ES2295174T3 - Metodo para determinar homocisteina total. - Google Patents
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Abstract
Un método para detectar o determinar homocisteína en una muestra, que comprende: (a) reducir la homocisteína de la muestra mediante un compuesto tiol, (b) hacer reaccionar la homocisteína reducida con una metiltransferasa y un donante de metilo, produciendo por ello homocisteína metilada, y (c) detectar o determinar el donante de metilo residual, la homocisteína metilada producida o un producto de reacción con enzima de la misma haciendo reaccionar el donante de metilo residual, la homocisteína metilada producida o un producto de reacción con enzima de la misma con una enzima que convierte D-aminoácido para producir un ácido oxo y/o amoníaco y detectar o determinar el ácido oxo y/o amoníaco producidos.
Description
Método para determinar homocisteína total.
La presente invención se refiere a un método
para determinar homocisteína total.
Se ha informado de que la homocisteína, que es
uno de los compuestos intermedios metabólicos en el metabolismo de
metionina, tiene citotoxicidad endotelial vascular y es uno de los
factores de riesgo para enfermedades arterioescleróticas
independiente de los otros factores de riesgo. También ha sido
evidente que, además de hiperhomocisteinemia grave (homocistinuria)
causada por deficiencia de enzimas metabólicas de homocisteína, una
hiperhomocisteinemia moderada es causada por una disminución de la
actividad de enzimas metabólicas debida a anormalidad de genes,
insuficiencia renal, envejecimiento, fumar, falta de ejercicio o
similares (Jacobsen, Clin. Chem. 44:8(B), 1998). Además,
también se ha informado de que la hiperhomocisteinemia se mejora
tomando vitamina B6, ácido fólico o similares (JAMA 270:693 (1993).
Por tanto, no sólo para examen de masa neonatal, sino también para
la prevención de enfermedades arterioscleróticas de adultos o la
detección de enfermedades por deficiencia de vitaminas, se demanda
un método simple para tratar un gran número de especímenes.
Buena parte de la homocisteína de la sangre
(99%) está presente en forma de compuestos disulfuro oxidados
(tales como complejo con proteína, homocistina,
cisteína-homocisteína) (Jacobsen, Clin. Chem.
44:8(B), 1998). La "homocisteína total" se refiere a la
cantidad total de homocisteínas oxidadas y reducidas y, en general,
es necesario convertir homocisteína de una muestra en homocisteína
reducida por un agente reductor con el fin de determinar la
homocisteína total.
Se emplean usualmente para determinar
homocisteína cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) e
inmunoensayo. Sin embargo, los aparatos de HPLC usados en
cromatografía líquida de alta eficacia no se usan comúnmente en el
ensayo clínico, y lleva tiempo, trabajo y coste hacer funcionar los
aparatos. En el inmunoensayo, aunque los aparatos estén
automatizados (Shipchandler, Clinj. Chem., 41, 7,
991-994, 1995), la determinación se realiza
combinando un procedimiento para convertir homocisteína en
S-adenosil-L-homocisteína
por una reacción de enzima y un procedimiento para detectarla por
un inmunoensayo, de modo que se requiere un aparato usado
exclusivamente para este propósito.
Se proponen métodos de determinación de
homocisteína basados en un inmunoensayo en la Publicación de Patente
Japonesa abierta a inspección por el público (Tokuhyo) Nº
9-512634 y (Tokkai) Nº 10-114797. En
el método descrito en la Publicación de Patente Japonesa abierta a
inspección por el público Nº 9-512634, se determina
inmunológicamente homocisteína modificando químicamente la
homocisteína para aumentar la antigenicidad, lo que requiere un gran
número de procedimientos y es complicado. La Publicación de Patente
Japonesa abierta a inspección por el público Nº
10-114797 describe un método para determinar
homocisteína, pero este método determina directamente sólo la
homocisteína unida a albúmina, y no determina la cantidad total de
homocisteína. En este método, sólo puede determinarse
aproximadamente el 70% de la homocisteína total.
Por otra parte, se describen métodos de
determinación bioquímica de homocisteína en la Patente japonesa Nº
2870704 y las Patentes de EE.UU. N^{os} 5998191 y 5885767. El
método descrito en la Patente Japonesa Nº 2870704 se caracteriza
por permitir a la homocisteína de una muestra que se ha tratado con
un agente reductor estar en contacto con adenosina y
S-adenosil-L-homocisteína
hidrolasa y evaluar la cantidad de adenosina en la mezcla residual.
Sin embargo, en este método, no se usa un inhibidor de la
S-adenosil-L-homocisteína
hidrolasa, y es necesario por tanto realizar la determinación en
modo cinético. Además, este método tiene el problema de que el
peróxido de hidrógeno producido no puede llevarse a un agente de
revelado del color oxidativo usado comúnmente en presencia de un
agente reductor que se usa para un procedimiento de reducción, que
es un procedimiento esencial para determinar la homocisteína total.
Por tanto, no puede usarse un aparato de análisis automático con
fines generales. Sin embargo, estas memorias descriptivas de
patentes no describen ningún método para evitar estos
problemas.
Los métodos descritos en la Publicación de
Patente Japonesa abierta a inspección por el público (Tokuhyo) Nº
2000-502262 y las Patentes de EE.UU. N^{os}
5998191 y 5885767 se caracterizan por hacer reaccionar homocisteína
con homocisteína desulfurasa, homocisteinasa o
metionina-\gamma-liasa para
detectar el sulfuro de hidrógeno, amoníaco o ácido
2-oxobutírico producidos. Sin embargo, estos métodos
tienen problemas tales como: requerir un gran número de
procedimientos; emplear un ion plomo, que es un metal pesado dañino,
para la detección de sulfuro de hidrógeno; y ser afectados por
cisteína y metionina, que son análogos estructurales a homocisteína
y están contenidos en una muestra biológica en una cantidad mayor
que la de homocisteína.
Así, los métodos convencionales para determinar
homocisteína tienen problemas tales como requerir un aparato
especial y una operación complicada y que tiene sensibilidad y
especificidad insuficientes, de manera que no se ha establecido aún
un método para determinar una concentración de trazas de
homocisteína rápidamente, simplemente y con alta sensibilidad.
Por tanto, el objeto de la presente invención es
proporcionar un método nuevo para determinar homocisteína contenida
en una muestra biológica o similar rápidamente, simplemente y con
alta sensibilidad, y un kit de uso en este método de
determinación.
Los inventores de la presente invención han
tenido éxito en detectar o determinar homocisteína haciendo
reaccionar el donante de metilo residual, la homocisteína metilada
producida o un producto de reacción con enzima de la misma con una
enzima que convierfte D-aminoácido para producir un
ácido oxo y/o amoníaco y detectando o determinando el ácido oxo y/o
amoníaco producidos. Con el método para determinar homocisteína de
la presente invención, puede detectarse y determinarse rápida y
simplemente homocisteína en una muestra biológica, en particular en
fluidos corporales tales como sangre y orina.
La presente invención se dirige a un método para
detectar o determinar homocisteína en una muestra que incluye:
(a) reducir la homocisteína de una muestra
mediante un compuesto tiol,
(b) hacer reaccionar la homocisteína reducida
con una metiltransferasa y un donante de metilo, produciendo por
ello una homocisteína metilada y
(c) detectar o determinar el donante de metilo
residual, la homocisteína metilada producida o un producto de
reacción con enzima de la misma haciendo reaccionar el donante de
metilo residual, la homocisteína metilada producida o un producto
de reacción con enzima de la misma con una enzima que convierte
D-aminoácido para producir un ácido oxo y/o
amoníaco y detectar o determinar el ácido oxo y/o amoníaco
producidos.
En una realización preferible, la
metiltransferasa es homocisteína metiltransferasa y el donante de
metilo es
D-metionina metil sulfonio.
D-metionina metil sulfonio.
En una realización más preferible, en la etapa
(c), la homocisteína metilada es D-metionina, y la
D-metionina se determina haciéndola reaccionar con
una enzima que convierte D-aminoácido.
En una realización más preferible, la enzima que
convierte D-aminoácido es
D-aminoácido oxidasa.
En una realización preferible, en la etapa (c),
el peróxido de hidrógeno producido por reacción con la
D-aminoácido oxidasa se detecta o determina por
revelado de color usando peroxidasa y un agente de revelado de color
oxidativo.
En una realización preferible, el reactivo SH es
un derivado de maleimida.
En otra realización preferible, en la etapa (c),
se detectan o determinan una disminución de NAD(P)H o
un aumento de NAD(P) haciendo reaccionar el ácido oxo y/o
amoníaco producidos con deshidrogenasa usando como coenzima
NAD(P)H.
En una realización preferible, en la etapa (c),
se detectan o determinan el ácido oxo y/o amoníaco producidos por
una reacción con la D-aminoácido oxidasa.
En una realización preferible, en la etapa (c),
se detectan o determinan una disminución de NAD(P)H o
un aumento de NAD(P) haciendo reaccionar el ácido oxo y/o
amoníaco producidos por una reacción con la
D-aminoácido oxidasa con deshidrogenasa usando como
coenzima NAD(P)H.
En una realización preferible, la deshidrogenasa
es leucina deshidrogenasa, y se detecta o determina una disminución
de NAD(P)H haciendo reaccionar el ácido oxo producido
con la leucina deshidrogenasa en presencia de amoníaco y
NAD(P)H.
En una realización preferible, la deshidrogenasa
es lactato deshidrogenasa, y se detecta o determina una disminución
de NAD(P)H haciendo reaccionar el ácido oxo producido
con la lactato deshidrogenasa en presencia de
NAD(P)H.
En una realización preferible, la deshidrogenasa
es glutamato deshidrogenasa, y se detecta o determina una
disminución de NAD(P)H haciendo reaccionar el amoníaco
producido con la glutamato deshidrogenasa en presencia de ácido
2-oxoglutárico y NAD(P)H.
En una realización más preferible, la
deshidrogenasa es lactato deshidrogenasa y glutamato deshidrogenasa,
y se detecta o determina una disminución de NAD(P)H
por una reacción con la lactato deshidrogenasa y la glutamato
deshidrogenasa en presencia de ácido 2-oxoglutárico
y NAD(P)H.
En una realización más preferible, las etapas
(a) y (b) se realizan al mismo tiempo.
\newpage
La presente invención se dirige también a un kit
de reactivos para determinación de homocisteína que comprende un
compuesto tiol, una metil transferasa que usa homocisteína como
aceptor de metilo, un donante de metilo y una enzima que convierte
D-aminoácido.
En una realización preferible, el kit incluye
además NAD(P)H, deshidrogenasa usando
NAD(P)H como coenzima y una sal de amonio o ácido
2-oxo como su cosustrato.
En una realización más preferible, la
deshidrogenasa es leucina deshidrogenasa, y el cosustrato de la
enzima es una sal de amonio.
En otra realización más preferible, la
deshidrogenasa es glutamato deshidrogenasa, y el cosustrato de la
enzima es un ácido 2-oxoglutárico.
En una realización preferible, la deshidrogenasa
es lactato deshidrogenasa.
En una realización preferible, la
metiltransferasa es homocisteína metiltransferasa, y el donante de
metilo es D-metionina metil sulfonio.
En una realización preferible, la enzima que
convierte D-aminoácido es
D-aminoácido oxidasa.
En una realización preferible, la
D-aminoácido oxidasa está contenida en un recipiente
distinto del compuesto tiol y la homocisteína metiltransferasa.
En una realización preferible, el reactivo SH es
un derivado de maleimida.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 es un diagrama esquemático de la
reacción cuando se usan homocisteína transferasa y
D-metionina metil sulfonio como enzima que convierte
homocisteína y cosustrato de homocisteína.
La Figura 2 es un gráfico que muestra el
transcurso del tiempo de reacción de
D-aminoácido oxidasa derivada de riñón de porcino
con respecto a D-metionina y
D-metionina metil sulfonio.
La Figura 3 es un gráfico que muestra el
transcurso del tiempo de reacción de D-aminoácido
oxidasa derivada de hongos con respecto a
D-metionina y D-metionina metil
sulfonio.
La Figura 4 es un gráfico que muestra los
efectos de un reactivo SH sobre un sistema de determinación de
D-metionina mediante el uso de un agente de revelado
del color oxidativo en presencia de un agente reductor.
La Figura 5 es un gráfico que muestra la
dependencia de la dosis cuando se usa como muestra un espécimen de
homocistina.
La Figura 6 es un gráfico que muestra la
absorbancia en cada caso cuando se usa un reactivo con
D-metionina metil sulfonio añadido y cuando se usa
un reactivo sin él al determinar homocisteína en una muestra de
suero.
La Figura 7 es un gráfico que muestra los
resultados de la determinación de homocisteína en una muestra de
suero usando un agente de revelado de color altamente sensible.
La Figura 8 es un gráfico que muestra la
correlación de los valores obtenidos determinando homocisteína en
una muestra de suero por el método de la presente invención (Método
I de MTasa) y por el método de HPLC convencional.
La Figura 9 es un gráfico que muestra la
dependencia de la dosis en un sistema de determinación de
D-metionina mediante el uso de
D-aminoácido oxidasa y leucina deshidrogenasa.
La Figura 10 es un gráfico que muestra la
dependencia de la dosis en un sistema de determinación de
homocisteína (el método de la presente invención: método II de
MTasa) mediante el uso de homocisteína metiltransferasa,
D-aminoácido oxidasa y leucina deshidrogenasa.
La Figura 11 es un gráfico que muestra la
dependencia de la dosis en un sistema de determinación de
homocisteína (el método de la presente invención: método II de
MTasa) mediante el uso de homocisteína metiltransferasa,
D-aminoácido oxidasa y glutamato deshidrogenasa.
La Figura 12 es un gráfico que muestra la
dependencia de la dosis en un sistema de determinación de ácido
4-metiltio-2-oxobutírico
mediante el uso de lactato deshidrogenasa.
El método de la presente invención se
caracteriza por hacer reaccionar homocisteína de una muestra con una
metiltransferasa en presencia de un donante de metilo, y determinar
después el derivado de D-aminoácido o análogo de
D-aminoácido producidos. Los ejemplos del donante de
metilo incluyen D-metionina metil sulfonio,
S-adenosil-D-metionina
y D-etionina metil sulfonio. Preferiblemente, puede
usarse D-metionina metil sulfonio.
Los principios de determinación de la presente
invención se describirán con referencia a la Figura 1, en la que se
usan una metiltransferasa y D-metionina metil
sulfonio como enzima que convierte homocisteína y cosustrato de
homocisteína.
Se describen ejemplos que emplean un reactivo SH
para determinar homocisteína en la Publicación de Patente Japonesa
abierta a inspección por el público (Tokuhyio) Nº
9-512634 y en la Patente de EE.UU. Nº 6020206. Como
se ha descrito antes, el primero es un método que incluye modificar
químicamente homocisteína para aumentar la inmunogenicidad y
detectarla inmunológicamente, y en el método se usa como modificador
un compuesto SH. El último es un método que incluye convertir
homocisteína en homocisteína tiolactona para proteger el grupo
tiol, separar otros compuestos que tengan un grupo tiol, tal como
cisteína contenida en la muestra, con un reactivo SH, abrir el
anillo de la tiolactona y determinar la homocisteína. Ambos métodos
tienen principios de determinación completamente diferentes de los
de la presente invención, y el reactivo SH se usa para un propósito
diferente del de la presente invención. Además, para determinar
ácidos grasos libres, hay algunos ejemplos en los que se usa un
reactivo SH para impedir que un cosustrato CoA interfiera con la
determinación usando un agente de revelado de color oxidativo
(Publicación de Patente Japonesa abierta a inspección por el
público (Tokkay) N^{os} 55-64800 y
57-8797). Sin embargo, la determinación se realiza
respecto a diferentes asuntos, de manera que no puede predecirse si
el reactivo SH es eficaz o no en la presente invención.
Los ejemplos del reactivo SH incluyen un agente
oxidante tal como el reactivo de Ellman, un agente formador de
mercaptida tal como ácido p-mercuribenzoico, y un
agente de alquilación tal como ácido yodoacético y
N-etilmaleimida, como se describe en Seikagakujiten
(Biochemical Dictionary) (tercera edición, pág. 182, Tokyo Kagaku
Dojin, 1998). Preferiblemente, se usa un agente de alquilación, más
preferiblemente un compuesto de maleimida y aún más preferiblemente
N-etilmaleimida.
Puede usarse cualquier muestra como muestra de
ensayo a someter al método de la presente invención, en tanto se
crea que contiene homocisteína. La homocisteína puede estar presente
en forma de no sólo homocisteína reducida, sino también
homocisteína oxidada que está unida a otra molécula por un enlace
disulfuro, tal como un complejo con proteína, un dímero de
homocisteína y un dímero de homocisteína-cisteína.
Por ejemplo, pueden usarse suero, plasma, sangre, orina y una
dilución de ellos.
El compuesto tiol usado en el método de la
presente invención no está limitado particularmente, e incluye, por
ejemplo, ditiotreitol, marcaptoetanol,
N-acetilcisteína, ditioeritritol y ácido
tioglicólico. Puede emplearse cualquier concentración como
concentración del compuesto tiol, en tanto en cuanto permita a
homocisteína oxidada convertirse en homocisteína reducida.
Preferiblemente, la concentración es 0,1 mM o más en términos de un
grupo tiol, y más preferiblemente 1 mM o más.
Principio de determinación cuando se usan una
metiltransferasa y D-metionina metil sulfonio
(método de metiltransferasa (al que se hace referencia en adelante
como Método de MTasa))
El principio de determinación del caso en el que
se utilizan una metiltransferasa usando homocisteína como aceptor
de metilo y D-metionina metil sulfonio, que es un
donante de metilo, se describirá con referencia a la Figura 1. En
otras palabras, en este caso, la homocisteína de una muestra se hace
reaccionar con una metiltransferasa y D-metionina
metil sulfonio, y se determina después la
D-metionina producida.
Puede usarse cualquier metiltransferasa, en
tanto en cuanto reaccione con D-metionina
metil sulfonio y L-homocisteína y catalice la
producción de D-metionina y
L-metionina. Los ejemplos de la metiltransferasa
incluyen homocisteína metiltransferasa [EC 2.1.1.10], ácido
5-metiltetrahidrofólico-homocisteína
S-metiltransferasa [EC 2.1.1.13], ácido
5-metiltetrahidropteroiltriglutámico-homocisteína
S-metiltransferasa [EC 2.1.1.14]. Preferiblemente,
puede usarse homocisteína metiltransferasa [EC 2.1.1.10]. El nombre
filogenético de homocisteína metiltransferasa es
S-adenosil-L-metionina:
L-homocisteína S-metiltransferasa, y
esta enzima produce L-metionina y
S-adenosil-L-homocisteína,
usando L-homocisteína, que es un aceptor de metilo,
y
S-adenosil-L-metionina,
que es un donante de metilo, como sustratos (Enzyme handbook,
Asakura Syoten, 1982). Además, S.K. Shapiro ha informado de que esta
enzima utiliza también
S-metil-L-metionina
(L-metionina metil sulfonio) o
S-adenosil-D-metionina
como donante de metilo (Biochim. Biophys. Acta, 29,
405-409, 1958).
Este informe confirmó también por los resultados
de experimentos de marcado con un radioisótopo que se produce
metionina por el grupo metilo de S-adenosilmetionina
transferido a homocisteína, y no por abrirse el enlace entre ribosa
y un átomo de azufre de S-adenosil metionina. Por
tanto, cuando se usa como donante de metilo
S-adenosil-L-metionina,
se producen L-metionina y
S-adenosil-L-homocisteína.
Cuando se usa como donante de metilo L-metionina
metil sulfonio, se producen dos moléculas de
L-metionina. Cuando se usa como donante de metilo
S-adenosil-D-metionina,
se producen L-metionina y
S-adenosil-D-homocisteína.
En todos los casos, se produce L-metionina, de modo
que puede determinarse cuantitativamente la cantidad de la
homocisteína determinando la L-metionina.
Sin embargo, en general, está contenida
L-metionina en una muestra biológica en una cantidad
mayor que la de homocisteína (de 3 a 5 veces mayor en plasma), de
modo que es necesario separar L-metionina
previamente de una manera que no afecte a homocisteína y determinar
específicamente la L-metionina que se produce por
una reacción de homocisteína metiltransferasa, que es una operación
complicada, y por tanto este método no es preferible. Por otra
parte, G. Grue-Sorensen et al. han informado
de que homocisteína metiltransferasa produce
D-metionina usando D-metionina metil
sulfonio como donante de metilo (J. Chem. Soc. Perkin Trans. I
1091-7 (1984)), aunque la especificidad es baja. Por
esta razón, en el método de la presente invención, que utiliza esta
reacción, se produce D-metionina, que no está
presente sustancialmente en una muestra biológica, y se determina
después la D-metionina para determinar
cuantitativamente homocisteína específicamente.
Puede usarse homocisteína metiltransferasa
derivada de cualquier fuente como homocisteína metiltransferasa
para la presente invención, siempre que se use
D-metionina metil sulfonio como donante de metilo.
Por ejemplo, pueden usarse enzimas derivadas de bacterias,
levaduras, ratas o similares.
No hay limitación particular con respecto al
método para determinar cuantitativamente
D-metionina, pero es preferible determinarla
enzimáticamente con una enzima que convierte
D-aminoácido. Más preferiblemente, se usa
D-aminoácido oxidasa [EC 1.4.3.3]. Los inventores de
la presente invención han hecho evidente inesperadamente que
D-metionina metil sulfonio, que es un
D-aminoácido, no puede servir sustancialmente como
sustrato de D-aminoácido oxidasa. Así, si la enzima
que convierte D-aminoácido no reacciona con
D-metionina metil sulfonio, o incluso aunque esta
enzima reaccione con él, si la enzima tiene una reactividad
suficientemente más baja que la que tiene con respecto a
D-metionina, la D-metionina
producida puede determinarse sin separar del sistema de reacción el
D-metionina metil sulfonio que permanece después de
la reacción con homocisteína metiltransferasa. Además de
D-aminoácido oxidasa, pueden usarse
D-aminoácido acetiltransferasa [EC 2.3.1.36],
D-aminoácido deshidrogenasa [EC 1.4.99.1] y
similares, que tienen propiedades similares (Figura 1).
Como se muestra en la Figura 1, cuando se hace
reaccionar D-metionina con
D-aminoácido oxidasa, se produce peróxido de
hidrógeno. Este peróxido de hidrógeno es llevado a un agente de
revelado de color oxidativo usado comúnmente en presencia de un
reactivo SH para ser determinado colorimétricamente. Además, cuando
se hace reaccionar D-metionina con
D-aminoácido acetiltransferasa, la coenzima A
producida se lleva a peróxido de hidrógeno por
acil-coenzima A sintetasa [EC 6.2.1.3] y pueden
determinarse cuantitativamente de la misma manera una
acil-coenzima A oxidasa [EC 1.3.3.6] y este peróxido
de hidrógeno.
Cuando se hace reaccionar
D-metionina con D-aminoácido oxidasa
o D-aminoácido deshidrogenasa, se producen amoníaco
y ácido
4-metiltio-2-oxobutírico.
La homocisteína puede determinarse cuantitativamente determinando
estos productos.
Puede determinarse cuantitativamente amoníaco
haciendo reaccionar el amoníaco con dinucleótido de nicotinamida
adenina reducido (NADH), fosfato de dinucleótido de nicotinamida
adenina reducido (NADPH) o derivados de ellos (a los que se hace
referencia en adelante como NAD(P)H en esta memoria
descriptiva), ácido 2-oxoglutárico y glutamato
deshidrogenasa ([EC 1.4.1.2], [EC 1.4.1.3] o [EC 1.4.1.4]) y
determinando una disminución de NAD(P)H midiendo el
cambio de absorbancia a 340 nm. Alternativamente, puede determinarse
un aumento de NAD, o NADP o derivados de ellos (a los que se hace
referencia en lo sucesivo como NAD(P) en esta memoria
descriptiva). Los ejemplos de los derivados de
NAD(P)H incluyen tio NAD(P)H y
dinucleótido de 3-acetilpiridina adenina (o fosfato
de dinucleótido de 3-acetilpiridina). Para la
determinación de amoníaco, además de la glutamato deshidrogenasa
como se ha descrito antes, puede usarse cualquier deshidrogenasa,
siempre que pueda catalizar una reacción de aminación reductora
utilizando amoníaco con NAD(P)H como coenzima. Por
ejemplo, pueden usarse leucina deshidrogenasa ([EC 1.4.1.9]),
alanina deshidrogenasa ([EC 1.4.1.1]), serina deshidrogenasa ([EC
1.4.1.7]), valina deshidrogenasa ([EC 1.4.1.8]) y glicina
deshidrogenasa ([EC 1.4.1.10]). Como cosustrato de estas
deshidrogenasas, puede usarse una sal de amonio, un ácido
2-oxo o similares. Los ejemplos del ácido
2-oxo incluyen ácido pirúvico, ácido
2-oxobutírico, ácido
2-oxoisocaproico, ácido
2-oxoisovalérico, ácido
2-oxovalérico, ácido 2-oxocaproico,
ácido glioxílico y ácido hidroxipirúvico, además de ácido
2-oxoglutárico como se ha descrito antes.
Puede determinarse cuantitativamente amoníaco
utilizando un reactivo de Nessler, un indicador de pH, un método de
electrodo u otros métodos.
Puede determinarse cuantitativamente ácido
4-metiltio-2-oxobutírico
haciendo reaccionar el ácido
4-metiltio-2-oxobutírico
con NADH, amoníaco y leucina deshidrogenasa [EC 1.4.1.9] y
determinando, por ejemplo, una disminución de NADH midiendo el
cambio de absorbancia a 340 nm como en el caso de amoníaco. Se sabe
que el ácido
4-metiltio-2-oxobutírico
sirve como sustrato de leucina deshidrogenasa (G. Livesey et
al. Methods in Enzymology, 166, 282-288, 1988).
Para la determinación de ácido
4-metiltio-2-oxobutírico,
además de la leucina deshidrogenasa como se ha descrito antes, puede
usarse cualquier deshidrogenasa, en tanto pueda reducir ácido
4-metiltio-2-oxobutírico.
Por ejemplo, puede usarse lactato deshidrogenasa ([EC
1.1.1.27]).
Se sabe que el método para llevar ácido
4-metiltio-2-oxobutírico
o amoníaco a un sistema empleado para determinación cuantitativa
por el cambio de absorbancia a 340 nm de NAD(P)H es
improbable que sea afectado por un agente reductor. Por tanto, no
hay necesidad de usar un reactivo SH (Ikeda et al.
Rinshokensa (Clinical test), 41, 989-993, 1997). Un
ejemplo para llevarlos a un sistema de determinación cuantitativa de
NAD(P)H en presencia de un agente reductor es un
método de determinación de creatina quinasa en sangre (Rinshokagaku
(Clinical Chemistry), 19, 189-208, 1990).
En el sistema de determinación en el que se
produce amoníaco o ácido
4-metiltio-2-oxobutírico
por D-aminoácido oxidasa, es posible separar
peróxido de hidrógeno, que es uno de los productos, mediante el uso
de catalasa para evitar su efecto.
El método de la presente invención puede
emplearse manualmente o por análisis automático. Por ejemplo, cuando
se usa un aparato de análisis automático convencional para un
sistema de dos reactivos, el método se divide en el primer
procedimiento de realización de la reacción de homocisteína
metiltransferasa y el segundo procedimiento de detección de
D-metionina, para determinar homocisteína en una
muestra biológica fácilmente.
En la determinación cuantitativa de homocisteína
por el método de la presente invención, la precisión depende del
D-aminoácido de la muestra, pero la cantidad de
D-aminoácido en una muestra biológica es muy
pequeña. Sin embargo, se ha informado de que la cantidad de
D-aminoácido puede aumentarse en cierta clase de
enfermedad. Por tanto, para evitar el efecto de
D-aminoácidos, la determinación se realiza con un
reactivo preparado de la misma manera excepto que no contiene
homocisteína metiltransferasa, y el resultado se sustrae del valor
obtenido por determinación en una muestra que contenga esta enzima,
de modo que puede determinarse con precisión la cantidad de
homocisteína.
Cuando se detecta la absorbancia de NADH, se
añade a una muestra primero un reactivo para una reacción reductora
y el segundo procedimiento para causar una reacción, y se añade a
ello después un reactivo que contenga homocisteína metiltransferasa
para el primer procedimiento para causar una reacción. Se obtiene
después la diferencia de la absorbancia al final de cada reacción,
lo que hace posible determinar cuantitativamente homocisteína sin
ningún efecto de sustancias endógenas tales como
D-aminoácido.
Además, la presente invención proporciona un kit
para determinar homocisteína en una muestra que comprende (a) un
compuesto tiol para reducir homocisteína, (b) una metiltransferasa
que usa homocisteína como aceptor de metilo y un donante de metilo
para reacción con la homocisteína reducida (primer procedimiento) y
(c) (i) un reactivo SH y un agente de revelado de color oxidativo o
(ii) deshidrogenasa usando NAD(P)H como coenzima y un
cosustrato o un agente de revelado de color según las propiedades de
la deshidrogenasa para determinar el donante de metilo residual o
la homocisteína metilada producida (segundo procedimiento). Con el
fin de realizar el procedimiento de reducción y el primer
procedimiento al mismo tiempo, pueden contenerse juntos (a) y (b).
En particular, cuando se usa (c) (ii), (a), (b) y (c) pueden
contenerse juntos.
Se modificó parcialmente el método de S.K.
Shapiro (Methods Enzymol., 17 Pt. B, 400-405, 1971)
para preparar una solución de enzima homocisteína metiltransferasa
de la siguiente manera.
Primero, se suspendieron 250 g de levadura de
panadero (fabricada por Oriental Yeast Co., Ltd.) en 125 ml de agua
destilada y se calentó a 37ºC, y se añadieron después a ello con
agitación 16,3 g de hidrógenocarbonato sódico y
44 ml de tolueno. La mezcla se incubó durante 90 minutos con agitación a 37ºC, y se añadió después a ello un volumen igual de agua destilada enfriada con hielo, y la mezcla se enfrió rápidamente. Esta solución se centrifugó a 7000 rpm durante 30 minutos. El sobrenadante se filtró a través de una toalla de papel y el filtrado se centrifugó adicionalmente a 9000 rpm durante 90 minutos, y se recogió el sobrenadante.
44 ml de tolueno. La mezcla se incubó durante 90 minutos con agitación a 37ºC, y se añadió después a ello un volumen igual de agua destilada enfriada con hielo, y la mezcla se enfrió rápidamente. Esta solución se centrifugó a 7000 rpm durante 30 minutos. El sobrenadante se filtró a través de una toalla de papel y el filtrado se centrifugó adicionalmente a 9000 rpm durante 90 minutos, y se recogió el sobrenadante.
Se añadió después L-metionina
con agitación bajo enfriamiento con hielo de tal modo que la
concentración final fue 0,5%, y se disolvió durante aproximadamente
60 minutos. La temperatura de la solución se mantuvo en 3ºC o
menos, y se añadió etanol enfriado a aproximadamente a -20ºC con un
caudal de 20 ml/min, con agitación. En el punto en que la
concentración de etanol alcanzó aproximadamente 25%, se inició el
enfriamiento disminuyendo la temperatura del baño de enfriamiento a
-10ºC o menos usando sal-hielo. Se añadió después
etanol de igual manera hasta que la concentración final alcanzó
53%, y se dejó después a la solución reposar a -20ºC durante 16
horas. Se centrifugó después la solución a 9000 rpm y -10ºC durante
60 minutos. Se recogió el sobrenadante y se añadió etanol en las
mismas condiciones hasta que la concentración final alcanzó 70%
mientras se enfriaba a -10ºC o menos usando
sal-hielo. Después de la adición, se dejó reposar la
solución durante una hora, y se centrifugó a 9000 rpm y -10ºC
durante 90 minutos.
El precipitado resultante se disolvió en
aproximadamente 7 ml de tampón de fosfato potásico 10 mM (pH 6,8).
La solución disuelta se dializó dos veces frente al mismo tampón, y
se concentró después hasta aproximadamente 1,5 ml con un
concentrador centrífugo (Centriprep-10 fabricado por
Amicon). Se obtuvo así una solución de enzima.
Se determinó después la actividad de
homocisteína metiltransferasa de la solución de enzima obtenida de
la siguiente manera. Primero, se mezclaron y dejaron reaccionar a
37ºC durante 2 horas tampón de fosfato 60 mM
(pH 7,4), 10% de la solución de enzima, ditiotreitol 1 mM, homocistina 0,2 mM (H-6010 fabricada por Sigma-Aldrich Corp.) y L-metionina metil sulfonio yodado (27794-0250 fabricado por Across) o D-metionina metil sulfonio bromado (29939-0010 fabricado por Across) 0,4 mM. Se manchó con la mezcla una placa de capa fina (placa para cromatografía de capa fina) en una cantidad de aproximadamente 8 \mul por cada mancha, y se reveló con etanol del 95%-amoníaco acuoso del 28% (77:23, v/v), y se realizó después el revelado de color por ninhidrina. Como resultado, se confirmó que en cualquier caso en que se usó como sustrato L-metionina metil sulfonio o D-metionina metil sulfonio, estaba contenida metionina en el producto de reacción. Por otra parte, se confirmó que cuando se separó del sistema de reacción homocisteína, que es un aceptor de metilo, no se produjo metionina.
(pH 7,4), 10% de la solución de enzima, ditiotreitol 1 mM, homocistina 0,2 mM (H-6010 fabricada por Sigma-Aldrich Corp.) y L-metionina metil sulfonio yodado (27794-0250 fabricado por Across) o D-metionina metil sulfonio bromado (29939-0010 fabricado por Across) 0,4 mM. Se manchó con la mezcla una placa de capa fina (placa para cromatografía de capa fina) en una cantidad de aproximadamente 8 \mul por cada mancha, y se reveló con etanol del 95%-amoníaco acuoso del 28% (77:23, v/v), y se realizó después el revelado de color por ninhidrina. Como resultado, se confirmó que en cualquier caso en que se usó como sustrato L-metionina metil sulfonio o D-metionina metil sulfonio, estaba contenida metionina en el producto de reacción. Por otra parte, se confirmó que cuando se separó del sistema de reacción homocisteína, que es un aceptor de metilo, no se produjo metionina.
Se confirmó por lo anterior que la solución de
enzima obtenida tiene actividad de homocisteína metiltransferasa, y
que esta solución de enzima puede utilizar no sólo
L-metionina metil sulfonio, sino también
D-metionina metil sulfonio como donante de
metilo.
Se determinó la reactividad de
D-aminoácido oxidasa derivada de riñón de porcino
con respecto a D-metionina y
D-metionina metil sulfonio usando un aparato de
análisis automático Hitachi 7170 de la siguiente manera. Primero,
se añadieron 200 \mul de un reactivo 1 que contenía tampón de
fosfato 92 mM (pH 7,4), 4-aminoantipirina 1,3 mM y
3,3 U/ml de peroxidasa a 10 \mul de una muestra que contenía
D-metionina 1,3 mM, y se dejó reaccionar a 37ºC
durante aproximadamente 5 minutos. Después, se añadieron a ello 50
\mul de una reactivo 2 que contenía tampón de fosfato 69 mM (pH
7,4), TOOS 5,2 mM, 2,6 U/ml de D-aminoácido oxidasa
derivada de riñón de porcino (fabricada por
Sigma-Aldrich Corp.) y dinucleótido de flavina
adenina (FAD) 2,6 mM, y se dejó reaccionar adicionalmente durante
aproximadamente 5 minutos a 37ºC. Se detectó el cambio de
absorbancia a una longitud de onda dominante de 546 nm y una
longitud de onda secundaria de 700 nm. Además, se determinaron de la
misma manera una muestra que contenía D-metionina
metil sulfonio bromado 1,3 mM y una muestra que contenía
D-metionina 1,3 mM y
D-metionina metil sulfonio bromado 1,3 mM. La Figura 2 muestra el transcurso del tiempo de reacción. La D-aminoácido oxidasa derivada de riñón de porcino reaccionó fuertemente con D-metionina metil sulfonio (\Delta), en comparación con D-metionina (\bullet). También se encontró que la reactividad con D-metionina no cambiaba incluso en presencia de D-metionina metil sulfonio (\ding{115}).
D-metionina metil sulfonio bromado 1,3 mM. La Figura 2 muestra el transcurso del tiempo de reacción. La D-aminoácido oxidasa derivada de riñón de porcino reaccionó fuertemente con D-metionina metil sulfonio (\Delta), en comparación con D-metionina (\bullet). También se encontró que la reactividad con D-metionina no cambiaba incluso en presencia de D-metionina metil sulfonio (\ding{115}).
La reactividad se determinó de la misma manera
que en el Ejemplo 2, excepto que se sustituyó
D-aminoácido oxidasa derivada de riñón de porcino
por D-aminoácido oxidasa derivada de hongos
(Fusarium, fabricado por Ikedatohka Kogyo). La Figura 3 muestra el
transcurso del tiempo de reacción. Era evidente que la
D-aminoácido oxidasa derivada de hongos reaccionaba
también fuertemente con D-metionina metil sulfonio
(\Delta), en comparación con D-metionina
(\bullet). Además, se encontró también que no cambió la
reactividad con D-metionina incluso en presencia
de D-metionina metil sulfonio (\ding{115}).
Efecto de N-etilmaleimida en un
sistema de determinación de D-metionina que emplea
un agente de revelado de color oxidativo en presencia de un agente
reductor
Seguidamente, se determinó
D-metionina usando un aparato de análisis automático
Hitachi 7170 de la siguiente manera. Primero, se añadieron 200
\mul de un reactivo 1 que contenía tampón de fosfato 100 mM (pH
7,4), TOOS
1 mM, y 0,05% de Triton X-100 a 20 \mul de D-metionina 0, 0,625, 0,125, 0,25, 0,5 o 1 mM que contenía ditiotreitol (DTT) 5 mM y se dejó reaccionar a 37ºC durante aproximadamente 5 minutos. Después, se añadieron a ello 50 \mul de una reactivo 2 que contenía tampón de fosfato 100 mM (pH 7,4), 4-aminoantipirina 4 mM, 1 U/ml de D-aminoácido oxidasa, 17,6 U/ml de peroxidasa, FAD 1 mM y 0,05% de Triton X-100 y se dejó reaccionar adicionalmente durante aproximadamente 5 minutos a 37ºC. Se midió el cambio de absorbancia (a una longitud de onda dominante de 546 nm y una longitud de onda secundaria de 700 nm) desde el punto de detección 16 a 34. Se preparó después un reactivo de la misma manera excepto que se añadió N-etilmaleimida (NEM) 2,8 mM al reactivo 1, y se realizó la determinación para el caso de la adición de NEM de la misma manera.
1 mM, y 0,05% de Triton X-100 a 20 \mul de D-metionina 0, 0,625, 0,125, 0,25, 0,5 o 1 mM que contenía ditiotreitol (DTT) 5 mM y se dejó reaccionar a 37ºC durante aproximadamente 5 minutos. Después, se añadieron a ello 50 \mul de una reactivo 2 que contenía tampón de fosfato 100 mM (pH 7,4), 4-aminoantipirina 4 mM, 1 U/ml de D-aminoácido oxidasa, 17,6 U/ml de peroxidasa, FAD 1 mM y 0,05% de Triton X-100 y se dejó reaccionar adicionalmente durante aproximadamente 5 minutos a 37ºC. Se midió el cambio de absorbancia (a una longitud de onda dominante de 546 nm y una longitud de onda secundaria de 700 nm) desde el punto de detección 16 a 34. Se preparó después un reactivo de la misma manera excepto que se añadió N-etilmaleimida (NEM) 2,8 mM al reactivo 1, y se realizó la determinación para el caso de la adición de NEM de la misma manera.
Como se muestra en la Figura 4, cuando se
realizó la determinación mediante el uso del reactivo sin NEM
(\circ), no se detectó en absoluto D-metionina
por el ditiotreitol contenido en la muestra. Por otra parte, cuando
se realizó la determinación mediante el uso del reactivo con NEM
(\bullet), se reconoció una dependencia de la dosis lineal y se
encontró que puede determinarse la D-metionina.
Se hicieron reaccionar primero a 37ºC durante 90
minutos homocistina 0, 100 o 200 \muM (0, 200 o 400 \muM en
términos de homocisteína, respectivamente), tampón de fosfato 86 mM
(pH 7,4), 10% de la solución de enzima, ditiotreitol 4 mM y
D-metionina metil sulfonio bromado 1,5 mM.
La cantidad de la D-metionina en
la mezcla de reacción se determinó usando un aparato de análisis
automático Hitachi 7170 de la siguiente manera. Primero, se
añadieron 200 \mul de un reactivo 1 que contenía tampón de
fosfato
100 mM (pH 7,4), TOOS 1 mM y N-etilmaleimida (NEM) 1,7 mM a 30 \mul de la muestra (mezcla de reacción) y se dejó reaccionar a 37ºC durante aproximadamente 5 minutos. Después, se añadieron a ello 50 \mul de una reactivo 2 que contenía tampón de fosfato 100 mM (pH 7,4), 4-aminoantipirina 4 mM, 1 U/ml de D-aminoácido oxidasa, 17,6 U/ml de peroxidasa y FAD 0,2 mM, y se dejó reaccionar adicionalmente durante aproximadamente 5 minutos a 37ºC. Se midió el cambio de absorbancia (a una longitud de onda dominante de 546 nm y una longitud de onda secundaria de 700 nm) desde el punto de detección 16 a 34. Los resultados se muestran en la Figura 5 con la concentración de homocistina en el eje horizontal y el cambio de absorbancia (x 10000) en el eje vertical.
100 mM (pH 7,4), TOOS 1 mM y N-etilmaleimida (NEM) 1,7 mM a 30 \mul de la muestra (mezcla de reacción) y se dejó reaccionar a 37ºC durante aproximadamente 5 minutos. Después, se añadieron a ello 50 \mul de una reactivo 2 que contenía tampón de fosfato 100 mM (pH 7,4), 4-aminoantipirina 4 mM, 1 U/ml de D-aminoácido oxidasa, 17,6 U/ml de peroxidasa y FAD 0,2 mM, y se dejó reaccionar adicionalmente durante aproximadamente 5 minutos a 37ºC. Se midió el cambio de absorbancia (a una longitud de onda dominante de 546 nm y una longitud de onda secundaria de 700 nm) desde el punto de detección 16 a 34. Los resultados se muestran en la Figura 5 con la concentración de homocistina en el eje horizontal y el cambio de absorbancia (x 10000) en el eje vertical.
Como se ve en la Figura 5, el cambio de
absorbancia aumenta dependiendo de la dosis de homocistina
(\bullet). Por otra parte, cuando no se añadió
D-metionina metil sulfonio (\Delta) y cuando no se
añadió la enzima (\Box), no se vio la dependencia de la
dosis.
Primero, se añadieron 50 \mul de una solución
de tratamiento que contenía tampón de fosfato 50 mM (pH 7,4), 30%
de la solución de enzima, ditiotreitol 15 mM y
D-metionina metil sulfonio bromado 3 mM a 100
\mul de una muestra en la que se añadió homocistina 0, 10, 20,
30, 40 o 50 \muM (0 a 100 \muM en términos de homocisteína) a
suero testigo normal SERACLEAT HE (AZWELL Inc.) mezclado con ella, y
se dejó reaccionar a 37ºC durante 90 minutos.
La cantidad de la D-metionina en
la mezcla de reacción se determinó usando un aparato de análisis
automático Hitachi 7170 de la siguiente manera. Primero, se
añadieron 200 \mul de un reactivo 1 que contenía tampón de
fosfato
100 mM (pH 7,4), TOOS 1 mM, NEM 2,8 mM y 0,05% de Triton X-100 a 20 \mul de la muestra (mezcla de reacción) y se dejó reaccionar a 37ºC durante aproximadamente 5 minutos. Después, se añadieron a ello 50 \mul de una reactivo 2 que contenía tampón de fosfato 100 mM (pH 7,4), 4-aminoantipirina 4 mM, 1 U/ml de D-aminoácido oxidasa, 17,6 U/ml de peroxidasa, FAD 1 mM y 0,05% de Triton X-100, y se dejó reaccionar adicionalmente durante aproximadamente 5 minutos a 37ºC. Se midió el cambio de absorbancia (a una longitud de onda dominante de 546 nm y una longitud de onda secundaria de 700 nm) desde el punto de detección 16 a 34. Los resultados se muestran en la Figura 6 con la concentración de homocistina añadida en el eje horizontal y diferencias de absorbancia en el eje vertical, en la que se obtuvieron las diferencias sustrayendo el cambio de absorbancia (x 10000) en la muestra sin homocistina del cambio de absorbancia (x 10000) en cada muestra.
100 mM (pH 7,4), TOOS 1 mM, NEM 2,8 mM y 0,05% de Triton X-100 a 20 \mul de la muestra (mezcla de reacción) y se dejó reaccionar a 37ºC durante aproximadamente 5 minutos. Después, se añadieron a ello 50 \mul de una reactivo 2 que contenía tampón de fosfato 100 mM (pH 7,4), 4-aminoantipirina 4 mM, 1 U/ml de D-aminoácido oxidasa, 17,6 U/ml de peroxidasa, FAD 1 mM y 0,05% de Triton X-100, y se dejó reaccionar adicionalmente durante aproximadamente 5 minutos a 37ºC. Se midió el cambio de absorbancia (a una longitud de onda dominante de 546 nm y una longitud de onda secundaria de 700 nm) desde el punto de detección 16 a 34. Los resultados se muestran en la Figura 6 con la concentración de homocistina añadida en el eje horizontal y diferencias de absorbancia en el eje vertical, en la que se obtuvieron las diferencias sustrayendo el cambio de absorbancia (x 10000) en la muestra sin homocistina del cambio de absorbancia (x 10000) en cada muestra.
Como se ve en la Figura 6, se encontró también
en la muestra de suero (\bullet) la dependencia de la dosis de la
cantidad de la homocistina añadida. Por otra parte, cuando no se
añadió D-metionina metil sulfonio (\circ), no se
encontró tal dependencia. Los resultados descritos antes hacen
evidente que puede determinarse cuantitativamente la cantidad de la
homocisteína en la muestra.
La determinación se realizó exactamente de la
misma manera que en el Ejemplo 6, excepto que se sustituyó un
sistema de TOOS y 4-aminoantipirina como agente de
revelado de color para determinación cuantitativa de
D-metionina por TPM-PS, que es un
agente de revelado de color altamente sensible. Más específicamente,
se usaron para determinación un reactivo obtenido separando TOOS del
reactivo 1 para determinación cuantitativa de
D-metionina, y un reactivo obtenido separando 4-aminoantipirina del reactivo 2 y añadiendo en su lugar TMP-PS 2 mM. Como se muestra en la Figura 7, la determinación mediante el uso de TMP-PS puede realizarse con mayor sensibilidad que la determinación mediante el uso del sistema de TOOS y 4-aminoantipirina.
D-metionina, y un reactivo obtenido separando 4-aminoantipirina del reactivo 2 y añadiendo en su lugar TMP-PS 2 mM. Como se muestra en la Figura 7, la determinación mediante el uso de TMP-PS puede realizarse con mayor sensibilidad que la determinación mediante el uso del sistema de TOOS y 4-aminoantipirina.
Para 35 muestras de suero, se determinó
homocisteína por el método I de MTasa. Se usó una solución salina
como reactivo en blanco y se usó como patrón una solución salina que
contenía homocisteína 50 \muM. Se añadieron primero a 100 \mul
de una muestra 50 \mul de tampón de fosfato 35 mM (pH 7,0) que
contenía 9,6 U/l de homocisteína metiltransferasa, DTT 15 mM,
D-metionina metil sulfonio bromado 1,5 mM y bromuro
de zinc 0,5 mM, y se dejó reaccionar a 37ºC durante 90 minutos. Debe
indicarse que 1 U de homocisteína metiltransferasa es la cantidad
de enzima que cataliza la síntesis de D-metionina en
una cantidad de 1 \mumol por minuto cuando se usa como donante de
metilo D-metionina metil sulfonio y se usa como
aceptor de metilo homocisteína. La misma muestra se hizo reaccionar
de igual forma con un reactivo que no contenía homocisteína
metiltransferasa. Se añadieron después a ello 150 \mul de una
solución que contenía NEM 18 mM para detener la reacción. La
cantidad de la D-metionina en la mezcla de reacción
se determinó usando un aparato de análisis automático Hitachi 7170
de la siguiente manera. Primero, se añadieron 150 \mul de tampón
de fosfato 96 mM (pH 7,0) que contenía TOOS 0,48 mM a 30 \mul de
la mezcla de reacción y se dejó reaccionar a 37ºC durante
aproximadamente 5 minutos. Después se añadieron a ello 100 \mul
de tampón de fosfato 90 mM (pH 7,0) que contenía
4-aminoantipirina 0,7 mM, 1,4 U/ml de
D-aminoácido oxidasa, 4,4 U/ml de peroxidasa y FAD 1
mM, y se deó reaccionar adicionalmente durante aproximadamente 5
minutos a 37ºC. Se midió el cambio de absorbancia (a una longitud de
onda dominante de 546 nm y una longitud de onda secundaria de 700
nm) desde el punto de detección 16 a 34. La cantidad de la
homocisteína en la muestra se calculó usando un valor obtenido
sustrayendo el cambio de absorbancia en el reactivo sin
homocisteína metiltransferasa (muestra en blanco) del cambio de
absorbancia en el reactivo con esta enzima.
Por otra parte, se determinó la homocisteína en
la misma muestra por el método de HPLC (transferido a SRL Inc.).
Los resultados se muestran en la Figura 8 con el
valor obtenido por el método de HPLC en el eje horizontal y el
valor obtenido por el método de la presente invención (Método I de
MTasa) en el eje vertical. Como se ve en la Figura 8, se obtiene
una correlación muy satisfactoria, y puede determinarse con
precisión la homocisteína en las muestras por el método de la
presente invención.
La D-metionina se determinó
usando un aparato de análisis automático Hitachi 7170 de la
siguiente manera. Primero, se añadieron 180 \mul de un reactivo 1
que contenía TAPS (ácido
N-tris(hidroximetil)metil-3-aminopropanosulfónico;
fabricado por Dojin Kagaku Kenkyusho) 50 mM (pH 8,5), cloruro
amónico (fabricado por Nakarai)
990 mM, 3,4 U/ml de leucina deshidrogenasa (fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 32 U/ml de catalasa (fabricada por Roche) y NADH (fabricado por Oriental Yeast Co., Ltd.) 0,16 mM a 30 \mul de una muestra que contenía D-metionina 0, 25, 50, 100, 200 o 400 \muM en una solución salina (0,9% de NaCl) y se dejó reaccionar a 37ºC durante aproximadamente 5 minutos. Después, se añadieron a ello 40 \mul de un reactivo 2 que contenía TAPS 50 mM (pH 8,5), cloruro amónico 990 mM, 5 U/ml de D-aminoácido oxidasa (derivada de riñón de porcino, fabricada por Kikkoman) y 0,1 mg/ml de FAD, y se dejó reaccionar adicionalmente durante aproximadamente 5 minutos a 37ºC. Se midió el cambio de absorbancia (a una longitud de onda dominante de 340 nm y una longitud de onda secundaria de 405 nm) de NADH a partir del punto de detección 16 a 34. A continuación, se preparó un reactivo exactamente de la misma manera excepto que se añadió DTT 10 mM al reactivo 1, y se realizó de igual manera la determinación mediante el uso de DTT.
990 mM, 3,4 U/ml de leucina deshidrogenasa (fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 32 U/ml de catalasa (fabricada por Roche) y NADH (fabricado por Oriental Yeast Co., Ltd.) 0,16 mM a 30 \mul de una muestra que contenía D-metionina 0, 25, 50, 100, 200 o 400 \muM en una solución salina (0,9% de NaCl) y se dejó reaccionar a 37ºC durante aproximadamente 5 minutos. Después, se añadieron a ello 40 \mul de un reactivo 2 que contenía TAPS 50 mM (pH 8,5), cloruro amónico 990 mM, 5 U/ml de D-aminoácido oxidasa (derivada de riñón de porcino, fabricada por Kikkoman) y 0,1 mg/ml de FAD, y se dejó reaccionar adicionalmente durante aproximadamente 5 minutos a 37ºC. Se midió el cambio de absorbancia (a una longitud de onda dominante de 340 nm y una longitud de onda secundaria de 405 nm) de NADH a partir del punto de detección 16 a 34. A continuación, se preparó un reactivo exactamente de la misma manera excepto que se añadió DTT 10 mM al reactivo 1, y se realizó de igual manera la determinación mediante el uso de DTT.
Los resultados se muestran en la Figura 9, con
la concentración de D-metionina en el eje horizontal
y el cambio de absorbancia a 340 nm (longitud de onda secundaria de
405 nm) en el eje vertical.
Como se ve en la Figura 9, cuando no se añadió
DTT (\Delta), se observó en este sistema de determinación el
cambio de absorbancia lineal dependiente de la dosis de
D-metionina, de modo que la
D-metionina puede determinarse cuantitativamente.
Cuando se añadió DTT (\circ), la determinación de
D-metionina no se afectó por DTT.
Se determinó homocisteína mediante el uso de un
aparato de análisis automático Hitachi 7170 de la siguiente manera.
Primero, se añadieron 180 \mul de un reactivo 1 que contenía TAPS
50 mM (pH 8,5), cloruro amónico 990 mM, DTT 10 mM, 0,5 U/ml de
homocisteína metiltransferasa (derivada de levadura, obtenida de
Ozeki), D-metionina metil sulfonio bromado 0,6 mM,
5 U/ml de leucina deshidrogenasa (fabricada por Wako Pure Chemical
Industries, Ltd.),
32 U/ml de catalasa y NADH 0,16 mM a 30 \mul de una muestra que contenía homocistina 0, 12,5, 25, 50 o 100 \muM (0, 25, 50, 100 o 200 \muM en términos de homocisteína) en una solución salina (0,9% de NaCl) y se dejó reaccionar a 37ºC durante aproximadamente 5 minutos. Se añadieron después a ello 40 \mul de un reactivo 2 que contenía TAPS
50 mM (pH 8,5), cloruro amónico 990 mM, 7,5 U/ml de D-aminoácido oxidasa (fabricada por Kikkoman) y
0,1 mg/ml de FAD y se dejó reaccionar adicionalmente durante aproximadamente 5 minutos a 37ºC. Se midió el cambio de absorbancia (a una longitud de onda dominante de 340 nm y una longitud de onda secundaria de 405 nm) en NADH desde el punto de detección 16 a 34. A continuación, se realizó la determinación exactamente de la misma manera que antes excepto que se usó como muestra una muestra en la que se añadió homocistina 0, 12,5, 25, 50
100 \muM a un suero testigo normal SERACLEAR HE.
32 U/ml de catalasa y NADH 0,16 mM a 30 \mul de una muestra que contenía homocistina 0, 12,5, 25, 50 o 100 \muM (0, 25, 50, 100 o 200 \muM en términos de homocisteína) en una solución salina (0,9% de NaCl) y se dejó reaccionar a 37ºC durante aproximadamente 5 minutos. Se añadieron después a ello 40 \mul de un reactivo 2 que contenía TAPS
50 mM (pH 8,5), cloruro amónico 990 mM, 7,5 U/ml de D-aminoácido oxidasa (fabricada por Kikkoman) y
0,1 mg/ml de FAD y se dejó reaccionar adicionalmente durante aproximadamente 5 minutos a 37ºC. Se midió el cambio de absorbancia (a una longitud de onda dominante de 340 nm y una longitud de onda secundaria de 405 nm) en NADH desde el punto de detección 16 a 34. A continuación, se realizó la determinación exactamente de la misma manera que antes excepto que se usó como muestra una muestra en la que se añadió homocistina 0, 12,5, 25, 50
100 \muM a un suero testigo normal SERACLEAR HE.
Los resultados se muestran en la Figura 10, con
la concentración de la homocisteína añadida en el eje horizontal y
el cambio de absorbancia a 340 nm (longitud de onda secundaria de
405 nm) en el eje vertical.
Como se ve en la Figura 10, en ambos casos del
espécimen de homocisteína (\bullet) y la muestra de suero
(\ding{115}), puede verse que el cambio de absorbancia depende de
la dosis de la homocisteína añadida, de manera que es evidente que
también en este sistema de determinación, la homocisteína puede
determinarse cuantitativamente.
Se determinó homocisteína mediante el uso de un
aparato de análisis automático Hitachi 7170 de la siguiente manera.
Primero, se añadieron 180 \mul de un reactivo 1 que contenía
tampón de Tris 100 mM (pH 8,0), DTT
10 mM, D-metionina metil sulfonio bromado 0,6 mM, 2 U/ml de D-aminoácido oxidasa (fabricada por Kikkoman), 0,03 mg/ml de FAD, 32 U/ml de catalasa, 8 U/ml de glutamato deshidrogenasa (fabricada por Toyobo Co., Ltd.), ácido 2-oxoglutárico (fabricado por Nakarai) 8 mM y NADH 0,16 mM a 30 \mul de una muestra que contenía homocistina 0, 12,5, 25, 50 o 100 \muM (0, 25, 50, 100 o 200 \muM en términos de homocisteína) en una solución salina (0,9% de NaCl) y se dejó reaccionar a 37ºC durante aproximadamente 5 minutos. Se añadieron después a ello 40 \mul de un reactivo 2 que contenía tampón de Tris 100 mM (pH 8,0), y 2,1 U/ml de homocisteína metiltransferasa (derivada de levadura, obtenida de Ozeki) y se dejó reaccionar adicionalmente durante aproximadamente 5 minutos a 37ºC. Se midió el cambio de absorbancia (a una longitud de onda dominante de 340 nm y una longitud de onda secundaria de 405 nm) en NADH desde el punto de detección 16 a 34. A continuación, se realizó la determinación de la misma manera que antes excepto que se usó como muestra una muestra en la que se añadió homocistina 0, 12,5, 25, 50 o 100 \muM a un suero testigo normal SERACLEAR HE.
10 mM, D-metionina metil sulfonio bromado 0,6 mM, 2 U/ml de D-aminoácido oxidasa (fabricada por Kikkoman), 0,03 mg/ml de FAD, 32 U/ml de catalasa, 8 U/ml de glutamato deshidrogenasa (fabricada por Toyobo Co., Ltd.), ácido 2-oxoglutárico (fabricado por Nakarai) 8 mM y NADH 0,16 mM a 30 \mul de una muestra que contenía homocistina 0, 12,5, 25, 50 o 100 \muM (0, 25, 50, 100 o 200 \muM en términos de homocisteína) en una solución salina (0,9% de NaCl) y se dejó reaccionar a 37ºC durante aproximadamente 5 minutos. Se añadieron después a ello 40 \mul de un reactivo 2 que contenía tampón de Tris 100 mM (pH 8,0), y 2,1 U/ml de homocisteína metiltransferasa (derivada de levadura, obtenida de Ozeki) y se dejó reaccionar adicionalmente durante aproximadamente 5 minutos a 37ºC. Se midió el cambio de absorbancia (a una longitud de onda dominante de 340 nm y una longitud de onda secundaria de 405 nm) en NADH desde el punto de detección 16 a 34. A continuación, se realizó la determinación de la misma manera que antes excepto que se usó como muestra una muestra en la que se añadió homocistina 0, 12,5, 25, 50 o 100 \muM a un suero testigo normal SERACLEAR HE.
Los resultados se muestran en la Figura 11, con
la concentración de la homocisteína añadida en el eje horizontal y
el cambio de absorbancia a 340 nm (longitud de onda secundaria de
405 nm) en el eje vertical.
Como se ve en la Figura 11, en ambos casos del
espécimen de homocisteína (\bullet) y la muestra de suero
(\ding{115}), puede verse que el cambio de absorbancia depende de
la dosis de la homocisteína añadida. Es evidente que también en
este sistema de determinación, la homocisteína puede determinarse
cuantitativamente.
Se determinó ácido
4-metiltio-2-oxobutírico
mediante el uso de un aparato de análisis automático Hitachi 7170
de la siguiente manera. Primero, se añadieron 180 \mul de un
reactivo 1 que contenía tampón de fosfato 200 mM
(pH 7,0) y NADH 0,16 mM a 30 \mul de una muestra que contenía ácido 4-metiltio-2-oxobutírico 0, 50, 100, 200 o 400 \muM en una solución salina (0,9% de NaCl) y se dejó reaccionar a 37ºC durante aproximadamente 5 minutos. Se añadieron después a ello 40 \mul de un reactivo 2 que contenía tampón de fosfato 200 mM (pH 7,0), y 65 U/ml de lactato deshidrogenasa (derivada de corazón de porcino, fabricada por Oriental Yeast) y se dejó reaccionar adicionalmente durante aproximadamente 5 minutos a 37ºC. Se midió el cambio de absorbancia (a una longitud de onda dominante de 340 nm y una longitud de onda secundaria de 405 nm) en NADH desde el punto de detección 16 a 34.
(pH 7,0) y NADH 0,16 mM a 30 \mul de una muestra que contenía ácido 4-metiltio-2-oxobutírico 0, 50, 100, 200 o 400 \muM en una solución salina (0,9% de NaCl) y se dejó reaccionar a 37ºC durante aproximadamente 5 minutos. Se añadieron después a ello 40 \mul de un reactivo 2 que contenía tampón de fosfato 200 mM (pH 7,0), y 65 U/ml de lactato deshidrogenasa (derivada de corazón de porcino, fabricada por Oriental Yeast) y se dejó reaccionar adicionalmente durante aproximadamente 5 minutos a 37ºC. Se midió el cambio de absorbancia (a una longitud de onda dominante de 340 nm y una longitud de onda secundaria de 405 nm) en NADH desde el punto de detección 16 a 34.
Los resultados se muestran en la Figura 12, con
la concentración de ácido
4-metiltio-2-oxobutírico
en el eje horizontal y el cambio de absorbancia a 340 nm (longitud
de onda secundaria de 405 nm) en el eje vertical.
Como se ve en la Figura 12, puede verse que el
cambio de absorbancia depende de la dosis del ácido
4-metiltio-2-oxobutírico,
de modo que es evidente que la lactato deshidrogenasa usa como
sustrato ácido
4-metiltio-2-oxobutírico,
y también en este sistema de determinación en el que se usa la
lactato deshidrogenasa en lugar de la leucina deshidrogenasa y la
glutamato deshidrogenasa de los Ejemplos 10 y 11, puede determinarse
cuantitativamente homocisteína.
La presente invención permite detectarse y
determinarse cuantitativamente rápida y simplemente y con alta
sensibilidad homocisteína de una muestra biológica, en particular de
fluidos corporales tales como sangre y orina.
Claims (9)
1. Un método para detectar o determinar
homocisteína en una muestra, que comprende:
(a) reducir la homocisteína de la muestra
mediante un compuesto tiol,
(b) hacer reaccionar la homocisteína reducida
con una metiltransferasa y un donante de metilo, produciendo por
ello homocisteína metilada, y
(c) detectar o determinar el donante de metilo
residual, la homocisteína metilada producida o un producto de
reacción con enzima de la misma haciendo reaccionar el donante de
metilo residual, la homocisteína metilada producida o un producto
de reacción con enzima de la misma con una enzima que convierte
D-aminoácido para producir un ácido oxo y/o
amoníaco y detectar o determinar el ácido oxo y/o amoníaco
producidos.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
la metiltransferasa es homocisteína metiltransferasa y el donante
de metilo es D-metionina metil sulfonio.
3. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en
el que la enzima que convierte D-aminoácido es
D-aminoácido oxidasa.
4. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que, en la etapa (c), el peróxido de
hidrógeno producido se detecta o determina por revelado de color
usando peroxidasa y un agente de revelado de color oxidativo.
5. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que, en la etapa (c), se detecta o
determina una disminución de NAD(P)H o un aumento de
NAD(P) haciendo reaccionar el ácido oxo y/o amoníaco
producidos con deshidrogenasa usando NAD(P)H como
coenzima.
6. Un kit de reactivos para determinación de
homocisteína que comprende un compuesto tiol, una metiltransferasa
que usa homocisteína como aceptor de metilo, un donante de metilo y
una enzima que convierte D-aminoácido.
7. El kit de la reivindicación 6, que comprende
además NAD(P)H, deshidrogenasa usando
NAD(P)H como coenzima y una sal de amonio o ácido
2-oxo como su cosustrato.
8. El kit de la reivindicación 6, en el que la
metiltransferasa es homocisteína metiltransferasa, y el donante de
metilo es D-metionina metil sulfonio.
9. El kit de una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, en el que la enzima que convierte
D-aminoácido es D-aminoácido
oxidasa.
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