ES2295961T3 - Proceso para la sintesis peptidica utilizacndo una cantidad reducida de agente de desproteccion. - Google Patents
Proceso para la sintesis peptidica utilizacndo una cantidad reducida de agente de desproteccion. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para sintetizar de enfuvirtida o fragmentos peptídicos de la misma, que comprenda los pasos de: a. proporcionar una composición que comprenda un fragmento peptídico, en la que el fragmento peptídico comprenda al menos un residuo aminoacídico e incluya un grupo protector N-terminal sensible a la base; b. eliminación del grupo protector N-terminal sensible a la base del fragmento peptídico utilizando una la base como reactivo desprotector; c. eliminación de la base de la composición para proporcionar un contenido de bases residual de más de 100 pmm; d. provocar que un fragmento peptídico reactivo con un extremo C-terminal reactivo y un grupo protector N-terminal sensible a la base reaccione con la funcionalidad N-terminal desprotegida del fragmento peptídico bajo, condiciones tales que el fragmento peptídico reactivo se añada al fragmento peptídico; y e. repetición opcional de los pasos (b) al (d) hasta alcanzar el péptido deseado.
Description
Proceso para la síntesis peptídica utilizando
una cantidad reducida de agente de desprotección.
La presente invención hace referencia a la
síntesis de enfuvirtida. Especialmente, la invención se refiere a
los pasos de desprotección y la unión de aminoácidos durante la
síntesis de enfuvirtida.
Se han publicado muchos métodos de síntesis de
péptidos (por ejemplo, ver Patente estadounidense núm. 6 015 881;
Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters
29:4005-4008; Mergler et al. (1988)
Tetrahedron Letters 29:4009-4012; Kamber et
al. (eds), Peptides, Chemistry and Biology, ESCOM, Leiden (1992)
525-526; Riniker et al. (1993) Tetrahedron
Letters 49:9307-9320; Lloyd-Williams
et al. (1993) Tetrahedron Letters
49:11065-11133; y Andersson et al. (2000)
Biopolymers 55:227-250; Bray, Brian L., Nature
Reviews 2:587-593 (2003). Los diversos métodos de
síntesis se distinguen por el estado físico de la fase en la cual
tiene lugar la síntesis, concretamente, fase líquida o fase
sólida.
Los métodos en fase líquida (a menudo
denominados métodos en fase de solución) de síntesis desarrollan
todas las reacciones en una fase homogénea. Los aminoácidos
sucesivos se unen en una solución hasta que se ha formado la
sustancia polipeptídica deseada. Durante la síntesis, se purifican
los péptidos intermediarios sucesivos mediante precipitación y/o
lavados.
En la síntesis de péptidos en fase sólida
(SPFS), un primer aminoácido o grupo peptídico se fija a un soporte
insoluble, tal como la resina. Se añaden aminoácidos o grupos
peptídicos sucesivos al primer aminoácido o grupo peptídico, hasta
que se forma la sustancia peptídica deseada. El producto de la
síntesis en fase sólida es de este modo un péptido unido a un
soporte insoluble. Los péptidos sintetizados utilizando las técnicas
de SPFS se escinden ahora de la resina y se aísla el péptido
escindido
Además de la fase líquida y las técnicas de SPPS
descritas anteriormente, se puede utilizar un método híbrido. La
síntesis híbrida se utiliza normalmente para fabricar secuencias
complejas.
Por ejemplo, en una combinación híbrida
representativa, se pueden elaborar las secuencias complejas mediante
la síntesis en fase sólida de los intermediarios peptídicos
protegidos, los cuales se unen posteriormente mediante fase de
solución o métodos de SPFS para producir un producto peptídico más
largo. De este modo, por ejemplo, en un paso de la síntesis, se
elabora un compuesto intermedio que incluye cada uno de los residuos
de aminoácidos localizados en la secuencia deseada en la cadena
peptídica y varios de estos residuos tienen grupos protectores de
cadena lateral. Entonces se unen los péptidos intermedios protegidos
en una solución para formar péptidos más largos. Ver, por ejemplo,
WO 99/48513.
Los péptidos y los aminoácidos a partir de los
cuales se sintetizan los péptidos tienden a tener grupos laterales
reactivos además de extremos reactivos. Cuando se sintetiza un
péptido, es importante que el grupo amino de un péptido reaccione
con el grupo carboxilo de otro péptido. Las reacciones no deseadas
en los grupos laterales o en el extremo opuesto de un reactante
producen productos derivados no deseados, a veces en cantidades
significantes. Estos pueden afectar el rendimiento o incluso
estropear el producto que se está sintetizando desde una perspectiva
práctica. Para minimizar reacciones laterales, en la práctica
tradicional se enmascara adecuadamente a los grupos laterales
reactivos y a los extremos terminales de los reactantes para
garantizar que se produzca la reacción deseada.
Por ejemplo, un esquema típico de síntesis en
fase sólida implica la unión de un primer aminoácido o grupo
péptido a un soporte de resina a través de un dominio carboxilo del
péptido o del aminoácido. Esto deja libre el grupo amino de la
sustancia unida a la resina para unirse a aminoácidos o sustancias
peptídicas adicionales. De este modo, el dominio carboxilo del
aminoácido o la sustancia peptídica adicionales reacciona del modo
deseado con el grupo amino libre de la sustancia unida a la resina.
Para evitar reacciones laterales que involucran el grupo amino del
aminoácido o péptido adicionales, tal grupo amino se enmascara con
un grupo protector durante la reacción de unión. Dos grupos
protectores bien conocidos de la amina son el grupo BOC y el grupo
FMOC. También se han descrito muchos otros grupos en las
publicaciones. Después de la unión, el grupo protector
N-terminal del péptido unido a la resina se puede
eliminar, permitiendo así que se añadan de un modo similar
aminoácidos o sustancias peptídicas adicionales a la cadena
creciente. Mientras tanto, los grupos reactivos de cadena lateral
de los reactantes aminoácidos y péptidos, incluyendo la sustancia
peptídico unida a la resina, así como también la sustancia
adicional que se añadirá a la cadena creciente, permanecen
normalmente enmascarados con grupos protectores de cadena lateral
durante toda la síntesis. Estos mismos conceptos (sin la resina de
soporte para el aminoácido inicial) se pueden aplicar a las técnicas
de síntesis en fase líquida.
El paso de eliminar los grupos protectores de un
péptido se denomina normalmente desprotección. Cuando todos los
grupos protectores (incluyendo los grupos protectores de terminales
y los grupos protectores de cadena lateral) se eliminan,
normalmente se denomina desprotección global.
En algunos casos, sólo se elimina el grupo
protector N-terminal. Los reactivos utilizados en la
desprotección N-terminal normalmente dejan los
grupos protectores de cadena lateral intactos. En un esquema
ejemplar de desprotección N-terminal, la
eliminación del grupo protector N-terminal (por
ejemplo, un grupo Fmoc) se consigue típicamente mediante el
tratamiento con un reactivo que incluya 20-50% (en
base al peso) de piperidina en un disolvente, tal como
N-metilpirrolidona (NMP) o dimetilformamida (DMF).
Después de la eliminación del grupo protector FMOC, se efectúan
varios lavados para eliminar la piperidina residual y los productos
derivados del Fmoc (tales como dibenzofulveno y su aducto de
piperidina). Las técnicas de síntesis convencionales han hecho
hincapié en la importancia de la eliminación de la piperidina
residual, para reducir las reacciones no deseadas, tales como la
eliminación prematura de los grupos protectores Fmoc en los
aminoácidos que van a ser añadidos posteriormente a la cadena
peptídica. Es decir, se ha reconocido que el grupo Fmoc debe
permanecer en los aminoácidos hasta que el aminoácido particular se
ha incorporado en la sustancia peptídica creciente y está listo
para ser activado para acoplarse al aminoácido.
Se han llevado a cabo varias pruebas para
determinar cuando ha terminado la eliminación de los productos
derivados del Fmoc y la piperidina residual de una solución de
reacción. La más común de estas pruebas es la prueba del cloranilo,
que utiliza una solución saturada de cloranilo y tolueno en acetona.
Se utiliza el color para determinar la presencia de aminas
secundarias (indicando así que los productos derivados del Fmoc y/o
la piperidina residual están todavía presentes). Otras pruebas
suponen el control del pH de la solución de reacción para
determinar la presencia de piperidina (por ejemplo, utilizando papel
indicador de pH). Otras pruebas suponen la inclusión de un
colorante con el reactivo de desprotección, y el control visual del
color de la solución de reacción para determinar cuando ha sido
eliminado el colorante (y por lo tanto, el reactivo de
desprotección) de la solución de reacción. Una vez eliminado el
grupo protector Fmoc, se puede añadir un residuo de aminoácido
activado adicional al fragmento peptídico, y el ciclo se puede
repetir para posteriores residuos de aminoácidos hasta que se
termine el péptido deseado.
Para la fabricación de péptidos a gran escala,
las cuestiones relacionadas con el consumo del reactivo, así como
con el tiempo del ciclo y de tratamiento, pueden afectar mucho la
viabilidad del plan de síntesis del péptido. De este modo, hay una
necesidad continua de procesos de síntesis de péptidos capaces de
producir sustancias peptídicas de interés comercial en grandes
cantidades. La desprotección de residuos de aminoácidos en el
extremo N-terminal para permitir el acoplamiento de
un aminoácido adicional, por ejemplo, mediante el tratamiento con
una la base, es un aspecto de la síntesis que requiere mejoras.
Puede que las metodologías tradicionales utilicen reactivos a
niveles más altos de los que se desean y suponen pasos de
tratamiento adicionales que son innecesarios.
La invención se refiere a los métodos para la
síntesis de enfuvirtida y sus intermediarios, en particular métodos
que comprenden la síntesis de sustancias peptídicas con uso reducido
de reactivo, volúmenes de mezclas de reacción, y tiempos de ciclo y
tratamiento reducidos. Hablando en términos generales, los métodos
inventivos se pueden aplicar a los pasos de desprotección y
acoplamiento de la enfuvirtida. Más específicamente, la invención
trata el uso y la presencia del reactivo de desprotección durante
los pasos de desprotección y acoplamiento de la síntesis.
En un aspecto de la invención, sorprendentemente
se ha descubierto que niveles de reactivo desprotector
significativamente más altos se pueden tolerar en los pasos de la
síntesis de enfuvirtida posteriores. Por ejemplo, se ha descubierto
que una mayor cantidad de base residual se puede tolerar en las
reacciones posteriores a la desprotección, donde se añade sustancia
peptídica en la región C-terminal de un fragmento
peptídico sin que la la base debilite la protección
N-terminal de la sustancia peptídica que se añade.
En este aspecto, la invención proporciona procesos de síntesis
peptídica que implican reacciones de acoplamiento con
características novedosas. Por ejemplo, en un modo de realización,
la mezcla de reacción para el acoplamiento es básica en cuanto al
pH. Tal y como se describe aquí, las reacciones de síntesis a las
que los métodos inventivos son particularmente aplicables implican
una la base (como la piperidina) como agente desprotector. La
presencia de niveles más altos de reactivo desprotector en la
composición durante las reacciones de acoplamiento proporcionará una
composición más básica. En otros modos de realización, la mezcla de
reacción para el acoplamiento incluye un contenido de bases
residual de más de 100 ppm (en base al peso), que es
significativamente más alto de lo que permiten las técnicas de
síntesis convencionales. Por ejemplo, las técnicas de síntesis
convencionales requieren la eliminación de la piperidina residual y
de los productos derivados del Fmoc (dibenzofulveno y su aducto de
piperidina) antes del acoplamiento de un aminoácido posterior. Con
este fin, se efectúa una prueba para asegurarse que no queda
piperidina en la mezcla de reacción antes de añadir el siguiente
aminoácido al sistema de reacción. Tal y como se describe aquí, las
pruebas convencionales que se han elaborado para la eliminación del
control de la piperidina pueden identificar: (a) la presencia de
aminas secundarias en la mezcla de reacción (por ejemplo, una
prueba de cloranilo); (b) un pH neutral de la mezcla de reacción
(por ejemplo, usando papel indicador de pH u otros controles de
pH); y/o (c) la presencia de colorantes que se incluyen en el
reactivo de desprotección (por ejemplo, acoplados al reactivo de
desprotección). En modos de realización de la invención
adicionales, la reacción de acoplamiento se efectúa en una mezcla de
reacción que proporcionaría una prueba positiva si se sometiera a
una prueba de cloranilo.
Según algunos aspectos de la invención, los
reactivos son necesarios en cantidades inferiores para eliminar el
reactivo desprotector antes de llevar a cabo el paso de
acoplamiento. Preferentemente, los métodos inventivos eliminan los
pasos del tratamiento mediante la reducción del número de lavados
necesarios para eliminar el reactivo desprotector. La eliminación
de los pasos de lavado puede reducir sustancialmente el tiempo de
tratamiento total y el tiempo del ciclo, que puede aumentar la
capacidad de síntesis global. Los métodos inventivos pueden reducir
la cantidad de disolvente de lavado necesaria hasta un 50%. Esto
puede dar lugar a ahorros significativos en el coste de las
materias primas por kilogramo del producto péptido producido.
En un aspecto, los métodos inventivos utilizan
cantidades significativamente menores de reactivo desprotector para
eliminar los grupos protectores del extremo
N-terminal durante el paso de desprotección. Por
ejemplo, las técnicas de síntesis convencionales puede que usen una
solución que contenga 20-50% de piperidina (en base
al peso) en un disolvente como NMP o DMF. Para la síntesis en fase
sólida, la concentración de piperidina puede estar en la región más
baja de este intervalo de concentración (por ejemplo,
20-30% de piperidina en disolvente), mientras que
en la síntesis en fase líquida, la concentración puede estar en la
región más alta de este intervalo de concentración (por ejemplo,
30% o más de piperidina en disolvente). En contraste, algunos modos
de realización de los métodos inventivos pueden utilizar reactivos
de desprotección que incluyan piperidina en cantidades inferiores
al 20%, o inferiores al 10%, o alrededor de 5% (en base al peso). En
modos de realización preferidos, los métodos inventivos utilizan un
reactivo de desprotección que incluye piperidina en una cantidad en
el intervalo entre aproximadamente el 5% hasta aproximadamente el
10% (en base al peso).
Según estos aspectos de la invención, los
métodos inventivos permiten una reducción significativa del uso de
reactivos durante la síntesis, y este uso reducido de reactivos
puede proporcionar ventajas significativas en la síntesis de
péptidos a gran escala. Se pueden utilizar cantidades
sustancialmente menores de sustancias iniciales en la formación del
reactivo de desprotección, la cual cosa puede resultar en ahorros de
coste sustanciales. A su vez, en la mezcla de reacción una vez la
desprotección ha finalizado y antes de que se pueda efectuar el
acoplamiento, habrá menos reactivo desprotector. De este modo, los
métodos inventivos requieren menos lavados para eliminar el
reactivo de desprotección después de la escisión del grupo protector
N-terminal. La reducción de los lavados se puede
traducir en una reducción del uso de reactivo y una reducción de los
tiempos del ciclo y del tratamiento en la síntesis global.
Tal y como se verá en el estudio de la presente
descripción, los modos de realización de la invención pueden
incluir la realización de reacciones de síntesis de enfuvirtida
posteriores a la desprotección en mezclas de reacción que muestran
niveles de reactivos de desprotección superiores, la utilización de
menos agente desprotector en las reacciones de síntesis de
péptidos, o una combinación de estos aspectos. En cualquiera de los
modos de realización descritos aquí, los métodos inventivos pueden
proporcionar sorprendentemente un rendimiento y una pureza del
fragmento comparables, como los métodos convencionales.
En un aspecto, la invención proporciona un
método de sintetización de un péptido que consta de los siguientes
pasos: (a) proporcionar una composición que comprenda un fragmento
peptídico, donde el fragmento peptídico conste de al menos un
residuo aminoacídico e incluya un grupo protector
N-terminal sensible a la base; (b) eliminación del
grupo protector N-terminal sensible a la base del
fragmento peptídico utilizando un reactivo desprotector que
comprenda una la base, a través de la cual quede desprotegida la
funcionalidad N-terminal del fragmento peptídico;
(c) eliminación de la base de la composición para proporcionar un
contenido básico residual de más de 100 ppm; (d) provocar que un
fragmento peptídico reactivo con un extremo
C-terminal reactivo y un grupo protector
N-terminal sensible a la base reaccione con el grupo
funcional N-terminal desprotegido del fragmento
peptídico bajo condiciones tales que el fragmento peptídico reactivo
se añade al fragmento peptídico, donde la composición tiene un pH
básico durante la reacción del fragmento peptídico reactivo con el
fragmento peptídico; y (e) repetición opcional de los pasos (b) al
(d) hasta, la obtención del péptido deseado.
En otro aspecto, la invención proporciona un
método de síntesis de enfuvirtida que consta de los siguientes
pasos: (a) proporcionar una composición que comprenda un fragmento
peptídico, donde el fragmento peptídico conste de al menos de un
residuo aminoacídico e incluya un grupo protector
N-terminal sensible a la base; (b) eliminación del
grupo protector N-terminal sensible a la base del
fragmento peptídico utilizando un reactivo desprotector que
comprenda una la base, a través de la cual quede desprotegida la
funcionalidad N-terminal del fragmento peptídico;
(c) eliminación de la la base de la composición hasta el punto en el
que la composición proporcionaría un resultado de prueba positivo
si se sometiera a la prueba del cloranilo; (d) provocar que un
fragmento peptídico reactivo con un extremo
C-terminal reactivo y un grupo protector
N-terminal sensible a la base reaccione con la
funcionalidad desprotegida del extremo N-terminal
del fragmento peptídico bajo condiciones tales que el fragmento
peptídico reactivo se añade al fragmento peptídico; y (e) repetición
de los pasos (b) a (d) opcionalmente hasta la obtención del péptido
deseado.
En otro aspecto, la invención proporciona un
método de síntesis de enfuvirtida que consta de los siguientes
pasos: (a) proporcionar una composición que comprenda un fragmento
peptídico, donde el fragmento peptídico conste de al menos un
residuo aminoacídico e incluya un grupo protector
N-terminal sensible a la base; (b) eliminación del
grupo protector N-terminal sensible a la base del
fragmento peptídico utilizando un reactivo desprotector que
comprenda una la base, a través de la cual quede desprotegida la
funcionalidad N-terminal del fragmento peptídico;
(c) provocar que un fragmento peptídico reactivo con un extremo
C-terminal reactivo y un grupo protector
N-terminal sensible a la base reaccione con la
funcionalidad desprotegida del extremo N-terminal
del fragmento peptídico bajo condiciones tales que el fragmento
peptídico reactivo se añade al fragmento peptídico, donde la
composición tiene un pH básico durante la reacción del fragmento
peptídico reactivo y el fragmento peptídico; y (d) repetición
opcional de los pasos (b) y (c) hasta, la obtención del péptido
deseado.
La presente invención se dirige hacia métodos
para sintetizar enfuvirtida y sus intermediarios eficazmente, y en
particular para la eliminación eficaz de los grupos protectores
N-terminales sensibles a la base para de ese modo
formar un aminoácido N-terminal desprotegido (un
grupo amino N-alfa), y el acoplamiento posterior de
un aminoácido al grupo amino N-alfa.
Los métodos aquí descritos son particularmente
adecuados para mejorar los aspectos de la síntesis aumentada
proporcionalmente de enfuvirtida. En los modos de realización
preferidos, los métodos inventivos pueden proporcionar tales
mejoras como la reducción en los tiempos de tratamiento y ciclo, así
como también la reducción de la cantidad de reactivos y sustancias
iniciales necesarias.
Se entiende que los péptidos de la invención se
pueden sintetizar o preparar mediante técnicas bien conocidas en el
ámbito. Ver, por ejemplo, Creghton, 1983, Proteins: Structures and
Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., NY, así como
referencias adicionales aquí citadas. Los residuos de uno o muchos
otros constituyentes monoméricos, oligoméricos y/o poliméricos se
pueden incorporar a un péptido opcionalmente.
Como se usa aquí, el término "monómero"
significa una sustancia de peso molecular relativamente bajo (es
decir, que en general tiene un peso molecular inferior a
aproximadamente 500 Daltons) con uno o más grupos polimerizables.
"Oligómero" significa una molécula de tamaño relativamente
intermedio que comprende dos o más monómeros y generalmente tiene
un peso molecular de aproximadamente 500 hasta aproximadamente
10.000 Daltons. "Polímero" significa una sustancia
relativamente importante que comprende una subestructura formada por
dos o más constituyentes monoméricos, oligoméricos y/o poliméricos
y que generalmente tiene un peso molecular superior a
aproximadamente 10.000 Daltons.
Los aminoácidos a partir de los cuales se
obtienen los péptidos pueden ser residuos aminoacídicos producidos
naturalmente, residuos aminoacídicos no naturales, o combinaciones
de los mismos. Los veinte residuos aminoacídicos producidos
naturalmente son los siguientes: A (Ala, alanina), R (Arg,
arginina); N (Asn, asparagina); D (Asp, ácido aspártico); C (Cys,
cisteína) Q (Gln, glutamina), E (Glu, ácido glutámico); G (Gly,
glicina); H (His, histidina); I (Ile, isoleucina); L (Leu,
leucina); K (Lys, lisina); M (Met, metionina); F (Phe,
fenilalanina); P (Pro, prolina); S (Ser, serina); T (Thr,
treonina); W (Trp, triptófano); Y (Tyr, tirosina); y V (Val,
valina). También se contemplan Los aminoácidos producidos
naturalmente poco frecuentese incluyen, por ejemplo, selenocisteína
y pirrolisina.
Los aminoácidos no naturales son compuestos
orgánicos con una estructura y reactividad similares a las de los
aminoácidos producidos naturalmente y son, por ejemplo,
D-aminoácidos, aminoácidos beta,
omega-aminoácidos (tales como el ácido
3-aminopropiónico, el ácido
2,3-diaminopropiónico, el ácido
4-aminobutírico, y similares), aminoácidos gamma,
análogos de aminoácidos cíclicos, derivados de la proparglicina,
derivados del ácido
2-amino-4-cianobutírico,
amidas de Weinreb de -aminoácidos, y amino alcoholes.
La presente invención considera que las
sustancias peptídicas sintetizadas podrían actuar como
intermediarios en la síntesis de otros péptidos de interés mediante
la modificación del péptido resultante, mediante el acoplamiento
del péptido a otras sustancias como otros péptidos, o similares. Por
ejemplo, la presente invención sería particularmente útil para
sintetizar fragmentos peptídicos intermediarios útiles en la
síntesis de la enfuvirtida (también conocido como péptido
T-20), o alternativamente DP-178.
Tales fragmentos peptídicos de la invención incluyen, pero no se
limitan a, aquellos que tienen secuencias aminoacídicas
representadas a continuación en la Tabla 1:
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(Tabla pasa a página
siguiente)
La enfuvirtida es un péptido que corresponde a
los residuos aminoacídicos 638 a 673 de la proteína transmembrana
gp41 del VIH-1 de la cepa LAI y tiene la secuencia
36 aminoácidos (leyendo des del extremo amino, NH_{2} hacia el
extremo carboxilo, COOH,): NH_{2}
-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH (NÚM. ID.
SEC.:1).
El nombre químico de la enfuvirtida es
N-acetil-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-GlnGln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe-CONH_{2}.
Se entiende que los principios de la presente invención también se
aplicarán a a modos de realización preferidos para la recuperación
de péptidos que constituyen toda o una porción de fragmentos
peptídicos semejantes al péptido T-20, además de
fragmentos de péptido T-20. El término "semejantes
al T-20" tal y como se usa aquí incluye
cualquiera de los péptidos del VIH o no-VIH
enumerados en las Patentes estadounidenses núm. 5 464 933; 5 656
480, 6 015 881, 6 281 331, o en la publicación PCT Núm. WO 96/19495.
La síntesis de los péptidos con actividad T-20 y
los péptidos intermediarios usados para preparar péptidos con
actividad T-20 se describen en las patentes
estadounidenses núm. 5 464 933; 5 656 480, 6 015 881, 6 281 331, y
en la Publicación PCT Núm. WO 96/19495.
La invención considera la síntesis de los
péptidos que han sido químicamente alterados para que contengan uno
o más grupos químicos aparte de residuos aminoacídicos, a veces
denominados péptidos modificados. Tales grupos químicos se pueden
incluir en el extremo amino de los péptidos, al extremo carboxilo,
y/o a uno o más residuos aminoacídicos a lo largo del péptido. En
otros modos de realización adicionales, el péptido puede contener
grupos químicos adicionales presentes en su extremo amino y/o
carboxilo, tales que, por ejemplo, mejoren la estabilidad, la
reactividad y/o la solubilidad de los péptidos. Por ejemplo, los
grupos hidrofóbicos, tales como carbobenzoxilo, dansilo o acetilo,
se pueden añadir al extremo amino de los péptidos. De forma
semejante, un grupo éster de para-nitrobencilo se
puede colocar en el extremo carboxilo de los péptidos. Las técnicas
para introducir tales modificaciones son bien conocidas en el
ámbito.
En algunos aspectos, la invención proporciona
métodos para sintetizar péptidos que pueden incluir uno o más
grupos protectores. La naturaleza y el uso de los grupos protectores
son bien conocidos en el ámbito. Generalmente, un grupo protector
adecuado será cualquier tipo de grupo que pueda ayudar a impedir que
el átomo al cual se ha adjuntado, normalmente oxígeno o nitrógeno,
participe en reacciones no deseadas durante el tratamiento y la
síntesis. Los grupos protectores incluyen grupos protectores de
cadena lateral y grupos protectores amino- o
N-terminales.
Los grupos protectores también pueden impedir la
reacción o la unión de ácidos carboxílicos, tioles, y
semejantes.
Un grupo protector de cadena lateral es una
región química acoplada a la cadena lateral (grupo R en la fórmula
aminoacídica general
H_{2}N-C(R)(H)-COOH)de
un aminoácido que ayuda a impedir que una porción de la cadena
lateral reaccione con las sustancias químicas utilizadas en los
pasos de síntesis peptídica, tratamiento, y semejantes. La elección
de un grupo protector de cadena lateral puede depender de varios
factores, por ejemplo, el tipo de síntesis que se esté llevando a
cabo, tratamiento al cual el péptido estará expuesto, y los
productos intermediarios o finales deseados. El grupo protector de
cadena lateral también depende de la naturaleza del aminoácido en
sí. Generalmente, se escoge un grupo protector de cadena lateral que
no sea eliminado durante la desprotección de los grupos -amino
durante
la síntesis. Por tanto, el grupo -amino protector y el grupo protector de cadena lateral normalmente no son el mismo.
la síntesis. Por tanto, el grupo -amino protector y el grupo protector de cadena lateral normalmente no son el mismo.
En algunos casos, y en función del tipo de
reactivos utilizados en la síntesis en fase sólida y otros
tratamientos peptídicos, un aminoácido podría no requerir la
presencia de un grupo protector de cadena lateral. Tales aminoácidos
normalmente no incluyen un oxígeno o nitrógeno reactivos en la
cadena lateral.
Ejemplos de grupos protectores de cadena lateral
incluyen acetilo (Ac), benzoilo (Bz), terc butilo, trifenilmetil
(tritilo), tetrahidropiranilo, éter de bencilo (Bzl),
2,6-diclorobencilo (DCB),
t-butoxicarbonilo (BOC), nitro,
p-toluenosulfonilo (Tos), adamantyloxycarbonyl,
xantilo (Xan), bencilo, metilo, etilo, y éster de
t-butilo, benciloxicarbonilo (Z),
2-clorobenciloxicarbonilo
(2-Cl-Z),
t-amiloxicarbonilo (Aoc), y grupos protectores del
tipo uretno aromático o alifático, grupos fotolábiles como nitro
veratrilo oxicarbonilo(NVOC), y grupos fluoruro lábiles como
trimetilsilil oxicarbonilo (TEOC).
Por ejemplo, cualquiera de las cadenas laterales
de los residuos aminoacídicos de los fragmentos peptídicos
enumerados en la Tabla 1 se pueden proteger con grupos protectores
estándares tales como t-butilo
(t-Bu), tritilo (trt), y
t-builoxicarbonilo (Boc). Los grupos protectores de
cadena lateral preferidos son el grupo t-Bu para
los residuos aminoacídicos de tirosina, treonina, serina y ácido
aspártico; el grupo trt para los residuos aminoacídicos de
histidina, glutamina, y asparagina; y el grupo Boc para los residuos
aminoacídicos lisina y triptófano.
Durante la síntesis de los fragmentos de la
Tabla 1 que incluyen histidina, es preferible proteger la cadena
lateral de la histidina, preferentemente con un grupo protector
tritilo (trt). Si el residuo de histidina no está protegido, los
reactivos utilizados para la síntesis y el tratamiento de los
péptidos (por ejemplo, el ácido utilizado para escindir el
fragmento peptídico de la resina en la síntesis en fase sólida)
podrían reaccionar perjudicialmente con el residuo de histidina,
causando la degradación del fragmento peptídico.
Preferentemente, los residuos de glutamina de
los fragmentos peptídicos de la invención se protegen con grupos
tritilo (trt). Sin embargo, es preferible no proteger los residuos
de glutamina en el extremo carboxi-terminal de los
fragmentos 1-16 y 9-16. Se ha
observado que la ausencia de un grupo protector en el residuo de
glutamina del extremo carboxi-terminal del
fragmento 1-16 facilita la reacción del fragmento
1-16 con el fragmento 17-36,
permitiendo el acoplamiento de los fragmentos con sólo un 2% de
racemización. Además, si se desea disminuir la solubilidad de
cualquiera de los fragmentos peptídicos en solventes orgánicos de la
invención, se pueden eliminar los grupos protectores tritilo de uno
o más de los otros residuos de glutamina de los fragmentos.
Preferentemente, se protegen todos los residuos
de asparagina de cada fragmento peptídico de la invención. Además,
es preferible que se proteja el residuo de triptófano con un grupo
Boc.
Un grupo protector amino terminal (a los que
también nos hemos referido aquí como grupo protector
N-terminal) incluye una región química acoplada al
grupo alfa amino de un aminoácido. Normalmente, el grupo protector
amino terminal se elimina en una reacción de desprotección previa a
la adición del siguiente aminoácido que será añadido a la cadena
peptídica creciente, pero se puede mantener cuando el péptido se
escinde del soporte durante la síntesis en fase sólida. El grupo
amino terminal se puede mantener cuando se lava y también cuando se
trata del péptido. La elección de un grupo protector amino terminal
depende de varios factores, por ejemplo, del tipo de síntesis que
se lleve a cabo y del producto intermediario o el producto final
obtenido deseados.
Ejemplos de grupos protectores amino terminales
(a los que también nos hemos referido aquí como grupos protectores
N-terminales) son: (1) grupos protectores del tipo
acilo, tales como formilo, acrililo (Acr), benzoilo (Bz) y acetilo
(Ac); (2) grupos protectores del tipo uretano aromáticos, tales como
benciloxicarbonilo (Z) y Z sustituido, tales como
p-clorobenciloxicarbonilo,
p-nitrobenciloxicarbonilo,
p-bromobenciloxicarbonilo,
p-metoxibenciloxicarbonilo; (3) grupos protectores
alifáticos de uretano, tales como
t-butiloxicarbonilo (BOC),
diisopropilmetoxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, etoxicarbonilo,
aliloxicarbonilo; (4) grupos protectores cicloalquilo del tipo
uretano, tales como
9-fluorenil-metiloxicarbonilo
(Fmoc), ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonil, and
ciclohexiloxicarbonilo; y (5) grupos protectores del tipo
tiouretano, tales como feniltiocarbonilo. Los grupos protectores
preferidos son 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc),
2-(4-bifenililo)-propil(2)oxicarbonilo
(Bpoc),
2-fenilpropil(2)-oxicarbonilo
(Poc), y t-butiloxicarbonilo (Boc). El grupo
protector amino terminal preferido es el Fmoc.
Según la invención, los grupos protectores
preferidos son el Boc y el Fmoc.
En un paso inicial de la invención, se
proporciona una composición que comprende un fragmento peptídico, en
el que el fragmento peptídico comprende al menos un residuo
aminoacídico e incluye un grupo protector N-terminal
sensible a la base. Tal y como se usa aquí, un grupo protector
N-terminal sensible a la base se refiere a un grupo
protector que se puede desacoplar del aminoácido mediante una la
base. El grupo protector N-terminal sensible a la
base ayuda a asegurar el acoplamiento del aminoácido en la
localización y la orientación correctas. La elección de un grupo
protector N-terminal sensible a la base adecuado no
está especialmente limitada, siempre que el grupo protector sea
compatible con los reactivos utilizados en la síntesis, incluyendo
las sustancias y los disolventes iniciales. Los grupos protectores
N-terminales sensibles a la base preferidos son
grupos protectores cicloalquilo del tipo uretano, tales como
9-fluorenil-metiloxicarbonilo
(Fmoc), ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxcarbonil, y
ciclohexiloxicarbonilo.
Durante la provisión de la composición del
fragmento peptídico se pueden proporcionar opcionalmente uno o más
grupos protectores de cadena lateral, y/o grupos protectores
C-terminales al fragmento peptídico. Sin embargo,
tal y como se describe aquí, tales grupos protectores de cadena
lateral y/o C-terminales son opcionales y no son
imprescindibles.
La invención implica la eliminación del grupo
protector N-terminal sensible a la base del
fragmento peptídico utilizando un reactivo desprotector que
contenga una la base. Las bases adecuadas son aminas secundarias y/o
reactivos capaces de provocar hidrogenolisis. Las bases ejemplares
incluyen piperidina, dietilamina y piperacina.
Normalmente, el reactivo de desprotección se
proporciona en un disolvente, tal como NMP, DMF y
CH_{2}Cl_{2}.
Una vez el reactivo desprotector adecuado ha
eliminado el grupo protector N-terminal sensible a
la base, el grupo amino N-alfa del aminoácido
desprotegido está disponible para formar un enlace peptídico con un
fragmento peptídico reactivo adecuado. El fragmento peptídico
desprotegida es entonces preparado para la posterior reacción y la
formación del enlace amida.
Según la invención, la base se elimina de la
composición peptídica para proporcionar una mezcla de reacción
adecuada para el tratamiento posterior (como el acoplamiento). Los
inventores actuales han descubierto sorprendentemente que no se
deben eliminar todas las bases residuales de la composición
previamente al tratamiento posterior. Después de la desprotección,
la mezcla de reacción puede ser básica con respeto al pH para el
posterior acoplamiento y otros tratamientos. En términos generales,
las características básicas de la mezcla de reacción se pueden
evaluar de varios modos. Por ejemplo, la cantidad de base presente
en la mezcla de reacción se puede determinar en base al peso
(partes por millón, ppm). Una prueba cualitativa, tal como la prueba
del cloranilo, se puede llevar a cabo para determinar si hay base
residual presente en la mezcla de reacción. Se puede determinar el
pH de la mezcla de reacción para evaluar las características básicas
de la mezcla de reacción.
Según la invención, la reacción de acoplamiento
se puede llevar a cabo en mezclas de reacción que muestran
características novedosas. Por ejemplo, los métodos inventivos
incluyen reacciones de acoplamiento que incluyen un contenido de
base residual de más de aproximadamente 100 ppm, o preferentemente
en el intervalo de aproximadamente 100 ppm hasta aproximadamente
10.000 ppm, o más preferentemente en el intervalo de aproximadamente
500 ppm hasta aproximadamente 7.000 ppm (en base al peso). Tal y
como se describe aquí, el contenido de base residual de los métodos
inventivos es significativamente superior que en los métodos de
síntesis peptídica previos. Se puede hacer un seguimiento de la
cantidad de bases residuales presente en la reacción de
acoplamiento, por ejemplo mediante técnicas habituales conocidas en
el ámbito.
En otro modo de realización, la reacción de
acoplamiento puede incluir un contenido de base residual tal que la
reacción de acoplamiento daría un resultado positivo si se sometiera
la prueba del cloranilo. De este modo, la reacción de acoplamiento
se lleva a cabo en presencia de aminas secundarias (como resultado
de las bases residuales y/o los producto derivados). En todavía más
modos de realización, la reacción de acoplamiento se efectúa en
condiciones relativamente básicas, preferiblemente en condiciones de
pH moderadamente básico. En algunos modos de realización, el pH de
la mezcla de reacción durante la reacción de acoplamiento es
superior a 7, o en el intervalo de 7,2 a 8. Tal y como se describe
aquí, se dispone de muchos métodos habituales para medir el pH de
una composición, y se puede utilizar cualquiera de estos métodos en
conexión con la invención.
\newpage
Según la invención, la funcionalidad
N-terminal de un fragmento peptídico está
desprotegida, haciendo que el extremo N-terminal
del fragmento peptídico esté disponible para reaccionar con un
fragmento peptídico reactivo. Tal y como se usa aquí, los
fragmentos peptídicos reactivos incluyen un grupo protector
N-terminal sensible a la base, un extremo
C-terminal reactivo, y opcionalmente un grupo
protector de cadena lateral. El extremo C-terminal
reactivo de este modo está disponible para formar un enlace
peptídico con un grupo amino N-alfa de un fragmento
peptídico adicional.
La formación del enlace peptídico implica la
activación del grupo carboxilo del extremo
C-terminal reactivo. Hay cuatro técnicas
importantes de acoplamiento que se utilizan habitualmente. La
primera técnica de acoplamiento implica reactivos de acoplamiento
in situ, tales como acoplamiento mediado por carbodiimida,
BOP, hexafluorofosfato de
o-(benzotriazol-1-il)-N,N,N'N'-tetrametiluronio
(HBTU), y HATU, diciclohexilcarbodiimida (DCC), carbodiimida
hidrosoluble (CDISA), y reactivos de uronio (por ejemplo,
tetrafluoroborato de
o-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio
(TBTU). Una segunda técnica de acoplamiento utiliza ésteres
preformados tales como ésteres de hidroxisuccinimida (HOSu) y de
p-nitrofenol (HONp). Una tercera técnica de
acoplamiento implica anhídridos simétricos preformados, tales como
N-carboxianhidridos (NCAs). Otra técnica utiliza
haluros de ácido como el fluoruro de acilo, así como también,
también cloruro de acilo. Los derivados aminoacídicos preformados
pueden tener los beneficios adicionales de no generar productos
derivados a partir del agente activador y también de ser compatibles
con un residuo aminoacídico C-terminal desprotegido
en el componente amino. Para los métodos de carboiimida y TBTU, sin
embargo, es preferible la protección C-terminal.
Los solventes adecuados para la reacción de
acoplamiento incluyen diclorometano (DCM), dicloroetano (DCE),
dimetilformamida (DMF), cloruro de metileno, y semejantes, además de
las mezclas de estos reactivos. Otros disolventes útiles incluyen
DMSO, piridina, cloroformo, dioxano, tetrahidrofurano, acetato de
etilo, N-metilpirrolidona, y las mezclas de los
mismos.
El fragmento peptídico reactivo puede incluir un
residuo aminoacídico, o un péptido que contenga más de un residuo
aminoacídico, de la forma deseada. En algunos modos de realización,
los péptidos que incluyen más de un residuo aminoacídico están
acoplados. Cuando se acoplan péptidos, aumenta el riesgo de
racemización, debido a la posibilidad de formación de oxazolona.
Sin embargo, se dispone de varias técnicas para prevenir la
racemización mediante la provisión de reactivos protectores. Una de
las más comunes implica carbodiimida (por ejemplo, DCC o CDISA) con
un nucleófilo auxiliar añadido (por ejemplo,
1-hidroxibenzotriazol (HOBt),
1-hidroxiazabenzotriazol (HOAt), o HOSu). Otro
reactivo que se puede utilizar es el TBTU. El método del anhídrido
mezclado, utilizando cloroformato de isobutilo, con o sin un
nucleófilo auxiliar añadido, también se utiliza, como es el método
azida, debido a la baja racemización asociada con este. Estos tipos
de compuestos también incrementan la tasa de acoplamientos
mediados por carbodiimida, además de prevenir la deshidratación de
los residuos de Asn y Gln. Otros compuestos que pueden aumentar la
tasa de reacción y reducir la tasa de reacciones laterales incluyen
las sales de fosfonio y uronio que pueden, en la presencia de una la
base terciaria, convertir los aminoácidos protegidos en especies
activadas (por ejemplo BOP, PyBOPO, HBTU, y TBTU todos generan
ésteres de HOBt).
Según la invención, el fragmento peptídico
reactivo se activa para proveer un extremo carboxilo reactivo. En
un proceso de activación ejemplar, un aminoácido protegido por Fmoc,
un HOBT y un DIEA se disuelven en un disolvente inerte (como el
NMP) a temperatura ambiente. A continuación se enfría la solución a
aproximadamente 0ºC-5ºC, y luego se añade HBTU y la
solución de reacción se agita durante el tiempo necesario para
disolver el HBTU. Se ha observado que la activación y la
racemización se controlan mediante la adición al final de HBTU en
la solución fría. El fragmento peptídico está ahora preparado para
acoplarse a otro fragmento peptídico que incluye una funcionalidad
N-terminal desprotegida.
El fragmento peptídico reactivo se añade a una
mezcla de acoplamiento que incluye el fragmento peptídico
desprotegido. La reacción de acoplamiento normalmente utiliza un
exceso estequiométrico de aminoácidos, por ejemplo, 1,3 o más, 2 o
más, 2,5 o más, o 3,0 o más exceso molar de aminoácidos. El uso de
un exceso estequiométrico de aminoácidos asegura que la reacción de
acoplamiento llega a finalizarse y ayuda a la reacción a tolerar el
exceso de bases del reactivo desprotector.
La finalización del acoplamiento se puede
controlar con una prueba cualitativa de nihidrina como se describe
aquí.
Una vez se ha determinada la finalización del
acoplamiento, se lava la mezcla de reacción de acoplamiento con un
disolvente, y se repite el ciclo de acoplamiento para cada residuo
aminoacídico posterior del la sustancia peptídica. A continuación
del último ciclo de acoplamiento, se lava la resina con un solvente
como el NMP, y luego se lava con un segundo solvente inerte como el
DCM.
Los métodos de la invención se pueden utilizar
con métodos de síntesis en fase sólida o en fase líquida, como se
desee. Cuando se utiliza con respeto a la síntesis en fase sólida,
se puede utilizar cualquier tipo de soporte adecuado para la
práctica de SPPS de acuerdo con los métodos de la invención. En
modos de realización preferidos, el soporte comprende una resina
que se puede elaborar a partir de uno o más polímeros, copolímeros,
o combinaciones de polímeros como poliamida, polisulfamida,
polietilenos sustituidos, polietilen glicol, resinas fenólicas,
polisacáridos, o poliestireno. El soporte polimérico también puede
ser cualquier sólido suficientemente insoluble e inerte a los
disolventes utilizados en la síntesis peptídica. El soporte sólido
normalmente incluye una región de unión a la cual se acopla el
péptido creciente durante la síntesis y que se puede escindir bajo
las condiciones deseadas para liberar el péptido del soporte. Los
soportes sólidos adecuados pueden incluir conectores que puedan ser
fotoescindibles, escindibles por TFA, escindibles por HF, escindible
por fluoruro ion, escindible reductivamente, escondibles por
Pd(O), escindibles nucleofílicamente, o escindibles
radicalmente. Las regiones de unión preferentes se escinden bajo
condiciones tales que el péptido escindido está todavía
sustancialmente protegido mediante grupos protectores de cadena
lateral.
Los soportes sólidos preferentes incluyen
soportes sólidos sensibles a ácido, por ejemplo, resina polimérica
de
hidroximetil-poliestireno-divinilbenzeno
(resinas "Wang", ver Wang, S.S. 1973, J. Am. Chem. Soc.,
95:1328-33), resina de cloruro de
2-clorotritilo (ver Barlos et al. (1989)
Tetrahedron Letters 30(30):3943-3946), y
resina de ácido
4-hidroximetil-3-metoxifenoxibutírico
(ver Richter et al. (1994), Tetrahedron Letters
35(27):4705-4706), además de resinas de poli
N-acriloilpirrolidona funcionalizadas y encruzados y
resinas de polímero de divinilbenceno de clorometilpoliestireno.
Estos tipos de soporte sólido están comercialmente disponibles por,
por ejemplo, Calbiochem-Novabiochem Corp., San
Diego, CA.
Los procedimientos generales que se pueden
utilizar para la producción y la carga de las resinas se describen
en "Principles and Practice of Solid Phase Peptide Synthesis"
(Editado por Greagory A. Grant, 1992, W.H. Freeman y Company) y las
referencias de ello, y son bien conocidos por aquellos con
habilidades ordinarias en el ámbito. Los procedimientos específicos
para la carga de las resinas Wang se describen, por ejemplo, en
Sieber (1987) Tet. Lett. 28:6147-50, y Granadas
et al. (1989), Int. J. Pept. Protein Res.
33:386-90.
Una vez el fragmento peptídico reactivo ha
reaccionado con la funcionalidad N-terminal
desprotegida del fragmento peptídico, se forma un fragmento
peptídico protegido en su extremo N-terminal más
largo. Si se aclanza la longitud peptídica deseada, se puede parar
la síntesis en este punto, y el fragmento peptídico más largo se
puede recuperar por cualquiera de los métodos adecuados.
Alternativamente, si se desea un fragmento peptídico más largo, se
pueden repetir los siguientes pasos en ciclos: (i) eliminar el grupo
protector N-terminal sensible a la base del
fragmento peptídico utilizando un reactivo desprotector que
comprenda una la base; eliminar la la base de la composición para
proporcionar el contenido de bases residual deseado; y (iii)
provocar que un fragmento peptídico reactivo que tenga un extremo
C-terminal reactivo y un grupo protector
N-terminal sensible a la base reaccione con la
funcionalidad N-terminal desprotegida del fragmento
peptídico bajo condiciones tales que el fragmento peptídico
reactivo se añada al fragmento peptídico. Se puede repetir varias
veces, dependiendo del péptido a sintetizar. El número de ciclos de
los pasos (i) hasta (iii) se puede repetir como se desee, para
conseguir el producto peptídico deseado.
La invención se describirá ahora en referencia a
los siguientes ejemplos no limitantes.
Para el siguiente ejemplo, se adoptan los
siguientes reactivos y nomenclatura habituales:
La prueba del cloranilo: La solución la prueba
del cloranilo se preparó añadiendo una gota de una solución
saturada de cloranilo en tolueno en aproximadamente 1 mL de acetona.
Los lavados con NMP se probaron añadiendo una gota del lavado a la
solución de la prueba del cloranilo. Un color azul o violeta es un
indicador positivo para la presencia de aminas secundarias,
indicando que todavía hay presentes productos derivados del Fmoc
y/o piperidina residual.
La prueba de la ninhidrina: en la prueba
cualitativa de la ninhidrina, se extrajo una muestra de
2-20 mg de la resina y se lavó con NMP y
posteriormente DCM o metanol. Se añadieron a la muestra tres gotas
de una solución de fenol en etanol al 76%, seis gotas de una
solución de KCN 0,2 mM en piridina, y tres gotas de una solución de
ninhidrina en etanol 0,28 M, y la muestra se colocó en un bloque
calefactor a alrededor de 100ºC durante aproximadamente 5 minutos.
Se quitó la muestra e inmediatamente se diluyó con una solución de
etanol/agua (9:1). Un color azul o violeta es un indicador positivo
de la presencia de aminas libres, incluyendo que la reacción no
está todavía finalizada. Si se observó una prueba de la ninhidrina
positivo pasada una hora de la reacción de acoplamiento, se dejó
continuar la reacción de acoplamiento durante una hora adicional. Si
se obtuvo una prueba de ninhidrina positivo tres horas después de
la reacción de acoplamiento, se escurrió el recipiente, y se
repitió el acoplamiento utilizando aproximadamente un equivalente
del aminoácido activado y reactivos. Ejemplo 1: Sustancias
Iniciales Reducidas.
Este ejemplo ilustra la síntesis peptídica
utilizando una cantidad de reactivo desprotector disminuida (5% de
piperidina).
Se utilizó síntesis en fase sólida para preparar
el siguiente intermediario peptídico:
Ac-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-OH
\hskip4cm (NÚM. ID. SEC.: 17)
La resina cargada con
L-Trp(Boc) (10 g) se lavó con 100 mL de
CH_{2}Cl_{2} y 100 mL de NMP.
Mientras, se preparó una solución de aminoácidos
activados. Se disolvieron
Fmoc-L-AsnTrt(OH)
(equivalente 1,5), HOBt (equivalente 1,5) y DIEA (equivalente 1,7)
en NMP (40 mL). Se enfrió la solución a aproximadamente 0ºC y se
añadió una solución de HBTU (equivalente 1,5) en NMP (24 mL) y
CH_{2}Cl_{2} (18 mL) para formar la solución de reactivo de
aminoácidos activados.
La solución de reactivo de aminoácidos activados
se añadió a la resina, y se calentó la suspensión a 25ºC - 30ºC. Se
agitó la suspensión durante 1-3 h, hasta la
finalización de la reacción (establecida mediante el test de la
ninhidrina). Se lavó la resina con NMP (2 x 100 mL).
Entonces se trató la resina con 50 mL de una
solución de piperidina al 5% en NMP. Después de agitarla durante 30
minutos, se escurrió la resina y se trató otra vez con 50 mL de una
solución de piperidina al 5% en NMP durante 30 minutos. El análisis
HPLC mostró una desprotección completa. El análisis demostró que
después de los primeros 30 minutos de exposición a la piperidina
5%/NMP, la desprotección era más completa que 99,5%.
Se lavó la resina con NMO (7 x 70 mL) hasta
obtener una prueba del cloranilo negativo. La secuencia de
activación y desprotección aminoacídica que se muestra
anteriormente, se repitió para cada aminoácido de la secuencia
(Fmoc-L-Trp(Boc)-OH,
Fmoc-L-Leu-(OH),
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH,
Fmoc, L-Ala-OH,
Fmoc-L-Trp(Boc)-OH,
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-L-Asp (OtBu)OH).
Se escindió el péptido de la resina utilizando
TFA y se aisló utilizando técnicas habituales. Se obtuvo una
producción de péptido del 73%, y una pureza del producto (medida
mediante HPLC) de 91,8%.
Otros modos de realización de esta invención
serán evidentes para aquellos que trabajan en el ámbito en
consideración de esta especificación o a partir de la práctica de
la invención revelada aquí. Una persona que conozca bien este
ámbito podrá hacer varias omisiones, modificaciones y cambios a los
principios y modos de realización descritos aquí sin salirse del
verdadero ámbito y espíritu de esta invención que se indica mediante
las siguientes reivindicaciones. Todas las patentes, los documentos
de patente, y las publicaciones citadas aquí están incorporadas por
la presente mediante referencia, como si se hubieran incorporado
individualmente.
<110> F. Hoffmann-La Roche
AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proceso y sistemas para la síntesis
peptídica
\vskip0.400000\baselineskip
<130> caso 22367
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patente en versión 3.3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> enfuvirtida
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(36)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragmento de enfuvirtida
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (8)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragmento de enfuvirtida
1-15
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(15)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragmento de enfuvirtida
1-16
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(16)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragmento de enfuvirtida
1-18
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragmento de enfuvirtida
9-15
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (7)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragmento de enfuvirtida
9-16
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(8)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragmento de enfuvirtida
16-35
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragmento de enfuvirtida
16-36
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(21)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragmento de enfuvirtida
17-23
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(7)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragmento de enfuvirtida
17-26
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(10)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragmento de enfuvirtida
17-36
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragmento de enfuvirtida
19-35
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(17)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 13
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<210> 14
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<211> 18
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<223> sintético
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<220>
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<221> Fragmento de enfuvirtida
19-36
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<222> (1)..(18)
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<400> 14
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<210> 15
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<223> sintético
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<220>
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<221> Fragmento de enfuvirtida
24-35
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<222> (1)..(12)
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<400> 15
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<210> 16
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<223> sintético
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<220>
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<221> Fragmento de enfuvirtida
24-36
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<222> (1) .. (13)
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<400> 16
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<210> 17
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<223> sintético
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<220>
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<221> Fragmento de enfuvirtida
27-35
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<222> (1)..(9)
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<400> 17
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<210> 18
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> sintético
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<220>
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<221> Ertfuvirtide fragment
27-36
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<222> (1.)..(10)
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<400> 18
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<210> 19
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<211> 19
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> sintético
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<220>
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<221> Fragmento de enfuvirtida
17-35
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<222> (1)..(19)
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<400> 19
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Claims (8)
1. Un método para sintetizar de enfuvirtida o
fragmentos peptídicos de la misma, que comprenda los pasos de:
a. proporcionar una composición que comprenda un
fragmento peptídico, en la que el fragmento peptídico comprenda al
menos un residuo aminoacídico e incluya un grupo protector
N-terminal sensible a la base;
b. eliminación del grupo protector
N-terminal sensible a la base del fragmento
peptídico utilizando una la base como reactivo desprotector;
c. eliminación de la base de la composición para
proporcionar un contenido de bases residual de más de 100 pmm;
d. provocar que un fragmento peptídico reactivo
con un extremo C-terminal reactivo y un grupo
protector N-terminal sensible a la base reaccione
con la funcionalidad N-terminal desprotegida del
fragmento peptídico bajo, condiciones tales que el fragmento
peptídico reactivo se añada al fragmento peptídico; y
e. repetición opcional de los pasos (b) al (d)
hasta alcanzar el péptido deseado.
2. El método según la reivindicación 1 en el que
el grupo protector N-terminal sensible a la base es
un grupo protector Fmoc.
3. El método según la reivindicación 1 o 2 por
el que la la base es piperidina.
4. El método según la reivindicación 3 en el que
la piperidina se disuelve en un disolvente en una cantidad en el
intervalo de 5% a 10% en base al peso.
5. El método según la reivindicación 4 en el que
el disolvente es NMP.
6. El método según la reivindicación 1 en el que
el contenido de bases residual en la composición está en el rango
de 100 ppm a 10.000 pmm.
7. El método según las reivindicaciones 1 a 6 en
el que se sintetiza un péptido seleccionado a partir de NÚM. ID.
SEC.: 3, NÚM. ID. SEC.: 11 o a partir de NÚM. ID. SEC.: 17.
8. El método según las reivindicaciones 1 a 7 en
el que se aplican los métodos de síntesis en fase sólida o síntesis
en fase líquida para la síntesis peptídica.
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