ES2301659T3 - Metodos para aumentar la eficacia in vivo de oligonucleotidos e inhibir la inflamacion en mamiferos. - Google Patents

Metodos para aumentar la eficacia in vivo de oligonucleotidos e inhibir la inflamacion en mamiferos. Download PDF

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Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada o purificada que es un oligonucleótido que posee una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1-6, 8-18 y 21, 24, 27, 28, 30, (i) que comprende un sustitutivo de nucleótidos seleccionado entre el grupo que consiste en 2,6-diaminopurina y sus sales, o (ii) en el que al menos un nucleótido de adenosina del oligonucleótido está reemplazado con dicho sustitutivo de nucleótidos

Description

Métodos para aumentar la eficacia in vivo de oligonucleótidos e inhibir la inflamación en mamíferos.
Solicitud relacionada
Esta solicitud reivindica prioridad de la Solicitud Provisional de Estados Unidos 60/1303.071 presentada el 6 de Julio de 2001, cuya descripción se incorpora aquí por referencia en su totalidad.
Fundamento de la invención (a) Campo de la invención
La invención se refiere al uso de sustitutivos de nucleótidos para aumentar la eficacia in vivo de moléculas de ácidos nucleicos y también para inhibir la inflamación en mamíferos.
Más particularmente, la presente invención se refiere al uso de 2,6-diaminopurina (DAP) y sus análogos per se en composiciones antiinflamatorias, y también para preparar moléculas de ácidos nucleicos que poseen una eficacia fisiológica aumentada in vivo y una toxicidad reducida.
(a) Descripción breve de la técnica anterior
Los enfoques terapéuticos basados en el uso de moléculas de ácidos nucleicos están llegando a ser más y más populares. Las terapias génicas y las terapias basadas en antisentidos cambiarán, probablemente, de modo radical la medicina en un futuro cercano.
Los problemas existentes hasta la fecha con moléculas de ácidos nucleicos como agentes terapéuticos, y más particularmente, con oligonucleótidos antisentido, han sido la toxicidad (tanto sístémica como tópica), la estabilidad y la unión inespecífica a las proteínas de la superficie celular. La toxicidad de los oligonucleótidos antisentido parece variar entre especies, siendo las ratas las más sensibles, aun cuando la toxicidad aparece a dosis más altas que aquellas que son eficaces desde el punto de vista terapéutico (véase la publicación de ST Crooke, Hematologic Pathology, 1995, 9:5972 para una revisión). En enfermedades respiratorias pulmonares la toxicidad de las moléculas de ácidos nucleicos asociada con la administración de genes/antisentidos terapéuticos incluyen: un aumento de la estimulación inmunitaria, un infiltrado celular mononuclear-inflamatorio en los pulmones, y, posiblemente, hipersensibilidad y broncoconstricción de las vías respiratorias.
Varias soluciones, que son menos que óptimas, han sido propuestas hasta la fecha para soslayar el problema de la toxicidad. Entre las más populares está la preparación de moléculas de ácidos nucleicos que contienen diversas bases de ADN modificadas, bases de ARN modificadas y/o estructura de la cadena principal modificada. Por ejemplo, el documento WO 99/67378 describe construcciones de oligonucleótidos antisentido basadas en azúcares modificados. Asimismo, Nyce ha postulado, aun cuando no lo ha demostrado, en el documento WO 00/09525 y en el documento WO 00/62736, que la base de adenosina incluida en oligonucleótidos antisentido para tratar enfermedades respiratorias, es la causa principal de toxicidad en los pulmones. Por consiguiente, Nyce propone oligonucleótidos con bajo contenido de adenosina y oligonucleótidos en los que la base de adenosina ha sido reemplazada por un análogo de adenosina. No obstante, ninguno de los oligonucleótidos de bajo contenido de adenosina y ninguno de los análogos de adenosina propuestos por Nyce han sido ensayados nunca para determinar su actividad biológica o su toxicidad pretendidamente reducida.
Se ha encontrado que el nucleósido 2,6-diaminopurina (2-amino-2'-desoxiadenosina; DAP) estaba presente en ADN en lugar de adenosina por el cianófago S-2L (Chemg, X., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24:293-318,1995); Khudyakov, I.Y., et al., Virology 88:8-18, 1978). Desde entonces el nucleósido de 2,6-diaminopurina (DAP) ha sido ampliamente usado y estudiado, en especial como punto de partida químico para la síntesis de compuestos antivirales tales como la 2-amino-2',3'-didesoxiadenosina (no DAP) que es capaz de inhibir selectivamente la replicación in vitro del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) (Baizarini, J. et al., Biochem. and Biophys. Res. Communications 145:269-76 (1987). Sin embargo, el uso de DAP en oligonucleótidos antisentido o en métodos de terapia génica nunca ha sido sugerido.
Asimismo, las Patentes de EE.UU. Nº 5.925.624 y Nº 5.889.178, describen derivados de 2,6-diaminopurina-beta-D-ribofuranuronamida. Aun cuando estos derivados poseen efecto antiinflamatorio (la mayor parte de las veces contra la liberación de superóxidos de neutrófilos) y que estos derivados podrían usarse en el tratamiento terapéutico de enfermedades respiratorias, poseen una fórmula química que es diferente de la fórmula de DAP y sus análogos.
El documento WO 00/12563 describe procedimientos para incorporar en oligonucleótidos 2-aminoadenosina y análogos de 2-aminoadenosina.
En resumen, no ha existido hasta la fecha ni sugerencia ni ejemplo de que la DAP y sus análogos pudieran incorporarse en moléculas de ácidos nucleicos (construcciones génicas y antisentidos) para aumentar la eficacia in vivo de estos oligonucleótidos.
Existe una gran necesidad sentida de moléculas de ácidos nucleicos que pudieran permanecer estables en el cuerpo al tiempo que poner de manifiesto alta eficacia y baja toxicidad.
Existe más particularmente la necesidad de moléculas de ácidos nucleicos que incorporen un sustitutivo de nucleótidos tal como la 2,6-diaminopurina (DAP) y sus análogos, la necesidad de una composición que comprenda los mismas y la necesidad de métodos de uso de estas moléculas de ácidos nucleicos, en particular en métodos de terapias génicas y antisentidos. Nadie ha ensayado nunca si el reemplazo de una o más bases por sustitutivos de nucleótidos podía afectar a la estabilidad unión, eficacia de degradación y toxicidad de oligonucleótidos antisentido, ni han ensayado tales oligonucleótidos antisentido modificados para determinar su actividad biológica en células, en cultivos o en animales.
La presente invención cumple estas necesidades así como otras necesidades que serán evidentes para los expertos en la técnica al leer la memoria descriptiva que sigue.
Sumario de la invención
Un objeto de la invención es proporcionar moléculas de ácidos nucleicos tales como construcciones génicas y oligonucleótidos antisentido que podrían permanecer estables en el cuerpo al tiempo que exhibir alta eficacia y baja toxicidad.
Según un aspecto de la invención, se describe un método para aumentar la eficacia in vivo de una molécula de ácido nucleico que es administrada a un mamífero, que comprende incorporar en la molécula de ácido nucleico al menos un sustituido de nucleótidos. Tal incorporación aumenta la eficacia fisiológica in vivo de la molécula de ácido nucleico y reduce, asimismo, su toxicidad cuando se administra a un mamífero, en comparación con una molécula de ácido nucleico que no incorpore el sustitutivo de nucleótidos. El sustitutivo de nucleótidos se incorpora en la molécula de ácido nucleico para sustituir una base de adenosina. El sustitutivo de nucleótidos se selecciona entre el grupo que consiste en 2,6-diaminopurina y sus sales.
La invención se refiere también a un método mejorado para la administración in vivo de al menos una molécula de ácido nucleico a un mamífero. La mejora consiste en incorporar en la molécula de ácido nucleico al menos una 2,6-diaminopurina y/o una de sus sales. La 2,6-diaminopurina o su sal se incorpora en la molécula de ácido nucleico para sustituir en ella una base de adenosina.
Según otro aspecto de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico, aislada o purificada, seleccionada entre oligonucleótidos antisentido y moléculas de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia que codifica un producto génico terapéutico, comprendiendo la molécula de ácido nucleico según la presente invención un sustitutivo de nucleótidos seleccionado entre el grupo que consiste en 2,6-diaminopurina y sus sales.
Según otro aspecto de la invención, se proporciona una composición terapéutica que comprende al menos una molécula de ácido nucleico según se ha definido anteriormente, y un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico. La composición de la invención puede ser útil para tratar y/o prevenir una enfermedad seleccionada entre enfermedades del sistema respiratorio, enfermedades neurológicas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades reumatológicas, enfermedades digestivas, enfermedades cutáneas, enfermedades oftalmológicas, enfermedades del sistema urinario, cánceres, infecciones por organismos patógenos, y enfermedades genéticas, hipereosinofilia, inflamación general, y cánceres.
Según otro aspecto de la invención, se describe un método de terapia antisentido, que comprende la etapa de administrar directamente al sistema respiratorio de un mamífero necesitado de ello, una cantidad eficaz, terapéutica o profiláctica, de al menos un oligonucleótido antisentido según se ha definido anteriormente. Este método es útil para prevenir y/o tratar enfermedades del sistema respiratorio, cánceres, infecciones por organismos patógenos, y enfermedades genéticas, y más particularmente, enfermedades del sistema respiratorio asociadas con inflamación de los pulmones, las vías respiratorias y/o la nariz, tales como fibrosis pulmonar, síndrome de insuficiencia respiratoria del adulto, fibrosis quística, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, bronquitis crónica, bronquitis eosinofílica, asma, alergia, sinusitis, virus sincitial respiratorio u otras infecciones virales del tracto respiratorio e hipereosinofilia.
La presente invención proporciona también el uso de la molécula de ácido nucleico anterior, aislada o purificada, para la fabricación de un medicamento para terapia antisentido.
La presente invención proporciona, adicionalmente, un método de preparación de una molécula de ácido nucleico, aislada o purificada, según se ha definido anteriormente, que comprende reemplazar al menos un resto de adenosina del oligonucleótido, por DAP o una de sus sales.
La presente invención proporciona, además, el uso de DAP y sus sales para reemplazar al menos un resto de adenosina de un oligonucleótido, para aumentar la eficacia antiinflamatoria in vivo de dicho oligonucleótido.
Los objetos de la invención están definidos en las reivindicaciones que se acompañan.
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Descripción breve de los dibujos
Las Figuras 1A, 1B, 1C y 1D muestran la estructura química de adenina, adenosina, inosina, 2,6-diaminopurina (2-amino-2'-desoxiadenosina; DAP) y diferentes análogos de DAP.
La Figura 2A son representaciones de PCRs semicuantitativas que muestran la eficacia biológica de diferentes antisentidos para la cadena Beta común del receptor humano de GM-CSF , IL-3, e IL-5 en células U937. 1 = células sin tratar; 2 = células tratadas con AS107 antisentido; 3 = Células tratadas con el antisentido AS107 que contiene DAP en lugar de 2 bases de adenosina (AS107-DAP); y M = marcadores de pesos moleculares. G3PDH 460 bp = es el número de bases en que se encuentra el gen que gobierna G3PDH ; GM-CSFR\beta 340 bp: es el número de bases en que se encuentra la banda de la cadena Beta común.
La Figura 2B es una representación de PCRs semicuantitativas que muestran la eficacia biológica de antisentidos para la cadena Beta común del receptor humano de GM-CSF, IL-3 e IL-5, en células TF-1. 1 = células sin tratar; 2 = células tratadas con el antisentido AS107; 3 = Células tratadas con el antisentido AS107 que contiene DAP en lugar de 2 bases de adenosina (AS107-DAP); y M = marcadores de pesos moleculares. G3PDH 460 bp es el número de bases en que se encuentra el gen que gobierna G3PDH, cadena \beta 340 bp es el número de bases en que se encuentra la banda de la cadena Beta común.
La Figura 3 es una representación de PCRs semicuantitativas que muestra la ineficacia biológica de células TF-1 de reemplazar adenosina por su análogo inosina en el antisentido, respecto a la cadena Beta común del receptor humano de GM-CSF, IL-3 e IL-5. 1 = TF-1 Testigo (células sin tratar); 2 = células tratadas con AS107 sentido; 3 = Células tratadas con el antisentido AS107; 4 = Células tratadas con el antisentido AS107 que contiene inosina en lugar de 2 bases de adenosina (AS107-I); 5 = Células tratadas con el antisentido AS107 que tiene un desajuste de una base; y M = marcadores de pesos moleculares. G3PDH 450 bp es el número de bases en que se encuentra el gen que gobierna G3PDH; cadena \beta 340 bp es el número de bases en que se encuentra la banda de la cadena Beta común.
La Figura 4A es una gráfica que muestra los efectos sobre la resistencia pulmonar de ratas Brown Norway sensibilizadas, de la administración intratraqueal de un oligonucleótido de fósforotioato antisentido (AS 141) dirigido contra la cadena Beta común de GM-CSF, IL-3 e IL-5 de rata, en comparación con los efectos del mismo antisentido que contiene DAP en lugar de 2 bases de adenosina (AS141-DAP). La resistencia pulmonar se midió 0-2 horas después de administrar una dosis de 60 \mug de cada uno de los oligonucleótidos.
La Figura 4B es una gráfica que muestra los efectos sobre la resistencia pulmonar de ratas Brown Norway sensibilizadas, de la administración intratraqueal de un oligonucleótido de fosforotioato antisentido (AS141) dirigido contra la cadena Beta común de GM-CSF, IL-3 e IL-6 de rata, en comparación con el mismo antisentido que contiene inosina en lugar de 2 bases de adenosina (AS-141-inosina). La resistencia pulmonar se midió 0-2 horas después de administrar una dosis de 60 \mug de cada uno de los oligonucleótidos.
La Figura 5 es una gráfica que muestra los efectos sobre la resistencia pulmonar de la rata sensibilizada, de la instilación intratraqueal de adenosina, DAP (2-amino-2'-desoxiadenosina) y sus análogos.
La Figura 6A es un gráfico de barras que muestra que la incorporación de DAP en oligonucleótidos antisentido a CCR3\cdot de la rata y la cadena \beta común de los receptores de IL-3/IL-5/GM-CSF aumenta la eficacia fisiológica in vivo de estos antisentidos. La actividad biológica de los antisentidos fue medida en el modelo de asma de la rata. Testigo sin inducir; Testigo inducido; Ratas tratadas con 200 \mug de los antisentidos ASA4 y AS141 (18 nucleótidos); Ratas tratadas con 200 \mug de los antisentidos ASA4 y AS141 que contienen DAP en lugar de bases de adenosina (ASA4-DAP; 141-DAP); Ratas tratadas con 200 \mug de los antisentidos ASA4 y AS141desajustados; y Ratas tratadas con 200 \mug de los antisentidos ASA4-DAP y AS141-DAP desajustados. El grado de reacción a leucotrieno D4 se midió 15 horas despues de enfrentamiento con ovoalbúmina.
La Figura 6B es un gráfico de barras que muestra que la combinación de dos oligonucleótidos regulares y dos oligonucleótidos que contienen DAP (total 60 \mug) es más eficaz que 50 \mug de cada uno de los oligonucleótidos aislado.
La Figura 7A es un gráfico de barras que muestra que oligonucleótidos contra CCR3 que contiene DAP son más eficaces para inhibir la inflamación pulmonar in vivo después de inducir con antígeno, que los oligonucleótidos sin DAP.
La Figura 7B es un gráfico de barras que muestra que los oligonucleótidos contra la cadena \beta común de receptores de IL-3/IL-5/GM-CSF, que contienen DAP, son más eficaces para inhibir la inflamación pulmonar in vivo después de inducir con antígeno, que los oligonucleótidos sin DAP.
La Figura 7C es un gráfico de barras que muestra que la combinación de dos oligonucleótidos que contienen DAP (total 50 \mug) es más eficaz para inhibir la inflamación pulmonar in vivo después de enfrentamiento con antígeno, que la combinación de dos oligonucleótidos regulares sin DAP.
La Figura 8 es un gráfico de barras que muestra que la adenosina aumenta selectivamente la captación de eosinófilos en los pulmones de ratas, mientras que la DAP no lo hace, y que la DAP es un antagonista de los efectos proinflamatorios de la adenosina.
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Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos tales como construcciones génicas y antisentidos que podrían permanecer estables en el cuerpo, al tiempo que poner de manifiesto alta eficacia y baja toxicidad.
Según un aspecto de la invención, se describe un método para aumentar la eficacia in vivo de una molécula de ácido nucleico que se administra a un mamífero. Este método comprende la etapa de incorporar en la molécula de ácido nucleico al menos un sustitutivo de nucleótidos. Como se verá en los ejemplos que figuran más adelante en esta memoria, tal incorporación aumenta la eficacia fisiológica in vivo de las moléculas de ácidos nucleicos y asimismo reduce la toxicidad de las moléculas de ácidos nucleicos cuando se administran a un mamífero, en comparación con las moléculas de ácidos nucleicos que no incorporan el sustitutivo de nucleótidos.
La "toxicidad reducida" de las moléculas de ácidos nucleicos puede ser evaluada utilizando principios conocidos en la técnica. Según una realización preferida de la invención, el sustitutivo de nucleótidos se selecciona para que las moléculas de ácidos nucleicos que incorporan el sustitutivo de nucleótidos pongan de manifiesto menores propiedades inflamatorias in vivo, y por ello poseen una toxicidad reducida. Más preferiblemente, el sustitutivo de nucleótidos se selecciona para que las moléculas de ácidos nucleicos que incorporan esta modificación sean capaces de inhibir el aumento de linfocitos, eosinófilos, macrófagos y/o neutrófilos, en el sitio en que estas moléculas de ácidos nucleicos son administradas y/o en un sitio de enfermedad.
El sustitutivo de nucleótidos se incorpora en la molécula de ácido nucleico para sustituir en ella una base de adenosina. El sustitutivo de nucleótidos es 2,6-diaminopurina (véase la Fig. 1) o sus sales.
Según otro aspecto de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico, aislada o purificada, que comprende un sustitutivo de nucleótidos seleccionado entre el grupo que consiste en 2,6-diaminopurina y sus sales, según se ha definido anteriormente. La molécula de ácido nucleico de la invención puede consistir en un oligonucleótido antisentido, un ARN de doble cadena (como ARNI) o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un producto génico terapéutico. El sustitutivo de nucleótidos se incorpora en la molécula de ácido nucleico para sustituir en ella una base de adenosina.
Tal como se usa en esta memoria, la expresión "molécula de ácido nucleico" significa cualquier secuencia de ADN, ARN o de una molécula que posee un nucleótido o más, incluyendo secuencias de nucleótidos que codifican un gen completo. La expresión se entiende que engloba todos los ácidos nucleicos tanto si se presentan de modo natural o no natural, en una célula, tejido u organismo particular. Esto incluye ADN y sus fragmentos, ARN y sus fragmentos, cADNs y sus fragmentos, marcas de secuencias expresadas, y secuencias artificiales que incluyen secuencias artificiales aleatorizadas.
Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención son sintetizadas usando métodos bien conocidos en la técnica. Pueden estar en la forma de un ADN, o un ARN, y pueden comprender uno o una pluralidad de resto(s) de enlace a mononucleótidos tales como restos metilfosfonato, fosfotriéster, fosforotioato, fosfodiéster, fosforoditioato, boranofosfato, formacetal, tioformacetal, tioéter, carbonato, carbamato, sulfato, sulfonato, sulfamato, sulfonamida, sulfona, sulfito, sulfóxido, sulfuro, hidroxilamina, metileno (metilmino), metilenoxi (metilimino) y fosforamidato.
La base de DAP y sus análogos pueden introducirse químicamente en secuencias de ADN y ARN usando química convencional de fosforamidato. Alternativamente, puede incorporarse DAP a ADN y ARN por métodos enzimáticos mediante el uso de trifosfato de DAP y polimerasas, como es bien conocido en la técnica. Interesantemente, el trifosfato de DAP actúa como un verdadero análogo de ATP para enzimas sintéticas de ADN (Rackwitz, H.R., et al., Eur. J. Biochem., 72:191-200, 1977).
Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención pueden también estar ligadas a moléculas "portadoras" tales como restos de aminoácidos, péptidos, proteínas, peptidomiméticos, compuestos químicos pequeños, ligandos, lípidos, ácido nucleicos o carbohidratos.
El tamaño de las moléculas de ácidos nucleicos de la invención puede variar dependiendo del uso que se desee, teniendo el oligonucleótido típicamente desde 2 hasta aproximadamente 10.000 nucleótidos. Más preferiblemente, el tamaño de moléculas de ácidos nucleicos antisentido puede variar desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 100 nucleótidos, mientras que el tamaño de moléculas de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia que codifica un producto génico terapéutico podría variar, típicamente, desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 10.000 nucleótidos.
Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención pueden ser útiles para tratar y/o prevenir diversas enfermedades. Ejemplos típicos de enfermedades que podrían beneficiarse de las presentes moléculas de ácidos nucleicos incluyen enfermedades del sistema respiratorio, enfermedades neurológicas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades reumatológicas, enfermedades digestivas, enfermedades cutáneas, enfermedades oftalmológicas, enfermedades del sistema urinario, cánceres, infecciones por organismos patógenos, enfermedades genéticas, hipereosinofilia, inflamación general, y cánceres. Las moléculas de ácidos nucleicos más preferidas incluyen los oligonucleótidos que se indican en la Tabla 1 que figura seguidamente aquí.
TABLA 1 Oligonucleótidos antisentido para tratar o prevenir enfermedades atópicas y proliferación de células neoplásicas
1 
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Dado que las moléculas de ácidos nucleicos sustituidas con DAP, de la invención, poseen una eficacia mejorada y/o una toxicidad reducida, podrían usarse en terapia génica y en métodos de vacunación con ADN. Por ejemplo, las moléculas de ácidos nucleicos sustituidas con DAP podrían usarse como compuestos terapéuticos para inhibir la multiplicación de organismos patógenos del sistema respiratorio; como un compuesto terapéutico o una vacuna para tratar o evitar la preparación de células neoplásicas en los pulmones/las vías respiratorias/la nariz; como compuestos terapéuticos o vacunas para tratar enfermedades genéticas de los pulmones/las vías respiratorias/la nariz, tal como la fibrosis quística; y como compuestos terapéuticos o vacunas para el tratamiento y/o prevención del asma, alergias, la enfermedad obstructiva crónica, la fibrosis pulmonar, la tos crónica y la producción de moco, el síndrome de insuficiencia respiratoria del adulto, la inflamación general, las enfermedades inflamatorias, el cáncer, las infecciones por organismos patógenos (por ejemplo, sinusitis, el virus sincitial respiratorio u otras infecciones virales del tracto respiratorio), enfermedades genéticas o cualesquiera enfermedades del sistema respiratorio. Además. la DAP y sus análogos pueden insertarse en genes en lugar de la adenina o cualquier otra base, o administrarse en asociación con los genes (por ejemplo, incorporarse en una región codificante o no codificante) con objeto de hacer disminuir la respuesta inmunitaria que tiene lugar durante la terapia génica y/o mejorar la eficacia de métodos de terapia génica.
Más particularmente, las moléculas de ácidos nucleicos sustituidas con DAP podrían usarse para tratar infecciones por organismos patógenos y/o evitar que ocurrieran, inhibiendo la replicación de organismos patógenos del sistema respiratorio tales como el virus sincitial respiratorio (RSV), rinovirus, virus de la influenza, bacterias y otros agentes causantes de enfermedades. De modo semejante, las moléculas de ácidos nucleicos sustituidas con DAP que poseen actividad antitumoral, podrían usarse para el tratamiento y prevención del cáncer de pulmón y otros cánceres. Las moléculas de ADN o genes sustituidas con DAP podrían, también, ser particularmente útiles para aplicaciones terapéuticas en las que no se desea una respuesta inflamatoria al gen, como en el tratamiento de enfermedades genéticas del tracto respiratorio (por ejemplo, la fibrosis quística).
Dependiendo del uso deseado, puede ser necesario que la molécula de ácido nucleico con DAP sea incorporada en un vector, tal como un plásmido o un virus, y que comprenda una secuencia que codifique un producto génico terapéutico.
Según una realización preferida de la invención, las moléculas de ácidos nucleicos son oligonucleótidos antisentido. Como se mostrará en los ejemplos que figuran más adelante en esta memoria, los oligonucleótidos antisentido sustituidos con DAP poseen una eficacia mejorada y/o una toxicidad reducida. Estos oligonucleótidos antisentido podrían ser usados, por tanto, como agente terapéutico o como una vacuna dirigidos contra al menos un mediador o receptor de los pulmones/las vías respiratorias/la nariz, como agente terapéutico para inhibir la reacción inflamatoria que está presente en el asma o en las rinitis alérgicas, y como agente terapéutico para evitar el desarrollo de alergias o asma, o para desensibilizar a los pacientes con estas enfermedades.
Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido sustituidos con DAP podrían dirigirse contra secuencias de ácidos nucleicos que codifican mediadores y receptores, u otros componentes del proceso de inflamación, de modo que por inhibición de la expresión de estas proteínas, el proceso inflamatorio podría interrumpirse en los pulmones/las vías respiratorias (tratamiento terapéutico del asma, la enfermedad obstructiva pulmonar crónica) o en la nariz (rinitis alérgica) o en los senos (sinusitis crónica).
Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un método de terapia antisentido, cuyo método comprende la etapa de administrar a un mamífero necesitado de ello, una cantidad terapéutico o profiláctica eficaz de al menos un oligonucleótido antisentido, según se ha definido anteriormente. Este método es particularmente útil para prevenir y/o tratar enfermedades del sistema respiratorio, enfermedades neurológicas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades reumatológicas, enfermedades digestivas, enfermedades cutáneas, enfermedades oftalmológicas, enfermedades del sistema urinario, cánceres, infecciones por organismos patógenos, enfermedades genéticas, inflamación y cáncer en general.
Según una realización preferida, el oligonucleótido de orientación antisentido ha de administrarse directamente al sistema respiratorio para prevenir y/o tratar una enfermedad del sistema respiratorio asociada con una inflamación de los pulmones, las vías respiratorias y/o la nariz, tal como la fibrosis pulmonar, el síndrome de insuficiencia respiratoria del adulto, la fibrosis quística, la enfermedad obstructiva pulmonar crónica, la bronquitis crónica, la bronquitis eosinofílica, el asma, las rinitis alérgicas, las inusitis y la hipereosinofilia.
Preferiblemente, las moléculas de ácidos nucleicos de la invención podrían ser incorporadas en una composición farmacéutica que comprende al menos una de las moléculas de ácidos nucleicos anteriormente definidas, y un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
La cantidad de moléculas de ácidos nucleicos presente en la composición de la presente invención, es una cantidad terapéuticamente eficaz. Una cantidad terapéuticamente eficaz de moléculas de ácidos nucleicos, es la cantidad necesaria para que la molécula de ácido nucleico realice su función biológica sin causar, en el hospedante al que se administra la composición, efectos negativos en exceso. La cantidad exacta de las moléculas de ácidos nucleicos a usar y la composición que ha de ser administrada, puede variar según factores tales como la actividad biológica del oligonucleótido, el tipo de estado que ha de ser tratado, el modo de administración, así como los otros ingredientes de la composición. Típicamente, la composición estará compuesta desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 20% de la molécula o moléculas de ácidos nucleicos, y se administrará, aproximadamente, 20 \mug hasta aproximadamente 20 mg de la molécula de ácido nucleico.
El excipiente farmacéuticamente aceptable de la composición puede seleccionarse entre el grupo que consiste en excipientes sólidos, vehículos líquidos y excipientes de fase gaseosa. Ventajosamente, el excipiente está seleccionado entre el grupo que consiste en partículas de lípidos, vesículas de lípidos, microcristales y tensioactivos.
Otros agentes pueden ser añadidos a la composición de la invención. Por ejemplo, la composición de la invención puede comprender también agentes tales como fármacos, antioxidantes, tensioactivos, agentes saborizantes, aceites volátiles, agentes de tamponamiento, dispersantes, propulsores, y agentes conservantes. Para preparar tales composiciones farmacéuticas pueden usarse métodos bien conocidos en la técnica.
Las moléculas de ácidos nucleicos y la composición de la invención pueden administrarse por diversas vías. Por ejemplo, la composición puede administrarse en forma de preparaciones inyectables estériles, por ejemplo, en forma de suspensiones inyectables estériles, acuosas u oleaginosas. Estas suspensiones pueden formularse según procedimientos conocidos en la técnica usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión. Las preparaciones inyectables estériles pueden ser también soluciones o suspensiones inyectables estériles en el seno de diluyentes o disolventes no tóxicos aceptables para la administración por vía parenteral. Las soluciones o suspensiones inyectables estériles pueden administrarse por vía parenteral, por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular o subcutánea, mediante inyección o por infusión. Las moléculas de ácidos nucleicos y la composición de la invención pueden formularse también en forma de cremas o pomadas para administrar por vía tópica. También pueden administrarse en las vías respiratorias de un sujeto por medio de un distribuidor de aerosoles puesto bajo presión, un pulverizador nasal, un nebulizador, un inhalador de dosis medidas, un inhalador de polvo seco, o una cápsula. Las dosis adecuadas pueden cariar, dependiendo de factores tales como la cantidad de cada uno de los componentes de la composición, el efecto deseado (rápido o de larga duración), la enfermedad o afección que ha de ser tratada, la vía de administración y la edad y el peso del individuo a tratar. De todos modos, para administrar las moléculas de ácidos nucleicos y la composición de la invención, pueden usarse métodos bien conocidos en la técnica.
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Como se demostrará en esta memoria ahora por medio de ejemplos: (1) la presente invención proporciona una nueva tecnología antisentido, basada en análogos de la 2,6-diaminopurina, que sustituye a la adenosina; (2) no todos los sustitutivos de la adenosina son igualmente eficaces, siendo la DAP y sus sales, sorprendentemente, más eficaces que otros; (3) las moléculas de ácidos nucleicos de la invención son igualmente, y sorprendentemente, incluso más eficaces en la inhibición de la síntesis de proteínas diana que los oligonucleótidos antisentido estándar; (4) que la tecnología antisentido basada en DAP, según la presente invención, es más potente y constituye un avance importante con respecto a las tecnologías existentes, dado que los antisentidos basados en DAP poseen efectos antiinflamatorios más relevantes que los oligonucleótido antisentido convencionales; (5) las moléculas de ácidos nucleicos con DAP parecen ejercer sus efectos antiinflamatorios mediante un mecanismo que no parece estar relacionado con la inhibición de los receptores de adenosina; (6) las presentes moléculas de ácidos nucleicos poseen una toxicidad reducida de modo importante para cualquier enfermedad inflamatoria y/o de los pulmones/las vías respiratorias; (7) el uso de las moléculas de ácidos nucleicos con DAP, composiciones y métodos de la invención podrían ser más eficaces que el uso de antisentidos regulares (que no contienen DAP); y (8) finalmente, la 2,6-diaminopurina per se y sus análogos poseen actividad antiinflamatoria.
Ejemplos
Los ejemplos que siguen son ilustrativos del amplio intervalo de aplicabilidad de la presente invención y no están destinados a limitar su alcance. Pueden hacerse modificaciones y variaciones sin apartarse del alcance de la invención. Aun cuando pueden emplearse en la práctica para el ensayo de la presente invención, cualquier método y cualquier material similar o equivalente a los descritos en esta memoria, se describen los métodos y materiales preferidos.
A) Introducción
Los oligonucleótidos antisentido (AS) son una clase nueva de compuestos farmacéuticos que han sido descritos profusamente en la bibliografía científica y de patentes. Esta estrategia terapéutica podría aplicarse, potencialmente, a cualquier enfermedad en que se piensa que una sobreexpresión de uno o varios genes causa la presencia o persistencia de la enfermedad. Una eficacia y una eficacia antiinflamatoria aumentadas podría hacer que los AS fueran una estrategia terapéutica importante para todas las enfermedades respiratorias con inclusión del asma, las bronquitis, virales y de otras formas de infección, las rinitis, la fibrosis quística, las bronquitis crónicas, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, las toses eosinófilas y otras formas de tos. la fibrosis pulmonar, el síndrome de insuficiencia respiratoria del adulto, las conjuntivitis y otras formas de enfermedades inflamatorias de los ojos o de la piel.
Una revisión de los efectos sistémicos y de la toxicidad de los oligonucleótidos antisentido, ha sido resumida por ST Crooke (Hematologic Pathology, 9; 5972; 1995). Un modo de soslayar la toxicidad de los oligonucleótidos PS sería administrarlos en el lugar de la enfermedad que están destinados a tratar, minimizando la distribución sistémica y por tanto, la toxicidad asociada con él. Los oligonucleótidos AS PS han sido nebulizados a los pulmones de ratones o conejos (Templin MV et al., Abtisense and nucleic acid drug development, 10:359-368; 2000; Ali S et al., Am. J. Respir. Critic Care Med. 163: 989-993; 2001). Los resultados obtenido han puesto de manifiesto que hay muy poca distribución sistémica a las dosis que podrían considerarse terapéuticamente eficaces. Sin embargo, a dosis más altas tiene lugar un infiltrado celular multifocal en los pulmones de los ratones, que comprende principalmente linfocitos y neutrófilos, con algunos, pocos, macrófagos y monocitos. Aun cuando la base adenina incluida en los oligonucleótidos puede tener efectos pro- o antiinflamatorios, se ha indicado con anterioridad en la Patente WO 99/66037 que un oligonucleótido antisentido dirigido contra el receptor CCR3 y que contiene 5 adenosinas por 18-mero (27,7% de adenosina) era eficaz para inhibir la respuesta asmática in vivo en ratas.
Nadie ha ensayado sistemáticamente si el reemplazo de bases por análogos podía afectar a la estabilidad, unión, eficacia de degradación y toxicidad de los oligonucleótidos antisentido, ni los han ensayado para determinar su actividad biológica en células, en cultivo o en animales. Se ha encontrado que la 2,6-diaminopurina (DAP) estaba presente en el ADN en lugar de adenosina por el cianófago S-2L (Cheng, X., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24:293-318, 1995); Khudyakov, I.Y., et al., Virology 88: 8-18, 1978). La DAP altera la estructura de DNA dúplex e introduce un tercer enlace de hidrógeno en el dúplex D:T (similar a los tres enlaces de hidrógeno formados por la citosina y la guanosina) en comparación con el dúplex A:T (Chollett, A y Kawashima, E. of Biogen SA (Ginebra), Nucleic Acids Researxh 16:305-17, 1988). Este enlace de hidrógeno extra conduce a un aumento de la selectividad y de la fuerza de hibridación durante la hibridación ADN-ADN, así como también a la inhibición de la escisión de diversas enzimas de restricción (Bailly, C. y Waring, M.J., Nucleic Acids Research, 23:885-92, 1995; Bailly, C. et al., PNAS 93:13623-8, 1996).
El grupo amino de N2 adicional del carbono C2 de la DAP se usa para emparejamiento de bases. El enlace adicional ocasiona una estabilidad aumentada del dúplex de ADN y hace más hidrófilo el encaje menor de ambos B- y Z-DNA. La sustitución de adenosina por DAP ocasiona un aumento de la T_{m} del ADN que contiene DAP, la temperatura a la que dos hebras de ADN complementarias duplexadas funden, de 1,5ºC por resto de DAP (Hoheisel, J.D., Lehrach, H., FEBS Letters, 274:103-6, 1990). La DAP y sus análogos poseen, por tanto, el potencial de aumentar la eficacia y la actividad antiinflamatoria de los oligonucleótidos AS cuando está incluida en los oligonucleótidos o bien como sustitución de una base, en adición a las bases, cuando se incorpora a la terapia génica, o bien, como puede verse más adelante, cuando se administra sola.
B) Material y métodos Experimentos con líneas celulares
Se llevaron a cabo experimentos para determinar si los oligonucleótidos antisentido descritos en la Solicitud de Patente Internacional WO 99/66037 (incorporada en esta memoria), dirigidos contra la subunidad beta común del receptor de IL-3, IL-5 y GM-CSF, podían inhibir la expresión y la función de este receptor cuando ha sido modificado mediante el reemplazo de adenosina o bien por 2-amino-2'-desoxiadenosina, o bien por inosina. Las células TF-1 y U937 expresan niveles altos de receptores de GM-CSF. Además, las células TF-1 son dependientes de GM-CSF para su supervivencia. Estas células fueron cultivadas en medio RPMI 1640 suplementado con suero fetal de ternera inactivado por calor, al 10%, penicilina, estreptomicina y l-glutamina, a 37ºC en CO_{2} al 5% (las células TF-1 fueron suplementadas con GM-CSF). Durante 12 horas fueron cultivadas o bien en medio sólo o en medio con oligonucleótidos sentido (107S: 5'-ACCATCCCGCTGCAGACCC-3' (SEQ ID NO:19) o antisentido (107A: 5'-GGGTCTGCAGCGG
GATGGT-3'; SEQ ID NO.20), para la subunidad beta común del receptor de IL-3, IL-5 y GM-CSF. La secuencia del 107A-DAP era: 5'-GGGTCTGCDapQCGGGDapTGQT-3' (SEQ ID NO:21); la secuencia del 107A-inosina (107A-I) era: 5'-GGGTCTGCIGCGGGIT CGT-3' (SEQ ID NO:22). Las células fueron recuperadas y lavadas 3 veces. Se recu-
peró después el ARN y se determinó la presencia de la cadena beta del receptor mediante RT-PCR semicuantitativa.
Animales
Ratas Brown Norway de 6-8 semanas de edad y 220-275 g de peso, fueron obtenidas de Harlan-Sprague-Dawley (Walkerville, MD). Las ratas se mantuvieron en estabularios convencionales.
Sensibilización a la ovoalbúmina
La sensibilización activa de ratas se llevó a cabo mediante inyección subcutánea de 1 ml de solución salina que contenía 1 mg de ovoalbúmina de huevo de pollo (OA) (Sigma, St. Louis, MO) y 3,5 mg de gel de hidróxido de aluminio (BDH Chemicals, Poole, UK).
Inducción por ovoalbúmina
El día 14 después de la sensibilización con ovoalbúmina, después de anestesia general con pentotal, 65 mg/kg, e intubación endotraqueal, se llevó a cabo la inducción por ovoalbúmina inyectando por vía intratraqueal 200 microgramos de ovoalbúmina en 60 \mul. Después de 8 horas ó 15 horas, las ratas se intuban de nuevo con anestesia general y se efectúa un lavado pulmonar consistente en 5 veces instilación de 5 ml de solución salina al 0,9%. Se lavan las células, se someten a recuento y se centrifuga sobre portas en un Cytospin III^{TM}. Se lleva a cabo un recuento diferencial de células.
Medida de respuestas de las vías respiratorias
El equipo y la metodología que se emplearon para medir la resistencia pulmonar fueron como los descritos anteriormente (Renzi, P.M. et al., Am. Rev. Respir. Dis 146:163-169, 1992). Se indujo anestesia general o bien con pentotal (50 mg/kg) o bien con uretano (1,1 g/kg), por vía intraperitoneal. Luego se llevó a cabo intubación endotraqueal usando un catéter de polietileno de 6 cm de longitud, de PE-240^{TM}. Se usó una almohadilla calefactora para mantener constante la temperatura corporal y se monitorizó la temperatura rectal continuamente con un termómetro electrónico (Telethermometer^{TM}, Yellow Springs Instrument Co., Yellowsprings, OH). La resistencia pulmonar (RL) se midió durante la respiración periódica espontánea con los animales en posición de decúbito lateral. Se midió el flujo colocando la punta del tubo traqueal en el interior de una pequeña caja de Plexiglass^{TM} (volumen, 265 ml) Un pneumotacógrafo Flelsh^{TM} Nº 0 acoplado a un transductor de presión diferencial (MP-45+2 cm H_{2}O; Validyne Corp. Northridge, CA) se unió al otro extremo de la caja para medir el flujo de aire, y se obtuvo el volumen mediante integración numérica de la señal del flujo. Se midieron los cambios de la presión esofágica usando un catéter lleno con solución salina y un transductor de presión diferencial (Sanborn 267 BC^{TM}; Hewlett Packard, Waltham, MA). El otro puerto del transductor se conectó a la caja. El catéter esofágico consistía en un tubo de polietileno (PE-200^{TM}) de 20 cm de largo unido a un tubo (PE-100^{TM}) más corto (6 cm). La presión transpulmonar se computó como la diferencia entre la presión esofágica y la presión de la caja. La respuesta de las vías respiratorias se evaluó a partir de la RL, que se determinó ajustando la ecuación de movimiento del pulmón mediante regresión lineal múltiple usando un software comercial (RHT-Infodat Inc., Montreal, Quebec, Canadá).
Medida de la resistencia pulmonar inmediatamente después de administrar oligonucleótidos antisentido PS, regulares o modificados
El día 14 después de sensibilizar con ovoalbúmina, bajo anestesia general con pentotal, 65 mg/kg, e intubación endotraqueal, se inyectaron por vía intratraqueal 60 \mug de un oligonucleótido AS PS dirigido contra la cadena Beta común del receptor de GM-CSF, IL-3 e IL-6 (AS141A: 6'-TGGCACTTTAGGTGGCTG-3'; SEQ ID NO:23) de la rata. La resistencia pulmonar se midió en la línea de base, cada cinco minutos, durante 30 minutos y a intervalos de 15 minutos. Los mismos experimentos fueron repetidos con AS141 modificado, en el que se había reemplazado adenosina por DAP, AS141-DAP (5'-TGGCDapCTTTDapGGTGGCTG-3'; SEQ ID NO:24) o por Inosina, AS141-I (5'-TGGCITTTIGGTGGGCTG-3; SEQ ID NO: 25).
Experimentos para evaluar el grado de reacción de las vías respiratorias a adenosina y nucleósido con DAP y otros análogos de DAP específicos
El día 14 después de sensibilizar se anestesiaron ratas con pentotal (65 mg/kg), se intubó y se midió la RL de la línea de base. Las ratas recibieron por vía intratraqueal dosis crecientes de adenosina (CAS 58-61-7), sal hemisulfato de la 2,6-diaminopurina (CAS 69369-16-0), DAP (2-amino-2-desoxiadenosina; CAS 4546-70-7), 2-amino-9-(B-D-2'-desoxirribofuranosil)purina (CAS 3616-24-8), 7-desaza-2'-desoxiadenosina (CAS 60129-59-1), N-6-metil-2'-desoxiadenosina (CAS 2002-35-9), 2-aminoadenosina/2,6-diaminopurina ribósido (CAS 2096-10-08) a lo largo del intervalo de dosis de 0,125 \mug hasta 100 \mug en el seno de 50 \mul o bien de solución salina o bien de solución salina más ácido acético. Inmediatamente después de cada dosis se midió la RL. Se disolvió DAP del modo siguiente: 3 mg de DAP se mezclaron con 100 \mul de ácido acético, se ajustó a 1,5 a 3 ml mediante la adición de solución salina y se calentó a 70ºC. Esto proporcionó una concentración final de 1 a 2 \mug/\mul. Las diluciones se llevaron a cabo en la misma solución tampón. Los animales testigo recibieron solución salina con ácido acético en la misma concentración final que se ha indicado.
Experimentos para evaluar el grado de reacción de leucotrieno D4 después de inducción con antígeno
Hemos indicado anteriormente que el ASA4 antisentido (5'-ACTCATATTCATAGGGTG-3'; SEQ ID NO:26) dirigido contra el receptor CCR3 de la rata, era eficaz para inhibir el influjo de eosinófilos en los pulmones después de inducir con el antígeno (véase el documento WO 99/66037). Empleamos las mismas secuencias de oligonucleótidos para estos experimentos. El día 14, las ratas fueron intubadas, bajo anestesia general, con pentotal (65 mg/kg) y recibieron 200 \mug de ASA4, ASA4-DAP (5'-DapCTCDBpTDapTTCDapTDapCGGGTG-3; SEQ ID NO:27), ASA4-DAP desajustado (5'-CDapTCDapT TDapTCATGDapGGTG-3'; SEQ ID NO:28), AS141-DAP (5'-TGGCDapCTTTDapGGTGGCTG-3'; SEQ ID NO:29), AS141-DAP desajustado (5'-GTGCCDapTTTGDapGTGGC
TQ-3'; SEQ ID NO.30), una mezcla de ASA4-DAP y AS141-DAP (total de 100 \mug) o solución salina en el seno de 50 \mul de NaCl al 0,9%, por vía intratraqueal. Diez minutos más tarde, se llevó a cabo la inducción con ovoalbúmina mediante inyección de 200 microgramos de ovoalbúmina en el seno de 50 \mul de solución salina al 0,9%, por vía intratraqueal. Al cabo de 15 horas, las ratas fueron intubadas de nuevo bajo anestesia general se midió la resistencia pulmonar de la línea de base y concentraciones multiplicadas por dos de leucotrieno D4 fueron inyectadas por vía intratraqueal (50 ng a 1600 ng) hasta doblar la resistencia pulmonar de la línea de base (EC200).
Experimentos para evaluar el influjo pulmonar en los pulmones después de inducir con el antígeno
El día 14, las ratas fueron intubadas bajo anestesia general con pentotal (65 mg/kg) y recibieron 200 \mug de ASA4, ASA4-DAP (6'-DepCTCDapTDapTTCDapTDapGGGTG-3'; SEQ ID NO:27), AS141-DAP (6'-TGGCDapCTTT
DapGGTGGCTG-3'; SEQ ID NO:29), AS141-DAP desajustado (6'-GTGCCDapTTTGDapOTGGCTG-3'; SEQ ID NO: 30), una mezcla de ASA4-DAP y AS141-DAP (total de 100 \mug), o solución salina, en 60 \mul de NaCl al 0,9%, por vía intratraqueal. Veinte minutos más tarde se llevó a cabo la inducción con ovoalbúmina inyectando 200 \mug de ovoalbúmina en el seno de 50 \mul de solución salina al 0,9%, por vía intratraqueal. Al cabo de 15 horas, las ratas fueron intubadas de nuevo bajo anestesia general, y se llevó a cabo un lavado pulmonar que consistía en 5 veces una instilación de 5 ml. Se lavaron las células, se sometieron a recuento y se centrifugaron sobre portas en un Cytospin III^{TM}. Finalmente se llevó a cabo un recuento diferencial de las células.
Experimentos para evaluar el influjo celular en los pulmones después de administrar adenosina o DAP
Catorce días después de la sensibilización, las ratas fueron intubadas bajo anestesia, con pentotal (65 mg/kg) y se inyectaron 100 \mug de adenosina o 2-amino-2'-desoxiadenosina o de 2-amino-2'-desoxiadenosina seguido 10 minutos más tarde por adenosina, o de solución salina, por vía intratraqueal, en el seno de 50 \mul. Quince horas más tarde, las ratas fueron intubadas, bajo anestesia general, con pentotal, se llevó a cabo un lavado pulmonar, y las células fueron sometidas a recuento como se ha descrito anteriormente.
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C) Resultados Ejemplo 1 El reemplazo de adenosina por DAP es, por lo menos, tan eficaz in vitro como un oligonucleótido antisentido regular de fosforotioato
Un primer conjunto de experimentos fue ideado con objeto de determinar si el reemplazo de adenosina por DAP afectaba a la eficacia in vitro de oligonucleótidos AS. Ha de observarse en la Figura 2A que la eficacia biológica de antisentido para la cadena Beta común del receptor humano de GM-CSF, IL-3 e IL-5 no se ve afectada por el reemplazo de adenosina por 2-amino-2'-desoxiadenosina en células U937 que expresan este receptor. El AS107 es un oligonucleótido 19-mero que contiene 2 bases de adenosina. Las bases de adenosina fueron reemplazadas por DAP (AS107-DAP). Este oligonucleótido modificado era, por lo menos, igualmente eficaz en el bloqueo de mARN para la cadena Beta común cuando se evaluó mediante PCR semicuantitativa (con G3PDH como gen de gobierno), que el AS107 que contenía adenosina (AS 107).
Para confirmar la eficacia en otra línea celular, se repitieron los experimentos en células TF1 que dependen para su supervivencia de GM-CSF. Ha de apreciarse en la Figura 2B que el AS107-DAP para la cadena Beta común del receptor humano de GM-CSF, IL-3 e IL-5, era, por lo menos, igualmente eficaz en el bloqueo de la expresión de mARN, que el AS107 que contiene adenosina (AS107). El reemplazo de adenosina por DAP en oligonucleótidos antisentido es eficaz in vitro.
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Ejemplo 2 No todos los sustitutivos de adenosina son eficaces para inhibir genes, cuando están incorporados en oligonucleótidos antisentido de fosforotioato
Se realizaron experimentos con objeto de determinar si la sustitución de adenosina podía afectar a la eficacia de los oligonucleótidos antisentido. Ha de apreciarse en la Figura 3, que la eficacia del mismo oligonucleótido antisentido que se ha descrito anteriormente (AS107) se pierde cuando ambas adenosinas son reemplazadas por inosina. El antisentido que contenía inosina (AS107-I) no era eficaz para inhibir la expresión de mARN cuando se evaluó mediante PCR semicuantitativa y se comparó con el AS107 que contenía adenosina. Se llevaron a cabo los experimentos incubando células U937 con medio solo, AS107 ó AS107-I, en una concentración de 10 pmol, durante seis horas, antes de aislar el RNA y realizar la PCR semicuantitativa.
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Ejemplo 3 Tiene lugar un aumento de la resistencia pulmonar después de inyección intratraqueal de oligonucleótidos antisentido de fosforotioato que no está relacionada con la adenosina
Se llevaron a cabo experimentos para evaluar el efecto sobre la resistencia pulmonar después de inyección intratraqueal rápida de oligonucleótidos antisentido de fosforotioato contenidos en 50 \mul de solución salina.
La Figura 4A ilustra los efectos de la administración intratraqueal de un oligonucleótido antisentido de fosforotioato dirigido contra la cadena Beta común de GM-CSF, IL-3 e IL-5 de la rata (AS141, un oligonucleótido 19-mero que contiene 2 adenosinas) y el efecto de un oligonucleótido antisentido de fosforotioato sustituido con DAP (AS141-DAP) de la misma secuencia, a una dosis de 60 \mug cada uno, sobre la resistencia pulmonar de ratas Brown Norway (BN) sensibilizadas. Para estos experimentos y los que siguen, se emplearon ratas Brown Norway sensibilizadas según se ha descrito anteriormente (Renzi PM, Am. Rev. Respir. Dis. 146:183-9; 1992). La inyección de solución salina tamponada con fosfato causó un aumento ligero de la resistencia pulmonar, aumento máximo de 25%. El antisentido regular, que incluía menos de 15% de adenosina, causó un aumento moderado de la resistencia pulmonar (87%) Los oligonucleótidos modificados con DAP ocasionaron un aumento de ligero a moderado (33%) de la resistencia pulmonar. Nyce ha sugerido en los documentos WO 00/62736 y WO 00/09525, que el aumento de la resistencia pulmonar es causado por la adenosina que está incluida en el oligonucleótido. Sin embargo, los oligonucleótidos no podían haber tenido tiempo de degradarse y liberar adenosina (unos pocos minutos), y el oligonucleótido antisentido que se empleó contenía solamente 10% de adenosina (que, según los documentos WO 00/62736 y WO 00/09525, no tendrían efecto sobre la resistencia pulmonar).
Se llevó a cabo un ensayo para evaluar si los broncoespasmos eran debidos a las 2 adenosinas que estaban reemplazadas en el AS141, por 2 inosinas, dado que es sabido que la inosina no causa broncoconstricción de los pulmones/vías respiratorias en comparación con la adenosina (Mann, J.C. et al., J. Appl. Physiol. 61:1667-76, 1986). Como muestra la Figura 4B, la administración intratraqueal del mismo oligonucleótido de fosforotioato antisentido dirigido contra la cadena Beta común de GM-CSF, IL-3 e IL-6 de la rata (AS141) en que la adenosina había sido sustituida por inosina (AS141-inosina), causó también un aumento temporal de la resistencia pulmonar (en 108%). Estos resultados ponen de manifiesto que la inyección intratraqueal de oligonucleótidos antisentido aumenta temporalmente la resistencia pulmonar mediante un mecanismo que no parece estar relacionado con la adenosina.
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Ejemplo 4 Efecto de diferentes análogos de DAP sobre la resistencia pulmonar
Se evaluaron los efectos de la administración intratraqueal de análogos de DAP y de adenosina, sobre la resistencia pulmonar, en ratas Brown Norway. Como muestra la Figura 5, se estudiaron la adenosina, la DAP y cinco diferentes análogos de DAP. Para cada uno de los compuestos, se estudió un mínimo de seis ratas y se presenta el % medio de la resistencia pulmonar de la línea de base en función de la dosis intratraqueal de DAP o sus análogos. Como puede apreciarse en esta Figura, la resistencia pulmonar aumenta gradualmente hasta el pico en una concentración de 5 \mug de adenosina, mientras que esto no ocurre con la 2-amino-2'-desoxiadenosina (DAP) ni sus análogos en estudio. Estos resultados ponen de manifiesto, que al contrario que la adenosina, la DAP y sus análogos no aumentan significativamente la resistencia pulmonar. Dado que los oligonucleótidos se degradan progresivamente dentro de los pulmones, puede ser inesperadamente ventajoso usar estos compuestos en lugar de adenosina.
Ejemplo 5 Los oligonucleótidos antisentido de fosforotioato modificados con DAP son eficaces para inhibir el hiper-grado de reacción de las vías respiratorias que ocurre después de inducción con el antígeno, in vivo
La actividad biológica in vivo de oligonucleótidos antisentido modificados con DAP, dirigidos contra el CCR3 de la rata y la cadena Beta común de los receptores de IL-3/IL-5/GM-CSF en el modelo de asma de la rata, se demuestra en la Figura 6A. El ASA4 es un oligonucleótido antisentido de fosforotioato 18-mero que se ha puesto de manifiesto que inhibe el receptor CCR3 y que inhibe el influjo de eosinófilos que tiene lugar después de inducción con el antígeno (véase el documento WO 99/66037). El AS141 es, también, un oligonucleótido antisentido de fosforotioato 18-mero, que se ha indicado que inhibe la cadena Beta común de los receptores de IL-3/IL-5/GM-CSF y que inhibe el influjo de eosinófilo que ocurre después de inducción con el antígeno (véase el documento WO 99/66037). El ASA4 contiene 5 bases de adenosina (28% de adenosina). El AS143 contiene 2 bases de adenosina. Hay que hacer notar que el ASA4-DAP disminuye de modo importante el grado de reacción de las vías respiratorias al leucotrieno D4 15 horas después de realizar la inducción con ovoalbúmina, en comparación con ratas que no habían recibido AS (testigo inducido; p<0,01) o ratas tratadas, desajustadas, con DAP. Ha de apreciarse también que el ASA4-DAP tendía a ser más eficaz que el ASA4 sin modificar y no era diferente de los resultados obtenidos a partir de ratas sin inducir. El AS141 disminuyó asimismo de modo importante el hiper-grado de reacción a LTD_{4} (P<0,05) en comparación con las ratas testigo inducidas con el antígeno y las ratas desajustadas tratadas con el 141-DAP. Además, el grado de reacción de las vías respiratorias al LTD_{4} disminuyó de modo importante en las ratas tratadas con la combinación de CCR3 y los oligonucleótidos de la cadena \beta común, en comparación con cada uno de los oligonucleótidos antisentido, y esta combinación era tan eficaz como la combinación de oligonucleótidos con DAP (50 \mug, total;
Figura 6B).
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Ejemplo 6 Los oligonucleótidos antisentido de fosforotioato modificados con DAP son más eficaces que los oligonucleótidos antisentido convencionales para inhibir la inflamación de las vías respiratorias que ocurre después de inducir con antígeno, in vivo
Estos experimentos fueron llevados a cabo con oligonucleótidos antisentido dirigidos contra el receptor CCR3 de la rata o la cadena Beta común de IL-3,5 y GM-CSF. Ratas sensibilizadas e inducidas con ovoalbúmina fueron tratadas por inyección intratraqueal de solución salina, 200 \mug de ASA4 regular ó 200 \mug de ASA4-DAP diez minutos antes de la inducción con ovoalbúmina. Después de 15 horas, las ratas fueron anestesiadas, intubadas, y se llevó a cabo un lavado broncoalveolar para establecer el recuento total y diferencial de células. Los resultados indican que la administración de ambos, el ASA4 regular (Figura 7A) y el AS 141 (Figura 7B) y ambos ASA4-DAP y AS141-DAP, inhibían eficazmente la captación de eosinófilos (en 84% y 83%, respectivamente; Figura 7A). Sin embargo el AS4DAP tendía a hacer disminuir la captación de neutrófilos y macrófagos y disminuía de modo importante la captación de linfocitos (en 74%) El 141-DAP hizo disminuir de modo importante también la captación de macrófagos (p<0,05). La combinación de dos oligonucleótidos A4-DAP y 141-DAP (200 \mug en total) también hizo disminuir de modo importante la captación de linfocitos y de macrófagos (Figura 7C). Estos resultados ponen de manifiesto que los oligonucleótidos modificados con DAP no solamente son eficaces sino que también poseen un efecto antiinflamatorio más amplio que el de los oligonucleótidos regulares.
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Ejemplo 7 La adenosina tiene efectos proinflamatorios en los pulmones que son específicos para la captación de eosinófilos, y la DAP es un antagonista de los efectos proinflamatorios de la adenosina
En otro experimento, grupos de seis ratas Brown Norway sensibilizadas pero sin inducir, fueron anestesiadas con pentotal e intubadas por vía endotraqueal. Las ratas recibieron luego una inyección intratraqueal de o bien (1) solución salina (testigo), (2) 100 \mug de adenosina, (3) 100 \mug de 2-amino-2'-desoxiadenosina (DAP) ó (4) 100 \mug de DAP seguidos de 100 \mug de adenosina 10 minutos más tarde. Las ratas fueron despertadas, reanestesiadas e intubadas 16 horas más tarde para efectuar un lavado pulmonar. Las células que estaban presentes en los medios recogidos del lavado fueron sometidas a recueeento y se obtuvo un diferencial sobre portas de Cytoapin^{TM}.
Como indica la Figura 8, la adenosina es proinflamatoria en los pulmones, conduciendo a una captación selectiva de eosinófilos (un aumento mayor de 10 veces), sin afectar significativamente a otros tipos de células. Por el contrario, la DAP no aumenta la proporción de células del lavado pulmonar e inhibe completamente la captación de eosinófilos inducida por la adenosina.
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D) Conclusiones
A la vista de lo que antecede, los oligonucleótidos antisentido sustituidos con DAP poseen las ventajas que siguen en comparación con los antisentidos sin modificar o los antisentidos modificados con inosina:
a)
Como muestran las Figuras 1 a 8 y está documentado en la presente solicitud de patente, la estructura y propiedades químicas de DAP y de análogos de DAP son diferentes de las de la adenosina. Estas propiedades químicas diferentes hacen que los oligonucleótidos antisentido que contienen DAP y/o análogos de DAP tengan propiedades químicas, propiedades de hibridación y estabilidad diferentes, en comparación con los antisentidos sin modificar.
b)
El Ejemplo 1 muestra como los antisentidos de fosforotioato con DAP son eficaces en diferentes líneas celulares, in vitro.
c)
El Ejemplo 2 muestra que no todos los sustitutivos de adenosina son eficaces para inhibir genes cuando están incorporados en oligonucleótidos antisentido de fosforotioato (como se pone de manifiesto con la inosina).
d)
El Ejemplo 3 muestra que tiene lugar un aumento de la resistencia pulmonar después de inyección intratraqueal de oligonucleótidos antisentido de fosforotioato, y que este aumento no está relacionado con la adenosina. En realidad, aun cuando la inosina no estimula los receptores de adenosina, se aprecia un aumento de la resistencia pulmonar con oligonucleótidos con inosina. No obstante, este aumento fue menos importante con oligonucleótidos modificados con DAP.
e)
El Ejemplo 4 muestra que, aunque diferentes sustitutivos de adenosina, DAP y análogos de DAP tienen efectos diferentes sobre la resistencia pulmonar cuando se inyectan por vía intratraqueal in vivo, estos compuestos eran todos mucho menos tóxicos que la adenosina. Por ejemplo, como muestra la Figura 5, en la toxicidad de adenosina pico (6 \mug), la clasificación relativa de los compuestos ensayados fue adenosina>N6-Metil-2'desoxiadenosina> resto, con inclusión de DAP. Sin embargo en una concentración 5 veces menor (1 \mug) la clasificación de toxicidad era diferente con adenosina>2-amino-2-desoxiadenosina/DAP>el resto. La base de DAP libre se usó como testigo estructural para determinar si el azúcar era requerida para la toxicidad.
f)
El Ejemplo 5 muestra que los oligonucleótidos antisentido de fosforotioato modificados con DAP son eficaces para inhibir el hiper- grado de reacción de las vías respiratorias al leucotrieno D4 que tiene lugar después de inducción con el antígeno, in vivo, y tienden a ser mas eficaces que los oligonucleótidos PS convencionales. La combinación de dos oligonucleótidos modificados con DAP es más eficaz que cada uno de los oligonucleótidos aislado, lo que confirma sinergismo.
g)
El Ejemplo 6 muestra que los oligonucleótidos antisentido de fosforotioato, modificados con DAP, son más eficaces que los oligonucleótidos antisentido convencionales para inhibir la inflamación de las vías respiratorias que tiene lugar después de inducción con el antígeno, in vivo. Para el ASA4 había fuertes tendencias a disminución de neutrófilos y macrófagos y también un descenso importante de linfocitos, mientras que estos efectos no fueron encontrados con oligonucleótidos antisentido PS convencionales. Para el AS141 había fuertes tendencias a disminuciones de neutrófilos y también un descenso importante de linfocitos y macrófagos, mientras que estos efectos no fueron encontrados con los oligonucleótidos antisentido PS convencionales. Para la combinación de ASA4 y AS141, había fuertes tendencias a disminuciones de neutrófilos así como un descenso importante de linfocitos y macrófagos, mientras que estos efectos no eran encontrados con los oligonucleótidos antisentido PS convencionales.
h)
El Ejemplo 7 muestra que la adenosina posee un efecto proinflamatorio en los pulmones de la rata, captando selectivamente eosinófilos, y que no posee un efecto importante sobre los linfocitos. Al mismo tiempo, el Ejemplo 7 muestra que la DAP bloquea el influjo de eosinófilos, una demostración de que la DAP, per se, es un antagonista de la adenosina.
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Los 7 Ejemplos anteriores ponen de manifiesto que los antisentidos sustituidos con DAP y los antisentidos con análogos de DAP, son intrínsecamente más eficaces y mucho menos tóxicos para los pulmones/las vías respiratorias que los nucleósidos sin adenosina o los compuestos antisentido que contienen adenosina, sin modificar.
Asimismo, al contrario de lo que ha sido sugerido en los documentos WO 00/09525 y WO 00/62736, las adenosinas contenidas en los antisentidos no son proinflamatorias, puesto que antisentidos con hasta 28% de bases de adenosina eran capaces de inhibir el influjo de eosinófilos tanto como los antisentidos que no contenían adenosina sino DAP (véase la Figura 7). Sin embargo, puesto que los oligonucleótidos que contienen DAP inhibían también el influjo de linfocitos y macrófagos (Figura 7) y que la adenosina no afecta al influjo de linfocitos (Figura 8), parece que la DAP contenida en oligonucleótidos antisentido ejerce sus efectos mediante un mecanismo que no está relacionado con el receptor o los receptores de adenosina.
En resumen, los antisentidos con DAP proporcionan, por tanto, una plataforma tecnológica mejorada para el desarrollo de terapéuticas y vacunas con compuestos antisentido, para el tratamiento y prevención de enfermedades respiratorias tales como asma, rinitis alérgica, enfermedad obstructiva crónica, tos eosinofílica, fibrosis pulmonar, fibrosis quística, infecciones por organismos patógenos, enfermedades genéticas y cáncer de pulmón, y cualquier otra enfermedad en que la inflamación es una consecuencia. Asimismo, la DAP per se y sus análogos poseen un fuerte potencial en fármacos antiinflamatorios para inhibir la inflamación en mamíferos.
Aun cuando varias realizaciones de la invención han sido descritas, se entenderá que la presente invención es capaz de modificaciones adicionales, y que la presente solicitud de patente está destinada a cubrir cualesquiera variaciones, usos o adaptaciones de la invención, siguiendo, en general, los principios de la invención e incluyendo desviaciones de la presente descripción tales como vienen incluidas dentro del conocimiento de la práctica habitual en la técnica a que pertenece la invención.
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<110> TOPIGEN PHARMACEUTIQUE INC.
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<120> MÉTODOS PARA AUMENTAR LA EFICACIA IN VIVO DE OLIGONUCLEÓTIDOS E INHIBIR LA INFLAMACIÓN EN MAMÍFEROS
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<130> 009958-0002
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<150> U.S. 60/303.071
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<151> 06-07-2001
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<160> 30
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<170> PatentIn versión 3.1
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<210> 1
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<211> 20
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<212> ADN
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<220>
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<223> La secuencia está completamente sintetizada
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccgccggcgc agagcagcag 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcccccgcc cccgcccccg 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggtctgcag cgggatggt 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente sintetizada
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggtctgcagc gggatggtt 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente sintetizada
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agggtctgca gcgggatgg 
\hfill
19 
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<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente sintetizada
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<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcagggtctg cagcgggat 
\hfill
19 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcagcgggat ggtttcttc 
\hfill
19 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagcgggatg gttcttct 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtctgcagcg ggatggttt 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente sintetizada
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgggccatc agtgctctg 
\hfill
19 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccctgacata gtggatc 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tagcatggca ctgggc 
\hfill
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggagccagtc ctagcgagc 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accatcccgc tgcagaccc 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggtctgcag cgggatggt 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde al nucleósido de 2,6-diaminopurina (DAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde al nucleósido de 2,6-diaminopurina (DAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggtctgcng cgggntggt 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde a una inosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde a una inosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggtctgcng cgggntggt 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggcacttta ggtggctg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde al nucleósido de 2,6-diaminopurina (DAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)..(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde al nucleósido de 2,6-diaminopurina (DAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggcnctttn ggtggctg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde a una inosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)..(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde a una inosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggcnctttn ggtggctg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
actcatattc atagggtg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde al nucleósido de 2,6-diaminopurina (DAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde al nucleósido de 2,6-diaminopurina (DAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde al nucleósido de 2,6-diaminopurina (DAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde al nucleósido de 2,6-diaminopurina (DAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)..(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde al nucleósido de 2,6-diaminopurina (DAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
nctcntnttc ntngggtg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está completamente sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" corresponde al nucleósido de 2,6-diaminopurina (DAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> características misceláneas
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<222> (5)..(5)
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<223> "n" corresponde al nucleósido de 2,6-diaminopurina (DAP)
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<221> características misceláneas
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<222> (8)..(8)
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<223> "n" corresponde al nucleósido de 2,6-diaminopurina (DAP)
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<220>
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<221> características misceláneas
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<222> (14)..(14)
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<223> "n" corresponde al nucleósido de 2,6-diaminopurina (DAP)
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<400> 28
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\hskip-.1em\dddseqskip
cntcnttntc atgnggtg 
\hfill
18 
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<210> 29
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> La secuencia está completamente sintetizada
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<220>
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<221> características misceláneas
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<222> (5)..(5)
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<223> "n" corresponde al nucleósido de 2,6-diaminopurina (DAP)
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<220>
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<221> características misceláneas
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<222> (10)..(10)
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<223> "n" corresponde al nucleósido de 2,6-diaminopurina (DAP)
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<400> 29
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tggcnctttn ggtggctg 
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18 
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<210> 30
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> La secuencia está completamente sintetizada
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<220>
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<221> características misceláneas
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<222> (6)..(6)
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<223> "n" corresponde al nucleósido de 2,6-diaminopurina (DAP)
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<220>
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<221> características misceláneas
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<222> (11)..(11)
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<223> "n" corresponde al nucleósido de 2,6-diaminopurina (DAP)
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<400> 30
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gtgccntttg ngtggctg 
\hfill
18

Claims (49)

1. Una molécula de ácido nucleico aislada o purificada que es un oligonucleótido que posee una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1-6, 8-18 y 21, 24, 27, 28, 30, (i) que comprende un sustitutivo de nucleótidos seleccionado entre el grupo que consiste en 2,6-diaminopurina y sus sales, o (ii) en el que al menos un nucleótido de adenosina del oligonucleótido está reemplazado con dicho sustitutivo de nucleótidos.
2. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que dicho sustitutivo de nucleótidos es la 2,6-diaminopurina.
3. La molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, que comprende al menos un resto de enlace de mononucleótidos seleccionado entre el grupo que consiste en restos de metilfosfonato, fosfotriéster, fosforotioato, fosfodiéster, fosforoditioato, boranofosfato, formacetal, tioformacetal, tioéter, carbonato, carbamato, sulfato, sulfonato, sulfamato, sulfonamida, sulfona, sulfito, sulfóxido, sulfuro, hidroxilamina, metileno (metilmino), metilenoxi (metilimino) y fosforamidato.
4. La molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que dicha molécula de ácido nucleico consiste en ADN.
5. La molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que dicha molécula de ácido nucleico consiste en ARN.
6. La molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la molécula de ácido nucleico comprende desde 2 hasta aproximadamente 10.000 nucleótidos.
7. La molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que dicha molécula de ácido nucleico está enlazada a una molécula seleccionada entre el grupo que consiste en restos de aminoácidos, péptidos, proteínas, peptidomiméticos, compuestos químicos pequeños, ligandos, lípidos, ácidos nucleicos o hidratos de carbono.
8. La molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que dicha molécula de ácido nucleico es un oligonucleótido antisentido.
9. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 8, en la que dicho oligonucleótido antisentido comprende desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 100 nucleótidos.
10. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 9, en la que dicho oligonucleótido antisentido tiene la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO:21.
11. La molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia que codifica un producto génico terapéutico.
12. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que dicha molécula de ácido nucleico posee la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO:21 y comprende al menos un resto de enlace de fosforotioato.
13. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 12, en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende una pluralidad de restos de enlace de fosforotioato.
14. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 13, en la que todos los nucleótidos de dicha molécula de ácido nucleico están enlazados por restos de fosforotioato.
15. Una composición farmacéutica que comprende al menos una molécula de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en las moléculas de ácidos nucleicos definidas en las reivindicaciones 1-11, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
16. La composición según la reivindicación 15, para tratar y/o prevenir una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en enfermedades del sistema respiratorio, enfermedades neurológicas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades reumatológicas, enfermedades digestivas, enfermedades cutáneas, enfermedades oftalmológicas, enfermedades del sistema utinario, cánceres, infecciones por organismos patógenos, enfermedades genéticas, hipereosinofilia, inflamación general, y cánceres.
17. La composición según una cualquiera de la reivindicación 15 y 16, en la que dicha molécula de ácido nucleico está presente en una cantidad de aproximadamente 1% hasta aproximadamente el 90% de la composición.
18. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 15-17, que comprende, además, un agente seleccionado entre el grupo que consiste en fármacos, antioxidantes, tensioactivos, agentes saborizantes, aceites volátiles, agentes de tamponamiento, agentes dispersantes, propulsores y agentes conservantes.
19. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 15-18, en la que dicho excipiente farmacéuticamente aceptable está seleccionado entre el grupo que consiste en excipientes sólidos, vehículos líquidos y vehículos de fase gaseosa.
20. La composición según la reivindicación 19, en la que dicho excipiente farmacéuticamente aceptable está seleccionado entre el grupo que consiste en partículas de lípidos, vesículas de lípidos, microcristales y tensioactivos.
21. La composición según la reivindicación 15, para tratar y/o prevenir una dolencia asociada con una inflamación de los pulmones.
22. La composición según la reivindicación 15, para tratar y/o prevenir una enfermedad del sistema respiratorio seleccionada entre el grupo que consiste en fibrosis pulmonar, el síndrome de insuficiencia respiratoria del adulto, la fibrosis quística, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la bronquitis crónica, la bronquitis eosinofílica, el asma, la alergia, la rinitis alérgica, las sinusitis y la hipereosinofilia.
23. La composición según la reivindicación 22, en la que la enfermedad del sistema respiratorio es el asma, y en la que dicho oligonucleótido posee una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs:1-6, 8-18.
24. La composición según la reivindicación 15, para administración directa al sistema respiratorio.
25. La composición según la reivindicación 15, para administración por medio de un dispensador de aerosoles presurizado, un pulverizador nasal, un nebulizador, un inhalador de dosis medidas, un inhalador de polvos secos, o una cápsula.
26. La composición según la reivindicación 15, en la que dicha molécula de ácido nucleico posee la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 21 y comprende al menos un resto de enlace de fosforotioato.
27. La composición según la reivindicación 26, en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende una pluralidad de restos de enlace de fosforotioato.
28. La composición según la reivindicación 27, en la que todos los nucleótidos de dicha molécula de ácido nucleico están enlazados mediante restos de fosforotioato.
29. El uso de una molécula de ácido nucleico, aislada o purificada, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, para la preparación de un medicamento para terapia con antisentidos.
30. El uso según la reivindicación 29, en la que dicho medicamento es para prevenir o tratar una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en enfermedades del sistema respiratorio, enfermedades neurológicas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades reumatológicas, enfermedades digestivas, enfermedades cutáneas, enfermedades oftalmológicas, enfermedades del sistema urinario, cánceres, infecciones por organismos patógenos, enfermedades genéticas, inflamación general y cáncer.
31. El uso según la reivindicación 29, en el que dicho medicamento es para prevenir o tratar una enfermedad del sistema respiratorio que es una dolencia asociada con una inflamación de los pulmones, las vías respiratorias y/o la nariz.
32. El uso según la reivindicación 29, en el que dicho medicamento es para prevenir o tratar una enfermedad del sistema respiratorio seleccionada entre el grupo que consiste en fibrosis pulmonar, el síndrome de insuficiencia respiratoria del adulto, la fibrosis quística, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la bronquitis crónica, la bronquitis eosinófila, el asma, la alergia, la rinitis alérgica, las sinusitis y la hipereosinofilia.
33. Un método de preparación de una molécula de ácido nucleico aislada o purificada, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que comprende reemplazar por lo menos una adenosina del oligonucleótido con un sustitutivo de nucleótidos, en el que dicho sustitutivo de nucleótidos está seleccionado entre en grupo que consiste en 2,6-diaminopurina y sus sales.
34. El método según la reivindicación 33, en el que dicho sustitutivo de nucleótidos es 2,6-diaminopurílico.
35. El uso de un sustitutivo de nucleótidos seleccionado entre el grupo que consiste en 2,6-diamonopurina y sus sales, para reemplazar por lo menos un resto de adenosina de un oligonucleótido con dicho sustitutivo de nucleótidos, para aumentar la eficacia antiinflamatoria in vivo de un oligonucleótido.
36. El uso según la reivindicación 35, en el que dicho sustitutivo de nucleótidos es la 2,6-diaminopurina.
37. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 35-36, en el que dicha molécula de ácido nucleico consiste en ADN.
38. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 35-36, en el que dicha molécula de ácido nucleico consiste en ARN.
39. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 35-38, en el que la molécula de ácido nucleico comprende desde 2 hasta aproximadamente 10.000 nucleótidos.
40. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 35-39, en el que dicha molécula de ácido nucleico está enlazada a una molécula seleccionada entre el grupo que consiste en restos de aminoácidos, péptidos, proteínas, peptidomiméticos, compuestos químicos pequeños, ligandos, lípidos, ácidos nucleicos, o hidratos de carbono.
41. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 35-40, en el que dicha molécula de ácido nucleico es un oligonucleótido antisentido.
42. El uso según la reivindicación 41, en la que dicho oligonucleótido antisentido comprende desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 100 nucleótidos.
43. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 35-40, en el que dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia que codifica un producto génico terapéutico.
44. El uso según la reivindicación 41, en el que dicho oligonucleótido antisentido está dirigido a prevenir o tratar una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en: enfermedades del sistema respiratorio, enfermedades neurológicas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades reumatológicas, enfermedades digestivas, enfermedades cutáneas, enfermedades oftalmológicas, enfermedades del sistema urinario, cánceres, infecciones por organismos patógenos, enfermedades genéticas, inflamación general y cáncer.
45. El uso según la reivindicación 41, en el que dicho oligonucleótido antisentido está dirigido a prevenir o tratar una enfermedad del sistema respiratorio que es una dolencia asociada con una inflamación de los pulmones, las vías respiratorias y/o la nariz.
46. El uso según la reivindicación 41, en el que dicho oligonucleótido antisentido está dirigido a prevenir o tratar un sistema respiratorio seleccionado entre el grupo que consiste en fibrosis pulmonar, el síndrome de insuficiencia respiratoria del adulto, la fibrosis quística, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la bronquitis crónica, la bronquitis eosinófila, el asma, la alergia, la rinitis alérgica, las sinusitis y la hipereosinofilia.
47. El uso según la reivindicación 35, en el que el oligonucleótido que resulta posee la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO:21 y comprende al menos un resto de enlace de fosforotioato.
48. El uso según la reivindicación 47, en el que oligonucleótido que resulta comprende una pluralidad de restos de enlace de fosforotioato.
49. El uso según la reivindicación 48, en el que todos los nucleótidos del oligonucleótido que resulta están enlazados por restos de fosforotioato.
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