ES2297861T3 - Compuestos y metodos para modular la adhesion celular. - Google Patents
Compuestos y metodos para modular la adhesion celular. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2297861T3 ES2297861T3 ES97929070T ES97929070T ES2297861T3 ES 2297861 T3 ES2297861 T3 ES 2297861T3 ES 97929070 T ES97929070 T ES 97929070T ES 97929070 T ES97929070 T ES 97929070T ES 2297861 T3 ES2297861 T3 ES 2297861T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cyclic peptide
- baselineskip
- cadherin
- cells
- peptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/18—Feminine contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
- C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring
- C07K7/56—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring the cyclisation not occurring through 2,4-diamino-butanoic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
Abstract
PEPTIDOS CICLICOS Y COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN DICHOS PEPTIDOS CICLICOS. LOS PEPTIDOS CICLICOS COMPRENDEN UNA SECUENCIA DE RECONOCIMIENTO CAD (CADHERIN CELL ADHESION) DE TIPO HAV (HIS - ALA - VAL). PROCEDIMIENTOS DE USO DE DICHOS PEPTIDOS Y COMPUESTOS PARA LA MODULACION DE LA ADHERENCIA CELULAR POR CAD EN VARIOS CONTEXTOS.
Description
Compuestos y métodos para modular la adhesión
celular.
La presente invención se refiere, en general, a
métodos para modular la adhesión celular y, más en particular, a
péptidos cíclicos que comprenden una secuencia de reconocimiento de
la adhesión celular de cadherina, y al uso de dichos péptidos
cíclicos para inhibir o potenciar la adhesión celular mediada por
cadherina.
La adhesión celular es un proceso complejo, que
es de importancia para mantener la integridad celular y generar
barreras físicas y de permeabilidad en el organismo. Todos los
tejidos están divididos en compartimentos discretos, cada uno de
los cuales está compuesto por un tipo de célula específico, que se
adhiere a tipos de células similares. Esta adhesión desencadena la
formación de uniones intercelulares (es decir, sitios de contacto
fáciles de definir en las superficies de células adyacentes que se
adhieren entre sí), también conocidas como uniones estrechas,
uniones gap y desmosomas en cinturón. La formación de estas uniones
da lugar a barreras físicas y de permeabilidad que limitan el paso
libre de células y otras sustancias biológicas desde un
compartimento tisular a otro. Por ejemplo, los vasos sanguíneos de
todos los tejidos están compuestos por células endoteliales. Con el
fin de que los componentes de la sangre entren en un determinado
componente tisular, deben pasar, en primer lugar, desde la luz de
un vaso sanguíneo, a través de la barrera formada por las células
endoteliales de ese vaso. De manera similar, con el fin de que
determinadas sustancias entren en el organismo a través del
intestino, las sustancias deben pasar, en primer lugar, a través de
una barrera formada por las células epiteliales de ese tejido. Para
penetrar en la sangre a través de la piel, es necesario atravesar
capas de células tanto epiteliales como endoteliales.
La adhesión celular está mediada por moléculas
de adhesión a la superficie celular (CAMs) específicas. Existen
muchas familias diferentes de CAMs, incluidas las superfamilias de
inmunoglobulinas, integrinas, selectinas y cadherinas, y cada tipo
de célula expresa una combinación única de estas moléculas. Las
cadherinas constituyen una familia en rápida expansión de CAMs
dependientes del calcio (Munro et al., en: Cell Adhesion
and Invasion in Cancer Metastasis, P. Brodt, ed., págs.
17-34, RG Landes Co. (Austin TX, 1996). Las
cadherinas clásicas (abreviadas como CADs) son glicoproteínas
integrales de membrana que estimulan, en general, la adhesión
celular a través de interacciones homófilas (una CAD en la
superficie de una célula se une a una CAD idéntica situada en la
superficie de otra célula), si bien las CADs parecen ser capaces,
también, de formar complejos heterotípicos entre sí bajo
determinadas circunstancias y con una afinidad menor. Se ha
demostrado que las cadherinas regulan la adhesión de células
epiteliales, endoteliales, nerviosas y cancerosas, con expresiones
de CAD diferentes en los distintos tipos de células. La
N-cadherina (nerviosa) es expresada,
predominantemente, por células nerviosas, células endoteliales y
una variedad de células de tipo canceroso. La
E-cadherina (epitelial) es expresada,
predominantemente, por las células epiteliales. Otras CADs son la
P-cadherina (placentaria), que se encuentra en la
piel humana, y la R-cadherina (retiniana). En la
obra de Munro SB et al., 1996, en: Cell Adhesion and
Invasion in Cancer Metastasis, P. Brodt, ed., págs.
17-34, RG Landes Co. (Austin TX) se ofrece una
detallada discusión de las cadherinas clásicas.
Por lo general, las estructuras de las CADs son
similares. Tal como se muestra en la Figura 1, las CADs están
compuestas por cinco dominios extracelulares
(EC1-EC5), un dominio hidrófobo (TM) único que
atraviesa la membrana plasmática (PM), y dos dominios
citoplasmáticos (CP1 y CP2). Los restos que fijan calcio DXNDN (SEQ
ID NO:41), DXD y LDRE (SEQ ID NO:40) se encuentran dispersos entre
los dominios extracelulares. El primer dominio extracelular (EC1)
contiene la secuencia clásica de reconocimiento de adhesión celular
de cadherina (CAR), HAV
(His-Ala-Val), junto con secuencias
laterales a cada lado de la secuencia CAR, que pueden desempeñar
algún papel en la asignación de especificidad. Se ha demostrado que
péptidos sintéticos que contienen la secuencia CAR y anticuerpos
dirigidos contra la secuencia CAR inhiben los procesos dependientes
de CAD (Munro et al., véase antes; Blaschuk et al.,
J. Mol. Biol. 211:679-82, 1990; Blaschuk
et al., Develop. Biol. 139:227-29,
1990; Alexander et al., J. Cell Physiol.
156:610-18, 1993). Se han determinado la solución
tridimensional y las estructuras cristalinas del dominio EC1
(Overduin et al., Science 267:386-389,
1995; Shapiro et al., Nature
374:327-337, 1995).
Aun cuando la adhesión celular es necesaria para
determinadas funciones fisiológicas normales, hay situaciones en
las que el nivel de adhesión celular resulta indeseable. Por
ejemplo, muchas patologías (tales como enfermedades autoinmunes,
cánceres y enfermedades inflamatorias) implican una adhesión celular
anormal. La adhesión celular puede desempeñar también alguna
función en el rechazo de injertos. En tales circunstancias, puede
resultar deseable la modulación de la adhesión celular.
Adicionalmente, las barreras de permeabilidad
que surgen de la adhesión celular generan dificultades para el
suministro de medicamentos a tejidos específicos y tumores en el
organismo. Por ejemplo, los parches cutáneos representan un
instrumento cómodo para administrar medicamentos a través de la
piel. Sin embargo, el uso de parches cutáneos ha estado limitado a
pequeñas moléculas hidrófobas a causa de las barreras de células
epiteliales y endoteliales. De forma similar, las células
endoteliales determinan que los capilares sanguíneos sean
fundamentalmente impermeables a los medicamentos, y la barrera
hemoencefálica ha impedido desarrollar medicamentos dirigidos al
sistema nervioso central. Además, numerosos tumores sólidos
desarrollan barreras internas que limitan el suministro de
medicamentos antitumorales y anticuerpos a células internas.
Los intentos de facilitar el paso de
medicamentos a través de dichas barreras recurren, por lo general, a
receptores o proteínas portadoras específicas que transportan
moléculas a través de las barreras in vivo. No obstante,
estos métodos son a menudo ineficaces debido a la baja velocidad de
transporte endógeno o al mal funcionamiento de una proteína
portadora con los medicamentos. En tanto que se ha logrado mejorar
la eficacia usando una variedad de agentes químicos capaces de
romper la adhesión celular, estos agentes se encuentran asociados
típicamente con efectos secundarios indeseables, pueden requerir
procedimientos invasivos para su administración, y pueden dar lugar
a efectos irreversibles. Se ha señalado la posibilidad de utilizar
péptidos sintéticos lineales, que contienen una secuencia CAR de
cadherina, para el transporte de medicamentos (documento WO
91/04745), pero estos péptidos son, con frecuencia, inestables
metabólicamente y se considera, por lo general, que son agentes
terapéuticos insuficientes.
En consecuencia, existe la necesidad en la
técnica de compuestos que modulen la adhesión celular y mejoren el
suministro de medicamentos a través de barreras de permeabilidad sin
los citados inconvenientes. La presente invención satisface esta
necesidad y ofrece, adicionalmente, otras ventajas.
Blaschuk et al., Developmental
Biology, vol. 139, Nº 1, 1990, págs. 227-229,
hace referencia a la identificación de una secuencia de
reconocimiento de adhesión celular de cadherina.
La presente invención proporciona péptidos
cíclicos según las reivindicaciones, y péptidos para ser utilizados
en métodos destinados a modular la adhesión celular mediada por
cadherinas. En un aspecto, la presente invención proporciona
péptidos cíclicos que comprenden la secuencia
His-Ala-Val, en donde los péptidos
cíclicos modulan la adhesión celular mediada por cadherinas. El
péptido cíclico tiene la fórmula:
en donde X_{1} y X_{2} son
opcionales y, si están presentes, se seleccionan independientemente
del grupo consistente en residuos de aminoácidos y sus
combinaciones, en donde los residuos están unidos por enlaces
peptídicos, y en donde X_{1} y X_{2}, independientemente, tienen
un tamaño en el intervalo de 0 a 10 residuos, de modo que la suma
de residuos contenidos en X_{1} y X_{2} se encuentra dentro del
intervalo de 1 a
12;
en donde Y_{1} e Y_{2} se seleccionan,
independientemente, del grupo consistente en residuos de
aminoácidos, y en donde se forma un enlace covalente entre los
residuos Y_{1} e Y_{2}; y
en donde Z_{1} y Z_{2} son opcionales y, si
están presentes, se seleccionan independientemente del grupo
consistente en residuos de aminoácidos y sus combinaciones, en donde
los residuos están unidos por enlaces peptídicos. Estos péptidos
cíclicos pueden comprender modificaciones tales como un grupo
N-acetilo o N-alcoxibencilo y/o un
grupo amida o éster C-terminal. Los péptidos
cíclicos pueden estar ciclados, por ejemplo, a través de un enlace
disulfuro; un enlace amida entre grupos funcionales terminales,
entre cadenas laterales de residuos, o entre un grupo funcional
terminal y una cadena lateral de residuo; un enlace tioéter o
\delta_{1}\delta_{1}-ditriptófano, o un
derivado del mismo. Los péptidos cíclicos pueden estar unidos,
adicionalmente, por un agente de acceso ("targeting
agent"), un medicamento, un soporte sólido y/o una marca
detectable.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o
múltiples péptidos cíclicos, según la descripción anterior, en
combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Estas
composiciones pueden comprender, adicionalmente, un medicamento.
En otros aspectos adicionales, los péptidos son
para ser utilizados en métodos para modular la adhesión celular,
haciendo contactar una célula que expresa una cadherina con un
péptido cíclico, según la descripción anterior.
Dentro de otro aspecto adicional, se
proporcionan péptidos para reducir las adhesiones celulares no
deseadas en un mamífero, mediante la administración a un mamífero
de un péptido cíclico, según la descripción anterior.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona péptidos para potenciar el suministro de un medicamento
a través de la piel de un mamífero, haciendo entrar en contacto las
células epiteliales de un mamífero con un péptido cíclico, según la
descripción anterior, y un medicamento, bajo unas condiciones y
durante un período de tiempo suficientes para permitir el paso del
medicamento a través de las células epiteliales.
En un aspecto adicional, se proporcionan
péptidos para potenciar el suministro de un medicamento a un tumor
en un mamífero, mediante la administración a un mamífero de una
composición farmacéutica que comprende un péptido cíclico, según la
descripción anterior, y un medicamento.
Dentro de aspectos relacionados, se proporcionan
péptidos para tratar el cáncer y/o inhibir metástasis de células
tumorales en un mamífero, mediante la administración a un mamífero
afecto de cáncer de un péptido cíclico, según la descripción
anterior.
En un aspecto adicional, se proporcionan
péptidos para inducir la apoptosis en una célula que expresa una
cadherina, haciendo contactar una célula que expresa una cadherina
con un péptido cíclico, según la descripción anterior.
La presente invención proporciona, igualmente,
dentro de aspectos adicionales, péptidos para inhibir la
angiogénesis en un mamífero, mediante la administración a un
mamífero de un péptido cíclico, según la descripción anterior.
En una forma de realización adicional, la
presente invención proporciona péptidos para potenciar el suministro
de un medicamento al cerebro de un mamífero, mediante la
administración a un mamífero de un péptido cíclico, según la
descripción anterior.
En aspectos todavía adicionales, se proporcionan
péptidos para potenciar la adhesión celular. Dentro de uno de estos
aspectos, se proporcionan péptidos para potenciar la cicatrización
de heridas en un mamífero, haciendo contactar una herida de un
mamífero con un péptido cíclico, según la descripción anterior.
Dentro de un aspecto relacionado, la presente
invención proporciona péptidos para potenciar la adhesión de
tejidos extraños implantados en un mamífero, haciendo contactar un
lugar de implantación de tejidos extraños en un mamífero con un
péptido cíclico, según la descripción anterior.
La presente invención proporciona, asimismo, en
aspectos adicionales, péptidos para potenciar la extensión de
axones, haciendo contactar una neurona con un péptido cíclico, según
la descripción anterior.
En un aspecto relacionado, se proporcionan
péptidos para tratar lesiones de la médula espinal en un mamífero,
mediante la administración a un mamífero de un péptido cíclico,
según la descripción anterior.
En un aspecto relacionado adicional, la presente
invención proporciona péptidos para tratar una enfermedad
neurológica desmielinizante en un mamífero, administrando a un
mamífero un péptido cíclico, según la descripción anterior.
La presente invención proporciona, asimismo,
péptidos para modular el sistema inmune de un mamífero, mediante la
administración a un mamífero de un péptido cíclico, según la
descripción anterior.
En todavía otro aspecto, se proporcionan
péptidos para prevenir el embarazo en un mamífero, mediante la
administración a un mamífero de una composición, según la
descripción anterior.
En un aspecto adicional, se proporcionan
péptidos para incrementar la permeabilidad vascular en un mamífero,
mediante la administración a un mamífero de un péptido cíclico,
según la descripción anterior.
La presente invención proporciona, igualmente,
métodos para identificar un péptido cíclico capaz de modular la
adhesión celular mediada por cadherinas. Uno de tales métodos
comprende: (a) cultivar neuronas en una monocapa de células que
expresan N-cadherina, en presencia y en ausencia de
un péptido cíclico candidato, bajo las condiciones y durante el
período de tiempo suficientes para permitir la extensión de axones;
(b) determinar una longitud media de axón para las neuronas; y (c)
comparar la longitud media del axón para las neuronas cultivadas en
presencia de un péptido cíclico candidato con la longitud del axón
en neuronas cultivadas en ausencia de un péptido cíclico
candidato.
candidato.
Dentro de otra forma de realización, el método
comprende: (a) cultivar células que expresan una cadherina, en
presencia y en ausencia de un péptido cíclico candidato, bajo las
condiciones y durante el período de tiempo suficientes para
permitir la adhesión celular; y (b) evaluar visualmente el grado de
adhesión celular entre las células.
En todavía otra forma de realización, el método
comprende: (a) cultivar células NRK en presencia y en ausencia de
un péptido cíclico candidato, bajo las condiciones y durante el
período de tiempo suficientes para permitir la adhesión celular; y
(b) comparar el nivel de E-cadherina en la
superficie celular en las células cultivadas en presencia del
péptido cíclico candidato con el nivel en las células cultivadas en
ausencia del péptido cíclico candidato.
En una forma de realización adicional, el método
comprende: comparar la cantidad de marca experimental que pasa a
través del epitelio de la piel, en contacto con la marca
experimental, en presencia de un péptido cíclico candidato, con la
cantidad que atraviesa la piel en ausencia de un péptido cíclico
candidato.
Dentro de otra forma de realización, el método
in vitro comprende: comparar el grado de angiogénesis
observada en un vaso sanguíneo puesto en contacto con un péptido
cíclico candidato, hasta un grado predeterminado de angiogénesis
observado para un vaso sanguíneo en ausencia de un péptido cíclico
candidato y, a partir de aquí, identificar un péptido cíclico capaz
de modular la adhesión celular.
La presente invención proporciona también,
dentro de un aspecto adicional, un kit para administrar un
medicamento a través de la piel de un mamífero, que comprende: (a)
un parche dérmico; y (b) un péptido cíclico según la descripción
anterior.
Dentro de aspectos todavía adicionales, la
presente invención proporciona métodos in vitro para modular
la adhesión celular, que comprenden poner en contacto una célula que
expresa cadherina con un anticuerpo que se une a un péptido
cíclico, según la descripción anterior. En uno de estos aspectos, se
proporciona un método para hacer acceder un medicamento a una
célula que expresa cadherina en un mamífero, que comprende
administrar a un mamífero un anticuerpo que se une a un péptido
cíclico, según la descripción anterior, en donde el anticuerpo se
encuentra unido a un medicamento.
La presente invención proporciona, igualmente,
métodos para detectar la presencia de células que expresan
cadherina en una muestra, que comprenden: (a) poner en contacto una
muestra con un anticuerpo que se une a un péptido cíclico, según la
descripción anterior, bajo las condiciones y durante el período de
tiempo suficientes para permitir la formación de un complejo de
anticuerpo-cadherina; y (b) detectar el nivel de
complejo de anticuerpo-cadherina.
Dentro de otro aspecto, la presente invención
proporciona kits para detectar la presencia de células que expresan
cadherina en una muestra, que comprenden:
- (a)
- un anticuerpo que se une a un péptido cíclico, según la descripción anterior; y
- (b)
- un reactivo de detección.
Estos y otros aspectos adicionales de la
invención resultarán evidentes cuando se haga referencia a la
siguiente descripción detallada y a los dibujos anexos.
Figura 1 es un diagrama que representa la
estructura de CADs clásicas. Los cinco dominios extracelulares se
designan EC1-EC5, el dominio hidrófobo que atraviesa
la membrana plasmática (PM) está representado por TM, y los dos
dominios citoplasmáticos están representados por CP1 y CP2. Los
restos que fijan calcio se muestran mediante DXNDN (SEQ ID NO:41),
DXD y LDRE (SEQ ID NO:40). La secuencia CAR, HAV, se muestra dentro
de EC1. También se muestran las proteínas citoplasmáticas
\beta-catenina (\beta),
\alpha-catenina (\alpha) y
\alpha-actinina (ACT), que median la interacción
entre CADs y los microfilamentos (MF).
Figura 2 ofrece las secuencias de aminoácidos de
los dominios EC1 clásicos de cadherina en mamíferos:
N-cadherina humana (SEQ ID NO:1),
N-cadherina de ratón (SEQ ID NO:2),
N-cadherina bovina (SEQ ID NO:3),
P-cadherina humana (SEQ ID NO:4),
P-cadherina de ratón (SEQ ID NO:5),
E-cadherina humana (SEQ ID NO:6), y
E-cadherina de ratón (SEQ ID NO:7).
Figura 3 muestra las estructuras de péptidos
cíclicos representativos de la presente invención (estructuras a la
izquierda), junto con estructuras similares, pero inactivas (a la
derecha).
Figura 4 es un histograma que muestra la
longitud axonal media, en micrómetros, para neuronas cultivadas en
una monocapa de células 3T3 no transfectadas (primera columna), o
células 3T3 transfectadas con ADNc que codifica
N-cadherina (columnas 2-4). En la
tercera columna, se muestra la longitud axonal media en presencia
del péptido cíclico representativo
N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8). La columna
4 muestra la longitud axonal media en presencia del péptido de
control N-Ac-CHGVC-NH_{2} (SEQ ID
NO:9).
Figura 5 es un gráfico que muestra una curva de
respuesta a la dosis para el péptido cíclico representativo
N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8) sobre
células 3T3 de control (círculos abiertos) y sobre células 3T3 que
expresan N-cadherina (círculos macizos).
Figura 6 es un histograma que muestra la
longitud axonal media, en micrómetros, en neuronas cultivadas en
presencia (barras macizas) o ausencia (barras sombreadas) de 500
\mug/ml del péptido cíclico representativo
N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8). En el
primer par de barras, las neuronas se cultivaron en una monocapa de
células 3T3 no transfectadas. En las restantes columnas, se muestra
la longitud axonal media en neuronas cultivadas sobre células 3T3
transfectadas con ADNc que codifica N-CAM (segundo
par de barras), L1 (tercer par de barras), o
N-cadherina (cuarto par de barras).
Figuras 7A-C son fotografías que
muestran cultivos monocapa de células endoteliales bovinas en
presencia (Figura 7A) y ausencia (Figura 7C) de un péptido cíclico
representativo, o en presencia de un péptido de control inactivo
(Figura 7B). La Figura 7A muestra las células 30 minutos después de
la exposición a 500 \mug/ml de
N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8). La Figura
7B muestra las células 30 minutos después de la exposición al
péptido de control N-Ac-CHGVC-NH_{2} (SEQ
ID NO:9). La Figura 7C muestra las células en ausencia de péptido
cíclico. Obsérvese que las células endoteliales están retraídas
entre sí en presencia de N-Ac-CHAVC-NH_{2}
(SEQ ID NO:8).
Figuras 8A-C son fotografías que
muestran cultivos monocapa de células endoteliales bovinas en
presencia (Figura 8A) y ausencia (Figura 8C) de un péptido cíclico
representativo, o en presencia de un péptido de control inactivo
(Figura 8B). La Figura 8A muestra las células 30 minutos después de
la exposición a 500 \mug/ml de N-Ac-
CAHAVDIC-NH_{2} (SEQ ID NO:10). La Figura 8B muestra las células 30 minutos después de la exposición al péptido de control N-Ac-CAHGVDIC-NH_{2} (SEQ ID NO:11). La Figura 8C muestra las células en ausencia de péptido cíclico. En este caso, ninguno de los péptidos cíclicos exhibe actividad.
CAHAVDIC-NH_{2} (SEQ ID NO:10). La Figura 8B muestra las células 30 minutos después de la exposición al péptido de control N-Ac-CAHGVDIC-NH_{2} (SEQ ID NO:11). La Figura 8C muestra las células en ausencia de péptido cíclico. En este caso, ninguno de los péptidos cíclicos exhibe actividad.
Figuras 9A-C son fotografías que
muestran cultivos monocapa de células endoteliales bovinas en
presencia (Figura 9A) y ausencia (Figura 9C) de un péptido cíclico
representativo, o en presencia de un péptido de control inactivo
(Figura 9B). La Figura 9A muestra las células 30 minutos después de
la exposición a 500 \mug/ml de
N-Ac-CAHAVDC-NH_{2} (SEQ ID NO:16). La
Figura 9B muestra las células 30 minutos después de la exposición al
péptido de control N-Ac-CAHGVDC-NH_{2}
(SEQ ID NO:17). La Figura 9C muestra las células en ausencia de
péptido cíclico. Obsérvese que las células endoteliales están
retraídas entre sí en presencia de
N-Ac-CAHAVDC-NH_{2} (SEQ ID NO:16).
Figuras 10A-C son fotografías
que muestran cultivos monocapa de células endoteliales bovinas en
presencia (Figura 10A) y ausencia (Figura 10C) de un péptido
cíclico representativo, o en presencia de un péptido de control
inactivo (Figura 10B). La Figura 10A muestra las células 30 minutos
después de la exposición a 500 \mug/ml de
N-Ac-
CSHAVSSC-NH_{2} (SEQ ID NO:18). La Figura 10B muestra las células 30 minutos después de la exposición al péptido de control N-Ac-CSHGVSSC-NH_{2} (SEQ ID NO:19). La Figura 10C muestra las células en ausencia de péptido cíclico. Obsérvese que las células endoteliales están retraídas entre sí y se reúnen en presencia de N-Ac-CSHAVSSC-NH_{2} (SEQ ID NO:18).
CSHAVSSC-NH_{2} (SEQ ID NO:18). La Figura 10B muestra las células 30 minutos después de la exposición al péptido de control N-Ac-CSHGVSSC-NH_{2} (SEQ ID NO:19). La Figura 10C muestra las células en ausencia de péptido cíclico. Obsérvese que las células endoteliales están retraídas entre sí y se reúnen en presencia de N-Ac-CSHAVSSC-NH_{2} (SEQ ID NO:18).
Figuras 11A-F son fotografías
que muestran cultivos monocapa de células cancerosas de ovario
humano (SKOV3), en presencia (Figuras 11A y D-F) y
ausencia (Figura 11C) de un péptido cíclico representativo, o en
presencia de un péptido de control inactivo (Figura 11B). La Figura
11A muestra las células 24 horas después de haberlas cultivado en
presencia de 500 \mug/ml de
N-Ac-CHAVC-NH_{2} (ampliación 10x). La
Figura 11B muestra las células (ampliación 10x) 24 horas después de
haberlas cultivado en presencia del péptido de control
N-Ac-CHGVC-NH_{2} (SEQ ID NO:9). La Figura
11C muestra las células (ampliación 10x) en ausencia de péptido
cíclico. Las Figuras 11D-F muestran las células
(ampliación 20x) 48 horas después de la exposición a
N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8) a
concentraciones de 1 mg/ml, 100 \mug/ml y 10 \mug/ml,
respectivamente. Obsérvese que las células SKOV3 se retraen entre
sí y se reúnen cuando se les cultiva en presencia de 0,5 ó 1 mg/ml
de N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8).
Figuras 12A y 12B son fotografías que muestran
cultivos monocapa de células cancerosas de ovario humano (SKOV3),
24 horas después de la exposición a 500 \mug/ml del péptido
cíclico representativo N-Ac-CHAVC-NH_{2}
(SEQ ID NO:8) (Figura 12A), o del péptido de control
N-Ac-CHGVC-NH_{2} (Figura 12B). Obsérvese
que las células SKOV3 se reúnen cuando son cultivadas en presencia
de 0,5 mg/ml de N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID
NO:8).
Figuras 13A-D son fotografías de
cultivos monocapa de células renales de rata normales (NRK), no
tratadas (Figura 13A), o después de 48 horas de exposición a 1
mg/ml de H-CHAVSC-OH (SEQ ID NO:14) (Figura 13B), del
péptido de control N-Ac-CHGVC-NH_{2} (SEQ
ID NO:9) (Figura 13C), o del péptido cíclico representativo
N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8) (Figura
13D). Obsérvese que las células NRK se retraen entre sí cuando son
cultivadas en presencia de
N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8).
Adicionalmente, las células NRK no forman monocapas tipo empedrado
cuando son expuestas a este péptido.
Figuras 14A-D son fotografías de
inmunofluorescencia de los cultivos monocapa de células renales de
rata normales (NRK) que se muestran en las Figuras
13A-D, inmunomarcados para
E-cadherina. La Figura 14A muestra células no
tratadas, y las Figuras 14B-D muestran las células
48 horas después de la exposición a 1 mg/ml de H-CHAVSC-OH
(SEQ ID NO:14) (Figura 14B), del péptido de control
N-Ac-CHGVC-NH_{2} (SEQ ID NO:9) (Figura
14C), o del péptido cíclico representativo
N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8) (Figura
14D). Obsérvese que la expresión de E-cadherina se
halla fuertemente reducida en las células tratadas con
N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8), en
comparación con los niveles de E-cadherina
expresados por células no tratadas y células tratadas con los otros
dos péptidos cíclicos.
Figuras 15A-C son fotografías
que muestran cultivos monocapa de células cancerosas de ovario
humano (OVCAR3) en presencia de diversas concentraciones de un
péptido cíclico representativo. La Figura 15A muestra las células
24 horas después de haber sido cultivadas en presencia de 1 mg/ml de
H-CHAVSC-OH (SEQ ID NO:14). La Figura 15B muestra las
células 24 horas después de haber sido cultivadas en presencia de
100 \mug/ml de H-CHAVSC-OH (SEQ ID NO:14). La Figura 15C
muestra las células 24 horas después de haber sido cultivadas en
presencia de 10 \mug/ml de H-CHAVSC-OH (SEQ ID NO:14).
Obsérvese que las células se retraen entre sí en presencia de 100
\mug/ml de H-CHAVSC-OH (SEQ ID NO:14), en tanto que se
reúnen en presencia de 1 mg/ml de este péptido.
Figuras 16A y B son fotografías que muestran
cultivos de células ME115 de melanoma humano en presencia (Figura
16B) y ausencia (Figura 16A) de un péptido cíclico representativo.
Las células han sido inmunomarcadas para cadherina. La Figura 16B
muestra las células 48 horas después de haber sido cultivadas en
presencia de 500 \mug/ml de
N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8). La Figura
16A muestra cultivos no tratados de células ME115 de melanoma
humano. Obsérvese que cadherina está localizada en vesículas
intracelulares en las células tratadas con el péptido, mientras que
está presente en la superficie en las células no tratadas.
Figuras 17A y B son fotografías que muestran
cultivos monocapa de células epiteliales de mama humana A1N4 en
presencia (Figura 17B) y ausencia (Figura 17A) de un péptido cíclico
representativo. Las células han sido inmunomarcadas para
E-cadherina. La Figura 17B muestra las células 48
horas después de haber sido cultivadas en presencia de 500
\mug/ml de N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID
NO:8). La Figura 17A muestra cultivos monocapa no tratados de
células epiteliales de mama humana A1N4. Obsérvese que la
distribución de E-cadherina es no contigua en las
células tratadas con el péptido cíclico. Adicionalmente, han
aparecido separaciones en la monocapa de células tratadas con el
péptido.
Tal como se ha señalado anteriormente, la
presente invención proporciona, de acuerdo con sus reivindicaciones,
péptidos cíclicos capaces de modular la adhesión celular modulada
por cadherina. Determinados péptidos cíclicos descritos en este
documento inhiben la adhesión celular. Estos péptidos cíclicos se
pueden utilizar, por lo general, por ejemplo, para tratar
enfermedades u otros trastornos que se distinguen por una adhesión
celular no deseada, o para facilitar el suministro de medicamentos
a un tejido específico o a un tumor. De manera alternativa, se
puede utilizar un péptido cíclico, tal como cuando está unido a una
matriz o a otro péptido cíclico a través de un conector
("linker"), para potenciar la adhesión celular. Estos
conjugados de péptido cíclico-matriz se pueden
usar, por ejemplo, para mejorar la adhesión celular (por ejemplo,
para suplementar o sustituir a los puntos de sutura o para
facilitar la cicatrización de heridas), o para potenciar o dirigir
el crecimiento de axones.
La expresión "péptidos cíclicos", tal como
se usa en este documento, se refiere a un péptido o sal del mismo
que comprende (1) un enlace covalente intramolecular entre dos
residuos no adyacentes, y (2) al menos una secuencia de
reconocimiento de adhesión celular por cadherina (CAR). El enlace
intramolecular puede ser un enlace de esqueleto a esqueleto, cadena
lateral a esqueleto, o cadena lateral a cadena lateral (es decir,
los grupos funcionales terminales de un péptido lineal y/o los
grupos funcionales de la cadena lateral de un residuo terminal o
interior pueden estar unidos para alcanzar la ciclación). Enlaces
intramoleculares preferidos incluyen, pero no están limitados a
ellos, enlaces disulfuro, amida y tioéter. Al menos una secuencia
CAR comprende, por lo general, HAV
(His-Ala-Val). Los péptidos cíclicos
pueden contener solamente una secuencia CAR o, adicionalmente,
pueden contener uno o múltiples sitios de unión para moléculas de
adhesión, que pueden ser o no CARs. Estas secuencias adicionales
pueden estar separadas por un conector (es decir, uno o múltiples
péptidos no derivados de una secuencia CAR u otro sitio de unión de
moléculas de adhesión). En una de estas formas de realización, el
péptido cíclico contiene 2 secuencias HAV. En otra forma de
realización, el péptido cíclico contiene una secuencia HAV y una
secuencia CAR, reconocida por una CAM diferente. En una forma de
realización preferida, la segunda secuencia CAR deriva de
fibronectina y es reconocida por una integrina (es decir,
Arg-Gly-Asp; véase Cardarelli et
al., J. Biol. Chem. 267:23159-23164,
1992).
Además de la(s) secuencia(s) CAR,
los péptidos cíclicos comprenden, por lo general, al menos un
residuo adicional, de manera que el tamaño del anillo de péptido
cíclico se encuentra dentro del intervalo de 4 a aprox. 15 residuos,
preferentemente 5 a 10 residuos. Este(os) residuo(s)
adicional(es) puede(n) estar presente(s) en la
extremo N-terminal y/o C-terminal
de una secuencia CAR, y puede(n) derivar de secuencias que
flanquean la secuencia HAV en una o múltiples cadherinas de origen
natural (por ejemplo, N-cadherina,
E-cadherina, P-cadherina,
R-cadherina u otras cadherinas que contienen la
secuencia HAV), con o sin sustituyentes de aminoácidos y/u otras
modificaciones. En la Figura 2 y en las SEQ ID Nos:1 a 7 se
muestran las secuencias de flanqueo para las cadherinas N, E, P y R
endógenas. Los números de acceso a las bases de datos para las
cadherinas de origen natural son los siguientes:
N-cadherina humana, M34064,
N-cadherina de ratón, M31131 y M22556,
N-cadherina bovina X53615,
P-cadherina humana, X63629,
P-cadherina de ratón, X06340,
E-cadherina humana, Z13009,
E-cadherina de ratón, X06115. De manera
alternativa, residuos adicionales presentes en uno o ambos extremos
de la(s) secuencia(s) CAR pueden no estar
relacionados con una secuencia endógena (por ejemplo, residuos que
facilitan la ciclación).
Tal como se discutirá más adelante, en
determinadas formas de realización preferidas, se prefieren péptidos
cíclicos relativamente pequeños, que no contienen secuencias
importantes que flanquean la secuencia HAV, para modular la
adhesión celular mediada por N-cadherina y
E-cadherina. Estos péptidos pueden contener un grupo
N-acetilo y un grupo C-amida (por
ejemplo, el anillo de 5 residuos
N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8) o
N-Ac-KHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:20)). El
hallazgo, dentro de la presente invención, de que estos péptidos
cíclicos relativamente pequeños pueden ser inhibidores eficaces y
multivalentes de la adhesión celular representa un descubrimiento
inesperado. Estos péptidos cíclicos pueden ser considerados
"llaves maestras" que encajan en los sitios de unión peptídica
de cada una de las distintas cadherinas clásicas, y son capaces de
romper la adhesión celular de neuronas, células endoteliales,
células epiteliales y/o ciertas células cancerosas. En general, se
pueden utilizar pequeños péptidos cíclicos para modular de manera
específica la adhesión celular de neuronas y/u otros tipos de
células por medio de la administración tópica o administración
sistémica, con o sin la adición de un agente de acceso al péptido,
tal como se analiza más adelante.
En otras formas de realización preferidas, un
péptido cíclico puede contener secuencias que flanquean la secuencia
HAV en uno o ambos lados, y que han sido diseñadas para conferir
especificidad para la adhesión celular mediada por una o múltiples
cadherinas específicas, y que dan como resultado especificidad
tisular y/o por tipo de célula. Secuencias de flanqueo adecuadas
para conferir especificidad incluyen, sin estar limitadas a ellas,
secuencias endógenas presentes en una o múltiples cadherinas de
origen natural, y los péptidos cíclicos que poseen especificidad se
pueden identificar usando los sistemas de rastreo representativos
que se ofrecen en este documento. Por ejemplo, se ha encontrado,
dentro del contexto de la presente invención, que los péptidos
cíclicos que contienen residuos adicionales, derivados de la
secuencia nativa de E-cadherina, en el extremo
C-terminal de la secuencia CAR, son específicos para
células epiteliales (es decir, estos péptidos rompen la adhesión
celular mediada por E-cadherina en mayor grado que
la expresión de N-cadherina). La adición de
secuencias endógenas apropiadas puede dar como resultado,
igualmente, péptidos que rompan la adhesión celular mediada por
N-cadherina.
Para facilitar la preparación de péptidos
cíclicos con una especificidad deseada, pueden usarse técnicas de
resonancia magnética nuclear (RMN) e informáticas para determinar la
conformación de un péptido que confiere una especificidad conocida.
La RMN se utiliza extensamente en el análisis estructural de
moléculas. Las intensidades máximas cruzadas en los espectros del
efecto nuclear de Overhauser (NOE), las constantes de acoplamiento,
y los desplazamientos químicos dependen de la conformación de un
compuesto. Los datos NOE proporcionan la distancia entre protones n
el espacio y a través del anillo del péptido cíclico. Esta
información se puede utilizar para facilitar el cálculo de la
conformación de energía mínima para la secuencia HAV. A
continuación, la conformación se puede correlacionar con la
especificidad tisular, para permitir la identificación de péptidos
que tengan una especificidad tisular similar, o tengan una
especificidad tisular reforzada.
Los péptidos cíclicos tal como se describen en
este documento pueden comprender residuos de
L-aminoácidos, D-aminoácidos, o
cualquier combinación de los mismos. Los aminoácidos pueden proceder
de fuentes naturales o no naturales, con la condición de que la
molécula contenga al menos un grupo amino y al menos un grupo
carboxilo; generalmente, se prefieren
\alpha-aminoácidos y
\beta-aminoácidos. Los 20
L-aminoácidos normalmente presentes en las
proteínas se identifican en este documento por medio de las
abreviaturas convencionales de tres o una letra, que aparecen en la
Tabla 1, y los D-aminoácidos correspondientes se
designan por medio de un símbolo de una letra minúscula. Asimismo,
un péptido cíclico puede contener uno o múltiples aminoácidos raros
(tales como 4-hidroxiprolina o hidroxilisina),
ácidos o amidas orgánicos y/o derivados de aminoácidos comunes,
tales como aminoácidos que tienen el carboxilato
C-terminal esterificado (por ejemplo, ésteres
bencilo, metilo o etilo) o amidado, y/o que tienen modificaciones
del grupo amino N-terminal (por ejemplo, acetilación
o alcoxicarbonilación), con o sin cualquiera de una extensa
variedad de modificaciones de las cadenas laterales y/o
sustituciones (por ejemplo, metilación, bencilación,
t-butilación, tosilación, alcoxicarbonilación, y
similares). Derivados preferidos incluyen aminoácidos que tienen un
grupo N-acetilo (de manera que el grupo amino que
representa el extremo N del péptido lineal anterior a la ciclación
resultado acetilado) y/o un grupo amida C-terminal
(es decir, el extremo carboxi del péptido lineal antes de la
ciclación resulta amidado). Residuos diferentes de los aminoácidos
comunes que pueden estar presentes con un péptido cíclico incluyen,
pero sin estar limitados a ellos, penicilamina,
\beta,\beta-tetrametilencisteína,
\beta,\beta-pentametilen-cisteína,
ácido \beta-mercaptopropiónico, ácido
\beta,\beta-pentametilen-\beta-mercaptopropiónico,
2-mercapobenceno,
2-mercaptoanilina,
2-mercaptoprolina, ornitina, ácido diaminobutírico,
ácido \alpha-aminoadípico, ácido
m-aminometilbenzoico, y ácido
\alpha,\beta-diaminopropiónico.
\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos cíclicos según la presente
descripción se pueden sintetizar por métodos bien conocidos en la
técnica, incluidos métodos de ADN recombinante y síntesis química.
La síntesis química se puede llevar a cabo, por lo general, usando
técnicas de síntesis de péptidos de fase de solución o de fase
sólida convencionales, en los que se produce un enlace peptídico a
través de la condensación directa del grupo
\alpha-amino de un aminoácido con el grupo
\alpha-carboxi del otro aminoácido, con la
eliminación de una molécula de agua. La síntesis de enlaces
peptídicos por condensación directa, tal como se ha formulado
anteriormente, requiere la supresión del carácter reactivo del
grupo amino del primer aminoácido, y del grupo carboxilo del
segundo. Los sustituyentes de enmascaramiento deben permitir su
separación sencilla, sin inducir la degradación de la molécula
peptídica lábil.
En la síntesis de fase de solución, puede
utilizarse una amplia variedad de métodos de acoplamiento y grupos
protectores (véase Gross y Meienhofer, eds., "The Peptides:
Analysis, Synthesis, Biology", Vol. 1-4
(Academic Press, 1979); Bodansky y Bodansky, "The Practice of
Peptide Synthesis", 2ª edición (Springer Verlag, 1994)).
Adicionalmente, resultan posibles la purificación intermedia y la
ampliación ("scale-up"). Los expertos
en la técnica podrán apreciar que la síntesis en solución requiere
tener en consideración los grupos protectores de la cadena
principal y de la cadena lateral, y el método de activación. Además,
es necesaria una cuidadosa selección del segmento para minimizar la
racemización durante la condensación de segmentos. Asimismo, se han
de tener en cuenta las consideraciones de solubilidad.
La síntesis de péptidos en fase sólida utiliza
un polímero insoluble como soporte durante la síntesis orgánica. La
cadena peptídica soportada por el polímero permite usar etapas
simples de lavado y filtración en lugar de laboriosas
purificaciones en las etapas intermedias. La síntesis de péptidos en
fase sólida puede llevarse a cabo, por lo general, de acuerdo con
el método de Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc.
85:2149, 1963, que implica ensamblar una cadena peptídica lineal
sobre un soporte de resina, utilizando aminoácidos protegidos. La
síntesis de péptidos en fase sólida usa, típicamente, la estrategia
Boc o Fmoc. La estrategia Boc utiliza una resina de poliestireno
reticulada al 1%. El grupo protector estándar para las funciones
\alpha-amino es el grupo
terc-butoxicarbonilo (Boc). Este grupo se puede
separar con soluciones diluidas de ácidos fuertes tales como ácido
trifluoroacético (TFA) al 25%. El siguiente
Boc-aminoácido se acopla, típicamente, a la resina
de aminoacilo usando diciclohexilcarbodiimida (DCC). Después de
finalizar el ensamblaje, el complejo de
péptido-resina se trata con HF anhidro para
escindir el enlace éster bencílico y libera el péptido libre. Los
grupos funcionales de la cadena lateral están habitualmente
bloqueados durante la síntesis por grupos de bloqueo derivados de
bencilo, que también son escindidos por HF. A continuación, se
extrae el péptido libre de la resina con un disolvente apropiado,
se purifica y caracteriza. Péptidos recientemente sintetizados
pueden ser purificados, por ejemplo, por filtración sobre gel,
HPLC, cromatografía de partición y/o cromatografía de intercambio
iónico, y puede ser caracterizado, por ejemplo, por espectrometría
de masa o análisis de secuencia de aminoácidos. En la estrategia
Boc, pueden obtenerse péptidos amidados en el extremo
C-terminal usando resinas de benzilhidrilamina o
metilbenzilhidrilamina, que rinden amidas peptídicas directamente
tras la escisión
con HF.
con HF.
En los procedimientos anteriormente discutidos,
la selectividad de los grupos de bloqueo de la cadena lateral y de
la unión péptido-resina depende de las diferencias
de velocidad de escisión acidolítica. Se han introducido sistemas
Orthoganol, en los que los grupos de bloqueo de la cadena
lateral y la unión péptido-resina son completamente
estables frente al reactivo utilizado para separar el grupo
\alpha-protector en cada etapa de la síntesis. El
más frecuente de estos métodos comprende el procedimiento de
9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc). En este
método, los grupos protectores de la cadena lateral y la unión
péptido-resina son completamente estables frente a
las aminas secundarias utilizadas para escindir el grupo
N-\alpha-Fmoc. La protección de
la cadena lateral y la unión péptido-resina se
escinden por acidólisis suave. El contacto repetido con una base
hace que la resina de Merrifield no resulte adecuada para el método
Fmoc, y se utilizan, por lo general, ésteres de
p-alcoxibencilo. La desprotección y la escisión se
llevan a cabo, normalmente, usando TFA.
Los expertos en la técnica reconocerán que, en
la síntesis en fase sólida, las reacciones de desprotección y de
acoplamiento deben ir dirigidas a la compleción, y que los grupos
protectores de la cadena lateral deben ser estables durante la
totalidad de la síntesis. Adicionalmente, la síntesis en fase sólida
es, por lo general, la más apropiada cuando los péptidos se deben
producir a pequeña escala.
La acetilación del extremo
N-terminal se debe llevar a cabo haciendo reaccionar
el péptido final con anhídrido acético antes de la escisión de la
resina. La C-amidación se efectúa usando una resina
apropiada tal como la resina metilbenzilhidrilamina, utilizando la
tecnología Boc.
Después de la síntesis de un péptido lineal, con
o sin N-acetilación y/o C-amidación,
se puede realizar la ciclación por cualquiera de diversos métodos
bien conocidos en la técnica. En una forma de realización, se puede
generar un enlace entre cadenas laterales reactivas de aminoácidos.
Por ejemplo, se puede formar un enlace disulfuro desde un péptido
lineal que comprende dos residuos que comprenden tiol, por la
oxidación del péptido usando cualquiera de diversos métodos. En uno
de esos métodos, la oxidación con aire de los tioles puede generar
enlaces disulfuro durante un período de varios días, utilizando
medios acuosos tanto básicos como neutros. El péptido se utiliza en
una elevada dilución para minimizar la agregación y las reacciones
secundarias intermoleculares. Este método adolece del inconveniente
de ser lento, pero muestra la ventaja se producir únicamente
H_{2}O como producto secundario. Alternativamente, pueden usarse
agentes oxidantes fuertes tales como I_{2} y
K_{3}Fe(CN)_{6} para formar enlaces disulfuro. Los
expertos en la técnica reconocerán que se debe actuar con
precaución para no oxidar las cadenas laterales sensibles de Met,
Tyr, Trp o His. Los péptidos cíclicos producidos por este método
requieren purificación por medio de diversas técnicas, pero esta
oxidación es aplicable a pH ácidos. A modo de ejemplo, se pueden
utilizar agentes oxidantes fuertes para llevar a cabo la ciclación
que se muestra más adelante (SEQ ID Nos:33 y 34), en la que se cicla
la porción
subrayada:
subrayada:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Los agentes oxidantes permiten también la
desprotección/oxidación simultánea de precursores lineales
protegidos con S, para evitar una oxidación prematura e
inespecífica de la cisteína libre, tal como se muestra a
continuación (SEQ ID Nos: 35 y 36), en donde X e Y =
S-Trt o S-Acm:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
DMSO, a diferencia de I_{2} y
K_{3}Fe(CN)_{6}, es un agente oxidante suave que
no produce reacciones secundarias oxidativas de los aminoácidos
nucleófilos mencionados más arriba. DMSO es miscible con H_{2}O a
cualquier concentración, y las oxidaciones se pueden llevar a cabo a
pH ácido hasta neutro, con productos secundarios inocuos. De forma
alternativa, se puede utilizar
metiltriclorosilano-difenilsulfóxido como agente
oxidante, para la desprotección/oxidación simultánea de
S-Acm, S-Tacm o
S-t-Bu de cisteína, sin afectar a
otros aminoácidos nucleófilos. No se generan productos polímeros
como resultado de la formación de enlaces disulfuro. En el ejemplo
siguiente (SEQ ID Nos:37 y 38), X es Acm, Tacm o
t-Bu:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Residuos que contienen tiol, adecuados para ser
utilizados en estos métodos de oxidación, incluyen, pero sin estar
limitados a ellos, cisteína, \beta,\beta-dimetil
cisteína (penicilamina o Pen),
\beta,\beta-tetrametilen cisteína (Tmc),
\beta,\beta-pentametilen cisteína (Pmc), ácido
\beta-mercaptopropiónico (Mpr),
ácido\beta,\beta-pentametilen-\beta-mercaptopropiónico
(Pmp), 2-mercaptobenceno,
2-mercaptoanilina y
2-mercaptoprolina. Las siguientes fórmulas
representativas ilustran péptidos que contienen tales residuos, en
los que la porción subrayada está ciclada, los grupos
N-acetilo están indicados por N-Ac,
y los grupos amina C-terminales se representan con
-NH_{2}:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para los expertos en la técnica, resultará
fácilmente evidente que, dentro de cada una de estas fórmulas
representativas, se puede emplear cualquiera de los residuos que
contienen tiol en lugar de uno o ambos residuos que contienen tiol
mencionados.
En una forma de realización adicional, se puede
obtener la ciclación por formación de enlaces amida. Por ejemplo,
se puede formar un enlace peptídico entre grupos funcionales
terminales (es decir, los extremos amino y carboxi de un péptido
lineal, antes de la ciclación). Dos de estos péptidos son
AHAVDI (SEQ ID NO:44) y SHAVSS (SEQ ID NO:45), con o
sin un grupo acetilo N-terminal y/o una amida
C-terminal. En otra de estas formas de realización,
el péptido lineal comprende un D-aminoácido (por
ejemplo, HAVsS). Alternativamente, la ciclación se puede
lograr enlazando un extremo terminal y una cadena lateral del
residuo, o utilizando dos cadenas laterales, tal como en
KHAVD (SEQ ID NO:20) o KSHAVSSD (SEQ ID NO:46), con o
sin un grupo acetilo N-terminal y/o una amida
C-terminal. Residuos capaces de formar un enlace
lactámico incluyen lisina, ornitina (Orn), ácido
\alpha-amino adípico, ácido
m-aminometilbenzoico, ácido
\alpha,\beta-diaminopropiónico, glutamato o
aspartato.
Los métodos para formar enlaces amida son bien
conocidos en la técnica, y se basan en principios suficientemente
establecidos de reactividad química. En uno de tales métodos, la
formación de lactama mediada por carbodiimida se puede alcanzar por
la reacción de un ácido carboxílico con DCC, DIC, EDAC o DCCI, dando
como resultado la formación de una O-acilurea que
se puede hacer reaccionar de inmediato con el grupo amino libre para
completar la ciclación. La formación de la
N-acilurea inactiva, consecuencia de la migración O
\rightarrow N, se puede obviar mediante la conversión de la
O-acilurea en un éster activo por medio de la
reacción con un N-hidroxicompuesto tal como
1-hidroxibenzotriazol,
1-hidroxisuccinimida,
1-hidroxinorborneno carboxamida, o
2-hidroxiiino-2-cianoacetato
etílico. Además, para minimizar la migración O \rightarrow N,
estos aditivos actúan también como catalizadores durante la
ciclación y contribuyen a reducir la racemización. De manera
alternativa, la ciclación se puede llevar a cabo usando el método
de azida, en el cual se genera una azida reactiva intermedia a
partir de un éster alquílico a través de una hidrazida. La
hidrazinólisis del éster terminal requiere del uso de un grupo
t-butilo para la protección de las funciones
carboxilo de la cadena lateral en el componente de acilación. Esta
limitación se puede superar mediante el uso de ácido
difenilfosforílico (DPPA), que proporciona una azida directamente
tras la reacción con un grupo carboxilo. La lenta reactividad de las
azidas y la formación de isocianatos por su desproporcionación
restringen la utilidad de este método. El método de anhídrido mixto
de formación de lactama se utiliza extensamente debido a la sencilla
separación de los productos secundarios de la reacción. El
anhídrido se forma tras la reacción del anión carboxilato con un
cloroformiato alquílico o cloruro de pivaloílo. El ataque del
componente amino se conduce, entonces, al carbono carbonilo del
componente de acilación por medio del efecto de donación de
electrón del grupo alcoxi o por la masa estérica del grupo cloruro
t-butilo de pivaloílo, que obstruye el ataque sobre
el grupo carbonilo equivocado. También se han utilizado con éxito
anhídridos mixtos con derivados del ácido fosfórico. De modo
alternativo, la ciclación se puede conseguir usando ésteres
activados. La presencia de sustituyentes que retiran electrones en
el carbono alcoxi de ésteres aumenta su susceptibilidad a la
aminólisis. La elevada reactividad de los ésteres de
p-nitrofenol, los
N-hidroxicompuestos y de los fenoles polihalogenados
ha hecho que estos "ésteres activos" sean útiles de la
síntesis de enlaces amino. En los últimos años, se ha asistido al
desarrollo del hexafluorofosfonato de
benzotriazoliloxi-tris-(dimetilamino)-fosfonio
(BOP) y sus congéneres como reactivos de acoplamiento convenientes.
Su rendimiento es, por lo general, superior al de otras reacciones
de formación de enlaces de carbodiimida amida bien
establecidas.
establecidas.
En una forma de realización adicional, es
posible formar un enlace tioéter entre la cadena lateral de un
residuo que contiene tiol y un \alpha-aminoácido
adecuadamente derivatizado. A modo de ejemplo, se puede acoplar una
cadena lateral de lisina al ácido bromoacético a través del método
de acoplamiento de carbodiimida (DCC, EDAC) y, a continuación,
hacerla reaccionar con la cadena lateral de cualquiera de los
residuos que contienen tiol, mencionados anteriormente, para formar
un enlace tioéter. Con el fin de formar ditioéteres, se pueden
hacer reaccionar dos cadenas laterales cualquiera que contengan tiol
con dibromometano y diisopropilamina en DMF. A continuación, se
muestran ejemplos de enlaces que contienen tiol:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
La ciclación se puede conseguir también usando
\delta_{1},\delta_{1}-ditriptófano (es
decir,
Ac-Trp-Gly-Gly-Trp-OMe)
(SEQ ID NO:39), tal como se muestra a continuación:
En la Figura 3 se ofrecen estructuras
representativas de péptidos cíclicos. En la Figura 3, determinados
péptidos cíclicos que tienen la capacidad para modular la adhesión
celular (que se muestran a la izquierda), se acoplan con
estructuras similares inactivas (a la derecha). Las estructuras y
fórmulas mencionadas en la misma se ofrecen exclusivamente con
fines de ilustración, y en ningún caso pretenden limitar el alcance
de los péptidos cíclicos descritos en este documento.
Tal como se ha señalado anteriormente, los
péptidos cíclicos como los descritos en este documento son capaces
de modular (es decir, potenciar o inhibir) la adhesión celular
mediada por cadherina. En general, la capacidad de un péptido para
modular la adhesión celular se puede evaluar in vitro,
analizando el efecto del péptido cíclico sobre uno o múltiples de
los siguientes factores: (1) crecimiento axonal; (2) adhesión entre
células endoteliales, (3) adhesión entre células epiteliales (por
ejemplo, células renales normales de rata y/o de la piel humana),
y/o (4) adhesión entre células cancerosas. A los efectos de estos
ensayos, se evalúan por lo general péptidos que no están unidos a
un material de soporte o a otro compuesto (tal como se describe más
adelante). En general, se considera que un péptido cíclico es un
modulador de la adhesión celular si, dentro de uno o múltiples de
estos ensayos, el contacto de las células de ensayo con el péptido
da como resultado una disrupción discernible de la adhesión
celular.
En un ensayo representativo del crecimiento
axonal, se pueden cultivar neuronas en una monocapa celular (por
ejemplo, 3T3) que expresan N-cadherina. Las neuronas
cultivadas sobre tales células (bajo las condiciones adecuadas y
durante un período de tiempo suficiente) desarrollan axones de mayor
longitud que las neuronas cultivadas sobre células que no expresan
N-cadherina. Un péptido cíclico que module la
adhesión celular mediada por cadherina puede inhibir este
crecimiento axonal. Las condiciones apropiadas de crecimiento para
neuronas cerebelares incluyen crecimiento durante aproximadamente
18 horas en medio SATO/SBF (suero bovino fetal) al 2%. Bajo tales
condiciones, la presencia de 500 \mug/ml de péptido cíclico es
suficiente para romper la adhesión celular entre neuronas, según se
determina por un descenso de la longitud media del axón de al menos
50%, en relación con la longitud en ausencia del péptido cíclico, o
en presencia de un péptido de control negativo.
En un ensayo representativo de adhesión celular,
la adición de un péptido cíclico a células que expresan una
cadherina tiene como resultado la disrupción de la adhesión celular.
Una "célula que expresa cadherina", según se utiliza en este
documento, puede ser cualquier tipo de célula que expresa al menos
una cadherina en la superficie celular a un nivel detectable,
utilizando técnicas convencionales tales como protocolos
inmunoquímicos (Blaschuk y Farookhim, Dev. Biol.
136:564-567, 1989). Células que expresan cadherina
incluyen células endoteliales (por ejemplo, células endoteliales de
la arteria pulmonar bovina), células epiteliales y/o cancerosas
(por ejemplo, la línea de células cancerosas del ovario humano SKOV3
(ATCC nº HTB-77)). Por ejemplo, estas células se
pueden cultivar en placa bajo condiciones convencionales que
permiten la adhesión celular, en presencia y en ausencia del
péptido cíclico (por ejemplo, 500 \mug/ml). La disrupción de la
adhesión celular se puede determinar visualmente en el plazo de 24
horas, observando la retracción de las células entre sí.
En otro ensayo de este tipo, es posible evaluar
el efecto de un péptido cíclico sobre las células renales de rata
normales (NRK-52E; ATCC nº
1571-CRL). En ausencia del péptido cíclico, las
células NRK desarrollan monocapas estrechamente adherentes
características, con morfología de empedrado, en las que las células
exhiben un aspecto poligonal. Las células NRK tratadas con un
péptido cíclico adoptan, típicamente, una morfología no poligonal y
alargada (es decir, un aspecto similar al del fibroblasto) dentro de
las 48 horas siguientes al tratamiento con 1 mg/ml de péptido. En
los cultivos confluentes de estas células aparecen separaciones.
Adicionalmente, 1 mg/ml de dicho péptido induce, de manera
reproducible, una reducción rápidamente manifiesta de la tinción en
la superficie celular de E-cadherina, según se
evalúa por microscopia de inmunofluorescencia (Laird et al.,
J. Cell Biol. 131:1193-1203, 1995) de al
menos 75% en 48 horas.
Un tercer ensayo de adhesión celular comprende
evaluar el efecto de un péptido cíclico sobre la permeabilidad de
capas de células epiteliales y/o endoteliales adherentes. Por
ejemplo, se puede evaluar el efecto de la permeabilidad sobre la
piel humana. La piel puede ser derivada de fuentes naturales o puede
ser sintética. La piel de abdomen humano usada en estos ensayos
puede obtenerse, por lo general, de autopsias dentro de las 24
horas siguientes a la muerte. En pocas palabras, pueden disolverse
un péptido cíclico y una marca de ensayo (por ejemplo, las marcas
fluorescentes Oregon Green® y Rhodamine Green®, Dextran) en un
tampón estéril, y la capacidad de la marca para penetrar a través
de la piel y en el líquido receptor puede ser medida usando un
dispositivo Franz Cell (Franz, Curr. Prob. Dermatol.
7:58-68, 1978; Franz, J. Invest. Dermatol.
64:190-195, 1975). En general, un péptido cíclico
que potencia la permeabilidad de la piel humana da como resultado
un incremento estadísticamente significativo de la cantidad de marca
en el compartimento receptor después de 6-48 horas,
en presencia de 500 \mug/ml de péptido.
Un péptido cíclico, de acuerdo con la presente
descripción, puede, pero no necesita, estar unido a una o múltiples
moléculas adicionales. Por ejemplo, dos o más péptidos cíclicos
pueden unirse entre sí utilizando técnicas bien conocidas, como se
discute más adelante. En ciertas formas de realización, los péptidos
cíclicos unidos pueden contener secuencias HAV y pueden estar
reunidos por un conector, que puede ser una secuencia peptídica y/o
no peptídica. Preferentemente, el conector genera una distancia de
separación entre los sitios de reconocimiento de
50-200\mu. Un conector que se puede utilizar con
tales fines es H_{2}N(CH_{2})_{n}CO_{2}H, o
derivados del mismo, en donde n se encuentra en el intervalo de
1-10. Para los expertos en la técnica resultarán
evidentes otros conectores que se pueden utilizar. Los péptidos
cíclicos unidos de este modo se pueden utilizar, por lo general, en
métodos en los que se desea potenciar la adhesión celular mediada
por cadherina.
De manera alternativa, un péptido cíclico según
la presente descripción se puede unir a una molécula que comprende
una secuencia de reconocimiento de adhesión celular para una
molécula de adhesión diferente (incluidas, pero no limitadas a
CAMs), separadas preferentemente por un conector. Tal como se usa en
este documento, una "molécula de adhesión" es cualquier
molécula que media la adhesión celular a través de un receptor en la
superficie de la célula. Moléculas de adhesión incluyen proteínas
de adhesión celular (tales como integrinas y miembros de la
superfamilia génica de las inmunoglobulinas, tales como
N-CAM, así como la proteína de la matriz
extracelular), tales como laminina, fibronectina, colágenos,
vitronectina y tenascina. Secuencias de reconocimiento de adhesión
celular preferidas para unirse a un péptido cíclico incluyen
Arg-Gly-Asp, que está fijada por
integrinas, y
Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg
(SEQ ID NO:47), que está fijada por lamininas. Los péptidos cíclicos
unidos a estas moléculas (que pueden ser, asimismo, cíclicas) se
pueden utilizar en métodos en los que resulta deseable romper la
adhesión celular mediada por múltiples moléculas de adhesión.
Adicionalmente, tal como se analiza más
adelante, para determinadas aplicaciones puede ser beneficioso unir
uno o múltiples péptidos cíclicos a un gel o a un material de
soporte sólido, tal como una matriz polímera (que puede estar
formulada como una membrana o microestructura tal como una película
ultrafina), una superficie contenedora (por ejemplo, la superficie
de una placa de cultivo tisular o la superficie interior de un
biorreactor), o una perla u otra partícula que se puede preparar a
partir de una variedad de materiales, incluidos vidrio, plástico o
cerámica. Para ciertas aplicaciones, se prefieren materiales de
soporte biodegradables tales como celulosa y sus derivados,
colágeno o cualquiera de una variedad de poliésteres (por ejemplo,
los derivados de hidroxiácidos y/o lactonas), seda de araña o
suturas (véase la Patente de EE.UU. Nº 5.245.012). Los métodos
adecuados para unir un péptido cíclico a un material de soporte
dependerán de la composición del soporte y del uso previsto, y
resultarán evidentes para los expertos en la técnica. Por lo
general, el enlace se consigue por asociación no covalente tal como
adsorción o afinidad o, preferentemente, a través de un enlace
covalente (que puede ser un enlace directo entre un péptido cíclico
y grupos funcionales del soporte, o puede ser un enlace por medio
de un agente de reticulación). El enlace de un péptido cíclico por
adsorción puede alcanzarse por contacto, en un tampón apropiado,
con un soporte sólido durante un período de tiempo adecuado. El
tiempo de contacto varía con la temperatura, pero generalmente es
de aproximadamente 5 segundos a 1 día y, típicamente, está
comprendido entre aproximadamente 10 segundos y 1 hora.
El enlace covalente de un péptido cíclico a un
soporte sólido se puede lograr, por lo general, haciendo reaccionar,
en primer lugar, el soporte con un conector o un reactivo
bifuncional que reaccione tanto con el soporte como con un grupo
funcional, tal como un grupo hidroxilo o amino, en el péptido
cíclico. Por ejemplo, se puede unir un péptido cíclico a un soporte
o recubrimiento polímero apropiado usando benzoquinona, por
condensación de un grupo aldehído sobre el soporte con una amina y
un hidrógeno activo en el péptido cíclico, o por condensación de un
grupo amino en el soporte con un ácido carboxílico en el péptido
cíclico. Un método preferido para generar un enlace es a través de
los grupos amino, utilizando glutaraldehído. Un péptido cíclico
puede unirse a la celulosa a través de enlaces éster. De forma
similar, los enlaces éster pueden ser adecuados para otros
materiales de soporte tal como hemocianina del tipo "keyhole
limpet".
Aun cuando los péptidos cíclicos según la
presente descripción pueden unirse, preferentemente, a tejidos o
células específicas y, de este modo, pueden ser suficientes para
acceder a un sitio deseado in vivo, para determinadas
aplicaciones puede resultar deseable incluir un agente de acceso
adicional. En consecuencia, un agente de acceso puede estar unido
también, o alternativamente, a un péptido cíclico para facilitar el
acceso a uno o múltiples tejidos específicos. Tal como se usa en
este documento, un "agente de acceso" ("targeting
agent") puede ser cualquier sustancia (tal como un compuesto
o una célula) que, cuando se une a un péptido, potencia el
transporte del péptido a un tejido diana, aumentando, de esta forma,
la concentración local del péptido cíclico. Los agentes de acceso
incluyen anticuerpos o fragmentos de los mismos, receptores,
ligandos y otras moléculas que se fijan a las células del, o
próximas al tejido diana. Agentes de acceso conocidos incluyen
hormonas, anticuerpos contra antígenos de la superficie celular,
lectinas, moléculas de adhesión, ligandos que se fijan a la
superficie de células tumorales, esteroides, colesterol,
linfoquinas, enzimas fibrinolíticas y otros medicamentos y
proteínas que se unen a un sitio diana deseado. Entre los numerosos
anticuerpos monoclonales que pueden servir como agentes de acceso
se encuentran los anti-TAC, u otros anticuerpos
contra el receptor de interleuquina-2; 9.2.27 y
NR-ML-05, reactivos con el
proteoglicano de 250 kilodalton asociado al melanoma humano; y
NR-LU-10, reactivo con una
glicoproteína pancarcinoma. El anticuerpo usado en la presente
invención puede ser una molécula intacta (completa), un fragmento
de la misma, o un equivalente funcional de ella. Ejemplos de
fragmentos de anticuerpos son los fragmentos F(ab')2, -Fab y
F[v], que se pueden fabricar con métodos convencionales, o
por ingeniería genética o de proteínas. El enlace se puede efectuar
a través de cualquier enlace covalente, usando métodos estándares
bien conocidos en la técnica. Este enlace es, generalmente,
covalente y se puede lograr, por ejemplo, por condensación directa
u otras reacciones, o mediante conectores bi- o
multifuncionales.
Para ciertas formas de realización, puede ser
beneficioso enlazar también, o alternativamente, un medicamento a
un péptido cíclico. Tal como se usa en este documento,
"medicamento" hace referencia a cualquier agente bioactivo
previsto para ser administrado a un mamífero para prevenir o tratar
una enfermedad u otro estado no deseado. Los medicamentos incluyen
hormonas, factores de crecimiento, proteínas, péptidos y otros
compuestos. Más adelante, se analiza el uso de determinados
medicamentos específicos en el contexto de la presente
invención.
En ciertos aspectos de la presente invención,
uno o múltiples péptidos cíclicos, según la presente descripción,
pueden estar presentes en una composición farmacéutica. Una
composición farmacéutica comprende uno o múltiples péptidos
cíclicos en combinación con uno o múltiples vehículos, diluyentes o
excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables. Tales
composiciones pueden incluir tampones (por ejemplo, solución salina
tamponada neutra o solución salina con tampón fosfato), hidratos de
carbono (por ejemplo, glucosa, manosa, sacarosa o dextranos),
manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina,
antioxidantes, agentes quelantes tales como EDTA o glutatión,
coadyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio) y/o conservantes.
Dentro de todavía otras formas de realización, las composiciones
según la presente invención pueden estar formuladas en forma de
liofilizados. Un péptido cíclico (solo o en combinación con un
agente de acceso y/o medicamento) puede, pero no necesita estar
encapsulado con liposomas, usando una tecnología bien conocida. Las
composiciones de la presente invención pueden ser formuladas para
cualquier forma apropiada de administración, incluida, por ejemplo,
la administración tópica, oral, nasal, intravenosa, intracraneal,
intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. Para determinadas
aplicaciones tópicas, se prefiere la formulación en forma de crema o
loción, utilizando componentes bien conocidos.
Asimismo, una composición farmacéutica puede
contener uno o múltiples medicamentos, que pueden estar unidos a un
péptido cíclico o pueden estar libres dentro de la composición.
Prácticamente, se puede administrar cualquier medicamento en
combinación con un péptido cíclico según la presente descripción,
para una variedad de propósitos, según se describe más adelante.
Ejemplos de tipos de medicamentos que pueden ser administrados con
un péptido cíclico incluyen analgésicos, anestésicos,
antianginosos, antifúngicos, antibióticos, medicamentos
anticancerosos (por ejemplo, taxol o mitomicina C),
antiinflamatorios (por ejemplo, ibuprofeno e indometacina),
antihelmínticos, antidepresivos, antídotos, antieméticos,
antihistamínicos, antihipertensivos, productos contra la malaria,
agentes anti-microtúbulos (por ejemplo, colchicina o
alcaloides de vinca), agentes antimigrañosos, antimicrobianos,
antipsicóticos, antipiréticos, antisépticos, agentes
anti-señalización (por ejemplo, inhibidores de la
protein quinasa C o inhibidores de la movilización intracelular de
calcio), antiartríticos, agentes antitrombina, antituberculosos,
antitusivos, antivirales, inhibidores del apetito, medicamentos
cardioactivos, medicamentos contra dependencias químicas,
catárticos, agentes quimioterapéuticos, vasodilatadores coronarios,
cerebrales o periféricos, anticonceptivos, depresores, diuréticos,
expectorantes, factores de crecimiento, agentes hormonales,
hipnóticos, inmunosupresores, antagonistas de narcóticos,
parasimpatomiméticos, sedantes, estimulantes, simpatomiméticos,
toxinas (por ejemplo, toxina del cólera), tranquilizantes, y
antiinfecciosos urinarios.
Para la obtención de imágenes, se puede
incorporar cualquiera de una variedad de agentes diagnósticos en una
composición farmacéutica, ya sea unido a un péptido cíclico o libre
dentro de la composición. Agentes diagnósticos incluyen cualquier
sustancia administrada para destacar una función fisiológica en el
interior de un paciente, sin afectar simultáneamente, por lo
general, a otras funciones fisiológicas. Los agentes diagnósticos
incluyen metales, isótopos radiactivos y agentes
radio-opacos (por ejemplo, galio, tecnecio, indio,
estroncio, yodo, bario, bromo y compuestos que contienen fósforo),
agentes radiolucentes, agentes de contraste, tinciones (por
ejemplo, tinciones fluorescentes y cromóforos), y enzimas que
catalizan una reacción colorimétrica o fluorométrica. En general,
estos agentes se pueden unir usando diversas técnicas, según se ha
descrito anteriormente, y pueden estar presentes en cualquier
orientación.
orientación.
Las composiciones descritas en este documento se
pueden administrar como parte de una formulación de liberación
sostenida (es decir, una formulación tal como una cápsula o esponja
que lleva a cabo una liberación lenta del péptido cíclico tras su
administración). Estas formulaciones se pueden preparar,
generalmente, usando una tecnología bien conocida, y se pueden
administrar, por ejemplo, por vía oral, rectal o implante
subcutáneo, o por implante en el sitio diana deseado. Las
formulaciones de liberación sostenida pueden contener un péptido
cíclico disperso en una matriz portadora y/o estar contenidos en un
depósito rodeado por una membrana que controla la velocidad (véase,
por ejemplo, la Solicitud de Patente Europea 710.491 A). Los
vehículos utilizados con tales formulaciones son biocompatibles y
pueden ser, también biodegradables; preferentemente, la formulación
proporciona un nivel relativamente constante de liberación del
péptido cíclico. La cantidad de péptido cíclico contenido en una
formulación de liberación sostenida depende del sitio de implante,
de la velocidad y de la duración esperada de liberación, así como
de la naturaleza del trastorno que se debe tratar o prevenir.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención se pueden administrar de una manera apropiada para la
enfermedad que se debe tratar (o prevenir). Las dosificaciones
apropiadas y la duración y frecuencia de administración estarán
determinadas por factores tales como el estado del paciente, el tipo
y gravedad de la enfermedad del paciente, y del método de
administración. En general, una dosificación y un régimen de
tratamiento apropiados aporta el (los) péptidos cíclicos en
cantidad suficiente para proporcionar un beneficios terapéutico y/o
profiláctico. En formas de realización especialmente preferidas de
la invención, se puede administrar un péptido cíclico o composición
farmacéutica según la presente descripción, a una dosificación
dentro del intervalo de 0,001 a 50 mg/kg de peso corporal,
preferentemente de 0,1 a 20 mg/kg, en un régimen de dosis diarias
única o múltiples. Para la administración tópica, una crema
comprende, típicamente, una cantidad de péptido cíclico dentro del
intervalo de 0,00001% a 1%, preferentemente 0,0001% a 0,002%. Las
composiciones líquidas contienen, típicamente, alrededor de 10
ng/ml a 5 mg/ml, preferentemente desde alrededor de 10 \mug hasta
2 mg/ml de péptido cíclico. Las dosificaciones apropiadas pueden
determinarse, por lo general, usando modelos experimentales y/o
ensayos clínicos. En general, se prefiere utilizar la dosificación
mínima que resulta suficiente para proporcionar una terapia eficaz.
Por lo general, se puede monitorizar la eficacia terapéutica en los
pacientes utilizando ensayos apropiados para el trastorno que se
está tratando o previniendo, que resultarán familiares para los
expertos en la técnica.
En general, los péptidos cíclicos y las
composiciones que se describen en este documento se pueden utilizar
para modular la adhesión de células que expresan cadherina (es
decir, células que expresan una o múltiples de
E-cadherina, N-cadherina,
P-cadherina, R-cadherina y/u
otra(s) cadherina(s) que contiene(n) la
secuencia HAV, incluidas cadherinas aún no descubiertas), in
vitro y/o in vivo. En general, los métodos descritos en
este documento presentan una ventaja con respecto a técnicas
anteriores, en el sentido de que permiten el paso de moléculas de
gran tamaño y/o cargadas a través de barreras de células que
expresan cadherina. Tal como se analiza más detalladamente más
adelante, los péptidos cíclicos según la presente descripción, se
pueden utilizar también para romper o potenciar la adhesión celular
en una variedad de otros contextos adicionales. Dentro de los
métodos descritos en este documento, se puede administrar uno o
múltiples péptidos cíclicos, solos o en una composición
farmacéutica. En cada método específico descrito en este documento,
tal como se ha señalado anteriormente, puede utilizarse un agente
de acceso para aumentar la concentración local del péptido cíclico
en el sitio diana.
En uno de tales aspectos, la presente invención
proporciona péptidos para reducir una adhesión celular indeseada,
mediante la administración de un péptido cíclico según esta
descripción. La adhesión celular indeseada puede producirse entre
células tumorales, entre células tumorales y células normales, o
entre células normales, como resultado de una cirugía, lesión,
quimioterapia, enfermedad, inflamación u otro trastorno que ponga en
peligro la viabilidad o función celular. Péptidos cíclicos
preferidos para ser utilizados en estos métodos incluyen
N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8),
N-Ac-CHAVSC-NH_{2} (SEQ ID NO:14),
N-Ac-CAHAVDC-NH_{2} (SEQ ID NO:16),
N-Ac-CSHAVSSC-NH_{2} (SEQ ID NO:18), y
N-Ac-KHAVD-NH_{2} (SEQ ID NO:20). En
general, se prefiere la administración tópica del (los)
péptido(s) cíclico(s), pero también pueden emplearse
otras vías. Preferentemente, una composición líquida para la
administración tópica (que comprende, por ejemplo, solución salina
fisiológica) comprende una cantidad de péptido cíclico según se ha
descrito anteriormente y, más preferentemente, una cantidad en el
intervalo de 10 \mug/ml y 1 mg/ml. Por lo general, se pueden
formular cremas según se ha descrito anteriormente. La
administración tópica en el campo quirúrgico se puede efectuar en
una sola oportunidad, al final de la intervención, por irrigación
de la herida, como una irrigación intermitente o continua con el
uso de drenajes quirúrgicos en el postoperatorio, o utilizando
drenajes insertados específicamente en la zona de la inflamación,
lesión o enfermedad, en aquellos casos en que no se requiere llevar
a cabo una operación quirúrgica. De manera alternativa, se puede
emplear la administración parenteral o transcutánea para alcanzar
resultados similares.
En un aspecto adicional, se proporcionan
péptidos para potenciar el suministro de un medicamento a través de
la piel de un mamífero. El suministro transdérmico de medicamentos
representa un método conveniente y no invasivo que se puede
utilizar para mantener niveles relativamente constantes en sangre de
un medicamento. En general, para facilitar el suministro del
medicamento a través de la piel, es necesario alterar la adhesión
entre las células epiteliales (queratinocitos) y las células
endoteliales de la red microvascular. Con el uso de técnicas
disponibles en la actualidad, sólo es posible suministrar, in
vivo, a través de la piel moléculas pequeñas y exentas de
carga. Los métodos descritos en este documento no se encuentran
sometidos al mismo grado de limitación. En consecuencia, resulta
posible transportar una extensa variedad de medicamentos a través
de las capas de células epiteliales y endoteliales de la piel, para
la administración sistémica o tópica. Estos medicamentos se pueden
suministrar a melanomas, o pueden penetrar en el torrente sanguíneo
del mamífero para distribuirse a otros sitios del organismo.
Para potenciar el suministro de un medicamento a
través de la piel, se hacen contactar un péptido cíclico, según la
presente descripción, y un medicamento con la superficie cutánea.
Péptidos cíclicos preferidos para ser usados en dichos métodos
comprenden un grupo N-acetilo, según se ha descrito
anteriormente, tal como N-Ac-CHAVC-NH_{2}
(SEQ ID NO:8). El contacto se puede lograr por la aplicación directa
del péptido cíclico, generalmente dentro de una composición
formulada como crema o gel, o utilizando uno cualquiera de los
diversos dispositivos de contacto cutáneo para la administración
transdérmica (tales como los descritos en la Solicitud de Patente
Europea Nº 566.816 A; patente de EE.UU. Nº 5.613.958; Patente de
EE.UU. Nº 5.505.956). Un parche cutáneo representa un método
conveniente de administración (en especial, para formulaciones de
liberación lenta). Estos parches pueden contener un depósito de
péptido cíclico y medicamento, separado de la piel por una membrana
a través de la cual difunde el medicamento. En otros diseños de
parches, el péptido cíclico y el medicamento pueden estar disueltos
o suspendidos en un polímero o matriz adhesiva que, a continuación,
se pone en contacto directo con la piel del paciente. El péptido
cíclico y el medicamento pueden difundir, entonces, desde la matriz
hacia la piel. El o los péptidos cíclicos y el o los medicamentos
pueden estar contenidos en la misma composición o parche cutáneo, o
se pueden administrar por separado, si bien se prefiere la
administración simultánea y en el mismo sitio. En general, la
cantidad de péptido cíclico administrado a través de la piel varía
en función de la naturaleza del trastorno que se debe tratar o
prevenir, pero puede variar de la forma anteriormente descrita.
Estos niveles se pueden alcanzar mediante los ajustes apropiados del
dispositivo utilizado, o aplicando una crema formulada del modo
descrito más arriba. La transferencia del medicamento a través de la
piel y hacia el tejido diana se puede predecir sobre la base de
estudios in vitro, utilizando, por ejemplo, un aparato Franz
Cell, y evaluarla in vivo por medios apropiados, que
resultarán familiares para los expertos en la técnica. Por ejemplo,
la monitorización del nivel en suero del medicamento administrado en
el tiempo proporciona una medida conveniente de la transferencia
del medicamento a través de la piel.
El suministro transdérmico de medicamentos, como
se describe en este documento, resulta particularmente útil en
situaciones en las que se desea mantener una velocidad constante de
suministro de medicamento, para evitar la fluctuación de los
niveles en sangre del mismo. Por ejemplo, la morfina es un
analgésico que se utiliza con frecuencia inmediatamente después de
una intervención quirúrgica. Cuando se la administra de manera
intermitente en forma parenteral (intramuscular, intravenosa), el
paciente se siente habitualmente somnoliento durante la primera
hora, se encuentra bien durante las 2 horas siguientes, y
experimenta dolor durante la última hora, porque el nivel en sangre
sube rápidamente después de la inyección, y disminuye por debajo del
nivel deseable antes de alcanzar el intervalo de 4 horas prescrito
para la siguiente inyección. La administración transdérmica, según
la presente descripción, permite el mantenimiento de niveles
constantes durante períodos prolongados de tiempo (por ejemplo,
días), lo que permite un control adecuado del dolor y, al mismo
tiempo, conserva la alerta mental del paciente. La insulina ofrece
otro ejemplo de este tipo. Muchos pacientes diabéticos necesitan
mantener un nivel basal constante de insulina, que es diferente de
sus necesidades a las horas de las comidas. El nivel basal se puede
mantener usando una administración transdérmica de insulina, como se
describe en este documento. También es posible administrar
antibióticos a un ritmo constante, manteniendo niveles bactericidas
adecuados en sangre, y evitando, simultáneamente, los niveles altos
que son, a menudo, responsables de la toxicidad (por ejemplo, los
niveles excesivamente altos de gentamicina provocan, generalmente,
toxicidad renal).
El suministro de medicamentos por los métodos de
la presente descripción ofrece, igualmente, un método más
conveniente de administración de un medicamento. Por ejemplo, a
menudo resulta especialmente difícil administrar medicamentos
parenterales a recién nacidos y niños, debido a la dificultad
asociada con la detección de venas de calibre adecuado para llevar
a cabo el cateterismo. Sin embargo, los recién nacidos y los bebés
tienen a menudo una gran superficie cutánea, en comparación con el
adulto. El suministro transdérmico de medicamentos permite tratar a
estos pacientes de forma más sencilla y hace posible que ciertos
tipos de cuidados que, en la actualidad, sólo se puede llevar a
cabo en el hospital, se realicen en casa. Otros pacientes que,
típicamente, presentan dificultades similares con el cateterismo
venoso son los que están sometidos a quimioterapia o bajo diálisis.
Además, para los pacientes sometidos a tratamientos prolongados, la
administración transdérmica, según la presente descripción, resulta
más conveniente que la administración parenteral.
La administración transdérmica, según esta
descripción, permite también evitar el tracto gastrointestinal en
situaciones en las que el uso parenteral no resulta práctico.
Existe, por ejemplo, una creciente necesidad de métodos adecuados
para la administración de pequeños péptidos y proteínas
terapéuticos, que son típicamente digeridos en el tracto
gastrointestinal. Los métodos descritos en este documento permiten
la administración de dichos compuestos y posibilitan una sencilla
administración durante períodos prolongados de tiempo. Los
pacientes que tienen problemas con la absorción a través de su
tracto gastrointestinal debido a un íleo prolongado o enfermedades
gastrointestinales específicas que limitan la absorción del
medicamento pueden beneficiarse también de medicamentos formulados
para aplicaciones transdérmicas como las que se describen en este
documento.
Existen, adicionalmente, numerosas situaciones
clínicas en las que resulta difícil mantener la cooperación (del
paciente) ("compliance"). Por ejemplo, los pacientes con
problemas mentales (por ejemplo, pacientes con la enfermedad de
Alzheimer o psicosis) se pueden tratar de manera más sencilla si se
garantiza un ritmo constante de suministro de un medicamento, sin
tener que recurrir a su capacidad para recordar tomarlo a
determinadas horas del día. Asimismo, resulta menos probable que
los pacientes que simplemente olvidan tomar sus medicamentos de la
forma prescrita lo hagan si sólo deben ponerse periódicamente un
parche (por ejemplo, cada 3 días). Los pacientes con enfermedades
que no presentan síntomas, tales como la hipertensión, tienen un
riesgo especial de olvidar la toma de sus medicamentos de la forma
prescrita.
Para pacientes que deben tomar múltiples
medicamentos, se pueden formular dispositivos para la administración
transdérmica, tales como parches cutáneos, con combinaciones de
medicamentos que, con frecuencia, se utilizan conjuntamente. Por
ejemplo, muchos pacientes con insuficiencia cardíaca reciben
digoxina en combinación con furosemida. La combinación de ambos
medicamentos en un solo parche cutáneo facilita la administración,
reduce el riesgo de errores (para los ancianos resulta, a menudo,
complicado tomar las pastillas correctas a las horas indicadas),
reduce la presión psicológica de tener que" tomar tantas
pastillas", reduce la omisión de tomas debido a actividades
irregulares, y mejora la cooperación del paciente.
Los métodos descritos en este documento son
especialmente aplicables al ser humano, si bien también tienen
diversas aplicaciones en veterinaria, tales como la administración
de factores de crecimiento u hormonas (por ejemplo, para el control
de la fertilidad) a un animal.
Tal como se señalado anteriormente, de acuerdo
con los métodos ofrecidos en este documento es posible administrar
una extensa variedad de medicamentos. Algunos ejemplos de categorías
de medicamentos que se pueden administrar por vía transdérmica
incluyen fármacos antiinflamatorios (por ejemplo, en artritis y
otras afecciones) tales como AINEs, indometacina, prednisona, etc.;
analgésicos (en especial, cuando no es posible la absorción oral
tal como tras una cirugía, y cuando la administración parenteral no
resulta conveniente o deseable), incluidas morfina, codeína,
petidina, acetaminofen y combinaciones de éstos (por ejemplo,
codeína más acetaminofen); antibióticos tales como vancomicina (que
no se absorbe por vía GI y se administra a menudo por vía
intravenosa), o una combinación de INH y rifampicina (por ejemplo,
para la tuberculosis); anticoagulantes tales como heparina (que no
se absorbe bien en el tracto GI y se administra generalmente por vía
parenteral, dando lugar a fluctuaciones de los niveles en sangre,
con un incremento del riesgo de hemorragias a niveles altos, y
riesgos de ineficacia a niveles bajos), y warfarina (que se absorbe
en el tracto GI, pero no se puede administrar inmediatamente
después de una intervención abdominal, debido al íleo normal que
sigue al procedimiento); antidepresivos (por ejemplo, en
situaciones en que la cooperación es problemática como en la
enfermedad de Alzheimer, o cuando el mantenimiento de niveles
estables en sangre da como resultado una reducción importante de los
efectos secundarios anticolinérgicos, y una mejor tolerancia por
parte de los pacientes), tales como amitriptilina, imipramina,
prozac, etc.; antihipertensivos (por ejemplo, para mejorar la
cooperación y reducir los efectos secundarios asociados con niveles
en sangre fluctuantes), tales como diuréticos y
beta-bloqueadores (que se pueden administrar en el
mismo parche; por ejemplo, furosemida y propranolol); antipsicóticos
(por ejemplo, para facilitar la cooperación y simplificar que los
cuidadores y familiares se aseguren de que el enfermo toma el
medicamento), tales como haloperidol y clorpromazina; y
ansiolíticos o sedantes (por ejemplo, para evitar el descenso del
estado de alerta relacionado con niveles elevados en sangre tras la
administración oral, y permitir que el paciente reciba un beneficio
continuo durante todo el día al mantener constantes los niveles
terapéuticos).
Otros muchos medicamentos pueden ser
administrados de la forma descrita en este documento, incluidas
hormonas de, factores de crecimiento, proteínas y péptidos origen
natural y sintético. Por ejemplo, insulina y la hormona del
crecimiento humano, factores de crecimiento tales como
eritropoyetina, interleuquinas e interferones pueden ser
suministradas a través de la piel.
La presente invención proporciona, asimismo,
kits para administrar un medicamento a través de la piel de un
mamífero. Estos kits comprenden, por lo general, un dispositivo para
la aplicación transdérmica (es decir, un parche cutáneo) en
combinación con, o impregnado en uno o múltiples péptidos cíclicos.
Adicionalmente, se puede incluir un medicamento en tales kits.
En una forma de realización relacionada, el uso
de péptidos cíclicos tales como los descritos en este documento
para aumentar la permeabilidad cutánea, puede facilitar también la
toma de muestras del compartimento sanguíneo por difusión pasiva,
permitiendo la detección y/o la medición de los niveles de moléculas
específicas que circulan en la sangre. Por ejemplo, la aplicación
de uno o múltiples péptidos cíclicos a la piel, a través de un
parche cutáneo según la presente descripción, permite que el parche
actúe como una esponja para acumular una pequeña cantidad de
líquido que contiene una muestra representativa del suero. A
continuación, se retira el parche después de un período de tiempo
determinado, y por técnicas apropiadas se analiza el compuesto de
interés (por ejemplo, una medicación, hormona, factor de
crecimiento, metabolito o marca). De forma alternativa, se puede
impregnar un parche con reactivos que permiten el cambio de color si
se detecta una sustancia específica (por ejemplo, una enzima).
Sustancias que pueden ser detectadas de esta forma incluyen, pero
sin estar limitadas a ellas, drogas ilegales tales como cocaína,
enzimas VIH, glucosa y PSA. Esta tecnología es especialmente
beneficiosa para kits de ensayos domésticos.
En un aspecto adicional, se proporcionan
péptidos para potenciar el suministro de un medicamento a un tumor
en un mamífero, a través de la administración de un péptido cíclico
en combinación con un medicamento, a un mamífero portador de un
tumor. Péptidos cíclicos para utilizar en estos métodos incluyen los
designados para romper la adhesión celular mediada por
E-cadherina y/o N-cadherina, e
incluyen N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8),
N-Ac-CHAVSC-NH_{2} (SEQ ID NO:14),
N-Ac-CAHAVDC-NH_{2} (SEQ ID NO:16),
N-Ac-CSHAVSSC-NH_{2} (SEQ ID NO:18), y
N-Ac-KHAVD-NH_{2} (SEQ ID NO:20).
Preferentemente, el péptido cíclico y el medicamento están
formulados en la misma composición o dispositivo de suministro de
medicamentos antes de la administración. En general, un péptido
cíclico puede potenciar el suministro de un medicamento a cualquier
tumor, y el método de administración se puede seleccionar sobre la
base del tipo de tumor diana. Por ejemplo, puede ser preferible la
inyección o la administración tópica, según las descripciones
anteriores, para melanomas y otros tumores accesibles (por ejemplo,
las metástasis de tumores primarios de ovario se pueden tratar
lavando la cavidad peritoneal con la composición). Otros tumores
(por ejemplo, tumores de vejiga) pueden ser tratados por inyección
del péptido cíclico y el medicamento (tal como mitomicina C) en el
lugar del tumor. En otros casos, la composición se puede
administrar de forma sistémica, y dirigirla hacia el tumor usando
uno cualquiera de una variedad de agentes de acceso específicos.
Los expertos en la técnica podrán identificar medicamentos
adecuados, basándose en el tipo de cáncer que se debe tratar (por
ejemplo, mitomicina C para el cáncer de vejiga). En general, la
cantidad de péptido cíclico administrado varía en función del método
de administración y la naturaleza del tumor, dentro de los
intervalos indicados más arriba, preferentemente dentro del
intervalo de aproximadamente 1 \mug/ml hasta aproximadamente 2
mg/ml y, de forma más preferida, desde aproximadamente 10 \mug/ml
a 100 \mug/ml. La transferencia del medicamento al tumor diana se
puede evaluar por medios apropiados, que resultarán evidentes para
el experto en la técnica, tales como la reducción de tamaño del
tumor. Los medicamentos pueden estar también marcados (por ejemplo,
usando radionúclidos) para permitir la observación directa de la
transferencia al tumor diana, utilizando técnicas convencionales de
obtención de
imágenes.
imágenes.
Dentro de un aspecto relacionado, la presente
invención proporciona péptidos para tratar el cáncer y/o inhibir
metástasis en un mamífero. Los tumores cancerosos son masas sólidas
de células, que crecen sin control, que requieren de nutrición a
través de vasos sanguíneos. La formación de nuevos capilares es un
requisito previo para el crecimiento tumoral y la aparición de
metástasis. La administración de péptidos cíclicos, según la
descripción anterior, puede romper el crecimiento de estos vasos
sanguíneos, aportando de esta forma una terapia eficaz para el
cáncer y/o inhibir las metástasis. Los péptidos cíclicos se pueden
utilizar también para tratar leucemias. Péptidos cíclicos
preferidos para ser usados en estos métodos incluyen los que rompen
la adhesión celular mediada por N-cadherina, tales
como N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8),
N-Ac-CHAVSC-NH_{2} (SEQ ID NO:14),
N-Ac-CAHAVDC-NH_{2} (SEQ ID NO:16),
N-Ac-CSHAVSSC-NH_{2} (SEQ ID NO:18), y
N-Ac-KHAVD-NH_{2} (SEQ ID NO:20). Se puede
administrar un péptido cíclico solo (por ejemplo, a través de la
piel), o en una composición farmacéutica. Para los melanomas y
determinados tumores accesibles adicionales, puede ser preferible
la inyección o la administración tópica, según la descripción
anterior. En el cáncer de ovario, el lavado de la cavidad
peritoneal con una composición que comprende uno o múltiples
péptidos cíclicos, puede prevenir las metástasis de células
tumorales del ovario. Otros tumores (por ejemplo, tumores de vejiga,
bronquiales o traqueales) se pueden tratar por inyección del
péptido cíclico en la cavidad. En otros casos, la composición se
puede administrar de forma sistémica, dirigiéndola hacia el tumor
mediante una variedad de agentes de acceso, tal como se ha descrito
más arriba. En general, la cantidad de péptido cíclico administrado
varía en función del método de administración y de la naturaleza
del cáncer, pero puede hacerlo dentro de los intervalos
anteriormente identificados. La eficacia del tratamiento del cáncer
o de la inhibición de metástasis se puede evaluar usando
observaciones clínicas bien conocidas tales como el nivel de
marcadores séricos (por ejemplo, CEA o PSA).
En un aspecto relacionado adicional, se puede
utilizar un péptido cíclico para inhibir la angiogénesis (es decir,
el crecimiento de vasos sanguíneos a partir de vasos sanguíneos
preexistentes) en un mamífero. En general, la inhibición de la
angiogénesis puede ser beneficiosa en pacientes afectados por
enfermedades tales como cáncer o artritis. Péptidos cíclicos
preferidos para la inhibición de la angiogénesis incluyen
N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8) y
N-Ac-CHAVSC-NH_{2} (SEQ ID NO:14). El
efecto de un determinado péptido cíclico sobre la angiogénesis se
puede determinar, en general, evaluando el efecto del péptido sobre
la formación de vasos sanguíneos. En general, esta determinación se
puede llevar a cabo usando, por ejemplo, un ensayo de membrana
corioalantoica de pollo (Iruela-Arispe et
al., Molecular Biology of the Cell
6:327-343, 1995). En pocas palabras, se puede
incluir un péptido cíclico en una malla compuesta por vitrógeno a
una o múltiples concentraciones (por ejemplo, en el intervalo de
aproximadamente 1 a 100 \mug/malla). La o las mallas se pueden
aplicar, seguidamente, a membranas corioalantoicas de pollo.
Después de 24 horas, se puede determinar el efecto del péptido
usando un análisis morfométrico computadorizado. Un péptido cíclico
deberá inhibir la angiogénesis en al menos 25% a una concentración
de 33 \mug/malla.
La adición de un agente de acceso puede resultar
beneficiosa, especialmente cuando la administración es sistémica.
Las formas de administración adecuadas y la dosificación dependen
del trastorno que se debe prevenir o tratar, pero, en general, la
administración por inyección es apropiada. Las dosificaciones pueden
estar dentro de los intervalos descritos anteriormente. La eficacia
de la inhibición se puede evaluar grosso modo valorando la
incapacidad del tumor para mantener el crecimiento y, por
microscopia, por una ausencia de nervios en la periferia del
tumor.
En todavía otro aspecto relacionado, la presente
invención proporciona péptidos para inducir la apoptosis en una
célula que expresa cadherina. En general, los pacientes afectos por
cáncer pueden beneficiarse de este tratamiento. Péptidos cíclicos
preferidos para ser utilizados en estos métodos incluyen
N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8),
N-Ac-CHAVSC-NH_{2} (SEQ ID NO:14),
N-Ac-CAHAVDC-NH_{2} (SEQ ID NO:16),
N-Ac-CSHAVSSC-NH_{2} (SEQ ID NO:18), y
N-Ac-KHAVD-NH_{2} (SEQ ID NO:20). Se
prefieren también los péptidos cíclicos unidos a una molécula que
comprende un sitio de unión para una segunda molécula de adhesión
(tal como Arg-Gly-Asp) a través de
un conector. La administración puede ser tópica, por inyección o por
otro medio, y la adición de un agente de acceso puede ser
beneficiosa, especialmente cuando la administración es sistémica.
Los modos de administración y las dosificaciones adecuadas dependen
de la localización y naturaleza de las células cuya apoptosis se
desea, pero, en general, las dosificaciones pueden variar dentro del
intervalo descrito anteriormente. Se puede llevar a cabo una
biopsia para evaluar el nivel de inducción de apoptosis.
La presente invención proporciona también
péptidos para potenciar el suministro de un medicamento al sistema
nervioso central de un mamífero. La barrera hemoencefálica es
básicamente impermeable a la mayor parte de agentes neuroactivos, y
el suministro de medicamentos al cerebro de un mamífero requiere, a
menudo, procedimientos invasivos. Con el uso de un péptido cíclico
según la presente descripción, sin embargo, el suministro se puede
llevar a efecto, por ejemplo, por la administración sistémica de una
combinación de péptido
cíclico-medicamento-agente de
acceso, la inyección de un péptido cíclico (solo o combinado con un
medicamento y/o un agente de acceso) en la arteria carótida, o la
aplicación de un parche cutáneo que comprende un péptido cíclico en
la cabeza del paciente. Ciertos péptidos cíclicos preferidos para
ser utilizados con tales métodos son relativamente pequeños (por
ejemplo, un tamaño de anillo de 4-10 residuos;
preferentemente, 5-7 residuos), e incluyen péptidos
que comprenden un anillo de 5 residuos tales como
N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8) y
N-Ac-KHAVD-NH_{2} (SEQ ID NO:20). En
general, la cantidad de péptido cíclico administrado varía en
función del método de administración y de la naturaleza del
trastorno que se debe tratar o prevenir, pero varía típicamente
dentro del intervalo descrito más arriba. La transferencia del
medicamento al sistema nervioso central se puede evaluar por medios
adecuados, que resultarán evidentes para el experto en la técnica,
tales como imágenes generadas por resonancia magnética (MRI) o
escáner PET (tomografía de emisión de protones).
En aspectos todavía adicionales, la presente
invención proporciona péptidos para potenciar la adhesión de
células que expresan cadherina. En estas formas de realización, un
péptido cíclico se encuentra generalmente unido a un soporte
sólido, tal como se ha descrito anteriormente. La matriz resultante,
que comprende múltiples péptidos cíclicos unidos, puede ser usada
como un "adhesivo biológico" para unir múltiples células que
expresan cadherina en una diversidad de contextos.
En una forma de realización, los péptidos
cíclicos unidos a una matriz se pueden utilizar para potenciar la
cicatrización de heridas y/o reducir el tejido cicatricial en un
mamífero. Péptidos cíclicos preferidos para ser utilizados en estos
métodos incluyen N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID
NO:8) y N-Ac-KHAVD-NH_{2} (SEQ ID NO:20),
siendo especialmente preferidos los péptidos cíclicos que están
unidos a una matriz biocompatible y biodegradable tal como celulosa
o colágeno. Para utilizar en estos métodos, un péptido cíclico
deberá tener un grupo amino o hidroxilo libre. Los péptidos se
administran, por lo general, por vía tópica a la herida, en donde
pueden facilitar el cierre de la misma y aumentar la acción, o
incluso sustituir a los puntos de sutura. De manera similar, la
administración de péptidos cíclicos unidos a una matriz puede
facilitar la adhesión celular en injertos cutáneos e implantes
protésicos, pudiendo prolongar la duración y utilidad de la
inyección de colágeno. En general, la cantidad de péptidos cíclicos
unidos a una matriz que se administran a una herida, injerto o
sitio de implante varía con su gravedad y/o la naturaleza de la
herida, injerto o implante, pero puede estar dentro del intervalo
citado anteriormente.
En una forma de realización adicional, uno o
múltiples péptidos cíclicos pueden estar unidos a la superficie
interior de una placa de cultivo de tejidos u otro soporte de
cultivo celular, tal como para ser usado en un biorreactor. Esta
unión se puede llevar a cabo por cualquier técnica adecuada, tal
como se ha descrito anteriormente. Los péptidos cíclicos unidos de
esta forma se pueden usar, en general, para inmovilizar células que
expresan cadherina. Por ejemplo, se pueden utilizar placas
recubiertas con uno o múltiples péptidos cíclicos para inmovilizar
células que expresan cadherina en una variedad de ensayos y pruebas
de rastreo. Dentro de biorreactores (es decir, sistemas para la
producción a mayor escala de células u organoides), se pueden usar
péptidos cíclicos, en general, para mejorar la fijación celular y
estabilizar el crecimiento celular. Se pueden utilizar también
péptidos cíclicos dentro de biorreactores para contribuir a la
formación y función de organoides altamente diferenciados
derivados, por ejemplo, de poblaciones dispersas de células fetales
de mamífero. También se pueden usar biorreactores que contienen
biomatrices de péptidos cíclicos para facilitar la producción de
proteínas específicas.
Los péptidos cíclicos según la presente
descripción se pueden utilizar con una diversidad de configuraciones
de biorreactores. En general, un biorreactor se diseña con un área
de superficie interior suficiente para servir como soporte a un
número elevado de células adherentes. Esta superficie se puede
proporcionar usando membranas, tubos, pocillos de microtitulación,
columnas, fibras huecas, frascos rotatorios, placas, bandejas,
perlas o una combinación de estos elementos. Un biorreactor puede
estar dividido en compartimentos. El material de soporte dentro de
un biorreactor puede ser cualquier material apropiado conocido en la
técnica; preferentemente, el material de soporte no se disuelve ni
se hincha en agua. Materiales de soporte preferidos incluyen, pero
no están limitados a ellos, polímeros sintéticos tales como
acrílicos, vinilos, polietileno, polipropileno,
politetrafluoroetileno, nailon, poliuretanos, poliamidas,
polisulfonas y poli(tereftalatos de etileno); cerámicas;
vidrio y sílice.
Dentro de otros aspectos adicionales de la
presente invención, los péptidos cíclicos se pueden utilizar para
potenciar y/o dirigir el crecimiento neurológico. En un aspecto, el
crecimiento axonal se puede potenciar y/o dirigir haciendo
contactar una neurona con uno o múltiples péptidos cíclicos. Los
péptidos cíclicos preferidos para ser utilizados en estos métodos
están unidos a una matriz polímera u otro soporte, e incluyen los
péptidos que carecen sustancialmente de secuencias de flanqueo, tal
como se ha descrito anteriormente. En formas de realización
especialmente preferidas, el péptido cíclico es
N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8), o
N-Ac-KHAVD-NH_{2} (SEQ ID NO:20). En otras
formas de realización preferidas, un péptido cíclico está unido a
una molécula que comprende una secuencia de reconocimiento celular
de integrina (Arg-Gly-Asp), tal como
se ha descrito más arriba. El método de lograr el contacto y la
cantidad de péptido cíclico usado dependerán de la localización de
la neurona y del grado y naturaleza del crecimiento deseado. Por
ejemplo, una neurona se puede poner en contacto (por ejemplo, por
implantación) con péptido(s) cíclico(s)
unido(s)
a un material de soporte, tal como una sutura, una guía de fibra nerviosa u otro dispositivo protésico, de modo que el crecimiento axonal se dirige a lo largo del material de soporte. De manera alternativa, se puede emplear una guía de fibra nerviosa, en la cual la luz de dicha guía contiene una composición que comprende el o los péptidos cíclicos. In vivo, estas guías nerviosas u otros péptidos cíclicos soportados de alguna otra forma pueden ser implantados usando técnicas bien conocidas para, por ejemplo, facilitar el crecimiento de conexiones neuronales seccionadas y/o tratar lesiones de la médula espinal. Para el experto en la técnica resultará evidente que la estructura y composición del soporte deben ser las apropiadas para la lesión particular que se debe tratar. In vitro, puede utilizarse, de manera similar, una matriz polímera para dirigir el crecimiento de neuronas sobre superficies adecuadamente diseñadas, tal como se describe, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. Nº 5.510.628.
a un material de soporte, tal como una sutura, una guía de fibra nerviosa u otro dispositivo protésico, de modo que el crecimiento axonal se dirige a lo largo del material de soporte. De manera alternativa, se puede emplear una guía de fibra nerviosa, en la cual la luz de dicha guía contiene una composición que comprende el o los péptidos cíclicos. In vivo, estas guías nerviosas u otros péptidos cíclicos soportados de alguna otra forma pueden ser implantados usando técnicas bien conocidas para, por ejemplo, facilitar el crecimiento de conexiones neuronales seccionadas y/o tratar lesiones de la médula espinal. Para el experto en la técnica resultará evidente que la estructura y composición del soporte deben ser las apropiadas para la lesión particular que se debe tratar. In vitro, puede utilizarse, de manera similar, una matriz polímera para dirigir el crecimiento de neuronas sobre superficies adecuadamente diseñadas, tal como se describe, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. Nº 5.510.628.
Dentro de otro más de estos aspectos, puede
usarse uno o múltiples péptidos cíclicos en la terapia de una
enfermedad neurológica desmielinizante en un mamífero. Se ha
encontrado, en el contexto de la presente invención, que la
migración de células de Schwann sobre los astrocitos resulta
inhibida por N-cadherina. En una serie de
enfermedades neurológicas, tal como la esclerosis múltiple, se
produce la muerte de los oligodendrocitos. En teoría, se podrían
utilizar células de Schwann del sistema nervioso periférico para
sustituir los oligodendrocitos dañados del SNC. Sin embargo,
intentos previos de llevar a cabo esta sustitución han fracasado,
porque las células de Schwann implantadas en el cerebro no han
migrado sobre astrocitos o remielinizado las neuronas afectadas.
Los péptidos cíclicos tales como los descritos en este documento,
cuando son inyectados con células de Schwann en el cerebro, pueden
facilitar la migración de las células de Schwann y permitir la
práctica de esta terapia.
Los pacientes con esclerosis múltiple adecuados
para el tratamiento pueden ser identificados por criterios que
establecen un diagnóstico de EM clínicamente definitivo o
clínicamente probable (véase Poser et al., Ann.
Neurol. 13:227, 1983). Los pacientes candidatos para la terapia
profiláctica se pueden identificar por la presencia de factores
genéticos tales como los alelos HLA-DR2a y DR2b, o
por la presencia de signos precoces de la enfermedad de tipo
remitente recidivante.
Los injertos de células de Schwann se pueden
implantar directamente en el cerebro, junto con el o los péptidos
cíclicos, usando técnicas convencionales. Los péptidos cíclicos
preferidos para ser usados en estos métodos incluyen
N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8), y
N-Ac-KHAVD-NH_{2} (SEQ ID NO:20). Las
cantidades adecuadas de péptido cíclico se encuentran, por lo
general, en el intervalo descrito anteriormente, preferentemente
desde aproximadamente 10 \mug/ml hasta aproximadamente 1
mg/ml.
De manera alternativa, se puede administrar un
péptido cíclico solo o en una composición farmacéutica. La duración
y frecuencia de administración estarán determinadas por factores
tales como el estado del paciente y el tipo y gravedad de la
enfermedad del paciente. En formas de realización especialmente
preferidas de la invención, el péptido cíclico o la composición
farmacéutica se puede administrar en una dosificación en el
intervalo de 0,1 mg/kg hasta 20 mg/kg, si bien las dosificaciones
apropiadas se pueden determinar mediante ensayos clínicos. Los
métodos de administración incluyen inyección, por vía intravenosa o
intratecal (es decir, directamente en el líquido
cefalorraquídeo).
El tratamiento eficaz de la esclerosis múltiple
se puede poner de manifiesto por cualquiera de los siguientes
criterios: EDSS (siglas en inglés de Escala Extendida de Estado de
Incapacidad), aparición de exacerbaciones o MRI (imágenes obtenidas
por resonancia magnética). La EDSS es un medio de clasificar la
alteración clínica debida a EM (Kurtzke, Neurology 33:1444,
1983), y el descenso de una etapa completa define un tratamiento
eficaz en el contexto de la presente invención (Kurtzke, Ann.
Neurol. 36:573-79, 1994). Las exacerbaciones se
definen como la aparición de un nuevo síntoma atribuible a EM, y que
va acompañado por una nueva anomalía neurológica apropiada (Sipe
et al., Neurology 34:1368, 1984). Se considera que una
terapia es eficaz si se produce una diferencia estadísticamente
significativa en la tasa o proporción de pacientes libres de
exacerbaciones entre el grupo tratado y el grupo de placebo, o una
diferencia estadísticamente significativa en el tiempo transcurrido
hasta la primera exacerbación o la duración y gravedad en el grupo
tratado, en comparación con el grupo de control. Se puede usar MRI
para medir las lesiones activas usando la obtención de imágenes
reforzada por gadolinio-DTPA (McDonald et
al., Ann. Neurol. 36:14, 1994), o la localización y grado
de las lesiones usando técnicas T_{2} ponderadas. Los radiólogos
pueden determinar la presencia, localización y extensión de las
lesiones EM usando técnicas convencionales. La mejoría debida a
terapia se establece cuando se produce una mejoría estadísticamente
significativa en un paciente individual, en comparación con el nivel
basal o, en un grupo tratado, frente a un grupo de placebo.
La eficacia del péptido cíclico en el contexto
de la prevención se puede evaluar sobre la base de mediciones
clínicas tales como tasa de recidiva y EDSS. Otros criterios
incluyen una variación del área y volumen de las imágenes T2 en
MRI, y el número y volumen de lesiones determinadas por imágenes
potenciadas por gadolinio.
En otro aspecto, los procedimientos según la
presente descripción se pueden utilizar para modular el sistema
inmune de un mamífero en cualquiera de múltiples formas. Las
cadherinas se expresan en células B y T (timocitos y
pre-células B de la médula ósea) inmaduras, así como
en subconjuntos específicos de linfocitos B y T activados, y en
algunos tumores malignos hematológicos (véanse Lee et al.,
Immunol. 152:5653-5659, 1994; Munro et
al., Cellular Immunol. 169:309-312, 1996;
Tsutsui et al., Biochem.
120:1034-1039, 1996; Cepek et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 93:6567-6571, 1996). En
general, los péptidos cíclicos se pueden utilizar para modular
etapas específicas de las interacciones celulares durante una
respuesta inmune o durante la diseminación de linfocitos
malignos.
Por ejemplo, se puede utilizar un péptido
cíclico según la descripción de este documento para tratar
enfermedades asociadas con una generación excesiva de células T
que, por lo demás, son normales. Sin pretender atenerse a ninguna
teoría, se cree que la interacción de cadherinas sobre células T y
subconjuntos de células B en proceso de maduración contribuye a la
protección de estas células contra la muerte celular programada. Un
péptido cíclico puede reducir dichas interacciones, dando lugar a la
inducción de la muerte celular programada. En consecuencia, se
pueden utilizar péptidos cíclicos para tratar ciertos tipos de
diabetes y artritis reumatoide, en especial en niños pequeños, en
los que la expresión de cadherinas en pre-células T
tímicas es máxima.
Asimismo, es posible administrar péptidos
cíclicos a pacientes afectos de ciertos trastornos cutáneos (tales
como linfomas cutáneos), leucemia aguda de células B, y reacciones
inmunes excesivas que implican al sistema inmune humoral y la
generación de inmunoglobulinas, tales como respuestas alérgicas y el
rechazo de injertos mediado por anticuerpos. Adicionalmente, los
pacientes con células malignas circulantes, positivas para cadherina
(por ejemplo, durante regímenes en los que la quimioterapia o la
radioterapia está eliminando una parte importante de las células
malignas de la médula ósea y otros tejidos linfoides) pueden
beneficiarse del tratamiento con un péptido cíclico. Un tratamiento
de este tipo puede ser beneficioso, también, en pacientes sometidos
a trasplante de células madre de sangre periférica.
Péptidos cíclicos preferidos para ser utilizados
en tales métodos incluyen aquellos que rompen la adhesión celular
mediada por E-cadherina y/o
N-cadherina, tales como
N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8),
N-Ac-CHAVSC-NH_{2} (SEQ ID NO:14),
N-Ac-CSHAVSSC-NH_{2} (SEQ ID NO:18), y
N-Ac-KHAVD-NH_{2} (SEQ ID NO:20). Dentro de
los métodos mencionados anteriormente, el o los péptidos cíclicos
se administran, preferentemente, de forma sistémica (habitualmente,
por inyección) o tópica. Un péptido cíclico puede estar unido a un
agente de acceso. Por ejemplo, el acceso a la médula ósea puede ser
beneficioso. Una dosificación adecuada es suficiente para provocar
una reducción estadísticamente significativa de la población de
células B y/o T que expresan cadherina, y/o una mejoría de las
manifestaciones clínicas de la enfermedad bajo tratamiento. Las
dosificaciones típicas se encuentran dentro de los intervalos
descritos más arriba.
En aspectos adicionales, la presente invención
proporciona péptidos y kits para la prevención del embarazo en un
mamífero. En general, la disrupción de la función de la
E-cadherina previene la adhesión de trofoblastos y
su subsiguiente fusión para formar
sincitio-trofoblastos. En una forma de realización,
uno o múltiples péptidos cíclicos, según la presente descripción,
pueden ser incorporados en diversos dispositivos anticonceptivos
bien conocidos, tales como esponjas aptas para la inserción
intravaginal (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº
5.417.224), o cápsulas de implantación subcutánea. Sin embargo, son
posibles otras formas de administración, incluida la transdérmica,
para péptidos cíclicos unidos a un agente de acceso apropiado.
Péptidos cíclicos preferidos para ser utilizados en tales métodos
incluyen N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8),
N-Ac-CHAVSC-NH_{2} (SEQ ID NO:14),
N-Ac-CSHAVSSC-NH_{2} (SEQ ID NO:18), y
N-Ac-KHAVD-NH_{2} (SEQ ID NO:20). Los
métodos adecuados para la incorporación en dichos dispositivos
dependen del tipo de dispositivo, y son bien conocidos en la
técnica. Estos dispositivos facilitan la administración del o de los
péptidos cíclicos a la región uterina y pueden proporcionar una
liberación sostenida del o de los péptidos cíclicos. En general, el
o los péptidos cíclicos pueden ser administrados, a través de
dichos dispositivos anticonceptivos, en una dosificación en el
intervalo de 0,1 a 20 mg/kg, aunque las dosificaciones apropiadas se
pueden determinar por la monitorización de los niveles de hCG en
orina. La hCG es producida por la placenta, y los niveles de esta
hormona aumentan en la orina de la mujer gestante. Los niveles
urinarios de hCG se pueden evaluar por
radio-inmunoensayos usando técnicas bien conocidas.
Los kits para la prevención de la gestación comprenden, por lo
general, un dispositivo anticonceptivo impregnado con uno o
múltiples péptidos cíclicos.
De manera alternativa, se puede implantar una
formulación de liberación sostenida de uno o múltiples péptidos
cíclicos, típicamente por vía subcutánea, en un mamífero para
prevenir la gestación. Este implante se puede llevar a cabo usando
técnicas bien conocidas. Preferentemente, la formulación implantada
proporciona una dosificación como la descrita más arriba, aun
cuando los expertos en la técnica pueden determinar la dosificación
eficaz mínima usando, por ejemplo, una evaluación de los niveles de
hCG en la orina de la mujer.
La presente invención proporciona, igualmente,
péptidos para aumentar la permeabilidad vascular en un mamífero,
mediante la administración de uno o múltiples péptidos cíclicos o
composiciones farmacéuticas. En el interior de los vasos
sanguíneos, la adhesión de las células endoteliales (mediada por
N-cadherina) tiene como consecuencia una
permeabilidad vascular disminuida. En consecuencia, se pueden
utilizar péptidos cíclicos según la presente descripción para
aumentar la permeabilidad vascular. En ciertas formas de
realización, los péptidos cíclicos preferidos para ser utilizados
con tales métodos incluyen péptidos capaces de reducir la adhesión
de células tanto endoteliales como tumorales. Estos péptidos se
pueden usar para facilitar la penetración de agentes terapéuticos o
diagnósticos antitumorales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales) a
través de las barreras a la permeabilidad de células endoteliales y
barreras tumorales. Péptidos especialmente preferidos incluyen
N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8) y
N-Ac-KHAVD-NH_{2} (SEQ ID NO:20).
El tratamiento con un péptido cíclico puede ser
apropiado, por ejemplo, antes de la administración de un agente
terapéutico o diagnóstico antitumoral (por ejemplo, un anticuerpo
monoclonal u otra macromolécula), un agente antimicrobiano, o un
antiinflamatorio, con el fin de incrementar la concentración de
tales agentes en la proximidad del tumor, organismo o inflamación
diana, sin aumentar la dosis general que recibe el paciente. Los
péptidos cíclicos para ser utilizados con tales métodos pueden
estar unidos a un agente de acceso para aumentar, de manera
adicional, la concentración local del péptido cíclico, aunque la
administración sistémica de un agente vasoactivo, incluso en
ausencia de un agente de acceso, aumenta la perfusión de ciertos
tumores en relación con otros tejidos. Agentes de acceso adecuados
incluyen anticuerpos y otras moléculas que se unen específicamente
a células tumorales o a componentes de vasos sanguíneos
estructuralmente anómalos. Por ejemplo, un agente de acceso puede
ser un anticuerpo que se fija a un producto de degradación de la
fibrina o a una enzima celular tal como la peroxidasa liberada por
los granulocitos u otras células en tejidos necróticos o
inflamados.
En general, se prefiere la administración a
través de una inyección intravenosa o la administración
transdérmica. Las dosificaciones eficaces suelen ser suficientes
para aumentar la localización de un agente diagnóstico o
terapéutico administrado de forma subsiguiente, en un grado que
mejora la eficacia clínica de la terapia, o la precisión del
diagnóstico, de manera estadísticamente significativa. Se pueden
establecer comparaciones entre animales hospedadores de tumores,
tratados y no tratados, a los que se administran dosis equivalentes
del agente diagnóstico o terapéutico. En general, las dosificaciones
se encuentran dentro del intervalo descrito anteriormente.
Otros aspectos de la presente invención
proporcionan métodos que aprovechan las propiedades inmunogénicas
de los péptidos cíclicos. Por ejemplo, se pueden desarrollar
anticuerpos policlonales y monoclonales contra un péptido cíclico,
usando técnicas convencionales. Estos anticuerpos se pueden preparar
por cualquiera de las diversas técnicas conocidas por los expertos.
Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En una de dichas
técnicas, se inyecta un inmunógeno que comprende el péptido cíclico
en uno de una extensa variedad de mamíferos (por ejemplo, ratón,
rata, conejo, oveja o cabra). Debido a su escaso tamaño, el péptido
cíclico debe estar unido a una proteína portadora tal como albúmina
de suero bovino o hemocianina "keyhole limpet". Después
de una o múltiples inyecciones, los animales se someten a sangrados
periódicos. A continuación, es posible purificar anticuerpos
monoclonales específicos para el péptido cíclico a partir de estos
antisueros mediante, por ejemplo, cromatografía de afinidad, usando
un polipéptido acoplado a un soporte sólido apropiado.
Resulta posible preparar anticuerpos
monoclonales específicos para el péptido cíclico de interés
mediante, por ejemplo, el uso de la técnica de Kohler y Milstein,
Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976, y las
mejoras aportadas. En pocas palabras, estos métodos comprenden la
preparación de líneas celulares inmortales capaces de producir
anticuerpos que poseen la especificidad deseada, a partir de células
esplénicas obtenidas de un animal que ha sido inmunizado de la
forma descrita anteriormente. Las células esplénicas se
inmortalizan, por ejemplo, por su fusión con un miembro de fusión
celular del mieloma, preferentemente alguno que sea singeneico con
el animal inmunizado. Se seleccionan colonias aisladas y se analiza
en los sobrenadantes de sus cultivos su actividad de unión contra
el polipéptido. Se prefieren hibridomas con elevadas reactividad y
especificidad.
Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar de
los sobrenadantes de colonias de hibridomas en crecimiento, con o
sin el uso de diversas técnicas conocidas para aumentar el
rendimiento. Los contaminantes se pueden separar de los anticuerpos
por técnicas convencionales tales como cromatografía, filtración
sobre gel, precipitación, y extracción. En general, los anticuerpos
que poseen la actividad deseada se pueden identificar usando
análisis de inmunofluorescencia de cortes de tejidos, células u
otras muestras donde se halla localizada la cadherina diana.
Estos anticuerpos se pueden usar in vitro
o in vivo para modular la adhesión celular. En determinadas
formas de realización, se pueden usar anticuerpos con métodos en los
que se desea una adhesión celular potenciada, tal como se ha
descrito anteriormente. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos con
los citados métodos para potenciar y/o dirigir el crecimiento de
axones in vitro o in vivo. Los anticuerpos pueden ser
utilizados en la luz de una guía nerviosa tubular o pueden estar
unidos a la misma, a una sutura o a otro soporte sólido, usándolos
del modo descrito anteriormente para los péptidos cíclicos. Las
dosificaciones de anticuerpos son suficientes para potenciar o
dirigir el crecimiento axonal, y variarán en función del método de
administración y de la enfermedad a tratar.
Los anticuerpos pueden ser usados también como
"adhesivos biológicos", tal como se ha descrito anteriormente,
para unir múltiples células que expresan cadherina dentro de una
variedad de contextos, tales como potenciar la cicatrización de
heridas y/o reducir el tejido cicatricial, y/o facilitar la adhesión
celular en los injertos cutáneos o implantes protésicos. En
general, la cantidad de anticuerpo unido a una matriz que se
administra a una herida, injerto o implante varía en función de la
gravedad de la herida y/o la naturaleza de la herida, injerto o
implante, pero puede hacerlo dentro del intervalo descrito más
arriba. Los anticuerpos se pueden unir, asimismo, a diversos
materiales de soporte para ser usados en el cultivo de tejidos o
biorreactores.
En determinadas formas de realización, se pueden
usar anticuerpos (o, preferentemente, fragmentos de los mismos que
fijan antígenos) en situaciones en que se desea inhibir la adhesión
celular. Estos anticuerpos o fragmentos se pueden usar, por
ejemplo, para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes tales
como EM, o para inhibir interacciones entre células tumorales, tal
como se ha descrito anteriormente. En general, se prefiere el uso
de fragmentos Fab.
Los péptidos cíclicos se pueden utilizar también
para generar anticuerpos monoclonales, tal como se ha descrito más
arriba, que son específicos para cadherinas particulares (por
ejemplo, anticuerpos que se unen a E-cadherina,
pero no lo hacen de manera importante a N-cadherina,
o viceversa). En general, estos anticuerpos pueden ser usados con
fines terapéuticos, diagnósticos y experimentales. Por ejemplo,
estos anticuerpos pueden estar unidos a un medicamento y ser
administrados a un mamífero para permitir el acceso del medicamento
a una célula particular que expresa cadherina tal como una célula
leucémica en la sangre.
Los ensayos implican utilizar, típicamente, el
anticuerpo para detectar la presencia o ausencia de una cadherina
(libre o en la superficie de una célula), o un fragmento
proteolítico que contiene el dominio EC1 en una muestra biológica
apropiada, tal como un tumor o biopsias de tejidos normales,
muestras de sangre, ganglio linfático, suero u orina, o de otros
tejidos, homogenatos, o extractos de los mismos, obtenidos de un
paciente.
El experto en la técnica conoce una variedad de
formatos experimentales que utilizan un anticuerpo para detectar
una molécula diana en una muestra. Véase, por ejemplo, Harlow y
Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, 1988. Por ejemplo, el ensayo se puede llevar a cabo en
un formato de transferencia de western, en el que una preparación
de proteína de la muestra biológica se somete a electroforesis de
gel, se transfiere a una membrana apropiada y se le deja reaccionar
con el anticuerpo. La presencia del anticuerpo en la membrana se
puede detectar, entonces, usando un reactivo de detección adecuado,
como se describe más adelante.
En otra forma de realización, el ensayo
comprende el uso de un anticuerpo inmovilizado sobre un soporte
sólido para unirse a la cadherina diana, o de un fragmento
proteolítico que contiene el dominio EC1, y separarlo del resto de
la muestra. A continuación, la cadherina fijada puede ser detectada
usando un segundo anticuerpo o reactivo que contiene un grupo
informador. Alternativamente, se puede usar un ensayo competitivo,
en el que la cadherina se marca con un grupo informador y se le
deja unirse al anticuerpo inmovilizado tras la incubación del
anticuerpo con la muestra. El grado en que los componentes de la
muestra inhiben la unión de la cadherina marcada al anticuerpo es
indicativo de la reactividad de la muestra con el anticuerpo
inmovilizado y, como consecuencia, indicativo del nivel de
cadherina en la muestra.
El soporte sólido puede ser cualquier material,
conocido por el experto en la técnica, al que puede unirse el
anticuerpo, tal como un pocillo de ensayo en una placa de
microtitulación, un filtro de nitrocelulosa u otra membrana
adecuada. De forma alternativa, el soporte puede ser una perla o
disco, tal como vidrio, fibra de vidrio, látex o plástico tal como
poliestireno o cloruro de polivinilo. El anticuerpo puede
inmovilizarse sobre el soporte sólido usando una variedad de
técnicas conocidas por el experto, que aparecen extensamente
descritas en la bibliografía de patentes y científica.
En determinadas formas de realización, el ensayo
para la detección de una cadherina en una muestra es un ensayo en
emparedado de dos anticuerpos. Este ensayo se puede llevar a cabo
haciendo contactar, en primer lugar, un anticuerpo que ha sido
inmovilizado sobre un soporte sólido, habitualmente el pocillo de
una placa de microtitulación, con la muestra biológica, de forma
que la cadherina presente en la muestra se fija al anticuerpo
inmovilizado (generalmente, es suficiente con una incubación de 30
minutos a temperatura ambiente). Se retira, entonces, la muestra no
fijada de los complejos inmovilizados de
cadherina-anticuerpo, y se agrega un segundo
anticuerpo (que contiene un grupo informador tal como una enzima,
tinción, radionúclido, grupo luminiscente, grupo fluorescente o
biotina), capaz de unirse a un sitio diferente de la cadherina. Se
determina, a continuación, la cantidad de este segundo anticuerpo
que se mantiene unida al soporte sólido, usando un método apropiado
para el grupo informador específico. El método empleado para
detectar el grupo informador depende de la naturaleza de este
último. Para los grupos radiactivos, resultan normalmente adecuados
el recuento por escintilación o los métodos de autorradiografía. Se
pueden utilizar métodos espectroscópicos para detectar tinciones,
grupos luminiscentes y grupos fluorescentes. La biotina puede ser
detectada usando avidina, acoplada con un grupo informador diferente
(habitualmente, un grupo radiactivo o fluorescente, o una enzima).
Los grupos informadores enzimáticos se pueden detectar, por lo
general, mediante la adición de un sustrato (normalmente, durante un
período específico de tiempo), seguida de análisis espectroscópico
u otros análisis de los productos de reacción. Para la determinación
del nivel de cadherina en una muestra, pueden usarse estándares y
adiciones estándares, con técnicas bien conocidas.
La presente invención proporciona, igualmente,
kits para ser usados en estos inmunoensayos. Dichos kits comprenden,
por lo general, uno o múltiples anticuerpos, tal como se ha
descrito anteriormente. Además, uno o múltiples compartimentos o
recipientes del kit comprenden generalmente elementos, tales como
reactivos, tampones y/o soluciones de lavado, que se utilizan en el
inmunoensayo.
Dentro de aspectos adicionales, pueden usarse
péptidos cíclicos o anticuerpos contra ellos para facilitar la
identificación y la clasificación de células in vitro, o la
obtención de imágenes in vivo, lo que permite seleccionar
células que expresan diferentes cadherinas (o diferentes niveles de
cadherina). Preferentemente, el o los péptidos cíclicos o
anticuerpos que se usan en estos métodos están unidos a una marca
detectable. Marcas adecuadas son bien conocidas en la técnica, e
incluyen radionúclidos, grupos luminiscentes, grupos fluorescentes,
enzimas, tinciones, dominios de inmunoglobulinas constantes, y
biotina. En una forma de realización preferida, se hace contactar
un péptido cíclico o anticuerpo unido a una marca fluorescente, tal
como fluoresceína, con las células que, entonces, son analizadas
por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS, en sus
siglas en inglés).
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de
ilustración, y en ningún caso, como limitación.
Este Ejemplo ilustra la síntesis en fase sólida
de péptidos cíclicos representativos.
Los péptidos fueron ensamblados sobre resina de
metilbenzilhidrilamina (resina MBHA) para los péptidos con amida
C-terminal. Se utilizaron las resinas tradicionales
de Merrifield para cualquier péptido ácido
C-terminal. Se rellenaron bolsas de un material de
malla de polipropileno con la resina, y se empaparon en
diclorometano. Los paquetes de resina fueron lavados tres veces con
diisopropiletilamina al 5% en diclorometano y, a continuación,
fueron lavadas con diclorometano. Luego, los paquetes se
clasificaron y colocaron en un frasco Nalgene que contenía una
solución del aminoácido de interés en diclorometano. Se agregó una
cantidad similar de diisopropilcarbodiimida (DIC) en diclorometano
para activar la reacción de acoplamiento. El frasco se agitó durante
una hora para garantizar la compleción de la reacción. Se descartó
la mezcla de reacción, y los paquetes se lavaron con DMF. Se separó
el N-\alpha-Boc por acidólisis,
usando TFA al 55% en diclorometano durante 30 minutos, dejando la
sal de TFA del grupo \alpha-amino. Se lavaron las
bolsas y se completó la síntesis repitiendo el mismo procedimiento
mientras se sustituyó el aminoácido correspondiente en la etapa de
acoplamiento. Se llevó a cabo la acetilación del extremo
N-terminal haciendo reaccionar las resinas del
péptido con una solución de anhídrido acético en diclorometano, en
presencia de diisopropiletilamina. Seguidamente, se desprotegió la
cadena lateral del péptido y se escindió de la resina a 0ºC con HF
líquido, en presencia de anisol como eliminador del
carbocatión.
Los péptidos brutos se purificaron por
cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa. Los
precursores lineales purificados de los péptidos cíclicos se
solubilizaron en ácido acético al 75%, a una concentración de
2-10 mg/ml. Se agregó, gota a gota, una solución al
10% de yodo en metanol, hasta obtener una coloración persistente.
Se agregó a la mezcla, entonces, una solución al 5% de ácido
ascórbico en agua hasta su decoloración. Los compuestos que
contienen el puente de disulfuro se purificaron, seguidamente, por
HPLC y se caracterizaron por HPLC analítica y por análisis
espectral de masas.
Tres moléculas de adhesión celular,
N-cadherina, N-CAM y L1, son capaces
de regular el crecimiento de axones (Doherty y Walsh, Curr. Op.
Neurobiol. 4:49-55, 1994; Williams et
al., Neuron 13:583-594, 1994; Hall et
al., Cell Adhesion and Commun. 3:441-450,
1996; Doherty y Walsh, Mol. Cell. Neurosci.
8:99-111, 1994; Safell et al., Neuron
18:231-242, 1997). Las neuronas cultivadas en
monocapas de células 3T3, que han sido transfectadas con ADNc que
codifican N-cadherina, N-CAM o L1
extienden axones de mayor longitud que las neuronas cultivadas en
células 3T3 que no expresan estas moléculas de adhesión celular.
Este Ejemplo ilustra el uso de un péptido cíclico representativo
para inhibir el crecimiento axonal.
Se cultivaron neuronas en monocapas de células
3T3 transfectadas con ADNc que codifica N-cadherina,
básicamente de la forma descrita por Doherty y Walsh, Curr. Op.
Neurobiol. 4:49-55, 1994; Williams et
al., Neuron 13:583-594, 1994; Hall et
al., Cell Adhesion and Commun. 3:441-450,
1996; Doherty y Walsh, Mol. Cell. Neurosci.
8:99-111, 1994; Safell et al., Neuron
18:231-242, 1997. En pocas palabras, se
establecieron monocapas de fibroblastos 3T3 de control y
fibroblastos 3T3 que expresan N-cadherina mediante
el cultivo durante la noche de 80.000 células en pocillos
individuales de una lámina de cultivo celular de pocillos con 8
cámaras. Se cultivaron durante 18 horas 3.000 neuronas cerebelares
aisladas de cerebros de ratón post-natales, de 3
días de edad sobre las diversas monocapas en medio de control
(SATO/SBF al 2%), o en medio suplementado con diversas
concentraciones del péptido cíclico
N-Ac-CHAVC-NH_{2}
o un péptido de control, sin la secuencia HAV
(N-Ac-CHGVC-NH_{2}). A continuación, los
cultivos se fijaron y tiñeron para GAP43, que se fija
específicamente a las neuronas y a sus axones. Se midió, entonces,
la longitud del axón más largo en cada neurona positiva para GAP43
mediante morfometría computa-
dorizada.
dorizada.
Tal como se muestra en la Figura 4, el cultivo
durante 18 horas con N-Ac-CHAVC-NH_{2} a
una concentración de 500 \mug/ml inhibió el crecimiento axonal en
células 3T3 que expresan N-cadherina, en tanto que
el péptido cíclico N-Ac-CHGVC-NH_{2}
(también a una concentración de 500 \mug/ml) careció de efecto
sobre este proceso. Adicionalmente, el péptido cíclico
N-Ac-CHAVC-NH_{2} (usado a una
concentración de 500 \mug/ml) no inhibió el crecimiento del axón
en células 3T3 que no expresan N-cadherina,
N-CAM ni L1 (células de control), indicando, de
esta forma, que el péptido no es tóxico y carece de efectos
inespecíficos sobre el crecimiento axonal (Figura 4, compárense las
columnas 3 y 1). Estos datos indican, asimismo, que el péptido no
afecta a la función de la integrina.
Un estudio de respuesta a la dosis demostró que
N-Ac-CHAVC-NH_{2} inhibió de manera
significativa el crecimiento del axón en células 3T3 que expresan
N-cadherina a una concentración de 50 \mug/ml, y
lo inhibió por completo en estas células a una concentración de 500
\mug/ml (Figura 5). Por último,
N-Ac-CHAVC-NH_{2} (utilizado a una
concentración de 500 \mug/ml) no inhibió el crecimiento axonal en
células 3T3 que expresan N-CAM o L1 (Figura 6).
Estos resultados indican que el péptido
N-Ac-CHAVC-NH_{2} inhibe, de modo
específico, la función sobre N-cadherina. En su
conjunto, los resultados obtenidos de estos estudios demuestran que
N-Ac-CHAVC-NH_{2} es un inhibidor eficaz
del crecimiento axonal en virtud de su capacidad para romper la
función de la N-cadherina.
\vskip1.000000\baselineskip
Este Ejemplo ilustra el uso de péptidos cíclicos
representativos para romper la adhesión de células endoteliales que
expresan N-cadherina.
Se cosecharon células endoteliales de la arteria
pulmonar bovina por ablación estéril y digestión en colagenasa al
0,1% (tipo II; Worthington Enzymes, Freehold, NJ). Las células se
mantuvieron en medio esencial mínimo de Dulbecco (Clonetics, San
Diego, CA) suplementado con suero bovino fetal al 10% (Atlantic
Biologicals, Nor Cross, GA) y
antibiótico-antimicótico al 1%, a 37ºC en aire con
CO_{2} al 7%. Los cultivos se sometieron a pasajes semanales en
tripsina-EDTA (Gibco, Grand Island, NY) y se
sembraron en plástico de cultivo tisular a 20.000 células/cm^{2}
para todos los experimentos. Los cultivos endoteliales se usaron a
la semana 1 de cultivo, que es aproximadamente 3 días después del
establecimiento de la confluencia de cultivos. Las células
utilizadas en todos los protocolos estuvieron entre el pasaje 4º y
el pasaje 10º. Las células fueron sembradas sobre cubreobjetos y
tratadas durante 30 minutos con
N-Ac-CHAVC-NH_{2} o
N-Ac-CHGVC-NH_{2} a 500 \mug/ml y, a
continuación, fueron fijadas con paraformaldehído al 1%.
El péptido
N-Ac-CHAVC-NH_{2} rompió la monocapa de
células endoteliales dentro de los 30 minutos siguientes a su
adición al medio de cultivo, en tanto que
N-Ac-CHGVC-NH_{2} no tuvo efecto alguno
sobre las células (Figura 7). La morfología de las células
endoteliales se vio fuertemente afectada por
N-Ac-CHAVC-NH_{2}, y las células se
retrajeron entre sí, haciéndose no adherentes. Estos datos
demuestran que N-Ac-CHAVC-NH_{2} es capaz
de inhibir la adhesión de células endoteliales.
Bajo las mismas condiciones, los péptidos
cíclicos N-Ac-CHAVC-NH_{2},
N-Ac-CAHAVDIC-NH_{2} (Figura 8) y
N-Ac-CHAVSC-NH_{2} carecieron de efecto
sobre la morfología de las células endoteliales, lo que indica que
no todos los péptidos cíclicos que contienen HAV son capaces de
romper la adhesión de células endoteliales a una concentración de
500 \mug/ml. No es inesperado que varíen las potencias de péptidos
cíclicos individuales. El péptido cíclico
N-Ac-
CAHAVDC-NH_{2} (Figura 9) tuvo un ligero efecto, en tanto que N-Ac-CSHAVSSC-NH_{2} (Figura 10) rompió la monocapa de células endoteliales y provocó la retracción de las células entre sí.
CAHAVDC-NH_{2} (Figura 9) tuvo un ligero efecto, en tanto que N-Ac-CSHAVSSC-NH_{2} (Figura 10) rompió la monocapa de células endoteliales y provocó la retracción de las células entre sí.
\vskip1.000000\baselineskip
Este Ejemplo ilustra el uso de un péptido
cíclico representativo para romper la adhesión de células cancerosas
de ovario humano.
La línea de células cancerosas del ovario humano
SKOV3 (ATCC nº HTB-77) expresa
N-cadherina. Se cultivaron células SKOV3 en un
medio modificado, basado en MEM, que contuvo SBF al 10%. Las células
se cultivaron en frascos de cultivo T-250 y se
mantuvieron mediante subcultivo periódico. Los péptidos cíclicos se
ensayaron sobre células cultivadas en pocillos individuales de
placas de cultivo de 96 pocillos (superficie de cada pocillo, 0,32
cm^{2}). Las células se cosecharon de los frascos y se sembraron a
una densidad de 50.000 células por pocillo en 0,1 ml de medio que
contuvo el péptido cíclico a concentraciones de 1, 0,1 ó 0,01 mg/ml,
o en ausencia de péptido cíclico. Asimismo, se establecieron
pocillos de control con el medio. Los cultivos fueron evaluados
periódicamente por análisis microscópico tanto en campo brillante
como bajo contraste de fase. Los cultivos se mantuvieron durante 48
horas.
Tal como se muestra en la Figura 11A (compárese
con la Figura 11C) y 12A, el péptido
N-Ac-CHAVC-NH_{2} (concentración final de
1 mg/ml de medio) rompió la adhesión de las células SKOV3 en un
plazo de 24 horas, en tanto que el péptido de control
N-Ac-CHGVC-NH_{2} careció de efecto sobre
la adhesión celular (Figuras 11B y 12B). El efecto de diferentes
cantidades de N-Ac-CHAVC-NH_{2} después de
48 horas se muestra en las Figuras 11D-F. En
presencia de N-Ac-CHGVC-NH_{2} (Figuras 11B
y 12B), las células SKOV3 formaron monocapas fuertemente
adherentes. Por el contrario, las células SKOV3 no se diseminaron a
los sustratos ni formaron monocapas fuertemente adherentes en
presencia de N-Ac-CHAVC-NH_{2} (Figuras
11A, D y 12A). Estos datos demuestran que
N-Ac-CHAVC-NH_{2} es capaz de inhibir la
función de la N-cadherina humana.
Los péptidos cíclicos
N-Ac-CAHAVDIC-NH_{2}, y
N-Ac-CAHAVDC-NH_{2} y
N-Ac-KHAVC-NH_{2} fueron inactivos en las
células SKOV3, indicando, de este modo, que no todos los péptidos
que contienen la secuencia HAV son capaces de romper la adhesión de
células endoteliales a concentraciones de 0,01-1
mg/ml. No resulta inesperado que varíen las potencias de los
péptidos cíclicos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los vasos sanguíneos están compuestos por
células endoteliales adherentes. Este Ejemplo ilustra el uso de un
péptido cíclico representativo para bloquear la angiogénesis
(crecimiento de vasos sanguíneos a partir de vasos sanguíneos
preexistentes).
Se utilizó el ensayo de membrana corioalantoica
de pollo para evaluar los efectos de los péptidos cíclicos sobre la
angiogénesis (Iruela-Arispe et al.,
Molecular Biology of the Cell 6:327-343,
1995). Se incluyeron péptidos cíclicos en una malla compuesta por
vitrógeno a concentraciones de 3, 17 y 33 \mug/malla. A
continuación, las mallas se aplicaron a membranas corioalantoicas
embrionarias de pollo de 12 días de edad. Después de 24 horas, se
evaluaron los efectos de los péptidos sobre la angiogénesis mediante
análisis morfométrico computadorizado. El péptido cíclico
H-CHAVC-NH_{2}, al que se había retirado el grupo
bloqueador N-terminal, inhibió la angiogénesis en
27%, 34% y 35% a concentraciones de 3, 17 y 33 \mug/malla,
respectivamente. El péptido cíclico
N-Ac-CHAVSC-NH_{2} demostró ser inactivo en
este ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células NRK expresan
E-cadherina, y los cultivos monocapa de estas
células exhiben una morfología de empedrado. El presente Ejemplo
ilustra la capacidad de un péptido cíclico representativo para
romper la adhesión de células NRK.
Se sembraron células NRK (ATCC nº
1571-CRL) a razón de 10-20.000
células por frascos de cultivo de tejidos de 35 mm que contuvieron
DMEM con SBF al 10%, con subcultivos periódicos (Laird et
al., J. Cell Biol. 131:1193-1203, 1995).
Las células se cosecharon y repusieron en frascos de cultivos de
tejidos de 35 mm que contuvieron cubreobjetos de 1 mm y se
incubaron hasta una confluencia de 50-65%
(24-36 horas). En ese momento, se transfirieron los
cubreobjetos a una placa de 24 pocillos, se lavaron una vez con DMEM
recién preparado y fueron expuestos a soluciones de péptidos
cíclicos (N-Ac-CHAVC-NH_{2} y
N-Ac-CHGVC-NH_{2}), a una concentración de
1 mg/ml durante 24 horas. A continuación, se agregaron soluciones
recientes de péptidos y se dejaron las células en cultivo durante
24 horas adicionales. Las células fueron fijadas con metanol al 100%
durante 10 minutos y, entonces, fueron lavadas tres veces con PBS.
Los cubreobjetos se bloquearon durante 1 hora en BSA al 2%/PBS y se
incubaron durante 1 hora adicional, en presencia de anticuerpo
anti-E-cadherina de ratón
(Transduction Labs, Lexington, KY; dilución 1:250). Anticuerpos
primarios y secundarios fueron diluidos en BSA al 2%/PBS. Tras la
incubación en los anticuerpos primarios, los cubreobjetos se lavaron
tres veces durante 5 minutos cada vez en PBS y se incubaron durante
1 hora con anticuerpo anti-ratón de asno conjugado
con fluoresceína (Jackson Immuno Research, West Grove, PA; dilución
1:200). Después de un lavado adicional en PBS (3 x 5 min), se
montaron y analizaron los cubreobjetos por microscopia confocal.
El péptido
N-Ac-CHAVC-NH_{2} rompió la adhesión de
células NRK (Figura 13D, compárese con 13A), en tanto que
N-Ac-CHGVC-NH_{2} no tuvo ningún efecto
sobre la adhesión celular (Figura 13C). En presencia de
N-Ac-CHGVC-NH_{2}, las células NRK
formaron monocapas fuertemente adherentes con morfología de
empedrado. También expresaron E-cadherina, tal como
se desprende de los protocolos de tinción inmunofluorescente (Laird
et al., J. Cell Biol. 131:1193-1203,
1995) (Figura 14C). Por el contrario, las células NRK tratadas con
N-Ac-CHAVC-NH_{2} no mostraron adhesión
entre sí y no formaron monocapas contiguas (Figura 13D).
Adicionalmente, estas células expresaron niveles muy reducidos de
E-cadherina (Figura 14D). Estos datos demuestran que
N-Ac-CHAVC-NH_{2} es capaz de romper la
adhesión de células NRK.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células epiteliales de la piel (conocidas
como queratinocitos) expresan E-cadherina. Este
Ejemplo ilustra el uso de un péptido cíclico representativo para
potenciar la permeabilidad de la piel humana.
En estos ensayos, se utilizó piel del abdomen
humano obtenida en la autopsia dentro de las 24 horas siguientes al
fallecimiento. Utilizando un dispositivo Franz Cell (Franz, Curr.
Prob. Dermatol. 7:58-68, 1978; Franz, J.
Invest. Dermatol. 64:190-195, 1975) se evaluó,
entonces, el efecto de N-Ac-CHAVC-NH_{2} y
N-Ac-CHGVC-NH_{2} (usados a una
concentración de 500 \mug/ml) sobre la penetración de dos marcas
fluorescentes, Oregon Green (carga, -1,PM 386 dalton) y Rhodamine
Green Dextran (sin carga, PM 3000 dalton) a través de la piel
humana. Los péptidos y las marcas se disolvieron en tampón fosfato
estéril, pH 7,2, y se utilizó tampón fosfato como líquido receptor.
La penetración de las marcas a través de la piel se evaluó 6, 12,
24, 36 y 48 horas después del inicio del experimento. Para cada
combinación de péptido y marca, el experimento se llevó a cabo por
triplicado.
N-Ac-CHAVC-NH_{2}
(muestra nº 1) incrementó ligeramente la penetración de Oregon Green
a través de la piel, en comparación con el efecto de
N-Ac-CHgVC-NH_{2} (muestra nº 3) sobre la
penetración de esta marca (Tabla 2). La penetración de Rhodamine
Green a través de la piel resultó significativamente aumentada en
presencia de N-Ac-CHAVC-NH_{2}, comparada
con N-Ac-CHgVC-NH_{2} (Tabla 3).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Este Ejemplo ilustra, de manera adicional, la
capacidad de péptidos cíclicos representativos para romper la
adhesión entre células cancerosas de ovario humano.
En estos experimentos se utilizó la línea
celular del cáncer de ovario humano OVCAR-3, que
expresa E-cadherina. Las células se cultivaron en
RPMI suplementado con insulina, con un contenido de SBF al 20%. Las
células fueron cultivadas en frascos de cultivo
T-250 y fueron mantenidas por subcultivos
periódicos. Se cosecharon las células del frasco y se sembraron en
pocillos individuales de placas de cultivo de 96 pocillos
(superficie de cada pocillo, 0,32 cm^{2}), con una densidad de
50.000 células por pocillo en 0,1 ml de medio que contuvo los
péptidos cíclicos (a concentraciones de 1, 0,1 ó 0,01 mg/ml). Se
establecieron, igualmente, pocillos de control con medio. Los
cultivos se evaluaron periódicamente por examen microscópico, bajo
condiciones tanto de campo brillante como de contraste de fase, y
se mantuvieron durante 48 horas. Se demostró que
N-Ac-CHAVC-NH_{2} fue inactivo en este
ensayo a las citadas concentraciones. No obstante, el péptido
cíclico N-Ac-CHAVSC-NH_{2} rompió la
adhesión de OVCAR-3 (Figuras 15A-C).
Estos datos demuestran que
N-Ac-CHAVSC-NH_{2} actúa de forma
específica sobre células que expresan
E-cadherina.
\vskip1.000000\baselineskip
Este Ejemplo ilustra la capacidad de un péptido
cíclico representativo para romper la adhesión de células de
melanoma.
Se sembraron sobre cubreobjetos de vidrio
células ME115 de melanoma (cedidas amablemente por Meenhard Herlyn,
Wistar Institute, Filadelfia, PA), y se cultivaron durante 24 horas
en medio de cultivo de queratinocitos al 50% (Clonetics, San Diego,
CA) y 50% de L15. Se agregó, entonces, medio reciente que contuvo
los péptidos cíclicos (concentración final 500 \mug/ml de medio)
N-Ac-CHAVC-NH_{2} o
N-Ac-CHGVC-NH_{2}. Después de 24 horas de
cultivo en presencia de los péptidos, se separó el medio y se agregó
medio reciente que contuvo los péptidos. Las células se fijaron 24
horas más tarde con metanol frío y se conservaron en solución salina
con tampón fosfato (PBS).
Los cubreobjetos fueron bloqueados durante 1
hora en ovalbúmina al 3%/PBS, y se incubaron durante 1 hora
adicional en presencia de un anticuerpo de conejo contra
pan-cadherina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO),
diluido a 1:500. Los anticuerpos primario y secundario se diluyeron
en PBS que contuvo suero de cabra normal al 6%. Tras la incubación
en el anticuerpo primario, los cubreobjetos se lavaron 3 veces
durante 5 minutos cada vez en PBS, y se incubaron durante 1 hora en
inmunoglobulina G anti-conejo de cabra, conjugada
con fluoresceína (Kiekegard y Perry, San Francisco Sur, CA),
diluido a 1:100. Después de un lavado adicional en PBS (3 x 5
minutos), los cubreobjetos se montaron en Vectashield (Vector Labs,
Burlingame, CA) y se analizaron con un microscopio Zeiss corregido
para infinito.
Las fotografías que se muestran en la Figura 16
demuestran la ausencia de tinción de la membrana celular y la
aparición de tinciones vesiculares brillantes intracelulares en las
células tratadas con N-Ac-CHAVC-NH_{2}.
Por el contrario, las células expuestas a
N-Ac-CHGVC-NH_{2} mostraron tinción de
cadherina sobre la totalidad de la membrana celular.
Ocasionalmente, la tinción se concentró en puntos del contacto entre
células. Estos resultados indican que el péptido cíclico
representativo N-Ac-CHAVC-NH_{2} rompe la
adhesión entre células de melanoma.
\vskip1.000000\baselineskip
Este Ejemplo ilustra la capacidad de un péptido
cíclico representativo para romper la adhesión de células
epiteliales del cáncer de mama humano.
Células epiteliales de cáncer de mama humano
A1N4 (amablemente cedidas por Martha Stampfer, Lawrence Berkeley
Laboratory, Berkeley, CA) se sembraron sobre cubreobjetos de vidrio,
cultivándolas en F12/DME con SBF al 0,5% y 10 ng/ml de EGF, durante
24 horas. Se agregó, entonces, medio reciente que contuvo los
péptidos cíclicos (concentración final 500 \mug/ml de medio)
N-Ac-CHAVC-NH_{2} o
N-Ac-CHGVC-NH_{2}. Después de 24 horas de
cultivo en presencia de los péptidos, se separó el medio y se agregó
medio reciente que contuvo los péptidos. Las células fueron fijadas
24 horas más tarde con metanol frío y se conservaron en solución
salina con tampón fosfato (PBS).
Los cubreobjetos fueron bloqueados durante 1
hora en ovalbúmina al 3%/PBS, incubándolos durante 1 hora adicional
en presencia de 1 \mug/ml de anticuerpo
anti-E-cadherina de ratón (Zymed,
Gaithersburg, MD). Los anticuerpos primario y secundario se
diluyeron en PBS que contuvo suero de cabra normal al 6%. Tras la
incubación en el anticuerpo primario, se lavaron los cubreobjetos
durante sendos 5 minutos en PBS, y se les incubó durante 1 hora con
anti-ratón de cabra conjugado con fluoresceína
(Kiekegard y Perry, San Francisco Sur, CA), diluido a 1:100.
Después de un lavado adicional en PBS (3 x 5 minutos), los
cubreobjetos se montaron en Vectashield (Vecta Labs, Burlingame,
CA), analizándolos con un microscopio Zeiss corregido para
infinito.
Las fotografías que aparecen en las Figuras 17A
y B demuestra una tinción de E-cadherina disminuida,
con aspecto entrecortado en las células tratadas con
N-Ac-CHAVC-NH_{2}. Adicionalmente, en la
monocapa se aprecian perforaciones, en los puntos donde las células
se han retraído entre sí. Por el contrario, las células expuestas a
N-Ac-CHGVC-NH_{2} mostraron tinción de
E-cadherina concentrada en los puntos de contacto
entre células, y formaron una monocapa fuertemente adherente.
\vskip1.000000\baselineskip
Este Ejemplo ilustra el trabajo inicial para
evaluar los efectos citotóxicos de péptidos cíclicos
representativos.
Se evaluaron los posibles efectos citotóxicos de
N-Ac-CHAVC-NH_{2} y del péptido de control
N-Ac-CHGVC-NH_{2} en células endoteliales
microvasculares humanas (HMVEC; Clonetics), células endoteliales de
la vena umbilical humana (HUVEC; ATCC nº CRL-1730),
IAFp2 (línea celular de fibroblastos humanos; Instituto
Armand-Frapier, Montreal, Quebec),
WI-38 (línea celular de fibroblastos humanos; ATCC
nº CCL-75), MDA-MB231 (línea celular
de cáncer de mama humano; ATCC nº HTB-26), y
PC-3 (línea celular de cáncer de próstata humano;
ATCC nº CRL-1435), utilizando el ensayo MTT (Plumb
et al., Cancer Res. 49:4435-4440,
1989). Ninguno de los péptidos fue citotóxico a concentraciones de
hasta 100 \muM, incluida esta última. Del mismo modo, ninguno de
los péptidos fue capaz de inhibir la proliferación de las líneas
celulares anteriores a concentraciones de hasta 100 \muM, tal
como se determina por los ensayos de incorporación de
^{3}H-timidina.
Adicionalmente, se evaluaron los posibles
efectos citotóxicos de N-Ac-CHAVC-NH_{2} y
N-Ac-CHAVSC-NH_{2}, así como sus
correspondientes péptidos de control
N-Ac-CHGVC-NH_{2} y
N-Ac-CHGVSC-NH_{2}, sobre las líneas
celulares anteriormente citadas, usando el ensayo MTT. Ninguno de
los péptidos fue citotóxico a concentraciones de hasta 100 \muM.
Sin embargo, N-Ac-CHAVSC-NH_{2} y
N-Ac-CHGVSC-NH_{2} inhibieron la
proliferación de HUVEC a concentraciones (valores de CT_{50}) de
57 \muM y 42 \muM, respectivamente, tal como se deduce de los
ensayos de incorporación de ^{3}H-timidina.
N-Ac-CHAVSC-NH_{2} inhibió también la
proliferación de células MDA-MB231 a una
concentración de 52 \muM (Tablas 4 y 5).
Sobre la base de todo lo anterior, resultará
evidente que, aunque en este documento se han descrito formas de
realización específicas de la invención con el fin de ilustrarla, es
posible llevar a cabo diversas modificaciones sin desviarse de la
invención.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: McGill University
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPUESTOS Y MÉTODOS PARA MODULAR LA ADHESIÓN CELULAR
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 47
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: SEED y BERRY LLP
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 6300 Columbia Center, 701 5ª Avenida
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Seattle
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Washington
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 98104
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA DIGITAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FECHA ACTUAL DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 11-JUL-1997
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Maki, David J.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 31.392
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/CERTIFICADO: 100086.401PC
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (206) 622-4900
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (206) 682-6031
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 108 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 108 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 108 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 108 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 108 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 108 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 108 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys His Ala Val Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys His Gly Val Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ala His Ala Val Asp Ile Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ala His Gly Val Asp Ile Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ser His Ala Val Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ser His Gly Val Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys His Ala Val Ser Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys His Gly Val Ser Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ala His Ala Val Asp Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:17:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ala His Gly Val Asp Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:18:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ser His Ala Val Ser Ser Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:19:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ser His Gly Val Ser Ser Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:20:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys His Ala Val Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:21:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys His Gly Val Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:22:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ala His Ala Val Asp Ile Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:23:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ala His Gly Val Asp Ile Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /producto = "Dbu"/
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:24:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa His Ala Val Ser Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /producto = "Om"/
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:25:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa His Ala Val Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:26:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Ala His Ala Val Asp Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:27:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Ala His Gly Val Asp Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 5
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /producto = "OTRO"/observación = "El residuo es beta, beta-dimetil cisteína"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:28:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys His Ala Val Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /producto = "OTRO"/observación = "El residuo es beta, beta-tetrametilen cisteína"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:29:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Xaa Tyr Ser His Ala Val Ser Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /producto = "OTRO"/observación = "El residuo es beta, beta-pentametilen cisteína"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:30:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Xaa Tyr Ser His Ala Val Ser Ser
Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /producto = "OTRO"/observación = "El residuo es ácido beta-mercaptopropiónico"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:31:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Tyr Ser His Ala Val Ser Ser Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /producto = "OTRO"/observación = "El residuo es ácido beta, beta-pentametilen-beta-mercaptopropiónico"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:32:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Tyr Ser His Ala Val Ser Ser Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:33:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Asp Gly Tyr Pro Lys asp Cys Lys
Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:34:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Asp Gly Tyr Pro Lys Asp Cys Lys
Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:35:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu
Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:36:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu
Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:37:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Tyr Ile Gln Asn Cys Pro Leu Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:38:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Tyr Ile Gln Asn Cys Pro Leu Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:39:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Trp Gly Gly Trp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:40:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Asp Arg Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:41:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:41:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Xaa Asn Asp Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:42:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:42:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Asp Xaa Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:43:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:43:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Val Asn Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:44:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:44:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala His Ala Val Asp Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:45:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:45:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser His Ala Val Ser Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:46:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:46:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Ser His Ala Val Ser Ser Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:47:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:47:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Ile Gly Ser Arg}
Claims (76)
1. Un péptido cíclico que tiene la fórmula
(Z1)-(Y1)-(X1)-His-Ala-Val-(X2)-(Y2)-(Z2),
en donde X_{1} y X_{2} son opcionales y, si están presentes, se
seleccionan, independientemente, del grupo consistente en residuos
aminoácidos y sus combinaciones, en donde los residuos están unidos
por enlaces peptídicos, y en donde X_{1} y X_{2} tienen,
independientemente, un tamaño dentro del intervalo de 0 a 10
residuos, de forma que la suma de residuos contenidos en X_{1} y
X_{2} se encuentra dentro del intervalo de 1 a 12; Y_{1} e
Y_{2} se seleccionan, independientemente, del grupo consistente
en residuos aminoácidos, y en donde se forma un enlace covalente
entre los residuos Y_{1} e Y_{2}; y en donde Z_{1} y Z_{2}
son opcionales y, si están presentes, se seleccionan,
independientemente, del grupo consistente en residuos aminoácidos y
sus combinaciones, en donde los residuos están unidos por enlaces
peptídicos, en donde dicho péptido cíclico modula la adhesión
celular mediada por cadherina.
2. Un péptido cíclico según la reivindicación 1,
en donde Z_{1} no está presente, e Y_{1} comprende un grupo
N-acetilo, o en donde Z_{2} no está presente, e
Y_{2} comprende un grupo amida C-terminal, o en
donde Y_{1} e Y_{2} están unidos covalentemente entre sí a
través de un enlace disulfuro, o en donde Y_{1} e Y_{2} están
unidos covalentemente por un enlace amida, o en donde Y_{1} e
Y_{2} están unidos covalentemente por un enlace tioéter.
3. Un péptido cíclico según la reivindicación 2,
en donde Y_{1} e Y_{2} están unidos covalentemente por un
enlace disulfuro, y en donde Y_{1} e Y_{2} se seleccionan, cada
uno de forma independiente, del grupo consistente en penicilamina,
\beta,\beta-tetrametilen cisteína,
\beta,\beta-pentametilen cisteína, ácido
\beta-mercaptopropiónico, ácido
\beta,\beta-pentametilen-\beta-mercaptopropiónico,
y 2-mercaptobenceno,
2-mercaptoanilina,
2-mercaptoprolina.
4. Un péptido cíclico según la reivindicación 2,
en donde Y_{1} e Y_{2} están unidos covalentemente a través de
un enlace disulfuro, y en donde Y_{1} e Y_{2} son residuos
cisteína.
5. Un péptido cíclico según la reivindicación 4,
en donde dicho péptido cíclico comprende la secuencia
Cys-His-Ala-Val-Cys
(SEQ ID NO:8).
6. Un péptido cíclico según la reivindicación 5,
que comprende, adicionalmente, un grupo N-acetilo o
un grupo amida C-terminal.
7. Un péptido cíclico según la reivindicación 4,
en donde dicho péptido cíclico comprende una secuencia seleccionada
del grupo consistente en
Cys-Ala-His-Ala-Val-Asp-Ile-Cys
(SEQ ID NO:10),
Cys-Ser-His-Ala-Val-Cys
(SEQ ID NO:12),
Cys-His-Ala-Val-Ser-Cys
(SEQ ID NO:14),
Cys-Ala-His-Ala-Val-Asp-Cys
(SEQ ID NO:16), y
Cys-Ser-His-Ala-Val-Ser-Ser-Cys
(SEQ ID NO:18).
8. Un péptido cíclico según la reivindicación 2,
en donde Y_{1} e Y_{2} están unidos covalentemente a través de
un enlace amida, y en donde dicho enlace amida se forma entre grupos
funcionales terminales, o en donde dicho enlace amida se forma
entre cadenas laterales de residuos, o en donde dicho enlace amida
se forma entre un grupo funcional terminal y una cadena lateral del
residuo.
9. Un péptido cíclico según la reivindicación 2,
en donde Y_{1} e Y_{2} están unidos covalentemente a través de
un enlace amida, y en donde:
- (a)
- Y_{1} se selecciona del grupo consistente en lisina y ornitina, e Y_{2} se selecciona del grupo consistente en aspartato y glutamato;
- (b)
- Y_{2} se selecciona del grupo consistente en lisina y ornitina, e Y_{1} se selecciona del grupo consistente en aspartato y glutamato.
10. Un péptido cíclico según la reivindicación
2, en donde Y_{1} e Y_{2} están unidos covalentemente a través
de un enlace amida, y en donde dicho péptido cíclico comprende la
secuencia
Lys-His-Ala-Val-Asp
(SEQ ID NO:20), o
Ala-His-Ala-Val-Asp-Ile
(SEQ ID NO:44).
11. Un péptido cíclico según la reivindicación
1, en donde Y_{1} e Y_{2} son, cada uno, triptófano, de modo
que dicho enlace covalente genera un
\delta_{1}\delta_{1}-ditriptófano.
12. Un péptido cíclico según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 11, unido a un agente de acceso
("targeting agent") o un medicamento, o un soporte
sólido, o una marca detectable.
13. Un péptido cíclico según la reivindicación
12, en donde dicho soporte sólido es una matriz polímera.
14. Un péptido cíclico según la reivindicación
13, en donde dicho soporte sólido se selecciona del grupo
consistente en placas plásticas, tubos plásticos, suturas,
membranas, películas ultrafinas, biorreactores y
micropartículas.
15. Un péptido cíclico según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 11, unido a una molécula que comprende un
sitio de unión para una molécula de adhesión, en donde dicha
molécula de adhesión no es una cadherina clásica.
16. Una composición farmacéutica que comprende
un péptido cíclico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
11, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
17. Una composición según la reivindicación 16,
que comprende, adicionalmente, un medicamento.
18. Una composición según la reivindicación 17,
en la que dicho medicamento está unido a dicho péptido cíclico.
19. Una composición según la reivindicación 16,
en la que dicho péptido cíclico se encuentra presente en una
formulación de liberación sostenida.
20. Un método in vitro para modular la
adhesión celular, que comprende hacer contactar una célula que
expresa cadherina con un péptido cíclico según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11.
21. Un método según la reivindicación 20, en
donde dicha cadherina se selecciona del grupo consistente en
E-cadherina o N-cadherina, o en el
que dicha cadherina se selecciona del grupo consistente en
P-cadherina, R-cadherina y otras
cadherinas que comprenden la secuencia de reconocimiento de adhesión
celular HAV.
22. Un método según la reivindicación 20, en el
que dicha célula se selecciona del grupo consistente en células
epiteliales, células endoteliales, células nerviosas, células
tumorales, y linfocitos.
23. Un método según la reivindicación 20, en el
que dicho péptido cíclico inhibe la adhesión celular.
24. Un péptido cíclico según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 11, para ser usado en un método dirigido a
reducir las adhesiones celulares no deseadas en un mamífero, que
comprende administrar dicho péptido a un ma-
mífero.
mífero.
25. Un péptido cíclico según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 11, para ser utilizado en un método
dirigido a potenciar el suministro de un medicamento a través de la
piel de un mamífero, que comprende hacer contactar las células
epiteliales de un mamífero con dicho péptido y un medicamento, bajo
las condiciones y durante el período de tiempo suficientes para
permitir el paso de dicho medicamento a través de dichas células
epiteliales.
26. Un péptido según la reivindicación 25, en el
que dicho péptido cíclico pasa al torrente circulatorio de dicho
mamífero.
27. Una composición según la reivindicación 16,
para ser usada en un método dirigido a potenciar el suministro de
un medicamento a un tumor en un mamífero, que comprende administrar
dicha composición a un mamífero.
28. Una composición según la reivindicación 27,
en la que dicha composición se administra a dicho tumor.
29. Una composición según la reivindicación 27,
en la que el tumor se selecciona del grupo consistente en tumores
de vejiga, tumores ováricos, y melanomas.
30. Una composición según la reivindicación 27,
en la que dicha composición se administra por inyección, o por vía
tópica, o por vía sistémica.
31. Una composición según la reivindicación 16,
para ser usada en el tratamiento del cáncer en un mamífero, que
comprende administrar dicha composición a un mamífero afecto de
cáncer.
32. Una composición según la reivindicación 31,
en la que dicho cáncer se selecciona del grupo consistente en
carcinomas, leucemia, y melanomas.
33. Una composición según la reivindicación 16,
para ser utilizada en un método dirigido a inhibir las metástasis
de células tumorales en un mamífero, que comprende administrar dicha
composición a un mamífero.
34. Una composición según la reivindicación 16,
para ser utilizada en un método dirigido a inhibir la angiogénesis
en un mamífero, que comprende administrar dicha composición a un
mamífero.
35. Una composición según la reivindicación 16,
para ser utilizada en un método dirigido a potenciar el suministro
de un medicamento al cerebro de un mamífero, que comprende
administrar dicha composición a un mamífero.
36. Una composición según la reivindicación 35,
en la que dicha composición se administra por inyección.
37. Un método según la reivindicación 20, en el
que dicho péptido cíclico potencia la adhesión celular.
38. Un péptido cíclico según la reivindicación
13, para ser usado en un método dirigido a potenciar la
cicatrización de heridas en un mamífero, que comprende hacer
contactar una herida en un mamífero con dicho péptido.
\newpage
39. Un péptido cíclico según la reivindicación
13, para ser usado en un método dirigido a potenciar la adhesión de
un tejido extraño implantado en un mamífero, que comprende hacer
contactar un sitio de implante en un mamífero con dicho
péptido.
40. Un péptido según la reivindicación 39, en el
que dicho tejido extraño es un injerto cutáneo o un implante de
órgano.
41. Un método in vitro para inducir la
apoptosis en una célula que expresa cadherina, que comprende hacer
contactar una célula que expresa cadherina con un péptido cíclico,
según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
11.
11.
42. Un método in vitro para potenciar y/o
dirigir el crecimiento axonal, que comprende hacer contactar una
neurona con un péptido cíclico según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11.
43. Una composición según la reivindicación 16,
para ser usada en un método dirigido a tratar lesiones de la médula
espinal en un mamífero, que comprende administrar dicha composición
a un mamífero.
44. Un péptido cíclico según la reivindicación
13, para ser usado en un método dirigido a tratar lesiones de la
médula espinal en un mamífero, que comprende administrar dicho
péptido a un mamífero.
45. Una composición según la reivindicación 16,
para ser usada en un método dirigido a tratar una enfermedad
neurológica desmielinizante en un mamífero, que comprende
administrar dicha composición a un mamífero.
46. Una composición según la reivindicación 45,
en la que dicha enfermedad es esclerosis múltiple.
47. Una composición según la reivindicación 16,
para ser usada en un método dirigido a modular el sistema inmune de
un mamífero, que comprende administrar dicha composición a un
mamífero.
48. Una composición según la reivindicación 19,
para ser usada en un método dirigido a prevenir la gestación en un
mamífero, que comprende administrar dicha composición a un
mamífero.
49. Una composición según la reivindicación 48,
en la que la administración se lleva a cabo por vía intravaginal o
intrauterina.
50. Una composición según la reivindicación 16,
para ser usada en un método dirigido a aumentar la permeabilidad
vascular en un mamífero, que comprende administrar dicha composición
a un mamífero.
51. Un método para identificar un péptido
cíclico capaz de modular la adhesión celular mediada por cadherina,
que comprende:
- (a)
- cultivar neuronas en una monocapa de células que expresan N-cadherina, en presencia y en ausencia de un péptido cíclico candidato, bajo las condiciones y durante el período de tiempo suficientes para permitir el crecimiento axonal;
- (b)
- determinar la longitud media del axón para dichas neurona; y
- (c)
- comparar la longitud media del axón en las neuronas cultivadas en presencia del péptido cíclico candidato, con la longitud media del axón de las neuronas cultivadas en ausencia del péptido cíclico candidato y, a partir de estos datos, identificar un péptido cíclico capaz de modular la adhesión celular.
52. Un método para identificar un péptido
cíclico capaz de modular la adhesión celular mediada por cadherina,
que comprende:
- (a)
- cultivar células que expresan una cadherina, en presencia y en ausencia de un péptido cíclico candidato, bajo las condiciones y durante el período de tiempo suficientes para permitir la adhesión celular;
- (b)
- evaluar visualmente el grado de adhesión entre dichas células; y a partir de estos datos, identificar un péptido cíclico capaz de modular la adhesión celular.
53. Un método según la reivindicación 52, en el
que dichas células se seleccionan del grupo consistente en células
endoteliales, epiteliales, y cancerosas.
54. Un método para identificar un péptido
cíclico capaz de modular la adhesión celular mediada por cadherina,
que comprende:
- (a)
- cultivar células NRK en presencia y en ausencia de un péptido cíclico candidato, bajo las condiciones y durante el período de tiempo suficientes para permitir la adhesión celular;
- (b)
- comparar el nivel de E-cadherina en la superficie celular en las células cultivadas en presencia del péptido cíclico candidato con el nivel en células cultivadas en ausencia del péptido cíclico candidato y, a partir de estos datos, identificar un péptido cíclico capaz de modular la adhesión celular.
55. Un método para identificar un péptido
cíclico capaz de modular la adhesión celular modulada por cadherina,
que comprende:
- (a)
- hacer contactar una superficie epitelial de piel con una marca experimental, en presencia y en ausencia de un péptido cíclico candidato, y
- (b)
- comparar la cantidad de marca experimental que atraviesa dicha piel en presencia del péptido cíclico candidato con la cantidad que la atraviesa en ausencia del péptido cíclico candidato y, a partir de estos datos, identificar un péptido cíclico capaz de modular la adhesión celular.
56. Un método según la reivindicación 55, en el
que dicha piel es piel humana.
57. Un método in vitro para identificar
un péptido cíclico capaz de modular la adhesión celular mediada por
cadherina, que comprende:
- (a)
- hacer contactar un vaso sanguíneo con un péptido cíclico candidato; y
- (b)
- comparar el grado de angiogénesis de dicho vaso sanguíneo con un nivel predeterminado de angiogénesis observado en un vaso sanguíneo en ausencia del péptido cíclico candidato y, a partir de estos datos, identificar un péptido cíclico capaz de modular la adhesión celular.
58. Un kit para administrar un medicamento a
través de la piel de un mamífero, que comprende:
- (a)
- un parche cutáneo; y
- (b)
- un péptido cíclico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
59. Un kit según la reivindicación 58, en el que
dicho parche cutáneo está impregnado con dicho péptido cíclico.
60. Un kit según la reivindicación 59, que
comprende, adicionalmente, un medicamento.
61. Un método in vitro para modular la
adhesión celular, que comprende hacer contactar una célula que
expresa cadherina con un anticuerpo que se une específicamente a un
péptido cíclico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
11.
62. Un método in vitro para dirigir el
acceso de un medicamento a una célula que expresa cadherina en un
mamífero, que comprende administrar a un mamífero un anticuerpo que
se une específicamente a un péptido cíclico según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicho anticuerpo está unido a
un medicamento.
63. Un método para detectar la presencia en una
muestra de células que expresan cadherina, que comprende:
- (a)
- hacer contactar una muestra con un anticuerpo que se une específicamente a un péptido cíclico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, bajo las condiciones y el período de tiempo suficientes para permitir la formación de un complejo de anticuerpo-cadherina; y
- (b)
- detectar el nivel de complejo de anticuerpo-cadherina y, a partir de éste, detectar la presencia en una muestra de células que expresan cadherina.
64. Un método según la reivindicación 63, en el
que dicho anticuerpo está unido a un material de soporte.
65. Un método según la reivindicación 63, en el
que dicho anticuerpo está unido a una marca detectable.
66. Un método según la reivindicación 65, en el
que dicha marca detectable es una marca fluorescente, y en el que
la etapa de detección se lleva a cabo usando la clasificación de
células activada por fluorescencia.
67. Un kit para detectar la presencia en una
muestra de células que expresan cadherina, que comprende:
- (a)
- un anticuerpo que se une específicamente a un péptido cíclico, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11; y
- (b)
- un reactivo de detección.
68. Un péptido cíclico según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 11, para ser usado en un método dirigido a
modular la adhesión celular, que comprende hacer contactar una
célula que expresa cadherina con dicho péptido.
69. Un péptido según la reivindicación 68, en el
que dicha cadherina se selecciona del grupo consistente en
E-cadherina y N-cadherina, o en el
que dicha cadherina se selecciona del grupo consistente en
P-cadherina, R-cadherina, y otras
cadherinas que comprenden la secuencia de reconocimiento de adhesión
celular HAV.
70. Un péptido según la reivindicación 68, en el
que dicha célula se selecciona del grupo consistente en células
epiteliales, células endoteliales, células nerviosas, células
tumorales, y linfocitos.
71. Un péptido según la reivindicación 68, en el
que dicho péptido cíclico inhibe la adhesión celular.
72. Un péptido según la reivindicación 68, en el
que dicho péptido cíclico potencia la adhesión celular.
73. Un péptido cíclico según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 11, para ser usado en un método dirigido a
inducir la apoptosis en una célula que expresa cadherina, que
comprende hacer contactar una célula que expresa cadherina con
dicho péptido.
74. Un péptido cíclico según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 11, para ser utilizado en un método para
potenciar y/o dirigir el crecimiento axonal, que comprende hacer
contactar una neurona con dicho péptido.
75. Un anticuerpo que se une específicamente a
un péptido cíclico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
11, para ser usado en un método dirigido a modular la adhesión
celular, que comprende hacer contactar una célula que expresa
cadherina con dicho anticuerpo.
76. Un anticuerpo que se une específicamente a
un péptido cíclico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
11, para ser usado en un método para dirigir el acceso de un
medicamento a una célula que expresa cadherina en un mamífero, que
comprende administrar dicho anticuerpo a un mamífero, en donde dicho
anticuerpo está unido a un medicamento.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US2161296P | 1996-07-12 | 1996-07-12 | |
US21612P | 1996-07-12 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2297861T3 true ES2297861T3 (es) | 2008-05-01 |
Family
ID=21805187
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES97929070T Expired - Lifetime ES2297861T3 (es) | 1996-07-12 | 1997-07-11 | Compuestos y metodos para modular la adhesion celular. |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US6031072A (es) |
EP (1) | EP0937103B1 (es) |
JP (1) | JP2001500475A (es) |
AU (1) | AU722985B2 (es) |
CA (1) | CA2259966A1 (es) |
DE (1) | DE69738326T2 (es) |
ES (1) | ES2297861T3 (es) |
WO (1) | WO1998002452A2 (es) |
Families Citing this family (65)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6465427B1 (en) | 1996-07-12 | 2002-10-15 | Mcgill University | Compounds and methods for modulating cell adhesion |
US6346512B1 (en) * | 1996-07-12 | 2002-02-12 | Mcgill University | Compounds and methods for modulating cell adhesion |
US6562786B1 (en) | 1996-07-12 | 2003-05-13 | Mcgill University | Compounds and methods for modulating apoptosis |
US6333307B1 (en) * | 1996-07-12 | 2001-12-25 | Mcgill University | Compounds and method for modulating neurite outgrowth |
US6610821B1 (en) | 1996-07-12 | 2003-08-26 | Mcgill University | Compounds and methods for modulating endothelial cell adhesion |
US6207639B1 (en) * | 1996-07-12 | 2001-03-27 | Mcgill University | Compounds and methods for modulating neurite outgrowth |
CA2259966A1 (en) | 1996-07-12 | 1998-01-22 | Mcgill University | Compounds and methods for modulating cell adhesion |
US20020168761A1 (en) * | 2000-01-24 | 2002-11-14 | Gour Barbara J. | Peptidomimetic modulators of cell adhesion |
US7122623B2 (en) | 1996-07-12 | 2006-10-17 | Adherex Technologies, Inc. | Compounds and methods for modulating cell adhesion |
US6417325B1 (en) * | 1996-07-12 | 2002-07-09 | Mcgill University | Compounds and methods for cancer therapy |
US6169071B1 (en) * | 1996-07-12 | 2001-01-02 | Mcgill University | Compounds and methods for modulating cell adhesion |
US20040006011A1 (en) * | 1996-07-12 | 2004-01-08 | Gour Barbara J. | Peptidomimetic modulators of cell adhesion |
US6551994B1 (en) | 1997-04-10 | 2003-04-22 | Mcgill University | Compounds and methods for inhibiting the interaction between α-catenin and β-catenin |
US6472367B1 (en) * | 1998-05-05 | 2002-10-29 | Adherex Technologies, Inc. | Compounds and methods for modulating OB-cadherin mediated cell adhesion |
US6638911B1 (en) * | 1998-05-05 | 2003-10-28 | Adherex Technologies Inc. | Compounds and methods for modulating desmosomal cadherin-mediated functions |
US7481999B2 (en) | 1998-05-05 | 2009-01-27 | Adherex Technologies, Inc. | Compounds and methods for modulating OB-cadherin-mediated function |
JP2002513804A (ja) * | 1998-05-05 | 2002-05-14 | アドヘレックス テクノロジーズ インコーポレイテッド | 非古典的カドヘリン媒介機能を調節するための化合物および方法 |
US6680175B2 (en) * | 1998-05-05 | 2004-01-20 | Adherex Technologies, Inc. | Methods for diagnosing and evaluating cancer |
US20050203025A1 (en) * | 1998-05-05 | 2005-09-15 | Adherex Technologies, Inc. | Compounds and methods for modulating nonclassical cadherin-mediated functions |
US6465007B1 (en) | 1998-07-02 | 2002-10-15 | Genzyme Corporation | Transgene expression in polarized cells |
US6277824B1 (en) * | 1998-07-10 | 2001-08-21 | Adherex Technologies | Compounds and methods for modulating adhesion molecule function |
AU4417000A (en) * | 1999-04-15 | 2000-11-02 | Glaxo Group Limited | Novel pharmaceutical composition suitable for gene therapy |
US6303576B1 (en) * | 1999-04-21 | 2001-10-16 | Adherex Technologies Inc. | Compounds and methods for modulating β-catenin mediated gene expression |
US20040254099A1 (en) * | 1999-04-21 | 2004-12-16 | Adherex Technologies, Inc. | Compounds and methods for modulating beta-catenin mediated gene expression |
US6391855B1 (en) * | 1999-06-02 | 2002-05-21 | Adherex Technologies, Inc. | Compounds and methods for modulating junctional adhesion molecule-mediated functions |
US6787136B1 (en) | 1999-09-03 | 2004-09-07 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods and compositions for treatment of inflammatory disease using cadherin-11 modulating agents |
WO2002034880A2 (en) * | 2000-10-23 | 2002-05-02 | University Of Kansas | Cadherin peptides for drug delivery and inhibition of tumor metastasis/invasion |
US6815426B2 (en) * | 2001-02-16 | 2004-11-09 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Angiogenesis-inhibitory tripeptides, compositions and their methods of use |
US20020192206A1 (en) * | 2001-05-05 | 2002-12-19 | Kozarov Emil V. | Methods and compositions for angioproliferative disorder treatment |
US20030105025A1 (en) * | 2001-10-31 | 2003-06-05 | Fortuna Haviv | Tri-and tetrapeptides having antiangiogenic activity |
US7175990B2 (en) * | 2002-02-26 | 2007-02-13 | The Regents Of The University Of California | Method of determining endometrial receptivity |
AU2003283155A1 (en) * | 2002-11-14 | 2004-06-03 | Adherex Technologies Inc. | Compounds and methods for modulating functions of classical cadherins |
AU2003298475A1 (en) * | 2002-11-14 | 2004-06-18 | Adherex Technologies, Inc. | Compounds and methods for modulating desmosomal and atypical cadherin-mediated cell adhesion |
US7196061B2 (en) | 2003-09-10 | 2007-03-27 | Wyeth | Compounds that modulate neuronal growth and their uses |
AU2004283751B2 (en) * | 2003-10-24 | 2011-05-19 | Exelixis, Inc. | p70S6 kinase modulators and method of use |
AU2005231123A1 (en) * | 2004-03-08 | 2005-10-20 | Wyeth | Ion channel modulators |
US7169756B2 (en) * | 2004-04-16 | 2007-01-30 | Mcmaster University | Streptogramin antibiotics |
GEP20115226B (en) * | 2005-04-26 | 2011-06-10 | Pfizer | P-cadherin antibodies |
US20110034396A1 (en) * | 2005-09-28 | 2011-02-10 | Biovascular, Inc. | Methods and compositions for inhibiting cell migration and treatment of inflammatory conditions |
US7691839B2 (en) | 2005-09-28 | 2010-04-06 | Biovascular, Inc. | Methods and compositions for blocking platelet and cell adhesion, cell migration and inflammation |
JP2009538282A (ja) * | 2006-05-15 | 2009-11-05 | バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド | 乏突起膠細胞の生存を促進させるためのNogo受容体−1(NgR1)アンタゴニストの使用 |
WO2008039525A2 (en) * | 2006-09-27 | 2008-04-03 | Adherex Technologies, Inc. | Cadherin antagonists in combination with anticancer agents for use in cancer treatment |
EP2091552A4 (en) | 2006-11-15 | 2010-01-06 | Dana Farber Cancer Inst Inc | STABILIZED MAML PEPTIDES AND USES THEREOF |
US20090291967A1 (en) * | 2008-03-05 | 2009-11-26 | Adherex Technologies, Inc. | Small molecule modulators of cell adhesion |
US9599603B2 (en) * | 2008-07-16 | 2017-03-21 | Case Western Reserve University | Methods and compositions for modulating adhesion and migration of cadherin expressing cells |
JP2012515172A (ja) | 2009-01-14 | 2012-07-05 | エルロン・セラピューティクス・インコーポレイテッド | ペプチド模倣大環状分子 |
US8680150B2 (en) | 2009-05-28 | 2014-03-25 | Ligand Pharmaceuticals, Inc. | Small molecule hematopoietic growth factor mimetic compounds that activate hematopoietic growth factor receptors |
JP2013505300A (ja) * | 2009-09-22 | 2013-02-14 | エルロン・セラピューティクス・インコーポレイテッド | ペプチド模倣大環状分子 |
US8877188B2 (en) | 2010-05-04 | 2014-11-04 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Detection and treatment of non-dermal fibrosis |
FR2980741B1 (fr) | 2011-09-30 | 2014-03-14 | Saint Gobain | Procede d'assemblage par collage d'un vitrage sur un support avec interposition d'une cale d'ecartement, vitrage muni d'une cale d'ecartement, cale, cordon profile et ensemble de cales. |
US8633158B1 (en) | 2012-10-02 | 2014-01-21 | Tarix Pharmaceuticals Ltd. | Angiotensin in treating brain conditions |
BR112015028788A2 (pt) | 2013-05-24 | 2017-09-19 | Tarix Pharmaceuticals Ltd | Peptídeos de angiotensina no tratamento da síndrome de marfan e de distúrbios relacionados |
US9133241B2 (en) | 2013-10-11 | 2015-09-15 | Tarix Pharmaceuticals Ltd. | Peptide compositions |
RU2016112931A (ru) | 2013-10-11 | 2017-11-16 | Терикс Фармасьютикалз Лтд. | Композиции новых пептидов |
WO2015077763A1 (en) | 2013-11-25 | 2015-05-28 | Stc.Unm | Cxcr antagonistic peptides and uses thereof |
US9333233B2 (en) | 2014-02-25 | 2016-05-10 | Tarix Pharmaceuticals Ltd. | Methods and compositions for the delayed treatment of stroke |
JP2017520575A (ja) | 2014-07-01 | 2017-07-27 | ファイザー・インク | 二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディおよびその使用 |
WO2016100301A1 (en) | 2014-12-15 | 2016-06-23 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Use of cadherin-11 antagonists to treat obesity-associated conditions and other metabolic disorders |
WO2016097753A1 (en) * | 2014-12-19 | 2016-06-23 | Neuro-Bio Ltd | Cyclic acetylcholinesterase c-terminal peptide in the treatment or prevention of cancer or metastasis |
GB2538947A (en) | 2014-12-19 | 2016-12-07 | Neuro-Bio Ltd | Cancer |
WO2017004548A1 (en) | 2015-07-01 | 2017-01-05 | Aileron Therapeutics, Inc. | Peptidomimetic macrocycles |
US10960045B2 (en) | 2015-10-14 | 2021-03-30 | Constant Therapeutics Llc | Methods and compositions for the treatment of epidermolysis bullosa |
KR102167755B1 (ko) * | 2018-05-23 | 2020-10-19 | 주식회사 큐어바이오 | 단편화된 grs 폴리펩타이드, 이의 변이체 및 이들의 용도 |
WO2021183863A1 (en) | 2020-03-13 | 2021-09-16 | Constant Therapeutics Llc | Methods and compositions for treatment of coronavirus infection |
KR20220061018A (ko) * | 2020-11-05 | 2022-05-12 | 한국생명공학연구원 | 항염 및 조직 재생작용을 갖는 신규 펩타이드 |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5079600A (en) * | 1987-03-06 | 1992-01-07 | Schnur Joel M | High resolution patterning on solid substrates |
JP2945680B2 (ja) * | 1988-09-09 | 1999-09-06 | 旭硝子株式会社 | ペプチド誘導体およびその用途 |
US5231082A (en) * | 1989-05-10 | 1993-07-27 | Monsanto Company | Cyclic peptide with anti-metastasis activity |
EP0494175A4 (en) * | 1989-09-27 | 1993-05-05 | Athena Neurosciences, Inc. | Compositions for cell adhesion inhibition and methods of use |
AU669474B2 (en) * | 1990-10-30 | 1996-06-13 | La Jolla Cancer Research Foundation | T-cadherin adhesion molecule |
EP0617705B1 (en) * | 1991-11-22 | 1997-09-24 | Yeda Research And Development Company, Ltd. | Non-peptidic surrogates of the arg-gly-asp sequence and pharmaceutical compositions comprising them |
US5646250A (en) | 1992-04-17 | 1997-07-08 | Doheny Eye Institute | Cadherin polypeptides |
WO1994011401A1 (en) | 1992-11-17 | 1994-05-26 | Yale University | Human homolog of the e-cadherin gene and methods based thereon |
US5591432A (en) * | 1993-02-17 | 1997-01-07 | Becton, Dickinson And Company | Antibody to the neural cell adhesion molecule and methods of use |
US5665590A (en) * | 1994-07-29 | 1997-09-09 | Systemix, Inc. | Method for isolating and directly cloning genes which encode cell-surface and secreted proteins |
WO1996040781A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Tanabe Seiyaku Co., Ltd. | CYCLIC PEPTIDE INHIBITORS OF β1 AND β2 INTEGRIN-MEDIATED ADHESION |
GB9517098D0 (en) * | 1995-08-21 | 1995-10-25 | Imperial College | Receptor |
US6169071B1 (en) | 1996-07-12 | 2001-01-02 | Mcgill University | Compounds and methods for modulating cell adhesion |
CA2259966A1 (en) | 1996-07-12 | 1998-01-22 | Mcgill University | Compounds and methods for modulating cell adhesion |
US6551994B1 (en) | 1997-04-10 | 2003-04-22 | Mcgill University | Compounds and methods for inhibiting the interaction between α-catenin and β-catenin |
-
1997
- 1997-07-11 CA CA002259966A patent/CA2259966A1/en not_active Abandoned
- 1997-07-11 EP EP97929070A patent/EP0937103B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-11 WO PCT/CA1997/000489 patent/WO1998002452A2/en active IP Right Grant
- 1997-07-11 ES ES97929070T patent/ES2297861T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-11 DE DE69738326T patent/DE69738326T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-07-11 JP JP10505472A patent/JP2001500475A/ja active Pending
- 1997-07-11 AU AU33322/97A patent/AU722985B2/en not_active Ceased
- 1997-07-11 US US08/893,534 patent/US6031072A/en not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-02-17 US US09/507,102 patent/US6326352B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-12-04 US US10/006,982 patent/US6914044B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0937103A2 (en) | 1999-08-25 |
WO1998002452A3 (en) | 1998-03-05 |
WO1998002452A2 (en) | 1998-01-22 |
AU3332297A (en) | 1998-02-09 |
US20020151475A1 (en) | 2002-10-17 |
US6031072A (en) | 2000-02-29 |
DE69738326T2 (de) | 2008-07-03 |
US6914044B2 (en) | 2005-07-05 |
US6326352B1 (en) | 2001-12-04 |
CA2259966A1 (en) | 1998-01-22 |
DE69738326D1 (de) | 2008-01-10 |
AU722985B2 (en) | 2000-08-17 |
EP0937103B1 (en) | 2007-11-28 |
JP2001500475A (ja) | 2001-01-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2297861T3 (es) | Compuestos y metodos para modular la adhesion celular. | |
EP1042365B1 (en) | Compounds and methods for modulating occludin related tissue permeability | |
US6169071B1 (en) | Compounds and methods for modulating cell adhesion | |
ES2232941T3 (es) | Compuestos y metodos para inhibir la interaccion entre alfa-catenina y beta-catenina. | |
US6830894B1 (en) | Compounds and methods for modulating claudin-mediated functions | |
US20060183884A1 (en) | Compounds and methods for modulating cell adhesion | |
US20050163786A1 (en) | Compounds and methods for modulating adhesion molecule function | |
US6465427B1 (en) | Compounds and methods for modulating cell adhesion | |
US7476509B2 (en) | Compounds and methods for modulating functions of nonclassical cadherins | |
US6610821B1 (en) | Compounds and methods for modulating endothelial cell adhesion | |
US6346512B1 (en) | Compounds and methods for modulating cell adhesion | |
US6723700B1 (en) | Compounds and methods for modulating claudin-mediated functions | |
US6797807B1 (en) | Compounds and methods for cancer therapy |