DE69233718T2

DE69233718T2 - Staubblatt spezifische promotoren aus mais

Info

Publication number: DE69233718T2
Application number: DE69233718T
Authority: DE
Inventors: Marc De Beuckeleer; Lydia Herdies; Veronique Gossele; Celestina Mariani
Original assignee: Bayer Bioscience NV
Current assignee: Bayer CropScience NV
Priority date: 1991-02-07
Filing date: 1992-02-05
Publication date: 2008-12-04
Anticipated expiration: 2012-02-06
Also published as: ATE381622T1; ES2299172T3; EP0570422B1; AU1202192A; DE69233718D1; US5589610A; EP0570422A1; WO1992013957A1

Description

Diese Erfindung betrifft aus Mais isolierte Promotoren, die vorwiegend oder spezifisch in Staubblatt-Zellen einer Pflanze, insbesondere einer einkeimblättrigen Pflanze, eine Genexpression verursachen können, und dadurch wenig oder keine Genexpression in anderen Teilen der Pflanze schaffen können, die nicht an der Produktion von fertilem Pollen beteiligt sind. Die Promotoren eignen sich zur Produktion von transformierten Pflanzen, in denen ein Gen zumindest überwiegend exprimiert werden soll und vorzugsweise spezifisch in den Staubblattzellen, vorwiegend in den Antherenzellen. Die Promotoren sind besonders geeignet bei der Produktion von pollensterilen Pflanzen und Pflanzen, die die Pollenfertilität wiederherstellen, wie beschrieben in den europäischen Patentanmeldungen ("EPA") 89401194.9 bzw. 90402281.1 , insbesondere bei der Produktion von Hybriden einkeimblättriger Pflanzen, wie Mais, Reis oder Weizen.
Zusammenfassung der Erfindung
Erfindungsgemäß werden bereitgestellt: staubblattspezifische, vorzugsweise antherenspezifische Promotoren, ein Promotor, der die Expression der genomischen codierenden Sequenz steuert, die der cDNA von SEQ ID NR. 2 entspricht, und der in der Sequenz der Nukleotide 1 bis 1179 von SEQ ID NR. 3 enthalten ist (der "CA55-Promotor" oder "PCA55"). Jeder dieser Promotoren kann in einer fremden DNA-Sequenz verwendet werden, vorzugsweise einer fremden chimären DNA-Sequenz, die ein Strukturgen, vorzugsweise eine DNA für Pollensterilität oder eine DNA für die Wiederherstellung der Pollenfertilität unter Transkriptionskontrolle des Promotors enthält, und die zur Transformation des Kerngenoms einer Zelle einer Pflanze, insbesondere einer einkeimblättrigen Pflanze, verwendet werden kann. Erfindungsgemäß werden zudem bereitgestellt: die pollensterile Pflanze oder Pflanze, die die Pollenfertilität wiederherstellt, die aus einer solchen Zelle transformiert werden kann, die mit der erfindungsgemäßen fremden DNA-Sequenz transformiert wurde; die transformierte Zelle selbst; eine Kultur einer solchen Zelle; Samen einer solchen regenerierten Pflanze und ihrer Nachkommen; und eine Pflanze mit wiederhergestellter Pollenfertilität und ihre Samen, die aus der Kreuzung solcher pollensteriler Pflanzen und Pflanzen mit wiederhergestellter Pollenfertilität hervorgehen.
Eingehende Beschreibung der Erfindung Erfindungsgemäß kann eine pollensterile Pflanze oder eine Pollenfertilitäts-Wiederherstellerpflanze aus einer einzigen Pflanzenzelle produziert werden, indem man eine Pflanzenzelle in einer bekannten Weise so transformiert, dass die erfindungsgemäße fremde DNA-Sequenz stabil in ihr Kerngenom integriert wird. Die fremde DNA-Sequenz umfasst mindestens eine DNA für Pollensterilität oder DNA für die Wiederherstellung von Pollenfertilität, welche ist: unter der Kontrolle von und im Leseraster gebunden an ihrem stromaufwärts gelegenen (d. h. 5') Ende an einen der staubblattspezifischen, vorzugsweise antherenspezifischen, insbesondere tapetumspezifischen Promotoren dieser Erfindung, wie der Promotor und gegebenenfalls die Leader-Sequenz von SEQ ID NR. 3; und gebunden an ihrem stromabwärts gelegenen (d. h. 3') Ende an geeignete Transkriptionsterminations-(oder Regulations-)Signale, wie u. a. ein Polyadenylierungssignal. Dadurch wird die RNA und/oder das Protein oder Polypeptid, das von der DNA für Pollensterilität oder DNA zur Wiederherstellung von Pollenfertilität in Staubblattzellen der Pflanze zumindest vorwiegend, vorzugsweise ausschließlich produziert oder überproduziert. Die fremde DNA-Sequenz kann ebenfalls zumindest eine Marker-DNA umfassen, welche: eine RNA und/oder ein Protein oder Polypeptid codiert, die bzw. das bei Anwesenheit in zumindest einem spezifischen Gewebe oder in spezifischen Zellen der Pflanze die Pflanze leicht trennbar oder unterscheidbar von anderen Pflanzen macht, die keine solche RNA und/oder Protein oder Polypeptid zumindest in dem spezifischen Gewebe oder in den spezifischen Zellen enthalten; unter der Kontrolle eines zweiten Promotors steht und an ihrem 5'-Ende an diesen zweiten Promotor gebunden ist, welcher die Expression der Marker-DNA zumindest in dem spezifischen Gewebe oder den spezifischen Zellen durchführen kann; und an ihrem 3'-Ende an geeignete Transkriptionsterminationssignale, wie u. a. ein Polyadenylierungssignal, gebunden ist. Die Marker-DNA befindet sich vorzugsweise im gleichen genetischen Locus wie die DNA für Pollensterilität oder DNA für die Wiederherstellung der Pollenfertilität. Diese Bindung zwischen der DNA für Pollensterilität oder DNA für die Wiederherstellung der Pollenfertilität und der Marker-DNA garantiert mit einem hohen Maß an Sicherheit die gekoppelte Segregation der DNA für Pollensterilität oder DNA für die Wiederherstellung der Pollenfertilität und der Marker-DNA in die Nachkommen der Pflanze, die aus der transformierten Pflanzenzelle regeneriert wurde. In einigen Fällen ist jedoch eine solche gekoppelte Segregation nicht gewünscht, und in diesen Fällen sollte die Marker-DNA in einem anderen genetischen Locus als die DNA für die Pollensterilität oder DNA für die Wiederherstellung der Pollenfertilität sein.
Die erfindungsgemäße DNA für die Pollensterilität kann ein beliebiges Gen oder Genfragment sein, dessen Expressionsprodukt (RNA und/oder Protein oder Polypeptid) den Metabolismus, die Funktion und/oder die Entwicklung von Staubblattzellen, vorzugsweise Antherenzellen, signifikant stört, und somit die Produktion von fertilem Pollen verhindert. Bevorzugte DNAs für Pollenfertilität sind in EPA 89401194.9 beschrieben, beispielsweise solche DNAs, welche codieren: RNasen, wie RNase TI oder Barnase; DNasen, wie Endonukleasen (beispielsweise EcoRI); Proteasen, wie Papain; Enzyme, die die Synthese von Phytohormonen katalysieren (beispielsweise Isopentenyltransferase oder die Genprodukte von Gen 1 und Gen 2 der T-DNA von Agrobacterium; Glucanasen; Lipasen; Lipid-Peroxidasen; Pflanzenzellwand-Inhibitoren; oder Toxine (beispielsweise das A-Fragment von Diphtherie-Toxin oder Botulin). Andere bevorzugte Beispiele für DNAs für Pollensterilität sind Antisense-DNAs, die RNAs codieren, die zu den Genen komplementär sind, deren Produkte für die normale Entwicklung von fertilem Pollen wesentlich sind. Weiter bevorzugte Beispiele für DNAs für Pollensterilität codieren Ribozyme, die spezifisch gegebene Zielsequenzen spalten können, die Produkte codieren, welche für die Produktion von fertilem Pollen wesentlich sind. Noch weitere Beispiele für DNAs für Pollensterilität codieren Produkte, die Staubblattzellen, insbesondere Antherenzellen – und keine anderen Pflanzenteile – für spezifische Erkrankungen (beispielsweise Pilz- oder Virusinfektion) oder Stressbedingungen (beispielsweise Herbizide) empfänglich machen.
Die Konstruktion eines Vektors, der eine DNA für Pollensterilität umfasst, wie eine Barnase-codierende DNA, unter der Kontrolle eines erfindungsgemäßen Mais-Antheren-spezifischen Promotors erfolgt am besten in einem bakteriellen Wirtsorganismus, wie E. coli. Je nach der Beschaffenheit der DNA für Pollensterilität und der spezifischen Konfiguration des Vektors, können aufgrund der Expression der DNA für Pollensterilität und der gleichzeitigen Abnahme der Lebensfähigkeit des Wirtsorganismus Probleme auftreten. Solche Probleme können beispielsweise auf eine Reihe von Wegen gelöst werden. Der Wirtsorganismus kann beispielsweise auf dem gleichen oder einem anderen Plasmid als dasjenige, das die DNA für Pollensterilität enthält, oder sogar auf seiner Chromosomen-DNA, mit einer anderen DNA-Sequenz versorgt werden, die die Auswirkung der Expression der DNA für Pollensterilität im Wirtsorganismus verhindert oder signifikant hemmt. Eine solche andere DNA-Sequenz kann beispielsweise codieren: eine Antisense-RNA, so dass die Anreicherung und Translation der RNA für Pollensterilität verhindert wird; oder ein Protein (beispielsweise Barstar), das das Genprodukt der DNA für Pollensterilität spezifisch hemmt (beispielsweise Barnase; Hartley (1988) J. Mol. Biol. 202, 913). Alternativ kann die DNA für Pollensterilität Elemente enthalten, wie ein Pflanzen-Intron, das nur zu einem aktiven Genprodukt in einer Pflanzenzellumgebung führt. Beispiele für Introns, die sich für diesen Zweck verwenden lassen, sind Introns der Transkriptionseinheiten von: adh-1-Gen von Mais (Luehrsen und Walbot (1991) Mol Gen. Genet. 225, 81; Mascarenhas et al., (1990) Plant Mol. Biol. 15, 913), das shrunken-1-Gen von Mais (Vasil et al., (1989) Plant Physiol. 91, 1575), das cat-1-Gen der Rizinus-Bohne (Tanaka et al. (1990) Nucleic Acids Research ("NAR") 18, 6767), das act-1-Gen von Reis (McElroy et al. (1990) The Plant Cell 2, 163; PCT-Veröffentlichung WO 91/09948 ) und das TA36-Gen (Intron gezeigt in SEQ ID NR. 4).
Die erfindungsgemäße DNA für die Wiederherstellung der Pollenfertilität kann ein beliebiges Gen oder Genfragment sein, dessen Expressionsprodukt (RNA und/oder Protein oder Polypeptid) die spezifische Aktivität des Produktes einer DNA für Pollensterilität in Staubblattzellen, insbesondere in Antherenzellen inaktiviert, neutralisiert, hemmt, blockiert, abstellt, bewältigt oder sonst wie verhindert. Bevorzugte DNAs zur Wiederherstellung der Pollenfertilität sind in EPA 90402281.1 beschrieben, beispielsweise solche DNAs, welche codieren: Barstar, welches der Inhibitor von Barnase ist; EcoRI-Methylase, welche die Aktivität von EcoRI verhindert; oder Protease-Inhibitoren (beispielsweise die Inhibitoren von Papain). Andere Beispiele für DNAs, die die Pollenfertilität wiederherstellen, sind Antisense-DNAs, die RNAs codieren, welche zu DNAs für die Pollensterilität komplementär sind. Weitere Beispiele für DNAs für die Wiederherstellung von Pollenfertilität codieren Ribozyme, die spezifisch gegebene Zielsequenzen von DNAs für Pollensterilität spalten können.
Die erfindungsgemäße Marker-DNA kann ein beliebiges Gen oder Genfragment sein, das eine RNA und/oder ein Protein oder Polypeptid codiert, womit Pflanzen, die die Marker-DNA-exprimieren, von Pflanzen, die die Marker-DNA nicht exprimieren, leicht unterschieden und getrennt werden können. Beispiele für die Marker-DNA sind in EPA 89401194.9 beschrieben, wie Marker-DNAs, die Proteine oder Polypeptide codieren, welche: Pflanzenzellen eine unterscheidbare Farbe verleihen, wie das Al-Gen, das die Dihydroquercetin-4-Reduktase codiert (Meyer et al., (1987) Nature 330, 677–678) und das Glucuronidase-Gen (Jefferson et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA ("PNAS") 83, 8447); einer Pflanze eine spezifische morphologische Eigenschaft verleihen, wie Zwergwuchs, oder eine andere Blattform; Pflanzenstresstoleranz verleihen, wie sie von dem Gen verliehen wird, das die Superoxid-Dismutase codiert, wie beschrieben in EPA 88402222.9 ; einer Pflanze Krankheits- oder Schädlingsresistenz verleihen, wie es von einem Gen verliehen wird, das ein Bacillus thuringiensis Endotoxin codiert, das einer Pflanze eine Insektenresistenz verleiht, wie beschrieben in EPA 86300291.1 ; oder einer Pflanze eine Bakterienresistenz verleihen, wie sie bereitgestellt wird durch das Bakterienpeptid, beschrieben in EPA 88401673.4 . Bevorzugte Marker-DNAs codieren Proteine oder Polypeptide, die die Aktivität von Herbiziden hemmen oder neutralisieren, wie: das sfr-Gen und das sfrv-Gen, die die Enzyme codieren, welche Resistenz gegenüber Glutaminsynthetase-Inhibitoren verleihen, wie Bialaphos und Phosphinotricin, wie beschrieben in EPA 87400544.0 .
Damit das Protein oder Polypeptid, das von der Marker-DNA codiert wird, wie beabsichtigt funktioniert, wird es oft vorzugsweise in der Pflanzenzelle als Vorstufe produziert, in der das reife Protein an seinem N-terminalen Ende an ein weiteres Polypeptid (ein "Targeting-Peptid") gebunden ist, das das reife Protein zu einem spezifischen Kompartiment transloziert, wie die Chloroplasten, Mitochondrien, oder das endoplasmatische Retikulum. Diese Targeting-Peptide und DNA-Sequenzen, die dafür codieren (die "Targeting-Sequenzen") sind bekannt. Wenn beispielsweise eine Marker-DNA ein Protein codiert, das Toleranz oder Resistenz gegenüber einem Herbizid oder einem anderen Selektionsmedium verleiht, das auf den Chloroplasten-Metabolismus wirkt, wie das sfr-(oder bar)-Gen oder das sfrv-Gen ( europäische Patentveröffentlichung ("EP") 0 242 236 ), kann es bevorzugt sein, dass ein solches Gen ebenfalls eine Chloroplasten-Targeting-Sequenz umfasst, wie diejenige, die das Transit-Peptid der kleinen Untereinheit des Enzyms 1,5-Ribulosebisphosphatcarboxylase (Krebbers et al (1988) Plant Mol. Biol. 11, 745; EPA 85402596.2 ) codiert, obwohl andere Targeting-Sequenzen, die andere Transitpeptide codieren, wie diejenigen, die von Von Hejine et al (1991) Plant Mol. Biol., Reporter 9, 104, beschrieben wurden, verwendet werden können.
Jeder der erfindungsgemäßen staubbattspezifischen, vorzugsweise antherenspezifischen Promotoren, wie der CA55-Promotor stromaufwärts von Nukleotid 1180 in SEQ ID NR. 3, der zur Steuerung der DNA für Pollensterilität oder der DNA für die Wiederherstellung von Pollenfertilität verwendet werden kann, kann auf bekannte Weise identifiziert und isoliert werden, wie in EPA 89401194.9 beschrieben. Diesbezüglich können die erfindungsgemäßen cDNAs der SEQ ID NR. 2 als Sonde zur Identifikation (d. h. zur Hybridisierung an) des entsprechenden Bereichs des Mais-Genoms (d. h. den Bereich, der die DNA enthält, die die staubblattspezifische mRNA codiert, aus der die cDNA hergestellt wurde) verwendet werden. Dann kann der Anteil des Pflanzengenoms, der sich stromaufwärts (d. h. 5') von der DNA, die die eine solche staubblattspezifische mRNA codiert, befindet und die den Promotor dieser DNA enthält, identifiziert werden. Die cDNA der SEQ ID NR. 2 kann als Sonde zur Identifikation und Isolation eines genomischen Klons aus einer genomischen Bank von Zea mays verwendet werden, wie einer genomischen Lambda EMBL3 oder EMBL4-Zea mays Bank. Auf diese Weise kann ein genomischer DNA-Klon isoliert und sequenziert werden, wie der Klon von SEQ ID NR. 3. SEQ ID NR. 3 enthält einen codierenden Bereich, der homolog ist zu der cDNA von SEQ ID NR. 2, und stromaufwärts dieses codierenden Bereichs befindet sich eine Promotor-Sequenz mit einer TATA-Box, die die antherenspezifische Transkription des codierenden Bereichs steuert.
Der zweite Promotor, der die Marker-DNA steuert, kann ebenfalls in einer gut bekannten Weise ausgewählt werden und isoliert werden, wie beispielsweise beschrieben in EPA 89401194.9 , so dass die Marker-DNA entweder selektiv in einer oder mehreren spezifischen Geweben oder Zellen oder konstitutiv in der gesamten Pflanze, wie gewünscht, je nach der Natur der RNA und/oder dem Protein oder Polypeptid, das von der Marker-DNA codiert wird, exprimiert wird.
In der fremden DNA-Sequenz dieser Erfindung können 3'-Transkriptionsterminationssignale oder das "3'-Ende" aus solchen, die die korrekte Transkriptionstermination und/oder Polyadenylierung von mRNA in Pflanzenzellen bereitstellen können, ausgewählt werden. Die Transkriptionsterminationssignale können die natürlichen der DNA für die Pollensterilität oder DNA für die Wiederherstellung der Pollenfertilität sein, die transkribiert werden soll, oder können fremd oder heterolog sein Beispiele für heterologe 3'-Transkriptionsterminationssignale sind beispielsweise ausgewählt aus dem Octopin-Synthase-Gen (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3, 835–845) und des T-DNA-Gens 7 (Velten und Schell (1985) NAR 13, 6981–6998). Wenn die erfindungsgemäße fremde DNA-Sequenz mehr als ein Strukturgen umfasst (beispielsweise eine DNA für die Pollensterilität oder eine DNA für die Wiederherstellung der Pollenfertilität und eine Marker-DNA), sind die 3'-Enden der Strukturgene vorzugsweise unterschiedlich.
In Pflanzen, insbesondere in einkeimblättrigen Pflanzen, insbesondere Getreide, wie Reis, Mais und Weizen, kann die erfindungsgemäße Expression einer Marker-DNA und einer DNA für Pollensterilität oder DNA für die Wiederherstellung der Fertilität, durch das Vorhandensein von einer oder mehreren, vorzugsweise einer, geeigneten Position(en) in der Transkriptionseinheit von jeder erfindungsgemäßen fremden Transkriptionssequenz eines geeigneten Pflanzenintrons gesteigert werden (Luehrsen und Walbot (1991) Mol. Gen Genet. 225; 81; Mascarenhas et al., (1990) Plant Mol. Biol. 15, 913; Vasil et al., (1989) Plant Physiol. 91, 1575; Tanaka et al., (1990) NAR 18, 6767; McElroy et al., (1990) The Plant Cell 2, 163; PCT-Veröffentlichung WO 91/09948 ). Jedes Intron hat vorzugsweise eine Nukleotidsequenz, die: von den Zellen der Pflanzenspezies erkennbar ist, die transformiert wurden (für die Anforderungen der Intron-Erkennung durch Pflanzen siehe Goodall und Filipowicz (1989) Cell 58, 473; Hanley und Schuler (1988) NAR 16, 7159), länger als etwa 70 bis 73 bp ist (Goodall und Filipowicz (1990) Plant Mol. Biol. 14, 727), und sich nahe dem 5'-Ende der codierten mRNA befindet, insbesondere in jeder untranslatierten Leader-Sequenz.
Zellen einer Pflanze können mit der erfindungsgemäßen fremden DNA-Sequenz in einer geeigneten Weise transformiert werden. Wenn die zu transformierende Pflanze gegenüber einer Agrobacterium-Infektion empfänglich ist, wird vorzugsweise ein Vektor verwendet, der die fremde DNA-Sequenz enthält, d. h. das entschärfte Ti-Plasmid. Die Transformation kann mit den Verfahren, die beispielsweise in EP 0 116.718 und EP 0 270 822 beschrieben sind, durchgeführt werden. Bevorzugte Ti-Plasmid-Vektoren enthalten die fremde DNA-Sequenz zwischen den Grenzsequenzen oder sie befinden sich zumindest stromaufwärts der rechten Grenzsequenz. Andere Arten Vektoren können natürlich zur Transformation der Pflanzenzelle verwendet werden, wobei Verfahren verwendet werden, wie direkte Genübertragung (wie beschrieben beispielsweise in EP 0 223 247 ), pollenvermittelte Transformation (wie beispielsweise beschrieben in EP 0 270 356 , PCT-Veröffentlichung WO 85/01856 und EP 0 275 069 ), in-vitro-Protoplastentransformation (wie beispielsweise beschrieben in US-Patent 4 684 611 ), Pflanzenvirusvermittelte Transformation (wie beispielsweise beschrieben in EP 0 067 553 ) und US-Patent 4 407 956 ) und Liposomen-vermittelte Transformation (wie beispielsweise beschrieben in US-Patent 4 536 475 ).
Ist die zu transformierende Pflanze Mais, können neuerlich entwickelte Trans formationsverfahren verwendet werden, wie die Verfahren, die für bestimmte Maislinien von Fromm et al (1990) Bio/Technology 8, 833 und Gordon-Kamm et al., (1990) The Plant Cell 2, 603 beschrieben wurden.
Ist die zu transformierende Pflanze Reis, können neuerlich entwickelte Trans formationsverfahren verwendet werden, wie die Verfahren, die für bestimmte Reislinien von Shimamato et al. (1990) Nature 338, 274, Datta et al., (1990) Bio/Technology 8, 736, Christou et al., (1991) Bio/Technology 9, 957 und Lee et al., (1991) PNAS 88, 6389 beschrieben wurden.
Ist die zu transformierende Pflanze Weizen, kann ein Verfahren analog zu den oben für Mais oder Reis beschriebenen Verfahren verwendet werden. Die Transformation einer einkeimblättrigen Pflanze, insbesondere ein Getreide, wie Reis, Mais oder Weizen, kann vorzugsweise mit einem Verfahren der direkten DNA-Übertragung erfolgen, wie mit einem Verfahren der biolistischen Transformation oder Elektroporation. Bei der Verwendung eines solchen direkten Übertragungsverfahrens wird die übertragene DNA vorzugsweise minimiert, so dass im Wesentlichen nur ein Teil der erfindungsgemäßen fremden DNA-Sequenz mit ihrer DNA für Pollensterilität, DNA zur Wiederherstellung der Pollenfertilität und/oder Marker-DNA in das Pflanzen-Genom integriert. Wird diesbezüglich eine erfindungsgemäße Fremd-DNA-Sequenz konstruiert und auf einem Plasmid in einem bakteriellen Wirtsorganismus vervielfältigt, werden vorzugsweise vor der Transformation einer Pflanze mit der fremden DNA-Sequenz, Plasmid-Sequenzen, die zur Vermehrung in dem bakteriellen Wirtsorganismus erforderlich sind, wie ein Replikationsursprung, ein Antibiotikaresistenzgen für den Wirtsorganismus usw. aus den Teilen des Plasmids, das die fremde DNA-Sequenz enthält, entfernt.
Die folgenden Beispiele beschreiben: die Isolation und die Charakterisierung der beiden Mais-cDNA-Sequenzen SEQ ID NR. 1 und 2, die Verwendung der erfindungsgemäßen cDNA von SEQ ID NR. 2 zur Isolation erfindungsgemäßer staubblattspezifischer Promotoren aus dem Mais-Genom, wie dem CA55-Promotor stromaufwärts von Nukleotid 1180 in SEQ ID NR. 3; die Konstruktion der Promotor-Cassetten für die Fusion der Promotoren mit DNAs für Pollenfertilität und DNAs für die Wiederherstellung der Pollenfertilität; die Konstruktion von Pflanzentransformationsvektoren aus den Promotor-Cassetten; sowie die Transformation von Mais, Reis, und Tabak mit den resultierenden Pflanzentransformationsvektoren.
Wenn nicht anders in den Beispielen angegeben, wurden sämtliche Verfahren zur Herstellung und Manipulation von rekombinanter DNA durch Standard- Verfahren, beschrieben in Maniatis et al., Molecular Cloning – A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1982) und Sambrook et al., Molecular cloning A Laboratory Manual 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989) durchgeführt. Bei der Herstellung von Plasmid-Konstruktionen wurden die Orientierung und die Integrität der klonierten Fragmente mittels Restriktionskartierung und/oder Sequenzierung überprüft.
Die oben und in den Beispielen angegebenen Sequenzidentifizierungsnummern sind nachstehend aufgeführt.
Sequenzprotokoll

SEQ ID NR. 1: cDNA-Sequenz des CA444-Gens.
SEQ ID NR. 2: cDNA-Sequenz des CA455-Gens.
SEQ ID NR. 3: genomischer DNA-Klon, erhalten aus genomischer Zea mays Bank mittels cDNA von SEQ ID NR. 2 als Sonde.
SEQ ID NR. 4: Intron von TA-36-Gen von Nicotiana tabacum, gebunden an KpnI-Linker.
SEQ ID NR. 5: Sequenz von Plasmid pVE149.

Beispiel 1
Isolation und Charakterisierung antherenspezifischer cDNAs aus Mais
Für die Klonierung von cDNAs, die Genen entsprechen, welche ausschließlich oder zumindest überwiegend in Antheren von Mais exprimiert werden, wurde eine cDNA-Bank aus PolyA⁺-mRNA hergestellt, die aus den Ährchen der Maisfahne aus der öffentlich zugänglichen Maislinie B73 isoliert wurde, welche Antheren im Tetradenstadium trägt. Mit Hilfe des Amersham cDNA-Synthesesystems Plus RPN 1256 Y/Z-Kit (Amersham International PLC, Buckinghamshire, England) wurde cDNA mit Hilfe von reverser Transkriptase und einem Oligo-dT-Primer entsprechend den im Kit für den Gebrauch angegebenen Richtungen synthestisiert.
Die cDNAs wurden in Lambda gt10-Vektor kloniert, mit dem Amersham cDNA-Klonierungssystem – Lambda gt10 – RPN1257-Kit, entsprechend den im Kit für den Gebrauch angegebenen Richtungen. Mit der so erhaltenen cDNA-Bank (30 000 Plaques) wurde ein differentielles Screening mit einer markierten cDNA-Sonde aus B73-Keimlingen und mit einer markierten cDNA-Sonde aus Mais-B73-Vollährchen durchgeführt. 93 mögliche antherenspezifische cDNA-Klone wurden selektiert und wieder mit markierten cDNA-Sonden aus Mais-B73-Antheren, Keimlingen und Kolben gescreent. Mit den 66 verbleibenden Klonen aus diesen zusätzlichen Selektionen erfolgte eine Southern-Analyse mit verschiedenen cDNA-Sonden aus Antheren im Tetradenstadium und aus geöffneten Fahnen, Narbenfäden und Kolben aus der Maislinie B73. Dies führte zur Selektion von 27 antherenspezifischen Klonen, die in pGEM1 (Promega, Madison, Wisconsin, USA) subkloniert wurden. Die Kreuzhybridisierung zwischen diesen Subklonen ergab die Anwesenheit von mindestens 2 Klassen. Die Sonden von einigen dieser Subklone wurde hergestellt und erneut auf ihre Spezifität in Northern-Blots mit 5 bis 10 μg PolyA⁺-mRNA überprüft, die aus verschiedenen Mais-B73-Geweben (d. h. Antheren, Kolben, Narbenfäden, Blättern und Ährchen in verschiedenen Stufen) isoliert wurde. Aus dieser Auswahl wurden zwei antherenspezifische Klone, die als "pCA444" und "pCA455" bezeichnet wurden, identifiziert. Diese Klone wurden sequenziert, und ihre Sequenzen sind in dem Sequenzprotokoll als SEQ ID NR. 1 bzw. SEQ ID NR. 2 gezeigt. pCA455 hybridisierte ausschließlich mit RNA aus Antheren in unterschiedlichen Entwicklungsstadien. pCA444 hybridisierte Befunden zufolge mit mRNA aus Antheren und hybridisiert sehr schwach mit einer mRNA ähnlicher Größe aus Embryos.
Die cDNA-Sequenz von pCA444 offenbart die Anwesenheit von zwei offenen Leserastern ("ORF") über insgesamt 323 und 376 Nukleotiden. Die cDNA-Sequenz von pCA455 offenbart die Anwesenheit von zwei ORFs über insgesamt 387 und 300 Nukleotiden.
Beispiel 2
Isolation des antherenspezifischen Gens entsprechend dem antherenspezifischen cDNA-Klon pCA444 von Beispiel 1.
Zur Isolation der genomischen DNA-Klone, die die regulatorischen Sequenzen des Gens CA444, entsprechend pCA444, tragen, wurden zwei Ansätze unternommen.
Der erste Ansatz verwendet inverse Polymerasekettenreaktionen ("PCR") (Ochman et al., (1989) in "PCR: Applikation and Protocols", Innis, M. Gelfand, D., Sninsky, J., und White, Hrsg. Academic Press, New York) für die geometrische Amplifikation der DNA-Sequenzen, die einen ausgewählten Kernbereich der CA444-Gensequenz entsprechend der Sequenz von pCA444 stromaufwärts und stromabwärts flankieren. Es erfolgen DNA-Spaltungen mit herkömmlichen Puffern und bekannten Bedingungen. Fragmente einer geeigneten Größe (weniger als 3 bis 4 kb) für die korrekte Amplifikation und Zirkularisation werden durch Verwendung von Restriktionsenzymen produziert, die den gewählten Kernbereich der CA444-Gensequenz nicht spalten und die vorwiegend durch Southern-Hybridisierung identifiziert werden. Die Zirkularisation erfolgt mit T4-DNA-Ligase in einer verdünnten DNA-Konzentration, die monomere Zyklen begünstigt (Collins und Weissman (1984) PNAS 81, 6812–6815). Drei Polymerase-Kettenreaktionen werden mit drei verschiedenen Oligonukleotidpaaren unter herkömmlichen Bedingungen parallel durchgeführt (Saiki et al., (1985) Science 230, 1250–1354) mittels Vent^TM DNA-Polymerase (Katalog-Nr. 254L – Biolabs New England, Beverly, MA 01915, USA), isoliert aus Thermococcus litoralis (Neuner et al. (1990) Arch Microbiol. 153, 205–207). In einer Reaktion werden die flankierenden Bereiche des Kernbereichs von CA444 von Nukleotid 85 bis Nukleotid 358 der entsprechenden cDNA-Sequenz (SEQ ID NR. 1) mit dem folgenden Paar von 22 und 20 Oligonukleotiden mit den jeweils folgenden Sequenzen amplifiziert:

1) 5' CCG AGG ACC AGC AGG ACG AGG C 3' (Nukleotid 64 bis Nukleotid 85 von pCA444 (SEQ ID NR. 1)) und
2) 5' GGA TGG CAG GAG GGG AGA GG 3' (Nukleotid 358 bis Nukleotid 377 von pCA444 (SEQ ID NR. 1)).

In der zweiten Reaktion werden die flankierenden Bereiche des Kernbereichs von CA444, von Nukleotid 288 bis Nukleotid 392 der entsprechenden cDNA-Sequenz (SEQ ID NR. 1), mit dem folgenden Paar von 20 und 23 Oligonukleotiden mit den jeweiligen folgenden Sequenzen amplifiziert:

1) 5' GCA GGC TGT TGA TGA TGC CC 3' (Nukleotid 269 bis Nukleotid 288 von pCA444 (SEQ ID NR. 1)) und
2) 5' CCA TTT CAC AGT GAG AGC AGT CG 3' (Nukleotid 392 bis Nukleotid 414 von pCA444 (SEQ ID NR. 1)).

In der dritten Reaktion werden die flankierenden Bereiche des Kernbereichs von CA444, von Nukleotid 43 bis Nukleotid 74 der entsprechenden cDNA-Sequenz (SEQ ID NR. 1), mit dem folgenden Paar von 22 und 20 Oligonukleotiden mit den jeweiligen folgenden Sequenzen amplifiziert:

1) 5' GGG GCG GTG GCT GCT TCT AGC G 3' (Nukleotid 22 bis Nukleotid 43 von pCA444 (SEQ ID NR. 1)) und
2) 5' GCT GGT CCT CGG CGG CGG CA 3' (Nukleotid 74 bis Nukleotid 93 von pCA444 (SEQ ID NR. 1)).

Der zweite Ansatz verwendet eine genomische EMBL3- oder EMBL4-Zea mays-Bank, die mit der cDNA- Vollängensequenz von pCA444 als Sonde gescreent wird. Entsprechende genomische Klone, die mit pCA444 hybridisieren, werden sequenziert (Maxam und Gilbert (1977) PNAS 74, 560) und ihre Orientierung durch Northern-Blot-Analysis mit Ribosonden beider Orientierungen überprüft. Der Vergleich der Sequenzen von pCA444 mit den Sequenzen des genomischen Klons führt zu der Identifikation der homologen Regionen. Am 5'-Ende der Region von jeder dieser homologen genomischen Klone werden das ATG-Codon und die Konsensus-Sequenz TATA bestimmt. Durch Primer-Extension wird bestimmt, dass die "TATA"-Box Teil des Promotors ist.
Beispiel 3
Isolation der antherenspezifischen Gens entsprechend dem antherenspezifischen cDNA-Klon pCA455 von Beispiel 1
Zur Isolation von genomischen DNA-Klonen, die die regulatorischen Sequenzen des Gens CA455, entsprechend pCA455, tragen, werden zwei Ansätze von Beispiel 2 verwendet.
Im ersten Ansatz wird inverse PCR (Ochman et al. 1989) zur geometrischen Amplifikation der DNA-Sequenzen verwendet, die einen ausgewählten Kernbereich der CA455-Gensequenz, entsprechend der Sequenz von pCA455, flankieren. Die DNA-Spaltung und Zirkularisation werden in Beispiel 2 durchgeführt. Zwei Polymerasekettenreaktionen werden parallel mit zwei verschiedenen Oligonukleotid-Paaren unter herkömmlichen Bedingungen (Saiki et al., 1985) mit der Vent^TM-DNA-Polymerase, isoliert aus T. litoralis (Neuner et al., 1990) durchgeführt.
Bei einer Reaktion werden die flankierenden Bereiche des Kernbereichs von CA455 von Nukleotid 54 bis Nukleotid 87 der entsprechenden cDNA-Sequenz (SEQ ID NR. 2) mit dem folgenden Paar von 21 und 23 Oligonukleotiden mit den jeweiligen folgenden Sequenzen amplifiziert:

1) 5' GCT CGA TGT ATG CAG TGC AGC 3' (Nukleotid 34 bis Nukleotid 54 von pCA455 (SEQ ID NR. 2)) und
2) 5' CGT CGC CGT GTC GGT GCT TCT CG 3' (Nukleotid 87 bis Nukleotid 109 von pCA455 (SEQ ID NR. 2)).

In der zweiten Reaktion werden die flankierenden Bereiche des Kernbereichs von CA455, von Nukleotid 54 bis Nukleotid 557 der entsprechenden cDNA-Sequenz (SEQ ID NR. 2), mit dem folgenden Paar von 21 und 24 Oligonukleotiden mit den jeweils folgenden Sequenzen amplifiziert:

1) 5' GCT CGA TGT ATG CAG TGC AGC 3' (Nukleotid 34 bis Nukleotid 54 von pCA455 (SEQ ID NR. 2)) und
2) 5' CCG TTG CGT TGC GTT GCG TAG ACG 3' (Nukleotid 557 bis Nukleotid 580 von pCA455 (SEQ ID NR. 2)).

Der zweite Ansatz verwendet eine genomische EMBL3- oder EMBL4-Zea mays-Bank, die mit der cDNA-Volllängensequenz von pCA455 als Sonde gescreent wird. Entsprechende genomische Klone, die mit pCA455 hybridisieren, werden sequenziert (Maxam und Gilbert (1977) PNAS 74, 560) und ihre Orientierung durch Northern-Blot-Analysis mit Ribosonden beider Orientierungen überprüft. Der Vergleich der Sequenzen von pCA455 mit den Sequenzen des genomischen Klons führt zu der Identifikation der homologen Regionen. Am 5'-Ende der Region von jeder dieser homologen genomischen Klone werden das ATG-Codon und die Konsensus-Sequenz TATA bestimmt. Durch Primer-Extension wird bestimmt, dass die "TATA"-Box Teil des Promotors ist.
Mit diesem zweiten Ansatz wird eine bestehende genomische Lambda EMBL4-Zea mays-Bank mit der cDNA-Vollängensequenz von pCA455 als Sonde gescreent. Die Bank wurde von Dr. H. Saedler vom Max Planck-Institut in Köln, Deutschland, mit der Bezeichnung "GH#1417" erhalten. Die Bank umfasste die genomische Zea mays-DNA, die mit MboI partiell gespalten wurde, und deren resultierende Restriktionsfragmente wurden zwischen die BamHI-Stellen der Bakteriophagen-Lambda EMBL4-Replacement-Vektoren kloniert (Frischauff et al., (1983) J. Mol. Biol. 170, 827; Pouwels et al., (1988) Cloning vectors – a Laboratory Manual (Ergänzungs-Aktualisierung), Elsevier Science Publishers, Amsterdam). Die Restriktionsfragmente der Bank können aus den Vektoren als EcoRI-Fragmente ausgeschnitten werden.
Ein EcoRI-Fragment von etwa 6 kb Länge aus der Bank hybridisierte Befunden zufolge mit pCA455 und wurde als "VG55" bezeichnet. VG55 enthielt Befunden zufolge eine einzelne BamHI-Stelle und eines der EcoRI-BamHI-Fragmente von VG55 hybridisierte noch mit dem pCA455, das andere jedoch nicht. Das EcoRI-BamHI-Fragment, das mit dem pCA455 hybridisierte, wurde zwischen die EcoRI und BamHI-Stellen von Vektor pGEM1 (Promega) kloniert, so dass ein Plasmid erhalten wurde, das als "pVG55.3" bezeichnet wurde. pVG55.3 wurde sequenziert (Maxam und Gilbert, 1977), und seine Orientierung wurde durch Northern Blot-Analyse mit Ribosonden beider Orientierungen überprüft. Die Sequenz von pVG55.3, abgesehen von einigen Nukleotiden an ihrem 5'-Ende (welches ihre EcoRI-Stelle enthält), ist in der SEQ ID NR. 3 gezeigt und hat einen hohen Grad an Homologie zu pCA455. Das ATG-Codon der mutmaßlichen codierenden Sequenz von pVG55.3 befindet sich an der Position 1180, die mutmaßliche codierende Sequenz endet an der Position 1596, und die "TATA"-Box befindet sich an der Position 1072. Durch Primer-Extension wird bestätigt, dass die "TATA"-Box Teil des Promotors ist. Die vorstehend genannte einzige BamHI-Stelle befindet sich an der Position 2770 in der SEQ ID NR. 3.
Die Sequenz stromaufwärts von Position 1180 in SEQ ID NR. 3 kann als Promotorbereich für die antherenspezifische Expression einer interessierenden codierenden Sequenz sein. Diese Sequenz ist der CA55-Promotor oder PCA55. Vorzugsweise wird die vollständige Sequenz von der Position 1 bis Position 1179 verwendet, aber es scheint, dass die minimale Region, die als antherenspezifischer Promotor dienen kann, etwa 300 bis 500 bp stromaufwärts von Position 1180 in der SEQ ID NR. 3 verläuft. Die Verwendung der untranslatierten Leader-Sequenz in dem PCA55-Promotorbereich zwischen der Transkriptionsinitiationsstelle (die mittels Primer-Extension bestimmt werden kann) und dem ATG-Start der Translation, scheint für die antherenspezifische Expression eines heterologen Strukturgens unter der Steuerung de PCA55-Promotors bevorzugt aber nicht essentiell zu sein, und die Leader-Sequenz scheint durch die untranslatierte Leader-Sequenz anderer Gene, wie Pflanzengene, ersetzt zu werden.
Beispiel 4
Konstruktion von Promotor-Cassetten, hergeleitet von antherenspezifischen Genen der Beispiele 2 und 3
Die 5'-regulatorischen Sequenzen, einschließlich des Promotors von jedem der antherenspezifischen Gene der Beispiele 2 und 3 werden in den Polylinker von pMA5–8 und pMc5–8 ( EPA 87402348.4 ) subkloniert. Dies erzeugt Vektoren, die sich zur Isolation einzelsträngiger DNA zur Verwendung in der stellengerichteten Mutagenese verwenden lassen. Mit Hilfe der stellengerichteten Mutagenese ( EPA 87402348.4 ) werden Sequenzen, die das ATG-Translationsinitiations-Codon der 5'-regulatorischen Sequenzen von jedem der antherenspezifischen Gene umgeben, so modifiziert, dass eine einzigartige Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym erzeugt wird, für das es eine entsprechende Erkennungsstelle am 5'-Ende von jeder der DNAs für Pollensterilität und DNAs für die Wiederherstellung von Pollenfertilität gibt (die mit den nachstehenden 5'-regulatorischen Sequenzen im Beispiel 5 verbunden werden sollen). Die resultierenden Plasmide enthalten jeweils die neu erzeugte Restriktionsstelle. Die genaue Nukleotidsequenz, die jede neu erzeugte Restriktionsstelle überspannt, wird bestimmt, um zu bestätigen, dass sie sich nur von den 5'-regulatorischen Sequenzen des entsprechenden Maisantherenspezifischen Gens durch Substitution unterscheidet, so dass eine neue Restriktionsstelle erzeugt wird.
Bei der Verwendung dieses Verfahrens zur Herstellung der Promotor-Cassetten, wird eine NcoI-Stelle an dem ATG-Translationsinitiationscodon von pVG55.3 von Beispiel 3 wie folgt eingebracht. Ein 1280 bp EcoRI-AvaI-Fragment von pVG55.3 (die AvaI-Stelle befindet sich an der Position 1276 von SEQ ID NR. 3; die EcoRI-Stelle ist von pGEM1 (Promega) hergeleitet und befindet sich am 5' Ende von SEQ ID NR. 3 [nicht gezeigt]) wird zwischen die EcoRI- und AvaI-Stellen der Vektoren pMa5–8 und pMc5–8 kloniert (Stanssens et al (1989) NAR 17, 4441; EPA 87402348.4 ), so dass Plasmide erhalten werden, die als "pMa5-VG55.3" bzw. "pMc5-VG55.3", bezeichnet wurden. Diese Plasmide werden zur stellengerichteten Mutagenese durch ein "gapped duplex"-DNA-Verfahren mittels abwechselnder Selektionsmarker verwendet, wie von Stanssens et al (1989) siehe oben, beschrieben. Die "gapped duplex"-DNA wird aus einzelsträngigem pMc5-VG55.3 und dem großen EcoRI-AvaI-Fragment von pMa5-VG55.3 konstruiert. Für die Mutagenese wird das Oligonukleotid mit der folgenden Sequenz verwendet:
CAG GAG CGA GCC ATG GCT GCA G.
Diese Mutagenese bringt die NcoI-Stelle in das ATG-Codon der codierenden Sequenz von SEQ ID NR. 3 ein. Die resultierende Cassette umfasst die Promotor- und Leader-Sequenz von SEQ ID NR. 3 in einem EcoRI-NcoI-Fragment, das mit den codierenden Sequenzen der DNA für Pollensterilität und DNA für die Wiederherstellung der Pollenfertilität verbunden werden soll, wie im nachstehenden Beispiel 5 beschrieben.
Alternativ wird die NcoI-Stelle am ATG-Translationsinitiationscodon von pVG55.3 bei der Amplifikation durch PCR eines DNA-Fragmentes eingebracht, das den CA55-Promotorbereich enthält, mit Hilfe der folgenden Oligonukleotide als Primer:
5'-GAT TCG AAT TCT GGT ATG CAT CAA TAG AGC CG-3'
5'-CAG GAG CGA GCC ATG GCT GCA G-3'
Das amplifizierte DNA-Fragment wird direkt als Promotor-Cassette zur Konstruktion von Pflanzentransformationsvektoren wie in Beispiel 5 beschrieben verwendet.
Beispiel 5
Konstruktion von Pflanzentransformationsvektoren aus den Promotor-Cassetten von Beispiel 4
Mit den in EPA 89401194.9 und 90402281.1 beschriebenen Verfahren werden die Promotor-Cassetten von Beispiel 4 zur Konstruktion von Pflanzentransformationsvektoren verwendet, die fremde chimäre DNA-Sequenzen umfassen, die jeweils die 5'-regulatorischen Sequenzen enthalten, einschließlich der antherenspezifischen Gene, die in Beispiel 2 oder 3 isoliert werden. Jede dieser 5'-regulatorischen Sequenzen ist stromaufwärts von, ist in der gleichen Transkriptionseinheit wie, und steuert entweder eine DNA für Pollensterilität (aus EPA 89401194.9 ), die Barnase aus Bacillus amyloliquefaciens codiert (Hartley und Rogerson (1972) Preparative Biochemistry 2 (3), 342–250) oder eine DNA für die Wiederherstellung von Pollenfertilität (aus EPA 90402281.1 ), die Barstar codiert (Hartley und Rogerson (1972) siehe oben; Hartley und Sweaton (1973) J. Biol. Chem. 248 (16) 5624–5626). Stromabwärts jeder DNA für Pollensterilität oder DNA zur Wiederherstellung der Pollenfertilität befindet sich das 3'-Ende des Nopalinsynthase-Gens (An et al. (1985) EMBO J 4 (2), 277). Jede chimäre DNA-Sequenz umfasst auch den 35 S'3-Promotor (Null and Howell (1987) Virology 86, 482–493), der im Leseraster an das neo-Gen gebunden ist, das die Kanamycin-Resistenz codiert ( EPA 84900782.8 ), und das 3'-Ende des Octopinsynthase-Gens (Dhaese et al. (1983) EMBO J. 2, 419).
Alternativ werden die Pflanzentransformationsvektoren pVE149, pVE139 und pVE136 folgendermaßen konstruiert.
In einem ersten Schritt wird das 1083 bp EcoRI-HindIII-DNA-Fragment von pMT416, das die Barnase- und Barstar-codierenden Sequenzen enthält (Hartley (1988) J. Mol. Biol. 202, 913), in das große EcoRI-HindIII- Fragment von Plasmid pMc5–8, ligiert, das das Plasmid pMAa5tbps1 ergibt. Mit Hilfe der stellengerichteten Mutagenese (PCT-Veröffentlichung WO 89/03887 ) wird dann eine NcoI-Stelle an dem ATG-Translationsinitiationscodon der Barnase-codierenden Sequenz eingeführt. Für diesen Zweck wird eine gapped-duplex DNA aus dem einzelsträngigen pMa5tbs 1, dem großen EcoRI-HindIII-Fragment von pMc5–8, und dem folgenden Oligonukleotid konstruiert:
5'-GAT AAC CGG TAC CAT GGT TGT CAC AGG GG-3'.
Das resultierende Plasmid wird als "pVE145A" bezeichnet.
In einer anschließenden Mutageneserunde wird eine NsiI-Stelle 14 bp stromabwärts des ATG-Translationsinitiations-Codons der Barnase-codierenden Sequenz mit einer gapped-Duplex DNA, die aus der einzelsträngigen DNA aus pVE145A besteht, dem großen EcoRI-HindIII-Fragment von pMA5–8, und dem folgenden Oligonukleotid eingeführt:
5'-CCC CGT CAA ATG CAT TGA TAA CCG G-3'.
Das resultierende Plasmid wird als "pVE145" bezeichnet.
Die Plasmide pMA5–8 und pMc5–8 wurden am 3. Mai 1988 an der Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM), Mascheroderweg 1B, D-330 Braunschweig, Deutschland, unter den Zugriffsnummern DSM 4567 bzw. DSM 4566 hinterlegt.
pVE145 wird mit NsiI gespalten, mit Klenow aufgefüllt und in das 111 bp DNA-Fragment ligiert, das in der SEQ ID NR. 4 gezeigt ist, und das das TA36-Intron enthält und das mit KpnI gespalten wurde und mit Klenow stumpfendig gemacht wurde, so dass das Plasmid pVE146 erhalten wurde. Das Fragment von SEQ ID NR. 4 wird durch Amplifikation aus genomischer DNA von Nicotiana tabacum cv. Samsun, mittels PCR und den folgenden Oligonukleotiden als Primer erhalten:
5'-CGA CGG TAC CAC GTA ATT AG-3'
5'-CAT AGG GTA CCT GTA TGT AAT AAA AAC-3'.
Das Plasmid pVE147 wird konstruiert durch Ligation des 2820 bp EcoRI-HindIII-Fragmentes von pGEMI (Promega), des 979 bp HindIII-NcoI-Fragments von pVE146 (das das Barnase-Gen mit Intron enthält), und des 1184 bp PCR-Fragment von Beispiel 4, das den CA55 antherenspezifischen Promotor aus Mais trägt.
Schließlich wird pVE149 durch Ligation der folgenden vier DNA-Fragmente erhalten:

– das 1715 bp EcoRI (aufgefüllt mit Klenow) – XbaI-Fragment von pVE147, das das Barnase-Gen unter der Kontrolle des CA55-Promotors,
– ein 296 bp EcoRI-XbaI-Fragment von pTTM6 (hinterlegt am 7. März 1988 bei der DSM unter der DSM-Zugriffsnummer 4468), das das 3' untranslatierte Ende des Nopalinsynthase-Gens von Agrobacterium T-DNA trägt,
– ein 1728 bp BglII (aufgefüllt mit Klenow)-HindIII-Fragment, das das bar-Gen trägt ( EP 0 242 236 ) unter der Kontrolle des 35S3-Promotors ( EP 0 359 617 ) und mit einem 3'-untranslatierten Ende des Nopalinsynthase-Gens of Agrobacterium T-DNA (dieses Fragment entspricht der Sequenz in SEQ ID NR. 5 zwischen den Positionen 2409 und 4137), und
– das große EcoRI-HindIII-Fragment von pUC19 (New England Biolabs Inc. Beverly, MA, U.S.A.).

Die vollständige Sequenz von pVE149 ist in SEQ ID NR. 5 gezeigt.
Das Plasmid pVE136 ist identisch zu pVE149, außer dass es nicht das TA36-Intron in dem Barnase-Gen enthält. pVE136 wird konstruiert, indem man in pVE149 das 534 bp NcoI-BamHI-Fragment, das das Barnase-Gen enthält, gegen das 449 bp NcoI-BamHI-Fragment von pVE145A ersetzt.
pVE136 wird konstruiert und in E. coli WK6 gehalten, das das Plasmid pMc-BS enthält. pMc5-BS enthält das Barstar-Gen unter der Kontrolle des tac- Promotors (De Boer et al. (1983) PNAS 80, 21) und wird konstruiert durch Klonierung des EcoRI-HindIII-Fragmentes von pMT416 (Hartley (1988) J. Mol. Biol. 202, 913) in pMc5–8. Dann wird die Sequenz, die mit der PhoA-Signalsequenz beginnt und mit dem letzten Nukleotid vor dem Translationsinitiationscodon des Barstar-codierenden Bereichs aufhört, durch Loop-out-Mutagenese gemäß allgemeiner Verfahren, beschrieben von Sollazi et al., (1985) Gene 37, 199 deletiert. Die Verfügbarkeit eines Ampicillinresistenz-Gens auf den von pUC18 stammenden Plasmiden, die das chimäre Barnase-Gen und das Chloramphenicol-Resistenz-Gen auf pMc5-BS tragen, ermöglicht, dass der Stamm stabil auf Platten gehalten wird, die zwei Antibiotika enthalten, oder dass man auf ein beliebiges Plasmid selektiert. Die Genexpression von diesem Promotor, die zwar gewöhnlich reprimiert ist, kann durch Zugabe eines gemeinhin verwendeten Induktors des lac-Operons, IPTG (Isopropyl-β-d-thiogalactopyranosid) induziert werden.
Das 5843 bp NcoI-BamHI-Fragment von partiell gespaltenem pVE149, das das gesamte Plasmid außer der Barnase-codierenden Sequenz trägt, wird mit Klenow aufgefüllt und in ein DraI-HindIII-Fragment (aufgefüllt mit Klenow) von pVE151 ligiert, das die Barstarcodierende Sequenz trägt. Das resultierende Plasmid wird als "pVE139" bezeichnet. pVE151 wird mittels stellengerichteter Mutagenese von pMc5-BS erhalten, so dass eine DraI-Stelle an dem ATG-Translationsinitiations-Codon der Barstar-codierenden Sequenz eingeführt wird. Für diesen Zweck wird eine gapped-duplex DNA aus dem einzelsträngigen PMc5-BS, dem großen EcoRI-HindIII-Fragment von pMc5–8, und dem folgenden Oligonukleotid konstruiert:
5'-GCT TTT TTA AAT TTA TTT TCT CC-3'.
T-DNA-Vektoren für Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformationen werden durch Klonieren der geeigneten EcoRI (aufgefüllt mit Klenow)-HindIII-Fragmente von pVE149 oder pVE136 (mit 3553-Bar- und Mais-antherenspezifischen Promotor-Barnase-Chimärengenen) oder pVE139 (mit 3553-Bar- und Maisantherenspezifischen Promotor-Barstar-Chimärengenen) zwischen den HindIII- und XbaI- (aufgefüllt mit Klenow)-Stellen bekannter T-DNA-Vektoren pGSC1700 oder pGSC1701A hergestellt. pGSC1700 wurde am 21. März 1988 an der DSM unter der DSM-Zugriffsnummer 4469 hinterlegt, und pGSC1701A wurde am 22. Oktober 1987 an der DSM unter der DSM-Zugriffsnummer 4286 hinterlegt. Die T-DNA-Vektoren, die pVE149, pVE139 und pVE136 enthalten, werden zur Transformation von Tabak wie in Beispiel 7 beschrieben verwendet.
Beispiel 6
Transformation von Mais mit den Pflanzentransformationsvektoren aus Beispiel 5
Mit Hilfe der Verfahren, beschrieben von Fromm et al., (1990) siehe oben, werden embryogene Suspensionskulturen einer B73 × A188 Maislinie mit den in Beispiel 5 beschriebenen Pflanzentransformationsvektoren, einschließlich pVE149, pVE136 und pVE139 – und zwar entweder direkt oder nach einer geeigneten Linearisierung (beispielsweise nach der Spaltung mit EcoRI und/oder HindIII) transformiert. Transformierte Pflanzen, die aus embryogenen Suspensionskulturen regeneriert wurden, die jeweils einen antherenspezifischen Promotor von Beispiel 2 oder 3 enthalten und entweder eine DNA für Pollensterilität oder eine DNA für die Wiederherstellung der Pollenfertilität steuern, sind abgesehen von ihren Blüten normal. Diesbezüglich exprimiert jede Pflanze, die eine DNA für Pollensterilität unter der Kontrolle von einem der antheren-spezifischen Promotoren enthält, eine solche DNA zumindest vorwiegend in ihren Antheren und produziert keinen normalen Pollen, und jede Pflanze, die eine DNA zur Wiederherstellung der Pollenfertilität unter der Kontrolle von einem der antherenspezifischen Promotoren trägt, exprimiert eine solche DNA zumindest vorwiegend in ihren Antheren, produziert aber normalen Pollen.
Beispiel 7
Transformation von Tabak mit Pflanzentransformationsvektoren aus Beispiel 5
Mit den in EPA 89401194.9 und 90402281.1 beschriebenen Verfahren werden Tabakpflanzen durch Agrobacterium-vermittelte Übertragung mit den Pflanzentransformationsvektoren transformiert, die die fremden chimären DNA-Sequenzen aus Beispiel 5 enthalten. Die transformierten Tabakpflanzen, die jeweils einen antherenspezifischen Promotor aus Beispiel 2 oder 3 enthalten, und entweder eine DNA für Pollensterilität oder eine DNA für die Wiederherstellung der Pollenfertilität steuern, sind abgesehen von ihren Blüten normal. Diesbezüglich exprimiert jede Pflanze, die eine DNA für Pollensterilität unter der Kontrolle von einem der antherenspezifischen Promotoren enthält, diese DNA zumindest vorwiegend in ihren Antheren und produziert keinen normalen Pollen, und jede Pflanze, die eine DNA für die Wiederherstellung der Pollenfertilität unter der Kontrolle von einer der antherenspezifischen Promotoren enthält, exprimiert solche DNA zumindest vorwiegend in ihren Antheren, produziert aber normalen Pollen.
Beispiel 8
Transformation von Reis mit den Pflanzentransformationsvektoren aus Beispiel 5
Mit Hilfe der von Datta et al. (1990) siehe oben, beschriebenen Verfahren werden Protoplasten der Reislinie Oryza sativa var. Chinsurah Boro II, mit den in Beispiel 5 beschriebenen Pflanzentransformationsvektoren transformiert, einschließlich pVE149, pVE136, und pVE139 – und zwar entweder direkt oder nach einer geeigneten Linearisierung (beispielsweise nach der Spaltung mit EcoRI und/oder HindIII). Transformierte Pflanzen, regeneriert aus Protoplasten, die jeweils einen antherenspezifischen Promotor von Beispiel 2 oder 3 enthalten und entweder eine DNA für Pollensterilität oder eine DNA zur Wiederherstellung der Pollenfertilität steuern, sind abgesehen von ihren Blüten normal. Diesbezüglich exprimiert jede Pflanze, die eine DNA für Pollensterilität unter der Kontrolle der antherenspezifischen Promotoren enthält, diese DNA zumindest vorwiegend in ihren Antheren und erzeugt keinen normalen Pollen, und jede Pflanze, die eine DNA zur Wiederherstellung der Pollenfertilität unter der Kontrolle des antherenspezifischen Promotors enthält, exprimiert diese DNA zumindest vorwiegend in ihren Antheren, produziert aber normalen Pollen. Alternativ werden unreife Embryos aus Reis-Varietäten Gulfmont, Lemont, IR26, IR36, IR54 oder IR72 mit Gold-Teilchen beschossen, die geeignete Plasmid-DNA der Beispiele 5 tragen, und die Pflanzen werden gemäß den von Christou et al., (1991) Bio/Technology 9, 957, beschriebenen Verfahren regeneriert.
Natürlich ist die Verwendung der erfindungsgemäßen antherenspezifischen Maispromotoren nicht auf die Transformation spezifischer Pflanze(n) eingeschränkt. Diese Mais-Promotoren können in einer beliebigen Feldfrucht geeignet sein, wo sie die Genexpression steuern können, und vorzugsweise wo eine solche Expression zumindest vorwiegend, vorzugsweise spezifisch in Staubblattzellen der Feldfrucht erfolgt. Die Verwendung dieser Promotoren ist auch nicht auf die Steuerung der DNAs für die Pollensterilität oder DNAs für die Wiederherstellung der Pollenfertilität eingeschränkt, sondern kann zur Steuerung der Expression eines Gens selektiv in Staubblattzellen, verwendet werden.
Diese Erfindung ist darüber hinaus nicht auf die spezifischen staubblattspezifischen, vorzugsweise antherenspezifischen, insbesondere tapetumspezifischen Promotoren eingeschränkt, die in den vorstehenden Beispielen beschrieben sind. Tatsächlich nimmt man an, dass die DNA-Sequenzen der Promotoren der Beispiele 2 und 3 modifiziert werden können, indem einige ihrer Nukleotide durch andere Nukleotide ersetzt werden, vorausgesetzt, diese Modifikationen verändern die Fähigkeit der Polymerasekomplexe, einschließlich der Transkriptionsaktivatoren, Staubblattzellen, insbesondere Antherenzellen, zur Erkennung der Promotoren, wie modifiziert, nicht wesentlich. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Antheren-spezifischer Promotor der eine Sequenz enthält, die 300 bp oberhalb von Position 1180 in SEQ ID No 3 entspricht.
Antheren-spezifischer Promotor, dadurch gekennzeichnet, daß seine Nukleotidsequenz in der Sequenz der Nukleotide 1 bis 1179 gemäß SEQ ID Nr. 3 enthalten ist.
Promotorregion, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Sequenz, die ungefähr zwischen Nukleotid 680 und 880 beginnt und die bei Nukleotid 1179 gemäß SEQ ID Nr. 3 endet, aufweist.
Promotorregion nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Nukleotidsequenz zwischen Nukleotid 1224 und Nukleotid 2408 gemäß SEQ ID Nr. 5 aufweist.
Promotorregion nach Anspruch 3 oder 4, bei der die nichttranslatierte Leader-Sequenz durch die nichttranslatierte Leader-Sequenz eines anderen Gens, vorzugsweise eines pflanzlichen Gens, ersetzt ist.
DNA, die sich für die Transformation einer Pflanze eignet, wobei die DNA ein heterologes Strukturgen unter der Kontrolle des Promotors nach einem der Ansprüche 1 bis 2 oder der Promotorregion nach einem der Ansprüche 3 bis 5 enthält.
DNA nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem Strukturgen um eine DNA für Pollensterilität, die vorzugsweise eine Ribonuklease codiert, handelt.
DNA nach Anspruch 7, wobei das Strukturgen für Barnase codiert.
DNA nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem Strukturgen um eine DNA für die Restorierung der Pollenfertilität handelt.
DNA nach Anspruch 9, wobei das Strukturgen für Barstar codiert.
DNA nach einem der Ansprüche 6 bis 10, wobei es sich um ein Plasmid handelt.
DNA nach einem der Ansprüche 6 bis 10, wobei es sich um nukleäre DNA einer Pflanzenzelle handelt.
Pflanzenzelle, die die DNA nach einem der Ansprüche 7 bis 10 enthält.
Pflanzenzellkultur, die im wesentlichen aus den Pflanzenzellen nach Anspruch 13 besteht.
Pflanze oder Samen einer Pflanze, die im wesentlichen aus den Pflanzenzellen nach Anspruch 13 besteht.
Pflanze, ihr Saatgut oder ihre Nachkommenschaft, die aus der Pflanzenzelle nach Anspruch 13 regeneriert ist und in der nukleären DNA ihrer bzw. seiner Zellen die DNA nach einem der Ansprüche 7 bis 10 enthält.
Pflanze nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine einkeimblättrige Pflanze, vorzugsweise ein Getreide, handelt.
Pflanze nach Anspruch 17, wobei es sich um eine Maispflanze handelt.
Verfahren zur Isolierung eines Staubblatspezifischen Promotors aus Mais, dadurch gekennzeichnet, daß man mit einem Paar Oligonukleotide, das aus einem ersten Oligonukleotid, das zu einer 21 bis 24 Nukleotide langen Sequenz der DNA gemäß SEQ ID Nr. 2 oder der DNA gemäß SEQ ID Nr. 3 zwischen den Nukleotidpositionen 1120 und 1839 komplementär ist, und einem zweiten Oligonukleotid, das einer 21 bis 24 Nukleotide langen Sequenz der DNA gemäß SEQ ID Nr. 2 oder der DNA gemäß SEQ ID Nr. 3 zwischen den Nukleotidpositionen 1120 und 1839 entspricht, besteht, eine inverse PCR mit genomischer Mais-DNA durchführt.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das erste Oligonukleotid die folgende Sequenz 5'GCT CGA TGT ATG CAG TGC AGC 3' aufweist und wobei das zweite Oligonukleotid eine Sequenz aus der Gruppe 5'CGT CGC CGT GTC GGT GCT TCT CG 3' und 5'CCG TTG CGT TGC GTT GCG TAG ACG 3' aufweist.