ES2296803T3 - Vacunas que contienen ribavirina. - Google Patents

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Abstract

Una composición inmunogénica que comprende ribavirina y un antígeno viral, bacteriano, de moho o de levadura, o un ácido nucleico que lo codifica.

Description

Vacunas que contienen ribavirina.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones para aumentar el efecto de vacunas en animales, tales como especies domésticas, deportivas o mascotas, y en seres humanos. Más particularmente, las realizaciones preferidas se refieren al uso de ribavirina como adyuvante y de composiciones que tiene ribavirina y un antígeno.
Antecedentes de la invención
El uso de vacunas para prevenir enfermedades en seres humanos, animales de granja, animales deportivos y mascotas domésticas es una práctica común. Sin embargo, con frecuencia el antígeno usado en una vacuna no es suficientemente inmunogénico para elevar el título de anticuerpos a niveles que sean suficientes para proporcionar protección contra una exposición posterior o para mantener el potencial de disponer de esos niveles durante periodos de tiempo prolongados. Además, muchas vacunas son completamente incapaces de inducir inmunidad mediada por células, que es una defensa inmune primaria contra infecciones bacterianas y víricas. Actualmente se está centrando una cantidad considerable de investigación en el desarrollo de vacunas más potentes y de formas de mejorar la inmunogenicidad de preparaciones que contienen antígenos. (Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 6.056.961, 6.060.068, 6.063.380, y Li y col., Science 288:2219-2222(2000)).
Entre estas vacunas "débiles" son muy conocidas las vacunas de la hepatitis B. Por ejemplo, vacunas recombinantes contra el virus de la hepatitis B tales como Genhevacb (Pasteur Merieux Serums et Vaccines, 58, Avenue Leclerc 69007 Lyon, Francia), Engerixb (Smith, Kline and Symbol French) y Recombivaxhb (Merck, Sharp, and Dhome) son eficaces sólo después de al menos tres inyecciones en los días 0, 30 y 60 ó 180, seguidas de una dosis de refuerzo obligatoria después de un año. (Chedid y col., Patente de Estados Unidos Nº 6.063.380). Además, muchos sujetos que reciben estas vacunas responden de manera deficiente, en caso de hacerlo. Como muchas regiones del mundo son endémicas para la infección por HBV, el poco carácter inmunogénico de las vacunas de HBV existentes se ha convertido en un problema extremadamente grave.
Para obtener una respuesta celular y/o humoral más fuerte, es común administrar la vacuna en un material que aumente la respuesta inmune del paciente al antígeno presente en la vacuna. Los adyuvantes usados más comúnmente para protocolos de vacunas son preparaciones de aceite y alumbre. (Chedid y col., Patente de Estados Unidos Nº 6.063.380). Se necesita un mayor repertorio de adyuvantes seguros y eficaces.
En terapias antivirales se han usado mucho análogos de nucleósidos debido a su capacidad de reducir la replicación viral (Hosoya y col., J. Inf. Dis. 168:641-646 (1993)). La ribavirina (1-\beta-D-ribofuranosil-1,2,4-triazol-3-carboxamida) es un análogo de guanosina sintético que se ha usado para inhibir la replicación de virus de ARN y ADN. (Huffman y col., Antimicrob Agents. Chemother., 3:235(1973; Sidwell y col., Science, 177:705 (1972)). Se ha demostrado que la ribavirina es un inhibidor competitivo de la inositol mono-fosfato (IMP) deshidrogenasa (IMPDH), que convierte el IMP en IMX (que después se convierte en GMP). De Clerqc, Anti viral Agents: characteristic activity spectrum depending on the molecular target with which they interact, Academia press, Inc., New York N.Y., páginas 1-55 (1993). Como resultado del tratamiento a largo plazo con ribavirina se han agotado reservas intracelulares de GTP.
Además de la actividad antiviral, los investigadores han observado que algunos análogos de guanosina tienen un efecto sobre el sistema inmune (Patentes de Estados Unidos Nº 6.063.772 y 4.950.647). Se ha demostrado que la ribavirina inhibe las respuestas inmunes humorales funcionales (Peavy y col., J. Immunol., 126:861-864, (1981); Powers y col., Antimicrob. Agents. Chemother. 22: 108-114 (1982)) y la modulación mediada por IgE de la secreción de mastocitos. (Marquardt y col., J. Pharmacol. Exp. Therapeutics, 240:145-149 (1987)). Algunos investigadores han indicado que una terapia oral diaria de ribavirina tiene un efecto modulador inmune en seres humanos y ratones (Hultgren y col., J. Gen. Virol., 79:2381-2391 (1998) y Cramp y col., Gastron. Enterol., 118:346-355 (2000)). Sin embargo, la comprensión actual de los efectos de la ribavirina sobre el sistema inmune está en sus primeras fases.
Resumen de la invención
Se ha descubierto que la ribavirina puede usarse como adyuvante para mejorar o facilitar una respuesta inmune a un antígeno. Las realizaciones de la invención descritas en este documento incluyen preparaciones de vacunas "fuertes" que comprenden un antígeno y ribavirina. En general, estas preparaciones tienen una cantidad de ribavirina que es suficiente para mejorar o facilitar una respuesta inmune al antígeno. Por medio de una estrategia, por ejemplo, se identifica un animal que necesita una respuesta inmune potente a un antígeno y después se proporciona una cantidad de ribavirina junto con el antígeno. La ribavirina y el antígeno se proporcionan en combinación (es decir, en una sola composición). Varias realizaciones también se refieren a la fabricación y uso de composiciones que tienen ribavirina y un antígeno.
Aunque las composiciones incorporadas incluyen ribavirina y prácticamente cualquier antígeno o epítopo, las composiciones preferidas comprenden ribavirina y un antígeno o epítopo de virus de la hepatitis. El antígeno o epítopo puede estar basado en un péptido o en un ácido nucleico (por ejemplo, un ARN que codifica un antígeno peptídico o una construcción que expresa un antígeno peptídico cuando se introduce en un sujeto). Son realizaciones composiciones que tienen ribavirina y un péptido que comprende un antígeno o epítopo del virus de la hepatitis A (HAV) o un ácido nucleico que codifica dicho péptido. Son realizaciones composiciones que tienen ribavirina y un péptido que comprende un antígeno o epítopo del virus de la hepatitis B (HBV) o un ácido nucleico que codifica dicho péptido. Los antígenos de HBV que son adecuados incluyen, por ejemplo, el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg), el antígeno nuclear de hepatitis (HBcAg), el antígeno E de hepatitis (HBeAg), y ácidos nucleicos que codifican estas moléculas. Además, son realizaciones composiciones que tienen ribavirina y un péptido que comprende un antígeno o epítopo del virus de la hepatitis C (HCV) o un ácido nucleico que codifica dicho péptido. Los antígenos de HCV adecuados incluyen, pero sin limitación, uno o más dominios de la secuencia de HCV (por ejemplo, NS3 y/o NS4'A) y ácidos nucleicos que codifican dichas moléculas.
También se descubrió una nueva secuencia de HCV en el trabajo que llevó a la presente invención. Se clonó un nuevo fragmento NS3/4A del genoma de HCV y se secuenció a partir de un paciente infectado con HCV (ID. SEC. Nº: 16). Se descubrió que esta secuencia sólo tenía una homología del 93% con la secuencia de HCV más relacionada. También son realizaciones de la presente invención este nuevo péptido (ID. SEC. Nº: 17) y sus fragmentos de al menos 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 ó 20 aminoácidos de longitud, ácidos nucleicos que codifican estas moléculas, vectores que tienen dichos ácidos nucleicos y células que tienen dichos vectores, ácidos nucleicos o péptidos. Una realización particularmente preferida es una composición de vacuna que comprende ribavirina y el péptido de HCV de la ID. SEC. Nº: 17 o un fragmento del mismo de al menos 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 ó 20 aminoácidos de longitud (por ejemplo, la ID. SEC. Nº: 25) o un ácido nucleico que codifica dicho péptido o fragmentos.
Además, se descubrió que ciertos mutantes truncados y mutantes del péptido NS3/4A, que carecen de un sitio de escisión proteolítica, son muy inmunogénicos. En el alcance de la invención se incluyen estos nuevos péptidos (ID. SEC. Nº: 29-32 y 43-49) y fragmentos de los mismos de al menos 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 ó 20 aminoácidos de longitud (por ejemplo, las ID. SEC. Nº: 26, 27 y 33-42), ácidos nucleicos que codifican estas moléculas, vectores que tienen dichos ácidos nucleicos y células que tienen dichos vectores, ácidos nucleicos o péptidos. Una realización particularmente preferida es una composición de vacuna que comprende ribavirina y al menos un péptido de HCV de la ID. SEC. Nº: 29-32, 43-49 o un fragmento del mismo de al menos 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 ó 20 aminoácidos de longitud (por ejemplo, la ID. SEC. Nº: 26, 27 y 33-42 o un ácido nucleico que codifica dichos péptidos o fragmentos.
Además, son realizaciones de la invención composiciones que tienen una mezcla de los antígenos anteriores. Por ejemplo, algunas composiciones comprenden un antígeno de HBV, un antígeno de HAV y ribavirina, o un antígeno de HBV, un antígeno de HCV y ribavirina, o un antígeno de HAV, un antígeno de HCV y ribavirina, o un antígeno de HBV, un antígeno de HAV, un antígeno de HCV y ribavirina. Otras realizaciones comprenden ribavirina y un ácido nucleico que codifica una mezcla de los antígenos descritos anteriormente. Algunas realizaciones también incluyen otros adyuvantes, aglutinantes, emulsionantes, vehículos y cargas, como se muestra en la técnica, que incluyen, pero sin limitación, alumbre, aceite y otros compuestos que mejoran la respuesta inmune.
También son aspectos de la invención procedimientos de fabricación y uso de las composiciones descritas en este documento. Algunos procedimientos se ponen en práctica mezclando ribavirina con un antígeno peptídico o de ácido nucleico (por ejemplo, un antígeno de HAV, HBV o HCV) para formular una sola composición (por ejemplo, una composición de vacuna). Los procedimientos preferidos implican la mezcla de ribavirina con un antígeno de HCV que tiene un epítopo presente en uno o más dominios de HCV (por ejemplo, NS3 y/o NS4A).
Los procedimientos preferidos para usar las composiciones descritas en este documento implican proporcionar a un animal que lo necesita una cantidad suficiente de ribavirina y un antígeno de virus de la hepatitis (por ejemplo, un antígeno de HBV, un antígeno de HAV, un antígeno de HCV o un ácido nucleico que codifica uno de estos antígenos o cualquier combinación de los mismos). Por medio de una estrategia, por ejemplo, se identifica un animal que necesita una potente respuesta inmune a un antígeno de virus de la hepatitis (por ejemplo, un animal con riesgo o que ya se ha infectado con el virus de la hepatitis) y a dicho animal se le proporciona una cantidad de ribavirina y un antígeno de virus de la hepatitis (en una sola composición o por separado) que sea eficaz para mejorar o facilitar una respuesta inmune al antígeno de virus de la hepatitis. Preferiblemente, se identifica un animal que necesita una potente respuesta inmune a HCV y a dicho animal se le proporciona una composición que comprende ribavirina y un péptido que comprende un antígeno o epítopo presente en las ID. SEC. Nº: 1, 6, 7 ó 17 o un ácido nucleico que codifica dicho péptido. Los procedimientos particularmente preferidos implican la identificación de un animal que necesita una potente respuesta inmune a HCV y el suministro a dicho animal de una composición que comprende ribavirina y una cantidad de un antígeno de HCV (por ejemplo NS3/4A (ID. SEC. Nº: 17), NS3/3A mutante (ID. SEC. Nº: 29-32 y 43-49) o un fragmento del mismo de al menos 3, 4-10, 10-20, 20-30, ó 30-50 aminoácidos de longitud (por ejemplo, ID. SEC. Nº: 25-27 y 33-42) o un ácido nucleico que codifica una o más de estas moléculas) que sea suficiente para mejorar o facilitar una respuesta inmune a dicho antígeno.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un gráfico que muestra la respuesta humoral a 10 y 100 \mug de proteína 3 no estructural (NS3) del virus de la hepatitis C (HCV) recombinante, determinada por medio de títulos como criterio de valoración, cuando se coadministró una sola dosis de 1 mg de ribavirina.
\newpage
La Figura 2 es un gráfico que muestra la respuesta humoral a 20 \mug de proteína 3 no estructural (NS3) del virus de la hepatitis C (HCV) recombinante, determinada por medio de títulos como criterio de valoración, cuando se coadministró una sola dosis de 0,1, 1,0 ó 10 mg de ribavirina
La Figura 3 es un gráfico que muestra los efectos de una sola dosis de 1 mg de ribavirina sobre respuestas proliferativas de ganglios linfáticos específicas de NS3, determinados por respuestas de rellamada in vitro.
La Figura 4 es un gráfico que muestra el título de anticuerpos en ratones H-2^{d} contra NS3 en función del tiempo después de la primera inmunización. Los rombos indican el título de anticuerpos en ratones inmunizados con NS3/4A-pVAX y los cuadrados indican el título de anticuerpos en ratones inmunizados con NS3-pVaX.
La Figura 5A es un gráfico que muestra el porcentaje de lisis mediada por CTL específicos de células diana SP2/0 en función de la relación entre efector y diana. Como inmunógeno de control se usó solución salina tamponada con fosfato (PBS).
La Figura 5B es un gráfico que muestra el porcentaje de lisis mediada por CTL específicos de células diana SP2/0 en función de la relación entre el efector y la diana. Como inmunógeno se usó el plásmido NS3/4A-pVAX.
Descripción detallada de la invención
Se ha descubierto que las composiciones que comprenden ribavirina y un antígeno (por ejemplo, una molécula que contiene un epítopo de un patógeno tal como un virus, bacteria, moho o levadura) aumentan y facilitan la respuesta inmune de un animal al antígeno. Es decir, se descubrió que la ribavirina es un "adyuvante" eficaz que, para los fines de esta descripción, se refiere a un material que tiene la capacidad de aumentar o facilitar una respuesta inmune a un antígeno particular. La actividad adyuvante de la ribavirina se manifestó por un aumento significativo de la protección mediada por el sistema inmune contra el antígeno, un aumento en el título de anticuerpo inducido contra el antígeno y un aumento en las respuestas de células T proliferativas.
En este documento se describen varias composiciones (por ejemplo, vacunas) que comprenden ribavirina y un antígeno o epítopo. Las formulaciones de vacuna que contienen ribavirina, por ejemplo, pueden variar de acuerdo con la cantidad de ribavirina, la forma de ribavirina y el tipo de antígeno. El antígeno puede ser un péptido o un ácido nucleico (por ejemplo, un ARN que codifica un antígeno peptídico o una construcción que expresa un antígeno peptídico cuando se introduce en un sujeto). Las composiciones preferidas comprenden ribavirina y un antígeno viral de hepatitis (por ejemplo, antígeno de HAV, antígeno de HBV, antígeno de HCV, un ácido nucleico que codifica estas moléculas o cualquier combinación de los mismos). En particular, se desea al menos un antígeno de HCV o un epítopo presente en la ID. SEC. Nº: 1 o un ácido nucleico que codifica dicho antígeno de HCV para mezclar con ribavirina para obtener dichas composiciones. Es decir, algunas realizaciones incluyen, pero sin limitación, composiciones que comprenden ribavirina y un péptido que comprende la ID. SEC. Nº: 1, o un fragmento del mismo que tiene al menos 2500, 2000, 1600, 1200, 800, 400, 200, 100, 50, 10 ó 3 aminoácidos consecutivos de la ID. SEC. Nº: 1. Otras realizaciones se refieren a composiciones que comprenden ribavirina y un ácido nucleico que codifica la ID. SEC. Nº: 13 o un fragmento del
mismo que tiene al menos 9, 12, 15, 20, 30, 50, 75, 100, 200 ó 500 nucleótidos consecutivos de la ID. SEC. Nº: 13.
Otras realizaciones incluyen otra composición (por ejemplo, una vacuna) que comprende ribavirina y un fragmento específico de la ID. SEC. Nº: 1, donde dicho fragmento corresponde a un dominio particular de HCV. Algunas realizaciones, por ejemplo, comprenden un fragmento de HCV que corresponde a los aminoácidos 1-182, 183-379, 380-729, 730-1044, 1045-1657, 1658-1711, 1712-1971 ó 1972-3011 de la ID. SEC. Nº: 1. También son realizaciones de la invención composiciones que comprenden ribavirina y un ácido nucleico que codifica uno o más de estos fragmentos.
Además, en el trabajo que condujo a la presente invención se descubrió una nueva secuencia de HCV. Se clonó un nuevo ácido nucleico y proteína correspondiente al dominio NS3/4A de HCV a partir de un paciente infectado con HCV (ID. SEC. Nº: 16). Una búsqueda en el Genebank reveló que la secuencia clonada tenía la mayor homología con secuencias de HCV, pero sólo tenía una homología del 93% con el pariente de HCV más próximo (nº de acceso AJ 278830). En el alcance de la invención se incluye este nuevo péptido (ID. SEC. Nº: 17) y fragmentos del mismo de al menos 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 ó 20 aminoácidos de longitud, ácidos nucleicos que codifican estas moléculas, vectores que tiene dichos ácidos nucleicos y células que tienen dichos vectores, ácidos nucleicos o péptidos. Además, algunas de las realizaciones de vacuna descritas en este documento comprenden ribavirina y este nuevo péptido NS3/4A o un fragmento del mismo de al menos 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 ó 20 aminoácidos de longitud (por ejemplo, ID. SEC. Nº: 25) o un ácido nucleico que codifica una o más de estas moléculas.
También se crearon mutantes del nuevo péptido NS3/4A. Se descubrió que los mutantes truncados (por ejemplo, ID. SEC. Nº: 29) y los mutantes que carecen de un sitio de escisión proteolítica son muy inmunogénicos. En el alcance de la invención se incluyen estos nuevos péptidos (ID. SEC. Nº: 29-32 y 43-49) y fragmentos de los mismos de al menos 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 ó 20 aminoácidos de longitud (por ejemplo ID. SEC. Nº: 26, 27 y 33-42), ácidos nucleicos que codifican estas moléculas, vectores que tienen dichos ácidos nucleicos y células que tienen dichos vectores, ácidos nucleicos o péptidos. Además, algunas de las composiciones descritas en este documento comprenden ribavirina y al menos uno de los péptidos mutantes de HCV descritos anteriormente o un fragmento de los mismos de al menos 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 ó 20 aminoácidos de longitud. Otras realizaciones de vacuna comprenden ribavirina y un ácido nucleico (por ejemplo, ADN) que codifica uno o más de los péptidos descritos anteriormente.
También son realizaciones procedimientos para fabricar y usar las composiciones anteriores. Por ejemplo, las composiciones descritas anteriormente pueden obtenerse proporcionando ribavirina, proporcionando un antígeno (por ejemplo, un péptido que comprende un antígeno de HCV o un ácido nucleico que codifica dicho péptido) y mezclando dicha ribavirina y dicho antígeno para formular una composición que pueda usarse para mejorar o facilitar una respuesta inmune en un sujeto a dicho antígeno. Los procedimientos preferidos incluyen la mezcla de un antígeno o epítopo preferido (por ejemplo, un péptido que comprende la ID. SEC. Nº: 1, 6, 7 ó 17 o fragmentos específicos de los mismos, tales como los aminoácidos 1-182, 183-379, 380-729, 730-1044, 1045-1657, 1658-1711, 1712-1971 ó 1972-3011 de la ID. SEC. Nº: 1 y ácidos nucleicos que codifican estas moléculas) con ribavirina. Otros antígenos o epítopos también pueden mezclarse con ribavirina, incluyendo pero sin limitación, fragmentos de la ID. SEC. Nº: 1 que tienen al menos 2500, 2000, 1600, 1200, 800, 400, 200, 100, 50, 10 ó 3 aminoácidos consecutivos y ácidos nucleicos que codifican estos fragmentos. Los procedimientos particularmente preferidos se refieren a la obtención de composiciones de vacuna de la invención que contienen ribavirina y el fragmento NS3/4A descubierto recientemente o un mutante de NS3/4A (por ejemplo, un mutante truncado o un mutante que carece del sitio de escisión proteolítica), o un fragmento del mismo de al menos 4 aminoácidos de longitud o un ácido nucleico que codifica una o más de estas moléculas.
Las composiciones de la invención pueden usarse para aumentar o facilitar la respuesta inmune de un animal, incluyendo seres humanos, a un antígeno. Este uso puede ponerse en práctica, por ejemplo, identificando a un animal que necesite una potente respuesta inmune a un antígeno/epítopo y proporcionando a dicho animal una composición que comprende el antígeno/epítopo y una cantidad de ribavirina que sea eficaz para mejorar o facilitar una respuesta inmune al antígeno/epítopo.
Al animal se le administra ribavirina y un antígeno de hepatitis (por ejemplo, un antígeno de HAV, un antígeno de HBV, un antígeno de HCV o un ácido nucleico que codifica estas moléculas, o cualquier combinación de los mismos). El antígeno puede ser un antígeno de HCV, tal como un péptido que comprende la ID. SEC. Nº: 1, o un fragmento del mismo que tiene al menos 2500, 2000, 1600, 1200, 800, 400, 200, 100, 50, 10 ó 3 aminoácidos consecutivos de las ID. SEC. Nº: 1. Otras composiciones comprenden ribavirina y un ácido nucleico que codifica la ID. SEC. Nº: 13 o un ácido nucleico que codifica uno o más de los fragmentos descritos anteriormente.
Las composiciones preferidas comprenden ribavirina y un péptido que comprende la ID. SEC. Nº: 1 o un fragmento específico del mismo, que corresponde a un dominio de HCV que incluye, pero sin limitación, un péptido que comprende los aminoácidos 1-182, 183-379, 380-729, 730-1044, 1045-1657, 1658-1711, 1712-1971 ó 1972-3011 de las ID. SEC. Nº: 1. Las composiciones de vacuna particularmente preferidas comprenden el fragmento NS3/4A de la ID. SEC. Nº: 17 o el mutante NS3/4A (por ejemplo, ID. SEC. Nº: 29-32 y 43-49), que carecen de un sitio de escisión proteolítica, o un fragmento del mismo de al menos 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 ó 20 aminoácidos de longitud (por ejemplo las ID. SEC. Nº: 26, 27 y 33-42). También pueden usarse composiciones que comprenden ribavirina y un ácido nucleico que codifica estos fragmentos.
Se usan ribavirina y un antígeno o epítopo de HCV para preparar un medicamento para el tratamiento y/o prevención de la invención por HCV. Puede identificarse un individuo que necesita un medicamento que previene y/o trata la infección por HCV y a dicho individuo se le administra un medicamento que comprende ribavirina y un antígeno o epítopo de HCV, preferiblemente un epítopo presente en la ID. SEC. Nº: 1, más preferiblemente un fragmento de la ID. SEC. Nº: 1 que tiene al menos 2500, 2000, 1600, 1200, 800, 400, 200, 100, 50, 10 ó 3 aminoácidos consecutivos o, más preferiblemente, un fragmento de la ID. SEC. Nº: 1 tal como 1-182, 183-379, 380-729, 730-1044, 1045-1657, 1658-1711, 1712-1971 ó 1972-3011 o un ácido nucleico que codifica la ID. SEC. Nº: 1 o dichos fragmentos indicados anteriormente. Una composición de vacuna particularmente preferida comprende ribavirina y el fragmento NS3/4A de la ID. SEC. Nº: 17 o el mutante NS3/4A que carece de un sitio de escisión proteolítica (por ejemplo, las ID. SEC. Nº: 29-32 y 43-49) o un fragmento del mismo de al menos 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 ó 20 aminoácidos de longitud (por ejemplo las ID. SEC. Nº: 25-27 y 32-42) o un ácido nucleico que codifica una o más de estas moléculas. La sección proporcionada a continuación describe el uso de ribavirina como adyuvante con mayor detalle.
Ribavirina
Las composiciones descritas en este documento pueden fabricarse de acuerdo con procedimientos convencionales de farmacia galénica para producir agentes medicinales para administración a animales, por ejemplo mamíferos, incluyendo seres humanos. La ribavirina puede obtenerse a partir de proveedores comerciales (por ejemplo, Sigma e ICN). La ribavirina y/o el antígeno pueden formularse en la vacuna con y sin modificación. Por ejemplo, la ribavirina y/o el antígeno pueden modificarse o derivatizarse para obtener una molécula más estable y/o un adyuvante más potente. Por medio de una estrategia, la estabilidad de la ribavirina y/o un antígeno puede mejorarse acoplando las moléculas a un soporte tal como un polímero hidrófilo (por ejemplo, polietilenglicol).
Pueden generase muchos más derivados de ribavirina usando técnicas convencionales en el diseño racional de fármacos y en química combinatoria. Por ejemplo, Molecular Simulations Inc. (MSI), así como muchos otros proveedores, proporcionan un software que permite a un experto construir una biblioteca combinatoria de moléculas orgánicas. El programa C2.Analog Builder, por ejemplo, puede integrase con un juego de MSI de software de diversidad molecular Cerius2 para desarrollar una biblioteca de derivados de ribavirina que pueda usarse con las realizaciones descritas en este documento. (Véase por ejemplo, http://msi.com/life/products/cerius2/index.html).
Por medio de una estrategia, la estructura química de la ribavirina se registra en un medio legible por ordenador y se accede a la misma por medio de uno o más programas de aplicación de software de creación de modelos. Por ejemplo, el programa C2.Analog Builder junto con el programa C2Diversity permite al usuario generar una biblioteca virtual muy grande basada en la diversidad de grupos R para cada posición de sustituyente. Después se preparan compuestos que tienen la misma estructura que el derivado de ribavirina modelado creado en la biblioteca virtual usando la química convencional o pueden obtenerse a partir de una fuente comercial.
Los derivados de ribavirina fabricados recientemente después se someten a una selección en ensayos que determinan el grado de actividad adyuvante de la molécula y/o la medida de su capacidad de modular una respuesta inmune. Algunos ensayos pueden implicar el software de selección de fármacos virtual, tal como C2.Ludi. C2.Ludi es un programa de software que permite al usuario explorar bases de datos de moléculas (por ejemplo, derivados de ribavirina) para determinar su capacidad de interaccionar con el sitio activo de una proteína de interés (por ejemplo, RAC2 u otra proteína de unión a GTP). Basándose en las interacciones previstas descubiertas con el software de selección de fármacos virtual, los derivados de ribavirina pueden priorizarse para una caracterización adicional en ensayos convencionales que determinan la actividad adyuvante y/o el grado en el que una molécula modula una respuesta inmune. El Ejemplo I describe varios ensayos que se usaron para evaluar la actividad adyuvante de la ribavirina.
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Ejemplo 1
Los siguientes ensayos pueden usarse con cualquier derivado de ribavirina o combinaciones de derivados de ribavirina para determinar el grado de actividad adyuvante de la composición particular. En una primera serie de experimentos, se inmunizaron de tres a cinco ratones Balb/c (BK Universal, Uppsala, Suecia) i.p o s.c (por ejemplo, en la base de la cola) con 10 \mug o 100 \mug de proteína 3 no estructural recombinante (rNS3) del virus de la hepatitis C en las semanas cero y cuatro. La rNS3 se disolvió en solución salina tamponada con fosfato (PBS) sola o PBS que contenía 1 mg de ribavirina (obtenida a partir de ICN, Costa Mesa, CA). A los ratones se les inyectó un volumen total de 100 \mul por inyección.
Dos, cuatro y seis semanas después de la primera inmunización i.p, se extrajo sangre de todos los ratones por medio de extracción de muestras retro-orbital. Se recogieron muestras de suero y se analizaron con respecto a la presencia de anticuerpos contra rNS3. Para determinar el título de anticuerpos, se realizó un inmunoensayo enzimático (EIA). (Véase, por ejemplo, Hultgren y col., J Gen Virol. 79:2381-91 (1998) y Hultgren y col., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 4:630-632 (1997)). Los niveles de anticuerpos se registraron como la mayor dilución en suero que proporcionaba una densidad óptica a 405 nm dos veces mayor que la de los ratones no inmunizados.
Los ratones que recibieron 10 \mug ó 100 \mug de rNS3 mezclado con 1 mg de ribavirina en PBS presentaron uniformemente niveles superiores de anticuerpos contra NS3. El título de anticuerpo que se detectó por EIA dos semanas después de la inmunización se muestra en la Figura 1. Las formulaciones de vacuna que tenían 1 mg de ribavirina y 10 \mug o 100 \mug de rNS3 indujeron un título de anticuerpos significativamente mayor que las formulaciones de vacuna compuestas únicamente por rNS3.
En una segunda serie de experimentos, grupos de ocho ratones Balb/c en las semanas cero y cuatro se inmunizaron por vía intraperitoneal con 10 ó 50 \mug de rNS3 en 100 \mul de solución salina tamponada con fosfato que contenía 0 mg, 1 mg, 3 mg ó 10 mg de ribavirina (Sigma). A las cuatro, seis y ocho semanas, se extrajo sangre de los ratones y se separó y congeló el suero. Después de completar el estudio, los sueros se ensayaron con respecto a los niveles de anticuerpos contra NS3 recombinante, como se ha descrito anteriormente. Se compararon los niveles medios de anticuerpo contra rNS3 entre los grupos usando un ensayo t de Student (análisis paramétrico) o Mann-Whitney (análisis no paramétrico) y el paquete de software StatView 4.5 (Abacus Concepts, Berkely, CA). En la Tabla 1 se proporciona el efecto adyuvante de ribavirina cuando se añadió en tres dosis a 10 \mug de rNS3. En la Tabla 2 se proporciona el efecto adyuvante de ribavirina cuando se añade en tres dosis a 50 \mug de rNS3. En las Tablas 3 y 4 se proporcionan, respectivamente, comparaciones paramétricas de los títulos medios de anticuerpo contra rNS3 en ratones que recibían diferentes dosis de 10 \mug o 50 \mug de rNS3 y deferentes dosis de ribavirina. En las Tablas 5 y 6 se proporcionan, respectivamente, comparaciones no paramétricas de títulos medios de anticuerpo contra NS3 en ratones que recibieron diferentes dosis de 10 \mug o 50 \mug de rNS3 y diferentes dosis de ribavirina. Los valores proporcionados representan títulos contra rNS3 recombinantes como criterios de valoración.
TABLA 1
1
2 
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TABLA 2
3
4
TABLA 3
5
TABLA 4
6
TABLA 5
7
TABLA 6
8 
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Los datos anteriores demuestran que la ribavirina facilita o mejora una respuesta inmune a un antígeno de HCV o a epítopos de HCV. Se indujo una potente respuesta inmune a rNS3 después de la inmunización con una composición de vacuna que comprendía únicamente 1 mg de ribavirina y 10 \mug de antígeno de rNS3. Los datos anteriores también proporcionan pruebas de que la cantidad de ribavirina que es suficiente para facilitar una respuesta inmune a un antígeno está comprendida entre 1 y 3 mg por inyección para un ratón Balb/c de 25-30 g. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que estas cantidades están destinadas a utilizarse únicamente como guía y de ninguna manera deben considerarse limitantes del alcance de la invención. Sin embargo, los datos demuestran que composiciones de vacuna que comprenden dosis de aproximadamente 1 a 3 mg de ribavirina inducen una respuesta inmune que es más de 12 veces mayor que la respuesta inmune inducida en ausencia de ribavirina (Tablas 3 y 4). De esta manera, la ribavirina tiene un efecto adyuvante significativo sobre la respuesta inmune humoral de un animal y, de esta manera, aumenta o facilita la respuesta inmune al antígeno. El ejemplo indicado a continuación describe experimentos que se realizaron para comprender mejor la cantidad de ribavirina necesaria para aumentar o facilitar una respuesta inmune a un antígeno.
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Ejemplo 2
Para determinar la dosis de ribavirina que es suficiente para proporcionar un efecto adyuvante, se realizaron los siguientes experimentos. En una primera serie de experimentos se inmunizaron grupos de ratones (tres por grupo) con 20 \mug de rNS3 solo o una mezcla de 20 \mug de rNS3 y 0,1 mg, 1 mg o 10 mg de ribavirina. Después se determinaron los niveles de anticuerpo contra el antígeno por EIA. Se representaron los títulos medios como criterios de valoración en las semanas 1 y 3 y se muestran en la Figura 2. Se descubrió que el efecto adyuvante proporcionado por la ribavirina tenía diferentes cinéticas dependiendo de la dosis de ribavirina proporcionada. Por ejemplo, se descubrió que incluso bajas dosis (< 1 mg) de ribavirina aumentaba los niveles de anticuerpo en la semana uno pero no en la semana tres, mientras que se descubrió que a mayores dosis (1-10 mg) aumentaban los niveles de anticuerpo en la semana tres.
También se realizó una segunda serie de experimentos. En estos experimentos, a grupos de ratones se les inyectaron composiciones de vacuna que comprendían diversas cantidades de ribavirina y rNS3 y se controló la respuesta de IgG en estos animales. Las composiciones de vacuna comprendían aproximadamente 100 \mul de solución salina tamponada con fosfato y 20 \mug de rNS3 con o sin 0,1 mg, 1,0 mg o 10 mg de ribavirina (Sigma). Se extrajo sangre de los ratones en la semana seis y se determinaron los niveles de IgG específicos de rNS3 por EIA como se ha descrito previamente. Como se muestra en la Tabla 7, los efectos adyuvantes sobre los niveles de anticuerpos sostenidos fueron más evidentes en el intervalo de dosificación de 1-10 mg por inyección para un ratón de 25-30 g.
TABLA 7
9
En una tercera serie de experimentos, se investigó el efecto adyuvante de la ribavirina después de inyecciones primarias y de refuerzo. En estos experimentos, a ratones se les administraron dos inyecciones intraperitoneales de una composición de vacuna que comprendía 10 \mug de rNS3 con o sin ribavirina y se controlaron las respuestas de subclase de IgG al antígeno, como se ha indicado anteriormente. Por consiguiente, los ratones se inmunizaron con 100 \mul de solución salina tamponada con fosfato que contenía 10 \mug de NS3 recombinante solo, con o sin 0,1 ó 1,0 mg de ribavirina (Sigma) en las semanas 0 y 4. Se extrajo sangre de los ratones en la semana seis y se determinaron las subclases de IgG específicas de NS3 por EIA como se ha descrito previamente. Como se muestra en la Tabla 8, la adición de ribavirina al inmunógeno antes de la inyección no cambia la respuesta de subclase de IgG en la respuesta inmune específica de NS3. De esta manera, el efecto adyuvante de una composición de vacuna que comprende ribavirina y un antígeno no puede explicarse por un cambio en el equilibrio de Th1-Th2. Parece ser que otro mecanismo puede ser responsable del efecto adyuvante de la ribavirina.
TABLA 8
10
Los datos presentados en este ejemplo verifican adicionalmente que la ribavirina puede administrarse como un adyuvante y establecen que la dosis de ribavirina puede modular la cinética del efecto adyuvante. El ejemplo proporcionado a continuación describe otro ensayo que se realizó para evaluar la capacidad de la ribavirina de aumentar o facilitar una respuesta inmune a un antígeno.
Ejemplo 3
Este ensayo puede usarse con cualquier derivado de ribavirina o combinaciones de derivados de ribavirina para determinar el grado en el que una formulación de vacuna particular modula una respuesta inmune celular. Para determinar las respuestas de células T CD4+ a una vacuna que contiene ribavirina, se inmunizaron grupos de ratones s.c con 100 \mug de rNS3 en PBS o 100 \mug de rNS3 y 1 mg de ribavirina en PBS. Los ratones se sacrificaron 10 días después de la inmunización y se recogieron sus ganglios linfáticos y se drenaron. Después se realizaron ensayos de rellamada in vitro. (Véase, por ejemplo, Hultgren y col., J Gen Virol. 79:2381-91 (1998) y Hultgren y col., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 4:360-632 (1997). La cantidad de proliferación de células T CD4+ se determinó a las 96 horas de cultivo por medio de la incorporación [^{3}H] timidina.
Como se muestra en la Figura 3, los ratones que se inmunizaron con 100 \mug de rNS3 mezclados con 1 mg de ribavirina tuvieron una respuesta proliferativa de células T mucho mayor que los ratones que se inmunizaron con 100 \mug de rNS3 en PBS. Estos datos proporcionan indicios adicionales de que la ribavirina aumenta o facilita una respuesta inmune celular (por ejemplo, promoviendo el cebado eficaz de células T). La sección proporcionada a continuación describe algunos de los antígenos y epítopos que pueden usarse con las realizaciones descritas en este documento.
Antígenos y epítopos
Prácticamente cualquier antígeno que pueda usarse para generar una respuesta inmune en un animal, puede combinarse con ribavirina para preparar las composiciones descritas en este documento. Es decir, los antígenos que pueden incorporarse en estas composiciones (por ejemplo, vacunas) comprenden antígenos o epítopos bacterianos, antígenos o epítopos fúngicos, antígenos o epítopos vegetales, antígenos o epítopos de mohos, antígenos o epítopos virales, antígenos o epítopos de células cancerosas, antígenos o epítopos de toxinas, antígenos o epítopos químicos y autoantígenos o autoepítopos. Aunque muchas de estas moléculas inducen una respuesta inmune significativa sin un adyuvante, la ribavirina puede administrase junto o combinada con antígenos o epítopos "fuertes" o "débiles" para aumentar o facilitar la respuesta inmune a dicho antígeno o epítopo. Además, el uso de ribavirina como adyuvante puede permitir el uso de menores cantidades de antígenos mientras se mantiene la inmunogenicidad.
Además de antígenos peptídicos, en las composiciones de vacuna descritas en este documento pueden usarse antígenos basados en ácidos nucleicos. Se conocen diversas vacunas basadas en ácidos nucleicos y se contempla que estas composiciones y estrategias de inmunoterapia pueden aumentarse por medio de la reformulación con ribavirina (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.589.466 y 6.235.888). Por medio de una estrategia, por ejemplo, un gen que codifica un antígeno polipeptídico de interés se clona en un vector de expresión capaz de expresar el polipéptido cuando se introduce en un sujeto. La construcción de expresión se introduce en el sujeto en una mezcla de ribavirina o junto con ribavirina (por ejemplo, la ribavirina se administra poco después de la construcción de expresión en el mismo sitio). Como alternativa, al sujeto se le proporciona un ARN que codifica un antígeno polipeptídico de interés en una mezcla con ribavirina o junto con ribavirina.
Cuando el antígeno va a ser un ADN (por ejemplo, la preparación de una composición de vacuna de ADN), los promotores adecuados incluyen promotores del virus de simio 40 (SV40), un promotor del virus de tumor mamario de ratón (MMTV), un promotor del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) tal como el promotor de la repetición terminal larga (LTR) de HIV, del virus de Moloney, de ALV, de citomegalovirus (CMV) tal como el promotor temprano inmediato de CMV, del virus de Epstein Barr (EBV), del virus del sarcoma de Rous (RSV), así como promotores de genes humanos tales como la actina humana, la miosina humana, la hemoglobina humana, la creatina del músculo humano y la metalotioneína humana. Los ejemplos de señales de poliadenilación útiles con algunas realizaciones, especialmente en la producción de una vacuna genética para seres humanos incluyen, pero sin limitación, señales de poliadenilación de SV40 y señales de poliadenilación de LTR. En particular, se usa la señal de poliadenilación de SV40, que está en el plásmido pCEP4 (Invitrogen, San Diego, Calif.), denominada señal de poliadenilación de SV40.
Además de los elementos reguladores requeridos para la expresión génica, en una construcción génica también pueden incluirse otros elementos. Estos elementos adicionales incluyen potenciadores. El potenciador puede seleccionarse entre el grupo que incluye, pero sin limitación: actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina de músculo humano y potenciadores virales tales como los de CMV, RSV y EBV. Pueden proporcionarse construcciones génicas con un origen de replicación de mamífero para mantener la construcción extracromosómicamente y producir múltiples copias de la construcción en la célula. Los plásmidos pCEP4 y pREP4 de Invitrogen (San Diego, CA) contienen el origen de replicación del virus de Epstein Barr y la región codificante del antígeno nuclear EBNA-1, que produce un alto número de copias de replicación episomal sin integración. Pueden usarse todas las formas de ADN, ya sean replicantes o no replicantes, que no se integran en el genoma y que son expresables. El ejemplo proporcionado a continuación describe el uso de una composición que comprende un antígeno basado en ácido nucleico y ribavirina.
Ejemplo 4
A continuación se describe la inmunización de un animal con una vacuna que comprende un antígeno basado en ácido nucleico y ribavirina. Se anestesian ratones Balb/c hembras y machos de cinto a seis semanas de edad por medio de la inyección intraperitoneal de 0,3 ml de Avertina al 2,5%. Se realiza una incisión de 1,5 cm en el muslo anterior y se visualiza directamente el músculo cuadriceps. A un grupo de ratones se les inyectan aproximadamente 20 \mug de una construcción de expresión que tiene el gen de gp-120, dirigido por un promotor de citomegalovirus (CMV), y un a segundo grupo de ratones se les inyectan aproximadamente 5 \mug de ARN transcrito in vitro protegido terminalmente (por ejemplo, SP6, T7 o T3 (Ambion)) que codifica gp-120. Estos dos grupos son controles. A un tercer grupo de ratones se les inyectan aproximadamente 20 \mug del vector de expresión que tiene el gen de gp-120 y el promotor de CMV mezclado con 1 mg de ribavirina y a un cuarto grupo de ratones se les inyectan aproximadamente 5 \mug de ARN transcrito in vitro protegido terminalmente, mezclado con 1 mg de ribavirina. Las vacunas se inyectan en 0,1 ml de solución (PBS) en una jeringa de 1 cc a través de una aguja de calibre 27 durante un minuto, a aproximadamente 0,5 cm del sitio de inserción distal del músculo dentro de la rodilla y a una profundidad de aproximadamente 0,2 cm. Se pone una sutura sobre el sitio de inyección para poder localizarlo en el futuro y después se cierra la piel con grapas de acero inoxidable.
Se obtienen muestras de sangre antes de la inyección (Día 0) y hasta más de 40 días después de la inyección. El suero de cada muestra se diluye en serie y se evalúa en un ensayo de técnica ELISA convencional para la detección de anticuerpos, usando proteína gp-120 recombinante preparada en levadura como antígeno. En todas las muestras se detectarán tanto anticuerpos IgG como IgM específicos para gp-120, sin embargo, los grupos 3 y 4, que contenían la ribavirina, presentarán una mayor respuesta inmune a la gp-120 medida por la cantidad y/o título de anticuerpo detectado en los sueros.
Las realizaciones preferidas de la invención comprenden ribavirina y un antígeno viral o un epítopo presente en un virus, preferiblemente un virus de la hepatitis. Las composiciones comprenden, por ejemplo, ribavirina y un antígeno de HAV, un antígeno de HBV, un antígeno de HCV o cualquier combinación de estos antígenos o epítopos presentes en uno o más de estos virus. Los antígenos de la hepatitis pueden ser péptidos o ácidos nucleicos. Las composiciones que pueden usarse para vacunar contra la infección por HAV, por ejemplo, comprenden ribavirina y un péptido de HAV con una longitud de al menos 3-10 aminoácidos consecutivos, 10-50 aminoácidos consecutivos, 50-100 aminoácidos consecutivos, 100-200 aminoácidos consecutivos, 200-400 aminoácidos consecutivos, 400-800 aminoácidos consecutivos, 800-1200 aminoácidos consecutivos, 1200-1600 aminoácidos consecutivos, 1600-2000 aminoácidos consecutivos, y 2000-2227 aminoácidos consecutivos de la ID. SEC. Nº: 12.
Además, pueden usarse composiciones que comprenden ribavirina y un ácido nucleico que codifica uno o más de los péptidos de HAV descritos anteriormente para tratar o prevenir la infección por HAV. Los antígenos basados en ácidos nucleicos preferidos incluyen una secuencia de nucleótidos de al menos 9 nucleótidos consecutivos de una secuencia de HAV (por ejemplo, la ID. SEC. Nº: 15). Es decir, un antígeno basado en un ácido nucleico puede comprender al menos 9-25 nucleótidos consecutivos, 25-50 nucleótidos consecutivos, 50-100 nucleótidos consecutivos, 100-200 nucleótidos consecutivos, 200-500 nucleótidos consecutivos, 500-1000 nucleótidos consecutivos, 1000-2000 nucleótidos consecutivos, 2000-4000 nucleótidos consecutivos, 4000-8000 nucleótidos consecutivos, y 8000-9416 nucleótidos consecutivos de la ID. SEC. Nº: 15 o un ARN que corresponde a esas secuencias.
De forma similar, las realizaciones de vacuna de HBV preferidas comprende ribavirina y un péptido de HBV de al menos 3 aminoácidos consecutivos de HBsAg (ID. SEC. Nº: 10) o HBcAg y HBeAg (ID. SEC. Nº: 11). Es decir, algunas realizaciones tienen ribavirina y un péptido de HBV con una longitud de al menos 3-10 aminoácidos consecutivos, 10-50 aminoácidos consecutivos, 50-100 aminoácidos consecutivos, 100-150 aminoácidos consecutivos, 150-200 aminoácidos consecutivos y 200-226 aminoácidos consecutivos de la ID. SEC. Nº: 10 o la ID. SEC. Nº: 11.
Además, para tratar o prevenir una infección por HBV pueden usarse composiciones que comprenden ribavirina y un ácido nucleico que codifica uno o más de los péptidos HBV descritos anteriormente. Los antígenos basados en ácidos nucleicos incluyen una secuencia de nucleótidos de al menos 9 nucleótidos consecutivos de un HBV (por ejemplo, ID. SEC. Nº: 14). Es decir, un antígeno basado en ácido nucleico puede comprender al menos 9-25 nucleótidos consecutivos, 25-50 nucleótidos consecutivos, 50-100 nucleótidos consecutivos, 100-200 nucleótidos consecutivos, 200-500 nucleótidos consecutivos, 500-1000 nucleótidos consecutivos, 1000-2000 nucleótidos consecutivos, 2000-4000 nucleótidos consecutivos, 4000-8000 nucleótidos consecutivos y 8000-9416 nucleótidos consecutivos de la ID. SEC. Nº: 14 o un ARN que corresponde a estas secuencias. El ejemplo proporcionado a continuación describe el uso de ribavirina junto con una preparación de vacuna de HBV comercial.
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Ejemplo 5
El ejemplo adyuvante de la ribavirina se ensayó cuando se mezcló con dos dosis de una vacuna disponible en el mercado que contenía HBsAg y alumbre. (Engerix, SKB). Se mezclaron aproximadamente 0,2 \mug o 2 \mug de vacuna Engerix con PBS o con 1 mg de ribavirina en PBS y las mezclas se inyectaron por vía intraperitoneal en grupos de ratones (tres por grupo). Se administró un refuerzo que contenía la misma mezcla en la semana cuatro y se extrajeron muestras de sangre todos los ratones en la semana seis. Las muestras de suero se diluyeron de 1:60 a 1:37500 y las diluciones se ensayaron por EIA, como se ha descrito anteriormente, con la excepción de que se usó HBsAg humano purificada como antígeno de la fase sólida. Como se muestra en la tabla 9, las formulaciones de vacuna que tenían ribavirina aumentaron la respuesta a 2 \mug de una vacuna existente a pesar del hecho de que la vacuna ya contenía alumbre. Es decir, añadiendo ribavirina a una dosis de vacuna subóptima (es decir, una que no induce anticuerpos detectables solos), los anticuerpos se volvieron detectables, demostrando que la adición de ribavirina permite el uso de menores cantidades de antígeno en una formulación de vacuna sin comprometer la respuesta inmune.
TABLA 9
11
Algunas composiciones de vacuna de HCV comprenden ribavirina y un péptido de HCV de al menos 3 aminoácidos consecutivos de la ID. SEC. Nº: 1 o un ácido nucleico que codifica dicho péptido de HCV. Es decir, una composición de vacuna puede comprender ribavirina y uno o más péptidos de HCV con una longitud de al menos 3-10 aminoácidos consecutivos, 10-50 aminoácidos consecutivos, 50-100 aminoácidos consecutivos, 100-200 aminoácidos consecutivos, 200-400 aminoácidos consecutivos, 400-800 aminoácidos consecutivos, 800-1200 aminoácidos consecutivos, 1200-1600 aminoácidos consecutivos, 1600-200 aminoácidos consecutivos, 2000-2500 aminoácidos consecutivos y 2500-3011 aminoácidos consecutivos de la ID. SEC. Nº: 1 o un ácido nucleico que codifica uno o más de dichos fragmentos.
Las composiciones de HCV preferidas comprenden ribavirina y un péptido de al menos 3 aminoácidos consecutivos de la proteína nuclear de HCV (ID. SEC. Nº: 2), la proteína E1 de HCV (ID. SEC. Nº: 3), la proteína E2 de HCV (ID. SEC. Nº: 4), NS2 de HCV (ID. SEC. Nº: 5), NS3 de HCV (ID. SEC. Nº: 6), NS4A de HCV (ID. SEC. Nº: 7), NS4B de HCV (ID. SEC. Nº: 8) o NS5A/B de HCV (ID. SEC. Nº: 9) o péptidos consistentes en combinaciones de estos dominios. Es decir, las vacunas de HCV preferidas comprenden ribavirina y un péptido con una longitud de al menos 3-10 aminoácidos consecutivos, 10-50 aminoácidos consecutivos, 50-100 aminoácidos consecutivos, 100-200 aminoácidos consecutivos, 200-400 aminoácidos consecutivos, 400-800 aminoácidos consecutivos y 800-1040 aminoácidos consecutivos de una cualquiera o más de las ID. SEC. Nº: 2-9. Estos dominios corresponden a los restos aminoacídicos 1-182, 183-379, 380-729, 730-1044, 1045-1657, 1658-1711, 1712-1971 ó 1972-3011 de la ID. SEC. Nº: 1. De esta manera, las realizaciones preferidas también incluyen uno o más de 1-182, 183-379, 380-729, 730-1044, 1045-1657, 1658-1711, 1712-1971 ó 1972-3011 de la ID. SEC. Nº: 1 o fragmentos de los mismos.
También son realizaciones composiciones de vacuna que comprenden ribavirina y un ácido nucleico que codifica uno o más de los péptidos descritos anteriormente. Los antígenos basados en ácidos nucleicos preferidos incluyen una secuencia de nucleótidos de al menos 9 nucleótidos consecutivos de HCV (ID. SEC. Nº: 13). Es decir, un antígeno basado en ácido nucleico puede comprender al menos 9-25 nucleótidos consecutivos, 25-50 nucleótidos consecutivos, 50-100 nucleótidos consecutivos, 100-200 nucleótidos consecutivos, 200-500 nucleótidos consecutivos, 500-1000 nucleótidos consecutivos, 1000-2000 nucleótidos consecutivos, 2000-4000 nucleótidos consecutivos, 4000-8000 nucleótidos consecutivos y 8000-9416 nucleótidos consecutivos de una cualquiera de la ID. SEC. Nº: 13 o un ARN que corresponde a esas secuencias. La sección presentada a continuación describe algunas de las composiciones que contienen ribavirina y un antígeno.
Composiciones que contienen ribavirina y un antígeno
Las composiciones (por ejemplo, vacunas) que comprenden ribavirina y un antígeno o epítopo de un patógeno (por ejemplo, virus, bacteria, moho o levadura) pueden contener otros ingredientes que incluyen, pero sin limitación, adyuvantes, agentes aglutinantes, excipientes tales como estabilizadores (para promover el almacenamiento a largo plazo), emulsionantes, agentes espesantes, sales, conservantes, disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y para retrasar la absorción y similares. Estas composiciones son adecuadas para el tratamiento de animales como una medida preventiva para evitar una enfermedad o afección o como una medida terapéutica para tratar a animales que ya padecen una enfermedad o trastorno.
En la vacuna pueden estar presentes muchos otros ingredientes. Por ejemplo, la ribavirina y el antígeno pueden emplearse mezclados con excipientes convencionales (por ejemplo, vehículos orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para aplicación parenteral, entérica (por ejemplo, oral) o tópica, que no reaccionan de forma perjudicial con la ribavirina y/o el antígeno). Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero sin limitación, agua, soluciones de sales, alcoholes, goma arábiga, aceites vegetales, alcoholes bencílicos, polietilenglicoles, gelatina, carbohidratos tales como lactosa, amilosa o almidón, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, aceite de perfume, monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos de pentaeritritol, hidroxi metilcelulosa, polivinil pirrolidona, etc. En Remmington's Pharmaceutical Sciences, 15ª Edición, Easton; Mack Publishing Company, páginas 1405-1412 y 1461-1487 (1975) y The National Formulary XIV, 14ª Edición, Washington, American Pharmaceutical Association (1975), se describen muchos más vehículos adecuados.
Las construcciones génicas descritas en este documento pueden formularse o administrarse junto con agentes que aumentan la captación y/o expresión de la construcción génica por las células con respecto a la captación y/o expresión de la construcción génica por las células que tiene lugar cuando se administra una vacuna genética idéntica en ausencia de estos agentes. En los documentos WO 14/16737 y WO95/26718 se describen estos agentes y los protocolos para administrarlos junto con construcciones génicas. Los ejemplos de estos agentes incluyen: CaPO_{4}, DEAE dextrano, lípidos aniónicos; enzimas activas en la matriz extracelular; saponinas; lectinas; compuestos estrogénicos y hormonas esteroideas; alquilos inferiores hidroxilados; dimetil sulfóxido (DMSO); urea; y anilidas de ésteres del ácido benzoico, amidinas, uretanos y las sales clorhidrato de los mismos tales como las de la familia de los anestésicos locales. Además, las construcciones génicas se encapsulan dentro/administran junto con lípidos/complejos policatiónicos.
Las vacunas pueden esterilizarse y, si se desea, mezclarse con agentes auxiliares, por ejemplo lubricantes, conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones, sustancias colorantes, aromatizantes y/o aromáticas y similares, que no reaccionen de forma perjudicial con la ribavirina o el antígeno.
La dosis eficaz y el procedimiento de administración de una formulación de vacuna particular pueden variar basándose en el paciente individual y el tipo y estadio de la enfermedad, así como en otros factores conocidos para el experto en la materia. La eficacia terapéutica y la toxicidad de las vacunas pueden determinarse por procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, por la DE_{50} (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). Los datos obtenidos a partir de ensayos en cultivos de células y estudios animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificación para uso en seres humanos. La dosificación de las vacunas está preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE_{50} sin toxicidad. La dosificación varía dentro de este intervalo dependiendo del tipo de derivado de ribavirina y antígeno, la forma de dosificación empleada, la sensibilidad del paciente y la vía de administración.
Como la ribavirina se ha comercializado durante varios años, se conocen muchas formas de dosificación y vías de administración. Todas las formas de dosificación y vías de administración conocidas pueden proporcionarse dentro del contexto de las realizaciones descritas en este documento. Preferiblemente, una cantidad de ribavirina que es eficaz para mejorar una respuesta inmune a un antígeno en un animal puede considerarse una cantidad suficiente para conseguir un nivel en suero sanguíneo de antígeno de aproximadamente 0,25-12,5 \mug/ml en el animal, preferiblemente aproximadamente 2,8 \mug/ml. En algunas realizaciones, la cantidad de ribavirina se determina de acuerdo con el peso corporal del animal que va a recibir la vacuna. Por consiguiente, la cantidad de ribavirina en una formulación de vacuna puede ser de aproximadamente 0,1-1,0 mg/kg de peso corporal. Es decir, algunas realizaciones tienen una cantidad de ribavirina que corresponde a aproximadamente 0,1-1,0 mg/kg, 1,1-2,0 mg/kg, 2,1-3,0 mg/kg, 3,1-4,0 mg/kg, 4,1-5,0 mg/kg, 5,1, y 6,0 mg/kg de peso corporal de un animal. Más convencionalmente, las vacunas contienen aproximadamente 0,25 mg-2000 mg de ribavirina. Es decir, algunas realizaciones tienen aproximadamente 250 \mug, 500 \mug, 1 mg, 25 mg, 50 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 550 mg, 600 mg, 650 mg, 700 mg, 750 mg, 800 mg, 850 mg, 900 mg, 1 g, 1,1 g, 1,2 g, 1,3 g, 1,4 g, 1,5 g, 1,6 g, 1,7 g, 1,8 g, 1,9 g y 2 g de ribavirina.
Las preparaciones de vacuna convencionales pueden modificarse añadiendo una cantidad de ribavirina que sea suficiente para mejorar una respuesta inmune al antígeno. Es decir, las formulaciones de vacuna convencionales existentes pueden modificarse añadiendo simplemente ribavirina a la preparación o administrando la vacuna convencional junto con ribavirina (es decir, poco antes o después de proporcionar el antígeno). Como apreciará un experto en la materia, la cantidad de antígenos en una vacuna puede variar dependiendo del tipo de antígeno y de su inmunogenicidad. La cantidad de antígenos en las vacunas puede variar de acuerdo con esto. Sin embargo, como pauta general, las vacunas pueden tener aproximadamente 0,25 mg-5 mg, 5-10 mg, 10-100 mg, 100-500 mg, y hasta 2000 mg de un antígeno (por ejemplo, un antígeno del virus de la hepatitis).
En algunas estrategias descritas en este documento, el médico individual elige la cantidad exacta de ribavirina y/o antígeno dependiendo del paciente a tratar. Además, las cantidades de ribavirina pueden añadirse en combinación o por separado de la misma cantidad o de una cantidad equivalente de antígeno, y estas cantidades pueden ajustarse durante un protocolo de vacunación particular para proporcionar niveles suficientes a la luz de consideraciones específicas del paciente o específicas del antígeno. A este respecto, los factores específicos del paciente y específicos del antígeno que pueden tenerse en cuenta incluyen, pero sin limitación, la gravedad del estado de enfermedad del paciente, la edad y el peso del paciente, la dieta, el momento y la frecuencia de administración, combinaciones de fármacos, reacciones de sensibilidad y tolerancia/respuesta a la terapia. La siguiente sección describe el descubrimiento de un nuevo gen de HCV y la creación de secuencias mutantes de HCV que pueden usarse con las realizaciones descritas en este documento.
Nuevas secuencias de NS3/4A y secuencias NS3/4A mutantes
Se clonó un nuevo ácido nucleico y la proteína correspondiente al dominio NS3/4A de HCV a partir de un paciente infectado con HCV (ID. SEC. Nº: 16 y 17). Una búsqueda en el Genebank reveló que la secuencia clonada tenía la mayor homología con secuencias de HCV pero sólo tenía una homología del 93% con el pariente de HCV más próximo (nº de acceso AJ 278830). También se crearon un mutante truncado del nuevo péptido NS3/4A y mutantes de NS3/4A que carecen del sitio de escisión proteolítica. Se descubrió que estos nuevos péptidos y los ácidos nucleicos que codificaban dichos péptidos eran potentes inmunógenos que pueden mezclarse con ribavirina para obtener una composición que proporciona a un receptor una potente respuesta inmune a HCV. La clonación del nuevo dominio NS3/4A y la creación de los diversos mutantes de NS3/4A se describe en el siguiente ejemplo.
Ejemplo 6
[Sólo con fines informativos; no ilustrativo de la presente invención]
La secuencia de NS3/4A se amplificó a partir del suero de un paciente infectado con HCV (genotipo 1a de HCV) usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se extrajo el ARN total del suero, se realizó la síntesis de ADNc y se realizó una PCR de acuerdo con protocolos convencionales (Chen M y col., J. Med Virol. 43:223-226 (1995)). La síntesis de ADNc se inició usando el cebador antisentido "NS4KR" (5'-CCG TCT AGA TCA GCA CTC TTC CAT TTC ATC-3' (ID. SEC. Nº: 18)). A partir de este ADNc, se amplificó un fragmento de ADN de 2079 pares de bases de HCV, correspondiente a los aminoácidos 1007 a 1711, que incluye los genes NS3 y NS4A. Se usó una polimerasa de alta fidelidad (Expand High Fidelity PCR, Boehringer-Mannheim, Mannheim, Alemania) con el cebador "NS3KF" (5'-CCT GAA TTC ATG GCG CCT ATC ACG GCC TAT-3' (ID. SEC. Nº: 19) y el cebador NS4KR. El cebador NS3KF contenía un sitio de escisión de la enzima de restricción EcoRI y un codón de iniciación, y el cebador NS4KR contenía un sitio de escisión de la enzima de restricción XbaI y un codón de parada.
El fragmento amplificado después se secuenció (ID. SEC. Nº: 16). El análisis de comparación de secuencias reveló que el fragmento génico efectivamente se había amplificado a partir de una cepa viral de genotipo 1a. Una búsqueda BLAST computarizada frente a la base de datos del Genbank usando la página web NCBI reveló que el homólogo de HCV más próximo tenía una identidad del 93% en la secuencia de nucleótidos.
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El fragmento de ADN amplificado después se digirió con EcoRI y XbaI, y se insertó en un plásmido pcDNA3.1/His (Invitrogen) digerido con las mismas enzimas. El plásmido NS3/4A-pcDNA3.1 después se digirió con EcoRI y XbaI y el inserto se purificó usando el kit QiaQuick (Qiagen, Hamburg, Alemania) y se unió a un vector pVAX digerido con EcoRI y XbaI (Invitrogen) para generar el plásmido NS3/4A-pVAX.
El mutante truncado rNS3 se obtuvo delecionando la secuencia de NS4A del ADN de NS3/4A. Por consiguiente, la secuencia del gen NS3 de NS3/4A-pVAX se amplificó por PCR usando los cebadores NS3KF y 3'NotI (5'-CCA CGC GGC CGC GAC GAC CTA CAG-3' (ID. SEC. Nº: 20)) que contenían sitios de restricción de EcoRI y NotI, respectivamente. El fragmento NS3 (1850 pb) después se unió a un plásmido pVAX digerido con EcoRI y NotI para generar el vector NS3-pVAX. Los plásmidos se cultivaron en células E. coli BL21. Los plásmidos se secuenciaron y se verificaron por escisión de restricción y los resultados fueron los esperados basándose en la secuencia original.
Para cambiar el sitio de escisión proteolítica entre NS3 y NS4A, el plásmido NS3/4A-pVAX se mutagenizó usando el kit de mutagénesis QUICKCHANGE^{TM} (Stratagene), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Para generar la mutación "TPT", el plásmido se amplificó usando los cebadores 5'-CTGGAGGTCGTCACGCCTACCTGGGTGCT
CGTT-3' (ID. SEC. Nº: 21) y 5'-ACCGAGCACCCAGGTAGGCGTGACGACCTCCAG-3' (ID. SEC. Nº: 22) dando como resultado NS3/4A-TPT-pVAX. Para generar la mutación "RGT", el plásmido se amplificó usando los cebadores 5'-CTGGAGGTCGTC-CGCGGTACCTGGGTGCTCGTT-3' (ID. SEC. Nº: 23) y 5'-ACCGAGCACCCAGGTACC-GCGGACGACCTCCAG-3' (ID. SEC. Nº: 24) dando como resultado NS3/4A-RGT-pVAX.
Todas las construcciones mutagenizadas se secuenciaron para verificar que las mutaciones se habían realizado correctamente. Los plásmidos se cultivaron en células E. coli BL21 competentes. El ADN plasmídico usado para la inyección in vivo se purificó usando columnas de purificación de ADN Qiagen, de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes (Qiagen GmbH, Hilden, FRG). La concentración del ADN plasmídico resultante se determinó espectrofotométricamente (Dynaquant, Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) y el ADN purificado se disolvió en solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril a concentraciones de 1 mg/ml. Las secuencias de aminoácidos de las uniones de tipo natural y mutadas se muestran en la Tabla 10. La siguiente sección describe varios ácidos nucleicos que codifican péptidos de HCV.
TABLA 10
12
Ácidos nucleicos que codifican péptidos de HCV
Las realizaciones de ácido nucleico incluyen nucleótidos que codifican los péptidos de HCV descritos en este documento (por ejemplo, ID. SEC. Nº: 17, 29, 31, 32, y 43-49) o fragmentos de los mismos de al menos 4, 6, 8, 10, 12, 15 ó 20 aminoácidos de longitud (por ejemplo, las ID. SEC. Nº: 25-27 y 33-42). Algunas realizaciones, por ejemplo, incluyen ADN genómico, ARN y ADNc que codifica estos péptidos de HCV. Las realizaciones de nucleótidos de HCV no sólo incluyen las secuencias de ADN mostradas en la lista de secuencias (por ejemplo, ID. SEC. Nº: 16) sino que también incluyen secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos mostradas en la lista de secuencias (por ejemplo, ID. SEC. Nº: 17) y cualquier secuencia de nucleótidos que hibride con las secuencias de ADN mostradas en la lista de secuencias en condiciones rigurosas (por ejemplo, hibridación con ADN unido al filtro en NaHP0_{4} 0,5 M, dodecil sulfato sódico (SDS) al 7,0%, EDTA 1 mM a 50ºC) y lavado en 0,2 X SSC/SDS al 0.2% a 50ºC y cualquier secuencia de nucleótidos que hibride con las secuencias de ADN que codifican una secuencia de aminoácidos proporcionada en la lista de secuencias (ID. SEC. Nº: 17) en condiciones menos rigurosas (por ejemplo, hibridación en NaHP0_{4} 0,5 M, dodecil sulfato sódico (SDS) al 7,0%, EDTA 1 mM a 37ºC y lavado en 0,2X SSC/SDS al 0.2% a 37ºC).
Las realizaciones de ácidos nucleicos también incluyen fragmentos, modificaciones, derivados y variantes de las secuencias descritas anteriormente. Las realizaciones deseadas, por ejemplo, incluyen ácidos nucleicos que tienen al menos 12 bases consecutivas de una de las nuevas secuencias de HCV o una secuencia complementaria a la misma y los fragmentos preferidos incluyen al menos 12 bases consecutivas de un ácido nucleico que codifica la molécula de NS3/4A de la ID. SEC. Nº: 17 o una secuencia complementaria a la misma.
A este respecto, las realizaciones de ácido nucleico de la invención pueden tener de 12 a aproximadamente 2079 nucleótidos consecutivos. Algunos fragmentos de ADN de la invención, por ejemplo, incluyen ácidos nucleicos que tienen al menos 12-15, 15-20, 20-30, 30-50, 50-100, 100-200, 200-500, 500-1000, 1000-1500, 1500-2079 nucleótidos consecutivos de la ID. SEC. Nº: 16 o un complemento de los mismos. Las realizaciones de ácido nucleico también pueden alterarse por mutación tales como sustituciones, adiciones o deleciones. Debido a la degeneración de las secuencias codificantes de nucleótidos, en algunas realizaciones pueden usarse, por ejemplo, otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos de HCV representada en la ID. SEC. Nº: 17. Éstas incluyen, pero sin limitación, secuencias de ácido nucleico que codifican la totalidad o partes de NS3/4A (ID. SEC. Nº: 16) o ácidos nucleicos que complementan la totalidad o parte de esta secuencia que se han alterado por la sustitución de codones diferentes que codifican un resto aminoacídico equivalente funcionalmente dentro de la secuencia, produciendo de esta manera un cambio silencioso, o un resto aminoacídico no equivalente funcionalmente dentro de la secuencia, produciendo de esta manera un cambio detectable.
Usando las secuencias de ácido nucleico descritas anteriormente, pueden diseñarse sondas que complementan estas moléculas y fabricarse por síntesis de oligonucleótidos. Las sondas deseables comprenden una secuencia de ácido nucleico de la ID. SEC. Nº: 16 que es única para este aislado de HCV. Estas sondas pueden usarse para seleccionar ADNc de pacientes para aislar fuentes naturales de HCV, de las que algunas pueden ser nuevas secuencias de HCV por sí mismas. La selección puede realizarse, por ejemplo, por hibridación en filtro o por PCR. Por hibridación en filtro, la sonda marcada preferiblemente contiene al menos 15-30 pares de bases de la secuencia de ácido nucleico de la ID. SEC. Nº: 16 que es única para este péptido NS3/4A. Las condiciones de lavado de hibridación usadas preferiblemente son de una rigurosidad media a alta. La hibridación puede realizarse en NaHP0_{4} 0,5 M, dodecil sulfato sódico (SDS) al 7,0% y EDTA 1 mM a 42ºC durante una noche y el lavado puede realizarse en 0,2X SSC/SDS al 0.2% a 42ºC. Como pauta con respecto a estas condiciones véase, por ejemplo, Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press, N.Y.; y Ausubel y col., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.
También pueden aislarse ácidos nucleicos de HCV de pacientes infectados con HCV usando los ácidos nucleicos descritos en este documento. (Véase también el Ejemplo 6). Por consiguiente, el ARN obtenido a partir de un paciente infectado con HCV se transcribe de forma inversa y el ADNc resultante se amplifica usando PCR u otra técnica de amplificación. Los cebadores preferiblemente se obtienen a partir de la secuencia de NS3/4A (ID. SEC. Nº: 16).
Como revisión de la tecnología de PCR, véase Molecular Cloning to Genetic Engineering, White, B.A. Ed. en Methods in Molecular Biology 67: Humana Press, Totowa (1997) y la publicación titulada "PCR Methods and Applications" (1991, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Para la amplificación de ARNm, está dentro del alcance la invención transcribir de forma inversa ARNm en ADNc seguido por PCR (RT-PCR); o usar una sola enzima para las dos etapas como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.322.770. Otra técnica implica el uso de la reacción en cadena de la ligasa con huecos asimétricos mediante la transcriptasa inversa (RT-AGLCR), como se describe por Marshall R.L. y col. (PCR Methods and Applications 4:80-84, 1994).
En resumen se aísla ARN siguiendo procedimientos convencionales. Se realiza una reacción de transcripción inversa sobre el ARN usando un cebador oligonucleotídico específico para el extremo más 5' del fragmento amplificado como cebador de síntesis de la primera cadena. Después se añade "una cola" al híbrido de ARN/ADN resultante con guaninas usando una reacción de transferasa terminal convencional. El híbrido después se digiere con ARNasa H, y la síntesis de la segunda cadena se ceba con un cebador poli-C. De esta manera se aíslan fácilmente secuencias de ADNc cadena arriba del fragmento amplificado. Como revisión de las estrategias de clonación que pueden usarse, véase, por ejemplo, Sambrook y col., 1989, supra.
En cada uno de estos procedimientos de amplificación se añaden cebadores de cada lado de la secuencia a amplificar a una muestra de ácido nucleico preparada de forma conveniente junto con dNTP y una polimerasa termoestable, tal como la Taq polimerasa, la Pfu polimerasa o la Vent polimerasa. El ácido nucleico de la muestra se desnaturaliza y los cebadores se hibridan específicamente con secuencias de ácido nucleico complementarias de la muestra. Después se extienden los cebadores hibridados. Posteriormente se inicia otro ciclo de desnaturalización, hibridación y extensión. Los ciclos se repiten múltiples veces para producir un fragmento amplificado que contiene la secuencia de ácido nucleico entre los sitios cebadores. En varias patentes, incluyendo las Patentes de Estados Unidos Nº 4.683.195, 4.683.202 y 4.965.188 se ha descrito adicionalmente la PCR.
Los cebadores se seleccionan de manera que sean sustancialmente complementarios a una parte de la secuencia de ácido nucleico de la ID. SEC. Nº: 16 que es única para esta molécula de NS3/4A, permitiendo de esta manera amplificar las secuencias entre los cebadores. Preferiblemente, los cebadores tienen una longitud de al menos 16-20, 20-25 o 25-30 nucleótidos. La formación de híbridos estables depende de la temperatura de fusión (Tm) del ADN. La Tm depende de la longitud del cebador, la fuerza iónica de la solución y el contenido de G+C. Cuanto mayor es el contenido de G+C del cebador, mayor es la temperatura de fusión porque los pares G:C se mantienen por tres enlaces de H mientras que los pares A:T tienen sólo dos. El contenido de G+C de los cebadores de amplificación descritos en este documento preferiblemente varía entre el 10 y el 75%, más preferiblemente entre el 35 y el 60%, y aún más preferiblemente entre el 40 y el 55%. La longitud apropiada para los cebadores en una serie particular de condiciones de ensayo puede determinarse empíricamente por un experto en la materia.
La separación de los cebadores se refiere a la longitud del segmento a amplificar. En el contexto de las realizaciones descritas en este documento, los segmentos amplificados que llevan una secuencia de ácido nucleico que codifica péptidos de HCV pueden variar en tamaño desde al menos aproximadamente 25 pb a la longitud entera del genoma de HCV. Son típicos fragmentos de amplificación de 25-1000 pb, se prefieren los fragmentos de 50-1000 pb y son más preferidos los fragmentos de 100-600 pb. Se apreciará que los cebadores de amplificación pueden ser de cualquier secuencia que permita la amplificación específica de la región NS3/4A y, por ejemplo, pueden incluir modificaciones tales como sitios de restricción para facilitar la clonación.
El producto de PCR puede subclonarse y secuenciarse para asegurarse de que las secuencias amplificadas representan las secuencias de un péptido de HCV. El fragmento de PCR después puede usarse para aislar un clon de ADNc de longitud completa por una diversidad de procedimientos. Por ejemplo, el fragmento amplificado puede marcarse y usarse para seleccionar una biblioteca de ADNc tal como una biblioteca de ADNc de bacteriófago. Como alternativa, el fragmento marcado puede usarse para aislar clones genómicos a través de la selección de una biblioteca genómica. Además, puede construirse una biblioteca de expresión utilizando ADNc sintetizado, por ejemplo, a partir de ARN aislado de un paciente infectado. De esta manera, pueden aislarse productos génicos de HCV usando técnicas de selección de anticuerpos convencionales junto con anticuerpos inducidos contra el producto génico de HCV. (Como técnicas de selección véase, por ejemplo, Harlow, E. y Lane, eds., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor.)
Las realizaciones también incluyen (a) vectores de ADN que contienen cualquiera de las secuencias de ácido nucleico anteriores y/o sus complementos (es decir, antisentido); (b) vectores de expresión de ADN que contienen cualquiera de las secuencias de ácido nucleico anteriores asociadas operativamente con un elemento regulador que dirige la expresión del ácido nucleico; y (c) células hospedadoras modificadas por ingeniería genética que contienen cualquiera de las secuencias de ácido nucleico anteriores asociada operativamente con un elemento regulador que dirige la expresión de las secuencias codificantes en la célula hospedadora. Estas construcciones recombinantes pueden replicarse de forma autónoma en una célula hospedadora. Como alternativa, las construcciones recombinantes pueden integrarse en el ADN cromosómico de una célula hospedadora. Estos polinucleótidos recombinantes típicamente comprenden un polinucleótido de HCV genómico o de ADNc de origen semisintético o sintético, gracias a la manipulación humana. Por lo tanto, se proporcionan ácidos nucleicos recombinantes que comprenden estas secuencias y complementos de las mismas que no son de origen natural.
Aunque pueden emplearse ácidos nucleicos que codifican un péptido de HCV o ácidos nucleicos que tienen secuencias complementarias a un gen de HCV según aparecen en la naturaleza, a menudo se alterarán, por ejemplo, por deleción, sustitución o inserción y pueden ir acompañados por una secuencia no presente en seres humanos. Como se usan en este documento, los elementos reguladores incluyen, pero sin limitación, promotores inducibles y no inducibles, potenciadores, operadores y otros elementos conocidos por los expertos en la materia que dirigen y regulan la expresión. Estos elementos reguladores incluyen, pero sin limitación, el gen temprano inmediato de citomegalovirus hCMV, los promotores tempranos o tardíos de adenovirus SV40, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC, el sistema TRC, las regiones principales del operador y promotor del fago A, las regiones de control de la proteína de la cubierta fd, el promotor para la 3-fosfoglicerato quinasa, los promotores de la fosfatasa ácida y los promotores de los factores de apareamiento de levadura.
Además, pueden modificarse por ingeniería genética secuencias de ácido nucleico que codifican el péptido de HCV recombinante y sus secuencias complementarias para modificar su procesamiento o expresión. Por ejemplo, y no a modo de limitación, los ácidos nucleicos de HCV descritos en este documento pueden combinarse con una secuencia promotora y/o sitio de unión a ribosomas, o puede insertarse una secuencia señal cadena arriba de las secuencias que codifican el péptido de HCV para permitir la secreción del péptido y de esta forma facilitar la recolección o biodisponibilidad. Además, un ácido nucleico de HCV dado puede mutarse in vitro o in vivo para crear y/o destruir secuencias de traducción, iniciación y/o terminación o para crear variaciones en regiones codificantes y/o formar nuevos sitios de restricción o destruir sitios de restricción preexistentes, o para facilitar adicionalmente la modificación in vitro. (Véase el Ejemplo 6). Puede usarse cualquier técnica para mutagénesis conocida en la técnica, incluyendo pero sin limitación mutagénesis dirigida in vitro. (Hutchinson y col., J. Biol. Chem., 253:6551 (1978)).
Además, pueden unirse ácidos nucleicos que codifican otras proteínas o dominios de otras proteínas a ácidos nucleicos que codifican un péptido de HCV para crear una proteína de fusión. Los nucleótidos que codifican proteínas de fusión pueden incluir, pero sin limitación, una secuencia de NS3/4A de longitud completa (ID. SEC. Nº: 16), una secuencia de NS3/4A truncada o un fragmento peptídico de una secuencia de NS3/4A fusionada a una proteína o péptido no relacionado, tal como por ejemplo poli-histidina, hemaglutinina, una enzima, una proteína fluorescente o una proteína luminiscente, como se describe más adelante.
Sorprendentemente se descubrió que los vectores NS3-pVAX y NS3/4A-pVAX pueden inducir una potente respuesta inmune cuando se inyectan en un mamífero inmunocompetente. El siguiente ejemplo describe estos experimentos con mayor detalle.
Ejemplo 7
[Sólo con fines informativos; no ilustrativo de la presente invención]
Para determinar si se indujo una respuesta inmune humoral por los vectores NS3-pVAX y NS3/4A-pVAX, las construcciones de expresión descritas en el Ejemplo 6 se purificaron usando el sistema de purificación de ADN Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante y los vectores de ADN purificados se usaron para inmunizar grupos de cuatro a diez ratones Balb/c. Los plásmidos se inyectaron directamente en músculos tibialis anterior (TA) en regeneración como se ha descrito previamente (Davis y col., Human Gene Therapy 4(6):733 (1993)). En resumen, a los ratones se les inyectaron por vía intramuscular 50 \mul/TA de cardiotoxina 0,01 mM (Latoxan, Rosans, Francia) en NaCl estéril al 0,9%. Cinco días después, en cada músculo TA se inyectaron 50 \mul de PBS que contenía rNS3 o ADN.
Se obtuvieron cepas de ratón endogámicas C57/BL6 (H-2b) Balb/C (H-2d) y CBA (H-2k) a partir de la instalación de cría de Möllegard Dinamarca, Charles River Uppsala, Suecia, o B&K Sollentuna, Suecia. Todos los ratones eran hembras y se usaron a las 4-8 semanas de edad. Para controlar las respuestas humorales, todos los ratones recibieron una inyección de refuerzo de 50 \mul/TA de ADN plasmídico cada cuatro semanas. Además, algunos ratones recibieron proteína NS3 recombinante (rNS3), que se purificó como se describe en este documento. Los ratones que recibieron rNS3 no se inmunizaron más de dos veces. Se extrajeron muestras de todos los ratones dos veces al mes.
Se usaron ensayos enzimáticos de inmunoabsorbente (EIA) para detectar la presencia de anticuerpos murinos contra NS3. Estos ensayos se realizaron esencialmente como se describe en Chen y col., Hepatology 28(1): 219 (1998)). En resumen, se adsorbió pasivamente rNS3 durante una noche a 4ºC en placas de microtitulación de 96 pocillos (Nunc, Copenhagen, Dinamarca) a 1 \mug/ml en tampón carbonato sódico 50 mM (pH 9,6). Las placas después se bloquearon por incubación con tampón de dilución que contenía PBS, suero de cabra al 2% y albúmina de suero bovino al 1% durante una hora a 37ºC. Después se incubaron diluciones seriadas de sueros de ratón empezando a 1:60 en las placas durante una hora. Los anticuerpos de suero murino unidos se detectaron por medio de una IgG de cabra anti-ratón conjugada con fosfatasa alcalina (Sigma Cell Products, Saint Louis, MO) seguido de la adición del sustrato pNPP (1 comprimido/5 ml de tampón de dietanolamina 1 M con MgCl_{2} 0,5 mM). La reacción se detuvo por la adicción de NaOH 1 M y la absorbancia se leyó a 405 nm.
Después de cuatro semanas, cuatro de cinco ratones inmunizados con NS3/4A-pVAX habían desarrollado anticuerpos NS3, mientras que uno de cinco inmunizados con NS3-pVAX habían desarrollado anticuerpos (Figura 4). Después de seis semanas, cuatro de cinco ratones inmunizados con NS3/4A-pVAX habían desarrollado altos niveles (>10^{4}) anticuerpos NS3 (niveles medios 10800\pm4830) y uno tenía un título de 2160. Aunque todos los ratones inmunizados con NS3-pVAX desarrollaron anticuerpos contra NS3, ninguno de ellos desarrolló niveles tan elevados como los producidos por la construcción de NS3/4A-pVAX (niveles medios 1800\pm805). Los niveles de anticuerpo inducidos por la construcción de fusión NS3/4A fueron significativamente mayores que los inducidos por los NS3-pVAX a las seis semanas (rangos medios 7,6 frente a 3, 4, p<0,05, ensayo de suma de rangos de Mann-Whitney, y p<0,01, ensayo t de Student). De esta manera, la inmunización con NS3-pVAX o NS3/4A-pVAX dio como resultado la producción de anticuerpos anti-NS3, pero el gen de fusión NS3/4A fue un inmunógeno más potente. El siguiente ejemplo describe experimentos que se realizaron para determinar si la construcción NS3/4A-TPT-pVAX podía inducir una respuesta inmune potente.
Ejemplo 8
[Sólo con fines informativos; no ilustrativo de la presente invención]
Para ensayar si la mayor inmunogenicidad de NS3/4A podía atribuirse únicamente a la presencia de NS4A, o si la proteína de fusión NS3/4A además tenía que escindirse en la unión NS3/4A, se realizaron nuevos experimentos. En un primer experimento, se comparó la inmunogenicidad de los vectores NS3-pVAX, NS3/4A-pVAX y NS3/4A-TPT-pVAX en ratones Balb/c. Los ratones se inmunizaron en la semana cero como se ha descrito anteriormente y, después de dos semanas, se extrajeron muestras de sangre de todos los ratones y se determinó la presencia de anticuerpos contra NS3 a una dilución de suero de 1:60 (Tabla 11). De nuevo se extrajeron muestras de sangre de los ratones en la semana 4. Aunque el vector NS3/4A-TPT-pVAX era comparable al vector NS3-pVAX (4/10 frente a 0/10; NS, ensayo exacto de Fisher), el vector NS3/4A pVAX seguía siendo el inmunógeno más potente. De esta manera, todas las construcciones de HCV que se habían introducido en los ratones podían inducir una respuesta inmune contra NS3, sin embargo, la secuencia de NS4A y un sitio de escisión proteolítica funcional entre las secuencias de NS3 y NS4A proporcionó una respuesta inmune más potente.
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TABLA 11
13 
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Durante la fase crónica de infección, HCV se replica en hepatocitos y se propaga dentro del hígado. Un factor importante para combatir las infecciones virales crónicas y persistentes es el sistema de defensa inmune mediado por células. Los linfocitos CD4+ y CD8+ se infiltran en el hígado durante la fase crónica de la infección por HCV, pero no pueden eliminar el virus o prevenir la lesión hepática. Además, una infección persistente por HCV está asociada con el inicio del carcinoma hepatocelular (HCC). Los siguientes ejemplos describen experimentos que se realizaron para determinar si las construcciones NS3 y NS3/4A podían inducir una respuesta inmune mediada por células T contra NS3.
Ejemplo 9
[Sólo con fines informativos; no ilustrativo de la presente invención]
Para estudiar si las construcciones descritas anteriormente podían inducir una respuesta mediada por células contra NS3, se realizó un ensayo del crecimiento tumoral in vivo. Para este fin, se obtuvo una línea de células tumorales SP2/0 transfectada de forma estable con el gen NS3/4A. El plásmido pcDNA3.1 que contenía el gen NS3/4A gene se linealizó por digestión con BgIII. Se mezclaron un total de 5 \mug de ADN plasmídico linealizado con 60 \mug de reactivo de transfección (Superfect, Qiagen, Alemania) y la mezcla se añadió a una capa con una confluencia del 50% de células SP2/0 en una placa de 35 mm. Las células SP2/0 transfectadas (NS3/4ASP2/0) se cultivaron durante 14 días en presencia de 800 \mug/ml de geneticina y se aislaron los clones individuales. Se identificó un clon de SP2/0 que expresaba NS3/4A estable usando PCR y RTPCR. La línea celular clonada se mantuvo en DMEM que contenía suero bovino fetal al 10%, L-glutamina y penicilina-estreptomicina.
Después se evaluó la cinética de crecimiento in vivo de las líneas celulares SP2/0 y NS3/4A-SP2/0 en ratones Balb/c. A los ratones se les inyectaron por vía subcutánea 2 x 10^{6} células tumorales en el costado derecho. Cada día se determinó el tamaño del tumor a través de la piel. Las cinéticas de crecimiento de las dos líneas celulares fueron comparables. Por ejemplo, los tamaños medios del tumor no diferían entre las dos líneas celulares en ningún punto de tiempo (Véase la Tabla 12). El siguiente ejemplo describe experimentos que se realizaron para determinar si los ratones inmunizados con las construcciones NS3/4A habían desarrollado una respuesta de células T contra NS3.
TABLA 12
14
Ejemplo 10
[Sólo con fines informativos; no ilustrativo de la presente invención]
Para examinar si se induce una respuesta de células T por la inmunización con NS3/4A, se ensayó la capacidad de un sistema de defensa inmune de ratón inmunizado para atacar la línea celular de tumor que expresa NS3. El protocolo para ensayar la inhibición in vivo del crecimiento tumoral de la línea celular de mieloma SP2/0 en ratones Balb/c se ha descrito con detalle previamente (Encke y col., J. Immunol. 161:4917 (1998)). La inhibición del crecimiento tumoral en este modelo depende del cebado de los linfocitos T citotóxicos (CTL). En resumen, se inmunizaron grupos de diez ratones i.m. cinco veces con intervalos de un mes con 100 \mug de NS3-pVAX o 100 \mug de NS3/4A-pVAX. Dos semanas después de la última inmunización, se inyectaron 2 x 10^{6} células SP2/0 o NS3/4A-SP2/0 en el costado derecho de cada ratón. Dos semanas después, los ratones se sacrificaron y se midieron los tamaños máximos de los tumores. No hubo diferencia entre los tamaños medios de los tumores SP2/0 y NS3/4A-SP2/0 en los ratones inmunizados con NS3-pVAX (véase la Tabla 13).
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TABLA 13
15
Ensayo t no pareado para el diámetro máximo
Variable de agrupamiento: columna 1
Diferencia hipotetizada = 0
Exclusión de filas: NS3DNA-Tumor-001213
16
Info de grupo para el diámetro máximo
Variable de agrupamiento: columna 1
Exclusión de filas: NS3DNA-Tumor-001213
17
En la siguiente serie de experimentos, se evaluó la inhibición del crecimiento tumoral de SP2/0 o NS3/4A-SP2/0 en ratones Balb/c inmunizados con NS3/4A-pVAX. En ratones inmunizados con el plásmido NS3/4A-pVAX, el crecimiento del tumor NS3/4A-SP2/0 se inhibió significativamente en comparación con el crecimiento de las células SP2/0 no transfectadas (Véase la Tabla 14). De esta manera, la inmunización con NS3/4A-pVAX induce CTL que inhiben el crecimiento de células que expresan NS3/4A in vivo. El siguiente ejemplo describe experimentos que se realizaron para analizar la eficacia de diversas composiciones que contenían NS3 en la inducción de una respuesta mediada por células a NS3.
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TABLA 14
18
Ensayo t no pareado para el diámetro máximo
Variable de agrupamiento: columna 1
Diferencia hipotetizada = 0
Exclusión de filas: NS3DNA-Tumor-001213
19
Info de grupo para el diámetro máximo
Variable de agrupamiento: columna 1
Exclusión de filas: NS3DNA-Tumor-001213
20 
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Ejemplo 11
[Sólo con fines informativos; no ilustrativo de la presente invención]
Para analizar si la administración de diferentes composiciones que contenían NS3 afectaba a la inducción de una respuesta inmune mediada por células, los ratones se inmunizaron con PBS, rNS3, ADN irrelevante o la construcción NS3/4A, y se determinaron los tamaños de los tumores como se ha descrito anteriormente. Sólo la construcción NS3/4A pudo inducir una respuesta de células T suficiente para producir una reducción estadísticamente significativa en el tamaño del tumor (véase la Tabla 15). El siguiente ejemplo describe experimentos que se realizaron para determinar si la reducción en el tamaño tumoral puede atribuirse a la generación de linfocitos T específicos de NS3.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 15
21
22
23
Ensayo t no pareado para el tamaño del tumor más grande
Variable de agrupamiento: grupo
Diferencia hipotetizada = 0
24
Ejemplo 12
[Sólo con fines informativos; no ilustrativo de la presente invención]
Para determinar si se indujeron células T específicas de NS3 por las inmunizaciones con NS3/4A, se empleó un ensayo de lisis de células tumorales mediada por células T in vitro. El ensayo se ha descrito con detalle previamente (Townsend y col., J. Virol. 71:3365 (1997)). En resumen, se inmunizaron grupos de cinco ratones Balb/c tres veces con 100 \mug NS3/4A-pVAX i.m. Dos semanas después de la última inyección, los ratones se sacrificaron y se recogieron los esplenocitos. Se establecieron cultivos de reestimulación con 3 x 10^{6} esplenocitos y 3 x 10^{6} células NS3/4A-SP2/0. Después de cinco días, se realizó un ensayo de liberación de Cr^{51} convencional usando células NS3/4A-SP2/0 o SP2/0 como dianas. El porcentaje de lisis específica se calculó como la relación entre la lisis de células NS3/4A-SP2/0 y la lisis de células SP2/0. Sólo los ratones inmunizados con NS3/4A-pVAX presentaron una lisis específica mayor del 10% en cuatro de cinco ratones ensayados, usando una relación entre efector y diana de 20:1 (véanse las Figuras 5A y B). Por consiguiente, los ratones inmunizados con NS3/4A presentaron una reducción en la proliferación de células cancerosas y/o NS3/4A produjo la lisis de las células cancerosas. La siguiente sección describe con más detalle varios de los polipéptidos de HCV incorporados en las presentes realizaciones.
Péptidos de HCV
Los ácidos nucleicos que codifican los péptidos de HCV descritos en la sección previa pueden manipularse usando técnicas convencionales en biología molecular para crear construcciones recombinantes que expresan los péptidos de HCV. Los péptidos de HCV incorporados en las presentes realizaciones o sus derivados incluyen, pero sin limitación, los que contienen como secuencia de aminoácidos primaria toda la secuencia de aminoácidos sustancialmente representada en la lista de secuencias (ID. SEC. Nº: 17, 29-32 y 43-49) y fragmentos de la misma de al menos cuatro aminoácidos de longitud (por ejemplo, ID. SEC. Nº: 25-27 y 33-42) incluyendo secuencias alteradas en las que restos aminoacídicos funcionalmente equivalentes sustituyen a restos dentro de la secuencia dando como resultado un cambio silencioso. Son fragmentos preferidos de una secuencia de la ID. SEC. Nº: 17, 29-32 y 43-49, fragmentos de al menos cuatro aminoácidos y comprenden una secuencia de aminoácidos única para el péptido NS3/4A descubierto (ID. SEC. Nº: 17), incluyendo secuencias alteradas en las que restos aminoacídicos funcionalmente equivalentes sustituyen a restos dentro de la secuencia dando como resultado un cambio silencioso. Los péptidos de HCV pueden tener una longitud, por ejemplo, de al menos 12-15, 15-20, 20-25, 25-50, 50-100, 100-150, 150-250, 250-500 o 500-704 aminoácidos. También son aspectos de la invención otros fragmentos (por ejemplo, ID. SEC. Nº: 25-27,
y 33-42).
Las realizaciones de la invención también incluyen péptidos de HCV que son sustancialmente idénticos a los descritos anteriormente. Es decir, péptidos de HCV que tienen uno o más restos aminoacídicos dentro de la ID. SEC. Nº: 17 y fragmentos de los mismos que se sustituyen por otro aminoácido de una polaridad similar que actúa como un equivalente funcional, dando como resultado una alteración silenciosa. Los sustitutos de un aminoácido dentro de la secuencia pueden seleccionarse entre otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos polares neutros incluyen glicina, serina treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Los aminoácidos aromáticos incluyen fenilalanina, triptófano y tirosina.
Los péptidos de HCV descritos en este documento pueden preparase por procedimientos de síntesis química (tales como síntesis de péptidos en fase sólida) usando técnicas conocidas en esta materia tales como las indicadas por Merrifield y col., J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1964), Houghten y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 82:51:32 (1985), Stewart y Young (Solid phase peptide synthesis, Pierce Chem Co., Rockford, IL (1984), y Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman & Co., N.Y. Estos polipéptidos pueden sintetizarse con o sin una metionina en el extremo amino. Los péptidos de HCV sintetizados químicamente pueden oxidarse usando procedimientos indicados en estas referencias para formar enlaces disulfuro.
Aunque los péptidos de HCV descritos en este documento pueden sintetizarse químicamente, puede ser más eficaz producir estos polipéptidos por tecnología de ADN recombinante. Estos procedimientos pueden usarse para construir vectores de expresión que contienen las secuencias de nucleótidos de HCV descritas anteriormente, por ejemplo, y señales de control de la transcripción y la traducción apropiadas. Estos procedimientos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Como alternativa, el ARN capaz de codificar secuencias de nucleótidos de HCV puede sintetizarse químicamente usando, por ejemplo, sintetizadores. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Oligonucleotide Synthesis, 1984, Gait, M. J. ed., IRL Press, Oxford. Por consiguiente, varias realizaciones se refieren a líneas celulares que se han modificado por ingeniería genética para expresar los péptidos de HCV incorporados en las realizaciones. Por ejemplo, algunas células se obtienen para expresar los péptidos de HCV de las ID. SEC. Nº: 17, 29-32 y 43-49) o fragmentos de estas moléculas.
Para expresar los péptidos de HCV incorporados en las realizaciones, pueden utilizarse varios sistemas de hospedador-vector de expresión. Los sistemas de expresión adecuados incluyen, pero sin limitación, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli o B. subtilis) transformados con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN plasmídico o ADN cosmídico, que contienen secuencias de nucleótidos de HCV; levaduras (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas con vectores de expresión de levaduras recombinantes que contienen las secuencias de nucleótidos de HCV; sistemas de células de insecto infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen las secuencias de HCV; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, el virus del mosaico de la coliflor, CaMV; el virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión plasmídicos recombinantes (por ejemplo, el plásmido Ti) que contienen secuencias de HCV; o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que llevan construcciones de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, el promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; o el promotor 7.5K de virus vaccinia).
En los sistemas bacterianos, pueden seleccionarse ventajosamente varios vectores de expresión dependiendo del uso deseado del producto génico de HCV que se va a expresar. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de dicha proteína para la generación de composiciones farmacéuticas de péptidos de HCV o para producir anticuerpos contra el péptido de HCV, por ejemplo, pueden ser deseables vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteínas de fusión que se purifican fácilmente. Estos vectores incluyen, pero sin limitación, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther y col., EMBO J., 2: 1791 (1983), en el que la secuencia codificante de HCV puede unirse individualmente al vector en fase con la región codificante de lacZ de forma que se produzca una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res., 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem., 264:5503-5509 (1989)); y similares. También pueden usarse vectores pVEX para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST). En general, estas proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse a partir de células lisadas por adsorción en perlas de glutatión-agarosa seguido de elución en presencia de glutatión libre. Los vectores PGEX se diseñan para incluir sitios de escisión de la proteasa de trombina o del factor Xa de forma que el producto génico diana clonado pueda liberarse del resto GST.
En un sistema de insectos, se usa el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes extraños. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia codificante de HCV puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de la polihedrina) del virus y ponerse bajo el control de un promotor de virus AcNPV (por ejemplo, el promotor de la polihedrina). La inserción satisfactoria de una secuencia codificante del gen de HCV dará como resultado la inactivación del gen de la polihedrina y la producción de virus recombinantes no ocluidos (es decir, el virus que carece de la cubierta proteica codificada por el gen de la polihedrina). Estos virus recombinantes después se usan para infectar células de Spodoptera frugiperda en las que se expresa el gen insertado. (Véase, por ejemplo, Smith y col., J. Virol. 46: 584 (1983); y Smith, Patente de Estados Unidos Nº 4.215.051).
En células hospedadoras de mamífero, pueden utilizarse varios sistemas de expresión basados en virus. En casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresión, la secuencia de nucleótidos de HCV de interés puede unirse a un complejo de control de la transcripción/traducción de adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico después puede insertarse en el genoma de adenovirus por recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, región E1 o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar el producto del gen de HCV en hospedadores infectados. (Véase, por ejemplo, Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad Sci. USA 81:3655-3659 (1984)). También pueden requerirse señales de iniciación específicas para la traducción eficaz de secuencias de nucleótidos de HCV insertadas. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes.
Sin embargo, en casos en los que sólo se inserta una parte de la secuencia codificante de HCV, pueden proporcionarse señales de control de la traducción exógenas, incluyendo, quizás, el codón de iniciación ATG. Además, el codón de iniciación puede estar en fase con la fase de lectura de la secuencia codificante deseada para asegurar la traducción del inserto entero. Estas señales de control de la traducción exógenas y codones de iniciación pueden ser de una diversidad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de expresión puede mejorarse por medio de la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción apropiados, terminadores de la transcripción, etc. (Véase Bittner y col., Methods in Enzymol., 153:516-544 (1987)).
Además, puede elegirse una cepa de células hospedadoras que module la expresión de las secuencias insertadas o modifique y procese el producto génico de la forma específica deseada. Estas modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de productos proteicos son importantes para la función de la proteína. Las diferentes células hospedadoras tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento postraduccional y la modificación de proteínas y productos génicos. Pueden elegirse líneas celulares o sistemas hospedadores apropiados para asegurar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína extraña expresada. Para este fin, pueden usarse células hospedadoras eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcrito primario, glicosilación y fosforilación del producto génico. Estas células hospedadoras de mamífero incluyen, pero sin limitación, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3 y
WI38.
Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, pueden obtenerse por ingeniería genética líneas celulares que expresan de forma estable los péptidos de HCV descritos anteriormente. En lugar de usar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación virales, las células hospedadoras pueden transformarse con ADN controlado por elementos de control de la expresión apropiados (por ejemplo, promotores, secuencias potenciadotas, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador selectivo. Después de la introducción del ADN extraño, las células modificadas por ingeniería genética se dejan crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido; y después se cambian a un medio selectivo. El marcador selectivo en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de forma estable el plásmido en su cromosoma y se desarrollen para formar focos que a su vez se clonan y expanden en líneas celulares. Este procedimiento se usa ventajosamente para obtener por ingeniería genética líneas celulares que expresan el producto génico de HCV.
Pueden usarse varios sistemas de selección incluyendo, pero sin limitación, los genes de la timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler, y col., Cell 11:223 (1977), la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026 (1962), y la adenina fosforribosiltransferasa (Lowy, y col., Cell 22:817 (1980)) en células tk^{-}, hgprt^{-} o aprt^{-}, respectivamente. Además, puede usarse resistencia a antimetabolitos como base de la selección para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler, y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA 77:3567 (1980); O'Hare, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981); neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin, y col., J. Mol. Biol. 150:1 (1981); y hygro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre, y col., Gene 30:147 (1984)).
Como alternativa, puede purificarse fácilmente cualquier proteína de fusión utilizando un anticuerpo específico para la proteína de fusión que se expresa. Por ejemplo, un sistema descrito por Janknecht y col. permite la fácil purificación de proteínas de fusión no desnaturalizadas expresadas en líneas celulares humanas. (Janknecht, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972-8976 (1991)). En este sistema, el gen de interés se subclona en un plásmido de recombinación de vaccinia de tal forma que la fase de lectura abierta del gen se fusione traduccionalmente con una señal amino-terminal compuesta por seis restos de histidina. Se cargan extractos de células infectadas con el virus vaccinia recombinante en columnas de Ni^{2+}-ácido nitriloacético-agarosa y se eluyen selectivamente proteínas con señal de histidina con tampones que contienen imidazol. El siguiente ejemplo describe un procedimiento que se usó para expresar los péptidos de HCV codificados por los ácidos nucleicos incorporados en las presentes realizaciones.
Ejemplo 13
[Sólo con fines informativos, y no ilustrativo de la presente invención]
Para caracterizar la proteína de fusión NS3/4A y las versiones truncadas y mutadas de la misma, las construcciones del vector, descritas en el Ejemplo 6, se transcribieron y tradujeron in vitro y los polipéptidos resultantes se visualizaron por electroforesis en gel de dodecil sulfato sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE). La transcripción y la traducción in vitro se realizaron usando el sistema de lisado de reticulocitos acoplado a T7 (Promega, Madison, WI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todas las reacciones de traducción in vitro de las construcciones de expresión se realizaron a 30ºC con metionina marcada con ^{35}S (Amersham International, Plc, Buckinghamshire, UK). Las proteínas marcadas se separaron en geles de SDS-PAGE al 12% y se visualizaron para exponer la película de rayos X (Hyper Film-MP, Amersham) durante 6-18 horas.
El análisis in vitro reveló que todas las proteínas se expresaban en altas cantidades a partir de sus construcciones de expresión respectivas. La construcción rNS3 (vector NS3-pVAX) produjo un solo péptido de aproximadamente 61 kDa, mientras que la construcción TPT (NS3/4A-TPT-pVAX) y la construcción RGT (NS3/4A-RGT-pVAX) produjeron un solo polipéptido de aproximadamente 67 kDa, que es idéntico al peso molecular del péptido NS3/4A no escindido producido a partir de la construcción NS3/4A-pVAX. El producto escindido producido a partir del péptido NS3/4A expresado tenía aproximadamente 61 kDa, que era idéntico en tamaño al rNS3 producido a partir del vector NS3-pVAX. Estos resultados demostraron que las construcciones de expresión eran funcionales, la construcción NS3/4A era enzimáticamente activa, el rNS3 produjo un péptido del tamaño previsto y las mutaciones TPT y RGT anularon completamente la escisión en la unión NS3-NS4A.
Las secuencias, construcciones, vectores, clones y otros materiales que comprenden los ácidos nucleicos de HCV y péptidos incorporados en las presentes realizaciones pueden estar en forma enriquecida o aislada. Como se usa en este documento, "enriquecida" significa que la concentración del material es al menos aproximadamente 2, 5, 10, 100 ó 1000 veces su concentración natural (por ejemplo), ventajosamente del 0,01% en peso, preferiblemente de al menos aproximadamente el 0,1% en peso. También se contemplan preparaciones enriquecidas de aproximadamente el 0,5%, 1%, 5%, 10% y 20% en peso. El término "aislado" requiere que el material se retire de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si se produce de forma natural). Por ejemplo, un polinucleótido natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido separado de alguno o todos los materiales coexistentes en el sistema natural está aislado. También es ventajoso que las secuencias estén en forma purificada. El término "purificado" no requiere la pureza absoluta; sino que pretende ser una definición relativa. Las proteínas aisladas se han purificado convencionalmente hasta la homogeneidad electroforética por tinción con Coomassie, por ejemplo. Se contempla expresamente la purificación del material de partida o el material natural en al menos un orden de magnitud, preferiblemente dos o tres órdenes y más preferiblemente cuatro o cinto órdenes de magnitud.
El producto del gen de HCV descrito en este documento también puede expresarse en plantas, insectos y animales para crear un organismo transgénico. Los sistemas vegetales transgénicos deseables que tienen un péptido de HCV incluyen Arabidopsis, maíz y Chlamydomonas. Los sistemas de insecto deseables que tienen un péptido de HCV incluyen, pero sin limitación, D. melanogaster y C. elegans. Pueden usarse animales de cualquier especie incluyendo, pero sin limitación, anfibios, reptiles, aves, ratones, hámsteres, ratas, conejos, cobayas, cerdos, cerdos enanos, cabras, perros, gatos y primates no humanos, por ejemplo, babuinos, monos y chimpancés, para generar animales transgénicos que tengan una molécula de HCV incorporada en las presentes realizaciones. Estos organismos transgénicos deseablemente presentan transferencia de línea germinal de los péptidos de HCV descritos en este documento.
Preferiblemente se usa cualquier técnica conocida en esta materia para introducir el transgen de HCV en animales para producir las líneas fundadoras de animales transgénicos o para inactivar o reemplazar genes de HCV existentes. Estas técnicas incluyen, pero sin limitación, la microinyección pronuclear (Hoppe, P. C. y Wagner, T. E., 1989, Patente de Estados Unidos Nº 4.873.191); la transferencia de genes mediados por retrovirus en líneas germinales (Van der Putten y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:6148-6152 (1985); la dirección de genes en células madre embrionarias (Thompson y col., Cell 56:313-321 (1989); electroporación de embriones (Lo, Mol Cell. Biol. 3: 1803-1814 (1983); y transferencia de genes mediada por esperma (Lavitrano y col., Cell 57:717-723 (1989); véase también Gordon, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115:171-229 (1989). La siguiente sección describe la fabricación de anticuerpos que interaccionan con los péptidos de HCV descritos en este documento.
Anticuerpos Anti-HCV
Después de la síntesis, expresión y aislamiento o purificación de los péptidos de HCV, el péptido aislado o purificado puede usarse para generar anticuerpos. Dependiendo del contexto, el término "anticuerpos" puede incluir anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos, monocatenarios, fragmentos Fab y fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab. Los anticuerpos que reconocen los péptidos de HCV tienen muchos usos incluyendo, pero sin limitación, aplicaciones biotecnológicas, aplicaciones terapéuticas/profilácticas y aplicaciones de diagnóstico.
Para la producción de anticuerpos pueden inmunizarse varios hospedadores no humanos, incluyendo cabras, conejos, ratas y ratones, por inyección con un péptido de HCV. Dependiendo de la especie de hospedador, pueden usarse diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica. Estos adyuvantes incluyen, pero sin limitación, ribavirina, adyuvante de Freund, geles minerales tales como hidróxido de aluminio y sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles pluronic, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa californiana y dinitrofenol. También son adyuvantes potencialmente útiles BCG (Bacillus Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.
Los péptidos usados para inducir anticuerpos específicos pueden tener una secuencia de aminoácidos consistente en al menos cuatro aminoácidos, y preferiblemente de al menos 10 a 15 aminoácidos. Por medio de una estrategia, se fusionan tramos cortos de aminoácidos que codifican fragmentos de NS3/4A con los de otra proteína tal como la hemocianina de lapa californiana de tal forma que se produzca un anticuerpo contra la molécula quimérica. Además, a un animal se le administra una composición que comprende ribavirina y NS3/4A (ID. SEC. Nº: 17), un fragmento de la misma de al menos 4, 6, 8, 10, 12, 15 ó 20 aminoácidos de longitud o un ácido nucleico que codifica una o más de estas moléculas. Aunque pueden generarse anticuerpos capaces de reconocer específicamente HCV por inyección de péptidos sintéticos de 3, 10 y 15 unidades que corresponden a un péptido de HCV en ratones, puede generase una serie más diversa de anticuerpos usando péptidos de HCV recombinantes preparados como se ha descrito anteriormente.
Para generar anticuerpos contra un péptido de HCV, se aísla el péptido sustancialmente puro a partir de una célula transfectada o transformada. La concentración del péptido en la preparación final se ajusta, por ejemplo, por concentración en un dispositivo de filtro Amicon, al nivel de unos pocos microorganismos/mililitro. Después pueden preparase anticuerpos monoclonales o policlonales contra el péptido de interés como se indica a continuación:
Pueden prepararse anticuerpos monoclonales contra un péptido de HCV usando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo. Estas incluyen, pero sin limitación, la técnica de hibridoma descrita originalmente por Koehler y Milstein (Nature 256:495-497 (1975), la técnica de hibridoma de células B humanas (Kosbor y col. Immunol Today 4:72 (1983); Cote et al Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030 (1983)), y la técnica de hibridoma de EBV (Cole y col. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc, New York N.Y., pág. 77-96 (1985)). Además, pueden usarse técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos", el corte y empalme de genes de anticuerpo de ratón con genes de anticuerpo humano para obtener una molécula con la especificidad antigénica y la actividad biológica apropiada. (Morrison y col. Proc Natl Acad Sci 81:6851-6855 (1984); Neuberger y col. Nature 312:604-608(1984); Takeda y col. Nature 314:452-454 (1985)). Como alternativa, pueden adaptarse técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (Patente de Estados Unidos Nº 4.946.778) para producir anticuerpos monocatenarios específicos de HCV. También pueden producirse anticuerpos por inducción de la producción in vivo de la población de linfocitos o por selección de bibliotecas de inmunoglobulinas recombinantes o paneles de reactivos de unión de alta especificidad como es describe en Orlandi y col., Proc Natl Acad Sci 86: 3833-3837 (1989), y Winter G. y Milstein C; Nature 349:293-299 (1991).
También pueden generarse fragmentos de anticuerpo que contienen sitios de unión específica para un péptido de HCV. Por ejemplo, estos fragmentos incluyen, pero sin limitación, los fragmentos F(ab')_{2} que pueden producirse por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab que pueden generarse reduciendo los enlaces disulfuro de los fragmentos F(ab')_{2}. Como alternativa, pueden construirse bibliotecas de expresión de Fab para permitir una identificación rápida y fácil de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada. (Huse W. D. y col. Science 256:1275-1281 (1989)).
Por medio de una estrategia, se preparan anticuerpos monoclonales contra un péptido de HCV como se indica a continuación. En resumen, en un ratón se inoculan repetidamente unos pocos microgramos de la proteína seleccionada o péptidos derivados de la misma durante un periodo de unas pocas semanas. Después se sacrifica el ratón y se aíslan las células productoras de anticuerpos del bazo. Las células del bazo se fusionan en presencia de polietilenglicol con células de mieloma de ratón, y las células no fusionadas sobrantes se destruyen por medio del desarrollo del sistema en un medio selectivo que comprende aminopterina (medio HAT). Las células fusionadas satisfactoriamente se diluyen y se ponen alícuotas de la dilución en pocillos de una placa de microtitulación en la que se continúa el desarrollo del cultivo. Se identifican clones productores de anticuerpo por detección de anticuerpos en el líquido sobrenadante de los pocillos por procedimientos de inmunoensayo tales como ELISA, como describió originalmente Engvall, E., Meth. Enzymol. 70:419 (1980), y procedimientos derivados de los mismos. Los clones positivos seleccionados pueden expandirse y su producto de anticuerpo monoclonal puede recogerse para el uso. En Davis, L. y col. Basic Methods in Molecular Biology Elsevier, Nueva York, Sección 21-2 se describen procedimientos detallados para la producción de anticuerpos monoclonales.
Pueden prepararse antisueros policlonales que contienen anticuerpos contra epítopos heterogéneos de una sola proteína por inmunización de animales adecuados con la proteína expresada o péptidos derivados de la misma como se ha descrito anteriormente, que pueden estar sin modificar o modificados para aumentar la inmunogenicidad. La producción eficaz de anticuerpos policlonales se ve afectada por muchos factores relacionados tanto con el antígeno como con la especie hospedadora. Por ejemplo, las moléculas pequeñas tienden a ser menos inmunogénicas que otras y pueden requerir el uso de vehículos y adyuvantes. Además, los animales hospedadores varían en respuesta al sitio de las inoculaciones y la dosis, dando las dosis inadecuadas o excesivas de antígeno un antisuero de bajo título. Lo más fiable parece ser administrar pequeñas dosis (del nivel de ng) de antígeno en múltiples sitios intradérmicos. Puede encontrarse un protocolo de inmunización eficaz para conejos en Vaitukaitis, J. y col. J. Clin. Endocrinol. Metab. 33:988-991 (1971).
Se administran inyecciones de refuerzo a intervalos regulares y se recoge el antisuero cuando empieza a reducirse su título de anticuerpo, determinado semicuantitativamente, por ejemplo, por inmunodifusión doble en agar contra concentraciones conocidas del antígeno. Véase, por ejemplo, Ouchterlony, O. y col., Capítulo 19 en: Handbook of Experimental Immunology D. Wier (ed) Blackwell (1973). La concentración estacionaria de anticuerpo normalmente está en el intervalo de 0,1 a 0,2 mg/ml de suero (aproximadamente 12 \muM). La afinidad del antisuero por el antígeno se determina preparando curvas de unión competitiva, como se describe, por ejemplo, por Fisher, D., Capítulo 42 en: Manual of Clinical Immunology, 2ª Ed. (Rose y Friedman, Eds.) Amer. Soc. For Microbiol., Washington, D.C. (1980)). Las preparaciones de anticuerpo preparadas de acuerdo con cualquier protocolo son útiles en inmunoensayos cuantitativos que determinan las concentraciones de sustancias que llevan antígeno en muestras biológicas; también se usan semicuantitativa o cualitativamente (por ejemplo, en realizaciones de diagnóstico que identifican la presencia de HCV en muestras biológicas). La sección proporcionada a continuación describe con más detalle algunas de las realizaciones de diagnóstico.
Realizaciones de diagnóstico
En general, los diagnósticos incorporados en las realizaciones de la presente invención se clasifican de acuerdo con si se usa un ensayo basado en ácido nucleico o en proteínas. Algunos ensayos de diagnóstico detectan la presencia o ausencia de una secuencia de ácido nucleico de HCV incorporada en las realizaciones de la presente invención en una muestra obtenida a partir de un paciente, mientras que otros ensayos pretenden identificar si un péptido de HCV incorporado en las realizaciones de la presente invención está presente en una muestra biológica obtenida a partir de un paciente. Además, también se incorpora en las realizaciones de la presente invención la fabricación de kits que incorporan los reactivos y procedimientos descritos en este documento que permiten la rápida detección e identificación de HCV. Estos kits de diagnóstico pueden incluir, por ejemplo, una sonda de ácido nucleico o anticuerpo incorporado, que detecta específicamente HCV. El componente de detección de estos kits típicamente se suministrará en combinación con uno o más de los siguientes reactivos. A menudo se proporcionará un soporte capaz de absorber o unirse de otra manera al ADN, al ARN o las proteínas. Los soportes disponibles incluyen membranas de nitrocelulosa, nylon, o nylon modificado que puede caracterizarse por llevar una serie de sustituyentes cargados positivamente. En estos kits pueden suministrarse una o más enzimas de restricción, reactivos de control, tampones, enzimas de amplificación y polinucleótidos no humanos tales como ADN de timo de ternero o ADN de esperma de salmón.
Los diagnósticos basados en ácidos nucleicos útiles incluyen, pero sin limitación, secuenciación directa de ADN, análisis de transferencia de Southern, análisis dot blot, amplificación de ácidos nucleicos y combinaciones de estas estrategias. El punto de partida para estos análisis es un ácido nucleico aislado o purificado a partir de una muestra biológica obtenida de un paciente que se sospecha que ha contraído HCV o un paciente con riesgo de contraer HCV. El ácido nucleico se extrae de la muestra y puede amplificarse por RT-PCR y/o amplificación de ADN usando cebadores que corresponden a regiones que flanquean las secuencias de ácido nucleico de HCV incorporadas en las realizaciones de la presente invención (por ejemplo, NS3/4A (ID. SEC. Nº: 16)).
En algunas realizaciones, se unen sondas de ácido nucleico que hibridan específicamente con secuencias de HCV a un soporte en una serie ordenada, donde las sondas de ácido nucleico se unen a regiones distintas del soporte que no solapan entre si. Preferiblemente, esta serie ordenada se denomina "dirigible" cuando se registran las distintas localizaciones de la sonda y puede accederse a ellas como parte de un procedimiento de ensayo. Estas sondas se unen a un soporte en diferentes localizaciones conocidas. El conocimiento de la localización precisa de cada sonda de ácido nucleico hace que estas series "dirigibles" sean particularmente útiles en ensayos de unión. Los ácidos nucleicos procedentes de una preparación de varias muestras biológicas después se marcan por estrategias convencionales (por ejemplo, radiactividad o fluorescencia) y las muestras marcadas se aplican a la serie en condiciones que permiten la hibridación.
Si un ácido nucleico presente en las muestras híbrida con una sonda de la serie, entonces se detectará una señal en una posición del soporte que corresponda a la localización del híbrido. Como se conoce la identidad de cada muestra marcada y la región del soporte en el que se aplicó la muestra marcada, puede realizarse rápidamente una identificación de la presencia de la variante polimórfica. Estas estrategias se automatizan fácilmente usando la tecnología conocida para los expertos en la materia de análisis de detección o diagnóstico de alto rendimiento.
Además, puede emplearse una estrategia opuesta a la presentada anteriormente. Los ácidos nucleicos presentes en las muestras biológicas pueden disponerse en un soporte para crear una serie dirigible. Preferiblemente, las muestras se disponen en el soporte en posiciones conocidas que no solapan. La presencia de ácidos nucleicos de HCV en cada muestra se determina aplicando sondas de ácido nucleico marcadas que complementan ácidos nucleicos que codifican péptidos de HCV, en localizaciones de la serie que corresponden a las posiciones en las que se dispusieron las muestras biológicas. Como se conoce la identidad de la muestra biológica y su posición en la serie, puede realizarse rápidamente la identificación de un paciente que se ha infectado con HCV. Estas estrategias también se automatizan fácilmente usando la tecnología conocida para los expertos en la materia de análisis de diagnóstico de alto rendimiento.
Puede emplearse cualquier tecnología de series dirigibles conocida en la técnica. Una realización particular de la series polinucleotídicas se conoce como Genechips^{TM}, y se ha descrito, en general, en la Patente de Estados Unidos 5.143854; y en las Publicaciones PCT WO 90/15070 y 92/10092. Estas series generalmente se producen usando procedimientos de síntesis mecánicos o procedimientos de síntesis dirigida por luz, que incorporan una combinación de procedimientos fotolitográficos y síntesis de oligonucleótidos en fase sólida. (Fodor y col., Science, 251:767-777, (1991)). La inmovilización de series de oligonucleótidos en soportes sólidos se ha hecho posible por medio del desarrollo de una tecnología identificada en general como "Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis" (VLSPIS^{TM}) (Síntesis en Polímeros Inmovilizados a Escala muy Grande) en la que, típicamente, se inmovilizan sondas en una serie de alta densidad en una superficie sólida de un chip. En las Patentes de Estados Unidos 5.143.854 y 5.412.087, y en las Publicaciones PCT WO 90/15070, WO 92/10092 y WO 95/11995, se proporcionan ejemplos de tecnologías VLSPIS^{TM} que describen procedimientos para formar series de oligonucleótidos por medio de técnicas tales como técnicas de síntesis dirigidas por luz. Para diseñar estrategias destinadas a proporcionar series de nucleótidos inmovilizados en soporte sólidos, se desarrollaron otras estrategias de presentación para ordenar y presentar las series de oligonucleótidos en los chips con la intención de maximizar los patrones de hibridación y la información de diagnóstico. Se describen ejemplos de estas estrategias de presentación en las Publicaciones PCT WO 94/12305, WO 94/11530, WO 97/29212 y WO 97/31256.
Los expertos en la materia conocen una amplia diversidad de marcadores y técnicas de conjugación y éstos pueden usarse en diversos ensayos de ácidos nucleicos. Hay varias formas de producir ácidos nucleicos marcados para la hibridación o PCR incluyendo, pero sin limitación, oligomarcaje, desplazamiento de mella, marcaje terminal o amplificación por PCR usando un nucleótido marcado. Como alternativa, un ácido nucleico que codifica un péptido de HCV puede clonarse en un vector para la producción de una sonda de ARNm. Estos vectores se conocen en la técnica, están disponibles en el mercado y pueden usarse para sintetizar sondas de ARN in vitro por medio de la adición de una ARN polimerasa apropiada tal como T7, T3 o SP6 y nucleótidos marcados. Varias compañías tales como Pharmacia Biotech (Piscataway N.J.), Promega (Madison Wis.), y U.S. Biochemical Corp (Clevely Ohio) suministran kits comerciales y protocolos para usar estos procedimientos. Las moléculas indicadoras o marcadores adecuados incluyen los radionúclidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicos, así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares.
La presencia de un péptido de HCV en una muestra proteica obtenida a partir de un paciente también puede detectarse usando ensayos convencionales y las realizaciones descritas en este documento. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos que son inmunorreactivos con los péptidos de HCV descritos para seleccionar muestras biológicas con respecto a la presencia de una infección por HCV. En realizaciones preferidas, se usan anticuerpos que son reactivos con los péptidos de HCV incorporados en las realizaciones de la presente invención para inmunoprecipitar los péptidos de HCV descritos a partir de muestras biológicas, o se usan para reaccionar con proteínas obtenidas a partir de una muestra biológica en transferencias de Western o inmunotransferencias. Las realizaciones de diagnóstico preferidas también incluyen ensayos de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), radioinmunoensayos (RIA), ensayos inmunorradiométricos (IRMA) y ensayos inmunoenzimáticos (IEMA), incluyendo ensayos de sándwich que usan anticuerpos monoclonales y/o policlonales específicos para los péptidos de HCV descritos. David y col. describen ensayos de sándwich ilustrativos en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.376.110 y 4.486.530. Otras realizaciones emplean aspectos de la tecnología de tiras inmunes descrita en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.290.678; 5.604.105; 5.710.008; 5.744.358; y 5.747.274.
En otro diagnóstico basado en proteínas preferido, los anticuerpos descritos en este documento se unen a un soporte en una serie ordenada, donde una pluralidad de anticuerpos se unen a distintas regiones del soporte que no solapan entre sí. Como ocurre con las series basadas en ácidos nucleicos, las series basadas en proteínas son series ordenadas que están diseñadas para ser "dirigibles" de tal forma que las distintas localizaciones se registren y pueda accederse a ellas como parte de un procedimiento de ensayo. Estas sondas se unen a un soporte en diferentes localizaciones conocidas. El conocimiento de la localización precisa de cada sonda hace que estas series "dirigibles" sea particularmente útil en ensayos de unión. Por ejemplo, una serie dirigible puede comprender un soporte que tiene varias regiones a las que se une una pluralidad de sondas de anticuerpo que reconocen específicamente los péptidos de HCV presentes en una muestra biológica y diferencian el isotipo de HCV identificado aquí.
Por medio de una estrategia, se obtienen proteínas a partir de muestras biológicas y después se marcan por estrategias convencionales (por ejemplo, por radiactividad, colorimetría o fluorescencia). Las muestras marcadas después se aplican a la serie en condiciones que permiten la unión. Si una proteína de la muestra se une a una sonda de anticuerpo de la serie, entonces se detectará una señal en la posición del soporte que corresponde a la localización del complejo anticuerpo-proteína. Como se conoce la identidad de cada muestra marcada y se conoce la región del soporte en la que se aplicó la muestra marcada, puede realizarse rápidamente una identificación de la presencia, concentración y/o nivel de expresión. Es decir, empleando patrones marcados de una concentración conocida de péptido de HCV, un investigador puede determinar de forma precisa la concentración de proteína del péptido particular en una muestra ensayada y también puede evaluar el nivel de expresión del péptido de HCV. También pueden usarse procedimientos convencionales en densitometría para determinar de forma más precisa la concentración o nivel de expresión del péptido de HCV. Estas estrategias se automatizan fácilmente usando la tecnología conocida para los expertos en la materia del análisis de diagnóstico de alto rendimiento.
En otra realización, puede emplearse una estrategia opuesta a la presentada anteriormente. Las proteínas presentes en muestra biológicas pueden disponerse en un soporte para crear una serie dirigible. Preferiblemente, las muestras de proteínas se disponen en el soporte en posiciones conocidas que no solapan. Después se determina la presencia de un péptido de HCV en cada muestra aplicando sondas de anticuerpo marcadas que reconocen epítopos específicos para el péptido de HCV. Como se conoce la identidad de la muestra biológica y su posición en la serie, puede realizarse rápidamente una identificación de la presencia, concentración y/o nivel de expresión de un péptido de HCV.
Es decir, empleando patrones marcados de una concentración conocida de un péptido de HCV, un investigador puede determinar de forma precisa la concentración de péptido en una muestra y, a partir de esta información, puede evaluar el nivel de expresión del péptido. También pueden usarse procedimientos convencionales en densitometría para determinar de forma más precisa la concentración o nivel de expresión del péptido de HCV. Estas estrategias también se automatizan fácilmente usando tecnologías conocidas para los expertos en la materia del análisis de diagnóstico de alto rendimiento. Como se ha detallado anteriormente, puede emplearse cualquier tecnología de series dirigibles conocida en la técnica. La siguiente sección describe algunas de las composiciones que pueden tener uno o más de los ácidos nucleicos de HCV o péptidos de HCV incorporados en las realizaciones de la presente invención.
Composiciones que comprenden los ácidos nucleicos o péptidos de HCV incorporados en las presentes realizaciones
Algunas realizaciones contienen al menos uno de los ácidos nucleicos o péptidos de HCV unidos a un soporte. Preferiblemente, estos soportes se fabrican para crear un agente multimérico. Estos agentes multiméricos proporcionan el péptido o ácido nucleico de HCV de tal manera que se consiga una afinidad suficiente con la molécula. Un agente multimérico que tiene un ácido nucleico o péptido de HCV puede obtenerse uniendo la molécula deseada a un soporte macromolecular. Puede calificarse de "soporte" un vehículo, una proteína, una resina, una membrana celular o cualquier estructura macromolecular usada para unir o inmovilizar estas moléculas. Los soportes sólidos incluyen, pero sin limitación, las paredes de los pocillos de una bandeja de reacción, tubos de ensayo, perlas de poliestireno, perlas magnéticas, tiras de nitrocelulosa, membranas, micropartículas tales como partículas de látex, células animales, Duracyte®, células artificiales y otras. Un ácido nucleico o péptido de HCV también puede unirse a vehículos inorgánicos tales como material de óxido de silicio (por ejemplo, silicagel, zeolita, tierra de diatomeas o vidrio aminado) por ejemplo,
por medio de un enlace covalente a través de un grupo hidroxi, carboxi o amino y un grupo reactivo en el vehículo.
En varios agentes multiméricos, el soporte macromolecular tiene una superficie hidrófoba que interacciona con una parte del ácido nucleico o péptido de HCV por medio de una interacción no covalente hidrófoba. En algunos casos, la superficie hidrófoba del soporte es un polímero tal como un plástico o cualquier otro polímero en el que se han unido grupos hidrófobos tales como poliestireno, polietileno o polivinilo. Además, el ácido nucleico o péptido de HCV puede unirse covalentemente a vehículos que incluyen proteínas y oligo/polisacáridos (por ejemplo, celulosa, almidón, glucógeno, quitosano o sefarosa aminada). En estos últimos agentes multiméricos se usa un grupo reactivo en la molécula, tal como un grupo hidroxi o amino, para la unión a un grupo reactivo en el soporte para crear un enlace covalente. Otros agentes multiméricos adicionales comprenden un soporte que tiene otros grupos reactivos que están químicamente activados para unirse al ácido nucleico o péptido de HCV. Por ejemplo, se usan matrices activadas con bromuro de cianógeno, matrices activadas con epoxi, geles de tio y tiopropilo, enlaces de cloroformiato de nitrofenilo y cloroformiato de N-hidroxi succinimida, o soportes acrílicos de oxirano. (Sigma).
Deseablemente, los vehículos para uso en el cuerpo (por ejemplo, para aplicaciones profilácticas o terapéuticas) son fisiológicos, no tóxicos y preferiblemente no generan respuestas inmunes. Los vehículos adecuados para uso en el cuerpo incluyen poli-L-lisina, poli-D,L-alanina, liposomas y Chromosorb® (Johns-Manville Products, Denver Co.). Se ha ensayado Chromosorb® conjugado con ligando (Synsorb-Pk) en seres humanos para la prevención del síndrome hemolítico-urémico y se ha notificado que no presenta reacciones adversas. (Armstrong y col. J. Infectious Diseases 171:1042-1045 (1995)). Para algunas realizaciones, se administra un vehículo "desnudo" (es decir, que carece de un ácido nucleico o un péptido de HCV unido) que tiene la capacidad de unirse a un ácido nucleico o un péptido de HCV en el cuerpo de un organismo. Por medio de esta estrategia, se prevé una terapia de tipo "pro-fármaco" en la que el vehículo desnudo se administra por separado del ácido nucleico o péptido de HCV y, una vez que los dos están en el cuerpo del organismo, el vehículo y el ácido nucleico o péptido de HCV se ensamblan formando un complejo multimérico.
También se contempla la inserción de enlazadores, tales como enlazadores (por ejemplo "enlazadores \lambda" obtenidos por ingeniería genética para que se parezcan a las regiones flexibles del fago \lambda) de una longitud apropiada entre el ácido nucleico o péptido de HCV y el soporte, para mejorar la flexibilidad del péptido de HCV, híbrido o molécula de unión y de esta manera solucionar cualquier impedimento estérico que pueda presentar el soporte. La determinación de una longitud apropiada de enlazador que permita una respuesta celular óptima o la ausencia de la misma puede realizarse seleccionando el ácido nucleico o péptido de HCV con enlazadores variable en los ensayos detallados en la presente descripción.
También se prevé un soporte compuesto que comprende más de un tipo de ácido nucleico o péptido de HCV. Un "soporte compuesto" puede ser un vehículo, una resina o cualquier estructura macromolecular usada para unir o inmovilizar dos o más ácidos nucleicos o péptidos de HCV diferentes. Como se ha indicado anteriormente, también se contempla la inserción de enlazadores, tales como el enlazador \lambda, de una longitud apropiada entre el ácido nucleico o péptido de HCV y el soporte, para aumentar la flexibilidad en la molécula y de esta manera solucionar cualquier impedimento estérico que se pudiera producir. La determinación de una longitud de enlazador apropiada que permita una respuesta celular óptima o su ausencia puede determinarse seleccionando el ácido nucleico o péptido de HCV con enlazadores variables en los ensayos detallados en la presente descripción.
En otras realizaciones, los soportes multiméricos y compuestos descritos anteriormente pueden tener unidos ácidos nucleicos o péptidos de HCV multimerizados para crear "soportes multiméricos multimerizados" y "soportes compuestos multimerizados", respectivamente. Un ligando multimerizado puede obtenerse, por ejemplo, por medio del acoplamiento de dos o más ácidos nucleicos o péptidos de HCV en tándem usando técnicas convencionales en biología molecular. La forma multimerizada del ácido nucleico o péptido de HCV puede ser ventajosa para muchas aplicaciones debido, por ejemplo, a la capacidad de obtener un agente con mayor afinidad. También puede ser ventajosa para algunas realizaciones la incorporación de enlazadores o espaciadores, tales como enlazadores \lambda flexibles, entre los dominios individuales que constituyen el agente multimerizado. La inserción de enlazadores \lambda de una longitud apropiada entre dominios de unión a proteínas, por ejemplo, puede mejorar la flexibilidad en la molécula y puede solucionar el impedimento estérico. De manera similar, la inserción de enlazadores entre el ácido nucleico o péptido de HCV multimerizado y el soporte puede aumentar la flexibilidad y aumentar el impedimento estérico presentado por el soporte. La determinación de una longitud de enlazador apropiada puede determinarse usando los ácidos nucleicos o péptidos de HCV en los ensayos detallados en esta descripción.
Las realizaciones de la invención también incluyen vacunas genéticas como se ha descrito anteriormente. Estas composiciones contienen ribavirina y un ácido nucleico que codifica NS3/4A (ID. SEC. Nº: 17), NS3 (ID. SEC. Nº: 29), o un mutante (por ejemplo, ID. SEC. Nº: 30-32 y 43-49) o un fragmento del mismo (por ejemplo, ID. SEC. Nº: 25-
27 y 33-42). El siguiente ejemplo describe la preparación de una vacuna genética adecuada para uso en seres humanos.
Ejemplo 14
Se diseña un plásmido de expresión de HCV para expresar el péptido NS3/4A. La secuencia codificante de NS3/4A de NS3/4A-pVAX se retira por digestión con EcoRI y XBaI y el fragmento aislado se inserta en el plásmido A para que esté bajo el control transcripcional del promotor de CMV y el elemento potenciador de RSV. (Véase la Patente de Estados Unidos Nº 6.235.888 de Pachuk, y col.). El esqueleto del plásmido A tiene un longitud de 3969 pares de bases; contiene un origen de replicación de PBR para la replicación en E. coli y un gen de resistencia a kanamicina. En una región polienlazadora se clonan insertos tales como NS3/4A, poniendo el inserto entre y preferiblemente unido al promotor y a la señal de poliadenilación. La transcripción de los insertos clonados está bajo el control del promotor de CMV y los elementos potenciadores de RSV. La señal de poliadenilación se proporciona por la presencia de una señal de poli A de SV40 situada justo en la posición 3' del sitio de clonación. Después se obtiene una composición de vacuna que contiene NS3/4A mezclando 500 \mug de la construcción rNS3/4A con un 1 mg de ribavirina.
Dicha composición de vacuna puede usarse para inducir anticuerpos en un mamífero (por ejemplo, ratones o conejos) o puede inyectarse por vía intramuscular en un ser humano para inducir anticuerpos, preferiblemente un ser humano que está infectado de forma crónica con el virus de HCV. El destinatario preferiblemente también recibe tres refuerzos de inmunización de la mezcla a intervalos de cuatro semanas. Por medio del tercer refuerzo, el título de anticuerpo específico para HCV aumentará significativamente. Además, en este momento, dicho sujeto experimentará una mayor respuesta inmune mediada por anticuerpos y por células T contra NS3, como se demuestra por una mayor fracción de anticuerpos específicos de NS3 detectados por EIA, y una reducción en la carga viral detectada RT-PCR.
Las realizaciones también incluyen proteínas de fusión NS3/4A o ácidos nucleicos que codifican estas moléculas. Por ejemplo, la producción y la purificación de la proteína recombinante puede facilitarse por medio de la adición de aminoácidos auxiliares para formar "una señal". Estas señales incluyen, pero sin limitación, His-6, Flag, Myc y GST. Las señales pueden añadirse al extremo C, al extremo N o dentro de la secuencia de aminoácidos de NS3/4A. Otras realizaciones incluyen proteínas de fusión NS3/4A con truncamientos amino o carboxi terminales, o deleciones internas, o con secuencias polipeptídicas adicionales añadidas a los extremos amino o carboxi terminales, o añadidas internamente. Otras realizaciones incluyen proteínas de fusión NS3/4A, o versiones truncadas o mutadas de las mismas, donde se han sustituido los restos del sitio de escisión proteolítica de NS3/4A. Estas sustituciones incluyen, pero sin limitación, secuencias en las que el sitio P1' es una Ser, Gly o Pro, o la posición P1 es una Arg, o donde la secuencia P8 a P4' es Ser-Ala-Asp-Leu-Glu-Val-Val-Thr-Ser-Thr-Trp-Val (ID. SEC. Nº: 28).
Otras realizaciones se refieren a un inmunógeno que comprende la proteína de fusión NS3/4A, o una versión truncada o modificada de la misma, capaz de inducir una respuesta inmune mejorada contra NS3. El inmunógeno puede proporcionarse en una forma sustancialmente purificada, lo que significa que el inmunógeno se ha liberado sustancialmente de otras proteínas, lípidos, carbohidratos u otros compuestos con los que está asociado naturalmente. Las realizaciones también incluyen composiciones de vacuna que comprenden la proteína de fusión NS3/4A (ID. SEC. Nº: 17) o una versión truncada o mutada de la misma (por ejemplo, ID. SEC. Nº: 29-32 y 43-49) o un fragmento de la misma (por ejemplo, ID. SEC. Nº: 25-27 y 33-42), y un adyuvante, tal como ribavirina. El siguiente ejemplo describe una estrategia para preparar una composición de vacuna que comprende la proteína de fusión NS3/4A y un adyuvante.
Ejemplo 15
Para generar una construcción NS3/4A con señal, la secuencia codificante de NS3/4A de NS3/4A-pVAX se retira por digestión con EcoRI y XbaI, y el fragmento aislado se inserta en un vector Xpress(Invitrogen). El vector Xpress permite la producción de una proteína de fusión recombinante que tiene un péptido líder N-terminal corto que tiene una alta afinidad por cationes divalentes. Usando una resina quelante de níquel (Invitrogen), la proteína recombinante puede purificarse en una etapa y el líder puede retirarse posteriormente por escisión con enteroquinasa. Un vector preferido es el pBlueBacHis2 Xpress. El vector pBlueBacHis2 Xpress es un vector de expresión de Baculovirus que contiene un sitio de clonación múltiple, un gen de resistencia a ampicilina y un gen lac Z. Por consiguiente, el fragmento de amplificación digerido se clona en el vector pBlueBacHis2 Xpress y se infectan células SF9. La proteína de expresión después se aísla o purifica de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después se prepara una composición de vacuna que contiene NS3/4A mezclando 100 \mug del rNS3/4A con 1 mg de ribavirina.
Dicha composición de vacuna puede usarse para inducir anticuerpos en un mamífero (por ejemplo, ratones o conejos) o puede inyectarse por vía intramuscular en un ser humano para inducir anticuerpos, preferiblemente un ser humano que esté infectado de manera crónica con el virus de HCV. El receptor preferiblemente recibe tres refuerzos de inmunización de la mezcla a intervalos de 4 semanas. Por medio del tercer refuerzo, aumentará significativamente el título de anticuerpo específico para HCV. Además, en este momento, dicho sujeto experimentará una mayor respuesta inmune mediada por anticuerpos y por células T contra NS3, como se demuestra por una mayor fracción de anticuerpos específicos de NS3 detectados por EIA, y una reducción en la carga viral como se detecta por RT-PCR. La siguiente sección proporciona más explicación con respecto a los procedimientos de uso de las composiciones descritas en este documento.
Procedimientos para usar composiciones que comprenden ribavirina y un antígeno
Las rutas de la administración de las vacunas descritas en este documento incluyen, pero sin limitación, transdérmica, parenteral, gastrointestinal, transbronquial y transalveolar. La administración transdérmica puede conseguirse por aplicación de una crema, aclarado, gel u otro compuesto que permita que la ribavirina y el antígeno penetren a través de la piel. Las vías de administración parenteral incluyen, pero sin limitación, inyección eléctrica o directa tal como inyección directa en una línea venosa central, inyección intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea. Las vías de administración gastrointestinales incluyen, pero sin limitación, la vía por ingestión y rectal. Las vías de administración transbronquial y transalveolar incluyen, pero sin limitación, inhalación a través de la boca o por vía intranasal.
Las composiciones que tienen ribavirina y un antígeno que son adecuadas para la administración transdérmica incluyen, pero sin limitación, suspensiones, aceites, cremas y pomadas farmacéuticamente aceptables aplicadas directamente en la piel o incorporadas en un vehículo protector tal como un dispositivo transdérmico ("parche transdérmico"). Pueden encontrarse ejemplos de cremas, pomadas, etc. adecuadas, por ejemplo, en el Physician's Desk Reference. Por ejemplo, se describen ejemplos de dispositivos transdérmicos adecuados en la Patente de Estados Unidos Nº 4.818.540, expedida el 4 de abril de 1989 a Chinen, y col.
Las composiciones que tienen ribavirina y un antígeno que son adecuadas para administración parenteral incluyen, pero sin limitación, soluciones isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables. Estas soluciones incluyen, pero sin limitación, solución salina, solución salina tamponada con fosfato y preparaciones oleosas para inyección en una línea venosa central, inyección intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea.
Las composiciones que tienen ribavirina y un antígeno que son adecuadas para administración transbronquial y transalveolar incluyen, pero sin limitación, diversos tipos de aerosoles para inhalación. También son realizaciones dispositivos adecuados para la administración transbronquial y transalveolar de estas composiciones. Estos dispositivos incluyen, pero sin limitación, atomizadores y vaporizadores. Muchas formas de atomizadores y vaporizadores disponibles actualmente pueden adaptarse fácilmente para administrar vacunas que tienen ribavirina y un
antígeno.
Las composiciones que tienen ribavirina y un antígeno que son adecuadas para la administración gastrointestinal incluyen, pero sin limitación, polvos, píldoras o líquidos farmacéuticamente aceptables para ingestión y supositorios para administración rectal.
Las construcciones génicas descritas en este documento, en particular, pueden administrarse por medios que incluyen, pero sin limitación, jeringas tradicionales, dispositivos de inyección sin agujas o "pistolas génicas de bombardeo de microproyectiles". Como alternativa, la vacuna genética puede introducirse por varios medios en células que se extraen del individuo. Estos medios incluyen, por ejemplo, transfección ex vivo, electroporación, microinyección y bombardeo de microproyectiles. Después de que la construcción génica se haya captado por las células, se reimplantan en el individuo. Se contempla que células de otra manera no inmunogénicas que tienen construcciones génicas incorporadas pueden implantarse en el individuo incluso si las células vacunadas se extrajeron originalmente de otro individuo.
De acuerdo con algunas realizaciones, la construcción génica se administra a un individuo usando un dispositivo de inyección sin aguja. De acuerdo con algunas realizaciones, la construcción génica se administra simultáneamente a un individuo por vía intradérmica, subcutánea e intramuscular usando un dispositivo de inyección sin aguja. Los dispositivos de inyección sin aguja son bien conocidos y están ampliamente disponibles. Una persona con experiencia en la materia puede, siguiendo las enseñanzas del presente documento, usar dispositivos de inyección sin agujas para administrar material genético a las células de un individuo. Los dispositivos de inyección sin agujas son adecuados para administrar material genético a todos los tejidos. Son particularmente útiles para administrar material genético a la piel y a células musculares. En algunas realizaciones, puede usarse un dispositivo de inyección sin aguja para empujar un líquido que contiene moléculas de ADN hacia la superficie de la piel del individuo. El líquido se empuja a una velocidad suficiente para que, después del impacto con la piel, el líquido atraviese la superficie de la piel, se infiltre a través de la piel y llegue al tejido muscular por debajo de ésta. De esta manera, el material genético se administra de forma simultánea por vía intradérmica, subcutánea e intramuscular. En algunas realizaciones, puede usarse un dispositivo de inyección sin aguja para administrar un material genético en un tejido de otros órganos para introducir una molécula de ácido nucleico en las células de ese órgano.
Las vacunas que contienen ribavirina y un antígeno pueden usarse para tratar y prevenir un amplio espectro de enfermedades y pueden aumentar la respuesta inmune de un animal a un antígeno. Como apreciará un experto en la materia, se han administrado vacunas convencionales a sujetos que necesitan tratamiento o prevención de enfermedades bacterianas, enfermedades víricas, enfermedades fúngicas y cánceres. Como las vacunas descritas en el presente documento incluyen vacunas convencionales que se han modificado por la adición de ribavirina, los procedimientos descritos en el presente documento incluyen el tratamiento y prevención de una enfermedad usando una vacuna que comprende un antígeno y ribavirina.
Las vacunas de la invención son, en particular, para tratar o prevenir una infección de hepatitis. En estas realizaciones, a un animal que lo necesita se le proporciona un antígeno de hepatitis (un antígeno peptídico o un antígeno basado en ácidos nucleicos) y una cantidad de ribavirina suficiente para presentar una actividad adyuvante en dicho animal. Por consiguiente, un animal podría identificarse como uno que lo necesita por medio del uso de ensayos de diagnóstico disponibles actualmente o evaluación clínica. La serie de antígenos de virus de la hepatitis que pueden usarse con estas realizaciones es diversa. Los antígenos de virus de la hepatitis preferidos incluyen un antígeno de HBV, un antígeno de HAV, un antígeno de HCV, ácidos nucleicos que codifican estos antígenos o cualquier combinación de los mismos. Las realizaciones muy preferidas incluyen un antígeno de HBV seleccionado entre el grupo compuesto por el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg), el antígeno nuclear de hepatitis (HBcAg), y el antígeno e de la hepatitis (HBeAg), en particular, los antígenos basados en ácidos nucleicos y peptídicos descritos anteriormente. La ribavirina y el antígeno pueden proporcionarse por separado o en combinación, y también pueden proporcionarse otros adyuvantes (por ejemplo, aceite, alumbre u otros agentes que aumentan la respuesta inmune) al animal que lo necesita. De esta manera, las realizaciones preferidas incluyen procedimientos para tratar o prevenir la hepatitis en un animal (por ejemplo, HBV) identificando a un animal infectado o un animal con riesgo de infección y proporcionando a dicho animal un antígeno de hepatitis (por ejemplo, HBsAg, HBcAg y HBeAg) y una cantidad de ribavirina suficiente para presentar actividad adyuvante.
Las vacunas de la invención pueden usarse para aumentar una respuesta inmune a un antígeno proporcionando a un animal que lo necesita una cantidad de ribavirina que es eficaz para mejorar dicha respuesta inmune. En estas realizaciones, se identifica a un animal que necesita una mayor respuesta inmune a un antígeno por medio del uso de ensayos de diagnóstico o evaluación clínica disponibles actualmente. A menudo, estos individuos padecerán una enfermedad (por ejemplo, bacteriana, fúngica, por mohos, viral o cáncer) o tienen riesgo de contraer la enfermedad. Sin embargo, un animal que necesita una mayor respuesta inmune puede ser un animal que se ha envenenado (por ejemplo, al ser picado por un insecto o animal venenoso) o que se ha expuesto a una toxina u otro compuesto tóxico. Una vez identificados, a estos animales se les proporciona un antígeno apropiado y una cantidad de ribavirina eficaz para aumentar la respuesta inmune en el animal.
Como se ha indicado anteriormente, los antígenos del virus de la hepatitis que pueden usarse con estas realizaciones incluyen, pero sin limitación, un antígeno de HBV, un antígeno de HAV, un antígeno de HCV, un ácido nucleico que codifica estas moléculas o cualquier combinación de los mismos. Las realizaciones muy preferidas incluyen un antígeno de HBV seleccionado entre el grupo compuesto por el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg), el antígeno nuclear de hepatitis (HBcAg) y el antígeno e de la hepatitis (HBeAg), en particular, los antígenos basados en ácidos nucleicos y péptidos descritos anteriormente. El antígeno y la ribavirina pueden proporcionarse por separado o en combinación, y también pueden proporcionarse otros adyuvantes (por ejemplo, aceite, alumbre u otros agentes que aumentan una respuesta inmune) al animal que lo necesita. De esta manera, las realizaciones preferidas incluyen procedimientos para aumentar una respuesta inmune a un antígeno de hepatitis (por ejemplo, HBV) identificando a un animal que lo necesita y proporcionando al animal un antígeno de hepatitis (por ejemplo, HBsAg, HBcAg y HBeAg) y una cantidad de ribavirina que es eficaz para aumentar la respuesta inmune en el animal.
Por medio de una estrategia, por ejemplo, a un individuo no infectado se le proporcionan las composiciones de vacuna mencionadas anteriormente en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmune celular y humoral a NS3, para proteger a dicho individuo de la infección por HCV. En otra realización, se identifica un individuo infectado por HCV y se le proporciona una composición de vacuna que comprende ribavirina y NS3 en una cantidad suficiente para aumentar la respuesta inmune celular y humoral contra NS3 para reducir o eliminar la infección por HCV. Dicho individuo puede estar en fase crónica o aguda de la infección. En otra realización, a un individuo infectado con HCV que padece HCC se le proporciona una composición que comprende ribavirina y el gen de fusión NS3/4A en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmune celular y humoral contra células tumorales que expresan NS3.
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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no forma parte del documento de patente Europea. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patentes citados en la descripción
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<110> TRIPEP AB
\hskip1cm
Matti SALLBERG 
\hskip1cm
Catharina HULTGREN 
\vskip0.400000\baselineskip
<120> VACUNAS QUE CONTIENEN RIBAVIRINA Y PROCEDIMIENTOS DE USO DE LAS MISMAS
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<130> TRIPEP.023VPC
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<150> US 09/705.547
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<151> 2000-11-03
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/229.175
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2000-08-29
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/225.767
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2000-08-17
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<160> 49
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<170> FastSEQ para Windows versión 4.0
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<210> 1
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<211> 3011
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Secuencia del virus de la Hepatitis C
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<400> 1
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25
26
27
28
29
30
31
32 
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<210> 2
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<211> 182
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Secuencia de la proteína nuclear del virus de la Hepatitis C
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<400> 2
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33 
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<211> 197
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Secuencia de la proteína E1 del virus de la Hepatitis C
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34 
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<211> 350
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Secuencia de la proteína E2 del virus de la Hepatitis C
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35 
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Secuencia de la proteína NS2 del virus de la Hepatitis C
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36 
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Secuencia de la proteína NS3 del virus de la Hepatitis C
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37
38
39 
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<223> Secuencia de la proteína NS4A del virus de la Hepatitis C
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40 
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<211> 260
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Secuencia de la proteína NS4B del virus de la Hepatitis C
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Secuencia de la proteína NSSA/B del virus de la Hepatitis C
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44
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<211> 226
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Secuencia del antígeno S del virus de la Hepatitis B (HBsAg)
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<400> 10
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46 
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<210> 11
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<211> 212
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Antígeno C y antígeno E del virus de la Hepatitis
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47 
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Secuencia del virus de la Hepatitis A
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48
49
50
51
52
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<211> 9416
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Secuencia del virus de la Hepatitis C
\newpage
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<400> 13
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54
55
56 
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Secuencia del virus de la Hepatitis B
\newpage
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57
58 
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<211> 7478
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del virus de la Hepatitis A
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59
60
61 
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<210> 16
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<211> 2061
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región codificante de NS3/4A del virus de la Hepatitis C
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<212> PRT
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\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Péptido NS3/4A del virus de la Hepatitis C
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<210> 18
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> oligonucleótido de clonación
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\hfill
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<213> Secuencia Artificial
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<223> oligonucleótido de clonación
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<212> ADN
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ccacgcggcc gcgacgacct acag 
\hfill
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\hskip-.1em\dddseqskip
ctggaggtcg tcacgcctac ctgggtgctc gtt 
\hfill
33 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido de clonación
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accgagcacc caggtaggcg tgacgacctc cag 
\hfill
33 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido de clonación
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\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
ctggaggtcg tccgcggtac ctgggtgctc gtt 
\hfill
33 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido de clonación
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\hskip-.1em\dddseqskip
accgagcacc caggtaccgc ggacgacctc cag 
\hfill
33 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Péptido NS3/4A del virus de la Hepatitis C
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<211> 25
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Péptido NS3/4A del virus de la Hepatitis C mutante
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 26
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68 
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<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido NS3/4A del virus de la Hepatitis C mutante
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
69 
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<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido NS3/4A del virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 29
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<211> 632
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial del péptido NS3 del virus de la Hepatitis C
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido NS3 del virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
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70
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 30
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Péptido NS4A del virus de la Hepatitis C
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> NS3/4A del virus de la Hepatitis C mutante
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74
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77
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<223> Péptido NS3/4A del virus de la Hepatitis C mutante
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<223> Péptido NS3/4A del virus de la Hepatitis C mutante
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<223> Péptido NS3/4A del virus de la Hepatitis C mutante
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<223> Péptido NS3/4A del virus de la Hepatitis C mutante
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<223> Péptido NS3/4A del virus de la Hepatitis C mutante
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<223> Péptido NS5 del virus de la Hepatitis C
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<223> Péptido NSSA/B del virus de la Hepatitis C mutante
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<223> NS3/4A del virus de la Hepatitis C mutante
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<223> NS3/4A del virus de la Hepatitis C mutante
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<223> NS3/4A del virus de la Hepatitis C mutante
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Claims (16)

1. Una composición inmunogénica que comprende ribavirina y un antígeno viral, bacteriano, de moho o de levadura, o un ácido nucleico que lo codifica.
2. La composición inmunogénica de la reivindicación 1, que comprende un antígeno del virus de la hepatitis.
3. La composición inmunogénica de la reivindicación 2, en la que dicho antígeno del virus de la hepatitis comprende un ácido nucleico que codifica un péptido de hepatitis.
4. La composición inmunogénica de la reivindicación 2 ó 3, en la que dicho antígeno del virus de la hepatitis comprende un antígeno del virus de la hepatitis C.
5. La composición inmunogénica de la reivindicación 2 ó 3, en la que dicho antígeno del virus de la hepatitis comprende un antígeno del virus de la hepatitis B.
6. La composición inmunogénica de la reivindicación 2 ó 5, en la que dicho antígeno del virus de la hepatitis comprende un antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg), un antígeno nuclear de hepatitis (HBcAg) o un antígeno e de la hepatitis B (HBeAg).
7. La composición inmunogénica de la reivindicación 4, en la que dicho antígeno del virus de la hepatitis C comprende NS3 o un ácido nucleico que codifica NS3.
8. La composición inmunogénica de la reivindicación 4, en la que dicho antígeno del virus de la hepatitis C comprende un fragmento de NS3 o un ácido nucleico que codifica dicho fragmento de NS3.
9. La composición inmunogénica de la reivindicación 4, en la que dicho antígeno del virus de la hepatitis C comprende NS3/4A o un ácido nucleico que codifica NS3/4A.
10. La composición inmunogénica de la reivindicación 4, en la que dicho antígeno del virus de la hepatitis C comprende un mutante de NS3.
11. La composición inmunogénica de la reivindicación 4, en la que dicho antígeno del virus de la hepatitis C comprende el ácido nucleico de la ID SEC Nº:16.
12. La composición inmunogénica de la reivindicación 4, en la que dicho antígeno del virus de la hepatitis C comprende un fragmento del ácido nucleico de la ID SEC Nº:16 que tiene una longitud de al menos 12-15, 15-20, 20-30, 30-50, 50-100, 100-200, 200-500 ó 500 a 1000 nucleótidos consecutivos.
13. Un procedimiento para fabricar una composición inmunogénica, que comprende:
(a) proporcionar ribavirina;
(b) proporcionar un ácido nucleico que codifica un péptido de virus de la hepatitis, comprendiendo dicho ácido nucleico la secuencia de la ID SEC Nº:16 o un fragmento de la misma que comprende al menos 12-15, 15-20, 20-30, 30-50, 50-100, 100-200, 200-500 ó 500 a 1000 nucleótidos consecutivos de dicha secuencia; y
(c) mezclar dicha ribavirina y dicho ácido nucleico o fragmento del mismo para formular dicha composición inmunogénica.
14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicho fragmento comprende al menos 12-15, 15-20, 20-30, 30-50, 50-100, 100-200, 200-500 ó 500 a 1000 nucleótidos consecutivos.
15. Un procedimiento para fabricar una composición inmunogénica, que comprende:
(a) proporcionar ribavirina;
(b) proporcionar un péptido codificado por la secuencia de ácido nucleico de la ID SEC Nº: 16 o un fragmento de la misma que comprende al menos 12 a 15 ó 15 a 20 nucleótidos consecutivos de dicha secuencia; y
(c) mezclar dicha ribavirina y dicho péptido para formular dicha composición inmunogénica.
16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que dicho fragmento comprende al menos 12-15, 15-20, 20-30, 30-50, 50-100, 100-200, 200-500 ó 500 a 1000 nucleótidos consecutivos.
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