ES2300686T3 - Peptidos sw grelina marcados fluorescentemente. - Google Patents

Peptidos sw grelina marcados fluorescentemente. Download PDF

Info

Publication number
ES2300686T3
ES2300686T3 ES04024029T ES04024029T ES2300686T3 ES 2300686 T3 ES2300686 T3 ES 2300686T3 ES 04024029 T ES04024029 T ES 04024029T ES 04024029 T ES04024029 T ES 04024029T ES 2300686 T3 ES2300686 T3 ES 2300686T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
growth hormone
hormone secretagogue
ser
gln
secretagogue
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES04024029T
Other languages
English (en)
Inventor
Thilo Enderle
Martin Graf
Cornelia Hertel
Sannah Jensen Zoffmann
Eric Argirios Kitas
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Application granted granted Critical
Publication of ES2300686T3 publication Critical patent/ES2300686T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/60—Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N31/00—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods
    • G01N31/22—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods using chemical indicators

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Un secretagogo de la hormona del crecimiento marcado de la fórmula R1-Cys-F donde R1 es una secuencia peptídica derivada de la secuencia polipeptídica de la grelina del Núm. Id. Sec.: 1, una Cys está unida al aminoácido C-terminal de R1 y F es un fluorocromo.

Description

Péptidos de grelina marcados fluorescentemente.
La hormona del crecimiento, que se secreta desde la pituitaria, estimula el crecimiento de todos los tejidos del cuerpo capaces de crecer. Además, se sabe que la hormona del crecimiento tiene los siguientes efectos básicos en los procesos metabólicos del cuerpo: (1) Incremento de la tasa de síntesis de proteínas en todas las células del cuerpo; (2) Disminución de la tasa de utilización de carbohidratos en las células del cuerpo; (3) Incremento de la movilización de los ácidos grasos libres y utilización de los ácidos grasos para obtener energía. Una deficiencia en la secreción de la hormona del crecimiento puede resultar en varios trastornos médicos, tales como el enanismo.
La metodología para determinar la actividad de un compuesto como secretagogo de la hormona del crecimiento se conoce en el ámbito. Por ejemplo, se describe un ensayo ex vivo en Smith, et al., Science, 260,1640-1643 (1993) (ver texto de la Fig. 2 aquí), pero este ensayo requiere el uso de cultivos celulares y no da una indicación de la actividad de unión competitiva. Por consiguiente, sería deseable desarrollar un ligando marcado no radiactivamente que se pueda utilizar para identificar y caracterizar los receptores celulares que juegan un papel en la actividad del secretagogo de la hormona del crecimiento. También sería deseable tener un ligando marcado no radiactivamente disponible para utilizarlo en un ensayo para probar los compuestos para la actividad del secretagogo de la hormona del
crecimiento.
Tales estudios normalmente requieren un radioligando de actividad específica alta. Los intentos previos para desarrollar un análisis de fijación a receptores utilizando ligandos peptídicos marcados con [T] o [125I] derivados de GHRP-6 tuvieron un éxito limitado. Ver R. F. Walker, et al. Neuropharmacol. 989,28, 1139 y C. Y. Bowers et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 1991, 178,31. Generalmente, la unión de tales ligandos peptídicos era de baja afinidad y de una capacidad excesivamente elevada. Además, las afinidades de unión no se correlacionaban con la actividad secretora de la hormona del crecimiento de los péptidos. La falta de correlación entre la unión y la actividad secretora de la hormona del crecimiento más probablemente era el resultado de la actividad específica relativamente baja (en el caso de GHRP-6 [T]) y de las propiedades de unión no específicas de los radioligandos.
El problema a solucionar por la presente invención era proporcionar un análogo de la grelina marcado con fluorescencia que se pudiera utilizar en un cribado de alto rendimiento.
La presente invención se refiere al secretagogo de la hormona del crecimiento marcado de fórmula
R1-Cys-F
donde R1 es una secuencia peptídica derivada de la secuencia polipeptídica de la grelina (Núm. Id. Sec.: 1), y F es un colorante fluorescente. En un modo de realización preferido, R1 es el Núm. Id. Sec.: 2. En otro modo de realización preferido, R1 es octanoilado. En otro modo de realización preferido, R1 es N-octanoilado. En un modo de realización más preferido, R1 es ^{1}Gly-Ser-Dapa(N-octanoilo)-Phe-^{5}Leu-Ser-Pro-Glu-His-^{10}Gln-Arg-Val-Gln-
Gln-^{15}Arg-Lys-Glu-Ser. La N-octanoilación aumenta la estabilidad de la grelina frente la actividad esterasa. En un modo de realización todavía más preferido, F se selecciona del grupo que consiste en Texas Red, tetrametil-rodamina, MR121. ("New fluorescent dyes in the red region for biodiagnostics" M. Sauer et al 1995 J. Fluoresc. Vol. 5, pp 247-261, o BODIPY-FL ácido 4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno-3-propiónico. En un modo de realización más preferido, F es MR121.
Un secretagogo de la hormona del crecimiento marcado descrito aquí anteriormente se puede utilizar para identificar un compuesto que se puede unir al receptor del secretagogo de la hormona del crecimiento. Dicho secretagogo de la hormona del crecimiento marcado también se puede utilizar para identificar un receptor celular como receptor de secretagogo de la hormona del crecimiento.
La presente invención también proporciona un proceso para sintetizar un secretagogo de la hormona del crecimiento marcado que comprende los pasos de a) unión de una Cys al aminoácido C-terminal; y b) reacción del péptido que contiene el tiol con un colorante fluorescente. Preferiblemente, dicho colorante fluorescente se selecciona del grupo que consiste en Texas Red, tetrametil-rodamina, MR121. ("New fluorescent dyes in the red region for biodiagnostics" M. Sauer et al 1995 J. Fluoresc. Vol. 5, pp 247-261, o BODIPY-FL ácido 4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno-3-propiónico.
Muccioli et al. (J. Endocrin. Invest. 2001, 24, p.RC7-RC9) revela una grelina-Tyr4-^{125}I radiomarcada. La declaración en p. RC8, columna derecha, de que los sitios de unión del GHS sintético son mayores que los receptores de la grelina indica que este péptido de grelina radiomarcado tiene una alta actividad de unión no específica.
El documento WO01/92292 revela análogos de grelina no marcados. En el análisis de fijación a receptores revelado en la p.17, se utiliza una molécula pequeña (no un péptido) de unión al receptor del secretagogo de la hormona del crecimiento marcado son ^{35}S.
\newpage
El documento WO01/38355 revela un péptido relacionado con la motilina con una secuencia que corresponde a la grelina. Se revela un péptido marcado de forma fluorescente sin residuo Cys en el extremo C-terminal. Dicho péptido sólo se utilizó en experimentos in vivo. No hay indicaciones para el uso del péptido de grelina marcado de forma fluorescente en cribados, incluyendo los cribados de alto rendimiento.
La presente invención también se refiere a un método in vitro para identificar un compuesto que se puede unir a un receptor del secretagogo de la hormona del crecimiento que comprende el contacto de dicho compuesto con un huésped que expresa un receptor del secretagogo de la hormona del crecimiento en presencia de un secretagogo de la hormona del crecimiento marcado aquí antes descrito, o con una preparación de membrana de tal huésped, y un control de si el compuesto influencia la unión del secretagogo de la hormona del crecimiento marcado aquí antes descrito al receptor del secretagogo de la hormona del crecimiento mediante la medida de la fluorescencia de la marca del secretagogo de la hormona del crecimiento marcado unido aquí antes descrito.
El huésped, que no procede de células embrionarias humanas, puede ser una muestra de tejido, células primarias o células en cultivo que expresan un receptor del secretagogo de la hormona del crecimiento de forma natural, o que se transfectan de forma transitoria o estable con un receptor del secretagogo de la hormona del crecimiento. Los métodos para transfectar las células son bien conocidos en el ámbito (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA).
Preferiblemente, dicho método es un método de cribado de alto rendimiento. El método descrito aquí anteriormente es sensible con respeto al pH del tampón de prueba utilizado. Una desviación del pH de 0,2 resulta en una pérdida del 50% de la unión. Por eso, en un modo de realización preferido, el tampón de prueba utilizado en dicho método tiene un pH de 7,2. Los péptidos de esta invención tienden a unirse a las superficies. De esta manera, en un modo de realización preferido, el utensilio de plástico se compone de una superficie que no se une o se bloquea con una solución de caseína. El término "utensilio de plástico" como se utiliza aquí se refiere a las placas utilizadas para en análisis, así como cualquier tipo de tubo utilizado para preparar soluciones que se componen de los péptidos de esta invención. Preferiblemente, dicha solución de caseína contiene caseína al 1%. Más preferiblemente, el bloqueo se lleva a cabo durante toda la noche. En un modo de realización más preferido, las placas bloqueadas se lavan con tampón antes de ser usadas.
La presente invención también proporciona un método de identificación de un receptor celular como un receptor del secretagogo de la hormona del crecimiento que comprende el contacto de un huésped que se sospecha que expresa un receptor del secretagogo de la hormona del crecimiento con el secretagogo de la hormona del crecimiento marcado descrito aquí anteriormente y determinación de si la unión ha tenido lugar o no.
Además, la presente invención se refiere a un método para identificar la actividad de un compuesto como un secretagogo de la hormona del crecimiento que comprende el contacto del compuesto que se sospecha que tienen actividad como secretagogo de la hormona del crecimiento con un huésped que expresa un receptor del secretagogo de la hormona del crecimiento en presencia del secretagogo de la hormona del crecimiento marcado descrito aquí anteriormente y control de si el compuesto que se sospecha que tiene actividad como secretagogo de la hormona del crecimiento tiene influencia en la unión del secretagogo de la hormona del crecimiento descrito aquí anteriormente al receptor del secretagogo de la hormona del crecimiento.
Figuras
Fig. 1: Montaje de las placas para el ensayo de cribado de alto rendimiento (HTS, por sus siglas en inglés)
Fig. 2: Curvas de competencia del Zeiss-System, condiciones HTS. A) Competencia de la grelina (1-19) MR121 con H6935; b) Competencia de la grelina (1-19) MR121 con hexarelina.
Fig. 3: Afinidad de los análogos fluorescentes, determinada por análisis de competencia 125I-grelina. A) grelina (1-19) MR121; b) grelina (1-19) TMR; c) grelina (1-19) BoFl (BIODIPY-FL); d) grelina (1-19) Texas Red.
Fig 4: Polarización de los análogos fluorescentes, determinada según el protocolo del ejemplo 2.2.1 y 2.2.2.
Rojo (Más oscuro, barra de la izquierda): grelina(1-19)MR121, Azul (Más claro, barra de la derecha): grelina(1-19-N-oct)MR121.
1) Polarización fluorescente de los ligandos fluorescentes unidos totales (en presencia de membranas GHSR-1a); 2) Polarización fluorescente de los ligandos libres (en presencia de membranas GHSR-1a y exceso de competidor); 3) Polarización fluorescente de los ligandos fluorescentes en tampón.
Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis de los Péptidos Marcados
Ejemplo 1.1
Síntesis de ^{1}Gly-Ser-Ser(octanoil)-Phe-^{5}Leu-Ser-Pro-Glu-His-^{10}Gln-Arg-Val-Gln-Gln-^{15}Arg-Lys-Glu-Ser-Cys-NH_{2} 
\global\parskip0.900000\baselineskip
La síntesis en fase sólida de flujo continuo se efectuó en el sistema de síntesis peptídica Pioneer^{TM}, que empieza con la resina Tenta Gel S RAM (0,25 mmol/g (Rapp Polymere GmbH, Tübingen, Alemania) según el método descrito en "Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A practical approach" (Oxford University Press 2000) pp 41-74, Eds. W.C. Chan and P.D. White. Se utilizó el grupo Fmoc lábil a bases para la protección de a-amino. Se protegieron las cadenas laterales con los siguientes grupos protectores: -Asn(Trt), Glu(OtBu), Ser(tBu), His(Trt), Gln(Trt), His(Trt), Arg(Pbf), Lys(Boc), Cys (Trt). Se activaron los Fmoc-aminoácidos (4 equiv.) con una cantidad equivalente de O-(1,2-dihidro-2-oxopirid-1-il)-N,N,N', tetrafluoroborato de N'-tetrametiluronio (TPTU) y N,N-diisopropiletilamina (base de Hünig). La desprotección de Fmoc se consiguió con piperidina al 20% en DMF. La síntesis automatizada se interrumpió después de incorporar el residuo ^{4}Phe en la secuencia diana. La síntesis peptídica se continuó semimanualmente utilizando un sintetizador de proteínas SP650 (Labortec AG). Se añadió Fmoc-^{3}Ser-OH desprotegido de cadena lateral (0,65 g, 2 mmol), TPTU (0,59 g, 2 mmol), base de Hünig (1,03 mL) a la resina peptídica y se dejó la unión durante 1 h en disolvente DMF (negativo para el test de la ninhidrina). Se consiguió la octanoilación del hidroxilo de cadena lateral utilizando ácido caprílico (2,0 mL, 12 mmol), N,N'-diisopropilcarbodiimida, (1,9 mL, 12 mmol) N,N'-dimetilaminopiridina (18 mg, 0,15 mmol) en el solvente N-metilpirrolidina. Después de 4 horas se filtró la mezcla de reacción y se siguió la síntesis utilizando el protocolo de síntesis peptídica estándar (arriba). Se trató la resina ^{1}Gly-Ser(tBu)-Ser(octanoil)-Phe-^{5}Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OtBu)-His(Trt)-^{10}Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Val-Gln(Trt)-Gln(Trt)-^{15}Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-NH_{2} TentaGel-S (2,0 g) con una mezcla (100 mL) de 95% de TFA, 2,5% de H_{2}O, 2,5% de EDT, 2,5% de triisopropilsilano durante 5 horas. Se concentró la mezcla de reacción y se vertió en dietiléter y el precipitado se recogió mediante filtración y se liofilizó del agua. Se purificó el péptido bruto (0,80 g) mediante RP-HPLC preparativa. Se obtuvo ^{1}Gly-Ser-Ser(octanoil)-Phe-^{5}Leu-Ser-Pro-Glu-His-^{10}Gln-Arg-Val-Gln-Gln-^{15}Arg-Lys-Glu-Ser-Cys-NH2 (0,18 g, análisis EM Ion-spray (M+2H)^{2+}/2 = 1165,4, (M+3H)^{3+}/3 = 777,2).
Ejemplo 1.1b
Síntesis de ^{1}Gly-Ser-Dapa(N-octanoil)-Phe-^{5}Leu-Ser-Pro-Glu-His-^{10}Gln-Arg-Val-Gln-Gln-^{15}Arg-Lys-Glu-Ser- Cys-NH_{2} Ácido (S)-2-(9H-Fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-3-octanoilamino-propiónico; Fmoc-L-Dapa(N-octanoil)-OH
Se añadió una solución de Fmoc-L-Dapa-OH Neosysytem FA04002 8 (3,3 g, 10 mmol) en DMF (10 mL) a una mezcla pre-activada que contenía ácido caprílico (1,54 mL, 10 mmol), TPTU (2,8 g, 9,5 mmol) y base de Hünig (3,4 mL, 20 mmol) en DMF (20 mL). La mezcla de reacción se agitó durante 1 h, se concentró bajo presión reducida, se disolvió en acetato de etilo y se lavó con 5%/10% KHSO_{4}/K_{2}SO_{4}, salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4}, se filtró y se concentró. Cristalización a partir de acetato de etilo/hexano: 3,7 g, 82% ; EM = 451,4 (MH)^{-}.
La síntesis peptídica incorporando Fmoc-L-Dapa(N-octanoyl)-OH se llevó a cabo en un sistema de síntesis peptídica Pioneer^{TM} como se describe arriba empezando con una resina Tentagel S-NH_{2} (0,55 mmol), dando el péptido purificado ^{1}Gly-Ser-Dapa(N-octanoil)-Phe-^{5}Leu-Ser-Pro-Glu-His-^{10}Gln-Arg-Val-Gln-Gln-^{15}Arg-Lys-Glu-Ser-Cys-NH_{2} :135 mg; Ion-spray EM: (M+2H)^{2+}/2 = 1164,8, (M+3H)^{3+}/3 = 776,8).
Conjugación de los péptidos a fluoróforos
Ejemplo 1.2
^{1}Gly-Ser-Ser(octanoil)-Phe-^{5}Leu-Ser-Pro-Glu-His-^{10}Gln-Arg-Val-Gln-Gln-^{15}Arg-Lys-Glu-Ser-Cys(TxR)-NH_{2}
El péptido de arriba, que contiene tiol, (1,3 mg) se disolvió en 9:1 DMSO: tampón fosfato 50 mM pH 6 a una concentración final 2,5 mM. Se añadieron 1,2 equivalentes de TxR (Texas Red)-Maleimide (solución en DMSO preparada fresca 30 mM) y se dejó que la mezcla reaccionara a temperatura ambiente durante 10 minutos. La mezcla de reacción se purificó directamente mediante RP-HPLC: 0,17 mg. Análisis EM: masa monoisotópica calculada: C136H198N36O39S3 = 3055,38; masa monoisotópica encontrada: 3055,35.
Ejemplo 1.3
^{1}Gly-Ser-Ser(octanoil)-Phe-^{5}Leu-Ser-Pro-Glu-His-^{10}Gln-Arg-Val-Gln-Gln-^{15}Arg-Lys-Glu-Ser-Cys(TMR)-NH_{2}
El péptido derivado de la tetrametilrodamina (TMR, por sus siglas en inglés) se preparó de forma análoga al ejemplo 1.2: A partir de 1,7 mg del material peptídico inicial se aislaron 0,44 mg de péptido marcado. Análisis EM: masa monoisotópica calculada: C127H185N35O36S = 2808,34; masa monoisotópica encontrada: 2808,40.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1.4
^{1}Gly-Ser-Ser(octanoil)-Phe-^{5}Leu-Ser-Pro-Glu-His-^{10}Gln-Arg-Val-Gln-Gln-^{15}Arg-Lys-Glu-Ser-Cys(MR121)-NH_{2}
El péptido derivado de MR121* se preparó de forma análoga al ejemplo 1.2: A partir de 1,5 mg de material peptídico inicial se aislaron 0,37 mg del péptido marcado. Análisis EM: masa monoisotópica calculada: C129H196N37O35S = 2855,44; masa monoisotópica encontrada: 2855,38.
Ejemplo 1.5
^{1}Gly-Ser-Ser(octanoil)-Phe-^{5}Leu-Ser-Pro-Glu-His-^{10}Gln-Arg-Val-Gln-Gln-^{15}Arg-Lys-Glu-Ser-Cys(BODIPY-FL)-NH_{2}
El péptido derivado de BODIPY-FL (ácido 4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno-3-propiónico) se preparó de forma análoga al ejemplo 1.2: A partir de 0,7 mg de material inicial se aislaron 0,20 mg del péptido marcado. Análisis EM: masa monoisotópica calculada: C119H183BF2N36O34S = 2742,4; masa monoisotópica encontrada: 2742,4.
Ejemplo 1.6
^{1}Gly-Ser-Dapa(N-octanoil)-Phe-^{5}Leu-Ser-Pro-Glu-His-^{10}Gln-Arg-Val-Gln-Gln-^{15}Arg-Lys-Glu-Ser-Cys(MR121)-NH_{2}
El péptido derivado de MR121* se preparó de forma análoga al ejemplo 1.2: A partir de 0,7 mg de material peptídico inicial se aislaron 0,17 mg de péptido marcado. Análisis EM: masa monoisotópica calculada: C129H197N36O35S = 2854,46; masa monoisotópica encontrada: 2854,49.
*MR-121 es un colorante fluorescente de oxazina. [ver lit.: "New fluorescent dyes in the red region for biodiagnostics" M. Sauer et al 1995 J. Fluoresc. Vol. 5, pp 247-261].
Ejemplo 2 Análisis de fijación a receptores
Ejemplo 2.1
Preparación de la membrana
Las células de riñón de embrión humano HEK 293 (EBNA) crecieron en suspensión y se transfectaron según el método descrito previamente (Schlaeger and Christensen, Cytotechnology, 30, 71-83, 1999). Se centrifugaron las células durante 10 min a 500 rpm, se lavaron una vez con PBS-0,7 mM EDTA/(4ºC) y se resuspendieron en PBS-EDTA-PI (con un cóctel inhibidor de la proteasa), hasta 2 mL/g de células. Se rompieron las células con Ultra Turax nivel verde 3 x 15'' con 30'' de rotura en hielo. Para eliminar los restos se centrifugó la suspensión en un rotor Sorvall SS34 durante 20 min a 2.000 rpm. Se recogió el sobrenadante y se centrífugo durante 40 min a 20.000 rpm. Se resuspendió el sedimento en PBS-EDTA. Se verificó la densidad de receptor con análisis de fijación a receptores de saturación utilizando T- MK 0677 para tener 4,9 pmol/mg de proteína.
Ejemplo 2.2
Análisis de polarización fluorescente (FP, por sus siglas en inglés)
Ejemplo 2.2.1
Desarrollo del análisis
Las membranas celulares que contienen GHSR-1ª se diluyeron en tampón FP: Hepes 25 mM, MgCl_{2} 5 mM, CaCl_{2} 1 mM, PEG al 4%, BSA al 0,1% (fracción V) a un volumen final de 0,5-1 mL, pasando a través de una jeringa de 0,4 mm y se sometieron a ultrasonidos 20 pulsos 4 veces mientras se mantenían en hielo. Se preparó una solución 10 nM de grelina marcada con MR121 (marcador) y soluciones concentradas x20 de competidor en tampón FP. Para determinar la polarización del marcador de la unión del receptor, se prepararon tres muestras de 180 \muL: Unión total: Membranas + marcador, Ligando libre: membranas + marcador + competidor, Fluorescencia de fondo: membranas + tampón. Se transfirieron 3 x 50 \muL de cada muestra a placas de análisis justo después de mezclarlo.
\newpage
Ejemplo 2.2.2
Protocolo del HTS para en análisis de competición de fijación a receptores de la FP-grelina
La Figura 1 muestra una posible distribución de una placa de 384 pocillos para el cribado de alto rendimiento. Para una serie de cribado, se utilizaron 119 platos de muestra y un plato de DMSO (membranas p20F1+p22F1). El siguiente, es un ejemplo no limitante representativo de un protocolo HTS con MR121 como fluorocromo. Para el análisis, se utilizaron placas Costar para UV de 384 pocillos con superficie inerte. Se utilizó el siguiente tampón de análisis: Hepes 25 mM pH 7,2, MgCl_{2} 5 mM, CaCl_{2} 1 mM, polietilenglicol al 4%, y se añadió BSA al 0,1% (Frac. V) fresco cada semana. Se proporcionaron los receptores como se expone a continuación: se aislaron las membranas como se describe en el ejemplo 2.1. La concentración del análisis final era de 1,4 nM de GHSR-1A como se determina por la unión saturada de 125I-grelina. Los valores típicos para el estoc de membrana son: Bmax = 6 fmol/\mug; Concentración de proteína = 50 \mug/\muL.
Para evitar la sedimentación, es necesario pasar las membranas a través de una jeringa (x3/0,4 mm) y someterlas a ultrasonidos con el equipo "Branson sonifier 250" a un nivel de intensidad de 3-4 con 4 x 20 pulsos separados por una pausa de 30 seg. Se mantuvieron las membranas en hielo durante la exposición a los ultrasonidos. Se diluyeron las membranas hasta una concentración final del receptor de 1,4 nM.
La grelina marcadora (1-19)[K19MR121] se diluyó en tampón a partir de un estoc de DMSO 1 \muM. La concentración del análisis final fue de 0,5 nM. Debido que el péptido tiende a unirse a las superficies, los utensilios de plástico utilizados para diluir la solución peptídica o bien estaba compuesta por una superficie inerte, o bien se bloqueó durante toda la noche con una solución de caseína al 1%, y luego se lavó con tampón antes de usarse.
Se utilizaron los siguientes pasos para el cribado de alto rendimiento:
1)
se añadieron 30 \muL de solución de membrana x1,33 a todos los pocillos de las placas de análisis.
2)
se transfirieron 4,4 \mul de tampón a los pocillos "FPBLK"/"100% control" y se transfirieron 4,4 \muL de solución del compuesto de referencia a los pocillos "STD" y "0% control" de placas de reserva a las placas de análisis.
3)
se añadieron 10 \muL de agua con DMSO al 0% a las columnas 3 a 24 de la placa de almacenamiento de compuesto que contenía 1 mL de compuestos 2 mM (Conc. final 20 \muM).
4)
Se mezclaron los contenidos de la placa de almacenamiento.
5)
Se transfirieron 4,4 \muL de compuestos diluidos del plato de almacenamiento al plato de análisis.
6)
Se mezclaron los contenidos de los platos de análisis cinco veces y se incubaron durante 30 min a 24ºC.
7)
se añadieron 5,6 \muL de solución marcadora x7,143 a la placa de análisis excepto en los pocillos A1 a D2 (pocillos marcados "FPBLK" en la Fig. 1) a los cuales se añadieron 5,6 \muL de tampón.
8)
El contenido de las placas de análisis se mezcló 5 veces.
9)
Se transfirieron 30 \muL de solución en cada pocillo de la placa de análisis a la placa de lectura (superficie inerte UV de Corning).
10)
Se incubó la placa de lectura durante 10 minutos a temperatura ambiente.
11)
Se leyó la fluorescencia de MR121 de la placa de lectura a 650-695 nm (5 s, distancia de enfoque de 1 mm, escaneo xy de 0,5 mm), con polarización en paralelo (||) y cruzada (\perp), utilizando un lector de placas de microtitulación plate:vision de Zeiss.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> F. Hoffmann-La Roche AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Grelina marcada fluorescente
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 22229
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatenteIn versión 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> precursor de la grelina
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(117)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> grelina
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(117)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proteína madura
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> grelina
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo derivado del octanoilo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
1 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> grelina(1-19)
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> grelina(1-19)
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> derivado del octanoilo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
2

Claims (13)

1. Un secretagogo de la hormona del crecimiento marcado de la fórmula
R1-Cys-F
donde R1 es una secuencia peptídica derivada de la secuencia polipeptídica de la grelina del Núm. Id. Sec.: 1, una Cys está unida al aminoácido C-terminal de R1 y F es un fluorocromo.
2. El secretagogo de la hormona del crecimiento marcado de la reivindicación 1, donde R1 es el Núm. Id. Sec.: 2.
3. El secretagogo de la hormona del crecimiento marcado de la reivindicación 1, donde R1 está octanoilado.
4. El secretagogo de la hormona del crecimiento marcado de la reivindicación 1, donde R1 está N-octanoilado.
5. El secretagogo de la hormona del crecimiento marcado de la reivindicación 1, donde R1 es Gly-Ser-Ser(octanoil)-Phe-^{5}Leu-Ser-Pro-Glu-His-^{10}Gln-Arg-Val-Gln-Gln-^{15}Arg-Lys-Glu-Ser.
6. El secretagogo de la hormona del crecimiento marcado de la reivindicación 1, donde R1 es ^{1}Gly-Ser-Dapa(N-octanoil)-Phe-^{5}Leu-Ser-Pro-Glu-His-^{10}Gln-Arg-Val-Gln-Gln-^{15}Arg-Lys-Glu-Ser.
7. El secretagogo de la hormona del crecimiento marcado de las reivindicaciones 1 a la 6, donde F se selecciona del grupo que consiste en TxR, TMR, MR121 o BODIPY-FL.
8. Utilización in vitro del secretagogo de la hormona del crecimiento marcado de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7 para identificar un compuesto que se puede unir a un receptor de secretagogo de la hormona del crecimiento.
9. La utilización de la reivindicación 8 que es un método que consta de los pasos de:
a)
contactar dicho compuesto con una membrana aislada a partir de una célula que expresa un receptor de secretagogo de la hormona del crecimiento en la presencia del secretagogo de la hormona del crecimiento marcado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 7 en un tampón de análisis;
b)
lavar dicha membrana para eliminar el secretagogo de la hormona del crecimiento no unido; y
c)
controlar si el compuesto influencia la unión del secretagogo de la hormona del crecimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 7 al receptor del secretagogo de la hormona del crecimiento mediante la medida de la fluorescencia de dichas membranas.
10. El uso de la reivindicación 9, donde dicho método es un método de cribado de alto rendimiento.
11. El uso de las reivindicaciones 9 o 10, donde dicho tampón de análisis tiene un pH de 7,2.
12. Un proceso para sintetizar un secretagogo de la hormona del crecimiento marcado según las reivindicaciones 1 a la 7 que comprende los pasos de
a)
unir una Cys al aminoácido C-terminal; y
b)
reaccionar el péptido con tiol con un colorante fluorescente.
13. Un método in vitro de identificación de un receptor celular como un receptor del secretagogo de la hormona del crecimiento que comprende el contacto de un huésped que se sospecha que expresa un receptor del secretagogo de la hormona del crecimiento con el secretagogo de la hormona del crecimiento marcado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 7 y determinar si ha tenido lugar la unión.
ES04024029T 2003-10-16 2004-10-08 Peptidos sw grelina marcados fluorescentemente. Active ES2300686T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP03023568 2003-10-16
EP03023568 2003-10-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2300686T3 true ES2300686T3 (es) 2008-06-16

Family

ID=34429239

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES04024029T Active ES2300686T3 (es) 2003-10-16 2004-10-08 Peptidos sw grelina marcados fluorescentemente.

Country Status (6)

Country Link
US (2) US7173109B2 (es)
JP (1) JP4293971B2 (es)
CN (1) CN1637416B (es)
CA (1) CA2480199C (es)
DE (1) DE602004012207T2 (es)
ES (1) ES2300686T3 (es)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2625920C (en) * 2005-09-28 2014-12-23 Societe De Conseils De Recherches Et D'applications Scientifiques (S.C.R Analogs of ghrelin
JP5134627B2 (ja) * 2006-09-27 2013-01-30 イプセン ファルマ ソシエテ パール アクシオン サンプリフィエ Ｎ末端で置換されたグレリン類似体
CA2724976A1 (en) * 2008-05-23 2009-11-26 The University Of Western Ontario Novel ghrelin analogues
US20150133327A1 (en) * 2012-04-19 2015-05-14 Hon Sing Leong Method for detecting or monitoring prostate cancer

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1232175B1 (en) 1999-11-22 2009-07-08 ZymoGenetics, Inc. Method of forming a peptide-receptor complex with zsig33 polypeptides.
CA2411667A1 (en) 2000-05-30 2001-12-06 Merck & Co. Inc. Ghrelin analogs
MXPA03000738A (es) * 2000-07-24 2003-06-04 Ardana Bioscience Ltd Antagonistas de grelina.
WO2003072753A2 (en) * 2002-02-27 2003-09-04 Emory University Multimeric binding complexes
AU2003282755A1 (en) * 2002-10-07 2004-05-04 Zymogenetics, Inc. Methods of regulating body weight

Also Published As

Publication number Publication date
CA2480199C (en) 2013-03-12
DE602004012207D1 (de) 2008-04-17
JP2005120093A (ja) 2005-05-12
US7173109B2 (en) 2007-02-06
JP4293971B2 (ja) 2009-07-08
CN1637416A (zh) 2005-07-13
DE602004012207T2 (de) 2009-03-12
CA2480199A1 (en) 2005-04-16
CN1637416B (zh) 2011-08-17
US20050085421A1 (en) 2005-04-21
US20060073522A1 (en) 2006-04-06
US7186798B2 (en) 2007-03-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0988394B1 (en) Compositions for the detection of enzyme activity in biological samples and methods of use thereof
Chen et al. Synthesis of the Rheb and K‐Ras4B GTPases
AU2005248453B2 (en) Identification of compounds modifying a cellular response
JP2004532604A (ja) Ｂリンパ球刺激因子タンパク質（ＢＬｙＳ）のための結合性ポリペプチド
CA2158782C (en) Marker for growth hormone-releasing factor receptors
ES2300686T3 (es) Peptidos sw grelina marcados fluorescentemente.
Huang et al. Calcium binding and putative activity of the epidermal growth factor domain of blood coagulation factor IX
US8445291B2 (en) Method for detecting target substance, and tag, DNA, vector, probe and detection kit for use therewith
CN104211811A (zh) 铜银离子荧光蛋白探针及其制备方法和应用
Morimoto et al. Synthesis of a large library of macrocyclic peptides containing multiple and diverse N-alkylated residues
YAMASHITA et al. Reactive sulfhydryl groups of sarcoplasmic reticulum ATPase. II. Site of labeling with iodoacetamide and its fluorescent derivative
EP1524274B1 (en) Fluorescently labelled Ghrelin peptides.
US7041642B1 (en) Fluorescent bombesin-like peptides
Vidal et al. Solid‐phase synthesis and cellular localization of a C‐and/or N‐terminal labelled peptide
Fischer et al. Adrenomedullin disulfide bond mimetics uncover structural requirements for AM1 receptor activation
US4312943A (en) Method for enzyme immunoassay of pancreatic glucagon
Bes et al. Identification of a hexapeptide binding region in the nociceptin (ORL1) receptor by photo-affinity labelling with Ac-Arg-Bpa-Tyr-Arg-Trp-Arg-NH2
EP2436690B1 (en) Reversibly photoswitchable polypeptides
US5824772A (en) Fluorescent somatostatin
CA1157465A (en) Synthetic antigenically-active polypeptide and a process for its preparation
Wolf et al. The ring size of monocyclic ET‐1 controls selectivity and signaling efficiency at both endothelin receptor subtypes
Eldin et al. Expression of human β-myosin heavy chain fragments in Escherichia coli; localization of actin interfaces on cardiac myosin
US5693679A (en) Fluorescent somatostatin
ES2445018B1 (es) VARIANTES DE LA PROTEÍNA DE FUSIÓN SENSIBLE AL CALCIO tdTOMATO-AEQUORINA
Hlaváček et al. Insect oostatic activity of GnRH and its fragments