ES2300546T3

ES2300546T3 - Polvo de bacterias del acido lactico doblemente recubiertas usando proteina y polisacarido y metodo de preparacion del mismo y forma farmaceutica del mismo.

Info

Publication number: ES2300546T3
Application number: ES03255553T
Authority: ES
Inventors: Myung-Jun Chung; Young-Jai Cho; Soo-Dong Kim; Un-Pyoe Hong
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-09-05
Filing date: 2003-09-05
Publication date: 2008-06-16
Anticipated expiration: 2023-09-05
Also published as: EP1514553A1; ATE387207T1; DK1514553T3; EP1514553B1; DE60319375T2; DE60319375D1

Abstract

Método para preparar un polvo de bacterias del ácido láctico doblemente recubiertas, que comprende las etapas de: mezclar una proteína predeterminada para obtener una disolución acuosa de proteína; añadir una proteasa a la disolución acuosa de proteína para tratar enzimáticamente la disolución acuosa de proteína; fermentar las bacterias del ácido láctico en la disolución acuosa de proteína tratada enzimáticamente; separar y concentrar la disolución fermentada usando una separadora centrífuga de alta velocidad en la que las bacterias del ácido láctico se recubren con precipitados de proteína presentes en la disolución fermentada (primera etapa de recubrimiento); y mezclar homogéneamente las bacterias del ácido láctico recubiertas con una mezcla de una disolución acuosa de polisacárido y una disolución acuosa crioprotectora para recubrir las bacterias del ácido láctico con dicha mezcla de disolución, y liofilizar las bacterias del ácido láctico doblemente recubiertas (segunda etapa de recubrimiento).

Description

Polvo de bacterias del ácido láctico doblemente recubiertas usando proteína y polisacárido y método de preparación del mismo y forma farmacéutica del mismo.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a un polvo de bacterias del ácido láctico (BAL) doblemente recubiertas usando una proteína y un polisacárido, a un método para preparar el polvo de BAL y a un método para fabricar una forma farmacéutica que contiene el polvo de BAL. Más particularmente, la presente invención se refiere a un polvo de BAL doblemente recubiertas con una alta tasa de supervivencia de las células de BAL en el organismo recubriendo doblemente las BAL con una proteína y un polisacárido, a un método para preparar el polvo de BAL y a un método para fabricar una forma farmacéutica que contiene el polvo de BAL que puede minimizar la muerte de las células durante la fabricación de la forma farmacéutica.

Descripción de la técnica relacionada

Generalmente, las BAL residen en el intestino humano y muestran una variedad de efectos fisiológicos incluyendo la activación de la motilidad intestinal (peristaltismo), inhibición del crecimiento de bacterias dañinas, estimulación de las vitaminas y formación de material inmunoestimulador, etc. En vista de la estructura del cuerpo humano, dado que las BAL ingeridas alcanzan el intestino a través del estómago, se destruyen por el ácido gástrico secretado en el estómago y por tanto las actividades fisiológicas de las especies de BAL no pueden ejercerse de manera
suficiente.

Un método convencional para preparar un polvo de BAL sin recubrir comprende las etapas de fermentación de las BAL, recogida de las células de BAL y liofilización (véase la figura 1). Dado que el polvo de BAL sin recubrir es sumamente sensible al aire, humedad y temperatura, se encuentran graves problemas, tales como inestabilidad durante el almacenamiento y distribución y poca procesabilidad durante la fabricación de productos de consumo. Tal como se describió anteriormente, dado que la mayoría de las BAL ingeridas por una persona o animal se destruyen por contacto directo con ácido gástrico y ácido biliar, no pueden residir de manera estable en el intestino y no pueden garantizarse suficientemente la eficacia y efectos útiles de las BAL.

Para resolver estos problemas, se han recubierto las BAL. Los métodos convencionales para recubrir las BAL incluyen el uso de agentes de recubrimiento entéricos y microencapsulación usando gelatina, sacáridos, gomas, etc. Estos métodos de recubrimiento comprenden además una etapa adicional de añadir un agente de recubrimiento tras la recogida de las BAL.

El recubrimiento de las BAL se lleva a cabo comúnmente añadiendo un agente de recubrimiento a un polvo de BAL secado por congelación. El procedimiento general se muestra en la figura 1.

Se lleva a cabo una primera etapa (M1, M2) para cultivar BAL cultivando las BAL en un medio de fermentación complementado con peptonas, extracto de carne de vacuno, extracto de levadura, glucosa e iones inorgánicos en un aparato anaerobio. Estos componentes del medio están compuestos principalmente por los solubles en agua requeridos para la proliferación de las BAL. A continuación, se recoge el cultivo de BAL usando una centrifugación o ultrafiltración para separar el cultivo de BAL y filtrado y para concentrar el cultivo de BAL.

Una etapa de rápida congelación y liofilización del cultivo de BAL (M4) provoca la muerte de las células de BAL. Por esta razón, se añade un crioprotector que incluye sacáridos y aminoácidos para secar y pulverizar el cultivo de BAL, antes de liofilizar. Entonces, se añade un agente de recubrimiento en una disolución acuosa al polvo de BAL secado por congelación (M5). Se agita la mezcla resultante y vuelve a liofilizarse (M6).

Alternativamente, la etapa de recubrimiento puede llevarse a cabo usando un procedimiento de microencapsulación que comprende las etapas de añadir un agente de recubrimiento que puede formar perlas ultrafinas, esféricas y pulverizar la mezcla usando una boquilla.

Tal como se indicó anteriormente, dado que los métodos convencionales para recubrir BAL comprenden las etapas de mezclar y agitar un agente de recubrimiento, o usar un procedimiento de microencapsulación, tras la recogida de un cultivo de BAL y el secado-pulverización del cultivo de BAL, son económicamente desventajosos en cuanto a las etapas adicionales y el agente de recubrimiento costosos. Además, dado que existe un riesgo de contaminación por microorganismos, es difícil un procedimiento aséptico. Además, dado que se requieren un crioprotector y un estabilizador para garantizar la tasa de supervivencia y estabilidad de las BAL durante la etapa de liofilización, los métodos implican excesivas etapas de procesamiento y consumo de materiales.

Basándose en estos problemas de las técnicas anteriores, existe una necesidad de desarrollar polvos de BAL recubiertas que puedan controlar eficazmente la reacción con el aire y la humedad, muestren excelente resistencia al calor, ácido y bilis y garanticen la viabilidad, eficacia y efectos de las BAL. Además, existe una necesidad de desarrollar métodos para preparar de manera aséptica los polvos con materiales de bajo coste y costes de fabricación bajos. Además, cuando se usa solo un agente de recubrimiento seleccionado de proteínas, polisacáridos, gomas, diversos materiales de recubrimiento entéricos, etc., el efecto de recubrimiento del agente de recubrimiento es insatisfactorio, lo que afecta a la estabilidad de las BAL. Por consiguiente, es necesario maximizar el efecto de recubrimiento combinando diversos agentes de recubrimiento.

Por otra parte, ha habido intentos de fabricar formulaciones comestibles encapsulando un polvo de BAL o añadiendo una perla de azúcar del polvo de BAL a diversos productos alimenticios.

Sin embargo, ya que la encapsulación convencional de un polvo de BAL o perlas de azúcar del polvo de lactobacilos añadidas a los productos alimenticios y medicamentos son mortales para las BAL, no pueden garantizarse satisfactoriamente la eficacia y los efectos de las BAL en el organismo.

A continuación en el presente documento, se explicarán en detalle los procedimientos de encapsulación y preparación de perlas de azúcar convencionales y los problemas que se producen cuando se aplican los procedimientos para recubrir BAL.

En primer lugar, se explica el procedimiento de encapsulación. Generalmente, las cápsulas usadas para encapsular productos alimenticios y medicamentos se dividen en productos de cápsula blanda y productos de cápsula dura. Los productos de cápsula dura se fabrican llenando una cápsula formada previamente con materiales de partida, mientras que los productos de cápsula blanda se fabrican realizando simultáneamente tanto la formación de una cápsula como el llenado de la cápsula con materiales de partida. Ya que se añade un alcohol polihidroxilado como plastificante a la gelatina para fabricar una cápsula blanda, la cápsula blanda es ventajosa en comparación con una cápsula dura en cuanto a la flexibilidad. Además, la cápsula blanda puede fabricarse en una variedad de formas, tales como formas circular, ovoide o cilíndrica. Además, la cápsula blanda puede utilizarse para las administraciones oral, rectal y vaginal. En particular, cuando un material de partida que va a encapsularse está en un estado líquido, tal como una grasa, se usa principalmente una cápsula dura.

Para fabricar la cápsula blanda, se usa ampliamente un procedimiento de troquel rotativo. El procedimiento de troquel rotativo se lleva a cabo alimentando un material aceitoso mientras se introducen continuamente dos láminas de gelatina entre dos rodillos de estampación giratorios, y moldeando por compresión las láminas de gelatina. El procedimiento específico es tal como sigue:

1) pesar los materiales de partida,

2) preparar un material para llenar una cápsula,

3) fijar y desgasificar el material para estabilizarlo,

4) formar una película de lámina de gelatina,

5) moldear y llenar,

6) secar,

7) recubrir.

En la etapa 2), cuando se considera la capacidad de llenado y viscosidad, se usan principalmente aceite de semilla de soja, aceite de palma endurecido, lecitina, cremate de plomo, etc. como material para llenar la cápsula.

En la etapa 4), se usa principalmente gelatina como película de lámina. Puede añadirse glicerina y D-sorbitol en una razón predeterminada a la gelatina para determinar la dureza de la película. Si es necesario, pueden añadirse a la película de lámina un agente aromatizante y un agente colorante.

Cuando se moldea una cápsula deseada, es necesaria la determinación de una cantidad de llenado, zona de moldeado, temperatura de alimentación y temperatura de disolución apropiadas. Tras el llenado y moldeado, se elimina la humedad secando la cápsula moldeada durante 2-3 días. Si es necesario, puede llevarse a cabo una etapa de recubrimiento de la cápsula secada con un aceite para preparar un producto final.

Comparando las cápsulas blandas así preparadas con una cápsula dura, ya que la cápsula blanda limita la entrada de humedad y aire a través de la película, se mejora su vida útil de almacenamiento. La mejora en la vida útil de almacenamiento contribuye en gran medida a la estabilidad de las bacterias viables.

Sin embargo, cuando el método general y los materiales de partida para fabricar la cápsula blanda se usan para fabricar una cápsula blanda para encapsular BAL, existe el problema de que la mayoría de las células viables se destruyen durante el moldeado y secado de la cápsula blanda. Por consiguiente, no pueden conseguirse los objetivos deseados de una cápsula para encapsular BAL. Esto se debe a que el método y los materiales de partida para fabricar la cápsula blanda están limitados sólo a objetos inanimados. Es decir, el método y los materiales de partida no son adecuados para productos bacterianos viables.

Las principales causas de muerte de células viables durante la fabricación de una cápsula blanda para un polvo de BAL incluyen estrés debido a la oxidación de subproductos aceitosos usados para la formación de una película y el moldeado de la cápsula blanda, y a la humedad restante en la cápsula moldeada. Por consiguiente, se requieren actualmente materiales de partida específicos y concentraciones de los materiales de partida que puedan controlar apropiadamente la resistencia a la tracción y dureza de la película de la cápsula, y al mismo tiempo eviten de manera eficaz la muerte de células viables.

En vista de las situaciones mencionadas anteriormente, existe una necesidad de un método para fabricar una cápsula y una composición para fabricar una película de cápsula que pueda fabricar la forma farmacéutica de BAL en una forma de cápsula adecuada para la administración oral, minimizando de ese modo la muerte de células viables durante la fabricación y maximizando la eficacia de las BAL en el organismo.

A continuación, como método convencional para fabricar una perla de azúcar, se conoce un ejemplo de moldeado de un polvo de BAL en forma de perla usando ácido algínico. Este método usa las propiedades físicas del ácido algínico, tales como la capacidad de reticulación. Según el método, ya que se usa una disolución acuosa de ácido algínico y sal de calcio, etc., como agente de reticulación, las aplicaciones son sumamente limitadas. Por esta razón, el método de moldeado de un polvo de BAL en forma de perla no puede aplicarse al campo de los productos alimenticios. Por consiguiente, existe una necesidad de un método novedoso que incluya el moldeado de un polvo de BAL para dar una perla esférica, el recubrimiento, la coloración y el abrillantado usando un aparato común.

Cuando se usan métodos convencionales para fabricar una perla de azúcar que pueden aplicarse a productos alimenticios comunes para encapsular las BAL, la mayoría de las BAL mueren durante el procedimiento. Por consiguiente, existe una necesidad de un método y una composición que pueda moldear fácilmente una perla y evitar la muerte de células viables, y una composición que pueda usarse en el método.

Existen en la técnica otros métodos para extender la vida útil de almacenamiento de las BAL tal como el documento US 3.677.897 que describe cultivos de bacterias del ácido láctico que comprenden bacterias del ácido láctico cultivadas en un medio nutritivo, un recubrimiento de monoglicérido acetilado sobre dichas bacterias en cultivo y un vehículo combinado con dichas bacterias recubiertas, seleccionándose dicho vehículo de un grupo que consiste en glucosa, celulosa modificada y almidones modificados.

El documento KR 2002/069862 describe un método de fabricación de bacterias del ácido láctico recubiertas con proteína en el que se aumentaron la termoestabilidad, resistencia a ácidos y resistencia a bilis aumentando de ese modo la productividad y reduciendo el tiempo y coste de producción.

El documento US 6.455.052, por otra parte, describe la composición para formar un recubrimiento entérico sobre un comprimido, cápsula o gránulo para ingestión oral que incluye una mezcla líquida de partículas de ácido algínico dispersadas en una disolución acuosa de un agente de unión de semilla de algarroba, goma, gelatina, hidrocoloides vegetales y/o proteína animal. El documento WO 99/20745 también se refiere a un gránulo recubierto entérico preparado recubriendo bacterias del ácido láctico que contienen simiente con un material de recubrimiento miscible con agua y luego, si se desea, sometiendo el primer producto recubierto a un segundo recubrimiento con un material de recubrimiento de liberación controlada.

Sumario de la invención

Por tanto, la presente invención se ha realizado en vista de los problemas anteriores, y es un objeto de la presente invención proporcionar un polvo de BAL doblemente recubiertas que puede controlar de manera eficaz la reacción con el aire y la humedad, muestra excelente resistencia al calor, ácidos y bilis y garantiza la viabilidad, eficacia y los efectos de las BAL.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un método para un método para preparar de manera aséptica el polvo de BAL doblemente recubiertas con materiales de bajo coste y costes de fabricación bajos.

Es aún otro objeto de la presente invención proporcionar un método para fabricar una forma farmacéutica que contiene el polvo de BAL doblemente recubiertas que puede fabricar la forma farmacéutica en una forma adecuada para la administración oral y minimizar la muerte de células viables durante el procedimiento de fabrica-
ción.

Con el fin de conseguir los objetos anteriores de la presente invención, se proporciona un método para preparar un polvo de BAL doblemente recubiertas, que comprende las etapas de: mezclar una proteína predeterminada para obtener una disolución acuosa de proteína; añadir una proteasa a la disolución acuosa de proteína para tratar enzimáticamente la disolución acuosa de proteína; cultivar (fermentar) las BAL en la disolución acuosa de proteína tratada enzimáticamente; separar y concentrar la disolución fermentada usando una separadora centrífuga de alta velocidad, recoger las BAL y recubrir las BAL recogidas con precipitados de proteína presentes en la disolución fermentada (primera etapa de recubrimiento); y mezclar homogéneamente las BAL recubiertas con una disolución acuosa de polisacárido y una disolución acuosa crioprotectora para recubrir los lactobacilos con dicha mezcla de disolución, y liofilizar las BAL doblemente recubiertas (segunda etapa de recubrimiento).

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para preparar un polvo de BAL doblemente recubiertas, que comprende las etapas de: mezclar una proteína predeterminada para obtener una disolución acuosa de proteína; añadir una proteasa a la disolución acuosa de proteína para tratar enzimáticamente la disolución acuosa de proteína; cultivar (fermentar) las BAL en la disolución acuosa de proteína tratada enzimáticamente; separar y concentrar la disolución fermentada usando una separadora centrífuga de alta velocidad; recoger las BAL y recubrir las BAL recogidas con precipitados de proteína presentes en la disolución fermentada (primera etapa de recubrimiento); mezclar una disolución acuosa crioprotectora con las BAL recubiertas y liofilizarlas; y mezclar homogéneamente el polvo de BAL liofilizado con una disolución acuosa de polisacárido para recubrir las BAL con la disolución de polisacárido, y liofilizar las BAL doblemente recubiertas (segunda etapa de recubrimiento).

Breve descripción de los dibujos

Los anteriores y otros objetos, características y otras ventajas de la presente invención se entenderán más claramente a partir de la siguiente descripción detallada tomada junto con las fotografías y dibujos adjuntos, en los que:

la fotografía 1 muestra formas de los polvos de BAL doblemente recubiertas;

la fotografía 2 muestra una perla de azúcar que contiene polvo de bacterias del ácido láctico doblemente recubiertas;

la fotografía 3 muestra una cápsula que contiene polvo de bacterias del ácido láctico doblemente recubiertas;

la figura 1 es un diagrama de procedimiento que muestra un método convencional para preparar un polvo de BAL recubiertas;

la figura 2 es un diagrama de procedimiento que muestra un método para preparar un polvo de BAL doblemente recubiertas usando una proteína y un polisacárido según un ejemplo de la presente invención; y

la figura 3 es un diagrama de procedimiento que muestra un método para preparar un polvo de BAL doblemente recubiertas usando una proteína y un polisacárido, según otro ejemplo de la presente invención.

Descripción de las realizaciones preferidas

A continuación en el presente documento, se explicarán con más detalle ejemplos preferidos de un método para preparar un polvo de BAL doblemente recubiertas usando una proteína y un polisacárido según la presente invención, con referencia a las figuras 2 y 3 adjuntas.

La figura 2 muestra un diagrama de procedimiento de un método para preparar un polvo de BAL doblemente recubiertas usando una proteína y un polisacárido según un ejemplo de la presente invención. En referencia a la figura 2, las BAL recogidas se recubren doblemente con una proteína y un polisacárido y luego se liofilizan. La figura 3 muestra un diagrama de procedimiento de un método para preparar un polvo de BAL doblemente recubiertas usando una proteína y un polisacárido según otro ejemplo de la presente invención. En referencia a la figura 3, tras recubrirse en primer lugar las BAL recogidas con una proteína y liofilizarse, se recubre doblemente el polvo de BAL liofilizado con una disolución acuosa de polisacárido y se liofiliza.

Según los métodos de la presente invención, las células de BAL presentes en un medio de fermentación se recubren en primer lugar con un agente de recubrimiento de proteína, y se recubren además con una mezcla de una disolución acuosa de polisacárido y una disolución acuosa crioprotectora para preparar un polvo de BAL doblemente recubiertas. Los métodos de la presente invención consisten esencialmente en las etapas de añadir una proteasa, fermentar las BAL, recubrir en primer lugar con la proteína y recubrir en segundo lugar.

En la etapa de añadir una proteasa (S1), se usa una disolución acuosa al 1%-10% de leche desnatada o proteína de soja aislada o una mezcla de las mismas como medio de fermentación. Se añade una disolución de proteasa al medio de fermentación en una cantidad del 1\sim10% en peso basándose en el peso de la proteína para tratar enzimáticamente el medio de fermentación. La cantidad de proteasa añadida varía según la clase de especie de BAL que va a recubrirse. El hidrolizado tratado enzimáticamente de la leche desnatada y la proteína de soja aislada incluye un componente peptídico soluble en agua, de bajo peso molecular que se usará para proliferar las BAL, y un componente peptídico de alto peso molecular que es semisoluble en agua que se usará para recubrir las BAL.

En la etapa de fermentación de BAL (S2), tras añadir a la disolución tratada enzimáticamente, y disolver en la disolución, un 1\sim5% en peso de glucosa, un 0,1\sim1,5% en peso de extracto de levadura, un 0,1\sim1,5% en peso de extracto de carne de vacuno y un 0,01-0,1% en peso de un componente iónico seleccionado de citrato de amonio, acetato de sodio, fosfato de dipotasio, sulfato de magnesio, sulfato de manganeso, cloruro de sodio, etc., se cultivan las BAL en un tubo de fermentación anaerobia esterilizado por vapor.

En la primera etapa de recubrimiento con proteína (S3), se separa la disolución fermentada y se concentra usando una separadora centrífuga de alta velocidad a 15.000 rpm o más. En esta etapa, los componentes proteicos que permanecen en la disolución fermentada se depositan junto con las BAL para iniciar un mecanismo de recubrimiento. Controlando apropiadamente la concentración de proteína y la razón de tratamiento enzimático de la proteasa en la composición de hidrolizado que depende de la clase de especie de BAL que va a recubrirse, el lactobacilo puede proliferar rápidamente. Además, cuando se congela rápidamente, la composición de hidrolizado incluye las BAL y protege de la formación de cristales de hielo, mostrando de ese modo un efecto crioprotector.

En la segunda etapa de recubrimiento (S4), se usa como crioprotector una disolución acuosa al 35\sim45% del 1\sim10% en peso de trehalosa, maltodextrina, manitol y leche desnatada basándose en el peso de las BAL recogidas. Tras esterilizar a presión una disolución acuosa al 1%\sim10% del 1\sim10% en peso de goma xantana, celulosa o levano solo o mezclas de los mismos basándose en el peso de las BAL recogidas, se mezcla con las BAL recogidas y el crioprotector usando un agitador, se homogeniza y se liofiliza.

Según otro ejemplo (figura 3) del método para preparar un polvo de BAL doblemente recubiertas, puede mezclarse de manera homogénea un polvo de cultivo de bacterias secado por congelación, que están recubiertas con proteína y liofilizadas (S3-1), en la mezcla de la disolución acuosa de polisacárido y crioprotector anterior usando un agitador y luego se deshidrata por congelación, mediante lo cual el cultivo de bacterias se recubre en segundo lugar con polisacárido (S-4).

Cuando se liofilizan las BAL recubiertas con proteínas distribuidas uniformemente en una disolución acuosa de polisacárido, la poderosa fuerza adhesiva del polisacárido ayuda a la formación de agrupamientos que tienen una estructura sumamente compacta. Se trituran las agrupaciones se para que tengan un tamaño de partícula uniforme de 40\sim120 de malla (véase la fotografía 1).

El polisacárido usado como segundo agente de recubrimiento forma agrupaciones de BAL debido a su poderosa fuerza adhesiva. Además, ya que el polisacárido tiene hidrofilia, puede unirse con el primer agente de recubrimiento (proteína) y puede usarse en combinación con azúcares solubles en agua y el crioprotector (aminoácidos) y el estabilizador de BAL. En particular, el polisacárido es sustancialmente insoluble en agua en condiciones ácidas y se disocia y eluye fácilmente en condiciones neutras o básicas. Por consiguiente, las BAL así tratadas pueden sobrevivir en las condiciones ácidas del estómago y depositarse de manera estable en el intestino.

Además, la presente invención proporciona un método para fabricar una formulación que contiene el polvo de BAL doblemente recubiertas preparado anteriormente. En la presente invención, la forma farmacéutica que contiene el polvo de BAL doblemente recubiertas puede ser una perla de azúcar o una cápsula de gelatina blanda.

El método para fabricar una perla de azúcar que contiene el polvo de BAL doblemente recubiertas comprende las etapas de: pulverizar una disolución acuosa de polisacárido mientras se añade azúcar en polvo a azúcar blanco en rotación, para obtener una simiente central; pulverizar la disolución acuosa de polisacárido mientras se añade una mezcla de un polvo de BAL doblemente recubiertas y azúcar en polvo a la simiente central en rotación, para moldear una perla de azúcar; y secar la perla de azúcar moldeada en condiciones asépticas a una temperatura de 20ºC o inferior y una humedad relativa del 40% o inferior.

Además, la presente invención proporciona una composición para llenar una cápsula que contiene el polvo de lactobacilos doblemente recubiertos, que comprende una vitamina liposoluble, un polisacárido hidrófilo, un aceite vegetal, cera de abejas, lecitina, aceite de palma endurecido y el polvo de BAL doblemente recubiertas.

Preferiblemente, la composición para llenar una cápsula comprende un 10\sim50% en peso de una vitamina liposoluble, un 1\sim30% en peso de un polisacárido hidrófilo, un 15\sim25% en peso de un aceite vegetal, un 3\sim10% en peso de cera de abejas, un 0,5\sim3% en peso de lecitina, un 10\sim20% en peso de aceite de palma endurecido y el resto del polvo de BAL doblemente recubiertas.

Tal como se trató anteriormente, las causas principales de muerte de células viables durante la fabricación de una cápsula para un polvo de BAL incluyen estrés debido a la oxidación de subproductos aceitosos usados para la formación de una película y el moldeado de una cápsula, y a la humedad restante en la cápsula moldeada. Ya que la composición para llenar una cápsula comprende un contenido reducido de un aceite vegetal y comprende además una vitamina liposoluble, puede minimizar el estrés debido a los subproductos aceitosos. Además, ya que la composición para llenar una cápsula comprende además un polisacárido hidrófilo, puede evitarse la reacción con la humedad, contribuyendo de ese modo en gran medida a la estabilidad de las BAL y minimizando la muerte de células viables en la cápsula.

Una cápsula o perla de azúcar que contiene el polvo de BAL doblemente recubiertas puede minimizar la muerte de células viables durante la fabricación de la forma farmacéutica.

A continuación en el presente documento, se explica el método para fabricar la perla de azúcar y la composición para llenar la cápsula, con referencia a ejemplos preferidos del método para fabricar la perla de azúcar y la cápsula.

En primer lugar, se explica con detalle el método para fabricar la perla de azúcar. Como aparato para fabricar una perla de azúcar esférica que contiene el polvo de BAL doblemente recubiertas, puede usarse cualquier aparato que pueda aplicar una fuerza rotativa predeterminada a materiales en polvo, por ejemplo una cubeta de recubrimiento o una recubridora centrífuga. Además, pueden usarse como subproductos polisacáridos tales como sacarosa, goma arábiga, goma xantana, celulosa y levano, laca, diversos agentes de abrillantado y agentes colorantes de alimentos. Cuando la perla de azúcar se fabrica usando un procedimiento comúnmente conocido, puede producirse muerte de las BAL. Por el contrario, la perla de azúcar que contiene el polvo de BAL doblemente recubiertas no produce muerte de células viables durante la fabricación. El procedimiento y los materiales de partida se explican específicamente a continuación.

Un ejemplo del método para fabricar la perla de azúcar

1) Producir una simiente central;

2) moldear una perla de BAL;

3) tratar con un agente aromatizante y un agente colorante;

4) tratar con un agente de recubrimiento y un agente de abrillantado;

5) secar.

TABLA 1

1

El método para fabricar la perla de azúcar se explica en cuanto a las etapas respectivas. En primer lugar, se pulveriza una disolución acuosa de polisacárido mientras se añade azúcar en polvo a sacarosa de 20\sim30 de malla a temperatura ambiente bajo rotación de una cubeta de recubrimiento o recubridora centrífuga, para obtener una simiente central.

A continuación, se añade una mezcla de polvo de BAL y azúcar en polvo a la simiente central mientras se pulveriza la disolución acuosa de polisacárido bajo rotación usando una cubeta de recubrimiento o una recubridora centrífuga, para moldear una perla de azúcar. En esta etapa, puede mezclarse con el azúcar en polvo un agente edulcorante, un agente aromatizante tal como polvo con aroma de fruta, o un agente colorante tal como agentes colorantes amarillo o azul, etc.

Si es necesario, puede pulverizarse una disolución que contiene un agente de recubrimiento tal como laca o un agente de abrillantado sobre la perla de BAL, confiriendo de ese modo efectos de recubrimiento y abrillantado a la perla.

Finalmente, la perla de BAL moldeada se seca de manera natural en una habitación aséptica a una temperatura de 20ºC o inferior y una humedad relativa del 40% o inferior para fabricar una perla de azúcar deseada. La perla de azúcar así fabricada se muestra en la fotografía 2.

Tal como resultará evidente a partir de los datos mostrados en los ejemplos de prueba a continuación, la perla de azúcar fabricada puede minimizar la muerte de las BAL durante la etapa de moldeado.

A continuación, el método para fabricar la cápsula blanda que contiene el polvo de BAL doblemente recubiertas y la composición para llenar la cápsula se explican con detalle a continuación.

Se fabrica una cápsula blanda llenando un agente de recubrimiento con una composición de llenado lipófila. Ya que la cápsula blanda limita la entrada de humedad y aire a través de la película, se mejora su vida útil de almacenamiento. La mejora en la vida útil de almacenamiento contribuye en gran medida a la estabilidad de las células viables.

Por otra parte, la composición de llenado con que se llena la cápsula blanda debe tener una viscosidad y propiedades físicas adecuadas para el llenado, sin dañar la estabilidad de la película. Para este fin, la composición es lipófila y contiene una cantidad reducida de humedad o materiales volátiles, tales como aceite de semilla de soja, aceite de palma endurecido, lecitina y cera de abejas. Sin embargo, ya que la mayoría de los microorganismos mueren en la composición
lipófila, no puede aplicarse la composición lipófila a productos de bacterias viables, tales como productos de BAL.

En resumen, la presente invención se caracteriza por una composición para llenar una cápsula blanda aplicable a productos de BAL, sin provocar ninguna muerte de células viables durante la fabricación de la cápsula y sin dañar la estabilidad de una película de gelatina. El método para fabricar la cápsula que contiene la composición se explica específicamente a continuación.

1) Tamizado de materiales de partida

Con el fin de evitar el escape de una cápsula blanda, se usa un polvo tamizado que tiene un tamaño de partícula de 80 de malla o superior como polvo de lactobacilos doblemente recubiertos.

2) Preparación de composición adecuada para el polvo de BAL doblemente recubiertas

-: Con el fin de evitar la muerte de células viables, la composición de llenado contiene una concentración reducida de un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de semilla de soja. En su lugar, la composición de llenado contiene además una vitamina liposoluble tal como escualeno lipófilo en una cantidad del 10\sim50% en peso. La vitamina liposoluble evita la oxidación de los lípidos.

-: Con el fin de que pase fácilmente a través de una película, muestre una viscosidad suficiente para homogeneizar y estabilizar las BAL tras el secado, se añaden a la composición de llenado polisacáridos hidrófilos tales como almidones, gomas, celulosa y levano.

-: Con el fin de no provocar la muerte de las BAL durante la fabricación de la cápsula blanda y mantener la estabilidad de los lactobacilos durante la distribución de la cápsula blanda, la composición de llenado de la presente invención contiene componentes a proporciones óptimas. Un ejemplo representativo de las proporciones óptimas se muestra en la tabla 2 a continuación.

TABLA 2 Comparación entre una composición de llenado convencional y la composición de llenado de la presente invención

2

3) Despumación

Tras el mezclado, se despresuriza la composición de llenado que tiene propiedades deseadas a 70 cmHg (700/760 atm) para eliminar completamente las espumas incluidas en la misma.

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4) Formación de la película de gelatina

Como plastificante, se usa una mezcla de glicerina y D-sorbitol (21,6/8,2 (p/p)). La razón en peso del plastificante con respecto a la gelatina es de 0,43:1. La razón en peso minimiza la aparición de poros en una película y minimiza la entrada de oxígeno y humedad a través de la película, lo que es ventajoso en cuanto a la estabilidad de las BAL.

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5) Se llevan a cabo las etapas de moldeado y secado según un procedimiento para fabricar cápsulas blandas comunes

La cápsula fabricada según el método de la presente invención tal como se describió anteriormente se muestra en la fotografía 3.

Tal como resultara evidente a partir de los datos mostrados en los ejemplos de prueba a continuación, la cápsula fabricada que contiene la composición de llenado de la presente invención puede minimizar la muerte de las BAL durante la fabricación, maximizando de ese modo la tasa de supervivencia de las BAL incluidas en la cápsula.

A continuación en el presente documento, la presente invención se describirá con más detalle en referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos se proporcionan para el fin de ilustración y no deben interpretarse como limitativos del alcance de la invención.

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Ejemplo 1

Preparación de polvo de Lactobacillus acidophillus CBT-LH doblemente recubierto

Se suspendieron 4 kg de leche desnatada y 2 kg de proteína de soja aislada en 100 kg de agua. Se colocó la suspensión en un baño de tratamiento enzimático equipado con un agitador de baja velocidad, un termostato y un controlador del pH, y se añadió al mismo una disolución acuosa de 10,2 g de proteasa-N (Amano) en 100 ml de agua a 55ºC y pH 7,0. Se hidrolizó la mezcla hasta que el pH disminuyó hasta 6,0.

Se añadieron al hidrolizado 5 kg de glucosa, 1 kg de un extracto de carne, 0,5 kg de extracto de levadura, 50 g de fosfato de dipotasio, 50 g de citrato de amonio, 50 g de acetato de sodio, 10 g de sulfato de magnesio y 10 g de sulfato de manganeso y se disolvieron. Se transfirió la disolución a un tubo de fermentación anaerobia de 200 l, se esterilizó a 121ºC durante 15 minutos, y luego se inoculó con 2 l de un inóculo. Se fermentó la disolución resultante durante 12 horas mientras se mantenía a un pH de 6,0.

Se transfirió la disolución fermentada a una centrífuga continua a una velocidad de flujo de 60 l/h. Se depositaron los restos de BAL y proteínas y se recogieron. Se añadieron 100 g de goma xantana, 100 g de carboximetilcelulosa y 100 g de levano a 10 l de una disolución acuosa crioprotectora que consistía en 1 kg de trehalosa, 1 kg de manitol y 1 kg de maltodextrina, se disolvió, se esteriliza a presión, se homogeneizó a 5.000 rpm, se congeló rápidamente en un congelador a -55ºC y se liofilizó a una temperatura que oscilaba desde 0 hasta 40ºC. Los restos de proteína que eran semisolubles en agua rodearon a las BAL y los componentes peptídicos solubles en agua se depositaron sobre las paredes celulares de las BAL, completando de ese modo un recubrimiento con proteína. Los componentes de polisacárido se formaron en agrupaciones que tenían una estructura sumamente compacta debido a su poderosa adhesión a las BAL. El polvo de BAL doblemente recubiertas por la mezcla de leche desnatada y proteína de soja aislada y la mezcla de goma xantana, carboximetilcelulosa y levano, mostró estabilidad mejorada en una prueba acelerada, resistencia a ácidos y resistencia a bilis, en comparación con un polvo de BAL sin recubrir. Los resultados se muestran en la tabla 3 a continuación.

TABLA 3

3

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Ejemplo 2

Fabricación de una perla esférica que contiene polvo de BAL doblemente recubiertas

Se cargaron 10 kg de un polvo de sacarosa que tenía un tamaño de partícula de 20\sim30 de malla en una recubridora centrífuga a 100 rpm, y se añadieron lentamente 15 kg de azúcar en polvo a la misma mientras se pulverizaba una disolución acuosa de goma arábiga al 15%, para producir una simiente central. Se mezclaron 2 kg de un polvo de BAL doblemente recubiertas y 10 kg de azúcar en polvo con la simiente central, y luego se moldearon para dar una primera perla esférica de la misma manera que se describió anteriormente.

Se añadieron 10 kg de azúcar en polvo a la perla esférica moldeada de la misma manera que se describió anteriormente, para formar una película. Se mezclaron con la película 10 kg de azúcar en polvo, 0,1 kg de un polvo con aroma de limón y 0,2 kg de un colorante amarillo de gardenia para llevar a cabo las etapas de edulcoración, aromatización y coloración de la misma manera que se describió anteriormente. Se recubrió la película y se abrillantó pulverizando una disolución acuosa de laca al 0,7% y luego se secó de manera natural en una habitación limpia cerrada a 18ºC y una humedad relativa del 40% hasta que el contenido en humedad alcanzó el 4% o inferior.

Los componentes respectivos usados para fabricar la perla de azúcar en este ejemplo y el contenido de la misma se muestran en la tabla 4 a continuación. Las tasas de supervivencia de las BAL en la perla de azúcar se muestran en la tabla 5 a continuación.

TABLA 4

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TABLA 5

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Ejemplo 3

Fabricación de una cápsula blanda usando polvo de BAL doblemente recubiertas

Se agitó una mezcla de 40 kg de escualeno, 24 kg de aceite de semilla de soja, 5 kg de cera de abejas, 15 kg de aceite de palma endurecido y 1 kg de lecitina usando un aparato Agi-homomixer a 75 rpm y 62ºC, y se enfrió con agitación continua. A la disolución, se le añadieron 5 kg de un polvo de BAL doblemente recubiertas que tenían un tamaño de partícula de 80 de malla o superior y 10 kg de almidón de maíz. Se agitó homogéneamente la mezcla resultante usando un aparato Agi-homomixer a 78 rpm y temperatura ambiente, y se despumó completamente a presión reducida de 70 cmHg (700/760 atm, 0,092 Mpa).

Se añadieron 68,8 kg de gelatina, 21,6 kg de glicerina, 8,2 kg de D-sobitol, 0,16 kg de etilvainillina, 0,69 kg de dióxido de titanio y agentes colorantes de alimentos (Azul nº 1 y Amarillo nº 4) a 63,4 kg de agua purificada para formar una película que tenía un espesor de 0,5-0,8 mm. Se moldeó la película para dar una cápsula blanda que tenía un espesor adhesivo de 0,175 mm o superior. Se sometió la cápsula blanda moldeada a un secado por tambor a 16\sim22 Hz durante 2\sim3 horas, y luego se secó adicionalmente en una habitación de secado durante 2\sim3 días, para fabricar una cápsula blanda de BAL. Tras el secado, los contenidos en humedad sobre y dentro de la película eran del 7% y el 10% o inferiores, respectivamente.

Los componentes, contenido de los mismos y condiciones de procedimiento para fabricar la cápsula blanda en este ejemplo se muestran en la tabla 6 a continuación. Las tasas de supervivencia de las BAL en la cápsula se muestran en la tabla 7 a continuación.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA 7

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Según el método para preparar el polvo de BAL doblemente recubiertas de la presente invención, la combinación de diversos crioprotectores, estabilizadores, etc., es posible dependiendo de la clase de especie de BAL que va a recubrirse. Dado que el polvo de BAL doblemente recubiertas puede prepararse fácilmente a través de etapas de homogeneización y liofilización, el método puede llevarse a cabo sin ninguna instalación adicional, y puede aplicarse a sedimentos celulares centrifugados o polvos de BAL secados por congelación. Por consiguiente, el método tiene las ventajas de una excelente adaptabilidad y compatibilidad. Además, dado que la tasa de recogida del polvo de BAL puede aumentarse hasta el 50\sim90% usando el método, se consigue una alta productividad. El polvo de BAL doblemente recubiertas así preparado es ventajoso en cuanto a su excelente resistencia al calor, ácidos y bilis, y vida útil de almacenamiento mejorada. Además, cuando el polvo de BAL doblemente recubiertas se administra al cuerpo humano, puede depositarse de manera estable en el intestino y ejerce así de manera suficiente actividades fisiológicas de las BAL, lo que maximiza la capacidad de uso del polvo de BAL doblemente recubiertas.

Aunque se han descrito las realizaciones preferidas de la presente invención para fines ilustrativos, los expertos en la técnica apreciarán que son posibles diversas modificaciones, adiciones y sustituciones, sin apartarse del alcance de la invención tal como se reivindica en las reivindicaciones adjuntas.

Claims

1. Método para preparar un polvo de bacterias del ácido láctico doblemente recubiertas, que comprende las etapas de:

: mezclar una proteína predeterminada para obtener una disolución acuosa de proteína;

: añadir una proteasa a la disolución acuosa de proteína para tratar enzimáticamente la disolución acuosa de proteína;

: fermentar las bacterias del ácido láctico en la disolución acuosa de proteína tratada enzimáticamente;

: separar y concentrar la disolución fermentada usando una separadora centrífuga de alta velocidad en la que las bacterias del ácido láctico se recubren con precipitados de proteína presentes en la disolución fermentada (primera etapa de recubrimiento); y

: mezclar homogéneamente las bacterias del ácido láctico recubiertas con una mezcla de una disolución acuosa de polisacárido y una disolución acuosa crioprotectora para recubrir las bacterias del ácido láctico con dicha mezcla de disolución, y liofilizar las bacterias del ácido láctico doblemente recubiertas (segunda etapa de recubrimiento).

2. Método según la reivindicación 1, en el que el polisacárido proporcionado se selecciona del grupo que consiste en goma xantana, celulosa, levano y mezclas de los mismos.

3. Método según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la proteína proporcionada se selecciona del grupo que consiste en leche desnatada, proteína de soja aislada y una mezcla de las mismas.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el método comprende además la etapa de mezclar glucosa, extracto de levadura, extracto de carne de vacuno y un componente iónico con la disolución acuosa de proteína, antes de la etapa de fermentación.

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el componente iónico proporcionado se selecciona de citrato de amonio, acetato de sodio, fosfato de dipotasio, sulfato de magnesio, sulfato de manganeso y cloruro de sodio y mezclas de los mismos.

6. Método para preparar un polvo de bacterias del ácido láctico doblemente recubiertas, que comprende las etapas de:

: cultivar (fermentar) las bacterias del ácido láctico en la disolución acuosa de proteína tratada enzimáticamente;

: separar y concentrar la disolución fermentada usando una separadora centrífuga de alta velocidad en la que las bacterias del ácido láctico se recubren con precipitados de proteína presentes en la disolución fermentada (primera etapa de recubrimiento);

: mezclar una disolución acuosa crioprotectora con las bacterias del ácido láctico recubiertas con proteína, y liofilizarlas; y

: mezclar homogéneamente dicho polvo de bacterias del ácido láctico liofilizado con una disolución acuosa de polisacárido de manera que se recubran las bacterias del ácido láctico con una mezcla de la disolución acuosa crioprotectora y la disolución acuosa de polisacárido, y liofilizar las bacterias del ácido láctico doblemente recubiertas resultantes (segunda etapa de recubrimiento).

7. Polvo de bacterias del ácido láctico doblemente recubiertas preparado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Método para fabricar una perla de azúcar que contiene un polvo de bacterias del ácido láctico doblemente recubiertas preparado según el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende las etapas de:

: pulverizar una disolución acuosa de polisacárido mientras se añade azúcar en polvo a sacarosa en rotación, para obtener una simiente central;

: pulverizar la disolución acuosa de polisacárido mientras se añade una mezcla de un polvo de bacterias del ácido láctico doblemente recubiertas y azúcar en polvo a la simiente central en rotación, para moldear una perla de azúcar; y

: secar la perla de azúcar moldeada en condiciones asépticas a una temperatura de 20ºC o inferior y una humedad relativa del 40% o inferior.

9. Método según la reivindicación 8 en el que se proporciona un agente edulcorante, un agente aromatizante o un agente colorante y se mezclan durante la etapa de moldeado.

10. Método según la reivindicación 8, en el que se pulveriza un agente de recubrimiento o agente de abrillantado sobre la perla de azúcar moldeada, tras la etapa de moldeado.

11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en el que el polisacárido proporcionado se selecciona del grupo que consiste en goma xantana, celulosa, levano y mezclas de los mismos.

12. Composición para llenar una cápsula blanda que contiene un polvo de bacterias del ácido láctico doblemente recubiertas, que comprende una vitamina liposoluble, un polisacárido hidrófilo, un aceite vegetal, cera de abejas, lecitina, aceite de palma endurecido y un polvo de bacterias del ácido láctico doblemente recubiertas preparado según el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

13. Composición según la reivindicación 12, en la que la composición comprende el 10\sim50% en peso de la vitamina liposoluble, el 1\sim30% en peso del polisacárido hidrófilo, el 15\sim25% en peso del aceite vegetal, el 3\sim10% en peso de cera de abejas, el 0,5\sim3% en peso de lecitina, el 10\sim20% en peso de aceite de palma endurecido y el resto del polvo de bacterias del ácido láctico doblemente recubiertas.

14. Composición según las reivindicaciones 12 ó 13, en la que la vitamina liposoluble es escualeno.

15. Composición según las reivindicaciones 12-14, en la que el polisacárido hidrófilo se selecciona del grupo que consiste en almidones, gomas, celulosa, levano y mezclas de los mismos.