ES2301659T3 - Metodos para aumentar la eficacia in vivo de oligonucleotidos e inhibir la inflamacion en mamiferos. - Google Patents
Metodos para aumentar la eficacia in vivo de oligonucleotidos e inhibir la inflamacion en mamiferos. Download PDFInfo
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Abstract
Una molécula de ácido nucleico aislada o purificada que es un oligonucleótido que posee una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1-6, 8-18 y 21, 24, 27, 28, 30, (i) que comprende un sustitutivo de nucleótidos seleccionado entre el grupo que consiste en 2,6-diaminopurina y sus sales, o (ii) en el que al menos un nucleótido de adenosina del oligonucleótido está reemplazado con dicho sustitutivo de nucleótidos
Description
Métodos para aumentar la eficacia in vivo
de oligonucleótidos e inhibir la inflamación en mamíferos.
Esta solicitud reivindica prioridad de la
Solicitud Provisional de Estados Unidos 60/1303.071 presentada el 6
de Julio de 2001, cuya descripción se incorpora aquí por referencia
en su totalidad.
La invención se refiere al uso de sustitutivos
de nucleótidos para aumentar la eficacia in vivo de moléculas
de ácidos nucleicos y también para inhibir la inflamación en
mamíferos.
Más particularmente, la presente invención se
refiere al uso de 2,6-diaminopurina (DAP) y sus
análogos per se en composiciones antiinflamatorias, y
también para preparar moléculas de ácidos nucleicos que poseen una
eficacia fisiológica aumentada in vivo y una toxicidad
reducida.
Los enfoques terapéuticos basados en el uso de
moléculas de ácidos nucleicos están llegando a ser más y más
populares. Las terapias génicas y las terapias basadas en
antisentidos cambiarán, probablemente, de modo radical la medicina
en un futuro cercano.
Los problemas existentes hasta la fecha con
moléculas de ácidos nucleicos como agentes terapéuticos, y más
particularmente, con oligonucleótidos antisentido, han sido la
toxicidad (tanto sístémica como tópica), la estabilidad y la unión
inespecífica a las proteínas de la superficie celular. La toxicidad
de los oligonucleótidos antisentido parece variar entre especies,
siendo las ratas las más sensibles, aun cuando la toxicidad aparece
a dosis más altas que aquellas que son eficaces desde el punto de
vista terapéutico (véase la publicación de ST Crooke, Hematologic
Pathology, 1995, 9:5972 para una revisión). En enfermedades
respiratorias pulmonares la toxicidad de las moléculas de ácidos
nucleicos asociada con la administración de genes/antisentidos
terapéuticos incluyen: un aumento de la estimulación inmunitaria,
un infiltrado celular mononuclear-inflamatorio en
los pulmones, y, posiblemente, hipersensibilidad y
broncoconstricción de las vías respiratorias.
Varias soluciones, que son menos que óptimas,
han sido propuestas hasta la fecha para soslayar el problema de la
toxicidad. Entre las más populares está la preparación de moléculas
de ácidos nucleicos que contienen diversas bases de ADN
modificadas, bases de ARN modificadas y/o estructura de la cadena
principal modificada. Por ejemplo, el documento WO 99/67378
describe construcciones de oligonucleótidos antisentido basadas en
azúcares modificados. Asimismo, Nyce ha postulado, aun cuando no lo
ha demostrado, en el documento WO 00/09525 y en el documento WO
00/62736, que la base de adenosina incluida en oligonucleótidos
antisentido para tratar enfermedades respiratorias, es la causa
principal de toxicidad en los pulmones. Por consiguiente, Nyce
propone oligonucleótidos con bajo contenido de adenosina y
oligonucleótidos en los que la base de adenosina ha sido reemplazada
por un análogo de adenosina. No obstante, ninguno de los
oligonucleótidos de bajo contenido de adenosina y ninguno de los
análogos de adenosina propuestos por Nyce han sido ensayados nunca
para determinar su actividad biológica o su toxicidad
pretendidamente reducida.
Se ha encontrado que el nucleósido
2,6-diaminopurina
(2-amino-2'-desoxiadenosina;
DAP) estaba presente en ADN en lugar de adenosina por el cianófago
S-2L (Chemg, X., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct.
24:293-318,1995); Khudyakov, I.Y., et al.,
Virology 88:8-18, 1978). Desde entonces el
nucleósido de 2,6-diaminopurina (DAP) ha sido
ampliamente usado y estudiado, en especial como punto de partida
químico para la síntesis de compuestos antivirales tales como la
2-amino-2',3'-didesoxiadenosina
(no DAP) que es capaz de inhibir selectivamente la replicación
in vitro del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV)
(Baizarini, J. et al., Biochem. and Biophys. Res.
Communications 145:269-76 (1987). Sin embargo, el
uso de DAP en oligonucleótidos antisentido o en métodos de terapia
génica nunca ha sido sugerido.
Asimismo, las Patentes de EE.UU. Nº 5.925.624 y
Nº 5.889.178, describen derivados de
2,6-diaminopurina-beta-D-ribofuranuronamida.
Aun cuando estos derivados poseen efecto antiinflamatorio (la mayor
parte de las veces contra la liberación de superóxidos de
neutrófilos) y que estos derivados podrían usarse en el tratamiento
terapéutico de enfermedades respiratorias, poseen una fórmula
química que es diferente de la fórmula de DAP y sus análogos.
El documento WO 00/12563 describe procedimientos
para incorporar en oligonucleótidos 2-aminoadenosina
y análogos de 2-aminoadenosina.
En resumen, no ha existido hasta la fecha ni
sugerencia ni ejemplo de que la DAP y sus análogos pudieran
incorporarse en moléculas de ácidos nucleicos (construcciones
génicas y antisentidos) para aumentar la eficacia in vivo de
estos oligonucleótidos.
Existe una gran necesidad sentida de moléculas
de ácidos nucleicos que pudieran permanecer estables en el cuerpo al
tiempo que poner de manifiesto alta eficacia y baja toxicidad.
Existe más particularmente la necesidad de
moléculas de ácidos nucleicos que incorporen un sustitutivo de
nucleótidos tal como la 2,6-diaminopurina (DAP) y
sus análogos, la necesidad de una composición que comprenda los
mismas y la necesidad de métodos de uso de estas moléculas de ácidos
nucleicos, en particular en métodos de terapias génicas y
antisentidos. Nadie ha ensayado nunca si el reemplazo de una o más
bases por sustitutivos de nucleótidos podía afectar a la
estabilidad unión, eficacia de degradación y toxicidad de
oligonucleótidos antisentido, ni han ensayado tales
oligonucleótidos antisentido modificados para determinar su
actividad biológica en células, en cultivos o en animales.
La presente invención cumple estas necesidades
así como otras necesidades que serán evidentes para los expertos en
la técnica al leer la memoria descriptiva que sigue.
Un objeto de la invención es proporcionar
moléculas de ácidos nucleicos tales como construcciones génicas y
oligonucleótidos antisentido que podrían permanecer estables en el
cuerpo al tiempo que exhibir alta eficacia y baja toxicidad.
Según un aspecto de la invención, se describe un
método para aumentar la eficacia in vivo de una molécula de
ácido nucleico que es administrada a un mamífero, que comprende
incorporar en la molécula de ácido nucleico al menos un sustituido
de nucleótidos. Tal incorporación aumenta la eficacia fisiológica
in vivo de la molécula de ácido nucleico y reduce, asimismo,
su toxicidad cuando se administra a un mamífero, en comparación con
una molécula de ácido nucleico que no incorpore el sustitutivo de
nucleótidos. El sustitutivo de nucleótidos se incorpora en la
molécula de ácido nucleico para sustituir una base de adenosina. El
sustitutivo de nucleótidos se selecciona entre el grupo que consiste
en 2,6-diaminopurina y sus sales.
La invención se refiere también a un método
mejorado para la administración in vivo de al menos una
molécula de ácido nucleico a un mamífero. La mejora consiste en
incorporar en la molécula de ácido nucleico al menos una
2,6-diaminopurina y/o una de sus sales. La
2,6-diaminopurina o su sal se incorpora en la
molécula de ácido nucleico para sustituir en ella una base de
adenosina.
Según otro aspecto de la invención, se
proporciona una molécula de ácido nucleico, aislada o purificada,
seleccionada entre oligonucleótidos antisentido y moléculas de
ácidos nucleicos que comprenden una secuencia que codifica un
producto génico terapéutico, comprendiendo la molécula de ácido
nucleico según la presente invención un sustitutivo de nucleótidos
seleccionado entre el grupo que consiste en
2,6-diaminopurina y sus sales.
Según otro aspecto de la invención, se
proporciona una composición terapéutica que comprende al menos una
molécula de ácido nucleico según se ha definido anteriormente, y un
excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico. La
composición de la invención puede ser útil para tratar y/o prevenir
una enfermedad seleccionada entre enfermedades del sistema
respiratorio, enfermedades neurológicas, enfermedades
cardiovasculares, enfermedades reumatológicas, enfermedades
digestivas, enfermedades cutáneas, enfermedades oftalmológicas,
enfermedades del sistema urinario, cánceres, infecciones por
organismos patógenos, y enfermedades genéticas, hipereosinofilia,
inflamación general, y cánceres.
Según otro aspecto de la invención, se describe
un método de terapia antisentido, que comprende la etapa de
administrar directamente al sistema respiratorio de un mamífero
necesitado de ello, una cantidad eficaz, terapéutica o
profiláctica, de al menos un oligonucleótido antisentido según se ha
definido anteriormente. Este método es útil para prevenir y/o
tratar enfermedades del sistema respiratorio, cánceres, infecciones
por organismos patógenos, y enfermedades genéticas, y más
particularmente, enfermedades del sistema respiratorio asociadas
con inflamación de los pulmones, las vías respiratorias y/o la
nariz, tales como fibrosis pulmonar, síndrome de insuficiencia
respiratoria del adulto, fibrosis quística, enfermedad pulmonar
obstructiva crónica, bronquitis crónica, bronquitis eosinofílica,
asma, alergia, sinusitis, virus sincitial respiratorio u otras
infecciones virales del tracto respiratorio e hipereosinofilia.
La presente invención proporciona también el uso
de la molécula de ácido nucleico anterior, aislada o purificada,
para la fabricación de un medicamento para terapia antisentido.
La presente invención proporciona,
adicionalmente, un método de preparación de una molécula de ácido
nucleico, aislada o purificada, según se ha definido anteriormente,
que comprende reemplazar al menos un resto de adenosina del
oligonucleótido, por DAP o una de sus sales.
La presente invención proporciona, además, el
uso de DAP y sus sales para reemplazar al menos un resto de
adenosina de un oligonucleótido, para aumentar la eficacia
antiinflamatoria in vivo de dicho oligonucleótido.
Los objetos de la invención están definidos en
las reivindicaciones que se acompañan.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Las Figuras 1A, 1B, 1C y 1D muestran la
estructura química de adenina, adenosina, inosina,
2,6-diaminopurina
(2-amino-2'-desoxiadenosina;
DAP) y diferentes análogos de DAP.
La Figura 2A son representaciones de PCRs
semicuantitativas que muestran la eficacia biológica de diferentes
antisentidos para la cadena Beta común del receptor humano de
GM-CSF , IL-3, e
IL-5 en células U937. 1 = células sin tratar; 2 =
células tratadas con AS107 antisentido; 3 = Células tratadas con el
antisentido AS107 que contiene DAP en lugar de 2 bases de adenosina
(AS107-DAP); y M = marcadores de pesos moleculares.
G3PDH 460 bp = es el número de bases en que se encuentra el gen que
gobierna G3PDH ; GM-CSFR\beta 340 bp: es el número
de bases en que se encuentra la banda de la cadena Beta común.
La Figura 2B es una representación de PCRs
semicuantitativas que muestran la eficacia biológica de antisentidos
para la cadena Beta común del receptor humano de
GM-CSF, IL-3 e IL-5,
en células TF-1. 1 = células sin tratar; 2 = células
tratadas con el antisentido AS107; 3 = Células tratadas con el
antisentido AS107 que contiene DAP en lugar de 2 bases de adenosina
(AS107-DAP); y M = marcadores de pesos moleculares.
G3PDH 460 bp es el número de bases en que se encuentra el gen que
gobierna G3PDH, cadena \beta 340 bp es el número de bases en que
se encuentra la banda de la cadena Beta común.
La Figura 3 es una representación de PCRs
semicuantitativas que muestra la ineficacia biológica de células
TF-1 de reemplazar adenosina por su análogo inosina
en el antisentido, respecto a la cadena Beta común del receptor
humano de GM-CSF, IL-3 e
IL-5. 1 = TF-1 Testigo (células sin
tratar); 2 = células tratadas con AS107 sentido; 3 = Células
tratadas con el antisentido AS107; 4 = Células tratadas con el
antisentido AS107 que contiene inosina en lugar de 2 bases de
adenosina (AS107-I); 5 = Células tratadas con el
antisentido AS107 que tiene un desajuste de una base; y M =
marcadores de pesos moleculares. G3PDH 450 bp es el número de bases
en que se encuentra el gen que gobierna G3PDH; cadena \beta 340 bp
es el número de bases en que se encuentra la banda de la cadena Beta
común.
La Figura 4A es una gráfica que muestra los
efectos sobre la resistencia pulmonar de ratas Brown Norway
sensibilizadas, de la administración intratraqueal de un
oligonucleótido de fósforotioato antisentido (AS 141) dirigido
contra la cadena Beta común de GM-CSF,
IL-3 e IL-5 de rata, en comparación
con los efectos del mismo antisentido que contiene DAP en lugar de 2
bases de adenosina (AS141-DAP). La resistencia
pulmonar se midió 0-2 horas después de administrar
una dosis de 60 \mug de cada uno de los oligonucleótidos.
La Figura 4B es una gráfica que muestra los
efectos sobre la resistencia pulmonar de ratas Brown Norway
sensibilizadas, de la administración intratraqueal de un
oligonucleótido de fosforotioato antisentido (AS141) dirigido contra
la cadena Beta común de GM-CSF, IL-3
e IL-6 de rata, en comparación con el mismo
antisentido que contiene inosina en lugar de 2 bases de adenosina
(AS-141-inosina). La resistencia
pulmonar se midió 0-2 horas después de administrar
una dosis de 60 \mug de cada uno de los oligonucleótidos.
La Figura 5 es una gráfica que muestra los
efectos sobre la resistencia pulmonar de la rata sensibilizada, de
la instilación intratraqueal de adenosina, DAP
(2-amino-2'-desoxiadenosina)
y sus análogos.
La Figura 6A es un gráfico de barras que muestra
que la incorporación de DAP en oligonucleótidos antisentido a
CCR3\cdot de la rata y la cadena \beta común de los receptores
de IL-3/IL-5/GM-CSF
aumenta la eficacia fisiológica in vivo de estos
antisentidos. La actividad biológica de los antisentidos fue medida
en el modelo de asma de la rata. Testigo sin inducir; Testigo
inducido; Ratas tratadas con 200 \mug de los antisentidos ASA4 y
AS141 (18 nucleótidos); Ratas tratadas con 200 \mug de los
antisentidos ASA4 y AS141 que contienen DAP en lugar de bases de
adenosina (ASA4-DAP; 141-DAP); Ratas
tratadas con 200 \mug de los antisentidos ASA4 y
AS141desajustados; y Ratas tratadas con 200 \mug de los
antisentidos ASA4-DAP y AS141-DAP
desajustados. El grado de reacción a leucotrieno D4 se midió 15
horas despues de enfrentamiento con ovoalbúmina.
La Figura 6B es un gráfico de barras que muestra
que la combinación de dos oligonucleótidos regulares y dos
oligonucleótidos que contienen DAP (total 60 \mug) es más eficaz
que 50 \mug de cada uno de los oligonucleótidos aislado.
La Figura 7A es un gráfico de barras que muestra
que oligonucleótidos contra CCR3 que contiene DAP son más eficaces
para inhibir la inflamación pulmonar in vivo después de
inducir con antígeno, que los oligonucleótidos sin DAP.
La Figura 7B es un gráfico de barras que muestra
que los oligonucleótidos contra la cadena \beta común de
receptores de
IL-3/IL-5/GM-CSF,
que contienen DAP, son más eficaces para inhibir la inflamación
pulmonar in vivo después de inducir con antígeno, que los
oligonucleótidos sin DAP.
La Figura 7C es un gráfico de barras que muestra
que la combinación de dos oligonucleótidos que contienen DAP (total
50 \mug) es más eficaz para inhibir la inflamación pulmonar in
vivo después de enfrentamiento con antígeno, que la combinación
de dos oligonucleótidos regulares sin DAP.
La Figura 8 es un gráfico de barras que muestra
que la adenosina aumenta selectivamente la captación de eosinófilos
en los pulmones de ratas, mientras que la DAP no lo hace, y que la
DAP es un antagonista de los efectos proinflamatorios de la
adenosina.
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La presente invención se refiere a moléculas de
ácidos nucleicos tales como construcciones génicas y antisentidos
que podrían permanecer estables en el cuerpo, al tiempo que poner de
manifiesto alta eficacia y baja toxicidad.
Según un aspecto de la invención, se describe un
método para aumentar la eficacia in vivo de una molécula de
ácido nucleico que se administra a un mamífero. Este método
comprende la etapa de incorporar en la molécula de ácido nucleico
al menos un sustitutivo de nucleótidos. Como se verá en los ejemplos
que figuran más adelante en esta memoria, tal incorporación aumenta
la eficacia fisiológica in vivo de las moléculas de ácidos
nucleicos y asimismo reduce la toxicidad de las moléculas de ácidos
nucleicos cuando se administran a un mamífero, en comparación con
las moléculas de ácidos nucleicos que no incorporan el sustitutivo
de nucleótidos.
La "toxicidad reducida" de las moléculas de
ácidos nucleicos puede ser evaluada utilizando principios conocidos
en la técnica. Según una realización preferida de la invención, el
sustitutivo de nucleótidos se selecciona para que las moléculas de
ácidos nucleicos que incorporan el sustitutivo de nucleótidos pongan
de manifiesto menores propiedades inflamatorias in vivo, y
por ello poseen una toxicidad reducida. Más preferiblemente, el
sustitutivo de nucleótidos se selecciona para que las moléculas de
ácidos nucleicos que incorporan esta modificación sean capaces de
inhibir el aumento de linfocitos, eosinófilos, macrófagos y/o
neutrófilos, en el sitio en que estas moléculas de ácidos nucleicos
son administradas y/o en un sitio de enfermedad.
El sustitutivo de nucleótidos se incorpora en la
molécula de ácido nucleico para sustituir en ella una base de
adenosina. El sustitutivo de nucleótidos es
2,6-diaminopurina (véase la Fig. 1) o sus sales.
Según otro aspecto de la invención, se
proporciona una molécula de ácido nucleico, aislada o purificada,
que comprende un sustitutivo de nucleótidos seleccionado entre el
grupo que consiste en 2,6-diaminopurina y sus
sales, según se ha definido anteriormente. La molécula de ácido
nucleico de la invención puede consistir en un oligonucleótido
antisentido, un ARN de doble cadena (como ARNI) o una molécula de
ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un producto
génico terapéutico. El sustitutivo de nucleótidos se incorpora en la
molécula de ácido nucleico para sustituir en ella una base de
adenosina.
Tal como se usa en esta memoria, la expresión
"molécula de ácido nucleico" significa cualquier secuencia de
ADN, ARN o de una molécula que posee un nucleótido o más, incluyendo
secuencias de nucleótidos que codifican un gen completo. La
expresión se entiende que engloba todos los ácidos nucleicos tanto
si se presentan de modo natural o no natural, en una célula, tejido
u organismo particular. Esto incluye ADN y sus fragmentos, ARN y
sus fragmentos, cADNs y sus fragmentos, marcas de secuencias
expresadas, y secuencias artificiales que incluyen secuencias
artificiales aleatorizadas.
Las moléculas de ácidos nucleicos de la
invención son sintetizadas usando métodos bien conocidos en la
técnica. Pueden estar en la forma de un ADN, o un ARN, y pueden
comprender uno o una pluralidad de resto(s) de enlace a
mononucleótidos tales como restos metilfosfonato, fosfotriéster,
fosforotioato, fosfodiéster, fosforoditioato, boranofosfato,
formacetal, tioformacetal, tioéter, carbonato, carbamato, sulfato,
sulfonato, sulfamato, sulfonamida, sulfona, sulfito, sulfóxido,
sulfuro, hidroxilamina, metileno (metilmino), metilenoxi
(metilimino) y fosforamidato.
La base de DAP y sus análogos pueden
introducirse químicamente en secuencias de ADN y ARN usando química
convencional de fosforamidato. Alternativamente, puede incorporarse
DAP a ADN y ARN por métodos enzimáticos mediante el uso de
trifosfato de DAP y polimerasas, como es bien conocido en la
técnica. Interesantemente, el trifosfato de DAP actúa como un
verdadero análogo de ATP para enzimas sintéticas de ADN (Rackwitz,
H.R., et al., Eur. J. Biochem., 72:191-200,
1977).
Las moléculas de ácidos nucleicos de la
invención pueden también estar ligadas a moléculas "portadoras"
tales como restos de aminoácidos, péptidos, proteínas,
peptidomiméticos, compuestos químicos pequeños, ligandos, lípidos,
ácido nucleicos o carbohidratos.
El tamaño de las moléculas de ácidos nucleicos
de la invención puede variar dependiendo del uso que se desee,
teniendo el oligonucleótido típicamente desde 2 hasta
aproximadamente 10.000 nucleótidos. Más preferiblemente, el tamaño
de moléculas de ácidos nucleicos antisentido puede variar desde
aproximadamente 10 hasta aproximadamente 100 nucleótidos, mientras
que el tamaño de moléculas de ácidos nucleicos que comprenden una
secuencia que codifica un producto génico terapéutico podría
variar, típicamente, desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente
10.000 nucleótidos.
Las moléculas de ácidos nucleicos de la
invención pueden ser útiles para tratar y/o prevenir diversas
enfermedades. Ejemplos típicos de enfermedades que podrían
beneficiarse de las presentes moléculas de ácidos nucleicos incluyen
enfermedades del sistema respiratorio, enfermedades neurológicas,
enfermedades cardiovasculares, enfermedades reumatológicas,
enfermedades digestivas, enfermedades cutáneas, enfermedades
oftalmológicas, enfermedades del sistema urinario, cánceres,
infecciones por organismos patógenos, enfermedades genéticas,
hipereosinofilia, inflamación general, y cánceres. Las moléculas de
ácidos nucleicos más preferidas incluyen los oligonucleótidos que se
indican en la Tabla 1 que figura seguidamente aquí.
\vskip1.000000\baselineskip
Dado que las moléculas de ácidos nucleicos
sustituidas con DAP, de la invención, poseen una eficacia mejorada
y/o una toxicidad reducida, podrían usarse en terapia génica y en
métodos de vacunación con ADN. Por ejemplo, las moléculas de ácidos
nucleicos sustituidas con DAP podrían usarse como compuestos
terapéuticos para inhibir la multiplicación de organismos patógenos
del sistema respiratorio; como un compuesto terapéutico o una vacuna
para tratar o evitar la preparación de células neoplásicas en los
pulmones/las vías respiratorias/la nariz; como compuestos
terapéuticos o vacunas para tratar enfermedades genéticas de los
pulmones/las vías respiratorias/la nariz, tal como la fibrosis
quística; y como compuestos terapéuticos o vacunas para el
tratamiento y/o prevención del asma, alergias, la enfermedad
obstructiva crónica, la fibrosis pulmonar, la tos crónica y la
producción de moco, el síndrome de insuficiencia respiratoria del
adulto, la inflamación general, las enfermedades inflamatorias, el
cáncer, las infecciones por organismos patógenos (por ejemplo,
sinusitis, el virus sincitial respiratorio u otras infecciones
virales del tracto respiratorio), enfermedades genéticas o
cualesquiera enfermedades del sistema respiratorio. Además. la DAP
y sus análogos pueden insertarse en genes en lugar de la adenina o
cualquier otra base, o administrarse en asociación con los genes
(por ejemplo, incorporarse en una región codificante o no
codificante) con objeto de hacer disminuir la respuesta inmunitaria
que tiene lugar durante la terapia génica y/o mejorar la eficacia de
métodos de terapia génica.
Más particularmente, las moléculas de ácidos
nucleicos sustituidas con DAP podrían usarse para tratar infecciones
por organismos patógenos y/o evitar que ocurrieran, inhibiendo la
replicación de organismos patógenos del sistema respiratorio tales
como el virus sincitial respiratorio (RSV), rinovirus, virus de la
influenza, bacterias y otros agentes causantes de enfermedades. De
modo semejante, las moléculas de ácidos nucleicos sustituidas con
DAP que poseen actividad antitumoral, podrían usarse para el
tratamiento y prevención del cáncer de pulmón y otros cánceres. Las
moléculas de ADN o genes sustituidas con DAP podrían, también, ser
particularmente útiles para aplicaciones terapéuticas en las que no
se desea una respuesta inflamatoria al gen, como en el tratamiento
de enfermedades genéticas del tracto respiratorio (por ejemplo, la
fibrosis quística).
Dependiendo del uso deseado, puede ser necesario
que la molécula de ácido nucleico con DAP sea incorporada en un
vector, tal como un plásmido o un virus, y que comprenda una
secuencia que codifique un producto génico terapéutico.
Según una realización preferida de la invención,
las moléculas de ácidos nucleicos son oligonucleótidos antisentido.
Como se mostrará en los ejemplos que figuran más adelante en esta
memoria, los oligonucleótidos antisentido sustituidos con DAP
poseen una eficacia mejorada y/o una toxicidad reducida. Estos
oligonucleótidos antisentido podrían ser usados, por tanto, como
agente terapéutico o como una vacuna dirigidos contra al menos un
mediador o receptor de los pulmones/las vías respiratorias/la
nariz, como agente terapéutico para inhibir la reacción
inflamatoria que está presente en el asma o en las rinitis
alérgicas, y como agente terapéutico para evitar el desarrollo de
alergias o asma, o para desensibilizar a los pacientes con estas
enfermedades.
Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido
sustituidos con DAP podrían dirigirse contra secuencias de ácidos
nucleicos que codifican mediadores y receptores, u otros componentes
del proceso de inflamación, de modo que por inhibición de la
expresión de estas proteínas, el proceso inflamatorio podría
interrumpirse en los pulmones/las vías respiratorias (tratamiento
terapéutico del asma, la enfermedad obstructiva pulmonar crónica) o
en la nariz (rinitis alérgica) o en los senos (sinusitis
crónica).
Por tanto, otro aspecto de la invención se
refiere a un método de terapia antisentido, cuyo método comprende
la etapa de administrar a un mamífero necesitado de ello, una
cantidad terapéutico o profiláctica eficaz de al menos un
oligonucleótido antisentido, según se ha definido anteriormente.
Este método es particularmente útil para prevenir y/o tratar
enfermedades del sistema respiratorio, enfermedades neurológicas,
enfermedades cardiovasculares, enfermedades reumatológicas,
enfermedades digestivas, enfermedades cutáneas, enfermedades
oftalmológicas, enfermedades del sistema urinario, cánceres,
infecciones por organismos patógenos, enfermedades genéticas,
inflamación y cáncer en general.
Según una realización preferida, el
oligonucleótido de orientación antisentido ha de administrarse
directamente al sistema respiratorio para prevenir y/o tratar una
enfermedad del sistema respiratorio asociada con una inflamación de
los pulmones, las vías respiratorias y/o la nariz, tal como la
fibrosis pulmonar, el síndrome de insuficiencia respiratoria del
adulto, la fibrosis quística, la enfermedad obstructiva pulmonar
crónica, la bronquitis crónica, la bronquitis eosinofílica, el
asma, las rinitis alérgicas, las inusitis y la hipereosinofilia.
Preferiblemente, las moléculas de ácidos
nucleicos de la invención podrían ser incorporadas en una
composición farmacéutica que comprende al menos una de las
moléculas de ácidos nucleicos anteriormente definidas, y un
excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
La cantidad de moléculas de ácidos nucleicos
presente en la composición de la presente invención, es una cantidad
terapéuticamente eficaz. Una cantidad terapéuticamente eficaz de
moléculas de ácidos nucleicos, es la cantidad necesaria para que la
molécula de ácido nucleico realice su función biológica sin causar,
en el hospedante al que se administra la composición, efectos
negativos en exceso. La cantidad exacta de las moléculas de ácidos
nucleicos a usar y la composición que ha de ser administrada, puede
variar según factores tales como la actividad biológica del
oligonucleótido, el tipo de estado que ha de ser tratado, el modo de
administración, así como los otros ingredientes de la composición.
Típicamente, la composición estará compuesta desde aproximadamente
1% hasta aproximadamente 20% de la molécula o moléculas de ácidos
nucleicos, y se administrará, aproximadamente, 20 \mug hasta
aproximadamente 20 mg de la molécula de ácido nucleico.
El excipiente farmacéuticamente aceptable de la
composición puede seleccionarse entre el grupo que consiste en
excipientes sólidos, vehículos líquidos y excipientes de fase
gaseosa. Ventajosamente, el excipiente está seleccionado entre el
grupo que consiste en partículas de lípidos, vesículas de lípidos,
microcristales y tensioactivos.
Otros agentes pueden ser añadidos a la
composición de la invención. Por ejemplo, la composición de la
invención puede comprender también agentes tales como fármacos,
antioxidantes, tensioactivos, agentes saborizantes, aceites
volátiles, agentes de tamponamiento, dispersantes, propulsores, y
agentes conservantes. Para preparar tales composiciones
farmacéuticas pueden usarse métodos bien conocidos en la
técnica.
Las moléculas de ácidos nucleicos y la
composición de la invención pueden administrarse por diversas vías.
Por ejemplo, la composición puede administrarse en forma de
preparaciones inyectables estériles, por ejemplo, en forma de
suspensiones inyectables estériles, acuosas u oleaginosas. Estas
suspensiones pueden formularse según procedimientos conocidos en la
técnica usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de
suspensión. Las preparaciones inyectables estériles pueden ser
también soluciones o suspensiones inyectables estériles en el seno
de diluyentes o disolventes no tóxicos aceptables para la
administración por vía parenteral. Las soluciones o suspensiones
inyectables estériles pueden administrarse por vía parenteral, por
ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular o subcutánea, mediante
inyección o por infusión. Las moléculas de ácidos nucleicos y la
composición de la invención pueden formularse también en forma de
cremas o pomadas para administrar por vía tópica. También pueden
administrarse en las vías respiratorias de un sujeto por medio de un
distribuidor de aerosoles puesto bajo presión, un pulverizador
nasal, un nebulizador, un inhalador de dosis medidas, un inhalador
de polvo seco, o una cápsula. Las dosis adecuadas pueden cariar,
dependiendo de factores tales como la cantidad de cada uno de los
componentes de la composición, el efecto deseado (rápido o de larga
duración), la enfermedad o afección que ha de ser tratada, la vía
de administración y la edad y el peso del individuo a tratar. De
todos modos, para administrar las moléculas de ácidos nucleicos y la
composición de la invención, pueden usarse métodos bien conocidos en
la técnica.
\newpage
Como se demostrará en esta memoria ahora por
medio de ejemplos: (1) la presente invención proporciona una nueva
tecnología antisentido, basada en análogos de la
2,6-diaminopurina, que sustituye a la adenosina; (2)
no todos los sustitutivos de la adenosina son igualmente eficaces,
siendo la DAP y sus sales, sorprendentemente, más eficaces que
otros; (3) las moléculas de ácidos nucleicos de la invención son
igualmente, y sorprendentemente, incluso más eficaces en la
inhibición de la síntesis de proteínas diana que los
oligonucleótidos antisentido estándar; (4) que la tecnología
antisentido basada en DAP, según la presente invención, es más
potente y constituye un avance importante con respecto a las
tecnologías existentes, dado que los antisentidos basados en DAP
poseen efectos antiinflamatorios más relevantes que los
oligonucleótido antisentido convencionales; (5) las moléculas de
ácidos nucleicos con DAP parecen ejercer sus efectos
antiinflamatorios mediante un mecanismo que no parece estar
relacionado con la inhibición de los receptores de adenosina; (6)
las presentes moléculas de ácidos nucleicos poseen una toxicidad
reducida de modo importante para cualquier enfermedad inflamatoria
y/o de los pulmones/las vías respiratorias; (7) el uso de las
moléculas de ácidos nucleicos con DAP, composiciones y métodos de
la invención podrían ser más eficaces que el uso de antisentidos
regulares (que no contienen DAP); y (8) finalmente, la
2,6-diaminopurina per se y sus análogos
poseen actividad antiinflamatoria.
Los ejemplos que siguen son ilustrativos del
amplio intervalo de aplicabilidad de la presente invención y no
están destinados a limitar su alcance. Pueden hacerse modificaciones
y variaciones sin apartarse del alcance de la invención. Aun cuando
pueden emplearse en la práctica para el ensayo de la presente
invención, cualquier método y cualquier material similar o
equivalente a los descritos en esta memoria, se describen los
métodos y materiales preferidos.
Los oligonucleótidos antisentido (AS) son una
clase nueva de compuestos farmacéuticos que han sido descritos
profusamente en la bibliografía científica y de patentes. Esta
estrategia terapéutica podría aplicarse, potencialmente, a
cualquier enfermedad en que se piensa que una sobreexpresión de uno
o varios genes causa la presencia o persistencia de la enfermedad.
Una eficacia y una eficacia antiinflamatoria aumentadas podría hacer
que los AS fueran una estrategia terapéutica importante para todas
las enfermedades respiratorias con inclusión del asma, las
bronquitis, virales y de otras formas de infección, las rinitis, la
fibrosis quística, las bronquitis crónicas, la enfermedad pulmonar
obstructiva crónica, las toses eosinófilas y otras formas de tos. la
fibrosis pulmonar, el síndrome de insuficiencia respiratoria del
adulto, las conjuntivitis y otras formas de enfermedades
inflamatorias de los ojos o de la piel.
Una revisión de los efectos sistémicos y de la
toxicidad de los oligonucleótidos antisentido, ha sido resumida
por ST Crooke (Hematologic Pathology, 9; 5972; 1995). Un modo
de soslayar la toxicidad de los oligonucleótidos PS sería
administrarlos en el lugar de la enfermedad que están destinados a
tratar, minimizando la distribución sistémica y por tanto, la
toxicidad asociada con él. Los oligonucleótidos AS PS han sido
nebulizados a los pulmones de ratones o conejos (Templin MV et
al., Abtisense and nucleic acid drug development,
10:359-368; 2000; Ali S et al., Am. J.
Respir. Critic Care Med. 163: 989-993; 2001). Los
resultados obtenido han puesto de manifiesto que hay muy poca
distribución sistémica a las dosis que podrían considerarse
terapéuticamente eficaces. Sin embargo, a dosis más altas tiene
lugar un infiltrado celular multifocal en los pulmones de los
ratones, que comprende principalmente linfocitos y neutrófilos, con
algunos, pocos, macrófagos y monocitos. Aun cuando la base adenina
incluida en los oligonucleótidos puede tener efectos pro- o
antiinflamatorios, se ha indicado con anterioridad en la Patente WO
99/66037 que un oligonucleótido antisentido dirigido contra el
receptor CCR3 y que contiene 5 adenosinas por
18-mero (27,7% de adenosina) era eficaz para inhibir
la respuesta asmática in vivo en ratas.
Nadie ha ensayado sistemáticamente si el
reemplazo de bases por análogos podía afectar a la estabilidad,
unión, eficacia de degradación y toxicidad de los oligonucleótidos
antisentido, ni los han ensayado para determinar su actividad
biológica en células, en cultivo o en animales. Se ha encontrado que
la 2,6-diaminopurina (DAP) estaba presente en el
ADN en lugar de adenosina por el cianófago S-2L
(Cheng, X., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct.
24:293-318, 1995); Khudyakov, I.Y., et al.,
Virology 88: 8-18, 1978). La DAP altera la
estructura de DNA dúplex e introduce un tercer enlace de hidrógeno
en el dúplex D:T (similar a los tres enlaces de hidrógeno formados
por la citosina y la guanosina) en comparación con el dúplex A:T
(Chollett, A y Kawashima, E. of Biogen SA (Ginebra), Nucleic Acids
Researxh 16:305-17, 1988). Este enlace de hidrógeno
extra conduce a un aumento de la selectividad y de la fuerza de
hibridación durante la hibridación ADN-ADN, así como
también a la inhibición de la escisión de diversas enzimas de
restricción (Bailly, C. y Waring, M.J., Nucleic Acids Research,
23:885-92, 1995; Bailly, C. et al., PNAS
93:13623-8, 1996).
El grupo amino de N2 adicional del carbono C2 de
la DAP se usa para emparejamiento de bases. El enlace adicional
ocasiona una estabilidad aumentada del dúplex de ADN y hace más
hidrófilo el encaje menor de ambos B- y Z-DNA. La
sustitución de adenosina por DAP ocasiona un aumento de la T_{m}
del ADN que contiene DAP, la temperatura a la que dos hebras de ADN
complementarias duplexadas funden, de 1,5ºC por resto de DAP
(Hoheisel, J.D., Lehrach, H., FEBS Letters,
274:103-6, 1990). La DAP y sus análogos poseen, por
tanto, el potencial de aumentar la eficacia y la actividad
antiinflamatoria de los oligonucleótidos AS cuando está incluida en
los oligonucleótidos o bien como sustitución de una base, en
adición a las bases, cuando se incorpora a la terapia génica, o
bien, como puede verse más adelante, cuando se administra sola.
Se llevaron a cabo experimentos para determinar
si los oligonucleótidos antisentido descritos en la Solicitud de
Patente Internacional WO 99/66037 (incorporada en esta memoria),
dirigidos contra la subunidad beta común del receptor de
IL-3, IL-5 y GM-CSF,
podían inhibir la expresión y la función de este receptor cuando ha
sido modificado mediante el reemplazo de adenosina o bien por
2-amino-2'-desoxiadenosina,
o bien por inosina. Las células TF-1 y U937
expresan niveles altos de receptores de GM-CSF.
Además, las células TF-1 son dependientes de
GM-CSF para su supervivencia. Estas células fueron
cultivadas en medio RPMI 1640 suplementado con suero fetal de
ternera inactivado por calor, al 10%, penicilina, estreptomicina y
l-glutamina, a 37ºC en CO_{2} al 5% (las células
TF-1 fueron suplementadas con
GM-CSF). Durante 12 horas fueron cultivadas o bien
en medio sólo o en medio con oligonucleótidos sentido (107S:
5'-ACCATCCCGCTGCAGACCC-3' (SEQ ID
NO:19) o antisentido (107A:
5'-GGGTCTGCAGCGG
GATGGT-3'; SEQ ID NO.20), para la subunidad beta común del receptor de IL-3, IL-5 y GM-CSF. La secuencia del 107A-DAP era: 5'-GGGTCTGCDapQCGGGDapTGQT-3' (SEQ ID NO:21); la secuencia del 107A-inosina (107A-I) era: 5'-GGGTCTGCIGCGGGIT CGT-3' (SEQ ID NO:22). Las células fueron recuperadas y lavadas 3 veces. Se recu-
peró después el ARN y se determinó la presencia de la cadena beta del receptor mediante RT-PCR semicuantitativa.
GATGGT-3'; SEQ ID NO.20), para la subunidad beta común del receptor de IL-3, IL-5 y GM-CSF. La secuencia del 107A-DAP era: 5'-GGGTCTGCDapQCGGGDapTGQT-3' (SEQ ID NO:21); la secuencia del 107A-inosina (107A-I) era: 5'-GGGTCTGCIGCGGGIT CGT-3' (SEQ ID NO:22). Las células fueron recuperadas y lavadas 3 veces. Se recu-
peró después el ARN y se determinó la presencia de la cadena beta del receptor mediante RT-PCR semicuantitativa.
Ratas Brown Norway de 6-8
semanas de edad y 220-275 g de peso, fueron
obtenidas de Harlan-Sprague-Dawley
(Walkerville, MD). Las ratas se mantuvieron en estabularios
convencionales.
La sensibilización activa de ratas se llevó a
cabo mediante inyección subcutánea de 1 ml de solución salina que
contenía 1 mg de ovoalbúmina de huevo de pollo (OA) (Sigma, St.
Louis, MO) y 3,5 mg de gel de hidróxido de aluminio (BDH Chemicals,
Poole, UK).
El día 14 después de la sensibilización con
ovoalbúmina, después de anestesia general con pentotal, 65 mg/kg, e
intubación endotraqueal, se llevó a cabo la inducción por
ovoalbúmina inyectando por vía intratraqueal 200 microgramos de
ovoalbúmina en 60 \mul. Después de 8 horas ó 15 horas, las ratas
se intuban de nuevo con anestesia general y se efectúa un lavado
pulmonar consistente en 5 veces instilación de 5 ml de solución
salina al 0,9%. Se lavan las células, se someten a recuento y se
centrifuga sobre portas en un Cytospin III^{TM}. Se lleva a cabo
un recuento diferencial de células.
El equipo y la metodología que se emplearon para
medir la resistencia pulmonar fueron como los descritos
anteriormente (Renzi, P.M. et al., Am. Rev. Respir. Dis
146:163-169, 1992). Se indujo anestesia general o
bien con pentotal (50 mg/kg) o bien con uretano (1,1 g/kg), por vía
intraperitoneal. Luego se llevó a cabo intubación endotraqueal
usando un catéter de polietileno de 6 cm de longitud, de
PE-240^{TM}. Se usó una almohadilla calefactora
para mantener constante la temperatura corporal y se monitorizó la
temperatura rectal continuamente con un termómetro electrónico
(Telethermometer^{TM}, Yellow Springs Instrument Co.,
Yellowsprings, OH). La resistencia pulmonar (RL) se midió durante
la respiración periódica espontánea con los animales en posición de
decúbito lateral. Se midió el flujo colocando la punta del tubo
traqueal en el interior de una pequeña caja de Plexiglass^{TM}
(volumen, 265 ml) Un pneumotacógrafo Flelsh^{TM} Nº 0 acoplado a
un transductor de presión diferencial (MP-45+2 cm
H_{2}O; Validyne Corp. Northridge, CA) se unió al otro extremo de
la caja para medir el flujo de aire, y se obtuvo el volumen
mediante integración numérica de la señal del flujo. Se midieron los
cambios de la presión esofágica usando un catéter lleno con
solución salina y un transductor de presión diferencial (Sanborn
267 BC^{TM}; Hewlett Packard, Waltham, MA). El otro puerto del
transductor se conectó a la caja. El catéter esofágico consistía en
un tubo de polietileno (PE-200^{TM}) de 20 cm de
largo unido a un tubo (PE-100^{TM}) más corto (6
cm). La presión transpulmonar se computó como la diferencia entre la
presión esofágica y la presión de la caja. La respuesta de las vías
respiratorias se evaluó a partir de la RL, que se determinó
ajustando la ecuación de movimiento del pulmón mediante regresión
lineal múltiple usando un software comercial
(RHT-Infodat Inc., Montreal, Quebec, Canadá).
El día 14 después de sensibilizar con
ovoalbúmina, bajo anestesia general con pentotal, 65 mg/kg, e
intubación endotraqueal, se inyectaron por vía intratraqueal 60
\mug de un oligonucleótido AS PS dirigido contra la cadena Beta
común del receptor de GM-CSF, IL-3 e
IL-6 (AS141A:
6'-TGGCACTTTAGGTGGCTG-3'; SEQ ID
NO:23) de la rata. La resistencia pulmonar se midió en la línea de
base, cada cinco minutos, durante 30 minutos y a intervalos de 15
minutos. Los mismos experimentos fueron repetidos con AS141
modificado, en el que se había reemplazado adenosina por DAP,
AS141-DAP
(5'-TGGCDapCTTTDapGGTGGCTG-3';
SEQ ID NO:24) o por Inosina, AS141-I
(5'-TGGCITTTIGGTGGGCTG-3; SEQ ID NO:
25).
El día 14 después de sensibilizar se
anestesiaron ratas con pentotal (65 mg/kg), se intubó y se midió la
RL de la línea de base. Las ratas recibieron por vía intratraqueal
dosis crecientes de adenosina (CAS
58-61-7), sal hemisulfato de la
2,6-diaminopurina (CAS
69369-16-0), DAP
(2-amino-2-desoxiadenosina;
CAS 4546-70-7),
2-amino-9-(B-D-2'-desoxirribofuranosil)purina
(CAS 3616-24-8),
7-desaza-2'-desoxiadenosina
(CAS 60129-59-1),
N-6-metil-2'-desoxiadenosina
(CAS 2002-35-9),
2-aminoadenosina/2,6-diaminopurina
ribósido (CAS 2096-10-08) a lo
largo del intervalo de dosis de 0,125 \mug hasta 100 \mug en el
seno de 50 \mul o bien de solución salina o bien de solución
salina más ácido acético. Inmediatamente después de cada dosis se
midió la RL. Se disolvió DAP del modo siguiente: 3 mg de DAP se
mezclaron con 100 \mul de ácido acético, se ajustó a 1,5 a 3 ml
mediante la adición de solución salina y se calentó a 70ºC. Esto
proporcionó una concentración final de 1 a 2 \mug/\mul. Las
diluciones se llevaron a cabo en la misma solución tampón. Los
animales testigo recibieron solución salina con ácido acético en la
misma concentración final que se ha indicado.
Hemos indicado anteriormente que el ASA4
antisentido
(5'-ACTCATATTCATAGGGTG-3'; SEQ ID
NO:26) dirigido contra el receptor CCR3 de la rata, era eficaz para
inhibir el influjo de eosinófilos en los pulmones después de
inducir con el antígeno (véase el documento WO 99/66037). Empleamos
las mismas secuencias de oligonucleótidos para estos experimentos.
El día 14, las ratas fueron intubadas, bajo anestesia general, con
pentotal (65 mg/kg) y recibieron 200 \mug de ASA4,
ASA4-DAP
(5'-DapCTCDBpTDapTTCDapTDapCGGGTG-3;
SEQ ID NO:27), ASA4-DAP desajustado
(5'-CDapTCDapT
TDapTCATGDapGGTG-3'; SEQ ID NO:28),
AS141-DAP
(5'-TGGCDapCTTTDapGGTGGCTG-3';
SEQ ID NO:29), AS141-DAP desajustado
(5'-GTGCCDapTTTGDapGTGGC
TQ-3'; SEQ ID NO.30), una mezcla de ASA4-DAP y AS141-DAP (total de 100 \mug) o solución salina en el seno de 50 \mul de NaCl al 0,9%, por vía intratraqueal. Diez minutos más tarde, se llevó a cabo la inducción con ovoalbúmina mediante inyección de 200 microgramos de ovoalbúmina en el seno de 50 \mul de solución salina al 0,9%, por vía intratraqueal. Al cabo de 15 horas, las ratas fueron intubadas de nuevo bajo anestesia general se midió la resistencia pulmonar de la línea de base y concentraciones multiplicadas por dos de leucotrieno D4 fueron inyectadas por vía intratraqueal (50 ng a 1600 ng) hasta doblar la resistencia pulmonar de la línea de base (EC200).
TQ-3'; SEQ ID NO.30), una mezcla de ASA4-DAP y AS141-DAP (total de 100 \mug) o solución salina en el seno de 50 \mul de NaCl al 0,9%, por vía intratraqueal. Diez minutos más tarde, se llevó a cabo la inducción con ovoalbúmina mediante inyección de 200 microgramos de ovoalbúmina en el seno de 50 \mul de solución salina al 0,9%, por vía intratraqueal. Al cabo de 15 horas, las ratas fueron intubadas de nuevo bajo anestesia general se midió la resistencia pulmonar de la línea de base y concentraciones multiplicadas por dos de leucotrieno D4 fueron inyectadas por vía intratraqueal (50 ng a 1600 ng) hasta doblar la resistencia pulmonar de la línea de base (EC200).
El día 14, las ratas fueron intubadas bajo
anestesia general con pentotal (65 mg/kg) y recibieron 200 \mug
de ASA4, ASA4-DAP
(6'-DepCTCDapTDapTTCDapTDapGGGTG-3';
SEQ ID NO:27), AS141-DAP
(6'-TGGCDapCTTT
DapGGTGGCTG-3'; SEQ ID NO:29), AS141-DAP desajustado (6'-GTGCCDapTTTGDapOTGGCTG-3'; SEQ ID NO: 30), una mezcla de ASA4-DAP y AS141-DAP (total de 100 \mug), o solución salina, en 60 \mul de NaCl al 0,9%, por vía intratraqueal. Veinte minutos más tarde se llevó a cabo la inducción con ovoalbúmina inyectando 200 \mug de ovoalbúmina en el seno de 50 \mul de solución salina al 0,9%, por vía intratraqueal. Al cabo de 15 horas, las ratas fueron intubadas de nuevo bajo anestesia general, y se llevó a cabo un lavado pulmonar que consistía en 5 veces una instilación de 5 ml. Se lavaron las células, se sometieron a recuento y se centrifugaron sobre portas en un Cytospin III^{TM}. Finalmente se llevó a cabo un recuento diferencial de las células.
DapGGTGGCTG-3'; SEQ ID NO:29), AS141-DAP desajustado (6'-GTGCCDapTTTGDapOTGGCTG-3'; SEQ ID NO: 30), una mezcla de ASA4-DAP y AS141-DAP (total de 100 \mug), o solución salina, en 60 \mul de NaCl al 0,9%, por vía intratraqueal. Veinte minutos más tarde se llevó a cabo la inducción con ovoalbúmina inyectando 200 \mug de ovoalbúmina en el seno de 50 \mul de solución salina al 0,9%, por vía intratraqueal. Al cabo de 15 horas, las ratas fueron intubadas de nuevo bajo anestesia general, y se llevó a cabo un lavado pulmonar que consistía en 5 veces una instilación de 5 ml. Se lavaron las células, se sometieron a recuento y se centrifugaron sobre portas en un Cytospin III^{TM}. Finalmente se llevó a cabo un recuento diferencial de las células.
Catorce días después de la sensibilización, las
ratas fueron intubadas bajo anestesia, con pentotal (65 mg/kg) y se
inyectaron 100 \mug de adenosina o
2-amino-2'-desoxiadenosina
o de
2-amino-2'-desoxiadenosina
seguido 10 minutos más tarde por adenosina, o de solución salina,
por vía intratraqueal, en el seno de 50 \mul. Quince horas más
tarde, las ratas fueron intubadas, bajo anestesia general, con
pentotal, se llevó a cabo un lavado pulmonar, y las células fueron
sometidas a recuento como se ha descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Un primer conjunto de experimentos fue ideado
con objeto de determinar si el reemplazo de adenosina por DAP
afectaba a la eficacia in vitro de oligonucleótidos AS. Ha de
observarse en la Figura 2A que la eficacia biológica de antisentido
para la cadena Beta común del receptor humano de
GM-CSF, IL-3 e IL-5
no se ve afectada por el reemplazo de adenosina por
2-amino-2'-desoxiadenosina
en células U937 que expresan este receptor. El AS107 es un
oligonucleótido 19-mero que contiene 2 bases de
adenosina. Las bases de adenosina fueron reemplazadas por DAP
(AS107-DAP). Este oligonucleótido modificado era,
por lo menos, igualmente eficaz en el bloqueo de mARN para la
cadena Beta común cuando se evaluó mediante PCR semicuantitativa
(con G3PDH como gen de gobierno), que el AS107 que contenía
adenosina (AS 107).
Para confirmar la eficacia en otra línea
celular, se repitieron los experimentos en células TF1 que dependen
para su supervivencia de GM-CSF. Ha de apreciarse en
la Figura 2B que el AS107-DAP para la cadena Beta
común del receptor humano de GM-CSF,
IL-3 e IL-5, era, por lo menos,
igualmente eficaz en el bloqueo de la expresión de mARN, que el
AS107 que contiene adenosina (AS107). El reemplazo de adenosina por
DAP en oligonucleótidos antisentido es eficaz in vitro.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron experimentos con objeto de
determinar si la sustitución de adenosina podía afectar a la
eficacia de los oligonucleótidos antisentido. Ha de apreciarse en
la Figura 3, que la eficacia del mismo oligonucleótido antisentido
que se ha descrito anteriormente (AS107) se pierde cuando ambas
adenosinas son reemplazadas por inosina. El antisentido que
contenía inosina (AS107-I) no era eficaz para
inhibir la expresión de mARN cuando se evaluó mediante PCR
semicuantitativa y se comparó con el AS107 que contenía adenosina.
Se llevaron a cabo los experimentos incubando células U937 con
medio solo, AS107 ó AS107-I, en una concentración de
10 pmol, durante seis horas, antes de aislar el RNA y realizar la
PCR semicuantitativa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo experimentos para evaluar el
efecto sobre la resistencia pulmonar después de inyección
intratraqueal rápida de oligonucleótidos antisentido de
fosforotioato contenidos en 50 \mul de solución salina.
La Figura 4A ilustra los efectos de la
administración intratraqueal de un oligonucleótido antisentido de
fosforotioato dirigido contra la cadena Beta común de
GM-CSF, IL-3 e IL-5
de la rata (AS141, un oligonucleótido 19-mero que
contiene 2 adenosinas) y el efecto de un oligonucleótido antisentido
de fosforotioato sustituido con DAP (AS141-DAP) de
la misma secuencia, a una dosis de 60 \mug cada uno, sobre la
resistencia pulmonar de ratas Brown Norway (BN) sensibilizadas.
Para estos experimentos y los que siguen, se emplearon ratas Brown
Norway sensibilizadas según se ha descrito anteriormente (Renzi PM,
Am. Rev. Respir. Dis. 146:183-9; 1992). La inyección
de solución salina tamponada con fosfato causó un aumento ligero de
la resistencia pulmonar, aumento máximo de 25%. El antisentido
regular, que incluía menos de 15% de adenosina, causó un aumento
moderado de la resistencia pulmonar (87%) Los oligonucleótidos
modificados con DAP ocasionaron un aumento de ligero a moderado
(33%) de la resistencia pulmonar. Nyce ha sugerido en los
documentos WO 00/62736 y WO 00/09525, que el aumento de la
resistencia pulmonar es causado por la adenosina que está incluida
en el oligonucleótido. Sin embargo, los oligonucleótidos no podían
haber tenido tiempo de degradarse y liberar adenosina (unos pocos
minutos), y el oligonucleótido antisentido que se empleó contenía
solamente 10% de adenosina (que, según los documentos WO 00/62736 y
WO 00/09525, no tendrían efecto sobre la resistencia pulmonar).
Se llevó a cabo un ensayo para evaluar si los
broncoespasmos eran debidos a las 2 adenosinas que estaban
reemplazadas en el AS141, por 2 inosinas, dado que es sabido que la
inosina no causa broncoconstricción de los pulmones/vías
respiratorias en comparación con la adenosina (Mann, J.C. et
al., J. Appl. Physiol. 61:1667-76, 1986). Como
muestra la Figura 4B, la administración intratraqueal del mismo
oligonucleótido de fosforotioato antisentido dirigido contra la
cadena Beta común de GM-CSF, IL-3 e
IL-6 de la rata (AS141) en que la adenosina había
sido sustituida por inosina (AS141-inosina), causó
también un aumento temporal de la resistencia pulmonar (en 108%).
Estos resultados ponen de manifiesto que la inyección intratraqueal
de oligonucleótidos antisentido aumenta temporalmente la resistencia
pulmonar mediante un mecanismo que no parece estar relacionado con
la adenosina.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluaron los efectos de la administración
intratraqueal de análogos de DAP y de adenosina, sobre la
resistencia pulmonar, en ratas Brown Norway. Como muestra la Figura
5, se estudiaron la adenosina, la DAP y cinco diferentes análogos
de DAP. Para cada uno de los compuestos, se estudió un mínimo de
seis ratas y se presenta el % medio de la resistencia pulmonar de
la línea de base en función de la dosis intratraqueal de DAP o sus
análogos. Como puede apreciarse en esta Figura, la resistencia
pulmonar aumenta gradualmente hasta el pico en una concentración de
5 \mug de adenosina, mientras que esto no ocurre con la
2-amino-2'-desoxiadenosina
(DAP) ni sus análogos en estudio. Estos resultados ponen de
manifiesto, que al contrario que la adenosina, la DAP y sus análogos
no aumentan significativamente la resistencia pulmonar. Dado que
los oligonucleótidos se degradan progresivamente dentro de los
pulmones, puede ser inesperadamente ventajoso usar estos compuestos
en lugar de adenosina.
La actividad biológica in vivo de
oligonucleótidos antisentido modificados con DAP, dirigidos contra
el CCR3 de la rata y la cadena Beta común de los receptores de
IL-3/IL-5/GM-CSF en
el modelo de asma de la rata, se demuestra en la Figura 6A. El ASA4
es un oligonucleótido antisentido de fosforotioato
18-mero que se ha puesto de manifiesto que inhibe
el receptor CCR3 y que inhibe el influjo de eosinófilos que tiene
lugar después de inducción con el antígeno (véase el documento WO
99/66037). El AS141 es, también, un oligonucleótido antisentido de
fosforotioato 18-mero, que se ha indicado que inhibe
la cadena Beta común de los receptores de
IL-3/IL-5/GM-CSF y
que inhibe el influjo de eosinófilo que ocurre después de inducción
con el antígeno (véase el documento WO 99/66037). El ASA4 contiene
5 bases de adenosina (28% de adenosina). El AS143 contiene 2 bases
de adenosina. Hay que hacer notar que el ASA4-DAP
disminuye de modo importante el grado de reacción de las vías
respiratorias al leucotrieno D4 15 horas después de realizar la
inducción con ovoalbúmina, en comparación con ratas que no habían
recibido AS (testigo inducido; p<0,01) o ratas tratadas,
desajustadas, con DAP. Ha de apreciarse también que el
ASA4-DAP tendía a ser más eficaz que el ASA4 sin
modificar y no era diferente de los resultados obtenidos a partir
de ratas sin inducir. El AS141 disminuyó asimismo de modo importante
el hiper-grado de reacción a LTD_{4} (P<0,05)
en comparación con las ratas testigo inducidas con el antígeno y las
ratas desajustadas tratadas con el 141-DAP. Además,
el grado de reacción de las vías respiratorias al LTD_{4}
disminuyó de modo importante en las ratas tratadas con la
combinación de CCR3 y los oligonucleótidos de la cadena \beta
común, en comparación con cada uno de los oligonucleótidos
antisentido, y esta combinación era tan eficaz como la combinación
de oligonucleótidos con DAP (50 \mug, total;
Figura 6B).
Figura 6B).
\vskip1.000000\baselineskip
Estos experimentos fueron llevados a cabo con
oligonucleótidos antisentido dirigidos contra el receptor CCR3 de
la rata o la cadena Beta común de IL-3,5 y
GM-CSF. Ratas sensibilizadas e inducidas con
ovoalbúmina fueron tratadas por inyección intratraqueal de
solución salina, 200 \mug de ASA4 regular ó 200 \mug de
ASA4-DAP diez minutos antes de la inducción con
ovoalbúmina. Después de 15 horas, las ratas fueron anestesiadas,
intubadas, y se llevó a cabo un lavado broncoalveolar para
establecer el recuento total y diferencial de células. Los
resultados indican que la administración de ambos, el ASA4 regular
(Figura 7A) y el AS 141 (Figura 7B) y ambos
ASA4-DAP y AS141-DAP, inhibían
eficazmente la captación de eosinófilos (en 84% y 83%,
respectivamente; Figura 7A). Sin embargo el AS4DAP tendía a hacer
disminuir la captación de neutrófilos y macrófagos y disminuía de
modo importante la captación de linfocitos (en 74%) El
141-DAP hizo disminuir de modo importante también la
captación de macrófagos (p<0,05). La combinación de dos
oligonucleótidos A4-DAP y 141-DAP
(200 \mug en total) también hizo disminuir de modo importante la
captación de linfocitos y de macrófagos (Figura 7C). Estos
resultados ponen de manifiesto que los oligonucleótidos modificados
con DAP no solamente son eficaces sino que también poseen un efecto
antiinflamatorio más amplio que el de los oligonucleótidos
regulares.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro experimento, grupos de seis ratas Brown
Norway sensibilizadas pero sin inducir, fueron anestesiadas con
pentotal e intubadas por vía endotraqueal. Las ratas recibieron
luego una inyección intratraqueal de o bien (1) solución salina
(testigo), (2) 100 \mug de adenosina, (3) 100 \mug de
2-amino-2'-desoxiadenosina
(DAP) ó (4) 100 \mug de DAP seguidos de 100 \mug de adenosina
10 minutos más tarde. Las ratas fueron despertadas, reanestesiadas
e intubadas 16 horas más tarde para efectuar un lavado pulmonar. Las
células que estaban presentes en los medios recogidos del lavado
fueron sometidas a recueeento y se obtuvo un diferencial sobre
portas de Cytoapin^{TM}.
Como indica la Figura 8, la adenosina es
proinflamatoria en los pulmones, conduciendo a una captación
selectiva de eosinófilos (un aumento mayor de 10 veces), sin afectar
significativamente a otros tipos de células. Por el contrario, la
DAP no aumenta la proporción de células del lavado pulmonar e inhibe
completamente la captación de eosinófilos inducida por la
adenosina.
\newpage
A la vista de lo que antecede, los
oligonucleótidos antisentido sustituidos con DAP poseen las ventajas
que siguen en comparación con los antisentidos sin modificar o los
antisentidos modificados con inosina:
- a)
- Como muestran las Figuras 1 a 8 y está documentado en la presente solicitud de patente, la estructura y propiedades químicas de DAP y de análogos de DAP son diferentes de las de la adenosina. Estas propiedades químicas diferentes hacen que los oligonucleótidos antisentido que contienen DAP y/o análogos de DAP tengan propiedades químicas, propiedades de hibridación y estabilidad diferentes, en comparación con los antisentidos sin modificar.
- b)
- El Ejemplo 1 muestra como los antisentidos de fosforotioato con DAP son eficaces en diferentes líneas celulares, in vitro.
- c)
- El Ejemplo 2 muestra que no todos los sustitutivos de adenosina son eficaces para inhibir genes cuando están incorporados en oligonucleótidos antisentido de fosforotioato (como se pone de manifiesto con la inosina).
- d)
- El Ejemplo 3 muestra que tiene lugar un aumento de la resistencia pulmonar después de inyección intratraqueal de oligonucleótidos antisentido de fosforotioato, y que este aumento no está relacionado con la adenosina. En realidad, aun cuando la inosina no estimula los receptores de adenosina, se aprecia un aumento de la resistencia pulmonar con oligonucleótidos con inosina. No obstante, este aumento fue menos importante con oligonucleótidos modificados con DAP.
- e)
- El Ejemplo 4 muestra que, aunque diferentes sustitutivos de adenosina, DAP y análogos de DAP tienen efectos diferentes sobre la resistencia pulmonar cuando se inyectan por vía intratraqueal in vivo, estos compuestos eran todos mucho menos tóxicos que la adenosina. Por ejemplo, como muestra la Figura 5, en la toxicidad de adenosina pico (6 \mug), la clasificación relativa de los compuestos ensayados fue adenosina>N6-Metil-2'desoxiadenosina> resto, con inclusión de DAP. Sin embargo en una concentración 5 veces menor (1 \mug) la clasificación de toxicidad era diferente con adenosina>2-amino-2-desoxiadenosina/DAP>el resto. La base de DAP libre se usó como testigo estructural para determinar si el azúcar era requerida para la toxicidad.
- f)
- El Ejemplo 5 muestra que los oligonucleótidos antisentido de fosforotioato modificados con DAP son eficaces para inhibir el hiper- grado de reacción de las vías respiratorias al leucotrieno D4 que tiene lugar después de inducción con el antígeno, in vivo, y tienden a ser mas eficaces que los oligonucleótidos PS convencionales. La combinación de dos oligonucleótidos modificados con DAP es más eficaz que cada uno de los oligonucleótidos aislado, lo que confirma sinergismo.
- g)
- El Ejemplo 6 muestra que los oligonucleótidos antisentido de fosforotioato, modificados con DAP, son más eficaces que los oligonucleótidos antisentido convencionales para inhibir la inflamación de las vías respiratorias que tiene lugar después de inducción con el antígeno, in vivo. Para el ASA4 había fuertes tendencias a disminución de neutrófilos y macrófagos y también un descenso importante de linfocitos, mientras que estos efectos no fueron encontrados con oligonucleótidos antisentido PS convencionales. Para el AS141 había fuertes tendencias a disminuciones de neutrófilos y también un descenso importante de linfocitos y macrófagos, mientras que estos efectos no fueron encontrados con los oligonucleótidos antisentido PS convencionales. Para la combinación de ASA4 y AS141, había fuertes tendencias a disminuciones de neutrófilos así como un descenso importante de linfocitos y macrófagos, mientras que estos efectos no eran encontrados con los oligonucleótidos antisentido PS convencionales.
- h)
- El Ejemplo 7 muestra que la adenosina posee un efecto proinflamatorio en los pulmones de la rata, captando selectivamente eosinófilos, y que no posee un efecto importante sobre los linfocitos. Al mismo tiempo, el Ejemplo 7 muestra que la DAP bloquea el influjo de eosinófilos, una demostración de que la DAP, per se, es un antagonista de la adenosina.
\vskip1.000000\baselineskip
Los 7 Ejemplos anteriores ponen de manifiesto
que los antisentidos sustituidos con DAP y los antisentidos con
análogos de DAP, son intrínsecamente más eficaces y mucho menos
tóxicos para los pulmones/las vías respiratorias que los nucleósidos
sin adenosina o los compuestos antisentido que contienen adenosina,
sin modificar.
Asimismo, al contrario de lo que ha sido
sugerido en los documentos WO 00/09525 y WO 00/62736, las adenosinas
contenidas en los antisentidos no son proinflamatorias, puesto que
antisentidos con hasta 28% de bases de adenosina eran capaces de
inhibir el influjo de eosinófilos tanto como los antisentidos que no
contenían adenosina sino DAP (véase la Figura 7). Sin embargo,
puesto que los oligonucleótidos que contienen DAP inhibían también
el influjo de linfocitos y macrófagos (Figura 7) y que la adenosina
no afecta al influjo de linfocitos (Figura 8), parece que la DAP
contenida en oligonucleótidos antisentido ejerce sus efectos
mediante un mecanismo que no está relacionado con el receptor o los
receptores de adenosina.
En resumen, los antisentidos con DAP
proporcionan, por tanto, una plataforma tecnológica mejorada para el
desarrollo de terapéuticas y vacunas con compuestos antisentido,
para el tratamiento y prevención de enfermedades respiratorias
tales como asma, rinitis alérgica, enfermedad obstructiva crónica,
tos eosinofílica, fibrosis pulmonar, fibrosis quística, infecciones
por organismos patógenos, enfermedades genéticas y cáncer de pulmón,
y cualquier otra enfermedad en que la inflamación es una
consecuencia. Asimismo, la DAP per se y sus análogos poseen
un fuerte potencial en fármacos antiinflamatorios para inhibir la
inflamación en mamíferos.
Aun cuando varias realizaciones de la invención
han sido descritas, se entenderá que la presente invención es capaz
de modificaciones adicionales, y que la presente solicitud de
patente está destinada a cubrir cualesquiera variaciones, usos o
adaptaciones de la invención, siguiendo, en general, los principios
de la invención e incluyendo desviaciones de la presente
descripción tales como vienen incluidas dentro del conocimiento de
la práctica habitual en la técnica a que pertenece la invención.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> TOPIGEN PHARMACEUTIQUE INC.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MÉTODOS PARA AUMENTAR LA EFICACIA
IN VIVO DE OLIGONUCLEÓTIDOS E INHIBIR LA INFLAMACIÓN EN
MAMÍFEROS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 009958-0002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> U.S. 60/303.071
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
06-07-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente
sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagaccttcat gttcccagag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente
sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttcccagag cttgccacct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente
sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgcaagac cttcatgtt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
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<220>
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<223> La secuencia está completamente
sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskipcgcccacagc ccgcagagcc
\hfill20
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<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente
sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctccatgcag cctctcgcct
\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente
sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgccggcgc agagcagcag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 20
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente
sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente
sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill19
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<211> 19
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente
sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 19
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente
sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill19
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente
sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagggtctg cagcgggat
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente
sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente
sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagcgggatg gttcttct
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente
sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtctgcagcg ggatggttt
\hfill19
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 19
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente
sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgggccatc agtgctctg
\hfill19
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente
sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccctgacata gtggatc
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente
sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptagcatggca ctgggc
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente
sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagccagtc ctagcgagc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente
sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccatcccgc tgcagaccc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente
sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtctgcag cgggatggt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente
sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde al nucleósido
de 2,6-diaminopurina (DAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde al nucleósido
de 2,6-diaminopurina (DAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtctgcng cgggntggt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente
sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde a una
inosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde a una
inosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtctgcng cgggntggt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente
sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggcacttta ggtggctg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente
sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde al nucleósido
de 2,6-diaminopurina (DAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)..(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde al nucleósido
de 2,6-diaminopurina (DAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggcnctttn ggtggctg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente
sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde a una
inosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)..(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde a una
inosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggcnctttn ggtggctg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente
sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactcatattc atagggtg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente
sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde al nucleósido
de 2,6-diaminopurina (DAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde al nucleósido
de 2,6-diaminopurina (DAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde al nucleósido
de 2,6-diaminopurina (DAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde al nucleósido
de 2,6-diaminopurina (DAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)..(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde al nucleósido
de 2,6-diaminopurina (DAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipnctcntnttc ntngggtg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente
sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde al nucleósido
de 2,6-diaminopurina (DAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde al nucleósido
de 2,6-diaminopurina (DAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde al nucleósido
de 2,6-diaminopurina (DAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde al nucleósido
de 2,6-diaminopurina (DAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcntcnttntc atgnggtg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente
sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde al nucleósido
de 2,6-diaminopurina (DAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)..(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde al nucleósido
de 2,6-diaminopurina (DAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggcnctttn ggtggctg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente
sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde al nucleósido
de 2,6-diaminopurina (DAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde al nucleósido
de 2,6-diaminopurina (DAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgccntttg ngtggctg
\hfill18
Claims (49)
1. Una molécula de ácido nucleico aislada o
purificada que es un oligonucleótido que posee una secuencia
seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOs:
1-6, 8-18 y 21, 24, 27, 28, 30, (i)
que comprende un sustitutivo de nucleótidos seleccionado entre el
grupo que consiste en 2,6-diaminopurina y sus sales,
o (ii) en el que al menos un nucleótido de adenosina del
oligonucleótido está reemplazado con dicho sustitutivo de
nucleótidos.
2. La molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 1, en la que dicho sustitutivo de nucleótidos es la
2,6-diaminopurina.
3. La molécula de ácido nucleico según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, que comprende al menos un
resto de enlace de mononucleótidos seleccionado entre el grupo que
consiste en restos de metilfosfonato, fosfotriéster, fosforotioato,
fosfodiéster, fosforoditioato, boranofosfato, formacetal,
tioformacetal, tioéter, carbonato, carbamato, sulfato, sulfonato,
sulfamato, sulfonamida, sulfona, sulfito, sulfóxido, sulfuro,
hidroxilamina, metileno (metilmino), metilenoxi (metilimino) y
fosforamidato.
4. La molécula de ácido nucleico según una
cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que
dicha molécula de ácido nucleico consiste en ADN.
5. La molécula de ácido nucleico según una
cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que
dicha molécula de ácido nucleico consiste en ARN.
6. La molécula de ácido nucleico según una
cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la
molécula de ácido nucleico comprende desde 2 hasta aproximadamente
10.000 nucleótidos.
7. La molécula de ácido nucleico según una
cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que
dicha molécula de ácido nucleico está enlazada a una molécula
seleccionada entre el grupo que consiste en restos de aminoácidos,
péptidos, proteínas, peptidomiméticos, compuestos químicos pequeños,
ligandos, lípidos, ácidos nucleicos o hidratos de carbono.
8. La molécula de ácido nucleico según una
cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que
dicha molécula de ácido nucleico es un oligonucleótido
antisentido.
9. La molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 8, en la que dicho oligonucleótido antisentido
comprende desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 100
nucleótidos.
10. La molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 9, en la que dicho oligonucleótido antisentido tiene
la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO:21.
11. La molécula de ácido nucleico según una
cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que
dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia que
codifica un producto génico terapéutico.
12. La molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 1, en la que dicha molécula de ácido nucleico posee
la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO:21 y comprende al
menos un resto de enlace de fosforotioato.
13. La molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 12, en la que dicha molécula de ácido nucleico
comprende una pluralidad de restos de enlace de fosforotioato.
14. La molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 13, en la que todos los nucleótidos de dicha molécula
de ácido nucleico están enlazados por restos de fosforotioato.
15. Una composición farmacéutica que comprende
al menos una molécula de ácido nucleico seleccionada entre el grupo
que consiste en las moléculas de ácidos nucleicos definidas en las
reivindicaciones 1-11, y un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
16. La composición según la reivindicación 15,
para tratar y/o prevenir una enfermedad seleccionada entre el grupo
que consiste en enfermedades del sistema respiratorio, enfermedades
neurológicas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades
reumatológicas, enfermedades digestivas, enfermedades cutáneas,
enfermedades oftalmológicas, enfermedades del sistema utinario,
cánceres, infecciones por organismos patógenos, enfermedades
genéticas, hipereosinofilia, inflamación general, y cánceres.
17. La composición según una cualquiera de la
reivindicación 15 y 16, en la que dicha molécula de ácido nucleico
está presente en una cantidad de aproximadamente 1% hasta
aproximadamente el 90% de la composición.
18. La composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 15-17, que comprende, además, un
agente seleccionado entre el grupo que consiste en fármacos,
antioxidantes, tensioactivos, agentes saborizantes, aceites
volátiles, agentes de tamponamiento, agentes dispersantes,
propulsores y agentes conservantes.
19. La composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 15-18, en la que dicho excipiente
farmacéuticamente aceptable está seleccionado entre el grupo que
consiste en excipientes sólidos, vehículos líquidos y vehículos de
fase gaseosa.
20. La composición según la reivindicación 19,
en la que dicho excipiente farmacéuticamente aceptable está
seleccionado entre el grupo que consiste en partículas de lípidos,
vesículas de lípidos, microcristales y tensioactivos.
21. La composición según la reivindicación 15,
para tratar y/o prevenir una dolencia asociada con una inflamación
de los pulmones.
22. La composición según la reivindicación 15,
para tratar y/o prevenir una enfermedad del sistema respiratorio
seleccionada entre el grupo que consiste en fibrosis pulmonar, el
síndrome de insuficiencia respiratoria del adulto, la fibrosis
quística, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la bronquitis
crónica, la bronquitis eosinofílica, el asma, la alergia, la rinitis
alérgica, las sinusitis y la hipereosinofilia.
23. La composición según la reivindicación 22,
en la que la enfermedad del sistema respiratorio es el asma, y en la
que dicho oligonucleótido posee una secuencia de ácidos nucleicos
seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID
NOs:1-6, 8-18.
24. La composición según la reivindicación 15,
para administración directa al sistema respiratorio.
25. La composición según la reivindicación 15,
para administración por medio de un dispensador de aerosoles
presurizado, un pulverizador nasal, un nebulizador, un inhalador de
dosis medidas, un inhalador de polvos secos, o una cápsula.
26. La composición según la reivindicación 15,
en la que dicha molécula de ácido nucleico posee la secuencia de
ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 21 y comprende al menos un resto de
enlace de fosforotioato.
27. La composición según la reivindicación 26,
en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende una pluralidad
de restos de enlace de fosforotioato.
28. La composición según la reivindicación 27,
en la que todos los nucleótidos de dicha molécula de ácido nucleico
están enlazados mediante restos de fosforotioato.
29. El uso de una molécula de ácido nucleico,
aislada o purificada, según una cualquiera de las reivindicaciones
1-14, para la preparación de un medicamento para
terapia con antisentidos.
30. El uso según la reivindicación 29, en la que
dicho medicamento es para prevenir o tratar una enfermedad
seleccionada entre el grupo que consiste en enfermedades del sistema
respiratorio, enfermedades neurológicas, enfermedades
cardiovasculares, enfermedades reumatológicas, enfermedades
digestivas, enfermedades cutáneas, enfermedades oftalmológicas,
enfermedades del sistema urinario, cánceres, infecciones por
organismos patógenos, enfermedades genéticas, inflamación general y
cáncer.
31. El uso según la reivindicación 29, en el que
dicho medicamento es para prevenir o tratar una enfermedad del
sistema respiratorio que es una dolencia asociada con una
inflamación de los pulmones, las vías respiratorias y/o la
nariz.
32. El uso según la reivindicación 29, en el que
dicho medicamento es para prevenir o tratar una enfermedad del
sistema respiratorio seleccionada entre el grupo que consiste en
fibrosis pulmonar, el síndrome de insuficiencia respiratoria del
adulto, la fibrosis quística, la enfermedad pulmonar obstructiva
crónica, la bronquitis crónica, la bronquitis eosinófila, el asma,
la alergia, la rinitis alérgica, las sinusitis y la
hipereosinofilia.
33. Un método de preparación de una molécula de
ácido nucleico aislada o purificada, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-11, que comprende reemplazar por
lo menos una adenosina del oligonucleótido con un sustitutivo de
nucleótidos, en el que dicho sustitutivo de nucleótidos está
seleccionado entre en grupo que consiste en
2,6-diaminopurina y sus sales.
34. El método según la reivindicación 33, en el
que dicho sustitutivo de nucleótidos es
2,6-diaminopurílico.
35. El uso de un sustitutivo de nucleótidos
seleccionado entre el grupo que consiste en
2,6-diamonopurina y sus sales, para reemplazar por
lo menos un resto de adenosina de un oligonucleótido con dicho
sustitutivo de nucleótidos, para aumentar la eficacia
antiinflamatoria in vivo de un oligonucleótido.
36. El uso según la reivindicación 35, en el que
dicho sustitutivo de nucleótidos es la
2,6-diaminopurina.
37. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 35-36, en el que dicha molécula de
ácido nucleico consiste en ADN.
38. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 35-36, en el que dicha molécula de
ácido nucleico consiste en ARN.
39. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 35-38, en el que la molécula de
ácido nucleico comprende desde 2 hasta aproximadamente 10.000
nucleótidos.
40. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 35-39, en el que dicha molécula de
ácido nucleico está enlazada a una molécula seleccionada entre el
grupo que consiste en restos de aminoácidos, péptidos, proteínas,
peptidomiméticos, compuestos químicos pequeños, ligandos, lípidos,
ácidos nucleicos, o hidratos de carbono.
41. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 35-40, en el que dicha molécula de
ácido nucleico es un oligonucleótido antisentido.
42. El uso según la reivindicación 41, en la que
dicho oligonucleótido antisentido comprende desde aproximadamente 10
hasta aproximadamente 100 nucleótidos.
43. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 35-40, en el que dicha molécula de
ácido nucleico comprende una secuencia que codifica un producto
génico terapéutico.
44. El uso según la reivindicación 41, en el que
dicho oligonucleótido antisentido está dirigido a prevenir o tratar
una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en:
enfermedades del sistema respiratorio, enfermedades neurológicas,
enfermedades cardiovasculares, enfermedades reumatológicas,
enfermedades digestivas, enfermedades cutáneas, enfermedades
oftalmológicas, enfermedades del sistema urinario, cánceres,
infecciones por organismos patógenos, enfermedades genéticas,
inflamación general y cáncer.
45. El uso según la reivindicación 41, en el que
dicho oligonucleótido antisentido está dirigido a prevenir o tratar
una enfermedad del sistema respiratorio que es una dolencia asociada
con una inflamación de los pulmones, las vías respiratorias y/o la
nariz.
46. El uso según la reivindicación 41, en el que
dicho oligonucleótido antisentido está dirigido a prevenir o tratar
un sistema respiratorio seleccionado entre el grupo que consiste en
fibrosis pulmonar, el síndrome de insuficiencia respiratoria del
adulto, la fibrosis quística, la enfermedad pulmonar obstructiva
crónica, la bronquitis crónica, la bronquitis eosinófila, el asma,
la alergia, la rinitis alérgica, las sinusitis y la
hipereosinofilia.
47. El uso según la reivindicación 35, en el que
el oligonucleótido que resulta posee la secuencia de ácidos
nucleicos de SEQ ID NO:21 y comprende al menos un resto de enlace de
fosforotioato.
48. El uso según la reivindicación 47, en el que
oligonucleótido que resulta comprende una pluralidad de restos de
enlace de fosforotioato.
49. El uso según la reivindicación 48, en el que
todos los nucleótidos del oligonucleótido que resulta están
enlazados por restos de fosforotioato.
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