ES2298244T3 - Metodo para la deteccion de los virus de la gripe a/b en saliva. - Google Patents
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Abstract
Método para la detección de una infección con el virus de la gripe A y/o B que incluye los pasos i) Obtención de una muestra de saliva; ii) Preparación de la muestra de saliva para la detección; y iii) Detección del virus de la gripe A y/o B en la muestra de saliva que se caracteriza por que la muestra de saliva que se obtiene en el paso i) es saliva formada espontáneamente, de manera que en la toma de la muestra de saliva no se realiza ningún enriquecimiento de virus en la muestra, sino que solamente se recoge la saliva que se encuentra en la boca de forma espontánea.
Description
Método para la detección de los virus de la
gripe A/B en saliva.
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La invención se refiere a un método para
detectar los virus de la gripe A/B, a un estuche o lote de reactivos
para el análisis correspondiente así como a la utilización de
saliva como material de prueba para la detección de los virus
gripales A/B.
La gripe es una enfermedad infecciosa
subestimada frecuentemente, que en particular en las personas
mayores y en los pacientes de riesgo puede conducir a una tasa de
morbididad y de mortalidad. Los virus de la gripe A y/o B (llamados
de forma abreviada; virus de la gripe A/B) son responsables de la
auténtica gripe vírica, que padecen anualmente en el mundo entero
varios cientos de millones de personas. Los virus de la gripe A y B
afectan básicamente a la zona de la nariz, boca y la faringe o
garganta y causan inicialmente síntomas en general
respiratorios.
Incluso al médico experimentado no le es posible
diagnosticar la gripe con gran seguridad con ayuda exclusivamente
de la sintomática clínica del paciente, puesto que otros virus que
atacan la zona de la nariz o de la garganta como el adenovirus, el
virus parainfluenza o paragripal, o el virus respiratorio sincitial
(RS), tienen una sintomática comparable.
Debido a la gran importancia medicinal de la
infección de la gripe casi cada país de la tierra dispone de un
sistema de vigilancia o control de la gripe organizado desde un
punto de vista nacional. Para ello los médicos de los consultorios
obtienen un frotis nasal y/o de la faringe del paciente sospechoso y
éste se envía al centro de referencia nacional correspondiente. La
detección del virus de la gripe A/B se realiza habitualmente por
elución de la solución tampón del frotis y posterior cultivo de la
muestra del paciente de células mamíferas, por ejemplo, células
MDCK (células Madin-Darby Canine Kidney).
El cultivo en este laboratorio especial puede
requerir hasta 14 días y por lo tanto no es de una relevancia
inmediata como diagnóstico para cada uno de los pacientes. El
cometido de los centros de referencia nacional consiste en
tipificar y subtipificar los virus cultivados y comunicar los
resultados a la organización mundial de la salud (OMS). El cometido
del fabricante de las vacunas consiste pues en adaptar las vacunas
de la gripe de años posteriores a las cepas víricas que circulan
últimamente según la recomendación anual de la OMS.
El motivo de la mayor variabilidad genética y
por tanto inmunológica, en particular en el virus A de la gripe, se
debe a que además del viraje genético habitual (mutación puntual) en
algunos casos puede producirse también un cambio genético
("reassortment", es decir, una nueva clasificación del gen
vírico). Esto viene condicionado por el hecho de que el genoma del
virus de la gripe se presenta segmentado contrariamente a otros
virus y por que la gripe A es tanto patógena en el hombre como en
el animal.
Los antígenos inmunodominantes que se asientan
en la superficie del virus son la hemoglutinina (H) y la
neuraminidasa (N). En la gripe A se conocen actualmente 15 subtipos
de hemoglutinina (H1-H15) y 9 subtipos de
neuraminidasa (N1-N9).
Por ejemplo, en la coinfección de una célula
huésped (por ejemplo, de un cerdo) con un virus de la gripe del
tipo A patógeno en el ser humano y con un virus de pájaro de la
gripe del tipo A se puede producir una nueva clasificación
("reassortment") del genoma vírico y por tanto un nuevo subtipo
de virus A de la gripe, que luego en la transmisión al ser humano
se introduce totalmente en su sistema inmunológico. Un ejemplo
reciente de ello fue la aparición del llamado virus de la gripe
aviar o gripe del pollo en mayo de 1997 en Hong Kong (tipo
A/H5N1/Hong Kong/156/97), que a pesar de una detección precoz y un
tratamiento médico intensivo provocó la muerte de 6 de los 18
pacientes afectados.
Para que se produzca una gran epidemia o
ciertamente una pandemia mundial se debe transmitir un subtipo nuevo
de virus de la gripe directamente de hombre a hombre, como lo que
ocurrió en 1918/19 en la primera aparición del subtipo H1N1 (gripe
española, aproximadamente 50 millones de muertos en el mundo
entero), en 1957 (H2N2, gripe asiática, aproximadamente 1 millón de
víctimas) y 1968 (H3N2, gripe de Hong Kong, aproximadamente 1 millón
de víctimas).
Desde hace poco se dispone de una nueva
generación de fármacos para la gripe, los llamados inhibidores de
la neuraminidasa, que posibilitan inicialmente una terapia causal de
la gripe y por lo tanto se consideran entre los círculos de
expertos como la verdadera irrupción en la terapia de la gripe. Los
estudios clínicos sobre la admisión de esta nueva clase de
sustancias han demostrado que el éxito de la terapia depende
notablemente de un inicio prematuro del tratamiento tras la
aparición de los primeros síntomas clínicos. Debido a esta nueva
opción terapéutica, la necesidad de un inicio prematuro de la
terapia por un lado y de una sintomática clínica relativamente poco
específica por otro lado parece un diagnóstico individual rápido
como terapia decisiva.
Por ello recientemente algunos fabricantes de
diagnósticos han desarrollado pruebas rápidas inmunológicas para la
gripe a base de una detección de antígenos, de manera que estas
pruebas rápidas sobre frotis de la nariz y/o de la faringe o bien
sobre el líquido obtenido por los enjuagues nasales se recogen como
material de prueba. Los ejemplos de dichas pruebas rápidas para la
gripe son el test rápido para la gripe A/B de la empresa Roche
Diagnostics GMBH, el QUick Vue de Quidel y el AB FLU OIA de
Biostar.
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Un problema especial en la obtención de muestras
consiste en que de la zona o región infectada de la nariz o de la
faringe se tiene que extraer el material de prueba, que contenga una
cantidad suficiente para una detección de virus de gripe A y/o de
gripe B (a continuación en forma abreviada: virus de la gripe A/B).
La calidad de la toma de muestra tiene por tanto un efecto directo
en la tasa de positividad del test rápido, cuya sensibilidad
clínica es habitualmente de alrededor del 70%, es decir en el 70% de
todas las muestras evaluadas como positivas en gripe mediante el
método de referencia (cultivo celular), el test o la prueba rápida
inmunológica es también positiva. Los fabricantes de diagnósticos
indican por tanto en las fichas de embalaje sus pruebas rápidas de
gripe, de manera que la extracción de muestras únicamente pueda ser
realizada por personal médico especialmente instruido para
garantizar que el material de prueba obtenido contiene realmente
cantidades suficientes de virus de gripe
A/B.
A/B.
Además resulta difícil el que en la zona de la
faringe las regiones rascadas (pared posterior de la faringe,
faringe, amígdalas) se puedan distinguir en función de la infección
vírica existente. Esto significa por ejemplo que para la detección
de una infección por estreptococo deben rascarse otras zonas de la
faringe que las que corresponden a una detección del virus de la
gripe A/B.
La toma de un frotis nasal o de la faringe es
algo incómodo para el paciente y en particular resulta un problema
en el caso de los niños (pequeños). Por otro lado los niños, al
menos en la fase precoz de una epidemia de gripe, son los
principales portadores de la gripe vírica debido a su contacto
social (guarderías, colegio) y al sistema inmunológico a menudo no
totalmente pronunciado.
Puesto que los frotis de nariz y garganta no
representan ningún material de prueba homogéneo, la tasa de
positividad de una detección de gripe se determina junto con la
calidad del frotis mediante la elución correcta, es decir, el paso
del material del frotis a la fase líquida, que sirve como verdadero
"material de prueba".
En especial debido a la nueva opción terapéutica
(inhibidores de neuraminidasa) existirá en el futuro una necesidad
creciente de detección de virus gripales (virus de la gripe A/B) en
la consulta del médico o por el propio paciente, lo que con el
actual material de prueba empleado (frotis, enjuague nasal)no
está en consonancia con la necesidad de una toma de muestra por un
personal adiestrado (médico).
Covalciuc y cols., Journal of Clinical
Microbiology 37 (1999)3971-3974, comparan la
idoneidad de cuatro materiales de prueba diferentes (aspirado
nasal, exudado o frotis nasofaríngeo, exudado o extensión faríngea,
esputo) para la detección de virus de la gripe A y B por medio de
un inmunoanálisis óptico. Según el material de prueba empleado se
obtiene por tanto diferente sensibilidad, especificidad y
comparabilidad con las determinaciones en un cultivo de virus.
La WO 92/12256 propone un método y unos estuches
de prueba o análisis para la detección de infecciones víricas. Para
la detección de infecciones en las vías respiratorias se mencionan
como materiales de prueba posibles el "aspirado nasal", "los
lavados nasales", "extensiones faríngeas", "exudados
nasofaríngeos", "lavados de garganta","frotis de
garganta", "aspirados nasofaríngeos", "aspirados
traqueales" y "aspirados bronquiales". Para la detección de
la gripe se recomiendan exclusivamente las "extensiones o frotis
de garganta" o los "lavados de garganta".
El cometido de la presente invención consiste en
eliminar los inconvenientes de la tecnología actual. En particular
el cometido de la invención consiste en preparar un método para
detectar una infección por el virus de la gripe A y/o B, que pueda
ser realizado de forma muy sencilla por personal no instruido o
idealmente por el propio paciente. Sobre todo el cometido de la
invención consistirá en hallar un material de prueba lo más
homogéneo posible, que se pueda obtener fácilmente por el propio
paciente o por personal no instruido, a partir del cual se puedan
detectar los virus de la gripe A y/o B.
Este cometido se resuelve mediante el objeto de
la invención tal como se caracteriza en las reivindicaciones
independientes. Las formas de la invención preferidas se indican en
las reivindicaciones dependientes.
El objeto de la invención es un método para
detectar una infección por el virus de la gripe A y/o B que incluye
las etapas siguientes
- i)
- Obtención de una muestra de saliva del individuo que se investiga
- ii)
- Preparación de la muestra de saliva para la detección o para una reacción de detección; y
- iii)
- Detección del virus de la gripe A y/o B en la muestra de saliva, de manera que la muestra de saliva es saliva obtenida de forma espontánea, tal como se define a continuación.
Finalmente el objeto de la invención es el uso
de saliva configurada de forma espontánea como material de prueba
para la detección de una infección por el virus de la gripe A y/o
B.
De forma inesperada se averiguó que a partir de
la saliva obtenida de forma espontánea como material de prueba con
un procedimiento diagnóstico establecido es posible una detección
fidedigna de los virus de la gripe A7B.
En particular sorprende que la detección de los
virus de la gripe A/B a partir de la saliva sea posible sin que se
tengan que enriquecer los virus en la toma de muestra en saliva,
sino que sea suficiente con la saliva obtenida de forma espontánea
como material de prueba para la detección de los virus de la gripe
A/B. Por "saliva formada de modo espontáneo" se debe entender
en la presente invención que en la toma de muestra de la muestra de
saliva para la detección de los virus de la gripe A/B no se realiza
ningún enriquecimiento de los virus de la gripe A/B en la muestra.
Únicamente se recoge de forma espontánea la saliva que se encuentra
en la cavidad bucal y por ejemplo se traslada a un recipiente para
la recogida de la saliva (por ejemplo, a través de esputos entre
otras cosas). También es posible recoger la muestra de saliva con
ayuda de un material capaz de absorber, por ejemplo, de un algodón
(tampón) en la boca o bien empleando dispositivos para la recogida
de saliva (como por ejemplo, los llamados "Salivette" de la
empresa Sarstedt o el OraSure Specimen Collection Device de la
empresa Epitope Inc.Beaverton, OR 97008, USA).
El material de prueba conforme a la invención la
saliva y la forma simple de obtener la muestra facilita,
contrariamente a los materiales para muestras conocidos hasta el
momento en el diagnóstico de la gripe a base de frotis nasales y de
faringe y del líquido obtenido por lavado nasal, una obtención de
muestras estandarizada por parte de personas no instruidas para
ello o por el propio paciente y aporta por tanto una seguridad
diagnóstica superior de las pruebas de los virus de la gripe A/B.
Además la saliva como material de prueba es más homogénea que los
otros materiales empleados hasta el momento, lo que asimismo
contribuye a la seguridad diagnóstica.
En un método conforme a la invención se obtiene
inicialmente una muestra de saliva. Por ejemplo, esto se puede
hacer tal como se ha descrito antes a través de esputos en un
recipiente, mediante absorción de una muestra de saliva con el
material apropiado, por ejemplo a base de un tampón de algodón o
algo similar, o utilizando un dispositivo para la obtención de
saliva convencional.
Según el método de detección que se vaya a
emplear (detección inmunológica o detección a través de los
correspondientes ácidos nucleicos) se prepara la muestra de saliva
para la reacción de detección:
Para la detección inmunológica se libera de la
muestra de saliva, por ejemplo, la nucleoproteína vírica de los
virus gripales A/B mediante reactivos de lisis. Dichas reacciones
son conocidas por el experto y pueden contener como componentes
eficaces para la lisis sales o bien medios humectantes. El reactivo
para la lisis para detectar virus de la gripe contiene
preferiblemente un humectante (por ejemplo, da buen resultado el
Triton® X 100, Tween®20 o bien el betaoctilglucopiranósido), un
medio reductor suave (por ejemplo,
N-acetil-L-cisteina
o el DTT=ditiotreitol), solución salina fisiológica (es decir, 0,9%
en peso de NaCl en tampón fosfato 20-50 mM), un
medio conservante (por ejemplo, 0,09% en peso NaN3), y una proteína
para reducir el enlace poco específico (por ejemplo, RSA=albúmina
de suero bovino o RPLA=albúmina de plasma bovino). La detección
inmunológica puede detectar además de la nucleoproteína vírica, por
ejemplo, la proteína vírica de la matriz o las polimerasas víricas.
También es posible la detección de hemoglutinina o de neuraminidasa
de los virus de la gripe A/B, para lo que no se requiere ninguna
lisis puesto que estos componentes víricos se asientan en la
superficie del virus.
Para la detección a través de un ácido nucleico
se obtiene por ejemplo un ácido nucleico vírico (ARN), se purifica
y se amplifica del modo correspondiente en presencia del cebador
requerido para la detección, preferiblemente por medio de la
reacción en cadena de la transcriptasa-polimerasa
invertida (RT-PCR). Estos pasos son conocidos por
el experto, así como la detección de ácidos nucleicos sin
amplificación previa.
La detección de virus gripales A/B en la muestra
de saliva se realiza según el método conocido.
En la detección inmunológica, por ejemplo, de la
nucleoproteína vírica, se puede formar un complejo sándwich con el
anticuerpo marcado del modo correspondiente y se puede detectar. Sin
embargo, también son posibles formatos de detección competitivos.
Aunque la detección es preferible por medio de una tira reactiva
inmunocromatográfica que se evalúa visualmente como prueba rápida,
la detección puede realizarse a través de todos los métodos
inmunológicos habituales, por ejemplo ELISA, las pruebas
turbidimétricas o de aglutinación, etc...
En la detección de los virus A/B de la gripe por
medio de ácidos nucleicos como el ARN se prefiere marcar el
producto de RT-PCR por medio de un cebador marcador
y el marcaje del cebador (por ejemplo, una etiqueta enzimática o de
fluorescencia) se detecta según la naturaleza del marcaje
(etiqueta).
La invención se aclara con ayuda de los
siguientes ejemplos:
Para documentar la idoneidad de la saliva como
material de prueba para la detección del virus de la gripe se
extraían en 10 personas con sospecha de gripe y en 4 personas sin
sospecha de gripe aguda dos frotis de faringe y una muestra de
saliva. El material de prueba extraído del frotis de faringe se
recogía con fines comparativos y se analizaba la infección por el
virus de la gripe A/B. Los resultados de estos análisis se
comparaban con los resultados que se obtenían con saliva como
material de prueba. La tabla 1 que se muestra al final de la parte
experimental del ejemplo muestra los resultados comparativos.
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Los frotis de faringe se extraían de la forma
establecida por el experto por medio de un tampón para frotis de
algodón de un solo uso de la empresa Copan Italia
(I-24125 Brescia; Nr.ref.167CS01). Los dos frotis
de faringe extraídos de un paciente se obtenían mediante un raspado
de la faringe con un tampón para frotis con dos almohadillas
dispuestas una junto a la otra. De este modo se garantizaba una
comparabilidad de ambos frotis.
La muestra de saliva la obtenía el propio
paciente de forma que éste recogía unos 0,5 ml de saliva de
formación espontánea en un tubito de plástico desechable con tapón
de rosca (nr. ref. 62.559.001 de la empresa Sarstedt). Se rechazaba
conscientemente la utilización del método o dispositivos para la
obtención de saliva conocidos por el experto (como las
"Salivetten" de la empresa Sarstedt o el Orasure Specimen
Collection Device de la empresa Epitope Inc. Beaverton, OR 97008,
USA) para demostrar que sin la concentración previa o bien el
tratamiento de la saliva también es posible la detección del virus
de la gripe.
\vskip1.000000\baselineskip
El primer tampón del frotis se trasladaba
directamente tras la extracción a un tubito con 1,5 ml de medio de
transporte del virus de la gripe de la empresa Virotest
(Rosenbergstr. 85, D-70193 Stuttgart, nr. cat.
0500300) y se cultivaba sobre células MDCK
(Madine-Darby Canine Kidney-Zellen).
El cultivo de las muestras se realizaba conforme al método descrito
en la literatura (Diagnóstico Microbiológico, Georg Thieme Verlag,
Stuttgart, New York, 1992, Editor Friedrich Burkhardt, página 371).
Los resultados se indican en la tabla 1, donde "+" equivale a
un hallazgo positivo y "-" simboliza un hallazgo negativo.
El segundo tampón correspondiente del frotis se
analizaba directamente tras la extracción de la muestra de la zona
de la faringe del paciente por medio de una prueba inmunológica
rápida del antígeno en presencia del virus de la gripe (Influenza
A/B-rapid Test de la empresa Roche Diagnostics GMBH,
Mannheim, Alemania, nr. cat. 2 158 663). La prueba rápida empleada
corresponde básicamente a la prueba rápida inmunológica descrita
como ejemplo 2 en EP-A 0 926 498. En este documento
se hace expresamente referencia a ello.
Además de la valoración visual de las tiras
reactivas se medía de forma cuantitativa la intensidad de la línea
de detección una vez finalizada la cromatografía por medio de un
aparato medidor fotométrico de la remisión (iluminación anular por
medio de 24 LEDs verdes de longitud de onda 555 nm y cámara CCD con
objetivo). Para ello se estudiaba la intensidad de la señal del
trazo detectado en porcentaje de la remisión (%Rem: respecto a una
región "blanca" de la tira reactiva, a la que se atribuía el
100% de remisión): los valores de la remisión a partir del 98,5%
son reconocidos por el usuario como señal negativa; los valores de
remisión entre el 96% y el 98,5% se reconocen como una señal
débilmente positiva; los valores de remisión inferiores al 96% se
reconocen como una señal claramente positiva. Los resultados se
indican en la tabla 1, donde "+" significa una señal positiva,
"(+)" una señal débilmente positiva y "-" una señal
negativa.
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras de saliva se analizaban por medio
de RT-PCR (reacción en cadena de la
polimerasa-transcriptasa inversa) en presencia del
ácido nucleico de la gripe vírica (aquí: ácido ribonucleico, RNA).
El proceso de análisis se componía de tres etapas para la
preparación de la muestra habituales en el diagnóstico del ácido
nucleico (para la separación de inhibidores), la amplificación y
detección del ácido nucleico (compárese seguidamente en 1.3.1.a
hasta 1.3.1.c).
Para el aislamiento del ARN de la gripe vírica
se empleaba el equipo "High Pure Viral RNA kit" que se obtiene
en el comercio bajo el nr. de referencia 1 858 882 de Roche
Molecular Biochemicals (Sandhofer Strasse 116 en
D-68305 Mannheim/Alemania). La realización se
llevaba a cabo conforme al protocolo estándar detallado en la
descripción del producto, en el cual inicialmente 200 \mul de
saliva por recipiente de reacción (tubo filtrante) en presencia del
tampón de enlace se unían a la guata de vidrio del tubo filtrante y
tras retirar posibles eventuales inhibidores mediante dos etapas de
lavado se eluía el ácido nucleico vírico en 200 \mul de tampón de
elución. Para ello se debía tener en cuenta que el volumen de
muestra era idéntico antes (saliva) y después (eluido) de la
preparación de la muestra, de manera que no se producía ninguna
concentración de los virus de la gripe. Naturalmente también es
posible según la invención realizar la etapa de elución con menos
de la cantidad de saliva que corresponda a la cantidad de tampón de
la elución y así concentrar o enriquecer los virus de la gripe en un
eluido.
Todos los reactivos se referían a Roche
Molecular Biochemicals, mientras no se indicara o contrario.
El volumen por recipiente de reacción de PCR era
de 50 \mul. De estos 10 \mul eran de volumen de muestra (eluido
de la preparación de la muestra) y otros 10 \mul de tampón Bicine
(5 veces el tampón RT-PCR). Los otros componentes
de la mezcla principal se encontraban en la concentración final
siguiente: 2,5 mmolar de acetato de manganeso, 0,2 mmolar de ATP
(2'desoxiadenosin-5'-trifosfato),
dCTP(2'-desoxi-citidin-5'-trifosfato),
dGTP(2'-desoxi-guanosin-5'-trifosfato)
y
dUTP(2'-desoxi-uridina-5-trifosfato)
así como dTTP 0,05 mmolar
(2'-desoxi-timidina-5'-trifosfato);
0,01 U/ \mul UNG
(uracil-DNA-glucosilasa);
Tht-polimerasa 0,2 U/ \mul de Thermus
thermophilus HB8; Inhibidor RNasa 0,8 U/ \mul así como un
cebador de avance y reverso 1,0 \mumolar.
La secuencia del cebador se extraía de la
literatura (James C.Donofrio y cols., Detection of influenza A and
B in Respiratory Secretions with the PCR, 1992, PCR Methods and
Applications 1, páginas 263-268). Los cebadores son
específicos del tipo para la gripe A y presentan un segmento
genético muy conservado de par de bases 212 (posición 101 hasta
312). El cebador reverso del gen de la matriz se marcaba con biotina
en el extremo 5' para la detección posterior del producto de
amplificación en la placa de microvaloración. Los cebados
específicos del tipo para la gripe B se conocen asimismo en la
literatura (James C. Donofrio y cols., Detection of Influenza A and
B in Respiratory Secretions with the PCR, 1992, PCR Methods and
Applications 1, páginas 263-268).
La amplificación de la mezcla principal se
realizaba en un termociclador Perkin Elmer 9600 con el perfil de
temperaturas siguiente: 20 minutos a temperatura ambiente tras la
adición de UNG + 45 minutos a 60ºC + 2 minutos a 94ºC + 10 ciclos
(30 segundos 94ºC + 60 segundos 50ºC + 90 segundos 68ºC)+ 35 ciclos
(30 segundos a 94ºC + 60 segundos a 60ºC + 90 segundos a 68ºC)+ 7
minutos a 68ºC.
La detección del ácido nucleico amplificado por
medio de RT-PCR se realizaba utilizando el PCR ELISA
(detección DIG) de la empresa Roche Molecular Biochemicals, nr.
ref. 1636111. A excepción del volumen de pipeteado se realizaban
etapas conjuntas conforme a la ficha de embalaje. 10 \mul del
producto de amplificación se mezclaban con 20 \mul de solución
desnaturalizante en un recipiente de reacción de 1,5 ml y se
incubaban durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego se
añadían 250 \mul de una sonda de hibridación marcada con
digoxigenina. La concentración de la sonda de hibridación era de 70
ng/ml.
La secuencia de la sonda de hibridación se
extraía de la literatura (James C. Donofrio y cols., Detection of
Influenza A and B in Respiratory Secretions with the PCR, 1992, PCR
methods and Applications 1, páginas 263-268). La
sonda se dirige contra la posición 177-205 del gen
de la matriz (segmento 7) de la gripe A. Las sondas
correspondientes para la gripe B se conocen asimismo en la
literatura (James C. Donofrio y cols., Detection of Influenza A and
B in Respiratory Secretions with the PCR, 1992, PCR methods and
Applications 1, páginas 263-268).
200 \mul de la mezcla de reacción se
trasladaban a una cavidad ("pocillo") de una microplaca
revestida de estreptavidina y se incubaban durante 1 hora a 37ºC en
un agitador. Tras el enlace del producto de hibridación a la
estreptavidina de la pared de las microplacas el contenido de los
pocillos era aspirado y se lavaba 3 veces con 300 \mul de
solución de lavado respectivamente. Luego se añadían al pocillo 200
\mul de sustrato de
anti-digoxigenin-peroxidasa
(conjugado anti-DIG-POD) y la
solución se incubaba durante 30 minutos a 37ºC en un agitador. Tras
la unión del conjugado POD se aspiraba el contenido del pocillo, se
lavaba 3 veces con 300 \mul de solución de lavado y a
continuación se añadían 200 \mul de sustrato de sal de diamonio de
2,2'-azinodi-(3-etilbenzotiazolinsulfonato
(6))(sustrato ABTS). Tras una posterior incubación durante 30
minutos a 37ºC se medía la evolución del color a 405 nm en un
lector de microplacas.
En cada determinación del PCR de las muestras de
saliva se determinaban asimismo en paralelo varios controles
negativos (DEMC-agua
(Art.nr.16-001Y"Acu Gene Water, molecular biology
grade, autoclaved" del fabricante Bio Whittaker Europe
S.p.r.l.(Parc Industriel de Petit-Rechain,
B-4800 Verviers, Bélgica) para excluir falsos
valores positivos por contaminación) así como varios controles
positivos (series de dilución de residuos de cultivos de MDCK que
contienen gripe) por medio de la preparación de muestras y
RT-PCR. Además se realizaba un control positivo
interno en la microplaca para el control de los reactivos de
detección.
Los valores de extinción de los controles
negativos efectuados en la microplaca correspondían habitualmente a
100-150 mE. Los valores de los controles positivos
internos realizados equivalían habitualmente a
1000-1500 mE.
Como señal positiva para las muestras de los
pacientes se definían los valores de extinción \geq 300 mE, lo
que equivalía a una señal mayor que 2 veces el valor blanco/nulo.
Los resultados se pueden ver en la tabla 1, donde "+"
simboliza un hallazgo positivo y "-" un hallazgo negativo.
Para la detección de los virus A/B de la gripe
en la saliva se empleaba el análisis rápido de los virus A/B de la
gripe de la empresa Roche Diagnostics Nr. cat. 2 158 663. El
análisis rápido allí empleado correspondía esencialmente al
análisis rápido inmunológico descrito en EP-A 0 926
498. EN este documento se hace referencia a él de forma expresa.
El análisis se empleaba normalmente para
detectar la nucleoproteína vírica específica en los frotis de
faringe por medio de una tira reactiva de cromatografía
inmunológica. EL análisis diferencia entre los virus de la gripe A
y B.
Para garantizar una buena cromatografía de la
tira reactiva con saliva como material de muestra se empleaba un
tampón de lisis/elución especial, que no forma parte del estuche o
equipo de análisis. El tampón de lisis/elución especial se compone
de lo siguiente:
0,9% en peso de NaCl, KH_{2}PO_{4} 2 mM,
Na_{2}HPO_{4} 10 mM, 0,095% en peso de NaN_{3}, EDTA 10 mM,
1,5% en peso de albúmina serica bovina(RSA), 1,5% en peso de
Tritón® X-100.
EL análisis se realizaba del modo siguiente:
A diferencia de cómo se ha descrito en la ficha
de embalaje inicialmente para eluir un tampón de frotis de faringe
como muestra del paciente con 3 fracciones (=800 \mul) del tampón
de lisis/elución contenido en un equipo de análisis se añadían 300
\mul de saliva y 500 \mul de tampón especial de lisis/elución a
un recipiente de reacción y se mez-
claban.
claban.
La realización del análisis se llevaba a cabo
conforme a los pasos descritos en la ficha del embalaje. Esta
indicaba inicialmente la adición de 2 gotas de solución de
anticuerpo 1 (que contiene anticuerpo monoclonal biotinilado frente
a la nucleoproteína A y la nucleoproteína B), la adición de 2 gotas
de solución de anticuerpo 2(que contiene anticuerpo
monoclonal biotinilado frente a la nucleoproteína A y la
nucleoproteína B), así como la cromatografía final de esta mezcla
reactiva por medio de una tira reactiva.
Como se sabe de la EP-A 0 926
498 la tira reactiva contiene un vellón conjugado, que se impregna
de forma reversible con un conjugado de oro soluble en líquido de
muestra. Las partículas de oro se cargan por absorción de un
anticuerpo monoclonal contra la digoxigenina.
En otra zona de la tira reactiva en la dirección
de la cromatografía aguas abajo se encuentra una membrana de
nitrocelulosa en la cual se impregnan de forma irreversible la
poliestreptavidina como línea de detección y un anticuerpo
policlonal PAK<ratón Fc\gamma>S-IgG como
línea de control.
El complejo sándwich a base de anticuerpo
biotinilado/nucleoproteína/anticuerpo de digoxigenina formado en
presencia del analito en el recipiente de reacción, se cromatografía
por medio de la tira reactiva, se une al anticuerpo antigripal
marcado con digoxigenina del complejo sándwich tras disolverse el
conjugado de oro de éste sobre el
anticuerpo-antidigoxigenina, y seguidamente es
captado en la membrana de nitrocelulosa en un trazo de
poliestreptavidina sobre el anticuerpo antigripal marcado con
biotina del complejo sándwich. Todo ello es visible mediante un
trazo rojo en la membrana de nitrocelulosa que equivale a una señal
positiva del análisis.
El conjugado de oro que sobra se cromatografía
aguas abajo y es absorbido en un trazo de control de la membrana de
nitrocelulosa como otra línea roja visible por medio del PAK<Maus
Fc\gamma>S-IgG.
Además de la evaluación visual de la tira
reactiva se medía de forma cuantitativa la intensidad de la línea
de detección una vez finalizada la cromatografía por medio de un
aparato medidor fotométrico de la remisión (iluminación anular por
medio de 24 LEDs de color verde de longitud de onda 555nm y cámara
CCD con objetivo). De este modo se analizaba la intensidad de la
señal del trazo detector en cuanto al porcentaje de remisión (%
Rem.; respecto a un trazo "blanco" de la tira reactiva, al que
se atribuía una remisión del 100%): Los valores de remisión a
partir del 95% son reconocidos por el usuario como valor negativo;
los valores de remisión entre el 96% y el 98,5% son reconocidos
como señal débilmente positiva; los valores de remisión inferiores
al 96% se conocen como señal claramente positiva. Los resultados se
indican en la tabla 1, donde "+" corresponde a una señal
positiva, "(+)" una señal débilmente positiva y "-" una
señal negativa.
A continuación se indican a modo de ejemplo
algunos resultados obtenidos con muestras de pacientes (tabla
1).
Los resultados visualizados se refieren
exclusivamente a la detección de virus de gripe A, puesto que en el
momento de la toma de la muestra únicamente se hallaron pacientes
con virus de la gripe A y ningún paciente con virus de gripe B. El
experto sabe que la gripe B contrariamente a la gripe A no circula
en cada temporada de invierno y que o aparece de forma conjunta en
virus de gripe A/B o bien la gripe B siempre presenta una
prevalencia claramente infe-
rior.
rior.
Aquí no nos podemos olvidar de que muestras de
saliva positivas en gripe B fabricadas artificialmente (muestras de
saliva almacenadas, que se han creado con excesos de cultivos de
virus de la gripe B) también han sido adecuadas en el análisis del
ácido nucleico así como en el ensayo inmunológico, para la detección
de virus gripales a partir de la saliva. Los resultados
visualizados no presentan por tanto ninguna limitación en el
sentido de la invención para la detección conjunta o aislada de
virus de la gripe B además de virus de la gripe A a partir de
saliva. La saliva es lo más adecuado como material de muestra para
detectar los virus gripales A/B.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de los resultados que se muestran en la
tabla 1 se puede poner de manifiesto lo siguiente:
- No todas las personas clasificadas como
pacientes por gripe debido a la sintomática clínica
(Nr.1-10) eran realmente positivos. Las personas
nr. 9 y 10 dieron negativo tanto en el cultivo del frotis de faringe
como en el PCR de la saliva y también con el análisis rápido de
saliva y frotis de faringe. Esto aclara lo realizado anteriormente
y la afirmación conocida en el círculo de expertos de que un
diagnóstico definitivo de la gripe no es posible a base
exclusivamente de la sintomática clínica.
- Los frotis de faringe y las muestras de saliva
de las personas asintomáticas (Nr. 11-14) dieron
negativo con todos los métodos de ensayo indicados y ponen de
manifiesto claramente la especificidad clínica de estos métodos.
- De las 8 personas halladas positivas en gripe
A por medio del cultivo celular en el frotis de la faringe (Nr.
1-8; los llamados pacientes de cultivo positivo), 6
personas fueron asimismo diagnosticadas como positivas con el
ensayo rápido inmunológico en frotis de faringe. Eso explica que la
sensibilidad clínica de este ensayo rápido disponible hasta el
momento a partir de frotis como material de muestra se encuentre por
debajo del cultivo celular reconocido hasta el momento como
estándar de oro (sensibilidades clínicas de distintos ensayos
rápidos inmunológicos según la ficha de embalaje del fabricante
respectivo: Quidel 73% para frotis nasal, Roche 70% para frotis de
faringe, Biostar 62% para frotis de faringe y 83% para frotis
nasofaríngeo).
- Por el contrario, las correspondientes
muestras de saliva de los 8 pacientes positivos en el cultivo dieron
positivo con el ensayo rápido inmunológico.
- Además de la comparación de los valores de
remisión (no visualizada en la tabla) se deduce que las intensidades
del trazo detector en las tiras reactivas rápidas inmunológicas con
muestra de saliva eran algo más intensas que las intensidades
correspondientes al utilizar frotis de faringe.
- Los resultados del ensayo rápido en saliva se
aseguran con los resultados PCR correspondientes en saliva y
justifican por tanto que a partir de la saliva como material de
muestra incluso sin previo enriquecimiento en la obtención de la
muestra se puedan detectar con seguridad los virus de la gripe
A/B.
Claims (9)
1. Método para la detección de una infección con
el virus de la gripe A y/o B que incluye los pasos
- i)
- Obtención de una muestra de saliva;
- ii)
- Preparación de la muestra de saliva para la detección; y
- iii)
- Detección del virus de la gripe A y/o B en la muestra de saliva
que se caracteriza porque la muestra de
saliva que se obtiene en el paso i) es saliva formada
espontáneamente, de manera que en la toma de la muestra de saliva no
se realiza ningún enriquecimiento de virus en la muestra, sino que
solamente se recoge la saliva que se encuentra en la boca de forma
espontánea.
2. Método conforme a la reivindicación 1, que se
caracteriza porque la muestra de saliva en el paso i) se
obtiene con un dispositivo para obtener saliva sin enriquecimiento
específico de virus.
3. Método conforme a una de las reivindicaciones
1 hasta 2, que se caracteriza porque en el paso ii) se
obtiene de la muestra de saliva el B-RNA de la
gripe A y/o B, que se amplifica por medio de RT-PCR
y se detecta en el paso iii).
4. Método conforme a una de las reivindicaciones
1 hasta 2, que se caracteriza porque se analiza siguiendo un
método inmunológico la muestra de saliva en el paso iii) para ver si
existen virus de gripe A y/o B.
5. Método conforme a la reivindicación 4, que se
caracteriza porque la muestra de saliva del paso ii) se
trata con un tampón de lisis, de manera que se libera la
nucleoproteína vírica del virus de la gripe A y/o B y esta
nucleoproteína es detectada por un método inmunológico en el paso
iii).
6. Utilización de la saliva como material de
muestra para detectar una infección por el virus de la gripe A y/o
B, que se caracteriza porque la saliva es saliva formada de
manera espontánea, de modo que en la toma de muestra no se realiza
ningún enriquecimiento de virus en la muestra sino que se recoge la
saliva que se encuentra de forma espontánea en la boca.
7. Uso de la saliva conforme a la reivindicación
6, que se caracteriza porque la muestra de saliva se obtiene
con un dispositivo para obtener saliva sin enriquecimiento
específico de virus.
8. Uso de la saliva conforme a una de las
reivindicaciones 6 hasta 7, que se caracteriza porque la
detección de una infección con el virus de la gripe A y/o B se
realiza por medio de un ensayo inmunológico.
9. Uso de la saliva conforme a una de las
reivindicaciones 6 hasta 7, que se caracteriza porque la
detección de una infección por el virus de la gripe A y/o B se
realiza por medio de la detección de ácido nucleico.
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