ES2294793T3 - Induccion de tolerancia inmunologica a un anticuerpo terapeutico usando variantes de dicho anticuerpo terapeutico. - Google Patents
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Abstract
Esta invención se refiere a un anticuerpo que es una versión modificada de un anticuerpo terapéutico con afinidad por un antígeno de superficie celular, teniendo el citado anticuerpo una afinidad reducida por el antígeno en comparación con el anticuerpo terapéutico como resultado de una modificación o modificaciones en la molécula de anticuerpo, siendo capaz el anticuerpo de inducir tolerancia inmunológica frente al anticuerpo terapéutico. La invención comprende también un procedimiento de inducción de tolerancia inmunológica frente a un anticuerpo terapéutico que comprende administrar a un paciente un anticuerpo que es una versión modificada del anticuerpo terapéutico y que tiene una afinidad reducida por el antígeno, en comparación con el anticuerpo terapéutico.
Description
Inducción de tolerancia inmunológica a un
anticuerpo terapéutico usando variantes de dicho anticuerpo
terapéutico.
Esta invención se refiere al uso de anticuerpos
modificados para inducir tolerancia inmunológica en seres humanos o
animales.
Los anticuerpos, o inmunoglobulinas, comprenden
dos cadenas pesadas conjuntamente unidas mediante enlaces de
disulfuro y dos cadenas ligeras, en que cada cadena ligera está
unida a una respectiva cadena pesada mediante enlaces de disulfuro.
Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable seguido
de un cierto número de dominios constantes. Cada cadena ligera
tiene un dominio variable en un extremo y un dominio constante en
su otro extremo, en que el dominio variable de cadena ligera esta
alineado con el dominio variable de la cadena pesada y el dominio
constantes de cadena ligera alineado con el primer dominio constante
de la cadena pesada. Los dominios constantes en las cadenas ligeras
y pesadas no están directamente involucrados en la unión del
anticuerpo al antígeno.
Los dominios variables de cada par de cadenas
ligera y pesada forman el sitio de unión al antígeno. Los dominios
variables de las cadenas ligera y pesada tienen la misma estructura
general; cada dominio comprende cuatro regiones de entramado, cuyas
secuencias están relativamente conservadas, conectadas mediante tres
regiones determinantes complementarias (CDRs). Las CDRs están
mantenidas en una estrecha proximidad por medio de las regiones de
entramado. Las CDRs de dominios variables de cadenas ligera y pesada
adyacentes contribuyen conjuntamente a la formación del sitio de
unión al antígeno.
Los anticuerpos dirigidos a antígenos
específicamente escogido han sido usados en el tratamiento de
diversos estados. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales (mAb)
Campath-1 han sido usados satisfactoriamente para
inducir remisiones en asientos de linfoma y leucemia y para el
tratamiento de artritis reumatoide y vasculitis. El antígeno diana
CD52 (también denominado CDw52; véase, por ejemplo, Xia et
al, 1991) es una glicoproteína anclada a GPI de linfocitos y
monocitos (y partes del sistema reproductor masculino). Tiene una
secuencia de péptidos excepcionalmente cortos de 12 aminoácidos y
un único oligosacárido complejo unido a N en Asn3 (Hale et
al. 1990; Xia et al. 1991). El CD52 es una buena diana
para la destrucción mediada por anticuerpos y, por lo tanto, es una
molécula de superficie celular eficaz para diversos regímenes
terapéuticos en lo que es un objetivo la reducción de linfocitos
(por ejemplo, la supresión de células de médula ósea donante para
evitar la enfermedad de injerto frente a hospedante, tratamiento de
leucemia y linfoma e inmuno-supresión).
Diversos mAb de Campath-1 CD52
anti-humanos de rata fueron generados mediante
fusión de la línea de mieloma de rata Y3 con células de bazo de una
rata inmunizada con linfocitos T humanos (Hale et al, 1983).
Aunque la eficacia clínica de mAb de Campath-1 de
rata ha sido demostrada de forma regular, muchos pacientes mostraron
una respuesta anti-anticuerpos (antiglobulina)
frente a la proteína xenogénica que evitaba un nuevo tratamiento
con el anticuerpo terapéutico. La terapia de anticuerpos es a menudo
limitada por la respuesta antiglobulina. El componente
anti-idiotípico (anti-Id; dirigido
contra las regiones Ab V y en particular el sitio de combinación de
Ab) inhibe la unión del Ab a su diana, mientras que el componente
tanto anti-Id como el anti-isotípico
dirigido contra las regiones constantes) actúan para acelerar la
desaparición de anticuerpos. Una preocupación principal es el
efecto neutralizante de la respuesta antiglobulina. En general, como
con las respuestas antiglobulina, las respuestas
anti-Id interfieren con la potencia clínica de un Ab
terapéutico formando agregados de Ab que desaparecen rápidamente de
la circulación, reduciendo la posibilidad de una interacción con
antígeno diana. Desgraciadamente, la mayoría de los sueros
antiglobulinas contienen anticuerpos anti-Ib. Esto
ha sido demostrado para un cierto número de mAb terapéuticos y es
especialmente apreciado después de tratamientos repetidos.
Para reducir la inmunogenicidad del anticuerpo
de Campath-1 IgG2b de rata, YTH34-5,
los fragmentos de genes que codifican el VL y VH fueron humanizados
mediante "injertado en CDR" de las regiones hiperavariables de
roedores en regiones de entramado humanas (Jones et al. 1986;
Reichmann et al. 1988). Esto se llevo a cabo escindiendo las
secuencias de CDR que codifican el anticuerpo de
Campath-1 de rata en la cadena principal del
entramado humano que codifica secuencias proporcionada por las
proteínas de mieloma cristalográficamente resueltas NEW (para el
VH) y REI (para el VL). La proteína resultante tenía un título bajo
unión a antígenos y la modelación de la región V humanizada mostró
que el residuo 27 en la secuencia del entramado de VH era crítica
para conservar la estructura de bucle de CDR1. Este residuo fue
alterado desde el residuo encontrado en NEW (Ser) nuevamente hasta
el residuo de rata Phe que dio lugar a la restauración de la unión a
antígenos. Durante la modelación fue sugerido también un cambio
adicional (residuo NEW Ser para el residuo Thr de rata). Sin
embargo, en ensayos funcionales está sustitución no tuvo ningún
efecto sobre la unión a antígenos, pero el mutante doble (Ser27
para Phe27 y Ser30 para Thr30) expresó la mayoría de las proteínas
y, por lo tanto, fue usado para producir Ab
Campath-1 humanizado terapéutico, denominado
Campath-1 (Reichmann et al, 1988, documento
EP 0.308.404). Como muchos entramados de VH humano tienen una
treonina en la posición 30, este cambio no fue considerado un
riesgo adicional para la inmunogenicidad del anticuerpo.
Seguidamente los VL y los VH humanizados fueron genéticamente
fusionados con regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada,
respectivamente. En resumen, el anticuerpo de
Campath-1 humanizado consiste en residuos humanos en
todas las posiciones excepto las que codifican las 3 CDRs de la
cadena ligera, las 3 CDRs de la cadena pesada y los residuos Phe27 y
Thr30 en el VH de la cadena pesada.
En ensayos clínicos, la versión humanizada
(Campath-1H) se encontró que era mucho menos
inmunogénica que el anticuerpo de Campath-1 IgG2b
de rata. La humanización reduce la inmunogenicidad de mAb de
roedores, aunque tanto el idiotipo como el alotipo de mAb
humanizados pueden ser todavía dianas para respuesta humorales. La
sensibilización para el idiotipo ha sido documentada de hecho en
algunos receptores de alotipos coincidentes de
Campath-1H (Isaacs et al, 1992; Lockwood
et al, 1993). Estas respuestas fueron puestas de manifiesto
por la presencia de anti-Id en sueros de pacientes.
Un paciente género anti-Id de título elevado que
tubo una reacción cruzada en el panel completo de mAb CD52.
Una estrategia para reducir adicionalmente la
inmunogenicidad de Campath-1 puede ser injertar
nuevamente los 6 bucles de CDR en regiones de entramado de líneas
germinales humanas bien caracterizadas. La mayoría de las regiones
V humanizadas hasta ahora usadas reagruparon genes V como secuencia
de entramado aceptora. Este fue el caso para
Campath-1H cuando fueron usadas secuencias de
entramado de proteínas de mieloma para proporcionar secuencias
aceptoras de VH y VL. Los genes de V reagrupados contienen a menudo
mutaciones somáticas, adquiridas durante el procedimiento de
maduración de la afinidad. Esto será único para el individuo del que
derivan los genes reagrupados y, por lo tanto, puede ser
considerado como ajeno en otro individuo. Sin embargo hay una
posibilidad de que un nuevo injerto pueda introducir nuevos epitopos
idiotípicos, formados por las regiones de unión que abarcan
residuos de CDR y residuos de entramados nuevos. Además de ello la
humanización sola puede que no resuelva el problema de respuestas
anti-Id, por que la población humana es de razas
distintas y es improbable que todos los pacientes sean tolerantes a
un mAb humanizado dado. Incluso en regiones constantes de
anticuerpos, hay un cierto número de alelos diferentes que portan
marcadores alotípicos para los que pueden ser demostradas
respuestas antiglobulinas que se producen de forma natural. El
problema es más complejo para segmentos de la región de V, que
muestran un mayor grado de variación tanto en alotipo como en
haplotipo en comparación con las regiones constantes.
Otra aproximación es inducir tolerancia a los
péptidos potencialmente ajenos contenidos en la región V de
Campath-1H. Se conoce que la respuesta antiglobulina
es en sí misma una respuesta de células B que es dependiente de CD4
+ células T. Isaacs y Waldmann (1994) demostraron que ratones
desprovistos de células CD4+ T eran incapaces de responder a mAb de
unión celular ajenas (mAb CD8 anti-ratón de rata. El
agotamiento de células CD4+T se llevó a cabo mediante timectomía
adulta combinada con la administración de un mAb CD4 de
agotamiento.
En estos ratones, se midió la respuesta a mAb o
SRBC posteriormente administrados. Los ratones deficientes en
células CD4+T no consiguieron hacer una respuesta antiglobulina o
una respuesta anti-SRBC demostrando que la
respuesta anti-Ig, como la respuesta SRBC, es
clásicamente dependiente de células CD4+T. Con el fin de generar
ayuda de células T y conseguir la respuesta apropiada de células T,
el Ab administrado debe ser tratado como un antígeno de proteína y
presentado presumiblemente en el contexto de una molécula de clase
II de MHC, por una célula adecuada presentadora de antígeno. Por lo
tanto pueden ser adoptadas dos estrategias principales para
disminuir la inmunogenicidad de una región V humanizada. (1) Se
puede "silenciar" la molécula de anticuerpo en sí misma
adoptando estrategias para eliminar cualesquiera epitopos helper T
potenciales o (2) se pueden presentar todos los epitopos helper H
potenciales de una manera que induzca tolerancia en lugar de
reactividad para esos epitopos.
a) En teoría, debe ser posible silenciar el
anticuerpo en sí mismo en forma que el sistema inmune no reconozca
determinantes ajenos. Esto sería posible si se pudieran explorar las
secuencias de aminoácidos de VL y VH en cuanto a restos que puedan
unirse a moléculas de clase II de MHC. Si se pudieran identificar
así residuo(s) clave(s) en un péptido de clase II
potencial que no estuviera(s) involucrado(s) en la
especifidad o afinidad de anticuerpos, entonces podría(n)
ser alterados mediante mutagénesis dirigida al sitio para
residuo(s) que no permitan una asociación con moléculas de
clase II. Los péptidos helper T no son al azar, y cualquier proteína
tiene solamente un número limitado de péptidos capaces de unirse a
moléculas de clase II de MHC y también a receptores de antígenos de
células T. Sin embargo, esto no es posible en la actualidad por que
los péptidos de unión de clase II todavía no están caracterizados
hasta un grado suficiente como para ser identificados explorando
secuencia de proteínas. Esto es debido en parte a la naturaleza
heterogénea de los péptidos de clase II. Los péptidos tratados de
forma natural aislados a partir de moléculas de clase II de MHC son
generalmente de tamaño mayor, de longitud variable y tienen ambos
extremos irregulares en las terminaciones de C y N en comparación
con péptidos tratados aislados a partir de moléculas de clase I de
MHC. Mientras que los péptidos derivados de la clase I son
mayoritariamente de longitud uniforme de 8-9
residuos de aminoácidos, los péptidos asociados a la clase II de
MCH varían en el intervalo de 12-24 aminoácidos
(Rudensky et al, 1991; Hunt et al, 1992; Rudensky y
Janeway, 1993). Los péptidos derivados de la clase I tienen restos
de secuencias con residuos de anclaje específico en ciertas
posiciones que permiten que sus cadenas laterales se ajusten en los
embolsamientos de unión de los entrantes de unión al péptido, y el
entrante de unión al péptido está cerrado en ambos extremos. Por el
contrario, los péptidos de clase II están unidos en una conformación
extendida que sobresale de ambos extremos de un anclaje de unión a
antígeno de "extremos abiertos"; un embolsamiento no polar
sobresaliente en el que una cadena lateral de péptido de anclaje es
ajustada cerca de un extremo anclaje de unión (Brown et al,
1993).
b) Otras estrategias que pueden ser adoptadas
para "silenciar" el anticuerpo si se pudieran predecir los
restos de unión a péptido de clase II. Por ejemplo, se podría
incluir una inserción de sitio escisión de proteasa en cualquier
epitopo de clase II potencial para aumentar la posibilidad de
degradación del péptido antes de que pudiera ser presentado en el
contexto de la clase II. Alternativamente, la inserción de restos en
una región V como repeticiones de Gly-Ala puede
inhibir la degradación de la región V en péptidos que se podrían
asociar con moléculas de clase II. En un sistema, se mostró que las
repeticiones Gly-Ala de EBNA1 generaba una señal
inhibidora de actuación en cis que interfería con el tratamiento del
antígeno durante la presentación restringida a la clase I de MHC,
de forma que era inhibido el reconocimiento de CTL (Levitskaya et
al, 1995). Aunque cualquiera de estas aproximaciones puede
resultar algo alentadora en el futuro, nuevamente se basan en la
predicción de péptidos de clase II de MHC a partir de secuencias de
proteínas de regiones VL y VH humanizadas y, por lo tanto están
limitadas por el conocimiento insuficiente relativo a los restos de
consenso para péptidos de clase II.
En lugar de un conocimiento suficiente relativo
a los restos de péptidos de clase II, se ha dirigido la atención
hacia la inducción de tolerancia a anticuerpos terapéuticos. En
1986, Benjamin et al y Cobbold et al describieron una
propiedad inesperada de mAb de unión celular: mientras era posible
inducir una tolerancia a la región Fc (tolerancia
anti-isotipo), el isotipo permanecía antigénico bajo
condiciones equivalentes. Además de ello, era relativamente fácil
inducir una tolerancia a mAb que no son de unión celular, pero los
mAb de unión celular se encontró que eran muy inmunogénicos.
Isacss y Waldmann (1994) en un estudio
preliminar usaron unos derivados de "moléculas mixtas" que no
eran de unión celular de un Ab de una unión celular para inducir
una tolerancia a la forma de tipo salvaje. El anticuerpo de unión
celular era un mAb anti-CD8 en un modelo de ratón.
Los derivados que no eran de unión celular fueron preparados
emparejando las cadenas L y H relevantes con una cadena H o L
irrelevante, respectivamente. La cadena H relevante emparejada con
una cadena L irrelevante fue obtenida limitando la clonación por
dilución del hibridoma original que estaba expresando una cadena
ligera de mieloma (a partir del asociado de fusión Y3), así como
las cadenas H y L anti-CD8 específicas. Se obtuvo
una variante del hibridoma que expresaba la cadena L de mieloma y
la cadena H anti-CD8 específica pero no la cadena L
anti-CD8. Se obtuvo también de está manera un clon
que expresaba solamente la cadena L relevante. Ese clon fue
seguidamente fusionado a un hibridoma que expresaba una especifidad
irrelevante (CD3 anti-humano) y se selecciono una
variante que expresaba la cadena L anti-CD8
relevante con la cadena H anti-CD3 irrelevante. Como
las proteínas son tratadas en forma de péptidos antes de la
preparación de células T, los péptidos helper a partir de cadenas H
y L específicas para antígenos "serían observados" por células
T independientemente de su cadena asociada. Sin embargo, en este
caso, no hubo ninguna ventaja en la inducción de tolerancia usando
derivados de moléculas mixtas que no eran de unión celular mAb
terapéuticos in vivo, en comparación con un testigo de
isotipos coincidentes, sugiriendo que en la cepa de los ratones
usados, la mayoría (o la totalidad) de los epitopos helper estaban
ubicados en la región constante.
En la práctica, el uso de estas "moléculas
mixtas" de cadenas de inmunoglobulinas específicas para antígenos
e irrelevantes para una terapia humana no sería factible porque las
cadenas H y L irrelevantes portarían ellas mismas algunos epitopos
helper, complicando así la capacidad para conseguir una tolerancia
para las cadenas H y L relevantes. Tampoco se podría esperar
conseguir una tolerancia para esas células B que "observan" los
determinantes idiotípicos formados por la combinación de las
cadenas H y L relevantes del anticuerpo.
El Campath-1 es un mAb de unión
celular, y un tolerogen eficaz para ser usado con el mismo, de
manera que una forma que no es de unión celular del mAb terapéutico
sería por tanto ventajosa. Esto mismo es válido para otros
anticuerpos terapéuticos que tienen propiedades de unión celular, y
sus variantes que no son de unión celular.
Por lo tanto la invención proporciona el uso de
(i) un anticuerpo como se especifica en la reivindicación 1 que es
una versión modificada de un anticuerpo terapéutico, en el que el
anticuerpo terapéutico tiene afinidad por un antígeno de superficie
celular en que dicho anticuerpo tiene una afinidad reducida por el
antígeno en comparación con el anticuerpo terapéutica como
consecuencia de una modificación o de modificaciones de la molécula
del anticuerpo, en que el anticuerpo comprende al menos un epitopo
también presente en el anticuerpo terapéutico, que induce una
respuesta inmune en el paciente pretendido, para la elaboración de
un medicamento para inducir una tolerancia inmunológica al
anticuerpo terapéutico.
Preferentemente, la afinidad del anticuerpo
modificado por el antígeno es reducida a 50% o menos de la afinidad
del anticuerpo terapéutico por el antígeno. Más preferentemente, la
afinidad es reducida a 10% o menos o a 1% o menos de la afinidad
del anticuerpo terapéutico. La afinidad es necesario que sea
suficientemente reducida para permitir que el anticuerpo según la
invención actué como un tolerogen con respecto al anticuerpo
terapéutico. La expresión "variante que no es de unión
celular" es usada en la presente memoria descriptiva para hacer
referencia a anticuerpos según la invención, aunque los anticuerpos
según la invención pueden tener todavía alguna afinidad de unión
por el antígeno de superficie celular.
La capacidad del anticuerpo modificado para
inducir una tolerancia inmunológica a un anticuerpo de unión celular
terapéutico se basa en la presencia en el anticuerpo que no es de
unión celular de al menos de un epitopo también presente en el
anticuerpo terapéutico, que induce una respuesta inmune en el
paciente pretendido.
El anticuerpo que no es de unión celular es
preferentemente capaz de inducir una tolerancia a repuestas
anti-idiotípicas, al menos para las regiones
hipervariables de dominios V del anticuerpo terapéutico y
preferentemente también a las regiones de entramado. Por tanto, es
deseable que anticuerpo que induce una tolerancia tenga una
secuencia de aminoácidos similar al anticuerpo terapéutico en esas
regiones. Preferentemente, hay una identidad de secuencias de
aminoácidos >90% o >95% o >99% entre los dominios variables
del anticuerpo que no es de unión celular y el anticuerpo
terapéutico. Lo más preferentemente, las diferencias están
restringidas a cualquier sustitución(es)
de aminoácidos necesaria(s) para reducir suficientemente la afinidad de unión a antígenos en el anticuerpo que no es de unión celular.
de aminoácidos necesaria(s) para reducir suficientemente la afinidad de unión a antígenos en el anticuerpo que no es de unión celular.
También, preferentemente el anticuerpo que no es
de unión celular es capaz de inducir una tolerancia a las regiones
constantes del anticuerpo terapéutico. Por tanto, los dominios
constantes del anticuerpo que no es de unión celular son similares
a los del anticuerpo terapéutico teniendo una identidad de secuencia
de aminoácidos >90% o >95% o >99%. Lo más preferentemente,
los dominios constantes del anticuerpo que no es de unión celular y
el anticuerpo terapéutico son iguales y, por tanto, son
alotípicamente coincidentes.
La descripción emplea adicionalmente fragmentos
de un anticuerpo descrito en la presente memoria descriptiva,
teniendo los fragmentos una capacidad inductora de tolerancia. Estos
fragmentos incluyen fragmentos monovalentes y divalentes como los
fragmentos Fab, Fab' y F(ab\cdot)_{2}. También
están incluidos anticuerpos de cadenas únicas. Las características
preferidas de estos fragmentos son como se describe en la presente
memoria descriptiva en relación con anticuerpos que no son de unión
celular según la invención. Los fragmentos que no son de unión
celular pueden ser para ser usados con los correspondientes
fragmentos de anticuerpos terapéuticos, o con moléculas de
anticuerpos terapéuticos.
La afinidad de unión reducida de los anticuerpos
que no son de unión celular puede ser conseguida mediante una
diversidad de formas. En la realización preferida descrita en la
presente memoria descriptiva, una alteración en las CDRs que
comprende una o dos sustituciones más de aminoácidos reduce la
afinidad de unión. Alternativamente, las sustituciones de
aminoácidos en otras partes de la molécula del anticuerpo pueden ser
usadas para reducir la afinidad de unión. Por ejemplo, las
sustituciones de aminoácidos en las regiones de entramado se conoce
que afectan significativamente a ala afinidad de unión (Reichmann
et al, 1998). Otra alternativa que esta fuera del alcance de
la invención como se define en las reivindicaciones anejas es una
forma monovalente del anticuerpo terapéutico. Los anticuerpos
monovalentes tienen una afinidad de unión reducida en comparación
con sus equivalentes bivalentes. Las formas monovalentes pueden ser,
por ejemplo, fragmentos Fab o anticuerpos de cadena única o
cualesquiera otros fragmentos de anticuerpos tratados por ingeniería
genética que retengan un único sitio de unión. Las variantes
monovalentes pueden ser producidas también mutando el residuo de
cisteína que participa en la formación de disulfuros
(H-H) entre cadenas (por ejemplo, cys \rightarrow
ser o cys \rightarrow ala). La reducción de la afinidad de unión
de un anticuerpo monovalente en comparación con su equivalente
bivalente puede ser suficiente para hacer posible la inducción de
tolerancia. Preferentemente, el anticuerpo monovalente es incapaz
de unir receptores Fc, o incapaz de unir el componente
complementario C1q, o ambos. Cualquiera o ambas de estas
propiedades puede ser inducidas mediante mutaciones adecuadas
(véase, por ejemplo, Morgan et al. documento WO 94/29351,
publicado el 22 de diciembre de 1944 y Winter et al.
documento EP 0.037.434 B1).
Por tanto, los anticuerpos que no son de unión
celular pueden ser uno de una diversidad de tipos de anticuerpos
que incluye anticuerpos tratados por ingeniería genética. Además,
los anticuerpos serán generalmente de una mezcla de orígenes. Por
ejemplo, pueden ser quiméricos, por ejemplo, regiones constantes
humanas con dominios variables de rata; o humanizados o injertados
por CDR o reconformados de algún otro modo (véase, por ejemplo
Cabilly et al., patente de EE.UU nº 4.816.567; Cabilly et
al., patente Europea nº 0.125.023 B1; Boss et al.,
patente EE.UU nº 4.816.397; Boss et al., patente Europea nº
0.120.694 B1; Neuberger, M.S. et al., documento WO86/1533;
Neuberger, M.S. et al., patente Europea nº 0.194.276 B1;
Winter, patente de EE.UU nº 5.225.539, Winter patente Europea nº
0.239.400 B1; Queen el al., EE.UU. nº 5.585.089; Queem et
al., patente Europea nº 0.451.216 B1, Adair et al.,
documento WO 91/09967, publicado el 11 de julio de 1991, Adair et
al., patente Europea nº 0.460.167 B1; y Padlan, E:A: et
al., patente Europea No. 0.519.596 A1. Véase también Newman, R.
et al., Biotechnology, 10:1455-1460
(1992), publicación relativa a un anticuerpo primatizado y Huston
et al. patente EE.UU. nº 5.091.513; Huston et al.
patente EE.UU. nº 5.132.405; Ladner et al., patente de EE.UU.
nº 4.946.778 y Bird, R. E. et al., Science, 242:
423-426 (1998) relativas a anticuerpos de cadenas
únicas). El Campath-1H es considerado humanizado
aunque contiene dos sustituciones de aminoácidos en las regiones de
entramado.
De forma ideal, el anticuerpo modificado es tan
próximo como sea posible al anticuerpo terapéutico en el que está
basado. La administración de un "mutante mínimo" antes de la
inyección del mAb terapéutico de unión celular puede ser usada para
hacer tolerantes todos los epitopos de células T y la mayoría de B
en el mAb terapéutico. Experimentos clásicos indican que la
tolerancia es mantenida más eficazmente por las células T que por
las células B. Pero como la mayoría de las respuestas de células B
que incluyen la respuesta anti-Id requieren la
ayuda de células T incluso si una célula B es sensible a un antígeno
dado, la producción de anticuerpos será determinada por el estado
de sensibilidad de las T (Chiller et al. 1971). Por tanto,
será preferible usar una variante que no es unión celular que
contenga las mínimas diferencias necesarias para reducir su
afinidad por el antígeno de superficie celular de forma suficiente
para hacer posible que sea usado como un tolerogen. Usando técnicas
como cristalografía de rayos X, modelación por ordenador y
mutagénesis dirigida al sitio, y también métodos genéticos como
exhibición de fagos, será posible diseñar variantes adecuadas que
no son de unión celular para cualquier anticuerpo terapéutico de
unión celular.
El anticuerpo modificado está preferentemente en
forma biológicamente pura, y está deseablemente exento en al menos
95% (en peso) de otros materiales biológicos.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
la expresión "antígeno de superficie celular" significa un
antígeno que se encuentra en las superficies de células, pero no
necesariamente de forma exclusiva en las superficies de
células.
La expresión "anticuerpo terapéutico" es
usada en la presente memoria descriptiva para hacer referencia a un
anticuerpo que puede ser administrado a seres humanos o animales
para que tenga un efecto deseado, en particular, en el tratamiento
de una enfermedad. Estos anticuerpos terapéuticos serán generalmente
anticuerpos monoclonales y generalmente habrán sido tratados por
ingeniería genética.
En las figuras anejas:
La Figura 1 muestra los constructos de mutantes
mínimos de cadena pesada de Campath-1H preparados
como se describe en los ejemplos.
La Figura 2 muestra la estrategia de mutagénesis
por PCR para preparar los constructos mutantes de la Figura 1.
La Figura 3 muestra pGEM9zf que contiene una
cadena pesada de Campath-1H de tipo salvaje y una
sustitución de fragmentos mutantes en la cadena pesada.
La Figura 4 muestra una representación
esquemática de una realización de un anticuerpo terapéutico
monovalente que no es de unión celular.
En una realización para producir una variante
que no es de unión celular de un mAb terapéutico, son identificados
residuos de aminoácidos que están involucrados en la unión al
antígeno diana. En relación al número de residuos que comprende los
dominios de VL y VH los que están directamente involucrados en
interacciones con el antígeno son de número pequeño (Novotny et
al, 1983). Aunque el sitio de combinación de Ab está constituido
por 6 bucles hipervariables, 1 ó 2 de estos bucles pueden dominar
en esa interacción. Si un residuo o residuos claves pueden ser
identificados, puede(n) ser cambiado(s) mediante
mutagénesis dirigida al sitio a un residuo que reducirá (reducirá o
eliminará) la unión al antígeno. Como estos residuos se encontraran
lo más probablemente en las estructuras de bucles hipervariables y
no en la secuencia de entramado que soporta esos bucles, los cambios
pequeños puede que no rompan significativamente la estructura
global del Ab.
Como las regiones constantes y regiones
variables de Ab son muy similares en secuencias y estructuras, los
principios generales relativos a la estructura de Ab han sido
definidos usando relativamente pocas estructuras cristalinas
resueltas. Hasta la fecha, han sido incluidas aproximadamente 50
estructuras de fragmentos de Ab en el banco de datos Brokhaven
Protein Data Bank, y de estos, un 20% han sido refinados hasta una
resolución de 2,0 angstroms o mejor. A medida que aumenta la base
de conocimiento estructural, se hace más fiable la modelación
comparativa de Ab modelación por homología, ya que hay una mayor
elección de plantillas estructurales. Pueden ser combinadas
regiones variables (VL o VH) de estructuras de Ab diferentes como
una plantilla estructural después de superponer sus residuos más
conservados. Seguidamente son modeladas las conformaciones de las
cadenas laterales de residuos ocultados. Los bucles de CDR son
moderados mediante la identificación de plantillas de bucles
estructuralmente similares (a menudo bucles con la misma longitud y
una secuencia similar tienen conformaciones similares de la cadena
principal). Estas secuencias de CDR caen a menudo en forma de restos
de bucles canónicos (excluyendo H3, entre un 50 y un 95% de VL
(kappa) y VH tienen secuencias de bucles congruentes con los restos
canónicos clasificados). Las cadenas principales de los bucles
canónicos pueden ser seguidamente escindidas en el modelo del
entramado y las conformaciones de las cadenas laterales de CDR
pueden ser modeladas basándose en las conformaciones de los
residuos encontrados en las correspondientes posiciones en otros
bucles de la misma estructura canónica. Finalmente, el modelo es a
menudo refinado usando programas de ordenador que minimizan las
restricciones estereoquímicas conflictivas.
La construcción de modelos comparativos está
resultando ampliamente usada a medida que aumenta el tamaño de las
bases de datos estructurales, proporcionando una mayor gama de
plantillas estructurales. También, la mayor gama de programas
ordenador disponible asegura que los modelos están resultando
crecientemente exactos. Por ejemplo, la estructura cristalina
resuelta de Campath-1H era muy próxima a la
estructura prevista por modelación molecular. Se podría predecir a
partir de los datos de modelación que las mutaciones 1 y 2 descritas
en los ejemplos es probable que tuvieran un efecto perjudicial
sobre la unión a CD52. La estructura cristalina confirmó estas
predicciones y predijo también que la mutación 3 podría romper la
unión a CD52.
Obviamente para crear una versión que no es de
unión celular de un Ab terapéutico, es deseable comenzar con una
estructura cristalina resuelta, preferentemente
co-cristalizada con un antígeno que forma que el (o
los) residuo(s)
de contacto clave pueda(n) ser identificado(s) y sustituir a los residuo(s) que destruye(n) la unión al antígeno. Sin embargo, en muchos caso, un buen modelo molecular podría proporcionar la información necesaria. En los casos en que el modelo molecular es de escasa calidad (por ejemplo, si las plantillas estructurales apropiadas no existen en el banco de datos), los experimentos de intercambio de CDR (como se describe en los ejemplos) proporcionarán información sobre qué CDRs deben ser dirigidos a diana para la mutación. La metagénesis de exploración de alanina (mutando cada residuo secuencialmente a Ala) a través de esas regiones podría identificar el (o los) residuo(s) clave(s)
involucrado(s) en la unión al antígeno (Cunningham y Wells, 1989). Si cambia un único residuo a Ala reducido pero no destruye la unión, esa posición podría ser dirigida a diana para mutaciones más drásticas (por ejemplo, una sustitución que fuera creada en una diferencia de carga) para reducir adicionalmente la unión, si se desea.
de contacto clave pueda(n) ser identificado(s) y sustituir a los residuo(s) que destruye(n) la unión al antígeno. Sin embargo, en muchos caso, un buen modelo molecular podría proporcionar la información necesaria. En los casos en que el modelo molecular es de escasa calidad (por ejemplo, si las plantillas estructurales apropiadas no existen en el banco de datos), los experimentos de intercambio de CDR (como se describe en los ejemplos) proporcionarán información sobre qué CDRs deben ser dirigidos a diana para la mutación. La metagénesis de exploración de alanina (mutando cada residuo secuencialmente a Ala) a través de esas regiones podría identificar el (o los) residuo(s) clave(s)
involucrado(s) en la unión al antígeno (Cunningham y Wells, 1989). Si cambia un único residuo a Ala reducido pero no destruye la unión, esa posición podría ser dirigida a diana para mutaciones más drásticas (por ejemplo, una sustitución que fuera creada en una diferencia de carga) para reducir adicionalmente la unión, si se desea.
Métodos alternativos para obtener versiones que
no son de unión celular de anticuerpos terapéuticos incluyen
técnicas genéticas como exhibición de fagos usando PCR propensa a
error (Gram et al, 1992) y ciclación de genes de la región V
(por ejemplo, como constructos sFv) a través de una cepa mutadora
bacteriana (por ejemplo, mutD5) (Low et al., 1996). Estos
métodos genéticos pueden proporcionar sistemas de selección
potentes.
La invención se describirá seguidamente en los
ejemplos que siguen. Aunque en este documento es proporcionado el
ejemplo específico de Campath-1H, la invención no
está limita a anticuerpos basados en Campath-1H.
Esta anticipado que otros anticuerpos terapéuticos de unión
celular, especialmente los que serían proporcionados en dosis
repetidas, resultarían más ampliamente aceptados usando esta
estrategia.
Se ha concebido un método para determinar cuáles
de los bucles de CDR del mAb de Campath-1H
humanizado son los más importantes para la unión a CD52. Fueron
genéticamente construidos VL o VH mutantes en los que cada una de
las 6 regiones hipervariables (como se define por Kabat et al
(1987) usando alineaciones de secuencias de aminoácidos de regiones
V en las bases de datos de proteínas) estaban individualmente
intercambiada con la correspondiente CDR de la región V que había
proporcionado la secuencia aceptora VL o VH humana durante la
humanización (REI y NEW, respectivamente). Las regiones V tratadas
por ingeniería fueron expresadas como fragmentos de Fab en E.
coli usando el vector pHEN (Hoogenboom et al, 1991). En
este sistema, la secuencia líder peIB fue usada para dirigir la
expresión de proteínas al periplasmo, donde se produce la asociación
de la cadena L y la cadena H truncada (Hoogenboom et al,
1991). Cuando estos fragmentos Fab fueron ensayados en cuanto la
unión a CD52 inmovilizado, se encontró que intercambiando el (VH)
CD12 de NEW en el Fab de Campath-1 se destruyó
completamente la unión a CD52. La sustitución de (VH) CDR3 redujo la
unión a CD52 8 veces mientras que la sustitución de (VH) CDR1 y
(VL) CD3 redujo la unión 3 veces. No se detectó ningún cambio cuando
fueron sustituidos (VL) CDR1 o (VL) CDR2. A partir de estos
resultados, es evidente que el (VH) CDR2 contenía un(os)
residuo(s) clave(s) necesario(s) para la unión
al antígeno. El DNA que codifica la cadena H de
Campath-1 humanizado de "tipo salvaje"
(Reichmann et al, 1988) fue usado como plantilla de PCR para
la mutagénesis dirigida al sitio. Esta secuencia de cadena pesada
codifica proteína humana en todas las posiciones excepto las tres
regiones VH CDR y las posiciones 27 y 30 de la primera región de
entramado. Se abordó el bucle CH2 en VH CDR2 para hacer mutaciones
que impidieran la unión del Ab a CD52. H2 es la estructura del bucle
real (Chothia and Lesk, 1987) que es encontrado en los 19
aminoácidos de VH CDR2 denominados "hipervariables" por la
definición de Kabat et al (Kabat et al, 1987) (véase
la Figura 1). Es conocido que unos pocos residuos en el bucle y/o
las regiones de entramado determinan relativamente pocas
conformaciones de bucles de CDR y los restos de bucles canónicos
han sido identificados para la mayoría de CDR que incluyen VH CDR2
(Chothia and Lesk, 1987). Como las estructuras de los bucles son
las que se desprenden del entramado de la caja \beta de la región
V para entrar en contacto con el antígeno, las mutaciones en el
bucle tendrían la mayor posibilidad de destruir la unión al
antígeno, al mismo tiempo que conservan la estructura del Ab. En
general, fueron restringidos los cambios al bucle H2 excepto para
la cadena H mut6 que contenía una mutación adicional en el residuo
que precedía inmediatamente a H2, como se expone más en detalle con
posterioridad.
La mutación 1 es una única diferencia de carga
en el residuo 52b de Lys Asp. Se predijo a partir de la modelación
molecular de Ab de Campath-1H, y apoyado por la
estructura cristalina, que la cadena lateral de este residuo está
sobresaliendo del embolsamiento de unión Ag, hacia la aproximación
del antígeno. Como la carga positiva de Lys se cree que
interacciona con los grupos fosfatos de carga negativa del anclaje
GPI de CD52, es posible que esta mutación única destruya la unión
al antígeno.
La mutación 2 es una única diferencia de carga
en el residuo 52a de Asp a Lys. Se predijo a partir de la modelación
molecular de Ab de Campath-1H que este cambio
podría interferir con la unión al antígeno.
La mutación 3 es una única diferencia de carga
en el residuo 53 de Lys a Asp. A partir de la estructura cristalina
de Ab de Campath-1H, está claro que la mayoría de
esta cadena lateral del residuo es accesible a disolventes y, por
lo tanto, puede estar involucrada en la interacción con los grupos
fosfatos de carga negativa del anclaje GPI de CD52, como para la
mutación 1.
La mutación 4 es una mutación doble que abarca
las sustituciones individuales del mutante 1 y 3 (Lys52b y Lys53 a
Asp).
La mutación 5 es una mutación triple que abarca
las sustituciones individuales del mutante 1, 2 y 3 (tres
diferencias de carga: Asp52a a Lys; Lys52b y Lys53 a Asp).
La mutación 6 es una mutación triple que abarca
las sustituciones individuales del mutante 1 y 2 (dos diferencias
de carga Asp52a a Lys; Lys52b a Asp) y una mutación adicional de
Arg52 a Ala. El residuo 52 se ha mostrado que difiere entre 3 Ab de
Campath-1 de afinidad elevada, baja y moderada y,
por lo tanto, puede estar directamente involucrado en la maduración
de la afinidad. Esto ha su vez pude sugerir una función en la unión
al antígeno.
Para cada una de estas mutaciones de cadenas
pesadas, el (o los) cambio(s) fue/fueron codificados en
cebadores de oligonucleótidos 1B y 2A (Figura 2). La PCR se llevó a
cabo sobre DNA de cadena pesada de Campath-1 de
"tipo salvaje" usando un cebador en 5' que se hibridaba a la
secuencia líder y que contenía un sitio HindIII en dirección
ascendente cebador (1A) y un cebador 1B para generar un fragmento de
200 bp. Análogamente, fue generado un cebador 2B (que se hibridaba
a CH1 y que contenía un sitio BstXI seguido de un sitio EcoRi) y un
cebador 2A, un fragmento de 440 bp. Estos fragmentos fueron
purificados sobre gel y seguidamente combinados en una única
reacción PCR. El cebador 1A y el cebador 2B fueron añadidos después
del primer ciclo (permitiendo así que los 2 trozos de DNA
superpuestos se hibridaran antes de la amplificación). A
continuación de la PCR, los fragmentos fueron purificados sobre gel
y digeridos con HindIII y EcoRI y fueron transferidos en vectores
de secuenciado intermedios (PUC19 o pGEM3zf) para la verificación de
la secuencia. Un único sitio Pstl ubicado en el Vh de
Campath-1 y un único sitio BstXI en la región de CH1
permitieron que las regiones V mutantes (y la secuencia de CH1
parcial) fueran aisladas en forma de fragmentos de
Pstl-BstXI de forma que la(s)
mutación(es) fuera(n) codificada(s) en seis
cassettes de DNA diferentes flanqueados por sitios Pstl y BstXi.
Para crear las cadenas pesada de Campath-1H, el
constructo de cadena pesada original (en el vector intermedio
pGEM9zf) fue cortado con Pstl y BstXI y el fragmento fue suprimido.
El DNA restante (que codificaba la secuencia líder de cadena pesada
de Campath-1H de la región V en dirección ascendente
del sitio Pstl, más la región de CH1 en dirección descendente del
sitio BstXCI seguido por la artuculación, CH2, CH3 en pGEM9zf) fue
purificado sobre gel (Figura 3). Seguidamente fueron establecidas
las ligaduras en las que cada uno de los cassettes de DNA que
contenía la(s) mutación(es) anteriormente
descrita(s) estaban unidas al DNA de cadena pesada de
Campath-1H cortado en
pGEM9zf/Pst-BstXi purificado sobre gel. Estas seis
cadenas pesadas de Campath-1H mutagenizadas fueron
seguidamente aisladas por digestión con HindIII y purificación sobre
gel, seguido de ligadura en vector pBAN-2 de
expersión de mamíferos cortados en HindIII. Este vector es derivado
del vector pNH316 que contiene un marcador seleccionable de
neomicina bajo el control del promotor de metalotioneina de ratón y
el promotor de \beta-actima humano fuerte/señales
de poliadenilación para la expresión del producto génico deseado
(Page y Sydenham, 1991). A medida que estos fragmentos fueron
introducidos en único sitio de restricción HindIII, la orientación
de cada fragmento fue verificada mediante secuenciado de DNA.
El DNA que codifica la cadena ligera de
Campath-1H de "tipo salvaje" humanizada
(secuencia humana en todos los residuos excepto los tres CDR en la
región V) fue aislado a partir de un vector intermedio como un
fragmento HindIII a EcoRI. Este fragmento fue purificado sobre gel
y seguidamente ligado en vector de expresión pRDN-1
de mamífero cortado en HindIII-EcoRI. Este vector es
derivado del vector pLD9 que contiene un marcador seleccionable de
dihidrofolato reductasa "tarado" (el elemento mejorador del
promotor SV40 ha sido suprimido para permitir niveles aumentados de
expresión génica en presencia de metrotrexato) y el promotor de
\beta-actina humano/señales de poliadenilación
para la expresión del producto génico deseado (Page y Sydenham,
1991).
El sistema de expresión usado para producir
niveles elevados de Ab de Campath-1H humanizado en
el pasado es el sistema de expresión de mamíferos ampliamente usado
que caracteriza la amplificación de genes mediante el uso de
células de ovario de hamster chino (CHO) deficiente en dihidrofolato
reductasa (dhfr) y el uso de promotores de
\beta-actina fuertes para la selección y
amplificación de los productos génicos deseados (Page y Sydenham,
1991).
Se llevaron a cabo las siguientes transfecciones
(TF):
TF1: Simulación (pRDN-1
"vacío" más pBAN-2 "vacío")
TF2: Solamente cadena ligera (cadena
ligera/pEDN-1 más pBAN-2
"vacío")
TF3: Cadena ligera/pRDN-1 más
mutante 1 de cadena H/pBAN-2
TF4: Cadena ligera/pRDN-1 más
mutante 2 de cadena H/pBAN-2
TF5: Cadena ligera/pRDN-1 más
mutante 3 de cadena H/pBAN-2
TF6: Cadena ligera/pRDN-1 más
mutante 4 de cadena H/pBAN-2
TF7: Cadena ligera/pRDN-1 más
mutante 5 de cadena H/pBAN-2
TF8: Cadena ligera/pRDN-1 más
mutante 6 de cadena H/pBAN-2
TF9: Cadena ligera/pRDN-1 más
"tipo salvaje" de cadena H/pBAN-2
Se mezcló DNA (20 \mug de cadena
ligera/pRDN-1 más 20 \mug de cadena
pesada/pBAN-2) en un matraz Eppendorf esterilizado,
se precipitó con etanol y se aclaró dos veces con etanol al 70%. Los
sedimentos de DNA se volvieron a poner en suspensión
Tris-EDTAS esterilizado.
Para cada transfección, el DNA fue diluido con
60 \mul de HEPES 20 mM (pH 7,4) en un tubo de poliestireno de 5
ml. En otro tubo se diluyeron 120 \mul de reactivo de transfección
liposomal DOTAP (Boehringer Mannheim) con 80 \mul de HEPES 20 mM
(pH 7,4). Seguidamente se añadió el DNA/HEPES al DOTAP diluido, se
mezcló suavemente y se dejó a temperatura ambiente durante 15
minutos. Se aspiró el medio de cultivo (IMDM + 5% de FCS + HT) en
un matraz T75 que contenía células CHO deficientes dhfr que crecían
a una confluencia de aproximadamente 50%. El DNA/DOTAP fue
seguidamente añadido al matraz junto con 10 ml en medio de cultivo
de nueva aportación. El matraz fue cultivado durante 24 h a 37ºC en
5% de CO_{2}. El DNA/DOTAP fue seguidamente aspirado del matraz y
a las células se les proporcionaron 15 ml de medio de cultivo de
nueva aportación. Después de 24 h adicionales, se inició la
selección separando el medio de cultivo y añadiendo medio de
selección (IMDM + 5% de FCS dializado +1 mg/ml de G418). Las
células fueron cultivadas a 37ºC en 5% de CO_{2} y se añadió
medio de selección de nueva aportación en la medida necesaria. Las
materias sobrenadantes sobre el cultivo fueron seguidamente
ensayadas mediante un ensayo ELISA en cuanto a la presencia de
anticuerpo, como se describe con posterioridad.
Placas de microtitulación fueron revestidas con
50 \mul/pocillo de Ig Fc anti-humano (Sigma,
número de catalogo I-2136) en PBS a 2,5 \mug/ml
durante una noche a 4ºC. El Ab de revestimiento fue retirado y las
placas fueron bloqueadas mediante la adicción de 100 \mul/pocillo
de tampón bloqueante (PBS + 1%BSA + 5% FCS + 1% de suero de conejo
normal inactivado con calor (NRS)) durante una noche a 4ºC. Se
añadieron las materias sobrenadantes de la transfección (50
\mul/pocillo) durante al menos 1 h a temperatura ambiente. Los
pocillos se lavaron con PBS/0,5% de Tween-20
(PBS-Tween). Se añadió Ig
anti-humana de oveja biotinilada (Amersham, número
de catalogo RPN 1003) diluido 1/5000 en tampón bloqueante o cadena
ligera kappa anti-humana de cabra biotinilada
(Sigma, número de catalogo B-1393) diluida 1/1000
en tampón bloqueante (50 \mul/pocillo) durante 1 h a temperatura
ambiente. Los pocillos fueron lavados con PBS/Tween y se añadieron
50 \mul/pocillo de ExtrAvidin-peroxidasa (Sigma,
número de catalogo E-2886) durante 30 minutos a
temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron una vez más y se
añadieron 100 \mul/pocillo de sustrato de dihidrocloruro de
o-fenilenodiamina (Sigma, número de catálogo
P-7288). El cambio de color se midió a 492 nM usando
un lector de placas de microtitulación Multiskan Plus.
Placas de microtitulación fueron revestidas con
50 \mul/pocillo de Ig Fc anti-ratón (Sigma, número
de catalogo M-4280) en PBS a 2,5 \mug/ml durante
una noche a 4ºC. El Ab de revestimiento fue retirado y las placas
fueron bloqueadas mediante la adicción de 100 \mul/pocillo de
tampón bloqueante (PBS + 1% de BSA + 5% de FCS + 1% de NRS
inactivado con calor) durante una noche a 4ºC. Seguidamente se
añadió proteína de fusión Ag de Campath-1
recombinante purificada (secuencia que codifica la cadena principal
del péptido CD52 fusionada a una secuencia que codifica los
dominios CH2 y CH3 de ratón, y purificada en una columna de proteína
A) a 4 \mug/ml para cada pocillo (50 \mul/pocillo) en PDS
durante una noche a 4ºC. Los pocillos fueron seguidamente lavados
con PBS/Tween y las materias sobrenadantes de la transfección fueron
añadidas (50 \mul/pocillo) durante al menos 1 h a temperatura
ambiente. Los pocillos fueron lavados con PBS/Tween y se añadió y Ig
anti-humana de oveja biotinilada (Amersham, número
de catalogo RPN 1003) diluida en 1/5000 de tampón bloqueante (50
\mul/pocillo) durante 1 h a temperatura ambiente. Los pocillos se
lavaron con PBS/Tween y se añadieron 50 \mul/pocillo de
ExtrAvidin-peroxidasa (Sigma, número de catalogo
E-2886) durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Los pocillos se lavaron una vez más y se añadieron 100
\mul/pocillo de sustrato de dihidrocloruro de
o-fenilenodiamina (Sigma, número de catalogo
P-7288). El cambio de color fue medido a 492 nM.
El Ab de Campath-1H purificado
de "tipo salvaje" se une fuertemente a la proteína de fusión Ag
de Campath-1 recombinante en ensayos ELISA. Para
proporcionar una comparación para valorar los anticuerpos que no son
de unión celular, puede ser titulada la concentración Ab de tipo
salvaje justo a que sea detectable la unión. Esto puede ser
denominado "unidad de unión de uno Ab". Un mutante que no es de
unión adecuado del tipo salvaje no mostrara una unión detectable a
un valor de muchas veces esta concentración, por ejemplo, 100 veces
o 1000 veces, o preferentemente 10000 veces esta concentración de
Ab de Campath-1H de tipo salvaje.
Se describe un método alternativo que puede ser
aplicado para valorar la potencialidad de no unión. Como se conoce
que el Campath-1H de tipo salvaje provoca una fuerte
respuesta anti-inmunoglobulina en ratones tras
génicos que expresan CD52 humano (véase la siguiente sección para
detalles sobre estos ratones), pueden ser usadas preparaciones
desagregadas purificadas de los mutantes in vivo para valorar
si son inmunogénicas. Si una respuesta
anti-globulina no puede ser detectada a dosis entre
1 \mug y 1 mg de mutante desagregado por ratón, esto es un buen
indicio del que el mutante es incapaz de unirse a CD52.
Para ensayar la capacidad de los mutantes
mínimos de Campath-1H para hacer que sea tolerante
el Ab de Campath-1H de tipo salvaje in vivo,
son usados ratones transgénicos. Por ejemplo, pueden ser usados
ratones transgénicos que expresen CD52 humano detrás de un promotor
CD2 de murina para emular la expresión de CD52 sobre células
T.
T.
Para crear este ratón, un fragmento génomico de
2,8 kb que contiene los dos exones del gen CD52 humano, así como en
dirección ascendente de 4,5 kb y la secuencia que flanquea en 3' del
gen CD2 humano puede ser introducido en el genoma de ratones
trasgénicos. Se cree que están presentes regiones de control elevado
en 3' respecto al gen CD2 humano que determina los niveles elevados
y la expresión específica para los tejidos del gen (Greaves et
al, 1989). Mediante este método, fueron establecidos cuatro
fundidores CD52/CBA que transmitían el transgén de hecho, cuando
fueron analizadas manchas de sangre periférica de su progenie
mediante clasificación celular activada por fluorescencia y manchas
de dos colores, se mostró que las células que expresaban CD3 de
ratón (células T) expresaban también CD52 humano. Estos ratones
fueron criados para una homozigosidad y más de 95% de sus células T
expresaban niveles elevados de CD52 humano en la superficie
celular.
Estos ratones producen una vigorosa respuesta
anti-globulina (título de 1/1000 o más) respecto a
Campath-1H de tipo salvaje a dosis de 1 a 10
mg/ratón. Esta respuesta anti-globulina incluyen un
componente anti-Id, ya que los bucles de CDR son
secuencias de ratas. La eficacia de los mutantes mínimos para hacer
tolerantes la provocación posterior de Ab de
Campath-1H de tipo salvaje puede ser valorada de las
formas siguientes:
1. Administración intravenosa de una única dosis
(0,5 a 1 mg/ratón el día 0) de cada mutante que no es de unión
celular o Ab testigo irrelevante (desagregado mediante un
ultracentrifugación) seguido de provocación con 1 a 10 mg de Ab de
Campath-1H de tipo salvaje a las 4 a 6 semanas. La
sangre de la cola de 10 días posteriores a la provocación es
ensayada mediante ensayos ELISA en cuanto a la especifidad
anti-Id de Campath-1H.
2. Administración intravenosa de dosis múltiples
(0,5 a 1 m g/ratón) de mutante que no es de unión a celular
desagregado o Ab testigo durante 2 meses antes de la provocación con
1 a 10 mg de Ab de Campath-1H de tipo salvaje. Las
sangres de la cola 10 días después del desafío fueron ensayadas
mediante un ensayo ELISA en cuanto a la especifidad
anti-Id de Campath-1H. En ambos
casos, el Ab testigo irrelevante va a ser un Ab que no es de unión
celular de isotipos coincidentes en ratones, como
Campath-9, que es un Ab anti-CD4
humanizado (Gorman et al, 1991).
Una cantidad (por ejemplo, 500 mg de la forma no
celular del anticuerpo terapéutico seria administrada un paciente a
la espera de un tratamiento con el anticuerpo terapéutico.
Preferentemente, el anticuerpo que no es de unión celular
administrado está recientemente desagregado (por ejemplo, mediante
paso a través de un filtro fino). Un periodo de tiempo después (por
ejemplo 7 días) tiempo durante el cual las células T y células B se
habrían hecho tolerantes, se habría proporcionado la forma de tipo
salvaje del anticuerpo terapéutico.
1. Debe ser más fácil de hacer tolerante a un
mutante mínimo que a HGG o a moléculas de Ab de cadenas mixtas.
En los modelos de tolerancia de Bejamin et
al (1986) la tolerancia a HGG policlonal fue inducida en ratones
a continuación del agotamiento de CD4 + células T, pero también
usando material degradado. Se encontró que la tolerancia a estas
proteínas solubles podía ser concedida de forma relativamente fácil.
También en el trabajo de Isaacs y Waldmann (1994) se proporcionaron
Ab de CV4 mediante la inducción de tolerancia a moléculas de Ab de
cadena mixta que no son de unión celular (cadenas H y R irrelevantes
y específicas para el antígeno) o se usaron formas que no son de
unión celular como tolerogenes por sí mismos a continuación de su
desagregación.
En la aproximación modificada para inducir
tolerancia usando un mutante mínimo, el carácter ajeno de la
proteína será menor que el de HGG policlonal o las moléculas de Ab
de cadenas mixtas en ratones. En los casos en los que mAb
terapéutico sea humanizado, solamente los bucles de CVDR y en
algunos casos algunas posiciones de los entramados están
comprendidos por secuencias de roedores. Por lo tanto, puede ser
posible inducir una tolerancia con un mutante mínimo desagregado en
ausencia de mAb de CD4. Sin embargo, incluso aunque se requiera la
administración de CD4, esta disponible un CD4 terapéutico humanizado
(CAMPTH-9; Gorman et al, 1991). Los estudios
en animales transgénicos deben abordar estos detalles.
2. Creación de una forma monovalente del mutante
mínimo (Figura 4). Esta opción se sitúa fuera del alcance de la
presente invención, y está incluida solo por motivos de
ilustración.
Por tanto, hasta ahora se ha considerado la
inducción de tolerancia usando un mutante mínimo que es
esencialmente como el terapéutico de tipo salvaje excepto en cuanto
a cambio(s) de residuos mínimos que romperán la unión al
antígeno. Se propone también una forma monovalente que es también
significativamente más pequeña que el mutante mínimo.
En una realización la forma monovalente es una
Fv de cadena única [formada por el VL, un conector de péptidos
cortos (como los examinados por Huston et al, 1991) y el VH
mutado) generalmente fusionado con la secuencia que codifica la
articulación CH2-CH3 de IgG1 humana. Este constructo
es expresado en asociación con una cadena pesada truncada
(articulación CH2-CH3 solamente; Routlrdge et
al, 1991) de forma que es expresada una proteína que está
compuesta es esencialmente por un único sitio de combinación de Ab y
un dominio funcional de Ig Fc. La inmunogenicidad de los diferentes
conectores de péptidos se espera que no sea despreciable dado su
pequeño tamaño (generalmente 14 a 18 residuos de longitud) y la
abundancia de residuos pequeños (por ejemplo, Gly y Ser) que
constituyen los conectores. Una elección generalizada es el conector
de 15 residuos (Gly_{4}Ser)_{3} en el que los residuos
de serina confieren una hidrofilicidad extra sobre la cadena
principal del péptido (para inhibir su intercalación entre los
dominios variables durante el plegado) y que por lo demás esta
exento de cadenas laterales que podrían complicar el plegado de los
dominios (Huston et al, 1988).
El SFv asido expresado en células de mamíferos a
partir de un cierto número de anticuerpos diferente se ha mostrado
que se pliega en la conformación correcta para la unión a antígenos
mediante una actividad funcional (Gilliland et al, 1996). La
parte Fc es una característica preferida que debería asegurar una
semivida del suero comparable a la del mutante mínimo y al Ab
terapéutico de tipo salvaje, mientras que la monovalencia asegurara
que la unión CD52 está considerablemente reducida debido a la
disminución de la avidez. Se ha mostrado ya a partir de
experimentos de intercambio de CDR (sección A1) que el Ab de
Campath-1 se une escasamente a CD52 de una forma
monovalente. Además de reducir la avidez de la molécula, el tamaño
más pequeño puede ser una ventaja: en experimentos clásicos de
tolerancia, se encontró que cuanto más pequeña fuera la molécula,
mejor era para inducir la tolerancia (Parish y Ada, 1969; Anderson,
1969; Miranda et al, 1973). Combinado la monovalencia con un
mutante que no es de unión celular puede ser obtenido un tolerogen
altamente eficaz.
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Claims (11)
1. Uso de un anticuerpo que es una versión
modificada de un anticuerpo terapéutico, en el que el anticuerpo
terapéutico tiene afinidad por un antígeno de superficie celular en
que dicho anticuerpo tiene una afinidad reducida por el antígeno en
comparación con el anticuerpo terapéutico como consecuencia de una
modificación o de modificaciones en la molécula del anticuerpo, en
que (a) hay >90% de identidad de secuencias entre los dominios
constantes del anticuerpo y los dominios constantes del anticuerpo
terapéutico, (b) la modificación comprende una alteración de al
menos una de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs),
y (c) el anticuerpo comprende al menos un epitopo presente también
en el anticuerpo terapéutico que induce una respuesta inmune en el
paciente previsto, para la elaboración de un medicamento para
inducir una tolerancia inmunológica al anticuerpo terapéutico.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que hay
>90% de identidad de secuencias de aminoácidos entre las
regiones de entramado de los dominios variables del anticuerpo y las
regiones de entramado del anticuerpo terapéutico.
3. Uso según la reivindicación 2, en el que las
regiones de entramado de los dominios variables del anticuerpo
tienen la misma secuencia de aminoácidos que las regiones de
entramado del anticuerpo terapéutico.
4. Uso según la reivindicación 1, en el que la
alteración es conseguida mediante una manipulación genética de un
ácido nucleico que codifica las CDR.
5. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la afinidad por el antígeno es
reducida hasta 50% o menos de la afinidad del anticuerpo
terapéutico.
6. Uso según las reivindicaciones
1-5, en el que el anticuerpo es un anticuerpo
humanizado.
7. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el anticuerpo terapéutico tiene
afinidad por CD52.
8. Uso según la reivindicación 7, en el que el
anticuerpo terapéutico es un anticuerpo de Campath-1
humanizado.
9. Uso según la reivindicación 8, en el que la
modificación comprende una alteración en (VH) CDR2.
10. Uso según la reivindicación 9, en el que la
modificación comprende una sustitución única o doble de aminoácidos
en (VH) CDR2.
11. Uso según la reivindicación 10, en el que
los dominios constantes del anticuerpo tienen la misma secuencia de
aminoácidos que los dominios constantes del anticuerpo
terapéutico.
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