ES2303058T3 - Un enzima de translocacion como marcador de seleccion. - Google Patents
Un enzima de translocacion como marcador de seleccion. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para la selección de un microorganismo, caracterizado porque (a) se inactiva un gen endógeno presente, que codifica una actividad de translocación esencial y (b) se cura, por medio de un vector, la actividad de translocación esencial, inactivada según (a).
Description
Un enzima de translocación como marcador de
selección.
La presente invención se refiere a un sistema de
selección para microorganismos, que está basado en la inactivación
de un enzima de translocación esencial y en la curación de esta
inactivación por medio de un factor equivalente que se pone a
disposición de las células correspondientes por medio de un
vector.
En la actualidad se obtienen por medio de la
fermentación de microorganismos, aquellas proteínas que son
requeridas en grandes cantidades y, entre éstas, especialmente los
enzimas para los campos de aplicación industrial. Frente a tales
microorganismos, que forman, de manera natural, las proteínas
interesadas, adquieren cada vez mayor significado las cepas de
productores genéticamente modificados. Tales procedimientos de
ingeniería genética para la obtención de proteínas están
establecidos desde hace mucho tiempo en el estado de la técnica. El
principio correspondiente consiste en los genes para las proteínas
interesadas se incorporan en las células huésped como transgenes,
son transcritos por las mismas, traducidos y, en caso dado, son
secretados a través de las membranas correspondientes en el
periplasma, o bien en el medio circundante. Por lo tanto pueden ser
obtenidos a partir de las células correspondientes o bien de los
sobrenadantes de cultivo correspondientes.
En los procedimientos industriales para la
obtención de proteínas se utilizan, en primer lugar, las capacidades
naturales de los microorganismos, empleados para la producción,
para la síntesis y, en caso dado, para la secreción de las
proteínas. Básicamente, se elegirán como sistemas bacterianos para
la obtención de las proteínas, aquellos que sean de fermentación
económica, que prometan, desde un inicio, una elevada tasa de
formación de producto y que garanticen un plegamiento, una
modificación, etc. correctos de la proteína que debe ser preparada;
esto último es tanto más probable a medida que aumenta el parentesco
con el organismo originalmente productor de la proteína interesada.
Las células huésped, establecidas de manera especial para esta
finalidad, son las bacterias gramnegativas, tales como por ejemplo
Escherichia coli o Klebsiella, o las bacterias
grampositivas, tales como, por ejemplo, las especies de los géneros
Staphylococcus o Bacillus.
La economía de un procedimiento biotecnológico
depende, de manera esencial, del rendimiento en proteína alcanzable.
Este rendimiento está determinado, junto con el sistema de
expresión empleado para el procedimiento utilizado, de manera
especial por los parámetros de la fermentación y por los substratos.
Mediante la optimización del sistema de expresión y del proceso de
fermentación pueden acrecentarse claramente el potencial de un
organismo de producción y el rendimiento que puede ser
alcanzado.
Por otra parte, se desarrollan y se perfeccionan
sistemas de expresión esencialmente a base de dos construcciones
genéticas básicamente diferentes. Por un lado se integra el gen de
la proteína, que debe ser preparada, en el cromosoma del organismo
huésped. Tales constructos son muy estables sin selección con
respecto a la presencia de un gen marcador adicional (véase más
adelante). El inconveniente consiste en que únicamente está presente
en el huésped una copia del gen y en que es muy costosa, desde el
punto de vista de la metodología, la integración de otras copias
para aumentar la tasa de formación del producto mediante el efecto
de dosificación génica. A continuación se ha ilustrado brevemente
este estado de la técnica.
La patente europea EP 284126 B1 resuelve el
problema de una integración múltiple estable mediante la inserción
de varias copias génicas en la célula, que contienen entremedias
segmentos de ADN endógenos y, esencialmente, cromosómicos.
Otra solución para la integración múltiple
estable ha sido divulgada en la solicitud de patente WO 99/41358
A1. Según esta publicación, se integran dos copias del gen
interesado en sentidos de transcripción opuestos y se separan entre
sí por medio de un segmento de ADN no esencia, para impedir, de este
modo, la recombinación homóloga de ambas copias.
Se desprende por la solicitud de patente DD
277467 A1 un procedimiento para la obtención de enzimas
extracelulares, que está basado en la integración estable,
ventajosamente múltiple, en el cromosoma bacteriano del gen que
codifica el enzima interesado. La integración se lleva a cabo a
través de las regiones homólogas. Un gen de eritromicina, contenido
en el plásmido, que se inactiva cuando la integración tenga éxito,
sirve para controlar los acontecimientos de integración, que hayan
tenido éxito.
De conformidad con la publicación DE 4231764 A1
puede llevarse a cabo la integración en el cromosoma a través de un
entrecruzamiento sencillo o doble por medio del gen para la
timidilato-sintetasa. Éste último permite el
control de este modo de proceder puesto que se mantiene la actividad
thy en el caso de un entrecruzamiento sencillo, mientras que
se pierde en el caso de un entrecruzamiento doble, es decir que de
este modo se consigue una auxotrofia. En este sistema especial va
acompañado un entrecruzamiento sencillo por una resistencia contra
el antibiótico constituido por la trimetoprima, y por una
sensibilidad correspondiente en el caso de un entrecruzamiento
doble.
En la solicitud WO 96/23073 A1 se divulga un
sistema basado en transposon, para la integración de varias copias
de un gen interesado en el cromosoma bacteriano, caracterizado
porque el gen marcador del plásmido se somete a deleción por medio
de la integración y, de este modo, las cepas obtenidas están exentas
de un marcador de resistencia. Asimismo, según esta publicación,
únicamente se requiere un marcador para el control de la
construcción de la cepa bacteriana correspondiente.
De la misma manera, se divulga en la solicitud
WO 01/90393 A1 un sistema para aumentar el número de copias de
determinados transgenes, integrados en un cromosoma bacteriano.
El segundo postulado para la construcción de
cepas productoras consiste en transferir el gen interesado a un
elemento de replicación autónoma, por ejemplo un plásmido y, de este
modo, efectuar su transferencia hasta el organismo huésped. De
manera ventajosa se provoca en este caso el número usualmente
elevado de copias de plásmidos por célula mediante el efecto de
dosificación génica. Constituye un inconveniente el hecho de que
tenga que ejercerse una presión de selección durante de todo el
tiempo necesario para el cultivo, para mantener los plásmidos en
las células. Esto se lleva a cabo, de manera normalizada, a través
de la adición de antibióticos en el medio de cultivo, mientras que
los genes, que proporcionan resistencia contra la substancia
correspondiente, se presentan sobre los plásmidos. De este modo,
serían susceptibles de crecimiento únicamente las células, que
tengan los plásmidos en un número suficiente.
El empleo de substancias resistentes a los
antibióticos como marcadores de selección se enfrenta, en los
últimos años, a una crítica creciente. Por un lado, el empleo de
antibióticos es realmente costoso, especialmente cuando la
resistencia esté basada en un enzima que degrade al antibiótico y,
por lo tanto, tenga que aportarse la substancia correspondiente
durante todo el proceso de cultivo. Por otro lado su empleo cada vez
más extendido, especialmente en otros campos industriales,
contribuye a la propagación de genes resistentes en otras cepas,
incluso en otras cepas patológicas. Esto conduce, por ejemplo, en la
higiene medicinal y, de manera especial, en el caso del tratamiento
de enfermedades infecciosas, ya a considerables dificultades debidas
a las denominadas cepas humanopatógenas multirresistentes.
Por lo tanto, se utilizan en grandes cantidades
los sistemas precedentemente ilustrados para la integración estable
de genes en el cromosoma de las células productoras, puesto que
éstas son estables sin una presión de selección permanente. Desde
luego, tal como se ha indicado precedentemente, las cepas
correspondientes únicamente pueden obtenerse por medio de un gran
coste. En la práctica biotecnológica es más rápido y es más cómodo
introducir en las células huésped un gen, por ejemplo, recién
encontrado o modificado, en un plásmido con marcador de selección y
llevar a cabo su expresión de este modo.
En el estado de la técnica se han desarrollado,
entre tanto, también sistemas de selección exentos de antibióticos.
De este modo, se describen, por ejemplo, en la publicación
"Transposon vectors containing non-antibiotic
resistance selection markers for cloning and stable chromosomal
insertion of foreign genes in gram-negative
bacteria" de Herrero et al. (1990), en J. Bacteriol.,
tomo 172, páginas 6557-6567, resistencias contra
herbicidas y contra metales pesados como marcadores de selección.
Sin embargo, contra el empleo de estos compuestos hablan los mismos
reparos que en el caso de los antibióticos.
En principio la selección funciona, por ejemplo,
de manera similar a como lo hace una selección con antibiótico,
mediante la auxotrofia, es decir mediante un efecto metabólico
específico, que hace que las células correspondientes sean
dependientes del aporte de determinados productos del metabolismo.
Las cepas auxotrofas contienen entonces un transgen, acoplado con
el transgen interesado, que cura esta auxotrofia. En caso de
pérdida, éstos perderían simultáneamente su capacidad de
supervivencia bajo las condiciones de cultivo correspondientes de
tal manera, que se produciría una selección deseada de las cepas
productoras auxotrofas. De esta manera, se hace referencia, por
ejemplo, en la página 148 de la publicación "Gene cloning in
lactic streptococci" de de Vos en Netherlands Milk and Dairy
Journal, tomo 40, (1986), páginas 141-154, a
diversos marcadores de selección, desarrollados a partir del
metabolismo de Lacto-Streptococci; entre los cuales
se encuentran los que proceden del metabolismo de la lactosa, los
que son resistentes al cobre y los genes resistentes frente a
diversas bacteriocinas de Lacto-Streptococci. La
patente EP 284126 B1, que se ocupa del problema de la integración
estable de genes interesados en cromosomas bacterianos (véase más
arriba), reúne los posibles sistemas para la selección, de
auxotrofia, resistencia contra los biocidas y resistencia contra las
infecciones víricas en la página 7 bajo el concepto de "selección
de supervivencia". Como ejemplos de marcadores de selección por
auxotrofia se indican en este caso los genes del metabolismo
leu, his, trp "o similares"; evidentemente
quieren indicarse los que proceden de vías de síntesis de
aminoácidos.
Sin embargo, el empleo de tales auxotrofias se
configura en la práctica, hasta ahora, muy problemático puesto que
están disponibles casi todos los substratos necesarios en cantidades
suficientes, especialmente, en los medios industriales de
fermentación y las células correspondientes pueden compensar la
carencia para la síntesis de un compuesto determinado mediante la
absorción de este compuesto a partir del medio nutriente.
Hasta el presente constituye una excepción,
únicamente, la timidina esencial, que está presente, tan solo, en
trazas en los medios de fermentación industriales y, por lo tanto,
tiene que ser formada por los organismos - proliferantes y, por lo
tanto, sintetizadores de ADN - a través de una
timidilato-sintasa. De este modo, la solicitud EP
251579 A2 ofrece la solución de emplear como células huésped
aquellas que sean deficientes en timidilato-sintasa
en lo que se refiere al gen esencial para el metabolismo del
nucleótido. Por lo tanto, puede ponerse a disposición el gen
precisamente para esta función (thyA procedente de
Escherichia coli K12) a través de un vector y puede curarse
el defecto génico. Cuando este vector porte, adicionalmente, el gen
para la proteína interesada, se producirá una selección de las
células productoras, similar a la que se lleva a cabo con los
antibióticos.
En resumen, debe observarse que existe en el
estado de la técnica ciertamente una gran experiencia en lo que se
refiere a la producción biotecnológica de proteínas y que puede
controlarse de manera específica la expresión de los genes
interesados mediante la integración cromosómica y la selección por
medio de antibióticos, sin embargo no existe prácticamente ninguna
alternativa practicable hasta ahora para estos dos sistemas,
especialmente no existe ninguna alternativa que sea menos costosa
que la integración cromosómica y que, al mismo tiempo, pueda
llevarse a cabo sin la selección por medio de un compuesto caro o
cuestionable desde el punto de vista ecológico. De manera especial,
el postulado de la selección a través de marcadores de auxotrofia ha
conducido, hasta ahora, únicamente a resultados muy exiguos en lo
que se refiere a los medios nutrientes complejos usuales, en
general, en la industria.
Por lo tanto, se plantea la tarea de desarrollar
un nuevo sistema de selección, que pueda manipularse de una manera
comparativamente más sencilla que la selección a través de un
antibiótico, pero que pueda realizarse, sin embargo, sin
substancias caras y, en ciertas circunstancias, dañinas para el
medio ambiente. El sistema debería poderse emplear a escala
industrial. No debería estar formado sobre un gen esencial, cuyos
fallos puedan ser compensados por los productos acompañantes en los
medios industriales.
Esta tarea se resuelve, de conformidad con la
invención, mediante procedimientos para la selección de un
microorganismo, caracterizados porque
- (a)
- se inactiva un gen endógeno presente, que codifique una actividad de translocación esencial y
- (b)
- se cura, por medio de un vector, la actividad de translocación esencial, inactivada según (a).
De manera sorprendente, se ha descubierto que
los factores esenciales, que participan en la translocación, son
adecuados para una selección. De conformidad con la invención, sirve
para la selección un gen, cuya proteína derivada participa en la
translocación de la proteína como un factor esencial para la célula
correspondiente. Esto significa que la eliminación de este gen es
letal y, por lo tanto, posibilita una selección de los
microorganismos similar a la que se lleva a cabo con un
antibiótico.
Este sistema de selección actúa sin aditivos
(tales como, por ejemplo, los antibióticos establecidos en el
estado de la técnica) y funciona, en principio, independientemente
de la composición de los medios nutrientes. Con esta finalidad se
requiere una modificación biológica molecular de los microorganismos
correspondientes, que se describe después de las explicaciones
relativas a la translocación y que puede verse en los ejemplos de
la presente solicitud.
El proceso de translocación consiste en la
secreción de las proteínas formadas por las bacterias en el
periplasma (en el caso de bacterias gramnegativas), o bien en el
medio circundante (tanto en el caso de las bacterias gramnegativas
así como, también, en el caso de las bacterias grampositivas). Ésta
se ha descrito, por ejemplo, en el artículo de A.J. Driessen
(1994): "How proteins cross the bacterial cytoplasmic membrane"
en J. Membr. Biol., 142 (2), páginas 145-59. El
aparato de secreción, necesario con esta finalidad, está constituido
por una serie de proteínas diferentes, fundamentalmente asociadas a
la membrana, que se han mostrado en la figura 1 de la presente
solicitud. A éstas pertenecen, de manera especial, las proteínas que
están perfectamente caracterizadas, por ejemplo, para Bacillus
subtilis constituidas por SecA, SecD, SecF (en conjunto como
complejo SecDF), E, G e Y (van Wely, K.H., Swaving, J., Freudl, R.,
Driessen, A.J. (2001): "Translocation of proteins across the cell
envelope of Gram-positive bacteria", FEMS
Microbiol Rev. 2001, 25(4), páginas 437-54).
Otros factores que pueden asociarse a este sistema son YajC, que
entra también en contacto directo con el complejo Sec, y los
factores que pueden reconocerse también en la figura 1 Bdb (Dsb),
SPasa (para "peptidasa señal"), PrsA y b-SRP
(Ffh, Ffs/Scr, SRP-RNA).
El factor, que ha sido citado en último lugar,
está constituido por el factor bacteriano, que ejerce, en principio,
la misma función que la SRP (partícula de reconocimiento de señal
-signal recognition particle-) descrita originalmente en
eucariotas. Una subunidad del mismo es el factor Ffh, que está
caracterizado tanto a partir de B. subtilis así como,
también, a partir de E. coli. La subunidad siguiente de
b-SRP se llama Scr en B. subtilis y Ffs en
E. coli. De igual modo un ARN (SRP-ARN) forma
parte del complejo funcional b-SRP. Otro factor
funcional, emparentado con el anterior se denomina Srb en E.
coli y FtsY en B. subtilis. Éste corresponde desde el
punto de vista funcional a la proteína de acople eucariota.
En otro contexto debe incluirse por ejemplo
también el factor PrfB (factor B de desprendimiento de la cadena
peptídica -peptide chain release factor B-; denominado también RF2).
Éste es conocido por formar parte integrante del aparato para la
síntesis de proteínas y, concretamente, tanto en el caso de las
bacterias gramasí como, también, en el caso de las bacterias
gramnegativas. Éste es responsable, en relación con la traducción,
especialmente para el desprendimiento de las proteínas traducidas,
acabadas, del ribosoma, es decir que es responsable de la
terminación de la traducción. La relación con la translocación
precedentemente descrita está únicamente dada de manera indirecta,
puesto que el gen prfB se transcribe en muchas bacterias
simultáneamente con el gen para el factor SecA. Por lo tanto existe
una relación reguladora.
La condición previa para la translocación
consiste en que la proteína, que debe ser retirada, disponga en el
extremo N de un péptido señal (Park, S., Liu, G., Topping, T.B.,
Cover, W.H., Randall, L.L. (1988): "Modulation of folding
pathways of exported proteins by the leader sequence", Science,
239, páginas 1033-5). Esto es válido tanto para las
proteínas extracelulares así como, también, para las proteínas de la
membrana.
Una vez verificada con éxito la traducción en
los ribosomas, se mantiene en un estado no plegado la cadena
peptídica formada, mediante proteína citoplasmática con función de
chaperona, y es transportada hasta la membrana. A continuación se
cataliza el transporte del péptido a través de la membrana bajo
consumo de ATP (Mitchell, C., Oliver, D. (1993): "Two distinct
ATP-binding domains are needed to promote protein
export by Escherichia coli SecA ATPase", Mol. Microbiol.,
10(3), páginas 483-97). La SecA actúa en este
caso como componente suministrador de energía (ATPasa) del complejo
multienzimático translocasa. Una vez atravesada la membrana, se
corta el péptido señal por medio de la actividad de una peptidasa
señal y, de este modo, se desprende de la membrana la proteína
extracelular. En el caso de las bacterias grampositivas se lleva a
cabo de este modo la descarga de la exoproteína directamente en el
medio circundante. En el caso de las bacterias gramnegativas las
proteínas se encuentran, a continuación, por regla general en el
periplasma y son necesarias otras modificaciones para conseguir su
liberación en el medio circundante.
Una investigación novedosa de B.v.d.Berg et
al. (2004; Nature, tomo 427, páginas 36 hasta 44) describe la
estructura a los rayos X de la translocasa, es decir del complejo
SecY procedente de Methanococcus jannaschii como modelo para
el complejo correspondiente en otros organismos.
La molécula central de este proceso es, por lo
tanto, la preproteína-translocasa, constituida por
las subunidades SecA, SecY, SecE, SecD, SecF (SecDF) y SecG. En
este caso, tiene una función decisiva para la translocación el
factor SecA en todas las ATPasas, que controlan este proceso. Las
formas preferentes de realización de la presente invención están
caracterizadas por estos factores (véase más adelante).
En la tabla 1 siguiente se han enumerado los
factores conocidos hasta ahora, que participan en la translocación
y han sido detallados con relación a si son esenciales en uno o en
ambos organismos modelo constituidos por Escherichia coli
(gramnegativo) y Bacillus subtilis (grampositivo). Tan pronto
como sea esencial uno de los mismos en el correspondiente organismo
considerado, será adecuado para la selección de conformidad con la
invención. Básicamente se supondrá que existe un modelo
correspondiente también en otros organismos, especialmente en las
bacterias gramnegativas y en las bacterias grampositivas.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Así pues, puede seleccionarse, de conformidad
con la invención, en bacterias gramnegativas, especialmente en
bacterias coliformes, de manera muy especial en E. coli, por
medio de los siguientes enzimas de translocación o bien por medio
de sus genes correspondientes: SecA, SecY, SecE, SecD, SecF,
peptidasa señal, b-SRP (Ffh o Ffs), Srb o YajC.
Así pues, puede seleccionarse, de conformidad
con la invención, en bacterias grampositivas, especialmente en
Bacillus, de manera muy especial en B. subtilis, por
medio de los siguientes enzimas de translocación o bien por medio
de sus genes correspondientes: SecA, SecY, SecE,
b-SRP (Ffh o Scr), FtsY o PrsA.
En estas enumeraciones no debe entenderse que
está excluido en enlace alternativo. Desde el punto de vista
industrial debería ser posible desconectar simultáneamente también
varios de los genes correspondientes. De conformidad con la
invención es suficiente, sin embargo, elegir para esta finalidad
únicamente uno de ellos.
Las secuencias individuales respectivas de los
genes correspondientes pueden ser obtenidas, por ejemplo, a partir
de los bancos de datos siguientes, que son accesibles al público:
GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI,
National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA;
http://www3.ncbi.nlm.nih.gov); EMBL-European
Bioinformatics Institute (EBI) en Cambridge, Gran Bretaña
(http://www.ebi.ac.uk); Swiss-Prot (Geneva
Bioinformatics (GeneBio) S.A., Ginebra, Suiza;
http://www.genebio.com/sprot.html); "Subtilist" o
"Colibri" del Institut Pasteur, 25,28 rue du Docteur Roux,
75724 Paris CEDEX 15, Francia para genes y factores procedentes de
B. subtilis o bien de procedentes de E. coli
(http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/ y respectivamente
http://genolist.pasteur.fr/Colibri/). De la misma manera, pueden
utilizarse los bancos de datos, que pueden ser visitados por medio
de las referencias cruzadas en los bancos de datos citados. De
conformidad con la invención, es necesario respectivamente
identificar tan sólo un solo gen esencial del aparato de
translocación en la cepa considerada para el cultivo y aplicarlo de
manera correspondiente.
Otro punto de partida proporciona las secuencias
para el factor SecA procedente de diversos microorganismos, que
están dadas en el protocolo de secuencias para la presente
solicitud. Éstas pueden emplearse bien directamente (véase más
adelante: formas de realización preferentes) o pueden emplearse para
identificar el homólogo correspondiente en una genoteca, que se ha
establecido previamente para el microorganismo interesado.
En primer lugar se entenderán por estos enzimas
de translocación o factores de translocación las moléculas de tipo
silvestre. Sin embargo, en tanto en cuanto sea posible la
preparación de variantes de los mismos, que dispongan en el aparato
de translocación, de la misma función, en principio, que el enzima
de tipo silvestre, quedarán abarcados en el alcance de la
protección los sistemas de selección basados en los mismos.
Para la realización de la presente invención
tiene que verificarse con respecto a la cepa que se trata de
cultivar, en tanto en cuanto no pertenezca a una de las especies
ensayadas en la presente solicitud, si es esencial al menos uno de
estos factores. Esto es posible por ejemplo, en el caso más
sencillo, retirándose uno de estos genes conocidos de una cepa tan
emparentada como sea posible (por ejemplo una bacteria también
gramnegativa o respectivamente grampositiva) o sintetizándose por
medio de una inscripción en un banco de datos accesible al público
y efectuándose su introducción en un vector desactivado
(knock-out). Una forma de proceder de este tipo es
conocida por el técnico en la materia. Si las transformaciones de
este gen, realizadas con este vector y una recombinación homóloga
subsiguiente - de manera preferente introducida por separado de la
transformación - gen tienen un efecto letal en el genoma de la
célula huésped, deberá tratarse como esencial el gen considerado.
Este gen, reconocido como esencial, puede emplearse ahora como
marcador de selección de conformidad con la invención y, de manera
especial, según el modelo de los ejemplos de la presente
solicitud.
A título de ejemplo, se lleva a cabo una
inactivación, necesaria según la característica (a), por medio de
la recombinación homóloga de una copia génica inactivada, que haya
sido introducida por ejemplo mediante la transformación con un
vector correspondiente en una célula de la cepa del microorganismo
interesado. Los métodos para esta finalidad son en sí conocidos.
Como resultado del acontecimiento de recombinación se somete a
deleción total o parcial a la copia cromosómica del gen y, de este
modo, es inoperante. Esto puede llevarse a cabo, por ejemplo, a
través del mismo gen, con el cual se haya llevado a cabo previamente
el ensayo sobre la letalidad. De manera preferente, se empleará sin
embargo, en tanto en cuanto sea conocido o pueda aislarse con un
coste aceptable, el homólogo endógeno para conseguir una elevada
cuota de éxito para la recombinación. Lo decisivo para la
realización de la invención consiste en que la inactivación sea
realizada con éxito.
Este concepto puede realizarse, por ejemplo, con
vectores plásmidos, que tengan un origen de replicación sensible a
la temperatura y hayan sido insertados en las regiones de ADN
homólogas, consideradas, consideradas, del gen que debe ser
sometido a deleción (vector de deleción). Podría imaginarse, por
ejemplo, también una inactivación reversible, por ejemplo mediante
la integración de un elemento genéticamente móvil, por ejemplo de un
transposon, en el gen diana.
En este caso, debe observarse respectivamente la
característica (b), en concreto que esté disponible en la célula
correspondiente una copia intacta del gen elegido para la selección
de conformidad con la invención, ya como paso previo a este
episodio de recombinación o bien de este episodio de inactivación o,
como más tarde, simultáneamente con el mismo, puesto que la célula
no sobreviviría en otro caso la inactivación. De conformidad con la
invención, el defecto formado es compensado por medio de un vector,
es decir que el vector cura la inactivación. En este caso se
emplearán, como se ha indicado precedentemente, de manera preferente
los genes endógenos presentes en las células huésped y sometidos a
deleción según (a). De igual modo, pueden emplearse genes con la
misma función procedentes de otros organismos, de manera preferente
cepas emparentadas, en tanto en cuanto sean capaces de curar el
defecto correspondiente. Así pues, es posible, por ejemplo, curar el
defecto de SecA de un B. subtilis mediante la preparación de
un gen secA de Staphylococcus camosus.
De igual modo, podría imaginarse aplicar en la
célula, a través del vector, otro elemento genético que elimine el
primer defecto, por ejemplo el gen de un factor funcionalmente
idéntico en principio, pero modificado por mutación.
Por lo tanto, en esta célula reina una situación
tal, que se compensa un defecto letal por medio de un elemento
genético separado. De igual modo una pérdida de este elemento
genético separado sería letal de tal manera que una célula de este
tipo está obligada a transmitir este elemento a la generación
siguiente en cada división celular.
Esto es útil en la característica (c), en una
forma preferente de realización (véase más adelante), según la cual
el vector, que compensa el defecto génico, porta el transgen,
precisamente el gen para la proteína interesada, que debe ser
preparado por medio del procedimiento según la invención.
En cierta medida, reina una presión de selección
endógena sin que sea necesaria la adición de un compuesto de otro
tipo desde el exterior, es decir a través del medio nutriente, por
ejemplo de un metal pesado o de un antibiótico para impedir la
pérdida del vector con el transgen. Por otra parte, quedan
eliminadas las modificaciones costosas, descritas al principio,
para integrar al transgen propiamente dicho en el ADN cromosómico.
De este modo, pueden emplearse para transformaciones, siempre
nuevas, con vectores formados de manera similar, por ejemplo una
cepa de microorganismos generada una vez, que haya sido preparada
para una inactivación definida del aparato de translocación, cuyos
vectores pongan a disposición de las mismas, en cada caso, la
función que cura el defecto génico, pero que porten en cada caso
transgenes diferentes. De esta manera, se dispone de un sistema de
selección muy práctico y que puede emplearse de múltiples
maneras.
El sentido del procedimiento de selección, de
conformidad con la invención, consiste en obtener en la célula un
elemento genético estable a través de varias generaciones. Este
elemento es precisamente el vector, a través del cual se compensa
la inactivación de la actividad esencial de translocación, es decir
que es curada.
En una forma preferente de realización, los
procedimientos de selección, de conformidad con la invención, se
caracterizan porque
- (c)
- el vector según (b) porta un transgen.
Éste es, precisamente, el campo de aplicación
industrial más importante de los sistemas de selección. El elemento
genético, estable a través de varias generaciones, es entonces aquél
que porta un transgen, especialmente aquél cuyo producto génico es
de interés comercial. Formas preferentes de realización a este
respecto se explican más adelante.
En las formas preferentes de realización, un
procedimiento de selección, de conformidad con la invención, se
caracteriza porque la actividad de translocación esencial está
constituida por uno de los factores siguientes: SecA, SecY, SecE,
SecD, SecF, peptidasa señal, b-SRP (Ffh o Ffs /
Scr), FtsY / Srb, PrsA o YajC.
Precisamente, como se han agrupado en la tabla
1, estos factores y respectivamente los genes correspondientes
están constituidos por aquellos, que se sabe que son esenciales,
bien procedentes de E. coli o procedentes de B.
subtilis. Por lo tanto, es evidente que puede establecerse un
sistema de selección, de conformidad con la invención, mediante los
homólogos correspondientes, especialmente en estos dos organismos o
incluso en especies emparentadas o incluso en especies menos
emparentadas. Puesto que se sabe, que incluso algunos de estos
genes individuales pueden substituir la función correspondiente a
través del otro organismo correspondiente, es decir a través de los
límites gramnegativo/grampositivo, deberían poderse emplear, de
conformidad con la invención, al menos algunos de los genes
correspondientes individuales incluso procedentes de especies sólo
lejanamente emparentadas.
De manera preferente, la actividad de
translocación esencial está constituida por una de las siguientes
subunidades de la preproteína-translocasa: SecA,
SecY, SecE, SecD o SecF, de manera preferente se trata de la
subunidad SecA.
Precisamente, estos factores representan, como
se ha mostrado en la figura 1, en cierta medida el núcleo funcional
del aparato de translocación. Con relación al SecA se ha indicado
más arriba que este factor ejerce una posición clave importante a
través de la actividad ATPasa. Por este motivo se ha aplicado la
invención también en los ejemplos de la presente solicitud por
medio del gen secA.
De manera preferente, los procedimientos de
selección, de conformidad con la invención, se caracterizan porque
la curación según (b) se lleva a cabo a través de una actividad
equivalente a la actividad de translocación esencial existente de
manera endógena, inactivada, preferentemente por medio de una
actividad genéticamente emparentada, de forma especialmente
preferente por medio de la misma actividad.
Aquí se pone nuevamente de manifiesto, que
pueden ser empleados de manera prometedora de éxito los genes
correspondientes procedentes de especies menos emparentadas, debido
a los elevados valores de homología generales entre las especies
para los factores correspondientes. Sin embargo son preferentes,
evidentemente, los que procedan de especies más emparentadas y, de
forma muy preferente, los que procedan de los mismos organismos,
puesto que éstos son los más prometedores de éxito en lo que se
refiere al necesario entre cruzamiento para la inactivación. Una
vez más debe ponerse de manifiesto, que únicamente es suficiente un
solo gen adecuado para la inactivación con el fin de realizar una
selección de conformidad con la invención.
Tal como ya se ha indicado precedentemente, las
secuencias de ADN y de aminoácidos correspondientes pueden ser
obtenidas a partir de bancos de datos accesibles al público. De este
modo, las secuencias que han sido indicadas por ejemplo en el
protocolo de secuencias bajo SEQ ID NO. 1 y 2 para la proteína SecA
procedente de B. subtilis se ha tomado del banco de datos
"Subtilist" del Institut Pasteur (véase más arriba) (situación
a: 3.2.2003); éstas son idénticas a las de
Swiss-Prot (véase más arriba), que han sido
depositadas allí bajo el número de acceso P28366.
Las secuencias, indicadas en el protocolo de
secuencias bajo SEQ ID NO. 3 y 4, para la proteína SecA procedente
de E. coli procedente del banco de datos "Colibri" del
Institut Pasteur (véase más arriba; situación a: 3.2.2003); éstas
son idénticas a las de Swiss-Prot (véase más
arriba), que pueden ser consultadas en el mismo bajo el número de
acceso P10408.
Las SEQ ID NO. 5 y 6 para B.
licheniformis se obtuvieron, como se ha descrito en el ejemplo 1
de la presente solicitud, a partir de la cepa B.
licheniformis (DSM13) que puede ser adquirida en el comercio
(Colección Alemana de Microorganismos y de Cultivos Celulares
-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH-,
MascheroderWeg 1b, 38124 Braunschweig;
http://www.dsmz.de).
Puesto que las especies Bacillus subtilis,
Escherichia coli y Bacillus licheniformis constituyen los
microorganismos empleados más frecuentemente en la industria, es
especialmente importante proporcionar un procedimiento de
conformidad con la invención para estas bacterias. Con el protocolo
de secuencias de la presente solicitud se ponen a disposición los
genes secA homólogos procedentes de estos tres organismos,
que son los más importantes, sin que tengan que ser aislados para
la elaboración final. Mediante estos genes es posible, por ejemplo,
identificar los homólogos correspondientes en otros microorganismos,
por ejemplo mediante la preparación de una genoteca y el cribado
con uno de estos genes a título de sonda. Sin embargo, pueden
emplearse de manera especial en especies emparentadas también estos
genes propiamente dichos para una inactivación de conformidad con
la invención.
Por lo tanto, las formas de realización
preferentes se caracterizan porque se lleva a cabo la curación según
(b) mediante las regiones del gen secA, que restablecen la
actividad de translocación, procedente de Bacillus subtilis,
Escherichia coli o de Bacillus licheniformis, que se han
indicado en el protocolo de secuencias bajo SEQ ID NO. 1, SEQ ID
NO. 3 o bien SEQ ID NO. 5.
De la misma manera, los procedimientos
preferentes se caracterizan porque la inactivación se lleva a cabo,
según (a), de tal manera, que se impida una recombinación entre la
región génica inactivada, según (a), y la región homóloga sobre el
vector, según (b), de manera preferente con pérdida completa de un
segmento génico contenido en el gen cromosómico
correspondiente.
Precisamente, cuando el vector estuviese
integrado en el cromosoma de la célula huésped, se curaría de manera
duradera la mutación letal sin que existiese al mismo tiempo una
presión de selección sobre el vector correspondiente. De este modo
podría perderse el transgen interesado propiamente dicho a través de
la división celular subsiguiente. Esto impide una amplia deleción
durante la etapa de inactivación (a).
En el estado de la técnica se han descrito
procedimientos para la inactivación de genes por medio de un vector
de deleción, especialmente en la publicación "Genetic manipulation
of Bacillus amyloliquefaciens" de J.Vehmaanperä et
al. (1991) en J. Biotechnol., tomo 19, páginas
221-240. Por medio de esta descripción pudo llevarse
a cabo con éxito en el ejemplo 3 la deleción del gen secA de
B. licheniformis. El origen de la replicación de este vector
de deleción se caracteriza por su dependencia de la temperatura.
De este modo es posible, de una manera
especialmente fácil, efectuar la selección, en primer lugar a
temperatura más baja, para obtener una transformación con éxito y,
a continuación, ejercer una presión de selección mediante el
aumento de la temperatura para conseguir una integración con éxito,
es decir una inactivación del gen endógeno. De manera análoga,
sería posible por ejemplo también una construcción para el control
mediante la adición de compuestos de bajo peso molecular.
Los procedimientos preferentes, de conformidad
con la invención, se caracterizan, por lo tanto, porque la
inactivación, según (a), se lleva a cabo por medio de un vector de
deleción, preferentemente por medio de un vector de deleción con un
origen de replicación regulable de manera externa, de manera
especialmente preferente por medio de un vector de deleción con un
origen de la replicación en función de la temperatura.
Tal como se ha indicado más arriba, es posible,
en principio, que se integre en el cromosoma bacteriano el vector
de curación, según (b), con inclusión del transgen. Puesto que, sin
embargo, por este motivo existe el peligro de que el transgen se
pierda en esta ocasión de manera duradera, los procedimientos
preferentes se caracterizan porque el vector según (b) está
constituido por un plásmido, que se replica de manera autónoma en
el microorganismo. Éste se establece entonces en la línea celular
derivada.
Es especialmente ventajoso que el plásmido esté
constituido por un plásmido que se establezca con un número
repetido de copias (por ejemplo entre 2 y 100 plásmidos por célula),
de manera preferente con un número múltiple de copias (por encima
de 100 plásmidos por célula). Precisamente, cuanto mayor sea el
número de plásmidos presentes tanto mayor podrá será el éxito
alcanzado con la curación. De la misma manera, esto aumenta los
rendimientos alcanzables en este producto mediante el efecto de
dosificación génica en el caso en que el vector porte un transgen
que codifique una proteína interesada.
\newpage
Como consecuencia del gran significado de las
cepas bacterianas gramnegativas, especialmente en la clonación y en
la caracterización de genes o bien de productos génicos, los
procedimientos de selección preferentes se caracterizan porque el
microorganismo está constituido por una cepa de bacterias
gramnegativas.
Bajo este concepto se entenderán de manera
especial aquellos procedimientos, caracterizados porque se trata de
una cepa bacteriana gramnegativa del género E. coli o
Klebsiella, especialmente se trata de derivados de
Escherichia coli K12, de Escherichia coli B o de
Klebsiella planticola, y de una manera muy preferente se
trata de derivados de las cepas Escherichia coli BL21 (DE3),
E. coli RV308, E. coli DH5\alpha, E.coli
JM109, E. coli XL-1 o Klebsiella
planticola (Rf). Precisamente, éstos son los organismos que se
emplean con mayor frecuencia en la biología molecular.
De manera especial, las bacterias grampositivas
tienen un significado especial para la obtención de proteínas por
fermentación. Esto es válido, de una manera especial para las
proteínas secretadas. Por lo tanto, los procedimientos preferentes,
de conformidad con la invención, se caracterizan porque el
microorganismo está constituido por una cepa de bacterias
grampositivas.
Entre éstas se han impuesto, especialmente en la
industria, las cepas de bacterias grampositivas de los géneros
Staphylococcus, Corynebakterien o Bacillus, de manera
especial de las especies Staphylococcus carnosus,
Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B.
amyloliquefaciens, B. globigii o B. lentus, y de manera
muy especial los derivados de las cepas B. licheniformis o
B. amyloliquefaciens, con lo cual éstas caracterizan de
manera correspondiente los procedimientos de selección
preferentes.
Tienen un interés muy especial los
procedimientos, de conformidad con la invención, que estén dirigidos
hacia determinados productos, preparados mediante el cultivo de
microorganismos. De manera correspondiente son preferentes, por lo
tanto, los procedimientos de selección, que se caractericen porque
el transgen según (c) esté constituido por aquél que codifique una
proteína no enzimática, de manera especial que codifique una
proteína relevante desde el punto de vista farmacológico, de manera
muy preferente que codifique insulina o calcitonina.
De igual modo, los enzimas tienen un significado
industrial. Por este motivo se reivindicarán también, de
conformidad con la invención, aquellos procedimientos caracterizados
porque el transgen según (c) esté constituido por aquél que
codifique un enzima, de manera preferente que codifique un enzima
hidrolítico o una oxidorreductasa, de manera especialmente
preferente que codifique una proteasa, una amilasa, una
hemicelulasa, una celulasa, una lipasa, una cutinasa, una oxidasa,
una peroxidasa o una laccasa. A continuación se indican los
representantes productores preferentes de las mismas para el empleo
en los agentes de lavado y de limpieza.
En principio pueden emplearse tales agentes para
aumentar el rendimiento de lavado o bien el rendimiento de limpieza
de todos los enzimas que se han impuesto en el estado de la técnica.
Entre las proteasas son preferentes aquellas del tipo subtilisina,
por ejemplo las proteasas alcalinas procedentes de Bacillus
lentus. Las variantes comercializadas bajo la denominación
BLAP® se derivan de las proteasas procedentes de Bacillus
lentus DSM 5483 (WO 91/02792 A1), que han sido descritas, de
manera especial, en las publicaciones WO 92/21760 A1, WO 95/23221
A1, WO 02/088340 A2 y WO 03/038082 A2. Otras proteasas, que pueden
ser preparadas de conformidad con la invención, procedentes de
diversos Bacillus sp. y B. gibsonii se desprenden de
las solicitudes de patente WO 03/054185 A1, WO 03/056017 A2, WO
03/055974 A2 y WO 03/054184 A1.
Ejemplos de las amilasas, que pueden ser
preparadas de conformidad con la invención, son las
\alpha-amilasas procedentes de Bacillus
licheniformis, procedentes de B. amyloliquefaciens o
procedentes de B. stearothermophilus así como sus
desarrollos perfeccionados especialmente para el empleo en los
agentes de lavado y en los agentes de limpieza. De igual manera
deben señalarse para esta finalidad las
\alpha-amilasas procedentes de Bacillus
sp. A 7-7 (DSM 12368), que han sido divulgadas
en la solicitud WO 02/10356 A2 y la
ciclodextrina-glucanotransferasa (CGTasa)
procedente de B. agaradherens (DSM 9948), que ha sido
descrita en la solicitud WO 02/44350 A2. De igual modo, quedan
considerados los enzimas amilolíticos en el campo de la presente
solicitud, que pertenezcan al campo de secuenciación de las
\alpha-amilasas, que se define en la solicitud WO
03/002711 A2 y que han sido descritas en la solicitud WO 03/054177
A2. De la misma manera quedan incluidos los productos de fusión de
las moléculas citadas, por ejemplo las que están incluidas en la
solicitud DE 10138753 A1.
De conformidad con la invención, pueden
prepararse también lipasas o cutinasas, por ejemplo las lipasas que
pueden ser obtenidas originalmente a partir de Humicola
lanuginosa (Thermomyces lanuginosus), o bien las lipasas
perfeccionadas, especialmente aquellas con el intercambio de
aminoácidos D96L o las lipasas, o respectivamente las cutinasas,
cuyos enzimas de partida hayan sido aislados originalmente a partir
de Pseudomonas mendocina y Fusarium solanii.
De la misma manera, se ha pensado en las
celulasas, especialmente para el tratamiento industrial de artículos
textiles así como también para agentes de lavado, por ejemplo la
endoglucanasa y/o las celobiohidrolasas. Ejemplos de las celulasas,
que pueden ser preparadas también por medio de productores naturales
son aquellas que proceden de Bacillus sp. CBS 670.93 y CBS
669.93, como las que han sido divulgadas en la publicación WO
96/34092 A2. De igual modo, pueden prepararse otros enzimas, de
conformidad con la invención, que quedan reunidos bajo el concepto
de hemicelulasas. A éstas pertenecen, por ejemplo, las mananasas,
las xantanliasas, las pectinliasas (= pectinasas), las
pectinesterasas, las pectatliasas, las xiloglucanasas (= xilanasas),
las pululanasas y las \beta-glucanasas.
De la misma manera pertenecen a los enzimas para
los agentes de lavado y de limpieza las óxidorreductasas, por
ejemplo las oxidasas, las oxigenasas, las catalasas, las
peroxidasas, tales como las halo-peroxidasas, las
cloro-peroxidasas, las
bromo-peroxidasas, las
lignina-peroxidasas, las
glucosa-peroxidasas o las
manganeso-peroxidasas, las dioxigenasas o las
laccasas (las fenoloxidasas, las polifenoloxidasas) o todos los
otros enzimas descritos en el estado de la técnica para este campo
de aplicación.
Tal como ya se ha indicado al principio, la
tarea, en la que está basada la presente invención, se plantea de
una forma especialmente evidente sobre el fundamento de la
fermentación a escala industrial. Precisamente, en este campo se
presentan los inconvenientes, por un lado, de que una selección a
través de antibióticos es cara y, bajo ciertos puntos de vista
medioambientales, es problemática, por otro lado tiene que
compensarse una auxotrofia, basada en un defecto del metabolismo,
debido a la complejidad de los medios industriales.
Así pues, tiene un significado especial la
conversión de un procedimiento de selección de conformidad con la
invención en un procedimiento a escala industrial, por ejemplo para
la obtención de compuestos de bajo peso molecular tales como
antibióticos o vitaminas o, de manera muy preferente, para la
obtención de proteínas.
En el estado de la técnica se conocen, de manera
general, procedimientos para la obtención de una proteína mediante
el cultivo de células de una cepa de microorganismo. Éstos están
basados en que las células, que producen la proteína interesada de
manera natural o después de la transformación con un gen
correspondiente, pueden cultivarse de manera adecuada y pueden ser
estimuladas de manera preferente para la formación de la proteína
interesada.
Otro objeto de la invención consiste, por lo
tanto, en un procedimiento para la obtención de una proteína para
el cultivo de células de una cepa de microorganismo, caracterizadas
por un procedimiento de selección, que ha sido descrito
precedentemente. Con esta finalidad, las formas de realización
descritas más arriba señalan, de manera especial, que el vector de
curación propiamente dicho contiene un transgen y que éste codifica
de manera preferente una proteína no enzimática o codifica un
enzima. Entre éstas deben entenderse, de manera especial, las
proteínas de significación comercial. Así pues se utiliza la
insulina, preparada por vía transgénica, para el tratamiento de la
diabetes y un amplio espectro de enzimas, de proteasas, de lipasas y
de amilasas hasta los enzimas oxidantes se emplean para la
obtención de agentes de lavado y de limpieza.
Como consecuencia de la fácil manipulabilidad
industrial, cuando se preparen el transgen interesado y el gen de
curación sobre un vector, son preferentes aquellos procedimientos de
obtención de proteínas, de conformidad con la invención,
caracterizados porque el transgen según (c) codifique la proteína
preparada por medio de este procedimiento.
En principio, pueden emplearse bacterias sobre
una superficie sólida. Esto tiene un significado especial para
ensayar sus propiedades metabólicas o para el cultivo duradero a
escala de laboratorio. Por el contrario, son preferentes para la
producción de proteínas aquellos procedimientos caracterizados
porque el cultivo de los microorganismos se lleve a cabo en un
medio líquido, preferentemente en un fermentador. Tales técnicas
están ampliamente expandidas en el estado de la técnica y se
mejoran, de conformidad con la invención, precisamente mediante la
transposición a una selección mediante factores de translocación
esenciales.
Tienen un significado especial los
procedimientos para la obtención de proteínas caracterizados porque
la proteína interesada es secretada en el medio circundante.
Precisamente, de este modo, se facilita esencialmente la
elaboración del producto obtenido. Una posible alternativa, de
conformidad con la invención, consiste, sin embargo, en que las
correspondientes células, que preparan la proteína, son sometidas a
digestión después de la producción propiamente dicha y, de este
modo, se obtiene el producto.
En principio se genera una nueva cepa por medio
de cada modificación efectuada por biología molecular sobre un
microorganismo. Por lo tanto, se preparan también nuevas cepas de
microorganismos mediante la realización de la presente invención,
precisamente aquellas que se diferencian de la cepa de partida
(dicho de una manera más exacta: de las células de partida)
mediante la inactivación específica de una actividad de
translocación esencial y su curación mediante la preparación de un
factor de translocación equivalente. Mediante el empleo de un
procedimiento de selección, de conformidad con la invención, se
preparan, por lo tanto, microorganismos novedosos.
En el ámbito de la protección de la presente
solicitud quedan abarcados, por lo tanto, los microorganismos, que
hayan sido obtenidos mediante un procedimiento de selección
precedentemente descrito.
Un aspecto especialmente ventajoso consiste en
que se obtiene una multitud de microorganismos emparentados cuando
se lleve a cabo siempre el mismo tipo de la inactivación y de la
curación preparándose, sin embargo, sobre el vector de curación en
un transgen diferente en cada caso. De este modo, cuando un
procedimiento haya sido aplicado con éxito una vez, podrá
extrapolarse, de este modo, a un gran número de otros problemas de
selección.
Para la realización, de manera especial, de los
procedimientos para la obtención de proteínas, que han sido
descritos precedentemente, es necesario que sea expresado el
transgen. Los microorganismos preferentes, de conformidad con la
invención, están caracterizados de este modo.
Entre éstos son preferentes los microorganismos,
de acuerdo con lo que se ha dicho precedentemente con respecto a la
obtención de las proteínas, caracterizados porque se secreta el
transgen.
De conformidad con lo que se ha dicho
precedentemente, tan solo pueden encontrarse los sistemas de
selección, de conformidad con la invención, si se reconocen como
tales los genes esenciales, que codifiquen actividades de
translocación, mediante los cuales sea posible una selección. Un
empleo, de este tipo, de estos genes no ha sido imaginado hasta el
presente, aún cuando se conoce una pluralidad de los mismos
procedentes de un gran número de microorganismos. Precisamente este
conocimiento es beneficioso para los sistemas de selección de
conformidad con la invención, puesto que, de este modo, pueden
definirse prácticamente genes para todos los microorganismos,
mediante los cuales sea posible una selección correspondiente. Con
esta finalidad únicamente requieren ser inactivados, como se ha
indicado precedentemente, y tienen que ser substituidos en las
células correspondientes por medio de un homólogo funcional.
Por lo tanto, un objeto de la invención consiste
en el empleo de un gen, que codifica una actividad de translocación
esencial, para la selección de un microorganismo, caracterizado
porque
- (a)
- se inactiva esta actividad de translocación esencial, existente de manera endógena en el microorganismo y
- (b)
- se cura, por medio de un vector, la actividad de translocación esencial, inactivada según (a).
Las formas de realización, indicadas a
continuación, de este objeto de la invención son preferentes de
manera correspondiente, de acuerdo con las explicaciones dadas
hasta ahora.
Tiene un interés especial, desde el punto de
vista de la genética molecular y desde el punto de vista industrial,
que este empleo esté caracterizado porque
- (c)
- el vector, según (b), porte un transgen.
Un punto clave de la presente invención está
constituido por aquél empleo correspondiente caracterizado porque
la actividad de translocación esencial esté constituida por uno de
los factores siguientes: SecA, SecY, SecE, SecD, SecF, peptidasa
señal, b-SRP (Ffh o Ffs / Scr), FtsY / Srb, PrsA o
YajC.
En este caso, es preferente aquél empleo que
esté basado en la actividad de translocación esencial de una de las
subunidades siguientes de la
preproteína-translocasa: SecA, SecY, SecE, SecD o
SecF, de manera preferente en la subunidad SecA.
Un empleo ventajoso consiste en que la curación
según (b) se lleva a cabo a través de una actividad equivalente a
la actividad de translocación esencial, presente de manera endógena,
inactivada, de manera preferente a través de una actividad
genéticamente emparentada, de manera especialmente preferente a
través de la misma actividad.
Con esta finalidad, la presente solicitud
proporciona un punto de partida correspondientemente preferente, en
concreto las citadas posibilidades de aplicación, caracterizadas, de
manera especial, porque la curación según (b) se lleva a cabo a
través de la actividad de translocación de las regiones
restablecedoras del gen secA a partir de Bacillus
subtilis, Escherichia coli o de Bacillus licheniformis,
que se han indicado en el protocolo de secuencias bajo SEQ ID NO.
1, SEQ ID NO. 3 o bien SEQ ID NO. 5.
Las aplicaciones, especialmente ventajosas, se
caracterizan porque el vector, según (b), está constituido por un
plásmido que se replica de manera autónoma en el microorganismo.
Otras aplicaciones preferentes se caracterizan
porque el plásmido está constituido por un plásmido que se
establece en varios números de copias, de manera preferente que se
establece en un múltiple número de copias.
Finalmente se lleva a cabo la presente invención
también mediante la preparación de los vectores correspondientes.
En este caso se quiere indicar aquellos vectores que porten un gen
para una actividad de translocación esencial y un transgen capaz de
llevar a cabo la expresión, que, desde luego, no codifique una
resistencia a los antibióticos cuando esté presente como transgen
único.
En el sentido de la presente solicitud, no
constituye una condición industrial la exclusión de genes para una
resistencia a los antibióticos, cuando se trate del transgen único,
además del gen que cura la actividad de translocación esencial,
inactivada de conformidad con la invención. Únicamente debe tenerse
en consideración que éstos hayan sido ya descritos precisamente en
el estado de la técnica en relación con la caracterización de las
proteínas de translocación, que pueden ser empleadas de conformidad
con la invención. Esto comprende, evidentemente, también que hayan
sido secuenciados y clonados y, concretamente, por medio de los
vectores de clonación más ampliamente extendidos en el estado de la
técnica, así como aquellos que contengan como marcadores genes para
una resistencia a los antibióticos. De este modo, son conocidos en
el estado de la técnica, aquellos vectores que contienen únicamente
un gen, que codifica un enzima de translocación esencial y un
marcador de los antibióticos.
\newpage
De acuerdo con lo que se ha descrito
precedentemente, un vector, de conformidad con la invención, se
caracteriza de manera preferente porque el transgen contenido en el
mismo, pensado de manera preferente para la obtención de proteínas,
codifique una proteína no enzimática relevante desde el punto de
vista farmacológico o que codifique un enzima hidrolítico o que
codifique una óxidorreductasa. Éstos se caracterizan porque el gen,
que debe ser expresado está dotado con un promotor que funcione. En
este caso quedan comprendidos en el ámbito de la protección,
evidentemente, todos aquellos constructos, que codifiquen también
factores - eventualmente de interés farmacológico -, que puedan
promover una resistencia a los antibióticos, en tanto en cuanto la
presencia de este vector no sea seleccionada por esta propiedad,
sino que sea seleccionada por la actividad de translocación
esencial.
De acuerdo con las explicaciones
correspondientes al sistema de selección, determinados vectores
representan también formas preferentes de realización de la
presente invención.
A éstas pertenecen los vectores correspondientes
caracterizados porque la actividad de translocación, codificada por
los mismos, es capaz de curar una actividad de translocación
esencial, inactivada, presente de manera endógena en una cepa de
microorganismos, preferentemente por medio de una actividad
genéticamente emparentada, de manera especialmente preferente por
medio de la misma actividad.
De manera más preferente, pertenecen a este
respecto los vectores correspondientes caracterizados porque la
actividad de translocación esencial está constituida por uno de los
siguientes factores: SecA, SecY, SecE, SecD, SecF, peptidasa señal,
b-SRP (Ffh o Ffs / Scr), FtsY / Srb, PrsA o
YajC.
Entre éstos son preferentes aquellos vectores
caracterizados porque la actividad de translocación esencial está
constituida por una de las siguientes subunidades de la
preproteína-translocasa: SecA, SecY, SecE, SecD o
SecF, de manera preferente está constituida por la subunidad
SecA.
De acuerdo con las enseñanzas de la presente
solicitud, los vectores preferentes están caracterizados también
porque la actividad de translocación esencial está constituida por
uno de los genes secA de Bacillus subtilis, Escherichia
coli o de Bacillus licheniformis, que se han indicado en
el protocolo de secuencias bajo SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 3 o bien
SEQ ID NO. 5.
De igual modo, constituye una propiedad
favorable de los vectores, de conformidad con la invención, que
éstos estén constituidos por plásmidos que se repliquen de manera
autónoma en el microorganismo empleado.
En este caso es especialmente ventajoso, de
manera especial, debido al efecto de dosificación génica, que los
plásmidos se caractericen porque estén constituidos en este caso por
plásmidos establecidos con un número repetido de copias,
preferentemente con un número múltiple de copias.
Todas las fases de trabajo de biología molecular
siguen métodos normalizados, como los que se han dado por ejemplo
en el manual de los autores Fritsch, Sambrook y Maniatis
"Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring
Harbour Laboratory Press, New York, 1989, o en obras
especializadas comparables. Se han empleado los enzimas y los
estuches (kits) según las indicaciones del fabricante
correspondiente.
Para la identificación del locus
secA/prfB en B. licheniformis se derivó
mediante RCP una sonda génica por medio de la secuencia conocida
del locus génico prfB-secA de B.
subtilis (banco de datos "Subtilist" del Institut Pasteur,
25,28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX 15, Francia;
http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/; estado a: 16.8.2002). Este
locus génico se ha representado también en la figura 2. La sonda
obtenida tenía una longitud de 3113 bp y comprendía además las
primeras 451 bp de la región del extremo N del gen prfB. A
continuación se someten a digestión preparaciones del ADN
cromosómico de B. licheniformis, que puede adquirirse por
ejemplo en la Colección Alemana de Microorganismos y de Cultivos
Celulares (Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de)
bajo el número de referencia 13, y ADN cromosómico de B.
subtilis, con fines de control, con diversos enzimas de
restricción y se somete a una hibridación de Southern con dicha
sonda. Se identificó un único fragmento con un tamaño aproximado de
5,5 kB en el ADN cromosómico de B. licheniformis, tratado con
el enzima de restricción MunI, mientras que la digestión del
ADN cromosómico de B. subtilis con MunI proporcionó
los fragmentos esperados para B. subtilis.
Se aisló ADN cromosómico de la misma cepa B.
licheniformis, se sometió a digestión preparativa con
MunI y la región de ADN de aproximadamente 5,5 kB se aisló
mediante electrofóresis con el de agarosa y de igual modo se
extrajeron los ácidos nucleicos a partir de la misma con el estuche
que puede ser adquirido en el comercio. La mezcla obtenida de
fragmentos de ADN cortados con MunI se ligaron en los puntos
de corte EcoRI, compatibles con MunI de vector con un
bajo número de copias
(Low-copy-number) pHSG575 (descrito
en la publicación:
"High-copy-number and
low-copy-number vectors for lacZ
alpha-complementation and chloramphenicol- or
kanamycin-resistance selection"; S. Takeshita; M.
Sato; M. Toba; W. Masahashi; T. Hashimoto-Gotoh;
Gene (1987), tomo 61, páginas 63-74) y se
transformó en E. coli JM109 (que puede adquirirse en la firma
Promega, Mannheim, Alemania).
Se seleccionó con respecto a la resistencia
codificada por el vector. Adicionalmente el método del cribado
azul/
blanco (placas de selección que contenían 80 \mug/ml de X-Gal) sirvió para la identificación de los clones, que habían alojado un vector con inserto. De este modo se obtuvieron 200 clones, entre los cuales pudieron identificarse 5 clones mediante la hibridación de colonias, que portaban el gen B. licheniformis-secA. Éstos se verificaron mediante un nuevo análisis por transferencia de Southern con la sonda que ha sido descrita precedentemente y se prosiguió con un vector derivado de pHSG575 con el fragmento MunI que porta el gen secA de B. licheniformis, que comprende 5,5 kB, bajo la denominación pHMH1.
blanco (placas de selección que contenían 80 \mug/ml de X-Gal) sirvió para la identificación de los clones, que habían alojado un vector con inserto. De este modo se obtuvieron 200 clones, entre los cuales pudieron identificarse 5 clones mediante la hibridación de colonias, que portaban el gen B. licheniformis-secA. Éstos se verificaron mediante un nuevo análisis por transferencia de Southern con la sonda que ha sido descrita precedentemente y se prosiguió con un vector derivado de pHSG575 con el fragmento MunI que porta el gen secA de B. licheniformis, que comprende 5,5 kB, bajo la denominación pHMH1.
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La región clonada de 5,5 kB se caracterizó, en
primer lugar, mediante mapeado por restricción. Con esta finalidad
se llevaron a cabo digestiones simples y dobles con diversos enzimas
de pHMH1 y se identificaron mediante análisis por transferencia de
Southern, aquellos fragmentos, que portan partes del operón
secA/prfB. El mapa de restricción, resultante, se
completó tras la secuenciación completa del fragmento 5,5 kB (véase
más adelante) y pueden verse en la figura 3.
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento mostrado en la figura 3, con un
tamaño de 5,5 kB se secuenció en secuencias parciales según los
métodos normalizados. Las secuencias parciales mostraron una fuerte
homología con los genes siguientes de B. subtilis: fliT (que
codifica una proteína flagelo), orf189/yvyD (función
desconocida), secA (subunidad enlazadora de translocasa;
ATPasa) y prfB (factor de desprendimiento de la cadena
peptídica 2 -Peptide Chain Release Factor 2-), exactamente en el
mismo orden génico que en el caso de B. subtilis. Éstos se
han mostrado igualmente en la figura 3.
Como consecuencia de estos valores, también
puede partirse de la base de que la SecA de B. licheniformis
ejerce la misma actividad bioquímica que, especialmente, la SecA de
B. subtilis y, por lo tanto, ejerce la misma función
fisiológica. Por lo tanto debe considerarse como enzima esencial,
enlazado en la translocación.
La secuencia de ADN y la secuencia de
aminoácidos derivada de la misma, determinadas en este ejemplo, se
han indicado en el protocolo de secuencias bajo SEQ ID NO. 5 o bien
6. Por lo tanto el inicio de la traducción se encuentra en la
posición 154 y el codón de terminación se encuentra en las
posiciones 2677 hasta 2679. Como región promotora debe ser
considerada probablemente la secuencia parcial de las posiciones 60
hasta 65 o bien 77 hasta 82 y como punto de enlace de los ribosomas
la región de las posiciones 138 hasta 144.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen secA, obtenido en el ejemplo 1, se
amplificó con su propio promotor mediante RCP, a partir del ADN
cromosómico de B. licheniformis. Con esta finalidad se
eligieron cebadores, como se ha representado en la figura 4, por
medio de la secuencia de ADN del gen de B. licheniformis, que
tenían un punto de corte por restricción BamHI
respectivamente en el extremo 5'. A través de éste se clonó el
fragmento, amplificado con estos cebadores, en el punto de corte
del plásmido pCB56C. Éste está descrito en la solicitud WO 91/02792
A1 y contiene el gen para la proteasa alcalina de B. lentus
(BLAP).
Esta estrategia de clonación, que está
representada también en la figura 4, proporciona el vector
pCB56CsecA, que tiene un tamaño de 8319 bp, que contiene
además de los genes secA y BLAP, también un gen que codifica
una resistencia a la tetraciclina.
Se transformaron en B. licheniformis este
vector pCB56CsecA y el pCB56C, para el control del vector de
partida, y, concretamente, en el caso de pCB56C en la cepa de tipo
silvestre B. licheniformis (secA) capaz de formar la SecA.
En el caso del pCB56CsecA se llevó a cabo la transformación
de tal manera, que se inactivó al mismo tiempo el endogen
secA. En el ejemplo 3 se ha descrito la manera de proceder
con esta finalidad.
De este modo se obtuvieron las dos cepas B.
licheniformis (\DeltasecA) pCB56CsecA y B.
licheniformis (secA) pCB56C que serían capaces ambas de
expresar el gen codificado a través del plásmido para la proteasa
alcalina. Éstas se investigan adicionalmente en el ejemplo 4.
La desconexión del gen secA se llevó a
cabo por medio de un vector de deleción. La forma de proceder siguió
la descripción de los autores J.Vehmaanperä et al. (1991) en
J. Biotechn., tomo 19, páginas 221-240.
Como vector para la deleción secA se
eligió el plásmido pE194 descrito en la misma publicación. La
ventaja de este vector de deleción consiste en que éste tiene un
origen de replicación en función de la temperatura. A 33ºC puede
replicarse el pE194 en la célula de tal manera, que puede
seleccionarse a esta temperatura en primer lugar con respecto a una
transformación realizada con éxito. A continuación se incuban las
células, que contienen el vector, a 42C. A esta temperatura ya no
se replica el vector de deleción y se ejerce una presión de
selección sobre la integración del plásmido a través de una de las
dos regiones homólogas (región en el sentido ascendente 5' o en el
sentido descendente 3' -upstream o downstream- de secA) en el
cromosoma. Otra recombinación homóloga a través de otras (segundas)
regiones homólogas conduce entonces a la deleción secA. De
igual modo, sería posible una nueva recombinación de la primera
región homóloga. En este caso se recombina el vector de nuevo fuera
del cromosoma de tal manera, que se conservaría el secA
cromosómico. La deleción secA tiene que demostrarse, por lo
tanto, en el análisis por transferencia de Southern tras la
restricción del ADN cromosómico con enzimas adecuados o con ayuda de
la técnica de la RCP en función del tamaño de la región
amplificada.
Para la construcción del vector de deleción se
amplificaron las regiones en el sentido ascendente 5' y en el
sentido descendente 3' (upstream y downstream) de secA
(figura 5) por medio de la RCP. Los cebadores para la amplificación
y los puntos de corte por restricción, relacionados con los mismos,
para la clonación subsiguiente (XbaI y EcoRV) se
eligieron por medio de la secuencia de ADN, determinada según el
ejemplo 1, del locus secA/prfB de B.
licheniformis. En el caso de la deleción secA debe
tenerse en consideración que el prfB, localizado en el
sentido descendente 3' (downstream) de secA, se encuentra en
un operón con secA, es decir que no tiene un promotor propio
(véase la figura 2). El prfB codifica la proteína RF2, que
se encarga, en conexión con la biosíntesis de proteína, para
desprender la proteína del ribosoma. En el fin de garantizar la
transcripción del prfB, importante para las biosíntesis de
proteína, incluso tras la deleción secA, se amplificó el
orf189, que se encuentra por delante del secA, con
terminador propio y con el promotor secA, localizado en el
sentido descendente 3' (downstream) de tal manera, que el
prfB puede transcribirse (figura 5), tras la deleción
secA, directamente a partir del promotor secA.
Las regiones amplificadas (orf189' y
prfB') se sometieron a una clonación intermedia en una etapa
de control en el vector pBBRMCS2 de E. coli. La secuenciación
subsiguiente del constructo orf989'prfB' mostró que los
fragmentos amplificados se había clonado conjuntamente de manera
correcta.
En la siguiente etapa, el constructo
orf189'prfB' se sometió a una reclonación en B.
subtilis DB104 en el vector pE 194, elegido para la deleción
(figura 6). En este caso, se obtuvieron productos de transformación
con el método de la transformación de protoplastos según Chang &
Cohen, 1979, que portaban el vector de deleción pEorfprfB. Todas
las etapas de trabajo se llevaron a cabo a 33ºC para garantizar una
replicación del vector.
En una última etapa se transformó el vector
pCB56CsecA, descrito en el ejemplo 2, de igual modo por medio
del método de la transformación de protoplastos, en la cepa huésped
B. licheniformis, que porta el plásmido pEorfprfB. Los
productos de transformación obtenidos de es modo e identificados
como positivos con métodos usuales, se seleccionaron a continuación
a 42ºC bajo presión de selección (tetraciclina para
pCB56CsecA y eritromicina para pEorfprfB) con respecto a la
presencia de ambos plásmidos. A esta temperatura, el vector de
deleción ya no puede replicarse y únicamente sobreviven aquellas
células en las que el vector está integrado en el cromosoma,
teniendo lugar esta integración, con la máxima probabilidad, en
regiones homólogas o idénticas. Mediante el cultivo a 33ºC, sin
presión de selección por parte de la eritromicina, puede inducirse a
continuación la excisión del vector de deleción, retirándose por
completo del cromosoma el gen secA codificado por vía
cromosómica.
En la célula permanece el plásmido
pCB56CsecA, que induce la capacidad de la síntesis de la
subtilisina así como pone a disposición el factor de translocación
esencial SecA. La cepa, obtenida de este modo, se denominó B.
licheniformis (\DeltasecA) pCB56CsecA.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la determinación de la estabilidad genética
del plásmido de subtilisina pCB56CsecA, que porta el secA,
se ensayaron las dos cepas B. licheniformis (secA)
pCB56C y B. licheniformis (\DeltasecA) pCB56CsecA,
obtenidas según los ejemplos 2 y 3, en un experimento en matraz
vibrador sin aporte de antibióticos en medio líquido. Con esta
finalidad se realizó un cultivo durante la noche, a partir
respectivamente de una sola colonia y se inocularon con éste
respectivamente 14 ml de medio LB (según receta normalizada) hasta
una densidad óptica de 0,05 a 600 nm (OD_{600}). El cultivo se
llevó a cabo en un matraz vibrador de Erlenmeyer de 100 ml.
Respectivamente al cabo de 8 y de 16 horas se sobreinocularon los
cultivos con 14 ml de medio fresco y en este caso se ajustó, de
nuevo, una OD_{600} de 0,05. El cultivo se llevó a cabo durante 8
días y noches; en este caso se sobreinocularon los cultivos en
total 16 veces. Se distribuyeron a diario sobre placas series de
diluciones y se transfirió una elección aleatoria de los clones
obtenidos sobre placas de ensayo de proteasa. El resultado se ha
representado en la tabla 2 y en la figura 7.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los clones ensayados de la cepa B.
licheniformis (\DeltasecA) pCB56CsecA mostraron
actividad de proteasa en cualquier instante del cultivo, mientras
que en el caso de la cepa B. licheniformis (secA) pCB56C
algunos clones ya no tenían actividad de proteasa. Esto debe
interpretarse como pérdida del plásmido pCB56C; esta pérdida se
verificó de manera adicional mediante minipreparación de
plásmido.
Por lo tanto, se pone claramente de manifiesto,
por medio de estos datos, que el plásmido de subtilisina
pCB56CsecA, que porta secA, es estable en la cepa \DeltasecA cuando se verifica el cultivo en medio LB sin aporte de antibióticos, especialmente sin aporte de tetraciclina, para la cual proporcionaría resistencia el plásmido, mientras que el plásmido de subtilisina pCB56C se pierde en la cepa sin deleción secA cromosómica, en el transcurso del cultivo. Por lo tanto, el gen secA procedente de B. licheniformis puede curar la deficiencia SecA cromosómica por transferencia a un vector de expresión y, de este modo, puede ser aprovechado para la selección de un cultivo bacteriano, que exprese un gen para otra proteína, en este caso una proteasa alcalina.
pCB56CsecA, que porta secA, es estable en la cepa \DeltasecA cuando se verifica el cultivo en medio LB sin aporte de antibióticos, especialmente sin aporte de tetraciclina, para la cual proporcionaría resistencia el plásmido, mientras que el plásmido de subtilisina pCB56C se pierde en la cepa sin deleción secA cromosómica, en el transcurso del cultivo. Por lo tanto, el gen secA procedente de B. licheniformis puede curar la deficiencia SecA cromosómica por transferencia a un vector de expresión y, de este modo, puede ser aprovechado para la selección de un cultivo bacteriano, que exprese un gen para otra proteína, en este caso una proteasa alcalina.
De conformidad con la publicación de los autores
van Wely, K.H., Swaving, J., Freudl, R., Driessen, A.J. (2001);
"Translocation of proteins across the cell envelope of
Gram-positive bacteria", FEMS Microbiol Rev.
2001, 25(4), S. 437-54.
Puede verse que en la región secA se encuentra
también el gen prfB y que se forma un ARNm coherente, de tal
manera que puede hablarse también de un operón
secA/prfB.
Como se ha representado en el ejemplo 1 se
encuentra en la proximidad inmediata con respecto al secA el
gen prfB y un orf sobre un fragmento con un tamaño
aproximado de 5,5 kB, que puede ser obtenido mediante restricción
con MunI a partir del ADN genómico de B.
licheniformis.
Como se ha descrito en el ejemplo 2 se amplificó
el secA mediante a RCP y se clonó un vector, que contiene
como transgen la proteasa alcalina procedente de B.
lentus.
Amplificación de las regiones en el sentido
ascendente 5' y en el sentido descendente 3' (upstream y downstream)
de secA con los puntos de corte por restricción para
elegidos para la clonación como se ha descrito en el ejemplo 3. El
extremo 3' de orf189 se amplifica con el propio terminador y
con el promotor secA que se encuentra en el sentido 3' (downstream)
de tal manera que, tras la deleción secA puede transcribirse
el prfB directamente desde el promotor secA. Los segmentos
derivados orf189' y prfB' abarcan, respectivamente,
502 bp o bien 546 bp.
Las regiones, amplificadas por medio de la RCP,
se clonaron de manera intermedia en E.coli, se cortaron de
nuevo por medio de XbaI y de EcoRV y, a continuación,
se ligaron en los puntos de corte por restricción Xbal y
AccI en el vector pE194.
Tal como se ha descrito en el ejemplo 4, se ha
representado respectivamente la proporción de los clones con
actividad de proteasa al cabo de un número de días
correspondiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuadrados:
B. licheniformis (\DeltasecA)
pCB56CsecA
\vskip1.000000\baselineskip
Triángulos:
B. licheniformis (secA) pCB56C
(controles).
<110> Henkel Kommanditgesellschaft auf
Aktien
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Un enzima de translocación como
marcador de selección
\vskip0.400000\baselineskip
<130> H 05599 PCT
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DE10309557.8
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-03-04
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4148
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus subtilis
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (544)..(3069)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 841
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus subtilis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2706
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2706)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 901
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2706
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus licheniformis
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (154)..(2679)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 841
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus licheniformis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (39)
1. Procedimiento para la selección de un
microorganismo, caracterizado porque
- (a)
- se inactiva un gen endógeno presente, que codifica una actividad de translocación esencial y
- (b)
- se cura, por medio de un vector, la actividad de translocación esencial, inactivada según (a).
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque
- (c)
- el vector, según (b), porta un trasgen.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2,
caracterizado porque la actividad de translocación esencial
está constituida por uno de los factores siguientes: SecA, SecY,
SecE, SecD, SecF, peptidasa señal, b-SRP (Ffh o Ffs
/ Scr), FtsY / Srb, PrsA o YajC.
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque la actividad de translocación esencial
está constituida por una de las subunidades siguientes de la
preproteína-translocasa: SecA, SecY, SecE, SecD o
SecF, de manera preferente está constituida por la subunidad
SecA.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la curación
según (b) se lleva a cabo a través de una actividad equivalente a
la actividad de translocación esencial, presente de manera
endógena, inactivada, preferentemente por medio de una actividad
genéticamente emparentada, de manera especialmente preferente por
medio de la misma actividad.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la curación
según (b) se lleva a cabo por medio de las regiones, que
restablecen la actividad de translocación, del gen secA
procedente de Bacillus subtilis, Escherichia coli o de
Bacillus licheniformis, que se han indicado en el protocolo
de secuencias bajo SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 3 o bien SEQ ID NO.
5.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 2 a 6, caracterizado porque la inactivación
según (a) se lleva a cabo de tal manera, que se impida una
recombinación entre la región génica, inactivada según (a), y la
región homóloga sobre el vector según (b), de manera preferente con
pérdida completa de un segmento génico, contenido en el gen
cromosómico correspondiente.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la inactivación,
según (a), se lleva a cabo por medio de un vector de deleción, de
manera preferente por medio de un vector de deleción con un origen
de replicación que puede ser regulado de manera externa, de manera
especialmente preferente por medio de un vector de deleción con un
origen de la replicación dependiente de la temperatura.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el vector, según
(b), está constituido por un plásmido, que se replica de manera
autónoma en el microorganismo.
10. Procedimiento según la reivindicación 9,
caracterizado porque el plásmido está constituido por un
plásmido, que se establece un en número repetido de copias,
preferentemente con un número múltiple de copias.
11. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el
microorganismo está constituido por una cepa bacteriana
gramnegativa.
12. Procedimiento según la reivindicación 11,
caracterizado porque se trata de una cepa bacteriana
gramnegativa de los géneros E. coli o Klebsiella, de
manera especial se trata de derivados de Escherichia coli
K12, de Escherichia coli B o de Klebsiella planticola,
y de una manera muy especialmente preferente se trata de derivados
de las cepas Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli
RV308, E. coli DH5\alpha, E. coli JM109, E.
coli XL-1 o Klebsiella planticola
(Rf).
13. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el
microorganismo está constituido por una cepa bacteriana
grampositiva.
14. Procedimiento según la reivindicación 13,
caracterizado porque se trata de una cepa bacteriana
grampositiva de los géneros Staphylococcus, Corynebakterien
o Bacillus, de manera especial se trata de las especies
Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum,
Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B.
globigii o B. lentus, y, de manera muy especialmente
preferente, se trata de derivados de las cepas B.
licheniformis o B. amylotiquefaciens.
15. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 2 a 14, caracterizado porque el transgen,
según (c), está constituido por un transgen que codifica una
proteína no enzimática, especialmente que codifica una proteína
relevante desde el punto de vista farmacológico, de manera especial
que codifica insulina o calcitonina.
16. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 2 a 14, caracterizado porque el transgen,
según (c), está constituido por un transgen que codifica un enzima,
preferentemente un enzima hidrolítico o una óxidorreductasa, de
manera especialmente preferente codifica una proteasa, una amilasa,
una hemicelulasa, una celulasa, una lipasa, una cutinasa, una
oxidasa, una peroxidasa o una laccasa.
17. Procedimiento para la obtención de una
proteína mediante cultivo de células de una cepa de microorganismo,
caracterizado por un procedimiento de selección según una de
las reivindicaciones 1 a 16.
18. Procedimiento según la reivindicación 17,
caracterizado por un procedimiento de selección según una de
las reivindicaciones 2 a 16, en el que el transgen, según (c),
codifica la proteína preparada por medio de este procedimiento.
19. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 17 a 18, caracterizado porque se lleva a
cabo el cultivo de los microorganismos en un medio líquido, de
manera preferente en un fermentador.
20. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 17 a 19, caracterizado porque la proteína
interesada es secretada en el medio circundante.
21. Microorganismo, obtenido mediante un
procedimiento de selección según una de las reivindicaciones 1 a
16.
22. Microorganismo según la reivindicación 21,
caracterizado porque el transgen es expresado.
23. Microorganismo según la reivindicación 22,
caracterizado porque el transgen es secretado.
24. Empleo de un gen, que codifica una actividad
de translocación esencial para la selección de un microorganismo,
caracterizado porque
- (a)
- se inactiva en el microorganismo esta actividad de translocación esencial, presente de manera endógena y
- (b)
- se cura, por medio de un vector, la actividad de translocación esencial, inactivada según (a).
25. Empleo según la reivindicación 24,
caracterizado porque
- (c)
- el vector, según (b), porta un transgen.
26. Empleo según la reivindicación 24 o 25,
caracterizado porque la actividad de translocación esencial
está constituida por uno de los factores siguientes: SecA, SecY,
SecE, SecD, SecF, peptidasa señal, b-SRP (Ffh o Ffs
/ Scr), FtsY / Srb, PrsA o YajC.
27. Empleo según la reivindicación 26,
caracterizado porque la actividad de translocación esencial
está constituida por una de las siguientes subunidades de la
preproteína-translocasa: SecA, SecY, SecE, SecD o
SecF, de manera preferente está constituida por la subunidad
SecA.
28. Empleo según una de las reivindicaciones 24
a 27, caracterizado porque la curación, según (b), se lleva
a cabo por medio de una actividad equivalente a la actividad de
translocación esencial, presente de manera endógena, inactivada, de
manera preferente se lleva a cabo por medio de una actividad
genéticamente emparentada, de manera especialmente preferente se
lleva a cabo por medio de la misma actividad.
29. Empleo según una de las reivindicaciones 24
a 28, caracterizado porque la curación, según (b), se lleva
a cabo por medio de las regiones, que restablecen de la actividad de
translocación, del gen secA procedente de Bacillus
subtilis, Escherichia coli o de Bacillus licheniformis,
que se han indicado en el protocolo de secuencias bajo SEQ ID NO.
1, SEQ ID NO. 3 o bien SEQ ID NO. 5.
30. Empleo según una de las reivindicaciones 24
a 29, caracterizado porque el vector, según (b), está
constituido por un plásmido, que se replica de manera autónoma en
el microorganismo.
31. Empleo según la reivindicación 30,
caracterizado porque el plásmido está constituido por un
plásmido, que se establece con un número repetido de copias, de
manera preferente con un número múltiple de copias.
32. Vector, que porta un gen para una actividad
de translocación esencial y un transgen, que no codifica una
resistencia a los antibióticos, cuando esté presente como transgen
único.
33. Vector según la reivindicación 32,
caracterizado porque el transgen codifica una proteína no
enzimática farmacológicamente relevante o codifica un enzima
hidrolítico o codifica una óxidorreductasa.
34. Vector según la reivindicación 32 o 33,
caracterizado porque la actividad de translocación,
codificada por el mismo, es capaz de curar una actividad de
translocación esencial inactivada, presente de manera endógena en
una cepa de microorganismo, preferentemente por medio de una
actividad genéricamente emparentada, de manera especialmente
preferente por medio de la misma actividad.
35. Vector según una de las reivindicaciones 32
a 34, caracterizado porque la actividad de translocación
esencial está constituida por uno de los factores siguientes: SecA,
SecY, SecE, SecD, SecF, peptidasa señal, b-SRP (Ffh
o Ffs / Scr), FtsY / Srb, PrsA o YajC.
36. Vector según la reivindicación 35,
caracterizado porque la actividad de translocación esencial
está constituida por una de las siguientes subunidades de la
preproteína-translocasa: SecA, SecY, SecE, SecD o
SecF, de manera preferente está constituida por la subunidad
SecA.
37. Vector según una de las reivindicaciones 32
a 36, caracterizado porque la actividad de translocación
esencial está constituida por uno de los genes secA
procedentes de Bacillus subtilis, Escherichia coli o de
Bacillus licheniformis, que han sido indicados en el
protocolo de secuencias bajo SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 3 o bien SEQ
ID NO. 5.
38. Vector según una de las reivindicaciones 32
a 37, caracterizado porque se trata de un plásmido, que se
replica de manera autónoma en el microorganismo.
39. Vector según la reivindicación 38,
caracterizado porque el plásmido está constituido por un
plásmido, que se establece con un número repetido de copias, de
manera preferente se establece con un número múltiple de
copias.
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