ES2305100T3 - Tarjeta de reaccion y uso de tal tarjeta. - Google Patents
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Abstract
Tarjeta (1) de reacción constituida por un cuerpo, que tiene una cara (62) delantera y una cara (63) trasera delimitadas por un reborde (68), por al menos una entrada (2, 3, 4 y/o 5) y por al menos una salida (7 y/u 8), una (2, 3, 4 y/o 5) unida a la otra (7 y/u 8) por una red de canales (64) que constituyen al menos una vía de reacción para al menos un fluido (70, 71 y/o 72), estando el o los fluidos (70, 71 y/o 72) dirigidos en el interior de la tarjeta (1) mediante válvulas (11 a 35 y/o 61); cada válvula (11 a 35 ó 61) está constituida por una película (67) flexible, que puede deformarse para permitir el paso de un fluido o que actúa conjuntamente con un medio (75) de compresión para impedir el paso del fluido, estando la película (67) fijada sobre la cara (63) trasera de dicha tarjeta (1) al nivel de una hendidura (74) periférico del conjunto de los canales relacionados con la válvula (11 a 35 ó 61); la tarjeta (1) comprende canales (64) que afloran sobre al menos una de sus caras (62 y/o 63), siendo los canales (64) de dos secciones diferentes, una sección pequeña para la transferencia del fluido o de los fluidos (70, 71 y/o 72) y una sección grande que actúa como compartimiento de reacción; cada cara (62) delantera o trasera (63) está delimitada por al menos una película (48, 49, 65, 66 y/o 67).
Description
Tarjeta de reacción y uso de tal tarjeta.
La presente invención se refiere a una tarjeta
de reacción para llevar a cabo reacciones químicas y/o biológicas.
Se refiere igualmente al uso de tal tarjeta para purificar y
amplificar ácidos nucleicos y detectarlos.
El estado de la técnica está constituido por el
documento US-A-4.585.623 que tiene
como objeto un aparato para realizar rápidamente en un sitio único
ensayos químicos o inmunoquímicos. Este aparato comprende un cuerpo
de plástico moldeado que puede ser miniaturizado, y que presenta
varios tubos que contienen reactivos, un tubo que contiene la
muestra y un tubo de tamaño más pequeño que recibe la reacción.
Estando cada tubo asociado a un pistón, es posible insertar el
aparato en un autómata programable.
Este aparato es relativamente voluminoso aunque
la miniaturización sea posible, porque hay que prever la posición
de dicho aparato así como de las diferentes bielas que van a
permitir accionar los pistones. Además, sólo es posible efectuar
una sola reacción con tal aparato, si deben realizarse varias
reacciones, habrá que prever varios aparatos e igualmente tiempo
para cargar éstos con los reactivos y muestras adecuados.
El documento WO A-97/27324 se
refiere a una cajita para llevar a cabo varias reacciones en
paralelo que comprende una abertura de entrada y una abertura de
salida para la transferencia de la o de las muestras que van a
introducirse en la cajita. Algunas zonas de la cajita son de
construcción particular (cámara de Bursapak, válvula de pistón,
válvula de bola), permiten, bajo la acción de una fuerza interior o
exterior continua, mantener un canal abierto o cerrado. Las
cámaras de Bursapak se asocian a veces a filtros hidrófobos que
permiten bloquear la progresión de un líquido.
No obstante, esta construcción comprende un
inconveniente importante que radica en la estructura de las
válvulas de las cámaras de Bursapak. Estas comprenden todas
películas que tienen que preformarse previamente a su montaje sobre
la tarjeta de reacción. Este preformado permite mantener cada
cámara de Bursapak cerrada en posición de reposo (figuras 2A y 2B).
La abertura de esta cámara es posible bajo una acción interior
(figura 2C), como por ejemplo un aumento de la presión de un fluido
contenido en la tarjeta de reacción, o bajo una acción exterior
(figuras 2D y 2E), como por ejemplo un aumento de la presión debida
a la presión de un pistón u otros contra la película preformada.
Por tanto este preformado de cada película debe realizarse, antes
de su colocación sobre dicha tarjeta de reacción. El coste de
fabricación, de almacenamiento y de transporte de tales películas
es claramente más importante que para películas que permanecen
planas. Además, esto no facilita tampoco la fabricación, el
almacenamiento y el transporte de las tarjetas de reacción así
dotadas. Finalmente, las formas convexas de estas películas pueden
dañarse más fácilmente, lo que puede acarrear escapes o errores en
el uso posterior de dichas tarjetas.
El documento
WO-A-97/02357 describe un aparato de
diagnóstico de ácidos nucleicos que se parece a la cajita
anterior, en cuanto a la complejidad. Así, la figura 2b presenta
una válvula constituida por numerosos componentes.
Por tanto este aparato tiene sensiblemente los
mismos inconvenientes que el documento
WO-A-97/27324.
La solicitud de patente
WO-A-99/33559 propone un cartucho o
tarjeta de separación de un constituyente particular, tal como
ácidos nucleicos, presente en una muestra. Para esto, comprende
cierto número de compartimientos y de canales. Estos
compartimientos contienen desde el principio el conjunto de los
líquidos (líquido de elución, líquido de lavado por ejemplo) que va
a usarse. El control de los movimientos de fluidos se realiza
mediante válvulas dispuestas irregularmente en el interior de la
tarjeta, y mediante sensores de la presencia de fluidos. Estas
válvulas funcionan como diodos fluídicos, que dejan que un líquido
fluya en un sentido pero no en el sentido opuesto. Utilizan para
esto discos magnéticos que pueden desplazarse desde el exterior.
Los sensores están unidos eléctricamente hacia el exterior o a un
microprocesador interno en la tarjeta.
Este tipo de tarjeta es particularmente complejo
ya que el cuerpo de esta tarjeta está de hecho constituido por un
sándwich de varios elementos superpuestos, véase a este respecto
los diodos fluídicos. Además conviene garantizar la estanquidad
entre estos diversos elementos superpuestos. La tarjeta incorpora
además de los sensores, hilos eléctricos, diodos fluídicos, que
funcionan con imanes, e incluso un microprocesador. Por tanto el
coste de fabricación es prohibitivo, y todos estos constituyentes
eléctricos, magnéticos pueden tener una influencia sobre el
funcionamiento interno de dicha tarjeta. Por tanto tal tarjeta no
está muy adaptada a una tecnología basada en la microfluídica. La
presencia de líquidos en el interior de la tarjeta necesita un
almacenamiento limitado en el tiempo o la introducción de estos
líquidos por un manipulador experto. Por tanto la flexibilidad de
uso resulta bastante limitada.
Según la presente invención, se propone una
tarjeta de reacción que responde al conjunto de estos problemas.
Tal tarjeta propone el análisis biológico, de uno o de varios
ligandos, necesitando para su detección y/o su cuantificación, el
uso de uno o varios antiligandos. Un ejemplo de aplicación de las
técnicas de análisis se refiere a los inmunoensayos, sea cual sea
su formato, mediante análisis directo o mediante competición. Otro
ejemplo de aplicación se refiere a la detección y/o la
cuantificación de ácidos nucleicos que comprende el conjunto de las
operaciones necesarias para esta detección y/o para esta
cuantificación a partir de una extracción cualquiera que contiene
los ácidos nucleicos diana. Entre estas diferentes operaciones,
puede citarse la lisis, la fluidificación, la concentración, la
purificación, las etapas de amplificación enzimática de los ácidos
nucleicos, las etapas de detección que incorporan una etapa de
hibridación que usa por ejemplo una chip de ADN o una sonda
marcada. La solicitud de patente
WO-A-97/02357 o la solicitud de
patente presentada por el solicitante, con el número FR99/00111,
explicita diferentes etapas necesarias en el caso de ácidos
nucleicos.
El estado de la técnica más próximo se describe
en el documento WO0013795, que se refiere a una tarjeta de análisis
adaptada a una tecnología basada en la microfluídica que menciona
las siguientes características de la reivindicación independiente
1: la tarjeta de reacción está constituida por un cuerpo, que tiene
una cara delantera y una cara trasera delimitadas por un reborde,
por al menos una entrada y por al menos una salida, unidas entre sí
por una red de canales que constituyen al menos una vía de reacción
para al menos un fluido, estando dirigidos el o los fluidos en el
interior de la tarjeta mediante válvulas; la tarjeta comprende
canales que afloran sobre al menos una de sus caras, siendo los
canales de dos secciones diferentes, una sección pequeña para la
transferencia del fluido o de los fluidos y una sección grande que
actúa de compartimiento de reacción.
La diferencia entre el objeto de la
reivindicación independiente 1 y el estado de la técnica según D1
radica en que: cada válvula está constituida por una película
flexible, que puede deformarse para permitir el paso de un fluido o
que actúa conjuntamente con un medio de compresión para impedir el
paso del fluido, estando fijada la película sobre la cara trasera
de dicha tarjeta al nivel de una hendidura periférico del conjunto
de los canales relacionados con la válvula; cada cara delantera o
trasera está delimitada por al menos una película.
Con ese fin, la presente invención se refiere a
una tarjeta de reacción según las características de la
reivindica-
ción 1.
ción 1.
Según un modo particular de realización, el
cuerpo de la tarjeta es monobloque y el medio de compresión se
añade y es solidario de dicha tarjeta, o constituye una parte de un
aparato que permite la puesta en práctica de la tarjeta. Según un
modo particular de realización, la relación entre la sección
pequeña y la sección grande de los canales está comprendida entre l
a 1,01 y 1 a 10, preferiblemente entre l a 1,01 y 1 a 3.
Todavía según un modo particular de realización,
los canales afloran total o parcialmente al nivel de la cara
delantera de la tarjeta y las válvulas están presentes al nivel de
la cara trasera de dicha tarjeta.
Según aún un modo particular de realización, la
cara delantera de la tarjeta comprende una sola película al nivel
de todos los canales que afloran en esta cara, y la cara trasera de
dicha tarjeta comprende:
- al menos una película flexible al nivel de las
válvulas,
- al menos un filtro hidrófobo, y
eventualmente
- al menos una película al nivel de los canales
que afloran al nivel de la cara trasera.
\vskip1.000000\baselineskip
Según un modo particular de realización, el o
las películas flexibles y el o las películas constituyen una sola
y misma película.
Según otro modo particular de realización,
cuando la tarjeta tiene la forma sensiblemente de un
paralelepípedo, los canales están, total o parcialmente,
circunscritos en la parte mediana de la tarjeta, los filtros de
retención, que son hidrófobos, están circunscritos al nivel de al
menos uno de los lados de dicha tarjeta, y las válvulas están
posicionadas entre los canales y los filtros de retención.
En este último modo de realización y
preferiblemente, el reborde comprende el conjunto de las entradas y
salidas de fluidos de la tarjeta.
En el caso de que la tarjeta tenga forma
sensiblemente de paralelepípedo, la o las entradas están presentes
sobre uno de los lados que constituyen el reborde, mientras que la
o las salidas están presentes sobre otro lado de este reborde.
En este último caso y preferiblemente, la o las
entradas están presentes sobre un lado opuesto al lado donde están
presentes la o las salidas.
En el caso de que la tarjeta tenga forma
sensiblemente de paralelepípedo rectángulo, la o las entradas y la
o las salidas están presentes sobre los dos lados pequeños que
constituyen el reborde.
La presente invención se refiere igualmente al
uso de una tarjeta de reacción, tal como se define en la
reivindica-
ción 12.
ción 12.
La presente invención se refiere igualmente al
uso de una tarjeta de reacción, tal como se ha definido
anteriormente, para probar una disolución biológica, eventualmente
tratada previamente con el fin de liberar los ácidos nucleicos, se
efectúan las diferentes etapas biológicas en el siguiente
orden:
- -
- captura de los ácidos nucleicos,
- -
- recogida de los ácidos nucleicos capturados en una disolución de elución,
- -
- mezcla de los ácidos nucleicos recogidos con los constituyentes estructurales y funcionales que permite la amplificación de estos ácidos nucleicos, y
- -
- detección cualitativa y/o cuantitativa de los productos de amplificación.
Eventualmente, se efectúa una última etapa que
consiste en analizar estos ligandos o estos productos de
amplificación, o bien en un nuevo emplazamiento en el interior de la
tarjeta, o bien después de la transmisión hacia otro dispositivo.
Según una variante particular del uso, los ligandos o ácidos
nucleicos capturados se someten a al menos un líquido de lavado
previamente a su recogida.
Según otra variante de uso, la captura y
eventualmente el lavado se efectúan N veces sucesivamente, estando
comprendido N entre 1 y 10.
Según aún otra variante particular del uso, se
detecta un tratamiento de los ligandos o una amplificación de los
ácidos nucleicos previamente a la transmisión hacia un
compartimiento de la tarjeta o hacia otro dispositivo que permite
analizar los ligandos o los amplicones.
Preferiblemente, para todas las variantes de uso
anteriormente mencionadas, la tarjeta se usa después de un aparato
que permite tratar una disolución que ha de probarse, tal como un
aparato para lisar células biológicas y liberar los ligandos, tales
como ácidos nucleicos, y antes de un aparato que permite analizar
la presencia de estos ligandos, tal como un chip de ADN.
Estructuralmente, la tarjeta según la invención
se inserta entre dos aparatos que pueden estar constituidos
igualmente por tarjetas, una aguas arriba que efectúa un
pretratamiento de la disolución que ha de probarse, la otra aguas
abajo que efectúa un postratamiento de la disolución que ha de
probarse ya tratada.
Las figuras adjuntas se dan a titulo de ejemplo
explicativo y no tienen ningún carácter limitativo. Permitirán
comprender mejor la invención.
La figura 1 representa una vista desde la cara
delantera de una tarjeta de reacción según un primer modo de
realización de la presente invención.
La figura 2 representa una vista idéntica pero
parcial de la figura 1, cuando el procedimiento de uso de la
tarjeta está en curso de funcionamiento, habiendo recibido dicha
tarjeta la disolución que ha de probarse.
La figura 3 representa una vista idéntica a la
figura 2, cuando el procedimiento de uso de la tarjeta está en
curso de funcionamiento, habiendo sido objeto dicha tarjeta de una
U purga que permite dosificar de manera precisa el volumen de
disolución que ha de probarse.
La figura 4 representa una vista idéntica pero
parcial de la figura 1, cuando el procedimiento de uso de la
tarjeta está en curso de funcionamiento, siendo transferida la
disolución que ha de probarse del compartimiento de dosificación de
la disolución hacia la parte aguas arriba del compartimiento de
separación.
La figura 5 representa una vista idéntica a las
figuras 2 y 3, cuando el procedimiento de uso de la tarjeta está en
curso de funcionamiento, habiendo recibido dicha tarjeta el
líquido de elución.
La figura 6 representa una vista idéntica a las
figuras 2, 3 y 5, cuando el procedimiento de uso de la tarjeta está
en curso de funcionamiento, habiendo sido objeto dicha tarjeta de
una purga que permite dosificar de manera precisa el volumen de
líquido de elución.
La figura 7 representa una vista idéntica pero
parcial de la figura 1, cuando el procedimiento de uso de la
tarjeta está en curso de funcionamiento, estando el líquido de
elución en el compartimiento de separación y permitiendo la
recogida de los ácidos nucleicos.
La figura 8 representa una vista idéntica pero
parcial de la figura 1, cuando el procedimiento de uso de la
tarjeta está en curso de funcionamiento, transfiriéndose el líquido
de elución, que contiene los ácidos nucleicos, al compartimiento
de recogida de los constituyentes estructurales que permiten
realizar una amplificación.
La figura 9 representa una vista idéntica a la
figura 8, transfiriéndose el líquido de elución, que contiene los
ácidos nucleicos y los constituyentes estructurales, al
compartimiento de recogida de los constituyentes funcionales que
permiten realizar una amplificación.
La figura 10 representa una vista idéntica a las
figuras 8 y 9, transfiriéndose en parte el líquido de elución, que
contiene los ácidos nucleicos y los constituyentes estructurales y
funcionales, al compartimiento de muestreo con vistas a la etapa
representada en la figura 12.
La figura 11 representa una vista idéntica a las
figuras 8 a 10, transfiriéndose el líquido de elución, que
contiene los ácidos nucleicos y los constituyentes estructurales y
funcionales y que no se ha transferido al compartimiento de
muestreo, al compartimiento de convergencia, con vistas a su salida
hacia el exterior.
La figura 12 representa una vista idéntica a las
figuras 8 a 11, el líquido de elución, que está presente en el
compartimiento de muestreo, se transfiere al compartimiento de
detección y de lectura.
La figura 13 representa una vista en corte según
A-A de la figura 3.
La figura 14 representa una vista desde la cara
delantera de una tarjeta de reacción según un segundo modo de
realización de la presente invención.
La figura 15 representa una vista en perspectiva
de varias válvulas asociadas a la tarjeta de reacción.
Finalmente, la figura 16 representa una vista en
corte según B-B de la figura 15.
Por ligando, se entiende cualquier especie
biológica que puede ser de naturaleza proteica o ácido nucleico,
como por ejemplo un antígeno, un fragmento de antígeno, un
anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un hapteno, un ácido
nucleico, un fragmento de ácido nucleico, una hormona, una
vitamina, un péptido o un polipéptido.
Un ejemplo de pretratamiento, puede estar
constituido por una lisis celular, tal como se describe en las
solicitudes de patente del solicitante:
- FR99/04289, presentada el 1 de abril de 1999,
sobre la lisis por sonicación,
- PCT/FR99/01309, presentada bajo prioridad del
23 de julio de 1998, sobre la lisis mixta magnética y mecánica,
- PCT/FR99/00830, presentada bajo prioridad del
10 de abril de 1998, sobre la lisis eléctrica, y
- PCT/IB98/01475, presentada bajo prioridad del
23 de septiembre de 1997, sobre la lisis mecánica.
Un ejemplo de postratamiento, puede estar
constituido por una detección por medio de un biochip. Por biochip,
se entiende cualquier soporte sólido sobre el cual están fijados
ligandos, y en particular por un chip de ADN, se entiende cualquier
soporte sólido sobre el cual están fijados ácidos nucleicos. El
método de fijación de los ligandos puede realizarse de diferentes
maneras y especialmente mediante adsorción o covalencia como por
ejemplo la síntesis in situ mediante las técnicas de
fotolitografía o mediante un sistema piezoeléctrico, mediante
deposición capilar de ligandos preformados. A título de
ilustración, ejemplos de estos biochips aplicados a los chips de
ADN se dan en las publicaciones de G. Ramsay, Nature Biotechnology,
16, p 40-44, 1998; F. Ginot, Human Mutation, 10, p
1-10, 1997; J. Cheng et al, Molecular
diagnosis, 1(3), p 183-200, 1996; T. Livache
et al, Nucleic Acids Research, 22(15), p
2915-2921, 1994; J. Cheng et al, Nature
Biotechnology, 16, p 541-546, 1998 o en las
patentes US 4981783 (Augenlicht), US 5700637 (Southern), US 5445934
(Fodor), US 5744305 (Fodor), US 5807522 (Brown).
A constituyentes estructurales que permiten la
amplificación cuando se asocian a los constituyentes funcionales
definidos a continuación, cabe dar la siguiente definición:
nucleótidos (desoxirribonucleótidos dNTP y/o ribonucleótidos NTP),
al menos un par de cebadores que encuadran regiones específicas que
se desea amplificar, iones (por ejemplo MgCl_{2}, KC1) y un
tampón (tal como el Tris).
Los constituyentes funcionales están formados
por al menos una enzima, preferiblemente por dos o tres enzimas, en
presencia de un tampón, tal como Tris de pH 7,5, sales e iones que
permiten la reacción de amplificación cuando se asocian a los
constituyentes estructurales definidos anteriormente.
Por amplicones, hay que comprender productos de
una reacción de amplificación enzimática.
La presente invención se refiere a una tarjeta 1
de reacción representada en un primer modo de realización en la
figura 1. Esta tarjeta 1 de reacción está constituida por un
paralelepípedo rectángulo que comprende una cara 62 delantera y una
cara 63 trasera unidas entre sí, por un reborde, igualmente
denominado canto 68. En esta figura se representa por tanto en
trazos continuos, el conjunto de los elementos que constituye la
cara 62 delantera. Se observa entre otras cosas, cierto número de
canales 64 que desembocan al nivel de esta cara 62. Estos canales
64 son tabicados mediante una película 65 transparente, pegada
sobre dicha cara 62 delantera. No obstante, no es obligatorio que
esta película 65, como las que se describirán a continuación, sea
transparente, podría ser opaco translúcido, etc. La naturaleza
transparente permite sin embargo visualizar mejor eventualmente la
posición de una disolución 69 biológica que ha de probarse, o
cualquier otra disolución 70, 71 ó 72, introducida en la tarjeta 1.
La cara 63 trasera comprende igualmente una película transparente
con número de referencia 66 que tabica los canales 64, que en
algunos sitios afloran al nivel de esta cara 63 trasera. Estas
películas 65 y 66 están constituidas por películas BOPP (Biaxially
Oriented PolyPropylen, polipropileno orientado biaxialmente) u
otras películas de la misma naturaleza, que están soldadas o
pegadas sobre el cuerpo de la tarjeta 1, siendo este cuerpo inerte
con respecto a las disoluciones 69 a 72 transferidas y a las
reacciones que experimentan.
Esta película 66 puede estar presente sobre toda
la superficie de la tarjeta 1, o sobre algunas porciones de dicha
tarjeta 1. Sin embargo, esta película 66 puede estar constituida por
una pared realizada con el mismo material que el resto del cuerpo
de la tarjeta 1.
Se observa igualmente que la cara 63 trasera
está dotada de un cierto número de válvulas, con números de
referencia 11 a 35 e igualmente 61 en la figura; estas válvulas 11
a 35 y 61 corresponden a las válvulas descritas en la solicitud de
patente FR99/08116 presentada el 22 de junio de 1999 en nombre del
solicitante. A semejanza de este documento, el conjunto de las
válvulas 11 a 35 y 61 está delimitado con respecto al exterior de
la cara 63 trasera por una película 67 transparente. Ésta es de una
naturaleza lo suficientemente flexible como para permitir el paso
de una disolución 69 que ha de probarse, de una disolución 70
tratada, de un líquido 71 de lavado, de un líquido 72 de elución,
etc. Puede estar constituida por una membrana de silicona o por una
película compleja PE/PET (PolyEthylen/PolyEthylen Tetraphtalate,
polietileno, polietileno tetraftalato).
Cabe señalar que las películas 66 y 67
transparentes situadas al nivel de la cara 63 trasera, pueden estar
constituidas por una sola y la misma película transparente.
Permitiendo esto facilitar la fabricación de la tarjeta 1. Además,
la película 65 transparente situada al nivel de la cara 62
delantera, y las películas 66 y 67 transparentes situadas al nivel
de la cara 63 trasera, pueden estar constituidas por una sola y la
misma película transparente, lo que facilita aún más la fabricación
de tal tarjeta 1 así dotada.
En esta cara 63 trasera, se observa igualmente
la presencia de varios filtros 48 y 49 hidrófobos cuyo papel se
expondrá a continuación. De hecho, hay, en este modo de realización
de la tarjeta de la figura 1, dos vías paralelas. Una vía izquierda
y una vía derecha que permiten efectuar el mismo procedimiento. Sin
embargo es perfectamente posible tener únicamente una sola vía o
una pluralidad, es decir superior a dos, según el número de
reacciones que se desea efectuar.
Se observa finalmente sobre la periferia de la
tarjeta 1, y de manera más precisa sobre los dos lados de pequeñas
dimensiones, que están presentes entradas y salidas, que están
claramente separadas entre sí. Por tanto, en la parte superior de
esta figura 1, se representan cuatro entradas que corresponden a
cuatro funciones claramente definidas. Por tanto, si se enumeran
las funciones de entradas de la izquierda hacia la derecha, se
observa la presencia de una entrada 2 del líquido 71 de lavado, de
una entrada 3 de la disolución 69 que ha de probarse, de una
entrada 4 del líquido 72 de elución, y finalmente de una entrada
para la variación de presión 5 en el interior de dicha tarjeta 1.
El conjunto de estas entradas 2 a 5 está unido a una válvula 6 de
bola de entrada mediante cierto número de canales 64 así como las
válvulas 11 y 12 primera y segunda.
En el lado opuesto, el otro lado de la tarjeta 1
comprende dos salidas 7 y 8. La primera salida, denominada salida
7 de la disolución 70 tratada, es una salida que permite la
evacuación de una cantidad predeterminada de la disolución 70
tratada hacia el exterior con vistas a un análisis posterior o de
cualquier otro tratamiento posterior. La segunda salida es una
salida para el conjunto de los residuos biológicos y líquidos
procedentes del funcionamiento de la tarjeta 1. La salida 7 se
asocia a una válvula de bola de salida hacia el exterior mientras
que la salida de los residuos se asocia a un válvula 9 de bola de
salida hacia el exterior mientras que la salida de los residuos
está asociada a una válvula 10 de bola de salida de los
residuos.
Además de las dos partes, entradas 2 a 5 en
posición superior y salidas 7 y 8 en posición inferior, se observa
igualmente cierto número de canales, válvulas y compartimientos
entre estas dos partes extremas. Como eso ya se ha señalado, se
observa igualmente la presencia de dos vías separadas idénticas a la
izquierda y a la derecha de la figura 1. El primer compartimiento
en posición superior y en forma de C invertida sobre la vía de la
izquierda y en forma de C sobre la vía de la derecha, es de gran
tamaño y constituye un compartimiento 36 de dosificación de la
disolución. Este compartimiento 36 encierra en su interior un
compartimiento 37 de dosificación de líquido de elución,
compartimiento 37 que es de forma similar pero de un volumen
diferente. De hecho la relación existente entre el volumen del
compartimiento 36 de dosificación de la disolución y el volumen de
compartimiento 37 de dosificación de líquido de elución está
comprendido entre 1 a 1 hasta 10 a 1, preferiblemente entre 1,5 a 1
hasta 4 a 1 y aún más preferiblemente de 2 a 1.
En posición subyacente está presente un
compartimiento 38 de separación, que permite la recogida de
entidades de captura, tales como partículas magnéticas,
eventualmente revestidas de oligonucleótidos de captura, por
adsorción o covalencia (véase a este respecto las patentes
US-A-4.672.040 y 5.750.338), y así,
después de la mezcla, la selección por separación de los ácidos
nucleicos que se desea amplificar posteriormente. Las partículas
magnéticas se encuentran en el interior de este compartimiento 38
de separación bajo la forma de una pastilla 39 de partículas
magnéticas. Un modo de realización particularmente interesante de
estas partículas magnéticas se describe en las solicitudes de
patente presentadas por el solicitante con las siguientes
referencias:
- PCT/FR97/00912 bajo prioridad francesa del 24
de mayo de 1996, y
- PCT/FR99/00011 bajo prioridad francesa del 6
de enero de 1998.
En la última de estas solicitudes de patente, se
trata de partículas magnéticas termosensibles que tienen cada una
un núcleo magnético recubierto de una capa intermedia. La capa
intermedia está a su vez recubierta por una capa externa a base de
un polímero susceptible de interaccionar con al menos una molécula
biológica, el polímero externo es termosensible y presenta una
temperatura crítica inferior de solubilidad (LCST) predeterminada
comprendida entre 10 y 100°C y preferiblemente entre 20 y 60°C.
Esta capa externa se sintetiza a partir de monómeros catiónicos,
que generan un polímero que tiene la capacidad de unir los ácidos
nucleicos. Esta capa intermedia aísla las cargas magnéticas del
núcleo, con el fin de evitar los problemas de inhibición de las
técnicas de amplificación de estos ácidos nucleicos. Partículas
magnéticas en forma de pastillas ya se describieron en el estado de
la técnica, constituido por el documento EP-A-
0.811.694, por ejemplo. La fabricación de las pastillas en general
se describe claramente también en el estado de la técnica, por
ejemplo los documentos
US-A-4.678.812 y
US-A- 5.275.016. Esta fabricación anteriormente
mencionada podrá usarse para la síntesis de las otras pastillas que
se expondrán a continuación.
En posición subyacente, está presente un
compartimiento de recogida de los constituyentes estructurales que
permiten posteriormente la amplificación. Este compartimiento 40
contiene también una pastilla 41 que comprende constituyentes que
permitirán la amplificación posterior. Constituyentes en forma de
pastillas, para realizar una amplificación, ya se describieron en
el estado de la técnica. Es posible encontrar información en los
siguientes documentos: la patente
US-A-5.098.893 o el artículo
"Ambiant-temperature-stable
molecular biology reagents" R. Ramanujam et al., Product
Application Focus, Vol. 14, No. 3 (1993), 470-473,
por ejemplo.
Aún en posición subyacente está presente un
compartimiento 42 de amplificación que comprende una pastilla 43
que contiene constituyentes funcionales, tales como enzimas que,
asociados con los constituyentes estructurales anteriormente
citados, van a permitir realmente llevar a cabo una amplificación.
Enzimas en forma de pastillas, para realizar una amplificación, ya
se describieron en el estado de la técnica. Es posible encontrar
información en los siguientes documentos: la patente
US-A-4.891.319,
WO-A-87/00196,
WO-A-95/33488 o el artículo
"Extraordinary stability of enzymes dried in trehalose:
simplified molecular biology" de C. Colago et al.,
Bio/Technology, Vol. 10, Septiembre de 1992,
1007-1011.
Pueden usarse todas las técnicas de
amplificación. Por tanto, para la amplificación de los ácidos
nucleicos, existen entre otras las siguientes técnicas:
- PCR (Polymerase Chain Reaction, reacción en
cadena de la polimerasa), tal como se describe en las patentes
US-A-4.683.195,
US-A-4.683.202 y
US-A-4.800.159,
- LCR (Ligase Chain Reaction, reacción en cadena
de la ligasa), expuesta por ejemplo en la solicitud de patente
EP-A-0.201.184,
- RCR (Repair Chain Reaction, reacción en cadena
de reparación), descrita en la solicitud de patente
WO-A-90/01069,
- 3SR (Self Sustained Sequence Replication,
replicación de secuencia autosostenida) con la solicitud de patente
WO-A-90/06995,
- NASBA (Nucleic Acid
Sequence-Based Amplification, amplificación basada
en secuencias de ácidos nucleicos) con la solicitud de patente
WO-A-91/02818,
- SPSR (Single Primer Sequence Replication,
replicación de secuencia con un único cebador) con la patente
S-A-5.194.370, y
- TMA (Transcription Mediated Amplification,
amplificación mediada por transcripción) con la patente
US-A-5.399.491.
No obstante es posible efectuar otras etapas en
el compartimiento 42 anterior. Por ejemplo, estos cebadores pueden
eventualmente contener un marcador fluorescente que permita la
detección posterior de los productos de amplificación, sin tener
que efectuar una etapa suplementaria para el marcado. Por tanto,
tales cebadores se describen en el artículo de D. Whitcombe et
al., "Detection of PCR products using
self-probing amplicons and fluorescence", Nature
Biotechnology (17) 1999, 804 y siguientes, o en las solicitudes de
patente GB-A-2.338.301,
WO-A-99/29905 y
WO-A-99/60157.
Por debajo del compartimiento 42 de
amplificación, está presente un compartimiento 44 de muestreo que
va a permitir separar en dos, el volumen de la disolución 70
tratada presente en dicho compartimiento 42 de amplificación. Este
compartimiento 44 de muestreo está destinado de hecho a recibir una
cantidad predeterminada de dicha disolución 70 tratada.
Transfiriéndose el resto de la disolución 70 a continuación a un
compartimiento 47 de convergencia situado en posición inferior de
dicha tarjeta 1, pero en posición superior con respecto a los
medios de salida de los líquidos que estén asociados a la
disolución 70 tratada o a los residuos. El compartimiento 47 de
convergencia contiene por tanto una sola disolución que contiene el
conjunto de las disoluciones amplificadas que tienen o bien que
experimentar otros tratamientos en la misma tarjeta, o bien que
transferirse a otro dispositivo para permitir su análisis. Esta
disolución única procede del conjunto de las vías que constituye la
tarjeta 1, es decir en el caso presente, la vía izquierda y la vía
derecha.
Cuando los productos de amplificación contenidos
en el compartimiento 47 de convergencia se transfieren hacia otro
dispositivo para permitir su análisis, esto puede efectuarse
mediante un tubo, tal como se describe en las figuras 8 a 11 de la
solicitud PCT/FR99/02137 presentada el 8 de septiembre de 1999 por
el solicitante. Este otro dispositivo puede estar constituido por
un soporte que comprende por ejemplo sobre una de sus caras sondas
de captura de fuerte densidad, por ejemplo los chips de ADN
diseñados por la empresa Affymetrix ("Accessing Genetic
Information with High-Density DNA arrays", M.
Shee et al., Science, 274, 610-614.
"Light-generated oligonucleotide arrays for
rapide DNA sequence analysis", A. Caviani Pease et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 5022-5026), o
cualquier otro sistema de chips que comprenda ácidos nucleicos
fijados sobre un soporte sólido, como los chips de ADN definidos
anteriormente.
La alícuota presente en el compartimiento 44 de
muestreo va a transferirse a continuación hacia un compartimiento
45 de detección y de lectura. En este compartimiento 45 está
presente una pastilla que contiene medios 45a de detección.
Basándose en los documentos del estado de la técnica anteriormente
mencionados, es posible fabricar por ejemplo pastillas 45a que
contienen ácidos nucleicos marcados complementarios de todos o
parte de los amplicones que deben obtenerse durante las etapas
anteriores.
Como eso se ha descrito anteriormente es
igualmente posible efectuar el marcado durante la amplificación
mediante cebadores marcados. En este caso, ya no se necesita tener
una pastilla 45a, y el compartimiento 45 sólo es un sencillo
compartimiento de lectura. Este compartimiento 45 de marcado y de
lectura comprende por tanto una pastilla 45a de marcadores a su
entrada y una célula 46 de lectura aguas arriba. Esta célula 46 de
lectura permite detectar, por ejemplo mediante medida de
fluorescencia, si la amplificación efectivamente se ha realizado.
Si este es el caso, esto permite al manipulador o al autómata que
utiliza tal tarjeta 1, saber si se necesita transferir la
disolución 70 tratada, presente en el compartimiento 47 de
convergencia hacia medios de análisis de las secuencias
amplificadas, pudiéndose integrar estos medios en la tarjeta 1 o
estar contenidos en otro dispositivo más particularmente destinado
a esta función.
Los movimientos de líquidos en el interior de la
tarjeta 1 sea cual sea la disolución 69 que ha de probarse, la
disolución 70 tratada, el líquido 71 de lavado o el líquido 72 de
elución 72 se realizan mediante filtros hidrófobos que están
presentes aguas abajo de ciertas válvulas. Cada película 48 ó 49
hidrófoba comprende cierto número de filtros de retención, con
números de referencia 50 a 55 para la película 48 ó 56 a 60 para la
película 49. Su uso se describirá posteriormente.
Como se describe en la solicitud de patente
FR99/08116 presentada el 1999 por el solicitante, las válvulas 11 a
35 y 61 tienen una estructura que permite responder a los problemas
de soldadura de películas sobre un soporte sólido, tal como el
cuerpo de una tarjeta 1 de reacción, generalmente constituido por
materiales plásticos. Esta invención encuentra una aplicación
particularmente interesante en la tarjeta 1 según la presente
invención, así el cuerpo de dicha tarjeta 1 comprende en un cierto
lugar una ranura o hendidura 74 de forma periférica, claramente
representada en la figura 16, que va a recibir en la zona
circunscrita una parte de la película 67 transparente que es
flexible, dichas películas 67, cuatro en la figura 1, y el cuerpo
de la tarjeta 1, siendo solidarios entre sí mediante una soldadura
84 situada en el fondo de la ranura 74. Por eso, la soldadura no
genera ninguna deformación de la superficie superior de la tarjeta
1 y por tanto ningún problema posterior para usar dicha tarjeta 1 y
efectuar análisis. La manipulación de estas válvulas 11 a 35 y/o 61
puede realizarse mediante la acción de electroimanes o de gatos de
dimensiones adaptadas tal como se representa en las figuras 15 y
16.
En la descripción que sigue la referencia que se
hará a las válvulas 11 a 35 y 61, sólo se referirá a las válvulas
11 a 35 de la vía de la izquierda, en el caso de que no se precise
ninguna precisión sobre la vía en cuestión. Cualquier información
sobre las válvulas 11 a 35 y 61 de la vía de la derecha tendrán su
posición sobre esta vía de la derecha precisada. Por otra parte,
conviene subrayar que cuando una válvula 11 a 35 está cerrada, es o
bien el orificio de la izquierda, denominado orificio exterior, o
bien el orificio de la derecha, denominado orificio interior, de
dicha válvula 11 a 35 el que está tapado. Eso se cumple también
para la vía de la derecha y para las válvulas 11 a 35 y 61, pero la
posición se invierte. Por tanto, el orificio de la derecha se
denomina orificio exterior, y el orificio de la izquierda se
denomina orificio interior, de dicha válvula 11 a 35 o 61.
Finalmente, las válvulas 11 a 35 y 61 están
normalmente en reposo en posición abierta. Durante la transferencia
de un fluido, líquido o gas, son las válvulas que están cerradas
las que van a orientar este fluido.
\vskip1.000000\baselineskip
1ª
etapa
En esta primera etapa, el funcionamiento del
conjunto de los constituyentes se expondrá en detalle. Esto se hará
en menor medida posteriormente, sin embargo las grandes funciones
serán iguales, y será fácil extrapolar la información de esta
primera etapa para las etapas posteriores.
Se introduce en la tarjeta 1 la disolución 69
que ha de probarse a través de la entrada 3, según F2. La
disolución 69 toma el canal 64 entre la entrada 3 y la primera
válvula 11 que está abierta. Por eso, dicha disolución 69 puede
pasar al nivel de la segunda válvula 12 que está cerrada al nivel
de su orificio exterior, lo que impide que esta disolución 69 tome
el canal 64 que vuelve hacia la entrada 2 y dirige dicha disolución
70 hacia la válvula 6 de bola de entrada que está por su parte
abierta. De esta válvula 6 de bola parten dos canales 64 uno hacia
la vía de la izquierda el otro hacia la vía de la derecha. El canal
que va hacia la vía de la derecha está tapado mediante cierre del
orificio interior de la segunda válvula 12 de la vía de la derecha.
El canal que va hacia la vía de la izquierda, por su parte, permite
el paso de la disolución 69 que ha de probarse porque la tercera
válvula 13 y la séptima válvula 17 están abiertas. El objetivo es
permitir el rellenado del compartimiento 36 de dosificación de
dicha disolución 69 según la figura 2, por eso el orificio interior
de la cuarta válvula 14 y el orificio exterior de la octava válvula
18 están cerrados, es igualmente el caso del orificio exterior de
la cuarta válvula 14 de la vía de la derecha.
Si se desea rellenar igualmente el
compartimiento 36 de dosificación de la disolución 69 que ha de
probarse de la vía de la derecha, conviene cerrar el orificio
interior de la cuarta válvula 14 de la vía de la derecha, lo que
deja el orificio exterior de esta válvula 14 abierto de modo que el
rellenado del compartimiento 36 es posible, mientras que el del
compartimiento 37 de dosificación del líquido 72 de elución no es
posible. Conviene igualmente cerrar el orificio exterior de la
válvula 61 intermedia y el orificio exterior de la octava válvula
18 de la vía de la derecha.
Para dar más detalles sobre el mero rellenado
del compartimiento 36 de la vía de la izquierda, la disolución 69
que ha de probarse va a poder rellenar todos los canales 64 desde
la entrada 3 hasta el filtro 51 de retención de dicha disolución
69. Este filtro 51 de retención está colocado en la prolongación
del orificio exterior de la séptima válvula 17. Está constituido
por una parte por el primer filtro 48 hidrófobo, lo que permite el
paso de fluido gaseoso pero no de fluido líquido. Un material
interesante para constituir este filtro hidrófobo es una membrana
VERSAPOR 200R fabricada por la empresa americana GELMAN SCIENCES
(USA). Es la configuración de la figura 2. Cuando se ha usado este
tipo de filtro una vez, no puede usarse una segunda vez.
A continuación con el fin de dosificar
exactamente el volumen de la disolución 69 presente en el
compartimiento 36 de dosificación, cuyo volumen es de 100 \mul,
va a purgarse los canales 64. Para eso, se introduce según F1 un
líquido 71 de lavado por la entrada 2. En este caso se cierra las
siguientes válvulas:
- el orificio interior de la primera válvula
11,
- el orificio interior de la tercera válvula
13,
- el orificio interior de la cuarta válvula
14,
- el orificio interior de la octava válvula
18,
- el orificio interior de la decimocuarta
válvula 24,
- el orificio interior de la decimoquinta
válvula 25,
- el orificio interior de la segunda válvula 12
de la vía de la derecha,
- el orificio interior de la tercera válvula 13
de la vía de la derecha,
- el orificio interior de la cuarta válvula 14
de la vía de la derecha,
- el orificio interior de la octava válvula 18
de la vía de la derecha,
- el orificio interior de la decimocuarta
válvula 24 de la vía de la derecha, y
- el orificio interior de la decimoquinta
válvula 25 de la vía de la derecha.
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez que se ha efectuado el lavado, se
reemplaza el líquido 71 de lavado presente en los canales 64 por un
fluido gaseoso inerte, por ejemplo aire. En este caso, se inyecta
aire a presión por la entrada 5 según F4. Las válvulas cerradas son
entonces idénticas, con la excepción de las siguientes
características:
- reapertura del orificio interior de la primera
válvula 11,
- cierre del orificio interior de la segunda
válvula 12,
- cierre del orificio interior de la primera
válvula 11 de la vía de la derecha, y
- reapertura del orificio interior de la segunda
válvula 12 de la vía de la derecha.
\vskip1.000000\baselineskip
En esta configuración, el resultado obtenido es
el que se representa en la figura 3. La disolución 69 que ha de
probarse, que estaba presente al nivel de los canales 64, se evacuó
por tanto por la salida de los residuos 8 según F6. Además, los
canales 64 están limpios, únicamente la porción de canal 64 entre
la entrada 2 y el orificio interior de la segunda válvula 12
contiene líquido 71 de lavado, que podrá usarse posteriormente. Por
supuesto, es necesario entonces que las válvulas 6 de bola de
entrada y de salida de los residuos 10 estén abiertas.
Puede por supuesto repetirse este lavado varias
veces. No obstante este resultado puede obtenerse sin efectuar el
lavado. En este caso, conviene únicamente empujar los restos de la
disolución 69 situados en los canales 64 por la entrada 5 de aire
según F4. El resultado será idéntico con una única diferencia, no
habrá líquido 71 de lavado entre la entrada 2 y el orificio
exterior de la segunda válvula 12, y el líquido 71 de lavado
presente entre el orificio interior de la segunda válvula 12 y la
válvula 6 de bola de entrada será sustituido por disolución 69 que
ha de probarse. Esta posibilidad es por tanto menos interesante,
aunque sea posible, porque quedará en la tarjeta 1 disolución 69
susceptible de cruzar la válvula 6 de bola tan pronto como se
introduzca líquido 71 de lavado según F1.
En los dos casos que acaban de comentarse, es
posible desnaturalizar los ácidos nucleicos presentes en este
compartimiento 36. Para esto, se calienta a una temperatura
comprendida entre 80 y 100°C.
\vskip1.000000\baselineskip
2ª
etapa
En esta segunda etapa, la disolución 69 que ha
de probarse, que acaba de dosificarse y está presente en el
compartimiento 36, se transfiere al compartimiento siguiente,
denominado 38 de separación. Entonces se va a empujar la disolución
69 que ha de probarse presente en el compartimiento 36 hacia el
compartimiento 38 de separación, por la introducción en la red de
canales 64 de un fluido inerte, tal como aire, por la entrada 5
según F4. En este caso las válvulas cerradas son las
siguientes:
- el orificio interior de la segunda válvula
12,
- el orificio interior de la cuarta válvula
14,
- uno de los orificios de la sexta válvula
16,
- el orificio interior de la octava válvula
18,
- el orificio interior de la undécima válvula
21,
- el orificio exterior de la decimoquinta
válvula 25
- el orificio interior de la primera válvula 11
de la vía de la derecha, y
- el orificio exterior de la cuarta válvula 14
de la vía de la derecha.
\vskip1.000000\baselineskip
Como información el cierre de una válvula puede
no ser obligatorio, si el cierre de otra válvula aguas arriba o
aguas abajo tiene el mismo efecto. Por tanto, la sexta válvula 16
podría estar abierta. En este caso, convendrá cerrar el orificio
interior de la quinta válvula 15.
La transferencia de la disolución 69 dosificada
se obtiene tal como se representa claramente en la figura 4 y se
hace posible por la presencia en relación con este compartimiento
38 con un filtro 52 de retención que está unido a una derivación 73
en posición intermedia a lo largo de dicho compartimiento 38.
Estando este filtro 52 en relación con la décima válvula 20, el
aire presente aguas abajo de dicha disolución 69 puede escaparse
por este filtro 52 de retención. Cuando la disolución 69 alcanza el
filtro 52 de retención, a través de la derivación 73, la progresión
de dicha disolución 69 se detiene. Además, el volumen total de esta
disolución 69 es inferior al volumen de dicho compartimiento 38
aguas arriba de dicha derivación 73 y estará por tanto claramente
circunscrito en esta parte aguas arriba del compartimiento 38.
Se observa que en esta posición la disolución 69
dosificada todavía no ha alcanzado la pastilla 39 de partículas
magnéticas, que está a su vez situada aguas abajo de la
derivación.
En esta posición, el volumen de aire aguas abajo
de dicha disolución 69 que ha de probarse está aprisionado pero
sigue siendo en un volumen importante. A continuación es posible
forzando la entrada de aire según F4 comprimir el aire aprisionado.
Cuando se hacen varios movimientos de vaivén, la disolución 69 va a
permitir disolver la pastilla 39 de partículas magnéticas,
partículas que estarán presentes de forma homogénea en esta nueva
disolución 70, denominada disolución 70 tratada, nombre que se le
dará en lo sucesivo sea cual sea el estadio de tratamiento en el
que se encuentra (partículas magnéticas, constituyentes
estructurales, constituyentes funcionales, amplicones) a partir del
momento en que el líquido de base usado es la disolución 69 que ha
de probarse. Además, para el líquido 71 de lavado que se
describirá más adelante, cuando este líquido 71 de lavado ha
cumplido su función y contiene residuos que hay que evacuar, su
referencia no se modifica. Por otra parte, para el líquido 72 de
elución que se describirá igualmente más adelante, cuando el
líquido 72 de elución recoge los constituyentes estructurales,
constituyentes funcionales, amplicones u otros, este líquido se
denomina entonces líquido 70 tratado.
El movimiento de vaivén anteriormente expuesto,
y que se explicará igualmente a continuación en relación con el
líquido 71 de lavado y de elución 72, es posible por la
configuración del compartimiento 38 de separación. Por tanto este
compartimiento 38 es de un volumen más importante que el volumen de
líquido 69 que ha de probarse introducido, de modo que el líquido
69 circunscrito aguas abajo un volumen de aire que está
aprisionado. Por eso, cuando se empuja dicho líquido 69 mediante un
aumento de presión aguas arriba, o bien mediante un empuje debido a
dicho líquido 69 propiamente o bien mediante un aumento de la
presión de aire mediante introducción de un exceso gaseoso al nivel
de la entrada 5, y relajando a continuación este empuje, es posible
efectuar un movimiento de vaivén al nivel de la pastilla 39 de
partículas magnéticas. Este movimiento optimiza así poner o volver
a poner en suspensión de dichas partículas magnéticas.
A este respecto, la relación existente entre el
volumen del compartimiento 38 aguas arriba de la derivación 73 y el
volumen de dicho compartimiento 38 aguas abajo de dicha derivación
73 está comprendido entre 1 a 2 y 1 a 5, preferiblemente es de 1 a
3. La relación entre el volumen de dicha disolución 70 y el volumen
del compartimiento 38 aguas abajo de esta disolución 70 es por
tanto sensiblemente igual o inferior. En el caso de que esta
relación sea inferior, está por ejemplo comprendida entre 1 a 2,5 y
1 a 6, preferiblemente es de 1 a 3,5. Por las relaciones
mencionadas anteriormente, en el ejemplo descrito en las figuras
siendo el volumen total del compartimiento 36 de dosificación de 50
\mul, el compartimiento 38 de separación es por tanto de 150
\mul.
Las partículas magnéticas tienen la propiedad de
unir específicamente los ácidos nucleicos. Para eso, hay que
someter la mezcla de disolución 69 que ha de probarse y las
pastillas 39 de partículas magnéticas a una temperatura o un ciclo
de temperaturas que puede estar comprendido entre 25 y 60°C. A
continuación se procede a una separación magnética de las
partículas contra al menos una de las películas 65 y/o 66
transparentes que tabican la tarjeta al nivel de su cara 62
delantera y/o trasera 63, al nivel del compartimiento de
separación. La separación magnética de las partículas magnéticas
tiene lugar antes de que la disolución 70 tratada se evacue según
F6.
Eventualmente, estas etapas de dosificación de
disolución 70 tratada y la separación de los ácidos nucleicos
pueden reiterarse N veces, estando comprendido N entre 1 y 10, con
el fin de tratar volúmenes de disolución 70 tratada superiores al
volumen del compartimiento 38 de separación.
Se procede a continuación al lavado de las
partículas magnéticas con el fin de que sólo los ácidos nucleicos
buscados sean retenidos. Cuando se introduce líquido 71 de lavado
según F1, por la entrada 2, se cierran las siguientes válvulas:
- uno de los orificios de la primera válvula
11,
- el orificio interior de la cuarta válvula
14,
- uno de los orificios de la sexta válvula
16,
- el orificio interior de la octava válvula
18,
- el orificio interior de la duodécima válvula
22,
- uno de los orificios de la decimosexta válvula
26,
- uno de los orificios de la válvula 61
complementaria de la vía de la derecha,
- el orificio interior de la segunda válvula 12
de la vía de la derecha, y
- el orificio exterior de la cuarta válvula 14
de la vía de la derecha.
\vskip1.000000\baselineskip
El líquido 71 de lavado va por tanto a pasar al
compartimiento 38 de separación, donde las partículas magnéticas
siempre están imantadas. Se detiene el movimiento de este líquido
mediante el filtro 53 de retención, luego se interrumpe la
separación magnética y se procede a un movimiento de vaivén con el
fin de que dicho líquido 71 de lavado pueda limpiar lo mejor
posible las partículas magnéticas portadoras de los ácidos
nucleicos.
La separación magnética de las partículas
magnéticas se pone de nuevo en práctica antes de que el líquido 71
de lavado se evacue según F6. Las válvulas cerradas son por
supuesto idénticas a las usadas durante la evacuación del resto de
la disolución 70 que ha de probarse, cuyos ácidos nucleicos han
sido capturados por las partículas magnéticas.
Cuando se reintroduce líquido de lavado según F5
para efectuar un segundo lavado, se cierran las mismas válvulas que
para el primer lavado, con la excepción del orificio interior de
la duodécima válvula 22 que está abierta mientras que es el
orificio interior de la decimotercera válvula 23 el que está
cerrado. En esta configuración se detiene el movimiento del nuevo
líquido 71 de lavado introducido mediante el filtro 54 de
retención, unido a la duodécima válvula 22. Se interrumpe la
separación magnética y se procede a un movimiento de vaivén con el
fin de que dicho líquido 71 pueda limpiar lo mejor posible las
partículas magnéticas que llevan ácidos nucleicos.
Una vez que se efectúa el lavado, se reemplaza
el líquido 71 de lavado presente en los canales 64 por un fluido
gaseoso inerte, por ejemplo aire. En este caso, se inyecta aire a
presión por la entrada 5 según F4. El líquido 71 de lavado evacuado
sale de la tarjeta 1 por la salida 8 según F6 a través de la
válvula 10 de bola de salida de los residuos. Las válvulas cerradas
son entonces idénticas, con la excepción de las siguientes
características:
- reapertura del orificio interior de la primera
válvula 11,
- cierre del orificio interior de la segunda
válvula 12,
- cierre del orificio interior de la primera
válvula 11 de la vía de la derecha, y
- reapertura del orificio interior de la segunda
válvula 12 de la vía de la derecha.
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Esta etapa puede por supuesto realizarse entre
las dos etapas de lavado.
Puede por supuesto repetirse este lavado varias
veces, estando el líquido 71 de lavado sucio siempre evacuado por
la salida 8, a través de la válvula 10 de bola de salida, según
F6. En este caso habrá que prever otros filtros de retención entre
los filtros 54 y 55 de retención.
\vskip1.000000\baselineskip
3ª
etapa
En esta tercera etapa, la disolución 70 que ha
de probarse se ha evacuado casi completamente según F6. Sólo
permanecen enganchados sobre las partículas magnéticas, los ácidos
nucleicos que han sido capturados durante la etapa anterior. Estas
partículas magnéticas están siempre presentes porque la separación
magnética todavía se efectúa esperando la recogida de los ácidos
nucleicos por un líquido 72 de elución, lo que constituye el
objetivo de esta etapa.
Previamente conviene bien dosificar el líquido
72 de elución que va a usarse. El volumen que es necesario en el
caso presente es de 50 \mul. Hay por tanto una relación de 1 a 2
entre el volumen de la disolución 70 tratada y el volumen del
líquido 72 de elución. Sin embargo una relación que varía entre 1 a
1 y 1 a 10 es posible. Ya que esta etapa puede reiterase de 1 a 10
veces, esta relación puede por tanto ir de 1 a 100. La dosificación
del volumen de líquido 72 de elución se realiza en el
compartimiento 37 de dosificación.
Para esto, se introduce el líquido 72 de elución
por la entrada 4, según F3. Dicho líquido 72 toma luego los canales
64 para rellenar el compartimiento 37 de dosificación. Se detiene
este movimiento de 72 mediante el filtro 50 de retención.
Las válvulas cerradas son entonces las
siguientes:
- el orificio interior de la segunda válvula
12,
- el orificio exterior de la tercera válvula
13,
- el orificio interior de la sexta válvula 16,
y
- el orificio exterior de la segunda válvula 12
de la vía de la derecha.
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Esta configuración se representa claramente en
la figura 5.
Una vez que se ha efectuado la dosificación del
líquido 72 de elución, se reemplaza en los canales 64 por un fluido
gaseoso inerte, por ejemplo aire. En este caso, se inyecta aire a
presión por la entrada 5 según F4. El líquido 72 de elución
evacuado sale de la tarjeta 1 por la salida 8 según F6 a través de
la válvula 10 de bola de salida de los residuos. Se obtiene así una
tarjeta 1 que tiene una repartición de líquidos tal como se
representa en la figura 6. Las válvulas cerradas son entonces las
siguientes:
- cierre de uno de los orificios de la primera
válvula 11,
- reapertura del orificio exterior de la segunda
válvula 12,
- cierre del orificio interior de la octava
válvula 18,
- cierre del orificio interior de la
decimocuarta válvula 24,
- cierre del orificio interior de la
decimoquinta válvula 25,
- reapertura del orificio exterior pero cierre
del orificio interior de la tercera válvula 13,
- cierre del orificio interior de la tercera
válvula 13 de la vía de la derecha,
- cierre del orificio interior de la cuarta
válvula 14 de la vía de la derecha,
- cierre del orificio interior de la octava
válvula 18 de la vía de la derecha,
- cierre del orificio interior de la
decimocuarta válvula 24 de la vía de la derecha, y
- cierre del orificio interior de la
decimoquinta válvula 25 de la vía de la derecha.
\vskip1.000000\baselineskip
El líquido 72 de elución, que acaba de
dosificarse y está presente en el compartimiento 37, se transfiere
al compartimiento siguiente, denominado 38 de separación. Por
tanto se va a empujar dicho líquido 72 presente en el
compartimiento 36 hacia el compartimiento 38 de separación,
mediante la introducción en la red de canales 64 de un fluido
inerte, tal como aire, por la entrada 5 según F4. El movimiento del
líquido 72 de elución se detiene cuando dicho líquido 72 alcanza el
filtro 55 de retención. En este caso las válvulas cerradas son las
siguientes:
- el orificio interior de la segunda válvula
12,
- el orificio exterior de la tercera válvula
13,
- el orificio exterior de la novena válvula
19,
- uno de los orificios de la decimocuarta
válvula 24,
- el orificio exterior de la decimoquinta
válvula 25, y
- el orificio interior de la primera válvula 11
de la vía de la derecha.
\vskip1.000000\baselineskip
La configuración de la tarjeta 1 después del
desplazamiento del líquido 72 de elución se representa en la figura
7. En esta posición, dicho líquido 72 de elución permite la
recogida de las partículas magnéticas asociadas a los ácidos
nucleicos. Es posible en este estadio efectuar una mezcla como se
indicó anteriormente con la disolución 70 que ha de probarse y las
partículas magnéticas de la pastilla 39.
El líquido 72 de elución, que puede ser un
tampón tal como Tris de pH 7,5 y de baja fuerza iónica, va a
permitir separar los ácidos nucleicos de las partículas magnéticas,
procediendo a una incubación a una temperatura comprendida entre
25 y 60°C. Se va luego a proceder de nuevo a una separación
magnética únicamente de las partículas magnéticas, permaneciendo
los ácidos nucleicos en suspensión en dicho líquido 72.
\vskip1.000000\baselineskip
4ª
etapa
Esta cuarta etapa se representa claramente en la
figura 8. Las válvulas cerradas son las siguientes:
- el orificio interior de la segunda válvula
12,
- el orificio exterior de la tercera válvula
13,
- el orificio exterior de la novena válvula
19,
- uno de los orificios de la decimocuarta
válvula 24,
- el orificio interior de la decimoquinta
válvula 25,
- el orificio exterior de la decimoctava válvula
28, y
- el orificio interior de la primera válvula 11
de la vía de la derecha.
\vskip1.000000\baselineskip
En esta configuración, el líquido 72 de elución
que contiene los ácidos nucleicos extraídos de la disolución 70
que ha de probarse se transfiere del compartimiento 38 de
separación hacia el compartimiento 40 de recogida de los
constituyentes que permiten la amplificación. Se trata aquí de los
constituyentes estructurales que permiten esta amplificación. Estos
constituyentes se amalgaman y forman una pastilla 41 presente en la
entrada del compartimiento 40, de modo que el líquido de elución va
a disolver rápidamente la pastilla 41 durante su entrada en este
compartimiento 40 y va a arrastrar los constituyentes con él hasta
su posición tal como se define en la figura 8.
El volumen de este compartimiento 40 es de 150
\mul, o sea una relación de 1 a 3 con los 50 \mul del líquido
72 de elución. Sin embargo esta relación puede ser desde 1 a 2
hasta 1 a 5. Esta relación permite el desplazamiento de dicho
líquido 72 que contiene los ácidos nucleicos y que está cargado de
constituyentes estructurales, lo que facilita la mezcla.
La transferencia se efectúa bajo la acción de un
aumento de la presión en el interior de la tarjeta 1 aguas arriba
del líquido 72 de elución. Este aumento de presión se realiza
inyectando por la entrada 5 aire o cualquier otro fluido gaseoso
inerte según F4.
El líquido 72, que contiene por una parte los
ácidos nucleicos y por otra parte los constituyentes estructurales
de la amplificación, va a ser detenido por el filtro 56 de
retención asociado a la decimoséptima válvula 27.
Durante esta etapa, el orificio interior de la
decimosexta válvula 26 y el orificio interior de la decimoséptima
válvula 27 están cerrados cuando dicho líquido 72 está en este
compartimiento 40. Se incuba con una duración de 1 a 15 minutos a
una temperatura comprendida entre 30 y 65°C, lo que permite la
fijación de los cebadores sobre los ácidos nucleicos
correspondientes. Luego se ajusta la temperatura a un valor
comprendido entre 37 y 42°C. Como se expuso anteriormente, el
líquido resultante de esta 4ª etapa, que contiene esencialmente el
líquido 72 de elución y los constituyentes estructurales aptos en
algunas condiciones para permitir la amplificación, se denomina
disolución o líquido 70 tratado.
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5ª
etapa
Esta quinta etapa se representa claramente en la
figura 9. Las válvulas cerradas son entonces las siguientes:
- el orificio interior de la segunda válvula
12,
- el orificio exterior de la tercera válvula
13,
- el orificio interior de la novena válvula
19,
- el orificio interior de al menos una de las
válvulas 20, 21, 22 y/o 23 y/o uno de los orificios de la
decimocuarta válvula 24,
- el orificio interior de la decimoquinta
válvula 25,
- el orificio interior de la vigésimo cuarta
válvula 34, y
- el orificio interior de la primera válvula 11
de la vía de la derecha.
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En esta configuración, el líquido 72 de elución,
que contiene los ácidos nucleicos y los constituyentes
estructurales aptos para permitir una amplificación, denominado
disolución 70 tratada, se transfiere del compartimiento 40 de
recogida de los constituyentes estructurales que permiten la
amplificación hacia el compartimiento 42 de recogida de los
constituyentes funcionales que permiten esta misma amplificación.
El movimiento de dicha disolución 70 tratada es detenido por el
filtro 59 de retención.
Estos constituyentes funcionales contienen
esencialmente enzimas que permiten la amplificación. La naturaleza
y el número de estas enzimas y de los otros constituyentes está en
función de la técnica de amplificación que se elija. Estos
constituyentes se amalgaman y forman una pastilla 43 presente en la
entrada del compartimiento 42, de modo que la disolución 70 tratada
va a disolver rápidamente la pastilla 43 durante su entrada en este
compartimiento 42 y va a arrastrar los constituyentes con él hasta
su posición tal como se define en la figura 9. Esta posición sólo
es una posición intermediaria momentánea porque la presión según F4
va a permitir posteriormente transferir el líquido 72 de elución
que contiene los constituyentes estructurales y funcionales que
permiten realizar la amplificación, según, por supuesto, otra
configuración de las válvulas.
La transferencia es idéntica a la de la cuarta
etapa, se efectúa por tanto bajo la acción de un aumento de la
presión en el interior de la tarjeta 1 aguas arriba del líquido 70
tratado. Este aumento de presión se realiza inyectando por la
entrada 5 aire o cualquier otro fluido gaseoso inerte según F4. Hay
igualmente la misma relación de 1 a 3 entre el volumen de líquido
70 y el volumen del compartimiento 42, con el mismo efecto de
mezcla por vaivén ya descrito anteriormente.
Durante esta etapa, el orificio interior de la
decimoctava válvula 28 y el orificio interior de la decimonovena
válvula 29 están cerrados cuando dicho líquido 70 está en este
compartimiento 42. Se calienta durante 30 a 90 minutos a una
temperatura comprendida entre 30 y 75°C, preferiblemente entre 37 y
42°C, si se desea efectuar una amplificación isoterma como las
técnicas NASBA, TMA, 3SR, SBA. Para efectuar una PCR, conviene
cambiar de temperaturas varias veces quedando en el intervalo de
temperatura 30 a 100°C, con el fin de poder realizar varios ciclos
sucesivos de amplificación.
Debe observarse que estas etapas cuarta y quinta
pueden asociarse en una sola etapa. La única condición entonces es
usar enzimas estables a una temperatura superior o igual a 50°C,
denominadas termoestables.
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6ª
etapa
Durante esta sexta etapa que se representa
claramente en las figuras 10 a 12, se producen tres fases
sucesivas. Estas fases son las siguientes:
- la transferencia de una primera parte del
líquido 70 tratado, es decir sensiblemente 20 \mul, que contiene
o que no contiene el producto de amplificación, desde el
compartimiento 42 de recogida de los constituyentes funcionales
hacia el compartimiento 44 de muestreo, lo que corresponde a la
figura 10,
- la transferencia de una segunda parte del
líquido 70 tratado, correspondiente al resto de dicho líquido 70, o
sea sensiblemente 30 \mul, desde el compartimiento 42 de recogida
de los constituyentes funcionales hacia el compartimiento 47 de
convergencia, lo que corresponde a la figura 11, y
- la transferencia de esta parte de dicho
líquido 70 tratado desde el compartimiento 44 de muestreo hacia el
compartimiento 45 de detección y de lectura, lo que corresponde a
la figura 12.
\vskip1.000000\baselineskip
Según la figura 10, las válvulas cerradas son
las siguientes:
- el orificio interior de la segunda válvula
12,
- el orificio exterior de la tercera válvula
13,
- el orificio exterior de la novena válvula
19,
- el orificio interior de al menos una de las
válvulas 20, 21, 22 y/o 23 y/o uno de los orificios de la
decimocuarta válvula 24,
- el orificio interior de la decimoquinta
válvula 25,
- el orificio exterior de la vigésimo primera
válvula 31
- el orificio interior de la vigésimo cuarta
válvula 34, y
- el orificio interior de la primera válvula 11
de la vía de la derecha.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta transferencia permite dosificar de manera
precisa una alícuota de sensiblemente 20 \mul de disolución 70
tratada, que va a transferirse a continuación al compartimiento 45
de detección y de lectura. Durante esta fase, el líquido 70 se
detiene en su movimiento por la presencia de un filtro 57 de
retención, al nivel del compartimiento 45 de detección y de
lectura, y de un filtro 59 de retención, aguas abajo del
compartimiento 47 de convergencia.
Según la figura 11, las válvulas cerradas son
idénticas a la fase anterior. Sólo existen las diferencias
siguientes:
- apertura del orificio interior de la vigésimo
cuarta válvula 34,
- cierre del orificio interior de la vigésimo
quinta válvula 35,
- cierre del orificio exterior de la vigésimo
cuarta válvula 34 de la vía de la derecha, y
- cierre del orificio interior de la vigésimo
quinta válvula 35 de la vía de la derecha.
\vskip1.000000\baselineskip
Por eso, la transferencia hacia el
compartimiento 47 de convergencia es posible para el resto del
líquido 70 tratado que no se tiene en cuenta por el compartimiento
44. Esta parte de dicho líquido 70 se detiene en su movimiento por
el filtro 60 de retención, asociado a la vigésimo quinta válvula
35.
Según la figura 12, las válvulas cerradas son
las siguientes:
- el orificio interior de la segunda válvula
12,
- el orificio exterior de la tercera válvula
13,
- el orificio exterior de la novena válvula
19,
- el orificio interior de al menos una de las
válvulas 20, 21, 22 y/o 23 y/o uno de los orificios de la
decimocuarta válvula 24,
- el orificio interior de la decimoquinta
válvula 25,
- uno de los orificios de la vigésimo tercera
válvula 33, y
- el orificio interior de la primera válvula 11
de la vía de la derecha.
\vskip1.000000\baselineskip
La decimonovena válvula 29 está abierta, lo que
permite la transferencia hacia el compartimiento 45 de detección y
de lectura del líquido 70, anteriormente contenido en el
compartimiento 44 de muestreo, que contiene eventualmente
amplicones marcados. Se observa que durante esta fase, la alícuota
de dicho líquido 70 va a pasar por una zona aguas arriba de dicho
compartimiento 45 donde está presente una pastilla 45a de detección.
Tal pastilla 45a puede contener, por ejemplo, productos de marcado
y de corte de los amplicones, tal como se describen en la solicitud
de patente PCT/FR99/01469 del solicitante presentada el 17 de junio
de 1999, bajo prioridad del 17 de junio de 1998.
El líquido 70 que contiene los amplicones
eventualmente marcados y excindidos prosigue su movimiento y se
detiene en la parte aguas abajo del compartimiento 45 por un filtro
58 de retención, de modo que dicho líquido 70 está presente al
nivel de una célula 46 de lectura. Al nivel de esta célula 46, es
posible controlar que la amplificación ha tenido lugar y que la
fase siguiente puede efectuarse. El control de esta amplificación
puede realizarse mediante oligonucleótidos no marcados, denominados
sondas de captura, fijados al nivel de la célula 46 de lectura.
Estas sondas son aptas para hibridarse con el producto de
amplificación que tuvo que amplificarse, marcarse y partirse.
En otro modo de realización, el líquido 70 que
contiene los amplicones no marcados se detiene al nivel de la
célula 46. El control de la amplificación pone en práctica una
técnica de detección de los amplicones no marcados tal como la que
se describe por ejemplo:
- en las solicitudes de patente
WO-A-95/13399,
WOA-97/39008 o
WO-A-99/64432, o las patentes
US-A-5.283.174, US-A-5.656.207, US-A-5.658.737 o US-A-5.928.862, para las técnicas homogéneas, y
US-A-5.283.174, US-A-5.656.207, US-A-5.658.737 o US-A-5.928.862, para las técnicas homogéneas, y
- en la solicitud de patente
WO-A-91/19812, o las
patentes US-A-4.889.798
o US-A-5.998.135, para
las técnicas heterogéneas.
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7ª
etapa
La alícuota de líquido 70 tratado presente en el
compartimiento 47 de convergencia procede de la vía de la
izquierda de la tarjeta 1. Sin embargo, otra alícuota 70, que
contiene o no otros amplicones específicos debido a la
amplificación, puede estar igualmente presente procedente de la vía
de la derecha de dicha tarjeta 1. En el caso de la figura 12, las
válvulas cerradas son idénticas pero sobre las vías opuestas, es
entonces el filtro 35 de retención de la vía de la derecha el que
permite detener la llegada de esta alícuota al compartimiento 47 de
convergencia, y así la mezcla entre dichas alícuotas de las vías de
la derecha y de la izquierda.
Las amplificaciones en estas dos vías pueden ser
idénticas (uso de cebadores idénticos), con el fin de obtener más
amplicones, o diferentes (uso de cebadores diferentes), con el fin
de permitir varios análisis en función del número de amplicones
diferentes obtenidos.
Es igualmente posible tener más de dos vías en
una tarjeta 1 de reacción según la invención. En este caso, cabe
adaptar los canales 64 a las cercanías de las válvulas 6 de bola de
entrada y 9 de salida. Por tanto, será necesario tener otros
filtros de retención y otras válvulas en posición inferior con el
fin de poder hacer converger todas las alícuotas en el
compartimiento 47.
\newpage
Cuando la lectura al nivel de la célula 46
prueba que la amplificación se ha desarrollado bien lo que prueba
la presencia de una diana en la muestra biológica de salida, es
decir la disolución 69 que ha de probarse, la o las alícuotas
presentes en el compartimiento 47 de convergencia se transfieren a
continuación hacia otra tarjeta de análisis o de reacción, no
representada en las figuras, que permite identificar y analizar los
amplicones. Puede usar por ejemplo chips de ADN diseñados por la
empresa Affymetrix, como ya se ha descrito anteriormente. Esta
transferencia se efectúa entonces por la salida 7, según F5, a
través de la válvula 9 de bola.
No obstante, es igualmente posible que un chip
biológico sea estructuralmente solidario de la tarjeta 1 de
reacción. Es igualmente posible que la sexta etapa se limite a la
transferencia al compartimiento de convergencia, sin que haya
control de la realización o no de la amplificación. Finalmente esta
transferencia puede efectuarse directamente en el chip de ADN sin
pasar por el compartimiento de convergencia.
- 1.
- Tarjeta de reacción
- 2.
- Entrada del líquido 71 de lavado
- 3.
- Entrada de la disolución 69 que ha de probarse
- 4.
- Entrada del líquido 72 de elución
- 5.
- Entrada para la variación de presión en el interior de la tarjeta 1
- 6.
- Válvula de bola de entrada de la tarjeta 1
- 7.
- Salida de la disolución 70 tratada hacia el exterior
- 8.
- Salida de los residuos
- 9.
- Válvula de bola de salida hacia el exterior
- 10.
- Válvula de bola de salida de los residuos
- 11.
- Primera válvula
- 12.
- Segunda válvula
- 13.
- Tercera válvula
- 14.
- Cuarta válvula
- 15.
- Quinta válvula
- 16.
- Sexta válvula
- 17.
- Séptima válvula
- 18.
- Octava válvula
- 19.
- Novena válvula
- 20.
- Décima válvula
- 21.
- Undécima válvula
- 22.
- Duodécima válvula
- 23.
- Decimotercera válvula
- 24.
- Decimocuarta válvula
- 25.
- Decimoquinta válvula
- 26.
- Decimosexta válvula
- 27.
- Decimoséptima válvula
- 28.
- Decimoctava válvula
- 29.
- Decimonovena válvula
- 30.
- Vigésima válvula
- 31.
- Vigésimo primera válvula
- 32.
- Vigésimo segunda válvula
- 33.
- Vigésimo tercera válvula
- 34.
- Vigésimo cuarta válvula
- 35.
- Vigésimo quinta válvula
- 36.
- Compartimiento de dosificación de la disolución que ha de probarse
- 37.
- Compartimiento de dosificación del líquido de elución
- 38.
- Compartimiento de separación
- 39.
- Pastilla de partículas magnéticas
- 40.
- Compartimiento de recogida de los constituyentes estructurales
- 41.
- Pastilla de constituyentes estructurales que permiten la amplificación
- 42.
- Compartimiento de amplificación
- 43.
- Pastilla de los constituyentes funcionales que permiten la amplificación
- 44.
- Compartimiento de muestreo
- 45.
- Compartimiento de detección y de lectura
- 45a.
- Pastilla de detección
- 46.
- Célula de lectura
- 47.
- Compartimiento de convergencia
- 48.
- Primer filtro hidrófobo
- 49.
- Segundo filtro hidrófobo
- 50.
- Filtro de retención de un volumen determinado del líquido de elución en el compartimiento 37
- 51.
- Filtro de retención de un volumen determinado de la disolución 70 en el compartimiento 36
- 52.
- Filtro de retención de la disolución 70 que ha de probarse en el compartimiento 38
- 53.
- Filtro de retención del primer líquido 71 de lavado en el compartimiento 38
- 54.
- Filtro de retención del segundo líquido 71 de lavado en el compartimiento 38
- 55.
- Filtro de retención del líquido de elución en el compartimiento 38
- 56.
- Filtro de retención de la muestra con los constituyentes en el compartimiento 40
- 57.
- Filtro de retención de la muestra en la célula 46 de lectura
- 58.
- Filtro de retención de la muestra marcada en el compartimiento 45
- 59.
- Filtro de retención de la muestra con las enzimas en el compartimiento 42
- 60.
- Filtro de retención de la muestra con las enzimas en el compartimiento 47
- 61.
- Válvula complementaria de la vía de la derecha denominada válvula de purga
- 62.
- Cara delantera de la tarjeta 1
- 63.
- Cara trasera de la tarjeta 1
- 64.
- Canales que desembocan al nivel de la cara 62 delantera
- 65.
- Película transparente que tabica los canales 64 al nivel de la cara 62 delantera
- 66.
- Película transparente o pared que tabica los canales 64 al nivel de la cara 63 trasera
- 67.
- Película transparente que tabica las válvulas 11 a 35 y 61 sobre la cara 63 trasera
- 68.
- Reborde o canto de la tarjeta 1
- 69.
- Disolución que ha de probarse
- 70.
- Disolución tratada
- 71.
- Líquido de lavado
- 72.
- Líquido de elución
- 73.
- Derivación del compartimiento 38 para los filtros 52 a 55 de retención
- 74.
- Hendidura o ranura de cada válvula 11 a 35 y 61 donde se suelda la película 67
- 75.
- Medio de compresión de la película 67 o lengüeta flexible
- 76.
- Medio de cierre estanco o pasador de elastómero
- 77.
- Medio de apertura o bisel
- 78.
- Lámina en banda constituida por varias lengüetas 75
- 79.
- Accionador de tipo pistón
- 80.
- Tubo de goma para aire comprimido
- 81.
- Soporte
- 82.
- Superficie biselada de la tarjeta 1
- 83.
- Medio de fijación de la lámina 78
- 84.
- Soldadura periférica situada en el fondo de la ranura 74
- F1.
- Entrada del líquido 71 de lavado
- F2.
- Entrada de la disolución 70 que ha de probarse
- F3.
- Entrada del líquido de elución
- F4.
- Entrada para la variación de presión en el interior de la tarjeta 1
- F5.
- Salida de la disolución que ha de probarse hacia el exterior
- F6.
- Salida de los residuos
- F7.
- Entrada de aire comprimido de los medios 77 de accionamiento
- F8.
- Salida de aire comprimido de los medios 77 de accionamiento
- F9.
- Movimiento de los medios 77 de accionamiento
- F10.
- Basculamiento de la lengüeta 75
Claims (18)
1. Tarjeta (1) de reacción constituida por un
cuerpo, que tiene una cara (62) delantera y una cara (63) trasera
delimitadas por un reborde (68), por al menos una entrada (2, 3, 4
y/o 5) y por al menos una salida (7 y/u 8), una (2, 3, 4 y/o 5)
unida a la otra (7 y/u 8) por una red de canales (64) que
constituyen al menos una vía de reacción para al menos un fluido
(70, 71 y/o 72), estando el o los fluidos (70, 71 y/o 72) dirigidos
en el interior de la tarjeta (1) mediante válvulas (11 a 35 y/o
61); cada válvula (11 a 35 ó 61) está constituida por una película
(67) flexible, que puede deformarse para permitir el paso de un
fluido o que actúa conjuntamente con un medio (75) de compresión
para impedir el paso del fluido, estando la película (67) fijada
sobre la cara (63) trasera de dicha tarjeta (1) al nivel de una
hendidura (74) periférico del conjunto de los canales relacionados
con la válvula (11 a 35 ó 61); la tarjeta (1) comprende canales
(64) que afloran sobre al menos una de sus caras (62 y/o 63),
siendo los canales (64) de dos secciones diferentes, una sección
pequeña para la transferencia del fluido o de los fluidos (70, 71
y/o 72) y una sección grande que actúa como compartimiento de
reacción; cada cara (62) delantera o trasera (63) está delimitada
por al menos una película (48, 49, 65, 66 y/o 67).
2. Tarjeta, según la reivindicación 1,
caracterizada porque el cuerpo de la tarjeta (1) es
monobloque, y porque el medio (75) de compresión se añade y es
solidario de dicha tarjeta (1) o constituye una parte de un aparato
que permite la puesta en práctica de la tarjeta (1).
3. Tarjeta, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque la relación
entre la sección pequeña y la sección grande de los canales (64)
está comprendida entre l a 1,01 y 1 a 10, preferiblemente entre l a
1,01 y 1 a 3.
4. Tarjeta, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque los canales (64)
afloran total o parcialmente al nivel de la cara (62) delantera de
la tarjeta (1) y porque las válvulas están presentes al nivel de
la cara (63) trasera de dicha tarjeta (1).
5. Tarjeta, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la cara (62)
delantera de la tarjeta (1) comprende una sola película (65) al
nivel de todos los canales (64) que afloran en esta cara (62), y
la cara (63) trasera de dicha tarjeta (1) comprende:
- -
- al menos una película (67) flexible al nivel de las válvulas (11 a 35 y/o 61),
- -
- al menos un filtro hidrófobo (48 y/o 49), y eventualmente
- -
- al menos una película (66) al nivel de los canales (64) que afloran al nivel de la cara (63) trasera.
6. Tarjeta, según la reivindicación 5,
caracterizada porque la o las películas (67) flexibles y la
o las películas (65 y/o 66) constituyen una única y misma
película.
7. Tarjeta, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en forma sensiblemente de paralelepípedo,
caracterizada porque los canales (64) están, total o
parcialmente, circunscritos en la parte mediana de la tarjeta (1),
porque los filtros (50 a 60) de retención, asociados a los filtros
hidrófobos (48 y 49), están circunscritos al nivel de al menos uno
de los lados de dicha tarjeta (1), y porque las válvulas (11 a 35
y/o 61) están posicionadas entre los canales (64) y los filtros
(50 a 60) de retención.
8. Tarjeta, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el reborde (68)
comprende el conjunto de las entradas (2, 3, 4 y 5) y salidas (7 y
8) de fluidos (70, 71 y 72) de la tarjeta (1).
9. Tarjeta, según la reivindicación 8, en forma
sensiblemente de paralelepípedo, caracterizada porque la o
las entradas (2, 3, 4 y 5) están presentes sobre uno de los lados
que constituyen el reborde (68), y porque la o las salidas (7 y 8)
están presentes sobre otro lado de este reborde (68).
10. Tarjeta, según la reivindicación 9,
caracterizada porque la o las entradas (2, 3, 4 y 5) están
presentes sobre un lado opuesto al lado donde están presentes la o
las salidas (7 y 8).
11. Tarjeta, según la reivindicación 10, en
forma sensiblemente de paralelepípedo rectángulo,
caracterizada porque la o las entradas (2, 3, 4 y 5) y la o
las salidas (7 y 8) están presentes sobre los dos lados pequeños
que constituyen el reborde (68).
12. Uso de una tarjeta de reacción, según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para probar una
disolución (69) biológica, eventualmente tratada previamente con el
fin de liberar ligandos, en el que se efectúan las diferentes
etapas biológicas en el siguiente orden:
- -
- introducción de la disolución (69) biológica que ha de probarse en dicha tarjeta,
- -
- captura de los ligandos,
- -
- recogida de los ligandos capturados en una disolución (72) de elución,
- -
- mezcla de los ligandos recogidos con los constituyentes estructurales y funcionales que permiten tratar los ligandos, y
- -
- detección cualitativa y/o cuantitativa de los ligandos tratados.
13. Uso, según la reivindicación 12, en el que
los ligandos son ácidos nucleicos, los constituyentes estructurales
y funcionales que permiten tratar los ligandos son constituyentes
que permiten la amplificación de estos ácidos nucleicos, y la
detección cualitativa y/o cuantitativa de los ligandos tratados es
una detección cualitativa y/o cuantitativa de los productos de
amplificación.
14. Uso, según una cualquiera de las
reivindicaciones 12 o 13, en el que se efectúa una última etapa que
consiste en analizar estos ligandos o estos productos de
amplificación, o bien en un nuevo emplazamiento en el interior de
la tarjeta (1), o bien después de la transmisión hacia otro
dispositivo.
15. Uso, según una cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 14, en el que los ligandos o los ácidos
nucleicos capturados están sometidos a al menos un líquido (71) de
lavado previamente a su recogida.
16. Uso, según la reivindicación 15, en el que
la captura y eventualmente el lavado se efectúan N veces
sucesivamente, estando comprendido N entre 1 y 10.
17. Uso, según una cualquiera de las
reivindicaciones 12 ó 13, en el que se detecta un tratamiento de
los ligandos o una amplificación de los ácidos nucleicos
previamente a la transmisión hacia un compartimiento de la tarjeta
(1) o hacia otro dispositivo que permite analizar los ligandos o
los amplicones.
18. Uso, según una cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 16, en el que la tarjeta (1) se usa después
de un aparato que permite tratar una disolución (69) que ha de
probarse, tal como un aparato para lisar células biológicas y
liberar los ligandos, tales como ácidos nucleicos, y antes de un
aparato que permite detectar la presencia de estos ligandos, tal
como un chip de ADN.
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