalmente por la expresión de insulina,
glucoquinasa y/o PDX-1.
La expresión "célula precursora beta" tal
como se utiliza en la presente invención se refiere a una célula
epitelial capaz de dividirse y diferenciarse en una célula beta
madura. La célula precursora beta puede caracterizarse
adicionalmente por la expresión de los marcadores génicos
PDX-1 y/o Pax4 y la falta de expresión de
marcadores génicos de origen no epitelial (tal como la
vimentina).
Los términos "tratar", "terapia" y
"tratamiento" se utilizan en el sentido más amplio e incluyen
la prevención (profilaxis), moderación, reducción y curación de las
condiciones indicadas en la presente invención. La expresión "una
cantidad eficaz" se refiere a aquella cantidad de ligando de ErbB
o anticuerpo agonista de receptor ErbB que estimula o induce la
proliferación de células beta maduras o células precursoras beta
in vitro y/o in vivo, o que estimula o induce la
diferenciación in vitro y/o in vivo de células
precursoras beta.
La administración "en combinación" con uno
o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración
simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.
La expresión "disfunción pancreática" se
refiere de manera general a una o más condiciones en mamíferos que
se producen como resultado de una reducción o pérdida de masa de
células beta. La disfunción pancreática puede caracterizarse más
particularmente, por ejemplo, por niveles deficientes de insulina en
el mamífero, medios deficientes de secreción de insulina en el
mamífero o en forma de síndrome metabólico. La disfunción
pancreática puede deberse, por ejemplo, a la insuficiente
diferenciación de células precursoras beta en células beta maduras
o la destrucción de células beta que puede producirse en, por
ejemplo, la insulitis o la enfermedad autoinmunológica.
Los términos "diabetes" y "diabetes
mellitus" se utilizan en un sentido amplio y se refieren
generalmente a la condición o síndrome en mamíferos asociado a la
insulina como diabetes insulinodependiente (también denominado
diabetes de tipo I o IDDM), diabetes no
insulino-dependiente (también denominada diabetes de
tipo II o NIDDM), diabetes gestacional, diabetes relacionada con la
malnutrición (MRD) y la diabetes de aparición en la madurez del
joven (también denominada MODY).
El término "mamífero" se refiere a
cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo seres
humanos, animales domésticos y de granja, perros, caballos, gatos,
etc. Preferentemente el mamífero es el ser humano.
Los solicitantes han descubierto que diversos
ligandos de receptor ErbB alteran eficazmente la expresión de
factores o marcadores de transcripción de células pancreáticas,
descritos en más detalle posteriormente. Generalmente, las células
precursoras (o relativamente no diferenciadas) se identifican por la
presencia o ausencia de marcadores celulares específicos y
funcionalmente por la capacidad respectiva de las mismas de
diferenciarse en el tipo celular apropiado. La definición de
marcador para las células precursoras beta se deriva, por lo menos
en parte, a partir de una caracterización histológica de su origen y
de los factores de transcripción que resultan necesarios para la
formación pancreática. Edlund, Diabetes
47:1817-1823, 1998; Bouwens, J., Pathology
184:234-239, 1998, y Sander et al., J. Mol.
Med. 75:327-340, 1997, proporcionan revisiones del
desarrollo del tejido pancreático y comentarios de marcadores de
células pancreáticas, particularmente la expresión de los diversos
marcadores de factor de transcripción y el papel de dichos
marcadores como indicios de etapas del desarrollo y función de las
células pancreáticas.
En la actualidad se cree que por lo menos un
subconjunto de células epiteliales ductulares en mamíferos es capaz
de dar lugar a células endocrinas funcionales (tanto en el páncreas
fetal durante la embriogénesis como durante la vida adulta) y de
esta manera, los precursores razonablemente se esperaría que
expresasen, por ejemplo, la citoqueratina 19, un marcador asociado
a las células epiteliales ductales pancreáticas.
El factor de transcripción PDX-1
típicamente se expresa en un subconjunto de células endodérmicas del
tubo digestivo en mamíferos y se considera que la apariencia
temporal y espacial de estas células apoya que estas células sean
células precursoras pancreáticas tempranas. Además, la inactivación
genética de PDX-1 puede conducir a la ausencia de
páncreas o de tejido pancreático en mamíferos. Por consiguiente,
razonablemente es previsible que las células precursoras beta
expresen PDX-1. La ausencia de los factores de
transcripción Pax4, Pax6 y/o NeuroD puede conducir a la ausencia de
células beta maduras y de islotes maduros, y por lo tanto de manera
similar, las células precursoras beta razonablemente es previsible
que expresen uno o la totalidad de estos marcadores.
La insulina, el transportador de glucosa de tipo
2 (glut2), el factor de transcripción ISL1 y la glucoquinasa (GLK)
se expresan en células beta maduras. También pueden expresarse a
nivel reducido en las células precursoras beta, debido a que estas
células se comprometen a diferenciarse en el fenotipo de célula beta
madura. En el islote maduro, cada tipo de célula endocrina expresa
únicamente una de las hormonas principales: las células beta
expresan insulina, las células alfa expresan glucagón y las células
delta expresan somatostatina. En contraste, una célula precursora
de islote puede expresar los genes codificantes de más de una
hormona de islote. Por consiguiente, las células precursoras beta
también pueden expresar glucagón y somatostatina. El gen
codificante de la proteína ribosómica RPL19 se expresa en la mayoría
de tipos celulares y puede utilizarse, tal como se describe en los
Ejemplos, para representar cambios en el número celular.
Se cree que la utilización de ligandos de
receptor ErbB o de anticuerpos agonistas de receptor ErbB para
inducir la proliferación o el crecimiento de las células beta
maduras resultará beneficioso para incrementar la secreción de
insulina en el mamífero. La expansión de la masa de células beta
puede constituir un medio importante para compensar la pérdida o
disfunción de las células beta que se producen, por ejemplo, en la
diabetes. Debido a que las células precursoras beta aparentemente
también se encuentran presentes en toda la infancia y la adultez en
los mamíferos, también se cree que la utilización de ligandos de
receptor ErbB o de anticuerpos agonistas de receptor ErbB para
inducir o estimular la diferenciación de dichas células precursoras
en células beta madura resultará útil en el tratamiento de
condiciones asociadas a la deficiencia de insulina.
El ligando de ErbB (así como el receptor ErbB,
que puede utilizarse por ejemplo como inmunógeno para preparar
anticuerpos agonistas) puede prepararse mediante diversas técnicas
conocidas de la técnica, incluyendo procedimientos de síntesis
in vitro de polipéptidos o en cultivo celular recombinante
utilizando sistemas de huésped-vector, tales como
los descritos posteriormente.
Opcionalmente, se utilizan células huésped de
mamífero y dichos huéspedes pueden contener o no contener sistemas
post-traduccionales para procesar
pre-prosecuencias de ligando de ErbB en el modo
habitual. Si las células huésped contienen dichos sistemas,
resultará posible recuperar fragmentos subdominios naturales a
partir de los cultivos. En caso contrario, el procesamiento correcto
puede conseguirse mediante la transformación de los huéspedes con
el enzima o enzimas requeridos o mediante el suministro de los
mismos en un procedimiento in vitro. Sin embargo, no resulta
necesario transformar células con los genes prepro- o estructurales
completos de un polipéptido seleccionado en caso de que se desee
producir únicamente fragmentos de las secuencias. Por ejemplo,
puede ligarse un codón de inicio al extremo 5' del ADN codificante
de un polipéptido ligando de ErbB, este ADN se utiliza para
transformar células huésped y el producto se expresa directamente
como forma con Met N-terminal (si se desea, la Met
extránea puede eliminarse in vitro o con desmetionilasas
N-terminales endógenas). Alternativamente, el
ligando de ErbB puede expresarse como fusión con una secuencia de
señal reconocida por la célula huésped, que procesa y secreta el
ligando de ErbB maduro, tal como se describe adicionalmente
después. Las variantes de secuencia de aminoácidos de ligando de
ErbB de secuencia nativa pueden producirse de la misma manera.
El ADN codificante de ligando de ErbB puede
obtenerse a partir de cualquier biblioteca de ADNc preparada a
partir de tejido que se cree que posee ARNm de ligando de ErbB y
para expresarlo a un nivel detectable. De esta manera, puede
obtenerse a partir de una biblioteca genómica un gen de ligando de
ErbB.
Pueden cribarse bibliotecas con sondas diseñadas
para identificar el gen de interés o la proteína codificada por el
mismo. Para las bibliotecas de expresión de ADNc, entre las sondas
adecuadas se incluyen los anticuerpos monoclonales o policlonales
que reconocen y se unen específicamente al ligando; los
oligonucleótidos de aproximadamente 20 a 80 bases de longitud que
codifican una parte conocida o sospechada de ADNc de ligando de ErbB
de la misma especie o de una especie diferente, y/o ADNcs
complementarios u homólogos o fragmentos de los mismos que codifican
el mismo gen o un gen similar. Entre las sondas apropiadas para
cribar las bibliotecas de ADN genómico se incluyen, aunque sin
limitarse a ellos, oligonucleótidos, ADNcs o fragmentos de los
mismos que codifican el mismo gen o un gen similar; y/o ADNs
genómicos homólogos o fragmentos de los mismos. El cribado de ADNc o
de una biblioteca genómica con la sonda seleccionada puede llevarse
a cabo utilizando procedimientos estándares, tal como se describe
en los capítulos 10 a 12 de Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989).
Un medio alternativo para aislar el gen
codificante del ligando de ErbB es utilizar metodología de reacción
en cadena de polimerasa (PCR), tal como se describe en la sección 14
de Sambrook et al., supra. Este procedimiento
requiere la utilización de sondas oligonucleótidas que se hibridarán
con el ligando de ErbB. Se describen posteriormente las estrategias
para la selección de los oligonucleótidos.
Otro procedimiento alternativo para obtener el
gen de interés es sintetizarlo químicamente utilizando uno de los
procedimientos descrito en Engels et al., Agnew Chem. Int.
Ed. Engl. 28:216-734, 1989. Entre estos
procedimientos se incluyen los procedimientos de triéster, de
fosfito, de fosforamidita y de H-fosfonato, la PCR
y otros procedimientos de autocebador y síntesis de oligonucleótidos
sobre soportes sólidos. Estos procedimientos pueden utilizarse si
se conoce la secuencia de ácidos nucleicos completa del gen, o si la
secuencia del ácido nucleico complementaria de la cadena
codificante se encuentra disponible, o alternativamente, si la
secuencia de aminoácidos diana es conocida, pueden inferirse
secuencias de ácido nucleico potenciales utilizando residuos
codificantes conocidas y preferentes de cada residuo aminoácido.
Un procedimiento opcional es utilizar secuencias
oligonucleótidas seleccionadas cuidadosamente para cribar
bibliotecas de ADNc procedentes de diversos tejidos. Las secuencias
oligonucleótidas seleccionadas como sondas deben ser de suficiente
longitud y suficientemente inequívocas para minimizar los falsos
positivos. La secuencia o secuencias actuales de nucleótidos pueden
basarse, por ejemplo, en secuencias o regiones de nucleótidos
conservadas o altamente homólogas o regiones de ligando de ErbB. Los
oligonucleótidos pueden encontrarse degenerados en una o más
posiciones. La utilización de oligonucleótidos degenerados puede
resultar de particular importancia en el caso de que se cribe una
biblioteca de una especie en la que la utilización preferente de
codones en dicha especie no es conocida. El oligonucleótido debe
marcarse de manera que pueda detectarse tras la hibridación a ADN
en la biblioteca que se criba. El procedimiento preferente de
marcaje es utilizar ATP marcado con ^{32}P utilizando
polinucleótido quinasa, tal como es bien conocido de la técnica,
para marcar radioactivamente el oligonucléotido. Sin embargo,
pueden utilizarse otros procedimientos para marcar el
oligonucleótido, incluyendo, aunque sin limitación, la
biotinilación o el marcaje enzimático.
Pueden prepararse variantes de secuencia de
aminoácidos de ligandos de receptor ErbB mediante la introducción
de cambios de nucleótidos apropiados en el ADN, o mediante síntesis
in vitro del ligando polipéptido deseado. Entre dichas
variantes se incluyen, por ejemplo, deleciones o inserciones o
sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos
del ligando de ErbB de secuencia nativa. Puede realizarse cualquier
combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar al
constructo final, con la condición de que éste posea las
características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden
alterar procesos post-traduccionales, por ejemplo
cambiar el número de posición de sitios de glucosilación, alterar
las características de anclaje a membrana, alterar la localización
intracelular del polipéptido mediante inserción, deleción u otro
tipo de afección de la secuencia líder del polipéptido de secuencia
nativa, o modificar la susceptibilidad del mismo al corte
proteolítico.
\newpage
En el diseño de las variantes de secuencia de
aminoácidos de un ligando de ErbB, la localización del sitio de
mutación y la naturaleza de la mutación dependerá de las
características del polipéptido que debe modificarse. Los sitios
para la mutación pueden modificarse individualmente o en serie, por
ejemplo mediante (1) sustitución en primer lugar con elecciones
conservativas de aminoácidos y después con elecciones más radicales
dependiendo de los resultados alcanzados, (2) delecionar el residuo
diana, o (3) insertar residuos de otros ligandos de receptor
contiguos en el sitio localizado.
Un procedimiento útil para identificar
determinados residuos o regiones del polipéptido que son
localizaciones preferentes para la mutagénesis se denomina
"mutagénesis por escaneo de alaninas", tal como se describe en
Cunningham y Wells (Science 244:1081-1085, 1989). En
esta referencia, se identifica un residuo o grupo de residuos diana
(por ejemplo residuos con carga, tales como arg, asp, his, lys y
glu) y se sustituye con un aminoácido neutro o de carga negativa
(más preferentemente alanina o polialanina), afectando la
interacción de los aminoácidos con el ambiente acuoso circundante
en el interior o exterior de la célula. Aquellos dominios que
demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones seguidamente
se refinan mediante introducción de variantes adicionales u otras
variantes en o para los sitios de sustitución. De esta manera,
aunque el sitio para introducir una variación de secuencia de
aminoácidos no se encuentre predeterminado, no resulta necesario
que la naturaleza de la mutación per se se encuentre
predeterminada. Por ejemplo, para optimizar el rendimiento de una
mutación en un sitio dado, puede llevarse a cabo escaneo de alaninas
o mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y las variantes
de ligando de ErbB expresadas cribarse para la combinación óptima de
actividad deseada.
Existen dos variables principales en la
construcción de variantes de secuencia de aminoácidos: la
localización del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación.
Éstas son variantes de la secuencia nativa, y pueden representar
alelos de origen natural o formas mutantes predeterminadas que se
han preparado mutando el ADN con el fin de conseguir un alelo o una
variante que no se encuentra en la Naturaleza. En general, la
localización y la naturaleza de la mutación seleccionada dependerá
de la característica que debe modificarse.
Las deleciones de secuencia de aminoácidos
generalmente son de entre aproximadamente 1 y 30 residuos, más
preferentemente de entre aproximadamente 1 y 10 residuos, y
típicamente entre aproximadamente 1 y 5 son contiguos. El número de
deleciones consecutivas puede seleccionarse con el fin de conservar
la estructura terciaria del polipéptido en el dominio afectado, por
ejemplo entrecruzamiento con cisteínas, lámina
beta-plegada o hélice alfa.
Entre las inserciones de secuencia de
aminoácidos se incluyen las fusiones aminoterminales y/o
carboxilo-terminales de longitud comprendida entre
un residuo y polipéptidos que contienen cien o más residuos, así
como inserciones intrasecuencia de uno o múltiples residuos
aminoácidos. Las inserciones intrasecuencia puede encontrarse
comprendidas generalmente entre aproximadamente 1 y 10 residuos,
más preferentemente entre 1 y 5, y más preferentemente entre 1 y 3.
Entre los ejemplos de inserciones terminales se incluyen un ligando
de ErbB con un residuo metionilo N-terminal (un
artefacto de la expresión directa de ErbB en cultivo celular
recombinante bacteriano) y la fusión de una secuencia de señal
N-terminal heteróloga con el extremo
N-terminal del ligando de ErbB para facilitar la
secreción del ligando de ErbB maduro de las células huésped
recombinantes. Dichas secuencias de señal generalmente se obtienen,
y por lo tanto son homólogas, de la especie de célula huésped
pretendida. Entre las secuencias adecuadas se incluyen STII, tPA o
lpp para E. coli, factor alfa para levaduras, y señales
víricas, tal como gD de virus herpes, para las células de
mamífero.
Entre las demás variantes por inserción de
ligando de ErbB se incluyen la fusión con el extremo
N-terminal o C-terminal del ligando
de ErbB de un polipéptido inmunogénico, por ejemplo polipéptidos
bacterianos tales como beta-lactamasa o un enzima
codificado por el locus trp de E. coli, o proteína de
levadura, albúmina de suero bovino y polipéptidos quimotácticos. Se
encuentran contempladas las fusiones C-terminales
de ECD de ligando de ErbB con proteínas que presentan una vida
media prolongada, tal como regiones constantes de inmunoglobulina
(u otras regiones de inmunoglobulina), albúmina o ferritina, tal
como se describe en la patente WO nº 89/02922, publicada el 6 de
abril de 1989.
Otro grupo de variantes son las variantes de
sustitución de aminoácido. En estas variantes por lo menos un
residuo aminoácido en el polipéptido ha sido eliminado y se ha
insertado un residuo diferente en su lugar. Entre los sitios de
mayor interés para la mutagénesis sustitucional se incluyen sitios
identificados como el sitio o sitios activos del polipéptido, y
sitios en los que los aminoácidos presentes en los ligandos de ErbB
de diversas especies son sustancialmente diferentes en términos de
volumen de cadena lateral, carga y/o hidrofobicidad.
Las sustituciones no conservativas suponen
intercambiar un miembro de una de estas clases por un miembro de
otra. Dichos residuos sustituidos pueden introducirse en regiones
del polipéptido que son homólogas a otros ligandos de receptor o,
más preferentemente, en las regiones no homólogas de la
molécula.
En una realización, cualquier residuo metionilo
diferente del residuo metionilo de partida de la secuencia de señal
o cualquier residuo localizado a menos de aproximadamente tres
residuos en posición N-terminal o
C-terminal respecto a cada uno de dichos residuos
metionilo, se sustituye por otro residuo o se deleciona.
Alternativamente, se insertan aproximadamente 1 a 3 residuos
contiguos a dichos sitios.
\newpage
Cualquier residuo cisteína no implicado en el
mantenimiento de la conformación correcta del ligando de ErbB
también puede sustituirse, generalmente con serina, para mejorar la
estabilidad oxidativa de la molécula y para prevenir el
entrecruzamiento aberrante.
Puede prepararse ADN codificante de variantes de
secuencia de aminoácidos del ligando de ErbB mediante una
diversidad de procedimientos conocidos de la técnica. Entre estos
procedimientos se incluyen, aunque sin limitación, el aislamiento a
partir de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia
de aminoácidos de origen natural) o la preparación de mutagénesis
(sitio-dirigida) mediada por oligonucleótidos,
mutagénesis por PCR y mutagénesis por inserción de casete de una
variante preparada anteriormente o de una versión no variante.
Estas técnicas pueden utilizar ácido nucleico (ADN o ARN) o ácido
nucleico complementario a dicho ácido nucleico.
La mutagénesis mediada por oligonucleótido es un
procedimiento opcional para preparar variantes por sustitución,
deleción e inserción. Esta técnica es conocida de la técnica, tal
como se describe en Adelman et al., DNA 2:183, 1983.
Brevemente, se altera el ADN mediante hibridación de un
oligonucleótido codificante de la mutación deseada con un molde de
ADN, en el que el molde es la forma de cadena única de un plásmido
o bacteriófago que contiene la secuencia de ADN no alterada o
nativa. Tras la hibridación, se utiliza una ADN polimerasa para
sintetizar una segunda cadena complementaria completa del molde que
de esta manera incorporará el cebador oligonucleótido y codificará
la alteración seleccionada en el ADN.
Generalmente, se utilizan oligonucleótidos de
por lo menos 25 nucleótidos de longitud. Un oligonucleótido óptimo
presentará 12 a 15 nucleótidos que son completamente complementarios
al molde en ambos lados del nucleótido o nucleótidos codificantes
de la mutación. Ello garantiza que el oligonucléotido se hibridará
correctamente con la molécula de molde de ADN de cadena única. Los
oligonucleótidos se sintetizan fácilmente utilizando técnicas
conocidas de la técnica, tales como las descritas en Crea et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. 75:L5765, 1978.
También puede generarse un molde de ADN de
cadena única mediante desnaturalización de plásmido de ADN de doble
cadena utilizando técnicas estándares.
Para la alteración de la secuencia de ADN nativa
(por ejemplo para generar variantes de secuencia de aminoácidos),
el oligonucleótido se hibrida con el molde de cadena única bajo
condiciones de hibridación adecuadas. A continuación, se añade un
enzima polimerizador de ADN, habitualmente el fragmento klenow de la
ADN polimerasa I, para sintetizar la cadena complementaria del
molde utilizando el oligonucleótido como cebador para la síntesis.
De esta manera se forma una molécula heterodúplex en la que una
cadena de ADN codifica la forma mutada del polipéptido, y la otra
cadena (el molde original) codifica la secuencia no alterada nativa
del polipéptido. Esta molécula heterodúplex seguidamente se
transforma en una célula huésped adecuada, habitualmente un
procariota, tal como E. coli JM 101. Tras cultivar las
células, se siembran en placas de agarosa y se criban utilizando el
cebador oligonucleótido marcado radioactivamente con
^{32}P-fosfato para identificar las colonias
bacterianas que contienen el ADN mutado. A continuación, la región
mutada se elimina y se introduce en un vector apropiado para la
producción de proteínas, generalmente un vector de expresión del
tipo utilizado típicamente para la transformación de un huésped
apropiado.
El procedimiento descrito en el párrafo anterior
puede modificarse de manera que se cree una molécula homodúplex en
la que ambas cadenas del plásmido contienen la mutación o
mutaciones. Las modificaciones son las siguientes: el
oligonucleótido de cadena única se hibrida con el molde de cadena
única, tal como se ha descrito anteriormente. Se combina un mezcla
de tres desoxirribonucleótidos: desoxirriboadenosina (dATP),
desoxirriboguanosina (dGTP) y desoxiribotidimidina (dTTP) con una
tio-desoxirribocitosina modificada denominada
dCTP-(aS) (que puede obtenerse de Amersham Corporation). Esta mezcla
se añade al complejo de molde-oligonucleótido. Tras
la adición de la ADN polimerasa a dicha mezcla, se genera una cadena
de ADN idéntica al molde excepto por las bases mutadas. Además,
esta nueva cadena contendrá dCTP-(aS) en lugar de dCTP, que sirve
para protegerla de la digestión con endonucleasa de restricción.
Tras cortar la cadena molde del heterodúplex de doble cadena con un
enzima de restricción apropiado, la cadena molde puede digerirse con
nucleasa ExoIII u otra nucleasa apropiada pasada la región que
contiene el sitio o sitios que deben mutagenizarse. A continuación,
la reacción se detiene, dejando una molécula que sólo es
parcialmente de cadena única. Seguidamente, se forma un homodúplex
de ADN de doble cadena utilizando ADN polimerasa en presencia de los
cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato, ATP y ADN ligasa. A
continuación, esta molécula de homodúplex puede transformarse en una
célula huésped adecuada, tal como E. coli JM101, tal como se
ha indicado anteriormente.
Puede generarse de varias maneras ADN
codificante de variantes con más de un aminoácido que debe
sustituirse. Si los aminoácidos se encuentra próximos entre sí en
la cadena polipeptídica, pueden mutarse simultáneamente utilizando
un oligonucleótido que codifica la totalidad de las sustituciones de
aminoácidos deseadas. Sin embargo, si los aminoácidos se encuentran
situados a cierta distancia entre sí (separados por más de
aproximadamente diez aminoácidos), resulta más difícil generar un
único oligonucleótido que codifique todos los cambios deseados. Por
el contrario, puede utilizarse uno de entre dos procedimientos
alternativos.
En el primer procedimiento, se genera un
oligonucleótido separado para cada aminoácido que debe sustituirse.
A continuación, los oligonucleótidos se hibridan con el ADN molde de
cadena única simultáneamente, y la segunda cadena de ADN que se
sintetiza a partir del molde codificará todas las sustituciones
deseadas de aminoácidos.
\newpage
El procedimiento alternativo implica dos o más
rondas de mutagénesis para producir el mutante deseado. La primera
ronda es tal como se ha descrito para los mutantes únicos: se
utiliza ADN de tipo salvaje para el molde, se hibrida un
oligonucleótido codificante de la primera sustitución o
sustituciones de aminoácidos deseadas con dicho molde, generándose
la molécula de ADN heterodúplex. La segunda ronda de mutagénesis
utiliza el ADN mutado producido en la primera ronda de mutagénesis
como molde. De esta manera, este molde ya contiene una o más
mutaciones. El oligonucleótido codificante de la sustitución o
sustituciones de aminoácidos adicionales deseadas seguidamente se
hibridan con dicho molde y la cadena resultante de ADN ahora
codifica mutaciones de la primera y de la segunda ronda de
mutagénesis. Este ADN resultante puede utilizarse como molde en un
tercera ronda de mutagénesis, y de esta manera sucesivamente.
La mutagénesis por PCR también resulta adecuada
para preparar variantes de aminoácidos. Aunque el comentario
siguiente se refiere a ADN, se entiende que la técnica también
resulta aplicable a ARN. La técnica de PCR generalmente se refiere
al procedimiento siguiente (ver Erlich, supra, capítulo por
R. Higuchi, páginas 61 a 70). En el caso de que se utilicen
cantidades reducidas de ADN molde como material de partida en una
PCR, pueden utilizarse cebadores de secuencia ligeramente diferente
respecto a la región correspondiente en un ADN molde, con el fin de
generar cantidades relativamente grandes de un fragmento específico
de ADN que difiere de la secuencia molde únicamente en las
posiciones en las que los cebadores difieren del molde. Para la
introducción de una mutación en un plásmido de ADN, se diseña uno de
los cebadores para que se solape con la posición de la mutación y
para que contenga la mutación; la secuencia del otro cebador debe
ser idéntica a un tramo de secuencia de la cadena opuesta del
plásmido, aunque esta secuencia puede encontrarse situada en
cualquier sitio a lo largo del plásmido de ADN. Resulta preferente,
sin embargo, que las secuencias del segundo cebador se encuentren
situadas a menos de 200 nucleótidos de la secuencia del primero, de
manera que al final resulte fácil de secuenciar la región
amplificada completa de ADN unida por los cebadores. La
amplificación por PCR utilizando un par de cebadores tal como la
que se acaba de describir resulta en una población de fragmentos de
ADN que difieren en la posición de la mutación especificada por el
cebador, y posiblemente en otras posiciones.
Si la proporción de molde a material de producto
es extremadamente reducida, la amplia mayoría de fragmentos de
producto ADN incorporan la mutación o mutaciones deseadas. Este
material de producto se utiliza para sustituir la región
correspondiente del plásmido que sirvió como molde de PCR utilizando
tecnología estándar de ADN. Pueden introducirse mutaciones en
posiciones separadas simultáneamente utilizando un segundo cebador
mutante o llevando a cabo una segunda PCR con diferentes cebadores
mutantes y ligando los dos fragmentos de PCR resultantes
simultáneamente al fragmento de vector en una ligación de tres (o
más) partes.
Otro procedimiento para preparar variantes, la
mutagénesis por inserción de casete, se basa en la técnica descrita
por Wells et al. (Gene 34:315, 1985). El material de partida
es el plásmido (u otro vector) que comprende ADN que debe mutarse.
El codón o codones en el ADN que debe mutarse se encuentran
identificados. Debe existir un único sitio de restricción de
endonucleasa en cada lado del sitio o sitios de mutación
identificados. Si no existen dichos sitios de restricción, pueden
generarse utilizando el procedimiento de mutagénesis mediada por
oligonucleótido anteriormente descrita para introducirlos en
localizaciones apropiadas en el ADN. Tras introducir los sitios de
restricción en el plásmido, éste se corta en estos sitios para
linearizarlo. Se sintetiza utilizando procedimientos estándar un
oligonucleótido de doble cadena codificante de la secuencia de ADN
entre los sitios de restricción pero que contiene la mutación o
mutaciones deseadas. Las dos cadenas se sintetizan separadamente y
después se hibridan entre sí utilizando técnicas estándar. Este
oligonucleótido de doble cadena se denomina casete. Este casete se
diseña para que presente extremo 3' y 5' que son compatibles con los
extremos del plásmido linearizado, de manera que puede ligarse
directamente con el plásmido.
Pueden utilizarse cualquiera de dichos
procedimientos y técnicas para preparar o identificar las variantes
de ligando de ErbB útiles en la presente invención. En particular,
se hace referencia a la patente WO nº 98/35036, que da a conocer
diversas variantes de heregulina que pueden resultar útiles en la
presente invención.
Se inserta el ADNc o ADN genómico codificante
del polipéptido nativo o variante en un vector replicable para la
clonación adicional (amplificación del ADN) o para la expresión. Se
encuentran disponibles muchos vectores, y la selección del vector
apropiado dependerá de: 1) si debe utilizarse para la amplificación
del ADN o para la expresión de ADN, 2) el tamaño del ADN que debe
insertarse en el vector, y 3) la célula huésped que debe
transformarse con el vector. Cada vector contiene diversos
componentes dependiendo de la función del mismo (amplificación de
ADN o expresión de ADN) y la célula huésped con la que es
compatible. Entre los componentes del vector generalmente se
incluyen, aunque sin limitación, uno o más de los siguientes: una
secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes
marcadores, un elemento intensificador, un promotor y una secuencia
de terminación de transcripción.
En general, la secuencia de señal puede ser un
componente del vector, o puede ser una parte del ADN que se inserta
en el vector. El ADN nativo se cree que codifica una secuencia de
señal en el extremo aminoterminal (extremo 5' del ADN codificante
del polipéptido) del polipéptido que se corta durante el
procesamiento post-traduccional del polipéptido.
Por ejemplo, puede secretarse de la célula ligando nativo de ErbB,
aunque permanece alojado en la membrana debido a que contiene un
dominio transmembrana y una región citoplasmática en la región
carboxi-terminal del polipéptido. De esta manera,
en una versión soluble secretada del ligando de ErbB, el dominio
carboxilo-terminal de la molécula, que incluye el
dominio transmembranal, habitualmente se deleciona. Esta variante
truncada de ligando de ErbB puede secretarse de la célula, con la
condición de que el ADN codificante de la variante truncada
codifique una secuencia de señal reconocida por el huésped.
El polipéptido seleccionado puede expresarse no
sólo directamente, sino también en forma de una fusión con un
polipéptido heterólogo, preferentemente una secuencia de señal u
otro polipéptido que presente un sitio de corte específico en el
extremo N-terminal y/o C-terminal
del polipéptido maduro. En general, la secuencia de señal puede ser
un componente del vector, o puede ser una parte del ADN que se
inserta en el vector. Se encuentran comprendidos dentro del alcance
de la presente invención los ligandos de ErbB en los que la
secuencia de señal nativa ha sido delecionada y sustituida por una
secuencia de señal heteróloga. La secuencia de señal heteróloga
seleccionada debe ser una secuencia que resulte reconocida y
procesada, es decir, cortada por una peptidasa de señal, en la
célula huésped. Para las células huésped procarióticas que no
reconocen ni procesan la secuencia de señal del ligando nativo de
ErbB, la secuencia de señal se sustituye por una secuencia de señal
procariótica seleccionada, por ejemplo, de entre el grupo de los
líderes de fosfatasa alcalina, de penicilinasa, de lpp o de
enterotoxina II termoestable. Para la secreción en levaduras, la
secuencia de señal de ligando nativo de ErbB puede sustituirse por
los líderes de invertasa de levadura, de factor alfa o de fosfatasa
ácida. En la expresión de células de mamífero, la secuencia de
señal nativa es satisfactoria, aunque pueden resultar adecuadas
otras secuencias de señal de mamífero.
Los vectores tanto de expresión como de
clonación generalmente contienen una secuencia de ácidos nucleicos
que permite que el vector se replique en una o más células huésped
seleccionadas. Generalmente, en los vectores de clonación, esta
secuencia es una que permite que el vector se replique
independientemente del ADN cromosómico del huésped, e incluye
orígenes de replicación o secuencias de replicación autónoma. Dichas
secuencias son bien conocidas para una diversidad de bacterias,
levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322
resulta adecuado para la mayoría de bacterias
Gram-negativas, el origen del plásmido 2m resulta
adecuado para levaduras, y diversos orígenes víricos (SV40,
polioma, adenovirus, VSV o BPV) resultan útiles para los vectores
de clonación en células de mamífero. Generalmente el componente
origen de replicación no resulta necesaria para los vectores de
expresión de mamífero (el origen de SV40 típicamente puede
utilizarse únicamente debido a que contiene el promotor
temprano).
La mayoría de vectores de expresión son vectores
"lanzadera", es decir son capaces de replicación en por lo
menos una clase de organismos, pero pueden transfectarse en otro
organismo para la expresión. Por ejemplo, se clona un vector en
E. coli y después se transfecta el mismo vector en células de
levadura o de mamífero para la expresión.
También puede amplificarse ADN mediante
inserción en el genoma huésped. Esto se consigue fácilmente
utilizando especies de Bacillus como huéspedes, por ejemplo
mediante inclusión en el vector de una secuencia de ADN que es
complementaria a la secuencia presentes en el ADN genómico de
Bacillus. La transfección de Bacillus con este vector
resulta en la recombinación homóloga con el genoma y la inserción
del ADN codificante del polipéptido seleccionado. El ADN puede
amplificarse mediante PCR y transfectarse directamente en las
células huésped sin ningún componente de replicación.
Los vectores de expresión y de clonación deben
contener un gen de selección, también denominado marcador
seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria para la
supervivencia o el crecimiento de células huésped transformadas
cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Las células huésped no
transformadas con el vector que contiene el gen de selección no
sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos
codifican proteínas que: (a) proporcionan resistencia a antibióticos
o a otras toxinas, por ejemplo ampicilina, neomicina, metotrexato o
tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c)
suministran nutrientes críticos no disponibles de medios complejos,
por ejemplo el gen codificante de la D-alanina
racemasa para los Bacillus.
Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un
fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas
células que no se transforman con éxito con un gen heterólogo
expresan una proteína que proporciona resistencia a fármaco y que
de esta manera el régimen de selección. Los ejemplos de dicha
selección dominante utilizan los fármacos neomicina (Southern et
al., J. Molec. Appl. Genet. 1:327, 1982), ácido micofenólico
(Mulligan et al., Science 209:1422, 1980) o higromicina
(Sugden et al., Mol. Cell. Biol. 5:410-413,
1985). Los tres ejemplos proporcionados anteriormente utilizan genes
bacterianos bajo control eucariótico para proporcionar resistencia
al fármaco G418 apropiado, a neomicina (geneticina), xgpt (ácido
micofenólico) o a higromicina, respectivamente.
Otro ejemplo de marcadores seleccionables
adecuados para las células de mamífero son aquéllas que permiten la
identificación de células competentes para incorporar el ácido
nucleico, tales como la dihidrofolato reductasa (DHFR) o la
timidina quinasa. Los transformantes de células de mamífero se
sitúan bajo presión selectiva que sólo los transformantes adaptados
específicamente para sobrevivir en virtud de que han incorporado el
marcador. La presión selectiva se impone cultivando los
transformantes en condiciones bajo las que la concentración de
agente selectivo en el medio se modifica sucesivamente, conduciendo
de esta manera a la amplificación de tanto el gen de selección como
el ADN que codifica el polipéptido seleccionado. La amplificación es
el procedimiento por el que los genes con mayor demanda para la
producción de una proteína crítica para el crecimiento se reiteran
en tándem dentro de los cromosomas en sucesivas generaciones de
células recombinantes.
Por ejemplo, las células transformadas con el
gen de selección DHFR en primer lugar se identifican mediante el
cultivo de la totalidad de los transformantes en un medio de cultivo
que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR.
Una célula huésped apropiada, en el caso de que se utilice DHFR de
tipo salvaje, es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO)
deficiente en actividad de DHFR, preparada y propagada tal como
describen Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980.
A continuación, las células transformadas se exponen a niveles
incrementados de metotrexato. Esto conduce a la síntesis de
múltiples copias del gen DHFR y, concomitantemente, de múltiples
copias del otro ADN que comprende los vectores de expresión, tales
como el ADN codificante de ligando de ErbB. Esta técnica de
amplificación puede utilizarse con cualquier huésped adecuado de
otra manera, por ejemplo ATCC nº CCL61 CHO-K1, a
pesar de la presencia de DHFR endógeno si se utiliza, por ejemplo,
un gen DHFR mutante que es altamente resistente a Mtx (patente EP
nº 117.060). Alternativamente, pueden seleccionarse células huésped
(particularmente huéspedes de tipo salvaje que contienen DHFR
endógeno) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN
codificantes del polipéptido seleccionado, proteína DHFR de tipo
salvaje y otro marcador seleccionable, tal como aminoglucósido
3'-fosfotransferasa (APH), mediante cultivo celular
en medio que contiene un agente de selección para el marcador
seleccionable, tal como un antibiótico aminoglucosídico, por
ejemplo canamicina, neomicina o G418 (ver la patente US nº
4.965.199).
Un gen de selección adecuado para la utilización
en la levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de
levadura Yrp7 (Stinchcomb et al., Nature 282:39, 1979;
Kingsman et al., Gene 7:141, 1979, o Tschemper et
al., Gene 10:157, 1980). El gen trp1 proporciona un
marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece
de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo la ATCC nº
44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics 85:12, 1977). La
presencia de la lesión trp1 en el genoma de la célula huésped
de levadura entonces proporciona un ambiente eficaz para detectar
la transformación a partir del crecimiento en ausencia de
triptófano. De manera similar, las cepas de levadura deficientes en
Leu2 (ATCC nº 20.622 o nº 38.626) son complementadas por
plásmidos conocidos que portan el gen Leu2.
Los vectores de expresión y de clonación
habitualmente contienen un promotor que es reconocido por el
organismo huésped y se encuentra operablemente ligado al ácido
nucleico codificante del polipéptido. Los promotores son secuencias
no traducidas localizadas corriente arriba (5') del codón de inicio
de un gen estructural (generalmente a una distancia comprendida
entre aproximadamente 100 y 1.000 pb) que controlan la transcripción
y la traducción de una secuencia particular de ácido nucleico, tal
como ligando de ErbB, al que se encuentran operablemente ligados.
Dichos promotores típicamente se clasifican en dos grupos,
inducibles y constitutivos. Los promotores inducibles son
promotores que inician niveles incrementados de transcripción a
partir del ADN bajo su control en respuesta a algunos cambios en
las condiciones de cultivo, por ejemplo la presencia o la ausencia
de un nutriente o un cambio de temperatura. En la actualidad son
bien conocidos un gran número de promotores reconocidos por una
diversidad de potenciales células huésped. Estos promotores se
encuentran operablemente ligadas a ADN codificante de ligando de
ErbB mediante eliminación del promotor del ADN fuente mediante
digestión con enzimas de restricción e inserción de la secuencia de
promotor aislada en el vector. Tanto la secuencia promotora de
ligando nativo de ErbB como muchos promotores heterólogos pueden
utilizarse para dirigir la amplificación y/o la expresión del ADN
de ligando de ErbB. Sin embargo, resultan preferentes los promotores
heterólogos, debido a que generalmente permiten una mayor
transcripción y rendimientos más elevados de ligando de ErbB
expresado en comparación con el promotor de ligando nativo de
ErbB.
Entre los promotores adecuados para la
utilización con huéspedes procarióticos se incluyen los sistemas
promotores de \beta-lactamasa y de lactosa (Chang
et al., Nature 275:615, 1978, y Goeddel et al.,
Nature 281:544, 1979), fosfatasa alcalina, un sistema de promotor
triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8:4057, 1980 y
patente EP nº 36.776), tPA (patente US nº 5.641.655) y promotores
híbridos, tales como el promotor tac (deBoer et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25, 1983). Sin embargo,
resultan adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Las
secuencias nucleótidas de los mismos han sido publicadas,
permitiendo de esta manera que el experto en la materia las ligue
operablemente a ADN codificante del polipéptido seleccionado
(Siebenlist et al., Cell 20:269, 1980) utilizando línkers o
adaptadores para suministrar cualquier sitio de restricción
requerido. Los promotores para la utilización en los sistemas
bacterianos también contienen generalmente una secuencia de
Shine-Dalgarno (S.D.) operablemente ligada al ADN
codificante.
Entre las secuencias promotoras adecuadas para
la utilización con los huéspedes levadura se incluyen los
promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa
(Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) u otros
enzimas glucolíticos (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149,
1968, y Holland, Biochemistry 17:4900, 1978), tales como enolasa
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa,
fosfofructoquinasa,
glucosa-6-fosfato isomerasa,
3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa,
triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.
Otros promotores de levadura, que son promotores
inducibles que presentan la ventaja adicional de que la
transcripción se encuentra controlada por las condiciones de
cultivo, son las regiones promotoras para la alcohol deshidrogenasa
2, el isocitocromo C, la fosfatasa ácida, los enzimas degradativos
asociados con el metabolismo del nitrógeno, la metalotioneína, la
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa y los enzimas responsables de la utilización de la
maltosa y de la galactosa. Los vectores y promotores adecuados para
la utilización en la expresión de levaduras se describen
adicionalmente en Hitzeman et al., patente EP nº 73.657A.
Los intensificadores de levadura también se utilizan ventajosamente
con promotores de levadura.
Son conocidas las secuencias promotoras para los
eucariotas. Prácticamente la totalidad de los genes eucarióticos
presentan una región rica en AT localizados aproximadamente 25 a 30
bases corriente arriba del sitio en el que se inicia la
transcripción. Otra secuencia situada 70 a 80 bases cadena arriba
del inicio de la transcripción de muchos genes es una región CXCAAT
en la que X puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la
mayoría de genes eucarióticos es una secuencia AATAAA que puede ser
la señal para la adición de la cola poliA al extremo 3' de la
secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan
convenientemente en vectores de expresión de mamífero.
La transcripción génica a partir de vectores en
células huésped de mamífero puede encontrarse controlada por
promotores obtenidos de genomas de virus, tales como virus del
polioma, virus de la viruela aviar (patente UK nº 2.211.504,
publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como el adenovirus
2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar,
citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y más
preferentemente virus 40 del simio (SV40), por promotores
heterólogos de mamífero, por ejemplo el promotor de la actina o un
promotor de inmunoglobulina, por promotores de choque térmico y por
el promotor normalmente asociado a la secuencia de ligando de ErbB,
con la condición de que dichos promotores sean compatibles con los
sistemas de la célula huésped.
Los promotores temprano y tardío del virus SV40
se obtienen convenientemente en forma de fragmento de restricción
de SV40 que también contiene el origen de replicación del virus SV40
(Fiers et al., Nature 273:113, 1978; Mulligan y Berg,
Science 209:1422-1427, 1980; Pavlakis et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:7398-7402, 1981). El
promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene
convenientemente en forma de un fragmento de restricción HindIII
(Greenaway et al., Gene 18:355-360, 1982). Se
da a conocer un sistema para expresar ADN en huéspedes mamíferos
utilizando el virus del papiloma bovino en la patente US nº
4.419.446. Se describe una modificación de este sistema en la
patente US nº 4.601.978. Ver también Gray et al., Nature
295:503-508, 1983, sobre la expresión de ADNc
codificante de interferón inmune en células de mono; Reyes et
al., Nature 297:598-601, 1982, sobre la
expresión de ADNc de interferón \beta humano en células de ratón
bajo el control de un promotor timidina quinasa del virus herpes
simplex; Canaani y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
79:6777-6781, 1982, sobre la expresión de secuencias
CAT bacterianas en células renales de mono CV-1,
fibroblastos embrionarios de pollo, células de ovario de hámster
chino, células HeLa y células NIH-3T3 de ratón
utilizando la repetición terminal larga de virus del sarcoma de Rous
como promotor.
La transcripción de un ADN codificante de un
polipéptido seleccionado de la presente invención por eucariotas
superiores con frecuencia se incrementa mediante la inserción de una
secuencia intensificadora en el vector. Los intensificadores son
elementos de ADN que actúan en cis, habitualmente de una longitud
aproximada de entre 100 y 300 pb, que actúan sobre un promotor
incrementando la transcripción del mismo. Los intensificadores son
relativamente independientes respecto a la orientación y la
posición, y se han encontrado en orientación 5' (Laimins et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:993, 1981) y 3' (Lusky et
al., Mol. Cell Biol. 3:1108, 1983) respecto a la unidad de
transcripción, dentro de un intrón (Banerji et al., Cell
33:729, 1983), así como dentro de la secuencia codificante misma
(Osborne et al., Mol. Cell Biol. 4:1293, 1984). En la
actualidad se conocen muchas secuencias intensificadoras de genes de
mamífero (globina, elastasa, albúmina,
\alpha-fetoproteína e insulina). Sin embargo,
típicamente se utiliza un intensificador procedente de un virus de
célula eucariótica. Entre los ejemplos se incluyen el intensificador
de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100 a 270),
el intensificador del promotor temprano de citomegalovirus, el
intensificador de polioma en el lado tardío del origen de
replicación, y los intensificadores de adenovirus (ver también
Yaniv, Nature 297:17-18, 1982) sobre elementos
intensificadores para la activación de los promotores eucarióticos.
El intensificador puede insertarse en el vector en una posición 5' o
3' respecto al ADN de ligando de ErbB, aunque preferentemente se
localiza en un sitio 5' respecto al promotor.
Los vectores de expresión utilizados en células
huésped eucarióticas (levaduras, hongos, insectos, plantas,
animales, seres humanos o células nucleadas de otros organismos
multicelulares) también contienen secuencias necesarias para la
terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas
secuencias se encuentran disponibles comúnmente de las regiones no
traducidas 5', y ocasionalmente 3', de los ADNs o ADNcs
eucarióticos o víricos. Estas regiones contienen segmentos de
nucleótido transcritos en forma de fragmentos poliadenilados en la
parte no traducida del ARNm codificante del polipéptido. Las
regiones no traducidas 3' también incluyen sitios de terminación de
transcripción.
La construcción de vectores adecuados que
contienen uno o más de los componentes listados anteriormente y las
secuencias codificantes y de control deseadas utilizan técnicas de
ligación estándar. Los plásmidos o fragmentos de ADN aislados se
corta, adaptan y religan en la forma deseada para generar los
plásmidos requeridos.
Para el análisis de confirmación de las
secuencias correctas en los plásmidos construidos, se utilizan las
mezclas de ligación para transformar E. coli K12 cepa 294
(ATCC nº 31.446) y los transformantes exitosos se seleccionan a
partir de la resistencia a ampicilina o a tetraciclina, en caso
apropiado. Se preparan los plásmidos de los transformantes, se
analizan mediante digestión con endonucleasa de restricción y/o se
secuencian mediante el procedimiento de Messing et al.,
Nucleic Acids Res. 9:309, 1981, o mediante el procedimiento de
Maxam et al., Methods in Enzymology 65:499, 1980.
Resultan particularmente útiles en la práctica
de la presente invención los vectores de expresión que proporcionan
la expresión transitoria en células de mamífero. En general, la
expresión transitoria implica la utilización de un vector de
expresión que es capaz de replicarse eficientemente en una célula
huésped, de manera que la célula huésped acumula muchas copias del
vector de expresión y, a su vez, sintetiza niveles elevados de un
polipéptido deseado codificado por el vector de expresión. Los
sistemas de expresión transitoria, que comprenden un vector de
expresión adecuado y una célula huésped, permiten la identificación
positiva conveniente de polipéptidos codificados por ADNs clonados,
así como el cribado rápido de dichos polipéptidos para las
propiedades biológicas o fisiológicas deseadas. De esta manera, los
sistemas de expresión transitoria resultan particularmente útiles
en la invención para los fines de identificar análogos y variantes
útiles. Dicho sistema de expresión transitoria se describe en la
patente US nº 5.024.939.
Otros procedimientos, vectores y células
huéspedes adecuados para la adaptación a la síntesis del polipéptido
seleccionado en cultivo celular recombinante de vertebrado se
describen en Gething et al., Nature
293:620-625, 1981; Mantei et al., Nature
281:40-46, 1979; Levinson et al., patentes EP
nº 117.060 y nº 117.058.
Las células huésped adecuadas para clonar o
expresar los vectores de la presente invención son las células
procarióticas, de levadura o eucarióticas superiores indicadas
anteriormente. Entre los procariotas adecuados se incluyen las
eubacterias, tales como los organismos
Gram-negativos o Gram-positivos, por
ejemplo E. coli, Bacillus, tales como B.
subtilis, especies de Pseudomonas, tales como P.
aeruginosa, Salmonella typhimurium o Serratia
marcescans. Un huésped de clonación E. coli preferente es
E. coli 294 (ATCC nº 31.446), aunque resultan adecuadas
otras cepas, tales como E. coli X1776 (ATCC nº 31.537) y
E. coli W3110 (ATCC nº 27.325). Estos ejemplos son
ilustrativos y no limitativos. Preferentemente, la célula huésped
debe secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticos.
Alternativamente, resultan adecuados los procedimientos in
vitro de clonación, por ejemplo PCR u otras reacciones de
polimerasa de ácidos nucleicos.
Además de los procariotas, resultan huéspedes
adecuados los microbios eucarióticos, tales como los hongos
filamentosos o las levaduras. Saccharomyces cerevisiae, o
levadura común de panadería, es el más comúnmente utilizado de
entre los microorganismos huésped eucarióticos inferiores. Sin
embargo, se encuentran disponibles comúnmente varios otros géneros,
especies y cepas, y resultan útiles en la presente invención, tales
como Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature
290:140, 1981; patente EP nº 139.383, publicada el 2 de mayo de
1985), huéspedes de Kluyveromyces (patente US nº 4.943.529),
tales como, por ejemplo, K. lactis (Louvencourt et
al., J. Bacteriol. 737, 1983), K. fragilis, K.
bulgaricus, K. thermotolerans y K. marxianus,
Yarrowia (patente EP nº 402.226), Pichia pastoris
(patente EP nº 183.070), Sreekrishna et al., LT. Basic
Microbiol. 28:265-278, 1988; Candida,
Trichoderma reesia (patente EP nº 244.234), Neurospora
crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
76:5259-5263, 1979) y hongos filamentosos, tales
como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium
(patente WO nº 91/00357, publicada el 10 de enero de 1991), y
huéspedes Aspergillus, tales como A. nidulans
(Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.
112:284-289, 1983; Tilburn et al., Gene
26:205-221, 1983; Yelton et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 81:1470-1474, 1984) y A. niger
(Kelly y Hynes, EMBO J. 4:475-479, 1985).
Las células huésped adecuadas para la expresión
de polipéptido glucosilado se derivan de organismos multicelulares.
Dichas células huésped son capaces de actividades complejas de
procesamiento y de glucosilación. En principio, puede trabajarse con
cualquier cultivo celular de eucariotas superiores, de cultivo de
células de vertebrado o de invertebrado. Entre los ejemplos de
células de invertebrado se incluyen células vegetales y de insecto.
Se han identificado numerosas cepas y variantes baculovíricas de
huéspedes, tales como células huésped de Spodoptera
frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes
albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de
la fruta) y Bombyx mori (ver, por ejemplo, Luckow et
al., Bio/Technology 6:47-55, 1988; Miller et
al., en: Genetic Engineering, Set low. J.K. et al.,
editores, vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), páginas 277 a 279, y
Maeda et al., Nature 315:592-594, 1985). Se
encuentran disponibles para el público una diversidad de dichas
cepas víricas, por ejemplo la variante L-1 de
Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de
Bombyx mori NPV, y dichos virus pueden utilizarse como el
virus de la presente memoria según la presente invención,
particularmente para la transfección de células de Spodoptera
frugiperda. Pueden utilizarse como huéspedes cultivos de
células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y
tabaco. Típicamente, las células vegetales se transfectan mediante
incubación con determinadas cepas de la bacteria Agrobacterium
tumefaciens. Durante la incubación del cultivo de células
vegetales con A. tumefaciens, el ADN codificante del ligando
de ErbB se transfiere a la célula vegetal huésped de manera que
resulta transfectada y expresará, bajo condiciones apropiadas, ADN
de ligando de ErbB. Además, se encuentran disponibles secuencias
reguladoras y de señal compatibles con células vegetales, tales
como las secuencias de promotor de nopalina sintasa y de señal de
poliadenilación (Depicker et al., Mol. Appl. Gen. 1:561,
1982). Además, los segmentos de ADN aislados de la región corriente
arriba del gen 780 de ADN-T son capaces de activar o
incrementar los niveles de transcripción de genes expresables en
células vegetales en tejido vegetal que contiene ADN recombinante
(ver la patente EP nº 321.196, publicada el 21 de junio de
1989).
Sin embargo, el mayor interés se ha centrado en
las células de vertebrado y la propagación de células de vertebrado
en cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento
rutinario en los últimos años (Tissue Culture, Academic Press,
Kruse y Paterson, editores, 1973). Son ejemplos de líneas de células
huésped de mamífero, la línea CV1 renal de mono transformada por
SV40 (COS-7, ATCC nº CRL 1651), la línea renal
embrionaria humana (células 293 o 293 subclonadas para el
crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen.
Virol. 36:59, 1977), células renales de hámster neonato (BHK, ATCC
nº CCL 10), células ováricas de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y
Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980), células de
sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod.
23:243-251, 1980), células renales de mono (CV 1
ATCC nº CCL 70), células renales de mono verde africano
(VERO-76, ATCC nº CRL-1587), células
de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC nº CCL 2), células renales
caninas (MDCK, ATCC nº CCL 34), células hepáticas de rata búfalo
(BRL 3A, ATCC nº CRL 1442), células pulmonares humanas (W138, ATCC
nº CCL 75), células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065), tumor
mamario de ratón (MMT 060562, ATCC nº CCL51), células TRI (Mather
et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68,
1982), células MRC 5, células FS4 y una línea celular de hepatoma
humano (Hep G2). Las células huésped preferentes son células 293
renales embrionarias humanas y ováricas de hámster chino.
Las células huésped se transfectan y
preferentemente se transforman con los vectores de expresión o de
clonación anteriormente indicados de la presente invención y se
cultivan en medio nutritivo convencional modificado según resulte
apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o
amplificar los genes codificantes de las secuencias deseadas.
La transfección se refiere a la incorporación de
un vector de expresión por parte de una célula huésped, exprese de
hecho o no cualquier secuencia codificante. El experto ordinario en
la materia conoce numerosos procedimientos de transfección, por
ejemplo CaPO_{4} y electroporación. La transfección con éxito
generalmente se reconoce cuando se produce dentro de la célula
huésped cualquier indicación del funcionamiento de dicho
vector.
El término "transformación" se refiere a la
introducción de ADN en un organismo de manera que el ADN resulte
replicable, en forma de elemento extracromosómico o mediante
integración cromosómica. Dependiendo de la célula huésped
utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándar
apropiadas para dichas células. El tratamiento con calcio
utilizando cloruro de calcio, tal como se describe en la sección
1.82 de Sambrook et al., supra, generalmente se
utiliza para procariotas u otras células que contienen barreras de
pared celular sustanciales. Se utiliza la infección con
Agrobacterium tumefaciens para la transformación de
determinadas células vegetales, tal como se describe en Shaw et
al., Gene 23:315, 1983 y en la patente WO nº 89/05859,
publicada el 29 de junio de 1989. Para las células de mamífero sin
dichas paredes celulares, resulta preferente el procedimiento
descrito en las secciones 16.30-16.37 de Sambrook
et al., supra. Los aspectos generales de las
transformaciones de sistemas de células huésped de mamífero han
sido descritos por Axel en la patente US nº 4.399.216, publicada el
16 de agosto de 1983. Las transformaciones en levaduras típicamente
se llevan a cabo según el procedimiento de Van Solingen et
al., J. Bact. 130:946, 1977, y Hsiao et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. (USA) 76:3829, 1979. Sin embargo, también pueden
utilizarse otros procedimientos para introducir ADN en células,
tales como la inyección nuclear, la electroporación o la fusión de
protoplasto.
Las células procarióticas utilizadas para
producir el ligando de ErbB se cultivan en medios adecuados, tal
como se describe de manera general en Sambrook et al.,
supra.
Las células huésped de mamífero se utilizan para
producir el ligando de ErbB pueden cultivarse en una diversidad de
medios. Los medios disponibles comercialmente, tales como F10 de Ham
(Sigma), medio esencial mínimo 30 (MEM), Sigma),
RPMI-1640 (Sigma) y medio de Eagle modificado por
Dulbecco (DMEM), Sigma) resultan adecuados para cultivar las
células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y
Wallace, Meh. Enz. 58:44, 1979, Barnes y Sato, Anal. Biochem.
102:255, 1980, patente US nº 4.767.704, nº 4.657.866, nº 4.927.762
o nº 4.560.655, patentes WO nº 90/03430, nº 87/001956, patentes US
nº Re. 30.985, US nº 5.122.469, puede utilizarse como medio de
cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede
suplementarse según resulte necesario con hormonas y/o otros
factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor
de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro sódico,
calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES),
nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales
como el fármaco GENTAMYCIN), elementos traza (definidos como
compuestos inorgánicos habitualmente presentes a concentraciones
finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente
energética equivalente. También puede incluirse cualquier otro
suplemento necesario a concentraciones apropiadas que resultarían
conocidas para los expertos en la materia. Las condiciones de
cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son aquéllas
utilizadas anteriormente con la célula huésped seleccionada para la
expresión, y resultarán evidentes para el experto ordinario en la
materia.
Las células huésped a las que se hace referencia
en la presente exposición abarcan células en cultivo in
vitro, así como células que se encuentran dentro de un animal
huésped.
Se contempla adicionalmente que el ligando de
ErbB pueda producirse mediante recombinación homóloga, o mediante
procedimientos de producción recombinante utilizando elementos de
control introducidos en las células que ya contienen ADN
codificante del polipéptido actualmente utilizado en el campo. Por
ejemplo, se inserta un elemento promotor/intensificador potente, un
supresor o un elemento exógeno modulador de la transcripción en el
genoma de la célula huésped pretendida en proximidad y orientación
suficientes para influir sobre la transcripción del ADN codificante
del polipéptido deseado.
La amplificación y/o expresión génicas pueden
medirse en una muestra directamente, por ejemplo mediante
transferencia southern convencional, transferencia northern para
cuantificar la transcripción del ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 77:5201-5205, 1980), la transferencia por
puntos (análisis de ADN) o la hibridación in situ,
utilizando una sonda apropiadamente marcada basándose en las
secuencias proporcionadas en la presente invención. Pueden
utilizarse diversos marcajes, más comúnmente isótopos radioactivos,
particularmente ^{32}P. Sin embargo, también pueden utilizarse
otras técnicas, tales como la utilización de nucleótidos
modificados con biotina para la introducción en un polinucleótido. A
continuación, la biotina sirve como el sitio para la unión a
avidina o anticuerpos que pueden marcarse con una amplia diversidad
de marcajes, tales como radionucleidos, fluorescentes, enzimas o
similares. Alternativamente, pueden utilizarse anticuerpos que
pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN,
dúplex de ARN y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex
de ADN-proteína. Los anticuerpos, a su vez, pueden
marcarse y el ensayo puede llevarse a cabo en el sitio donde el
dúplex se encuentra unido a una superficie, de manera que, tras la
formación de dúplex sobre la superficie, pueda detectarse la
presencia de anticuerpo unido al dúplex.
Alternativamente, la expresión génica puede
medirse mediante procedimientos inmunológicos, tales como la
tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido y el ensayo de
cultivos celulares o de líquidos corporales, con el fin de
cuantificar directamente la expresión del producto génico. En las
técnicas de tinción inmunohistoquímica, se prepara una muestra
celular, típicamente mediante deshidratación y fijación, seguido de
la reacción con anticuerpos marcados específicos para el producto
génico acoplado en el sitio donde los marcajes habitualmente son
detectables visualmente, tales como los marcajes enzimáticos,
marcajes fluorescentes, marcajes luminiscentes y similares. Una
técnica de tinción particularmente sensible adecuada para la
utilización en la presente invención se describe en Hsu et
al., Am. J. Clin. Path. 75:734-738, 1980.
Los anticuerpos útiles para la tinción
inmunohistoquímica y/o el ensayo de muestras de líquidos pueden ser
monoclonales o policlonales, y pueden prepararse en cualquier
mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse
contra un ligando de ErbB nativo o contra un péptido sintético
basándose en las secuencias de ADN proporcionadas en la presente
invención, tal como se describe adicionalmente a continuación.
El ligando de ErbB puede recuperarse a partir de
una fracción de membrana celular. Alternativamente, se recupera del
medio de cultivo en forma de polipéptido soluble un fragmento o
subdominio soluble expresado que ha sido cortado proteolíticamente
o truncado. El polipéptido puede recuperarse de los lisados de
células huésped cuando se expresa directamente sin una señal
secretoria.
En el caso de que un ligando de ErbB se exprese
en una célula recombinante que no sea de origen humano, el ligando
de ErbB se encuentra completamente libre de proteínas o de
polipéptidos de origen humano. Sin embargo, resulta deseable
purificar ligando de ErbB a partir de proteínas o polipéptidos
celulares recombinantes con el fin de obtener preparaciones que
sean sustancialmente homogéneas respecto al ligando de ErbB. Como
primera etapa, se centrifuga el medio de cultivo o el lisado para
eliminar los residuos celulares particulados. A continuación, se
separan la membrana y las fracciones solubles de proteína.
Seguidamente puede purificarse ligando de ErbB a partir de la
fracción soluble de proteínas (requiriendo la presencia de una
proteasa) y a partir de la fracción de membrana del lisado de
cultivo, dependiendo de si el ligando de ErbB se encuentra unido a
membrana. Los procedimientos siguientes son ejemplares de
procedimientos de purificación adecuados: el fraccionamiento en
columnas de inmunoafinidad o de intercambio iónico, precipitación
con etanol, HPLC de fase reversa, cromatografía en sílice, sefarosa
con heparina o en una resina de intercambio catiónico, tal como
DEAE, cromatoenfoque, SDS-PAGE, precipitación con
sulfato amónico y filtración en gel utilizando, por ejemplo,
Sephadex G-75.
Las variantes de polipéptido en las que han sido
delecionados, insertados o sustituidos residuos se recuperan de la
misma manera que el polipéptido nativo, teniendo en cuenta cualquier
cambio sustancial de propiedades ocasionado por la variación. Por
ejemplo, la preparación de una fusión de ligando de ErbB con otra
proteína o polipéptido, por ejemplo un antígeno bacteriano o vírico,
facilita la purificación: para adsorber la fusión puede utilizarse
una columna de inmunoafinidad que contenga el anticuerpo contra el
antígeno. Pueden utilizarse columnas de inmunoafinidad, tales como
una columna de ligando anti-ErbB policlonal de
conejo, para adsorber variante de ligando de ErbB mediante la unión
de la misma a por lo menos un epítopo inmunológico remanente.
También puede resultar útil un inhibidor de proteasa, tal como el
fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), para inhibir la degradación
proteolítica durante la purificación, y pueden incluirse
antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes
accidentales. El experto en la materia apreciará que los
procedimientos de purificación adecuados para el polipéptido nativo
pueden requerir modificaciones para adaptarse a los cambios en el
carácter de las variantes o tras la expresión en cultivo celular
recombinante.
Las modificaciones covalentes de los ligandos de
ErbB se encuentran comprendidas dentro del alcance de la presente
invención. Tanto la secuencia nativa como las variantes de secuencia
de aminoácidos opcionalmente se modifican covalentemente. Un tipo
de modificación covalente comprendido dentro del alcance de la
presente invención es un fragmento de ligando de ErbB. Los
fragmentos de ligando de ErbB, tales como aquellos que presentan
hasta aproximadamente 40 residuos aminoácidos, se preparan
convenientemente mediante síntesis química o mediante corte
enzimático o químico del polipéptido ligando de ErbB de longitud
completa o el polipéptido variante de ligando de ErbB. Se
introducen en la molécula otros tipos de modificación covalente del
ligando de ErbB haciendo reaccionar los residuos aminoácidos diana
de los ligandos de ErbB con un agente derivatizante orgánico que
sea capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o
con los residuos N-terminales o
C-terminales.
Los residuos cisteinilo más comúnmente se hacen
reaccionar con \alpha-haloacetatos (y aminas
correspondientes), tales como el ácido cloroacético o la
cloroacetamida, proporcionando derivados carboximetilo o
carboxiamidometilo. Los residuos cisteinilo también se derivatizan
mediante reacción con bromotrifluoroacetona, ácido
\alpha-bromo-\beta-(5-imidozoil)propiónico,
fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas,
disulfuro de
3-nitro-2-piridilo,
disulfuro de metil 2-piridilo,
p-cloromercuribenzoato,
2-cloromercuri-4-nitrofenol
o
cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.
Los residuos histidilo se derivatizan mediante
reacción con dietilpirocarbonato a un pH comprendido entre 5,5 y
7,0 debido a que este agente es relativamente específico de la
cadena lateral histidilo. El bromuro de parabromofenacilo también
resulta útil: la reacción preferentemente se lleva a cabo en
cacodilato de sodio 0,1 M a pH 6,0.
Los residuos lisinilo y aminoterminales se hacen
reaccionar con anhídrido succínico u otros anhídridos de ácido
carboxílico. La derivatización con estos agentes presenta el efecto
de revertir la carga de los residuos lisinilos. Entre otros
reactivos adecuados para derivatizar residuos que contienen amino se
incluyen imidoésteres, tales como picolinimidato de metilo, fosfato
de piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, ácido
trinitrobencenosulfónico, O-metilisourea,
2,4-pentanodiona y reacción con glioxilato
catalizada por transaminasa.
Los residuos arginilo se modifican mediante
reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos
fenilglioxal, 2,3-butanodiona,
1,2-ciclohexanodiona y ninhidrina. La derivatización
de los residuos arginina requiere que la reacción se lleve a cabo
en condiciones alcalinas debido al elevado pK_{a} del grupo
funcional guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con
los grupos de lisina, así como el grupo amino épsilon de la
arginina.
La modificación específica de los residuos
tirosilo puede llevarse a cabo, con interés particular en la
introducción de marcajes espectrales en los residuos tirosilo
mediante reacción con compuestos diazonio aromático o
tetranitrometano. Más comúnmente, se utilizan
N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar
especies de O-acetil-tirosilo y
derivados 3-nitro, respectivamente. Los residuos
tirosilo se yoduran utilizando ^{125}I o ^{131}I para preparar
proteínas marcadas para la utilización en radioinmunoensayo,
resultando adecuado el procedimiento de la cloramina T descrito
anterior-
mente.
mente.
Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o
glutamilo) se modifican selectivamente mediante reacción con
carbodiimidas (R))-N=C=N-R)), en la
que R y R)) son grupos alquilo diferentes, tales como
1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)-carbodiimida
o
1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)-carbodiimida.
Además, los residuos aspartilo y glutamilo se convierten en
residuos asparaginilo y glutaminilo mediante reacción con iones
amonio.
La derivatización con agentes bifuncionales
resulta útil para entrecruzar ligando de ErbB con una matriz o
superficie de soporte insoluble en agua. Entre los agentes de
entrecruzamiento utilizados comúnmente se incluyen, por ejemplo,
1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano,
glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida,
por ejemplo ésteres con ácido 4-azidosalicílico,
imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres disuccinimidilo,
tales como 3.3.1-maleimidas
ditiobis(succinimidilpropionato) y bifuncionales, tales como
bis-N-maleimido-1.8-octano.
Los agentes derivatizantes, tales como propioimidato de
metil-3-((p-azidofenil)ditio)
rinden intermediarios fotoactivables que son capaces de formar
enlaces cruzados en presencia de luz. Alternativamente, para la
inmovilización de proteínas se utilizan matrices insolubles en agua
reactivas, tales como carbohidratos activados con bromuro de
cianógeno y los sustratos reactivos indicados en las patentes US nº
3.969.287, nº 3.691.016, nº 4.195.128, nº 4.247.642, nº 4.229.537 y
nº 4.330.440.
Los residuos glutaminilo y asparaginilo
frecuentemente se desamidan formando los residuos glutamilo y
aspartilo correspondientes, respectivamente. Alternativamente, estos
residuos se desamidan bajo condiciones levemente ácidas. Cualquiera
de las formas de estos residuos se encuentra comprendida dentro del
alcance de la presente invención.
Entre otras modificaciones se incluyen la
hidroxilación de prolina y de lisina, la fosforilación de grupos
hidroxilo de residuos serilo o treonilo, la metilación de los grupos
a-mino de las cadenas laterales de lisina, arginina
e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular
Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, páginas 79 a 86,
1983), la acetilación de la amina N-terminal y la
amidación de cualquier grupo carboxilo
C-terminal.
El ligando de ErbB opcionalmente se fusiona con
un polipéptido heterólogo respecto al ligando de ErbB. El
polipéptido heterólogo opcionalmente es una secuencia de anclaje,
tal como la que se encuentra en una proteína de cubierta fágica,
tal como las proteínas de los genes III y VIII del fago M13. Estos
polipéptidos heterólogos pueden acoplarse covalentemente a
polipéptido ligando de ErbB mediante cadenas laterales o mediante
los residuos terminales.
El ligando de ErbB también puede modificarse
covalentemente mediante la alteración de su patrón nativo de
glucosilación. Uno o más sustituyentes carbohidrato en estas
realizaciones se modifican mediante adición, eliminación o
variación de los componentes monosacárido en un sitio dado, o
mediante modificación de los residuos en el ligando de ErbB a
medida que dichos sitios de glucosilación se añaden o se
delecionan.
La glucosilación de polipéptidos típicamente es
N-ligada u O-ligada. El término
"N-ligado" se refiere a la unión del grupo
carbohidrato a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las
secuencias de tripéptido
asparagina-X-serina y
asparagina-X-treonina, en las que X
es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de
reconocimiento para la unión enzimática del grupo carbohidrato a la
cadena lateral asparagina. De esta manera, la presencia de
cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea
un potencial sitio de glucosilación. La glucosilación
O-ligada se refiere a la unión de uno de los
azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o
xilosa, a un ácido hidroxiamino, más comúnmente serina o treonina,
aunque también pueden utilizarse 5-hidroxiprolina o
5-hidroxilisina.
Se añaden sitios de glucosilación a ligando de
ErbB mediante alteración de su secuencia de aminoácidos para que
contenga una o más de las secuencias de tripéptido anteriormente
indicadas (para los sitios de glucosilación
N-ligadas). La alteración también puede realizarse
mediante la adición o la sustitución por uno o más residuos serina
o treonina en el ligando de ErbB (para los sitios de glucosilación
O-ligados). Para mayor facilidad, el ligando de
ErbB preferentemente se altera mediante cambios a nivel del ADN,
particularmente mediante la mutación del ADN codificante del
ligando de ErbB en bases preseleccionadas, de manera que se generen
codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.
El acoplamiento químico o enzimático de
glucósidos al ligando de ErbB incrementa el número de sustituyentes
carbohidrato. Estos procedimientos resultan ventajosos en el aspecto
de que no requieren la producción del polipéptido en una célula
huésped que sea capaz de glucosilación N-ligada u
O-ligada. Dependiendo del modo de acoplamiento
utilizado, el azúcar o azúcares pueden unirse a: (a) arginina e
histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo
libres, tales como aquellos de la cisteína, (d) grupos hidroxilo
libres, tales como aquellos de la serina, la treonina o la
hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos, tales como aquellos de la
fenilalanina, la tirosina o el triptófano, o (f) el grupo amida de
la glutamina. Estos procedimientos se describen en la patente WO nº
87/05330, publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y
Wriston (CRC Crit. Rev. Biochem., páginas 259 a 306, 1981).
Los grupos carbohidrato presentes en un ligando
de ErbB también se eliminan químicamente o enzimáticamente. La
desglucosilación química requiere la exposición del polipéptido al
compuesto ácido trifluorometanosulfónico o a un compuesto
equivalente. Este tratamiento resulta en el corte de la mayoría o de
la totalidad de los azúcares, excepto el azúcar ligante
(N-acetilglucosamina o
N-acetilgalactosamina), aunque dejando el
polipéptido intacto. La desglucosilación química se describe en
Hakimuddin et al. (Arch. Biochem. Biophys. 259:52, 1987) y
en Edge et al. (Anal. Biochem. 118:131, 1981). Los grupos
carbohidrato se eliminan del ligando de ErbB mediante una
diversidad de endoglucosidasas y exoglucosidasas mencionadas por
Thotakura et al. (Meth. Enzymol. 138:350, 1987).
La glucosilación también resulta suprimida por
la tunicamicina, tal como describen Duksin et al. (J. Biol.
Chem. 257:3105, 1982). La tunicamicina bloquea la formación de los
enlaces N-glucósido proteicos.
El ligando de ErbB también puede modificarse
uniendo el ligando de ErbB a diversos polímeros no proteicos, por
ejemplo polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de
la manera indicada en las patentes US nº 4.640.835, nº 4.496.689,
nº 4.301.144, nº 4.670.417, nº 4.791.192 o nº 4.179.337. Un modo
preferente de incrementar la vida media circulante in vivo
del ligando de ErbB no unido a membrana es conjugándolo a un
polímero que proporcione una vida media prolongada, tal como
polietilenglicol (PEG) (Maxfield et al., Polymer
16:505-509, 1975; Bailey, F.E. et al., en:
Non-ionic Surfactants (Schick, M.J., editor),
páginas 794-821, 1967; Abuchowski, A. et
al., J. Biol. Chem. 252:3582-3586, 1977;
Abuchowski, A. et al., Cancer Biochem. Biophys.
7:175-186, 1984; Katre, N.V. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. 84:1487-1491, 1987; Goodson, R.
et al., BioTechnology 8:343-346, 1990). La
conjugación a PEG también se ha informado que reduce la
inmunogenicidad y la toxicidad (Abuchowski, A. et al., J.
Biol. Chem. 252:3578-3581, 1977).
El ligando de ErbB también puede encapsularse en
microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante polimerización
interfacial (por ejemplo microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de
gelatina y microcápsulas poli-(metilmetacri-
lato), respectivamente), en sistemas coloidales de administración de fármaco (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se dan a conocer en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Oslo, A., editor, 1980.
lato), respectivamente), en sistemas coloidales de administración de fármaco (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se dan a conocer en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Oslo, A., editor, 1980.
Entre los anticuerpos contemplados para la
utilización en la presente invención se incluyen anticuerpos
policlonales, anticuerpos monoclonales y fragmentos de los mismos.
Preferentemente, los anticuerpos utilizados en los procedimientos
de la invención comprenden anticuerpos agonistas de receptor ErbB
que inducen o estimulan la proliferación de células precursoras
beta o células beta maduras, o que inducen o estimulan la
diferenciación de las células precursoras beta.
Los anticuerpos policlonales preferentemente se
cultivan en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas
(sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante (es decir, un
receptor ErbB) y un adyuvante. Puede resultar útil conjugar el
antígeno relevante a una proteína que es inmunogénica en las
especies que deben inmunizarse, por ejemplo la hemocianina de lapa
americana, albúmina sérica, tiroglobulina bovina o inhibidor
tripsina de soja utilizando un agente bifuncional o derivatizante,
por ejemplo éster de
maleimidobenzoil-sulfosuccinimida (conjugación
mediante residuos cisteína), N-hidroxisuccinimida
(mediante residuos lisina), glutaraldehído y anhídrido
succínico.
Los animales pueden inmunizarse contra el
antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados mediante la
combinación, pro ejemplo 100 g o 5 g de la proteína o conjugado
(para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de
adyuvante completo de Freund e inyectando la solución
intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes después, los animales
reciben un refuerzo con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de
péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante
inyección subcutáneas en múltiples sitios. Siete a 14 días después,
los animales se sangran y el suero se somete a ensayo para el título
de anticuerpos. Los animales reciben refuerzos hasta que el título
alcanza un valor de saturación. Preferentemente, el animal recibe
refuerzos con el conjugado del mismo antígeno, aunque conjugado con
una proteína diferente y/o mediante un reactivo de entrecruzamiento
diferente. Los conjugados también pueden prepararse en cultivo
celular recombinante en forma de fusiones de proteínas. Además,
convenientemente se utilizan agentes agregantes, tales como alúmina,
con el fin de incrementar la respuesta inmunológica.
Pueden prepararse anticuerpos monoclonales
utilizando el procedimiento de hibridoma descrito por primera vez
por Kohler et al., Nature 256:495, 1975, o pueden prepararse
mediante procedimientos de ADN recombinante (patente US nº
4.816.567).
En el procedimiento de hibridoma, se inmuniza un
ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster o mono
macaco, tal como se ha descrito anteriormente en la presente
memoria, para inducir que los linfocitos produzcan o sean capaces
de producir anticuerpos que se unan específicamente a la proteína
utilizada para la inmunización. Alternativamente, pueden
inmunizarse los linfocitos in vitro. A continuación, los
linfocitos se fusionan con células de mieloma utilizando un agente
de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una
célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and
Practice, páginas 59 a 103, Academic Press, 1986).
Las células de hibridoma preparadas de esta
manera se siembran y se cultivan en un medio de cultivo adecuado
que preferentemente contiene una o más sustancias que inhiben el
crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parentales
no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales
carecen del enzima hipoxantina guanina
fosforibosil-transferasa (HG-PRT o
HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá
hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que
previenen el crecimiento de las células deficientes en HGPRT.
Las células de mieloma preferentes son aquéllas
que se fusionan eficientemente, que soportan la producción estable
de alto nivel de anticuerpo por parte de las células productoras de
anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio, tal como el
medio HAT. Entre estas, las líneas celulares de mieloma preferentes
son las líneas de mieloma murino, tales como aquéllas derivadas de
los tumores de ratón MOP-21 y M.C.-11, disponibles
del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California,
USA, y las células SP-2 o
X63-AgB-653, disponible de la
American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA. Las
líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de
ratón-humano también han sido descritas para la
producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol.
133:3001, 1984; Brodeur et al., Monoclonal Antibody
Production Techniques and Applications, páginas 51 a 63 (Marcel
Dekker, Inc., New York, 1987).
El medio de cultivo en el que las células de
hibridoma crecen se somete a ensayo para la producción de
anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno.
Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos
monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina
mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in
vitro, tal como el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo de
inmunosorción ligado a enzima (ELISA).
La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal
puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard
de Munson et al., Anal. Biochem. 107:220, 1980.
Tras la identificación de las células de
hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad
y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse mediante
procedimientos de dilución limitante y se cultivan mediante
procedimientos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles
and Practice, páginas 59 a 103, Academic Press, 1986). Entre los
medios de cultivo adecuados para este fin se incluyen, por ejemplo,
medio D-MEM o RPMI-1640. Además,
las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo en forma
de tumores ascites en un animal.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los
subclones se separan convenientemente del medio de cultivo, líquido
ascites, o suero mediante procedimientos de purificación de
inmunoglobulina convencionales, tales como, por ejemplo, proteína
A-sefarosa, cromatografía de hidroxilapatito,
electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.
El ADN codificante de los anticuerpos
monoclonales se aísla con facilidad y se secuencia utilizando
procedimientos convencionales (por ejemplo mediante la utilización
de sondas oligonucleótidas que son capaces de unirse
específicamente a genes codificantes de las cadenas pesada y ligera
de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma sirven
como fuente preferente de dicho ADN. Tras el aislamiento, el ADN
puede introducirse en vectores de expresión, que seguidamente se
transfectan en células huésped, tales como células de E.
coli, células COS de simio, células ováricas de hámster chino
(CHO) o células de mieloma que no producen proteína
inmunoglobulina, con el fin de obtener la síntesis de anticuerpos
monoclonales en las células huésped recombinantes.
Las líneas celulares de hibridoma que producen
anticuerpos pueden identificarse mediante cribado de los
sobrenadantes de cultivo para anticuerpo que se une a uno o más
receptores ErbB. Esto se consigue rutinariamente mediante
inmunoensayos convencionales utilizando preparaciones de receptor
soluble o mediante FACS utilizando receptor unido a célula y
anticuerpo candidato marcado. Los anticuerpos agonistas de receptor
ErbB preferentemente son anticuerpos que activan la fosforilación
del receptor ErbB, que puede determinarse utilizando ensayos
conocidos de la técnica de fosforilación de tirosinas. Determinados
anticuerpos agonistas de uno o más receptores ErbB han sido
descritos anteriormente, por ejemplo por Yarden, Proc. Natl. Acad.
Sci. 87:2569-2573, 1990, y Defize et al.,
EMBO J. 5:1187-1192, 1986.
Las líneas celulares híbridas pueden mantenerse
en cultivo in vitro en medio de cultivo celular. Las líneas
celulares de la presente invención pueden seleccionarse y/o
mantenerse en una composición que comprende la línea celular
continua en medio de
hipoxantina-aminopterina-timidina
(HAT). De hecho, tras establecer la línea celular de hibridoma,
puede mantenerse en una diversidad de medios nutricionalmente
adecuados. Además, las líneas celulares híbridas pueden almacenarse
y conservarse en cualquiera de varias maneras convencionales,
incluyendo la congelación y el almacenamiento en nitrógeno líquido.
Las líneas celulares congeladas pueden revivirse y cultivarse
indefinidamente reanudando la síntesis y secreción de anticuerpo
monoclonal. El anticuerpo secretado se recupera del sobrenadante
del cultivo de tejidos mediante procedimientos convencionales, tales
como la precipitación, la cromatografía de intercambio iónico, la
cromatografía de afinidad o similar. Los anticuerpos indicados en
la presente invención también se recuperan de cultivos celulares de
hibridoma mediante procedimientos convencionales para la
purificación de IgG o IgM, según sea el caso utilizado hasta el
momento para purificar estas inmunoglobulinas a partir de plasma
agrupado, por ejemplo procedimientos de precipitación con etanol o
con polietilenglicol.
Pueden utilizarse anticuerpos humanos. Estos
anticuerpos pueden obtenerse mediante la utilización de hibridomas
humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer
Therapy, Alan R. Liss, página 77, 1985). Los anticuerpos quiméricos
(Cabilly et al., patente US nº 4.816.567, Morrison et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851, 1984; Neuberger et
al., Nature 312:604, 1984; Takeda et al., Nature 314:452,
1985) que contienen una región variable murina y una región
constante humana de actividad biológica apropiada (tal como la
capacidad de activar el complemento humano y de mediar en la ADCC)
se encuentran comprendidos dentro del alcance de la presente
invención, al igual que los anticuerpos humanizados producidos
mediante procedimientos convencionales de injertación de CDR
(Riechmann et al., Nature 332:333-327, 1988;
patente EP nº 0328404 A1; patente EP nº 02394000 A2).
Las técnicas para crear versiones de ADN
recombinante de regiones ligantes de antígeno de moléculas de
anticuerpo (fragmentos Fab o de regiones variables) que evitan la
generación de anticuerpos monoclonales también se encuentran
comprendidas dentro de la práctica de la presente invención. Una
técnica extrae moléculas de ARN mensajero específicas de anticuerpo
a partir de células del sistema inmunológico obtenidas de un sujeto
inmunizado, las transcribe en ADN complementario (ADNc) y clona el
ADNc en un sistema de expresión bacteriano y selecciona las
características de unión deseadas. El procedimiento de
Scripps/Stratagene utiliza un sistema de vector de bacteriófago
lambda que contiene una secuencia líder que causa que la proteína
Fab expresada migre al espacio periplásmico (entre la membrana
celular bacteriana y la pared celular) o que resulte secretada.
Pueden generarse y cribarse rápidamente un gran
número de fragmentos Fab funcionales con el fin de identificar
aquellos que se unen a los receptores con las características
deseadas. Alternativamente, los anticuerpos pueden prepararse
mediante las técnicas de expresión fágica descritas en Hoogenboom,
Tibtech febrero 1997 (vol. 15); Neri et al., Cell Biophysics
27:47-61, 1995; Winter et al., Annu. Rev.
Immunol. 12:433-55, 1994, y Sonderlind et
al., Immunol. Rev. 130:109-124, 1992, y las
referencias indicadas en las mismas, así como la técnica de
expresión fágica monovalente descrita en Lowman et al.,
Biochem. 30:10832-10838, 1991.
Los ligandos de receptor ErbB o anticuerpos
agonistas de receptor ErbB pueden utilizarse para inducir o
estimular la proliferación de células beta maduras o de células beta
precursoras. Los ligandos de receptor ErbB o anticuerpos agonistas
de receptor ErbB también pueden utilizarse para inducir o estimular
la diferenciación de las células beta precursoras. En particular,
se hace referencia a la utilización de ligandos de ErbB en los
procedimientos, posteriormente.
Entre los usos de la invención se incluyen usos
para el tratamiento de la disfunción pancreática en mamíferos. Un
procedimiento preferente es un procedimiento para tratar la
diabetes, e incluso más preferentemente, la diabetes de tipo I. Se
contempla que pueda administrarse un ligando de receptor ErbB en
forma de agente terapéutico único en el tratamiento del mamífero
que necesita dicho tratamiento. Alternativamente, puede
administrarse un ligando de ErbB en combinación con uno o más
ligandos de ErbB diferentes del primero. Por ejemplo, puede
administrarse en el mamífero una combinación de heregulina y
betacelulina. SE contempla además que los ligandos de receptor de
ErbB se administren en combinación con otras terapias o agentes
útiles para tratar la disfunción pancreática, o los síntomas
asociados con dicha disfunción pancreática, tales como insulina,
sulfonilurea, ciclosporina u otros agentes inmunosupresores
conocidos, tiozolidenodionas y metformina.
Pueden prepararse composiciones, tales como
formulaciones farmacéuticamente aceptables, para el almacenamiento
mediante la mezcla del ligando de receptor ErbB que presenta el
grado deseado de pureza con portadores, excipientes o
estabilizadores opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences,
supra). Los portadores, excipientes o estabilizadores
aceptables deben ser no tóxicos para los receptores a las dosis y
concentraciones utilizadas, e incluir tampones, tales como fosfato,
citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo el ácido
ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a
aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como la albúmina
sérica, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales
como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina,
glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos,
disacáridos, y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o
dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; alcoholes de azúcar,
tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal, tales
como sodio y/o surfactantes no iónicos, tales como TWEEN, PLURONICS
o polietilenglicol (PEG).
El ligando de receptor ErbB que debe utilizarse
para la administración in vivo debe ser estéril. Esto se
consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de
filtración estériles, previamente o posteriormente a la
liofilización y reconstitución. El ligando opcionalmente se almacena
en forma liofilizada o en solución.
Las composiciones terapéuticas que contienen el
ligando o ligandos de receptor ErbB generalmente se introducen en
un recipiente que presenta una abertura de acceso estéril, pro
ejemplo una bolsa o vial de solución intravenosa con un tapón
perforable con una aguja de inyección hipodérmica.
La vía de administración habitualmente será de
acuerdo con procedimientos conocidos, por ejemplo la inyección o
infusión mediante administración intravenosa, intraperitoneal,
intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial, aerosol
de polvos o líquido, o mediante medios de liberación sostenida, tal
como se indica posteriormente. El ligando de receptor ErbB
seleccionado puede administrarse continuamente mediante infusión o
mediante inyección de bolo. Se contempla que el ligando de receptor
ErbB se administre en el mamífero mediante una cánula, tal como
mediante la inserción de un dispositivo de cánula en el páncreas o
en tejido pancreático. El dispositivo de cánula también puede
utilizarse para administrar el ligando de receptor de ErbB en el
mamífero a través de la arteria celíaca. La utilización de un
dispositivo de cánula para la administración de agente terapéutico
es conocida de la técnica y puede conseguirse utilizando técnicas
conocidas por el experto en la materia.
Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de
liberación sostenida se incluyen matrices semipermeables de
polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el ligando de receptor
ErbB, matrices que se encuentra en la forma de productos
conformados, por ejemplo películas o microcápsulas. Entre los
ejemplos de matrices de liberación sostenida se incluyen
poliésteres, hidrogeles (por ejemplo
poli(2-hidroxietilmetacrilato), tal como
describen Langer et al., J. Biomed. Mater. Res.
15:167-277, 1981, y Langer, Chem. Tech.
12:98-105, 1982, o poli(alcohol vinílico),
poliláctidos (patentes US nº 3.773.919 y EP nº 58.481), copolímeros
de ácido L-glutámico y gamma
etil-L-glutamato (Sidman et
al., Biopolymers 22:547-556, 1983),
etileno-acetato de vinilo no degradable (Langer
et al., supra), copolímeros degradables de ácido
láctico-ácido glucólico, tales como LUPRON DEPOT (microesferas
inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido
glucólico y acetato de leuprólido) y ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico
(patente EP nº 133.988). Aunque polímeros tales como
etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido
glucólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100
días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante periodos de
tiempo más cortos. En el caso de que las proteínas encapsuladas
permanezcan en el cuerpo durante un tiempo prolongado, pueden
desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a
humedad a 37ºC, resultando en una pérdida de actividad biológica y
en posibles cambios de inmunogenicidad. Pueden diseñarse estrategias
racionales para la estabilización de proteínas dependiendo del
mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de
agregación es la formación de enlaces S-S
intermoleculares a través del intercambio de
tio-disulfuro, la estabilización puede conseguirse
mediante la modificación de los residuos sulfhidrilo, la
liofilización a partir de soluciones ácidas, el control del
contenido de humedad, la utilización de aditivos apropiados y el
desarrollo de composiciones de matriz de polímero específicas.
Entre las composiciones de liberación sostenida
también se incluye ligando de receptor ErbB atrapado en liposomas.
Pueden prepararse liposomas que contienen el ligando seleccionado
mediante procedimientos conocidos per se: patente DE nº
3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82:3688-3692, 1985; Hwang et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034, 1980; patentes EP
nº 52.322, EP nº 36.676, EP nº 88.046, EP nº 143.949, EP nº
142.641, solicitud de patente japonesa nº 83-118008;
patentes US nº 4.485.045 y nº 4.544.545 y EP nº 102.324.
Habitualmente los liposomas son del tipo unilamelar pequeño
(aproximadamente 200 a 800 angstroms) en el que el contenido de
lípidos es superior a aproximadamente 30 moles % colesterol,
ajustando la proporción seleccionada para optimizar la terapia. Los
liposomas con tiempo de circulación mejorado se dan a conocer en la
patente US nº 5.013.556.
La cantidad eficaz de ligando de ErbB que debe
utilizarse terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los
objetivos terapéuticos, de la vía de administración y de la
condición del paciente, por ejemplo de la severidad de la
disfunción pancreática. Puede resultar necesario para el terapeuta
titular la dosis y modificar la vía de administración según resulte
necesario para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosis
diaria típica puede encontrarse comprendida entre aproximadamente 1
\mug/kg y aproximadamente 1 mg/kg, y hasta 100 mg/kg o más,
dependiendo de los factores indicados anteriormente. Típicamente, el
médico clínico administrará el polipéptido o polipéptidos
seleccionados hasta alcanzar una dosis que consiga el efecto
deseado. La determinación de la dosificación y programación se
encuentra dentro de los conocimientos rutinarios de la técnica. Las
dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de las curvas de
dosis-respuesta derivadas de sistemas experimentales
in vitro o de modelos animales. El progreso de esta terapia
se monitoriza fácilmente mediante ensayos convencionales, por
ejemplo mediante ensayo de los niveles de péptido c, ensayo de
tolerancia a la glucosa o análisis sanguíneo de los niveles de
glucosa.
La invención también proporciona procedimientos
de tratamiento ex vivo de las células de mamífero utilizando
ligando de ErbB. Este tratamiento ex vivo puede resultar útil
para tratar, por ejemplo, las células precursoras beta en cultivo y
posteriormente trasplantar las células tratadas en un mamífero que
necesita dicho tratamiento utilizando técnicas de trasplante
apropiadas. Opcionalmente, el trasplante es un trasplante autólogo
en el que se extirpan las propias células del mamífero, se tratan en
cultivo con ligando de ErbB y después se trasplantan de vuelta en
el mismo mamífero.
En los procedimientos, pueden obtenerse de un
mamífero células o uno o más tejidos que contienen células beta
maduras o células precursoras beta (tal como mediante la realización
de un procedimiento quirúrgico o de biopsia) y preferentemente se
obtienen asépticamente. El número de células o la cantidad de tejido
necesaria para el cultivo in vitro pueden determinarse
empíricamente. A continuación, las células o tejidos se sitúan en
un plato o placa adecuado de cultivo celular o de tejidos y se
exponen a uno o más ligandos de ErbB. Típicamente el ligando de
ErbB se añade al cultivo celular a una concentración aproximada de
entre 0,1 y aproximadamente 100 nM, preferentemente de entre
aproximadamente 1 y 50 nM. Si se desea, las células pueden
cultivarse durante varias generaciones con el fin de expandir
suficientemente la población de células beta. Diversos medios de
cultivo celular conocidos de la técnica resultarán adecuados para el
cultivo in vitro, incluyendo F10 de Ham, MEM, RPMI 1640 y
DMEM. Estos medios se encuentran disponibles de Sigma (St. Louis,
MO) y de GIBCO (Gran Island, NY). Típicamente, el medio de cultivo
contiene componentes tales como carbohidratos (por ejemplo
glucosa), aminoácidos esenciales, vitaminas, ácidos grasos,
elementos traza y, opcionalmente, suero de una fuente mamífero. Las
condiciones de cultivo celular deben resultar adecuadas para
provocar la proliferación y/o diferenciación de las células
beta.
Las células o tejido o tejidos tratados pueden
formularse, si se desea, en un portador, tal como aquellos
indicados anteriormente. Las células o tejido o tejidos tratados
seguidamente pueden infusionarse o trasplantarse en un mamífero
receptor utilizando técnicas conocidas de la técnica. El mamífero
receptor puede ser el mismo individuo que el mamífero donador, o
puede ser otro mamífero heterólogo. La "cantidad eficaz" de las
células o tejido o tejidos tratados que deben trasplantarse en el
mamífero dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, de
la vía de administración y de la condición del paciente. Se
encuentra comprendido dentro de los conocimientos ordinarios del
practicante determinar la dosis de administración y modificar los
medios de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo.
Pueden administrarse dosis únicas o múltiples de las células o
tejido o tejidos tratados en el mamífero receptor. Puede resultar
deseable determinar intervalos de dosis aproximados in vitro
o en modelos animales, a partir de los cuales pueden extrapolarse
intervalos de dosis para pacientes humanos. En los procedimientos
en los que deben trasplantarse células o tejido o tejidos
heterólogos en el mamífero receptor, agentes inmunosupresores
conocidos de la técnica, tales como ciclosporina, también se
administran típicamente en el mamífero receptor.
Posteriormente al trasplante de las células
tratadas en el mamífero, se contempla que la administración
adicional o continuada de uno o más ligandos de ErbB en el mamífero
in vivo resulte útil para incrementar adicionalmente, por
ejemplo, la secreción de insulina por parte de las células beta.
Dicha administración adicional o continuada de ligando de ErbB
puede conseguirse utilizando las composiciones y procedimientos
descritos anteriormente.
Ejemplo
1
Se sometieron a ensayo cultivos primarios de
células pancreáticas fetales murinas con diversos ligandos de ErbB
y se examinó la expresión de diversos marcadores o de insulina.
Se diseccionaron páncreas de 14 embriones de
ratones CD1 (Charles River Laboratories). A continuación, los
páncreas se digirieron con 1,37 mg/ml de colagenasa/dispasa
(Boehringer Mannheim) en F12/DMEM (Gibco) a 37ºC durante 40 a 60
minutos. Tras la incubación, la digestión se neutralizó con un
volumen igual de BSA al 5% y después las células se lavaron una vez
con RPMI1640 (Gibco).
El día 1, las células se sembraron en placas de
cultivo de tejidos de 12 pocillos que habían sido prerecubiertas
con 20 microgramos/ml de laminina (Boehringer Mannheim) en PBS. Las
células de páncreas de 1-2 embriones se
distribuyeron en cada pocillo en medio de cultivo primario (RPMI1640
que contenía 10 microgramos/ml de insulina-rh
(Genentech, Inc.), 50 microgramos/ml de aprotinina, 60
microgramos/ml de extracto de pituitaria bovina (BPE)
(Pel-Freeze), 100 ng/ml de gentamicina, a 1:1.000 en
10 ml de PBS, 10 microgramos/ml de transferrina (Sigma), 10 ng/ml
de EGF (BRL), 10 microlitros de triyodotironina 5 x 10^{-9} M
(Sigma), 100 microlitros de etanolamina 10 nM (Sigma) y, a 1:1.000
y en 10 ml de EtOH 200 grados prueba, 2 microlitros de
hidrocortisona 1 nM (Sigma), 100 microlitros de progesterona 10 nM
(Sigma) y 500 microlitros de forscolina 1 micromolar (Calbiochem). A
continuación, los cultivos celulares se incubaron a 37ºC.
El día 2, se separó el medio de cultivo primario
y las células unidas se lavaron con RPMI1640. A continuación, se
añadieron dos ml de medio mínimo (RPMI1640 que contenía 10
microgramos/ml de transferrina, 1 microgramo/ml de insulina, 100
ng/ml de gentamicina, 50 microgramos/ml de aprotinina, 1
microgramo/ml de BPE), junto con los ligandos de receptor ErbB
siguientes (formas humanas recombinantes): EGF,
HG-EGF, TGF-alfa, anfiregulina,
beta-celulina y heregulina. El polipéptido
heregulina (Genentech, Inc.) consistía del dominio EGF únicamente
(HRG-beta 1 177-244). Los otros
ligandos consistían del polipéptido humano de longitud completa y se
adquirieron de R & D Systems. Los ligandos respectivos se
añadieron a los cultivos a cuatro concentraciones diferentes: 200
ng/ml, 100 ng/ml, 20 ng/ml y 4 ng/ml.
\newpage
El día 4, se extrajeron los medios de los
pocillos, se preparó ARNm de las células y se sometieron a ensayo
para el nivel de expresión de los marcadores identificados en la
figura 1. Los marcadores se describen adicionalmente en Edlung,
Diabetes 45:1817-1823, 1998, y en Bouwens, J.
Pathology 184:234-239, 1998, y las referencias
citadas en los mismos. Las lecturas de ARNm se utilizaron para
indicar los cambios en el número de células que expresaban los
diversos marcadores respecto al precursor o al fenotipo maduro. La
expresión de marcadores se analizó mediante PCR-RT
cuantitativa en tiempo real [Gibson et al., Genome Research
6:986-994, 1996]. Se determinó que un ligando de
ErbB era positivo si resultaba en un incremento de la expresión del
marcador relevante.
Se muestran los resultados en la figura 1. Tal
como se muestra, se determinó la expresión de los marcadores
siguientes: RPL19, NeuroD, Pax4, PDX-1, insulina,
glut2, GLK, Pax6, glucagón, ISL1, amilasa, somatostatina,
citoqueratina 19. Los resultados observados para cada uno de los
ligandos respectivos también se ilustran gráficamente en los
diagramas de columnas en las figuras 2 (HB-EGF), 3
(heregulina), 4 (anfiregulina), 5 (EGF), 6
(TGF-alfa) y 7 (betacelulina).
La totalidad de los ligandos de ErbB sometidos a
ensayo alteró la expresión de uno o más de los marcadores. La
totalidad de los ligandos excepto la heregulina produjo más de una
duplicación de la expresión de PDX-1 a lo largo de
una exposición de 48 horas al ligando. La totalidad de los ligandos
excepto la betacelulina produjo un incremento de más de dos veces
en la expresión de Pax4, y en la presencia de la todos excepto la
heregulina, se produjo un incremento de más de dos veces en la
expresión de insulina. Ninguno de los ligandos sometidos a ensayo
incrementó la expresión de amilasa, y la anfiregulina, el EGF y el
TGF-alfa de hecho redujeron el nivel de expresión
del marcador amilasa.
Ejemplo
2
Se crearon ratones heterocigóticos (+/-) para
heregulina, ErbB2 o ErbB3 mediante técnicas de manipulación
dirigida de genes, resultando en la pérdida de una copia génica
funcional y una reducción asociada de la proteína diana. A
continuación, se examinó la actividad in vivo de la
heregulina en las líneas de ratón heterocigótico y en ratones de
tipo salvaje (gestantes y no gestantes).
Los ratones quiméricos se generaron mediante
direccionamiento génico, descrito en Erickson et al.,
Development 124:4999-5011, 1997. Los ratones se
aparearon con cepas de ratón C57BL/6J y Balb/C sin observar
diferencias en la respuesta de heregulina sobre el nivel de fondo de
la cepa o del retrocruzamiento. Se trataron ratones de 8 a 12
semanas de edad de cada genotipo, con un peso medio de 20 g cada
uno, con una administración sistémica sostenida durante 14 días de
heregulina-beta 1 humana recombinante (aminoácidos
177 a 244) utilizando bombas ALZA [Holmes et al., Science
256:1205-1210, 1992]. Los grupos genotípicos que
recibían la heregulina consistían de 6 hembras y 6 machos cada uno.
Los grupos de control de cada genotipo (2 hembras y 3 machos)
recibieron PBS (Gibco). Se llenaron bombas miniosmóticas ALZA
(modelo 2002; tasa de bombeo: 0,5 microlitros/hora; duración: 14
días; volumen del reservorio: 200 microlitros) siguiendo las
instrucciones del fabricante, diluyendo la heregulina en PBS y las
dosis se administraron a los animales a una dosis de 0,75 mg/kg/día
o 1,0 mg/kg/día. Las bombas se almacenaron a 4ºC durante la noche
en PBS previamente a la implantación estéril. Los animales se
anestesiaron con quetamina, 75 a 80 mg/kg, xilazina, 7,5 a 15 mg/kg
y acepromazina, 0,75 mg/kg, administrados intraperitonealmente. La
bomba llena, con el portal de administración en primer lugar, se
insertó en un bolsillo subcutáneo a lo largo de la espalda. Los
animales se alojaron individualmente y se observaron diariamente.
Cualquier animal moribundo se sacrificó inmediatamente y se le
realizó una necropsia.
Los animales supervivientes se sacrificaron y se
les realizó una necropsia el día 14. Se fijó el tejido de los
órganos en formalina tamponada neutra al 10% a temperatura ambiente
durante la noche seguido de almacenamiento en etanol al 70%. Para
la inclusión en parafina, los tejidos se deshidrataron a través de
una serie gradada de alcoholes, seguido de salicilato de metilo e
infiltración durante la noche en Paraplast a 57ºC. Se cortaron
secciones seriadas de 6 micrómetros y se fijaron a portaobjetos
recubiertos con polilisina previamente a la tinción de
hematoxilina/eosina y el análisis histológico.
La tolerancia al tratamiento de heregulina
variaba dependiendo del genotipo. La mortalidad difería entre los
genotipos (p<0.001), presentando los grupos animales heregulina
(+/-) la mortalidad más elevada (12/12=100%), los grupos animales
ErbB2 y ErbB3 (+/-) la mortalidad más baja (1/12=8%) y presentando
el grupo de tipo salvaje una mortalidad intermedia (7/12=58%). No
se observó diferencia aparente de mortalidad según sexo. Tanto los
animales de tipo salvaje como heregulina (+/-) que recibieron
tratamiento de heregulina mostraron lagrimeo, deshidratación,
encorvamiento, pelaje alborotado, una temperatura corporal reducida
y eran notablemente hipoactivos. Los animales de tipo salvaje y los
heregulina (+/-) aparentemente también presentaban regiones
abdominales agrandadas. Los animales de control que recibían PBS
sobrevivieron el periodo completo de 14 días sin signos
clínicos.
El páncreas presentaba una apariencia bastante
normal en los ratones tratados no supervivientes de tipo salvaje y
heregulina (+/-) en la necropsia, con ectasia ductal limitada e
hiperplasia mínima, reflejando probablemente el corto tiempo de
exposición de los animales a la heregulina administrada (5 a 6 días)
(ver las figuras 8(b) y 8(c)). En contraste, en los
animales ErbB2 y ErbB3 (+/-) que recibieron tratamiento durante el
periodo completo de 14 días, se produjo una hiperplasia ductal y
proliferación pronunciadas en los conductos pancreáticos
principales en la necropsia, con presencia de células inflamatorias
en el lumen de los conductos (ver las figuras 8(d) y
8(e)). El daño a las células acinares no era generalizado,
aunque los niveles de amilasa se encontraban incrementados en
muchos animales.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente lista de referencias citada por el
solicitud se proporciona únicamente para comodidad del lector. No
forma parte del documento de patente europea. Aunque se tenido gran
cuidado durante la compilación de las referencias, no pueden
excluirse que se hayan producido errores u omisiones y la EPO se
exime de toda responsabilidad a este respecto.
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Claims (12)
1. Utilización de heregulina en la preparación
de un medicamento para tratar la disfunción pancreática en un
mamífero, mediante la inducción o estimulación de la diferenciación
o proliferación de las células precursoras beta o la proliferación
de las células beta maduras.
2. Utilización según la reivindicación 1, en la
que el medicamento es para tratar la diabetes en un mamífero.
3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en
la que dicha heregulina está destinada a la administración en
combinación con betacelulina.
4. Utilización según la reivindicación 2, en la
que dicha diabetes es la diabetes de tipo I.
5. Utilización según la reivindicación 2, en la
que dicho medicamento se formula para la administración en dicho
mamífero utilizando una cánula.
6. Procedimiento de preparación de un
medicamento para tratar la disfunción pancreática, que comprende las
etapas de exponer, in vitro, células beta maduras o células
precursoras beta de un mamífero donador a una cantidad eficaz de
heregulina con el fin de inducir o estimular la diferenciación o la
proliferación de dichas células precursoras beta o la proliferación
de dichas células beta maduras y posteriormente formular dichas
células beta maduras o células precursoras beta para la
administración en un mamífero receptor in vivo.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en
el que dicho mamífero donador y dicho mamífero receptor son el
mismo mamífero.
8. Procedimiento según la reivindicación 6, en
el que dicho mamífero donador y dicho mamífero receptor son
mamíferos diferentes.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que dichas células beta maduras o dichas células precursoras
beta se formulan para la administración en combinación con un agente
inmunosupresor.
10. Procedimiento para estimular o inducir la
proliferación de células precursoras beta o células beta maduras,
in vitro, que comprende exponer dichas células precursoras
beta o dichas células beta maduras a una cantidad eficaz de
heregulina.
11. Procedimiento para estimular o inducir la
diferenciación de células precursoras beta en células beta maduras,
in vitro, que comprende exponer dichas células precursoras
beta a una cantidad eficaz de heregulina.
12. Composición que comprende una cantidad
eficaz de heregulina y de betacelulina, y un portador
farmacéuticamente aceptable.
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