CN102495051A

CN102495051A - 一种生物活性和代谢快速检测的装置与方法

Info

Publication number: CN102495051A
Application number: CN2011103928136A
Authority: CN
Inventors: ***生; 吴文娟; 丁肇卉; 钱雪琴; 邓桂林; 王坦
Original assignee: SHANGHAI PUBLIC HEALTH CLINICAL CENTER; SHANGHAI JICAI MEDICAL EQUIPMENT CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI PUBLIC HEALTH CLINICAL CENTER; SHANGHAI JICAI MEDICAL EQUIPMENT CO Ltd
Priority date: 2011-12-01
Filing date: 2011-12-01
Publication date: 2012-06-13

Abstract

本发明属于生物活性或代谢检测技术领域，具体为一种用于生物活性和代谢快速检测的装置与方法。本发明装置为一种密封容器，其内侧含有分隔的腔体，腔体为2室或多室；腔体中设置有含有指示剂的透气材料层；所述指示剂用于指示和探测生物生长与代谢状况。当不同腔体内指示剂相同，透气材料层厚度不同时，可实现时相差快速检测,当不同腔体内指示剂不同，透气材料层厚度也不同时，可实现同步检测不同代谢产物。本发明可用于动、植物、细胞、微生物培养相关的检验、检疫，实现各种生物试验的自动化监测。

Description

一种生物活性和代谢快速检测的装置与方法

技术领域

本发明属于生物活性或代谢检测技术领域，具体涉及一种用于快速检测生物活性、代谢的装置和方法。

背景技术

大多数生物生长、代谢过程中会产生代谢产物气体，释放的气体包括：氧气（O₂）、二氧化碳（CO₂）、氨气（NH₃）或硫化氢（H₂S）等。

植物（包括藻类等低等生物）在光照情况下光合作用占优势，主要是吸收CO₂、释放O₂，无光照条件下仅进行呼吸代谢，吸收O2、释放CO₂，因此，通过CO₂、O2浓度检测可监测植物生长代谢情况。

细胞培养中，细胞消耗葡萄糖会释放CO₂，CO₂为酸性气体，使培养液呈酸性，常常使用酚红作为pH指示剂，酚红由玫瑰红（碱性色）变黄（酸色）说明细胞生长。

许多微生物生长代谢呼吸过程也与细胞类似，能释放CO₂，为此，通过测定释放的CO₂量（pH光子或电子等方法）来监测、测量微生物生长与否、生长特征，记录生长曲线。

一些微生物含有脲酶能消化尿素产生氨气（NH₃），氨气为碱性气体，可使用pH指示剂如溴百里酚蓝，由黄色（酸性色）变蓝色（碱性色）进行检测。

另外，某些细菌能分解培养基中含硫氨基酸产生硫化氢（H₂S），硫化氢是较强的还原剂，可使用氧化还原指示剂（如醋酸铅）显色反映微生物生长情况。

由于pH指示剂、氧化还原指示剂对细胞、细菌生长存在一定的毒性，甚至会抑制生长代谢，目前均采用异相检测，即指示剂与培养不在同一相，指示剂(相)颜色发生改变时，通过发光二级管发射-接受检测指示剂（相）波长的改变获得生物生长数据。如图1所示，其存在的问题：

1、仅一个指示剂相只能检测一种代谢产物，不能同步监测两种或多种代谢产物。

2、由于气体进入指示剂相使指示剂相变化是一个由上至下渐变的过程，目前的方法必须等到底部颜色发生改变时才能探测生长或代谢的发生，检测的时间延迟无疑降低了检测的灵敏度降低。

3、很多临床微生物尤其是苛养菌、缓慢生长菌（包括霉菌、酵母菌、结核分枝杆菌等）检测，检测目的往往是识别、判断微生物的存在，需要尽早获得培养结果（阳性还是阴性），但目前使用的检测容器仅提供了一个指示剂相，由于指示剂本身、指示剂相之间差异，迫使仪器的基线需要设定较高参数，直接影响检测的灵敏度，增加了目测判别结果的难度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种结构简单、监测方便的快速检测生物活性、代谢的装置和方法。

本发明提供的快速检测生物活性、代谢的装置，是一密封容器，其内侧含有分隔的腔体，所述腔体可以为2室，也可以为多室（2室以上，如3室、4室等），如图2 a、b、c、d所示。

本发明中，所述腔体中设有含有指示剂的透气材料层；不同腔体内的透气材料层的厚度可以相同，也可以不同；不同腔体内的透气材料层的中所含指示剂的种类可以相同，也可以不同。不同的情况可用于不同的检测目的。例如：

不同腔体内的透气材料层中所含指示剂种类相同，但透气材料层厚度不同，可实现时相差快速检测。

不同腔体内的透气材料层中所含指示剂种类不同，透气材料层厚度也不同，可用于同步检测不同的代谢产物。

本发明中，分隔的腔体可以设在装置（容器）内侧的底部、顶部（盖内）或侧面等，如图2 e、f、g所示。

本发明中，透气材料层厚度不同时，厚度比可在1：2~10之间。

本发明中，所述指示剂是指能随O₂、CO₂、NH₃、H₂S等气体浓度变化而发生变化的物质，所述变化可以是但不限于吸收光或发射光波长改变。指示剂可以是但不限于pH指示剂、氧化还原指示剂等。

本发明中，所述含指示剂的透气材料层，指通过吸附、乳化、溶解等手段将所述指示剂固相在透气材料中；透气材料可以是但不限于静电吸附尼龙膜、纤维素、琼脂、硅橡胶、树脂等。

本发明中，所述密封容器是以透明、半透明或不透明等不透气材料制造；其材料可以是但不限于PC、PP、PS、PE、PTFE、玻璃等能确保从容器外观测或检测到容器内变化（吸收光或发射光波长改变）。

利用本发明的上述装置可以快速检测生物活性、代谢的具体情况，具体步骤为，将培养物放置于本发明的密封容器中，根据指示剂的吸收光（颜色、灰度）或发射光波长改变或差别，可通过目测判断，也可通过扫描、摄像、照相等方式与单片机、计算机连接，通过软件监测、分析、判断、记录生长曲线和结果，从而实现同步、时相差快速检测生物活性、代谢情况，见图3、图4所示。例如：

当不同腔体内的透气材料层中所含指示剂种类相同，但透气材料层厚度不同时，可实现时相差快速检测。

当不同腔体内的透气材料层中所含指示剂种类不同，透气材料层厚度也不同时，可用于同步检测不同的代谢产物。

本发明中，将腔体设计在容器盖内侧具有通用性，不但能用于液体培养物检测，还可用于固体培养物检测，能指示固体斜面生物的生长。

本发明的装置可根据需要，任意设计适合于不同大小、形状的密封的容器、培养瓶或培养管等，可用于动物、植物、细胞、微生物培养相关的检验、检疫，以及各种微生物的药敏等试验。

使用本发明装置和方法可以但不限于用于快速检测生物、物理、化学等产生的相关气体。

附图说明

图1为现有技术的生物代谢检测方法图示。

图2为本发明设计的用于快速指示生物代谢的密封容器内侧腔体结构图示。其中，(a) 为有2室腔体（同心圆），（b）为有2室腔体（对半分隔），（c）为3室腔体，（d）为4室腔体；(e) 为有2室腔体设在容器顶部（盖）内侧，(f) 为有2室腔体设在容器底部内侧，(g) 为有2室腔体设在容器侧面内侧。

图3为本发明实施例中使用的密封容器盖结构。其中，(a)为盖内侧含有的同心圆2室腔体设计立体图，（b）为横截面结构。

图4为本发明实施例1图示，密封容器盖内侧的2室腔体中分别放置识别不同气体的指示剂（相），能同时探测不同气体的图示。

图5为本发明实施例2、3图示，密封容器盖内侧的2室腔体中放置相同指示剂（实施例2使用荧光pH指示剂，实施例3使用pH显色指示剂），但透气材料层厚度不同。

图6为本发明实施例3结果图示，密封容器盖内侧的2室腔体中放置不同厚度的含pH显色指示剂的透气材料层（测量CO₂释放量），从瓶盖顶部观测的结果 (a)为无细菌生长，指示相与参考相颜色、灰度一致，（b）为有细菌生长，指示相与参考相颜色、灰度不一致；(c)为从瓶盖顶部扫描的无细菌生长结果，（d）为从瓶盖顶部扫描的有菌生长结果；从瓶盖顶部扫描记录的代谢强度曲线：(e) 无细菌生长曲线，(f) 为有菌生长曲线。

图7 对本发明时相差快速检测方法原理进一步描述。

具体实施方式

下面通过实施例进一步描述本发明。

本发明实施例中，腔体设在密封容器盖子内侧，盖内侧以两个同心圆内、外圈形成2室腔体，如图3所示。(a)显示同心圆2室腔体盖的立体结构，（b）显示横截面图。

实施例中培养基采用上海积彩医疗器械有限公司生产的通用增菌培养基，配方（按1000mL计算）为：

米氏7H9肉汤	5.9g
		小牛血清白蛋白	5.0g
葡萄糖	2.0g
		触酶	0.003g
甘油	3 mL
		纯化水	1000 mL
合计	1000 mL

无菌条件下将培养基以每瓶5ml分装。

实施例1

上述瓶盖内2室腔体中分别放置能识别二氧化碳（CO₂）（pH指示剂）及硫化氢（H₂S）（醋酸铅氧化剂）的透气材料层，同步检测生物生长代谢释放的二氧化碳（CO₂）和硫化氢（H₂S）（图4）。

1．pH指示剂相制备：

a．取百里香酚蓝（Thymol blue pKa=8.9）0.1g ，加入1N NaOH 2ml溶解，加水至10ml备用。

b．取硅橡胶液（GE 2501）10g, 加入上述溶液0.2ml,混合后，注入对应腔体中，室温固化24小时,固化后的硅胶呈蓝色。

2. 硫化氢（H₂S）指示相制备：

a．取醋酸铅0.1g ，加水9ml溶解，加入10% TW-80 1ml备用。

b．取硅橡胶液（GE 2501）10g, 加入上述溶液0.2ml,混合后，注入对应腔体中，室温固化24小时，固化后的硅胶呈白色。

Pb²⁺ +S^2-=== PbS ↓ 。

3. 取两管含培养基的培养管，一支接种胎儿弯曲细菌(Campylobacter fetus ATCC 27374)，一支做对照，置37度培养24hr。

4．结果：如图4(b)，pH指示剂相变黄色，硫化氢（H₂S）指示相变黑色，说明该菌在生长的同时产生H₂S；而对照管无任何变化，两相保持原始的色调。

实施例2

上述瓶盖内2室腔体中分别放置不同厚度透气硅橡胶层，在透气硅橡胶层中含有能识别二氧化碳（CO₂）气体的荧光指示剂8-羟基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐（HPTS），该 HPTS为常用pH荧光指示剂, pka=7.3，最大激发波长405nm/455nm，通过荧光强度改变检测生物生长代谢产生的二氧化碳。

1．pH荧光指示剂相制备：

a．8-羟基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐0.1g ，加入1N NaOH 1ml溶解，加水至10ml备用。

b．取硅橡胶液（GE 2501）10g, 加入上述溶液0.2ml,混合后，注入对应腔体中，指示相1厚度1mm, 参考相2厚度5mm, 室温固化24小时（如图5）。

2．取两管含培养基的培养管，一支接种耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis MC2 155，ATCC 700084），一支做对照，置37度培养。

3．结果在LED紫外灯（3W，450nm）观测结果,对照管荧光保持不变，而接种管接种后5小时指示相荧光强度显著改变，而参考相荧光强度改变需要7小时。

实施例3

上述瓶盖内2室腔体中分别放置不同厚度的硅橡胶层，在硅橡胶层内含有能识别二氧化碳（CO₂）的指示剂对二甲酚蓝（Xylenol blue pka=8.9），含指示剂的硅橡胶层配置方法如下:

1．pH荧光指示剂相制备：

a．取对二甲酚蓝 0.1g ，加入1N NaOH 2ml溶解，加水至10ml备用。

b．取硅橡胶液（GE 2501）10g, 加入上述溶液0.2ml,混合后，注入对应腔体中，指示相1厚度1mm, 参考相2厚度6mm, 室温固化24小时（如图5）。

3．结果：对照管两相始终保持一致蓝色，而接种管接种后6小时，指示相蓝色开始变浅、黄，与参考相能明显区分，而参考相完全变黄（与指示相相同）需要8小时。

本发明中，瓶盖内指示剂的颜色（灰度）的差别可目测判断（图6中 a、b），也可通过扫描、摄像、照相等方式与单片机、计算机连接，通过软件分析、判断（图6中 c、d），或实时监测、记录生长曲线（图6中 e、f）。

实施例2、3结果表明，生物释放的二氧化碳使指示相（较簿）硅橡胶指示剂光强度先发生变化，而参考相（较厚）硅橡胶指示剂光强度后发生改变。

本发明所述“时相差检测方法”指根据指示相与参考相光强度变化存在时相差，利用光强度差判别生物的生长点方法。若将参考相设定为现有的方法，本发明方法可更早地判读生物生长、活性或代谢（图7）。

Claims

1.一种生物活性和代谢快速检测的装置，其特征在于为一种密封容器，其内侧含有分隔的腔体，所述腔体为2室，或者为2室以上的多室；所述腔体中设置有含有指示剂的透气材料层；不同腔体内的透气材料层的厚度相同或不同；不同腔体内的透气材料层的中所含指示剂种类相同或不同。

2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于所述分隔的腔体设在密封容器内侧的底部、顶部或侧面。

3.根据权利要求1所述的装置，其特征在于所述不同腔体内的透气材料层中所含指示剂种类相同，透气材料层厚度不同。

4.根据权利要求1所述的装置，其特征在于所述不同腔体内的透气材料层中所含指示剂种类不同，透气材料层厚度不同。

5.根据权利要求3或4所述的装置，其特征在于所述透气材料层厚度不同时，其厚度比在1：2~10之间。

6.根据权利要求1所述的装置，其特征在于所述指示剂为能随O₂、CO₂、NH₃、H₂S气体浓度变化而发生变化的物质。

7.根据权利要求6所述的装置，其特征在于所述指示剂为pH指示剂或氧化还原指示剂。

8.根据权利要求1所述的装置，其特征在于所述含指示剂的透气材料层，通过吸附、乳化或溶解将所述指示剂固相在透气材料中获得；所述透气材料层的材料为尼龙膜、纤维素、琼脂、硅橡胶或树脂；所述密封容器的材料是透明、半透明或不透明的不透气材料。

9.一种利用权利要求1—8之一所述装置进行生物活性和代谢检测的方法，其特征在于具体步骤为：将培养物放置于本发明的密封容器中，根据检测的要求，选择分隔的腔体的个数、各个腔体中透气材料层的厚度以及指示剂的种类，指示剂的吸收光或发射光波长的改变或差别，通过目测判断，或者通过扫描、摄像或照相方式与单片机、计算机连接，通过软件监测、分析、判断、记录生长曲线和结果，从而检测生物活性、代谢情况。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述培养物为液体培养物或固体培养物；适用于动物、植物、细胞、微生物培养相关的检验、检疫，以及各种微生物的药敏试验。