ES2291035T3 - Sinergismo de efectos dinamicos y de electropermeabilizacion sobre la vitalidad celular como nuevo agente citotoxico. - Google Patents

Abstract

Un método in vitro o ex vivo para inhibir el crecimiento celular o aumentar la muerte celular que comprende: a) proporcionar a una célula un agente fotosensible, el cual es directa o indirectamente tóxico para las células cuando se activa; b) aplicar un pulso eléctrico a la célula de una intensidad y duración suficientes para electroporar la célula con el agente fotosensible y c) aplicar luz de una longitud de onda activadora a la célula, activando de este modo el agente e inhibiendo el crecimiento celular o aumentando la muerte celular de la célula electroporada.

Description

Sinergismo de efectos dinámicos y de electropermeabilización sobre la vitalidad celular como nuevo agente citotóxico.

La presente invención se refiere en líneas generales a la electroporación o electropermeabilización y fotosensibilización y, más específicamente, a un aparato o equipo útil para la electropermeación de agentes fotosensibles y a métodos y usos de los agentes fotosensibles para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir el crecimiento celular o aumentar la muerte celular.

La fotoactivación o fotosensibilización es un proceso en el cual una sustancia fotosensible activada o excitada mediante energía proporcionada por la luz o el calor forma una molécula altamente reactiva que transfiere su energía (por ejemplo, a través de un hidrógeno o un electrón) a otras moléculas durante su retorno a un estado inactivado o desexcitado (decaimiento o relajación). La transferencia de hidrógeno o electrones al oxígeno puede formar radicales libres u oxígeno singlete, por ejemplo, así como intermedios de decaimiento reactivos que reaccionan posteriormente con otros componentes o los modifican de otra manera. Los agentes fotooxidantes son un tipo particular de agentes fotosensibles que forman moléculas reactivas que oxidan componentes y funcionan, generalmente, según uno de los dos caminos que se muestran a continuación: un agente fotooxidante activado de tipo (1) (^{3}D) reacciona con oxígeno (transferencia de hidrógeno o electrones) para producir un radical del agente positivo y oxígeno en forma de radical libre. El radical positivo del agente reacciona con guanina, por ejemplo, y el oxígeno en forma de radical libre puede reaccionar con otros componentes orgánicos. Un agente fotooxidante activado de tipo (2) (^{3}D) transfiere energía al oxígeno para producir oxígeno singlete el cual reacciona posteriormente con componentes de la célula como guanina, por ejemplo.

Tipo (1):

^{3}D + O_{2} D^{+} + O_{2}^{-}

\quad

D^{+} + G D + G^{+}

\vskip1.000000\baselineskip

Tipo (2):

^{3}D + O_{2} D + ^{1}O_{2}

\quad

^{1}O_{2} + G O_{2}^{-} + G^{+}

Donde: D es el colorante, ^{3}D su estado de triplete (activado o excitado); G, G^{+} representan guanina como sustrato y su radical escindido de la cadena de ADN y O_{2}, ^{1}O_{2} y O_{2}^{-} representan oxígeno, su estado de singlete y su radical.

Desde principios de siglo, se han usado agentes fotosensibles para acabar con células. Se ha utilizado experimentalmente la fotooxidación con agentes naturales o sintéticos para la destrucción de tejido enfermo y cáncer (Kessel D., Photochem. Photobiol, 44:489 (1986); Bottiroli et al., Photochem. Photobiol. 47:209 (1988); G. Jori y C. Perria (editores), Photodynamic therapy of tumors and other diseases, Libreria Progetta Editore, Padova, 1985; Berg et al., J. Naturwiss. 53:481 (1966); Koston et al., J. Photochem. Photobiol. B 36:157 (1996); Berg, H., J. Photochem. Photobiol. 28:399 (1998); Kennedy et al., Patente de Estados Unidos número 5.079.262). En la actualidad, la destrucción fotodinámica (terapia fotodinámica) de tumores es uno de los métodos más eficaces en la terapia del cáncer (G. Jori y C. Perria (editores), 1985 supra; Koston et al., supra (1996)). La hipertermia o el calor aumentan la velocidad de reacción del agente fotooxidante, aumentando de este modo la destrucción fotodinámica (Kimel et al., J. Laser Surg. Med. 12:432 (1992)). Sin embargo, la administración sistémica de agentes fotooxidantes se asocia normalmente con la destrucción no selectiva de células. Además, muchos agentes son relativamente insolubles, lo que hace que su utilidad in vivo sea limitada.

La membrana celular puede ser permeabilizada de manera transitoria sometiendo las células a un campo eléctrico breve, de alta intensidad. Esta permeabilización eléctricamente inducida de las membranas celulares, denominada electroporación, se ha utilizado por investigadores para introducir diversas composiciones como medicamentos, ADN, ARN, proteínas, liposomas, bolitas de látex, partículas de virus enteras y otras macromoléculas en células vivas de mamíferos (Berg et al., Efectos de los campos eléctricos sobre membranas biológicas: electroincorporación y electrofusión, en Bioelectrochemistry II, Membrane Phenomena (editores: R. G. Milazzo, M. Blank), Plenum Press, N.Y., London, p. 135-1661 (1987); Lehmann et al., Bioelectrochem. Bioenerg. 41:227-229 (1996); Hapala, Crit Rev. Biotechnol. 17:105 (1997); Eanault et al., Gene 144:205 (1994); Chu et al., Nucl. Acids Res. 15:1311 (1987); Knutson et al., Anal. Biochem. 164:44 (1987); Gibson et al., EMBO J. 6:2457 (1987); Dower et al., Genetic Engineering 12:275 (1990); Mozo et al., Plant Molecular Biology 16:917 (1991)). Estos estudios muestran que la electroporación proporciona un medio eficaz para suministrar composiciones terapéuticas tales como medicamentos, genes, polipéptidos y similares in vivo, aplicando un pulso eléctrico a células, tejidos u órganos concretos dentro de un sujeto.

Actualmente, se están explorando las aplicaciones terapéuticas de la electroporación: introducción de genes funcionales para terapia génica (Nishi et al., Cancer Research 56:1050 (1996)); electroporación de la piel para la entrega de medicamentos en la piel o para el suministro transdérmico de medicamentos a través de tejidos (Zhang et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 220:633 (1996); Weaver et al., patente de Estados Unidos número 5.019.034 y Prausnitz, Adv Drug. Deliv. 18:395 (1996)); para tratar la restenosis se ha utilizado angioplastia combinada con electroporación para entregar medicamentos a una parte localizada de las arterias coronaria o periféricas (Shapland et al., Patente de Estados Unidos número 5.498.238); tratamiento del cáncer mediante electroporación en presencia de dosis bajas de medicamentos quimioterapéuticos (Mir, Patente de Estados Unidos número 5.468.223). Para efectuar el tratamiento se han desarrollado equipos y aparatos específicos: Hofmann describe un aparato con jeringas para electroporar moléculas y macromoléculas en regiones de tejido in vivo en el cual las agujas de la jeringa utilizada para entregar las moléculas funcionan también como electrodos de electroporación (Patente de Estados Unidos número 5.273.525). Weaver describe un equipo de electroporación para el suministro de agentes químicos en tejidos in vivo (Patente de Estados Unidos número 5.389.069). Hofmann et al. describen un dispositivo en forma de catéter de electroporación útil para introducir macromoléculas terapéuticas en células endoteliales de los vasos sanguíneos de un paciente (Patente de Estados Unidos número 5.304.120).

Flynn et al describen la carga con metotrexato de eritrocitos como vehículos de entrega de medicamento utilizando electroporación, la posterior fotosensibilización de los eritrocitos cargados mediante su exposición a un derivado de hematoporfirina y fotoactivación para alcanzar una liberación predefinida del metotrexato cargado (Flynn et al., Cancer letters 82:225 (1994)).

Aunque se han dirigido numerosos esfuerzos a desarrollar nuevos enfoques terapéuticos para el tratamiento del cáncer, éste continúa siendo uno de las dolencias de proliferación celular más molestas que afectan a los seres humanos. En consecuencia, existe la necesidad del desarrollo de nuevos métodos y equipos o aparatos para tratar el cáncer y otras dolencias o trastornos de proliferación de células. La presente invención satisface esta necesidad y proporciona también ventajas en relación a ello.

La presente invención se basa en el descubrimiento de que la electroporación de un agente fotosensible en una célula y la posterior activación del mismo proporciona una destrucción más eficaz de la célula sometida a electroporación que si solamente se expone la célula a un agente fotosensible. De este modo, la fotosensibilización y la electroporación combinadas constituyen un método eficaz para tratar los trastornos caracterizados por una proliferación anormal o indeseable de las células.

En una primera realización, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento celular o aumentar la muerte celular. El método incluye proporcionar un agente fotosensible, el cual es directa o indirectamente tóxico para las células cuando se activa, aplicar un pulso eléctrico a la célula de una intensidad y duración suficientes para electroporar la célula con el agente fotosensible y aplicar luz de una longitud de onda activadora a la célula, activando de esta forma el agente e inhibiendo el crecimiento celular o aumentando la muerte de las células.

En otra realización, la invención proporciona el uso de un agente fotosensible que es directa o indirectamente tóxico para las células cuando se activa, para la preparación de una composición farmacéutica, para tratar un trastorno de proliferación celular en un sujeto, en el cual dicho agente será (i) entregado a las células electroporadas de dicho sujeto y (ii) activado mediante luz de una longitud de onda activadora.

En un aspecto, la invención proporciona un equipo para tratar un trastorno de proliferación celular en un sujeto, que comprende un agente fotosensible, el cual es directa o indirectamente tóxico para las células cuando se activa; un electrodo capaz de aplicar un pulso eléctrico de suficientes intensidad y duración para electroporar una célula en un sujeto; un conductor de luz para aplicar luz de una longitud de onda activadora a la célula electroporada y una fuente de luz para activar el agente.

La Figura 1 muestra el porcentaje de células U937 vivas después de electroporar tiopironina (1 x 10^{-5}M) e irradiar las células (10J/cm^{2} o más), para los tiempos indicados, comenzando 30 segundos después del pulso (intensidad del campo de 2 kV/cm, capacitancia de 800 F, longitud del pulso de 11-12 ms; curva inferior) y después de irradiar solamente (curva superior). Las células U937 estaban en un medio de nutrición 1:1 y 0,6 M de manitol, a temperatura ambiente (aproximadamente 18-22ºC).

La Figura 2 muestra el porcentaje de células U937 vivas después de electroporar protoporfirina (1 x 10^{-5}M) e irradiar las células para los tiempos indicados comenzando 30 segundos después del pulso (curva inferior) y después de irradiar solamente (curva superior). Los parámetros del pulso, el medio de crecimiento y la temperatura eran los mismos que en el caso anterior.

La Figura 3 muestra el porcentaje de células U937 vivas después de electroporar daunomicina (1 x 10^{-5}M) e irradiar las células para los tiempos indicados comenzando 30 segundos después del pulso (curva inferior) y después de irradiar solamente (curva superior). Los parámetros del pulso, el medio de crecimiento y la temperatura eran los mismos que en el caso anterior.

La presente invención se basa en el descubrimiento de que la introducción inducida por electroporación de un agente fotosensible en una célula (esto es, su electroincorporación) seguida de la activación del agente mediante la luz o el calor, puede inhibir el crecimiento celular o aumentar la muerte de células siendo el agente activado un agente fotooxidante, por ejemplo. Por lo tanto, la invención proporciona métodos in vitro -o ex vivo- para inhibir el crecimiento celular o para aumentar la muerte de las células así como el uso de un agente fotosensible para preparar una composición farmacéutica para el tratamiento de un sujeto con un trastorno de proliferación celular. Un método de la invención aplica un pulso eléctrico de una duración e intensidad suficientes a una célula para introducir un agente fotosensible, aplica luz de una longitud de onda activadora a la célula para activar el agente, mediante lo cual el agente activado inhibe el crecimiento celular o aumenta la muerte de las células. En una realización, un método o uso de la invención emplea un agente fotooxidante que puede causar la oxidación de los componentes de la célula electroporada, tales como ácido nucleico, inhibiendo de esta forma el crecimiento celular o aumentando la muerte celular. También se proporciona un equipo para tratar un trastorno de proliferación de células en un sujeto, que comprende un agente fotosensible, el cual es directa o indirectamente tóxico para las células cuando se activa; un electrodo capaz de aplicar un pulso eléctrico de intensidad y duración suficientes para electroporar una célula en el sujeto; un conductor de luz para aplicar a la célula electroporada luz de una longitud de onda activadora y una fuente de luz para activar el agente.

El equipo y los métodos y usos de la invención son ventajosos en varios sentidos. El equipo y los métodos y usos permiten inhibir el crecimiento celular o aumentar la muerte celular más que, por ejemplo, cuando se realiza el tratamiento de las células solamente con un agente fotosensible (esto es, sin electroporación) o solamente mediante electroporación (sin un agente fotosensible). De este modo, la invención puede emplear dosis más bajas de agente fotosensible de las que se emplean por ejemplo en terapias de tratamiento mediante fotooxidación. El equipo y los métodos y usos de la invención son ventajosos también cuando se emplean en combinación con otras técnicas para inhibir el crecimiento celular, aumentar la muerte celular o para tratar trastornos de proliferación celular. Por ejemplo, en un método y uso de la invención que incluye calor, la adición de calor estimula o acelera la difusión del agente fotosensible proporcionando de este modo un efecto aditivo o sinérgico. Como la invención emplea electroporación y agentes fotosensibles que no son tóxicos en el estado no activado, si se desea, la invención y los métodos y usos permiten un control sumamente delicado de la inhibición del crecimiento celular o del aumento de la muerte celular de las células indeseables o hiperproliferativas, evitando las células o el tejido sano que las rodean. Por ejemplo, electroporar tejido enfermo o células hiperproliferativas con un agente fotosensible, mientras que se evita la electroporación del tejido no enfermo o células normales, tiene como objetivo la muerte de células o tejido concretos mientras que se evita la muerte de las células o el tejido normales. De manera similar, la aplicación de luz a una población de células tumorales electroporadas que contienen un agente fotosensible sin aplicar luz al tejido normal que las rodea no electroporado minimiza también la muerte de las células del tejido normal o no dañado. De este modo, el equipo, los métodos y los usos de la invención se pueden usar para tratar más eficazmente un trastorno de proliferación celular en un sujeto, incluyendo, por ejemplo, cánceres.

El término agente fotosensible se usa en el presente documento en sentido amplio para significar una molécula que es directa o indirectamente tóxica para las células cuando se activa o excita mediante la luz, el calor, campos electromagnéticos u otro estímulo físico, químico (por ejemplo pH) o medioambiental capaz de producir el estado activado o excitado. El término agente activado se refiere a un agente activado o excitado de esta manera. Entre los agentes fotosensibles se incluyen agentes que son directamente tóxicos para las células en estado excitado o activado, así como agentes que producen un producto de reacción, un subproducto o un producto intermedio que es tóxico para las células tras la posterior transición del agente del estado activado al estado desactivado. Por ejemplo, la tiopironina activada mediante luz no es tóxica per se, pero la tiopironina activada reacciona con oxígeno para producir especies de oxígeno tóxicas (por ejemplo, oxígeno en forma de radical libre).

A su vez, los radicales libres de oxígeno, oxidan sustancias orgánicas, entre las que se incluyen, por ejemplo, ácidos nucleicos, proteínas, lípidos, carbohidratos y similares. La oxidación de una cantidad suficiente de tales componentes celulares puede inhibir el crecimiento celular o inducir la muerte de las células.

Típicamente, los agentes fotosensibles son moléculas pequeñas con estructuras de anillos, aunque tales agentes pueden ser cualquier producto químico, medicamento, proteína péptido, compuesto o conjugado de ellos de tal modo siempre que la molécula sea directa o indirectamente tóxica tras activación o excitación. Tal y como se usa en este documento, el término agente fotooxidante se refiere a un agente fotosensible que, directa o indirectamente, produce la modificación de componentes, generalmente caracterizada por oxidación. Aunque se prefieren agentes fotooxidantes tales como tiopironina, protoporfirina y daunomicina, la invención no se limita a agentes fotooxidantes. Antes bien al contrario, se piensa que está incluido cualquier medicamento, producto químico, proteína, etc que es fotosensible, según se explica en el presente texto, el cual directa o indirectamente produce modificaciones de los componentes, de las cuales un número suficiente puede inhibir el crecimiento celular o inducir la muerte celular. Por ejemplo, un agente fotosensible puede, tras su activación, reducir directa o indirectamente componentes y podría ser denominado entonces agente fotorreductor. Un péptido o proteína apoptóticos fotosensibles (por ejemplo, fas) o un conjugado, tras activación, podrían, directa o indirectamente, inducir o favorecer la apoptosis celular y por tanto se podrían denominar agente fotoapoptótico. De este modo, se pueden incluir agentes fotosensibles que modifican componentes directa o indirectamente de diversas maneras.

Según se usa en este documento, el término componente significa una sustancia o molécula en una célula que puede ser modificada directa o indirectamente mediante el agente fotosensible activado o excitado, o un producto reactivo, subproducto o intermedio producido por el agente activado o la especie de su decaimiento. Generalmente, los componentes modificables son ácidos nucleicos, proteínas, lípidos, carbohidratos, moléculas orgánicas pequeñas (por ejemplo, hormonas esteroides) y otras sustancias que están presentes en las células de manera natural. Sin embargo, los componentes pueden ser sustancias que no aparecen de manera natural que, cuando se introducen en la célula, se modifican según se ha descrito previamente en el texto mediante un agente fotosensible, inhibiendo posteriormente tal modificación el crecimiento celular o promoviendo la muerte celular. Cuando se acumulan un número suficiente de componentes modificados que aparecen de forma natural o no natural, se puede inhibir el crecimiento celular o se puede aumentar la muerte celular.

Los agentes fotosensibles útiles para practicar los métodos de la invención y con el aparato de la invención pueden ser relativamente no tóxicos o tóxicos (es decir, citostáticos). Entre los agentes fotosensibles específicos se incluyen, por ejemplo: tiopironina, naranja de acridina, ftalocianinasulfonato de Zn, benzoporfirina, protoporfirina, hematoporfirina, PHOTOFRIN I, PHOTOFRIN II, ANTRIN, porficeno y derivados funcionales suyos. Entre los agentes citostáticos específicos se incluyen, por ejemplo, daunomicina, adriamicinas y actinomicinas, antramicinas, mitomicinas, fenilacidas, cromomicina A, azul de metileno y mitramicina A.

Otros agentes fotosensibles son: PHOTOFRIL, colorantes orgánicos, Azul Rápido Monostral ("Monostral Fast Blue"), diporfirinas y diclorinas sintéticas, hidroporfirinas tales como clorinas y bacterioclorinas de la serie de las tetra(hidroxifenil)porfirina, ftalocianinas, tetrafenilporfirinas sustituidas en el oxígeno, 3,1-meso-tetrakis-(propionamido-
fenil)porfirina, verdinas, purpurinas, derivados de zinc y estaño de la octaetilpurpurina (NT2), etiopurpurina (ET2), clorinas, clorina e6, derivado mono-1-aspartilo de la clorina e6, derivados de la benzoporfirina (BPD, por sus siglas en inglés), derivados monoácidos de la benzoporfirina, aductos de tetracianoetileno de la benzoporfirina, aductos con dimetilacetilendiarboxilato de la benzoporfirina, aductos Diels-Adler de benzoporfirina, un derivado de benzoporfirina con un anillo monoácido, productos derivados de la sulfonación de las ftalocianinas (PC, por sus siglas en inglés) de aluminio, como AlPC sulfonados, disulfonados (AlPCS_{2}), derivados tetrasulfonados, ftalocianinas de aluminio sulfonadas, naftalocianinas de zinc, antracenodionas, antrapirazoles, aminoantraquinona, colorantes de fenoxacina, derivados de fenotiazina, colorantes de calcogenapirilio, derivados catiónicos de selenio y teluropirilio, PC catiónica sustituida con anillos, feoforbida, hematoporfirina (HP), protoporfirina, porfirinas boradas y aductos de sensibilizantes adecuados con anticuerpos.

Otros agentes fotosensibles que se pueden usar en la invención se pueden encontrar, por ejemplo, en Thompson et al. (Patente de Estados Unidos número 5.277.913) y en Hearst et al. (Patente de Estados Unidos número 5.503.721).

Otras composiciones útiles para practicar el método y usos de la invención incluyen agentes visualizantes, tales como el ácido 5-amino-levulínico, que emite fluorescencia y es útil, por lo tanto, para visualizar el lugar objetivo. De este modo, en otra realización, un método y uso de la invención incluye el suministro de un agente visualizador.

También son útiles en los métodos y usos de la invención composiciones modificadas o derivadas que son análogos funcionales de los agentes fotosensibles descritos en este documento y que se conocen en la técnica. Tales composiciones modificadas pueden tener añadidos o eliminados grupos sulfato, grupos fosfato o grupos hidrofóbicos tales como grupos alifáticos o aromáticos, o pueden tener grupos funcionales adicionales conjugados a ellas (por ejemplo, biotina, estreptavidina, polihistidina, etc). También se pueden usar conjugados funcionales de agentes fotosensibles.

Según se usan en el presente documento, los términos impulso, pulso, impulso eléctrico, pulso eléctrico, electropulso y variaciones gramaticales suyas son intercambiables y se refieren todos ellos a un estímulo eléctrico. Aunque los diversos términos se usan frecuentemente en este texto en singular y en plural, no se pretende que el uso de una forma excluya al de la otra (es decir, la referencia a pulsos múltiples incluye un pulso único y viceversa). Los impulsos eléctricos preferidos son campos eléctricos pulsados tales como los aplicados a través de un aparato de electroporación, por ejemplo. Se comprende que la electroporación de una célula, tejido u órgano normal o dañado, se puede realizar in vitro, in vivo o ex vivo. La electroporación se puede llevar a cabo también utilizando células individuales, por ejemplo, suspensiones de células individuales o in vitro o ex vivo, opcionalmente en cultivos celulares.

Entre los pulsos eléctricos adecuados para electroporar una célula con un agente fotosensible se incluyen, por ejemplo, pulsos de ondas cuadradas, ondas exponenciales, formas de ondas oscilantes unipolares, formas de ondas oscilantes bipolares, otras formas de ondas que generan campos eléctricos, o combinaciones de ellas. Cada forma de onda de los pulsos tiene ventajas concretas; por ejemplo, los pulsos de forma de onda cuadrada proporcionan mayores eficacias de trasformación celular que los pulsos con forma de onda de decaimiento exponencial y son más fáciles de optimizar en una amplio intervalo de voltajes (Saunders, Guide to Electroporation and Electrofusion, 1991, pp. 227-47). Preferentemente, la forma de onda es un pulso de onda cuadrada.

Se puede suministrar el pulso eléctrico mediante cualquier dispositivo electrónico que proporcione un pulso eléctrico adecuado. Ejemplos de generadores de pulsos capaces de generar un campo eléctrico pulsado son, por ejemplo, el equipo ECM600, que puede generar una forma de onda exponencial y el aparato ElectroSquarePorator (T820), que puede generar una forma de onda cuadrada; ambos están disponibles en el proveedor BTX, una división de Genetronics, Inc. (San Diego, California, Estados Unidos de América). Otros aparatos del tipo de los usados en electroporación están disponibles comercialmente y se entiende que tales equipos se pueden usar para generar los pulsos que permiten poner en práctica los métodos de la invención. Sin embargo, el ECM600, el ElectroSquarePorator (T820) y otros equipos similares se pueden usar para proporcionar el pulso eléctrico al aplicador de pulsos del equipo de la invención, como se explica en este documento.

La intensidad del pulso para electroporación variará de aproximadamente 25 a aproximadamente 200 voltios, preferentemente de aproximadamente 40 a aproximadamente 100 voltios y más preferentemente de aproximadamente 50 a aproximadamente 80 voltios. Generalmente, la intensidad del campo, que se calcula dividiendo el voltaje por la distancia entre los electrodos (V/d, donde d está generalmente en cm), estará, generalmente, entre aproximadamente 10 voltios/cm y aproximadamente 6,0 kV/cm. La anchura o duración del pulso estará entre aproximadamente 100 microsegundos (\mus) y 50 milisegundos (ms), preferentemente entre aproximadamente 100 \mus y aproximadamente 25 ms y más preferentemente entre aproximadamente 100 \mus y 10 ms. La capacitancia variará, generalmente, de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000 \muF, preferentemente de aproximadamente 200 a aproximadamente 800 \muF, más preferentemente de aproximadamente 400 a aproximadamente 800 \muF. Se pueden aplicar de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 pulsos. Preferentemente, el número de pulsos está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 y, más preferentemente, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 pulsos. Lo más preferible es que se apliquen de 1 a 10 pulsos. Los distintos parámetros de los pulsos (esto es, voltaje, intensidad de campo, tipo de forma de la onda, duración, capacitancia y número de pulsos aplicados) para electroporar células in vivo se pueden encontrar en una base de datos mantenida por Genetronics, Inc. (San Diego, California, Estados Unidos de América). Los campos eléctricos necesarios para la electroporación de células in vivo son de magnitud similar, generalmente, a los requeridos para células in vitro; las magnitudes preferidas están en el intervalo de aproximadamente 10 V/cm a 6000 V/cm; de aproximadamente 10 V/cm a 2000 V/cm o de aproximadamente 100 V/cm a 1500 V/cm. Se describen parámetros de electropulsación in vivo para tumores y otros tejidos utilizando un equipo con electrodos de aguja en la solicitud que está en trámite junto con esta de número de serie 09/177.678, la cual es continuación en parte de la solicitud de número de serie 08/905.240.

La luz se puede aplicar antes, durante o después de la electroporación utilizando diversas fuentes de luz, siempre que sea de una longitud de onda adecuada y de suficiente energía como para activar el agente fotosensible. La activación de un agente fotosensible mediante la luz depende generalmente del espectro de absorción del agente, el cual depende de la composición química, la estructura, quiralidad, conformación, etc del agente. La cantidad o concentración del sensibilizante excitado depende de la cantidad de fotones absorbidos. Por ejemplo, la tiopironina tiene un máximo de absorción a 560 nm, la protoporfirina tiene máximos de absorción a 370 nm y 630 nm, la daunomicina tiene un máximo de absorción a 480 nm y, por lo tanto, luz de una longitud de onda que corresponde a los máximos de absorción es adecuada para la activación. A diferencia de los anteriores, los porficenos se activan con luz de longitudes de onda más largas, entre aproximadamente 650 y 950 nm. En consecuencia, se puede usar luz de banda ancha que tenga una longitud de onda de aproximadamente 300 a aproximadamente 950 nm para activar generalmente cualquier agente fotosensible que tiene un máximo de absorción dentro de la longitud de onda de la luz de banda ancha (esto es entre 300 y 950 nm).

Como una alternativa a aplicar luz de banda ancha, si se desea, se puede aplicar luz de intervalo de longitudes de onda más estrecho, que coincida con el máximo de absorción del agente concreto o que esté cerca de dicho máximo, para activar el agente. Como la activación inducida por la luz de un agente fotosensible se puede aumentar aumentando la energía de la luz aplicada al agente o se puede disminuir disminuyendo la energía de la luz aplicada al agente, la energía de la luz aplicada (en Julios /cm^{2}) se puede variar de tal modo que se regule la activación del agente fotosensible, si se desea.

Entre las fuentes de luz adecuadas que se pueden usar para aplicar luz de una longitud de onda que se pueda activar se incluyen, por ejemplo, lámparas de wolframio, láseres y diversos instrumentos artroscópicos y de fibra óptica. La selección de la fuente de luz dependerá de la aplicación concreta o del trastorno concreto de proliferación celular tratado. Por ejemplo, en un método de la invención practicado extracorpóreamente, la fuente de luz puede ser una lámpara de wolframio o un láser. Cuando la luz se aplica internamente (es decir, dentro de un sujeto), lo cual está fuera de la invención, la fuente de luz se puede aplicar mediante una varilla de fibra óptica, la cual se puede pasar hacia el interior del sitio objetivo mediante un artroscopia u otro dispositivo similar. Opcionalmente, una varilla de fibra óptica puede comprender varias fibras ópticas, que pueden pasarse hacia el interior de un sitio objetivo mediante un pequeño tubo hueco, tal como una aguja hipodérmica, por ejemplo.

Ciertas longitudes de onda son más eficaces para penetrar en la piel o en tejidos más profundos. Por ejemplo, las longitudes de onda de aproximadamente 400 nm o superiores comienzan a penetrar la piel; longitudes de onda más altas penetran en la piel a mayores profundidades. Así, una fuente de luz exterior que aplique luz con una longitud de onda mayor de aproximadamente 400 nm se puede usar para activar un agente fotosensible electroporado en una población de células de un espacio interior, tejido u órgano. Sin embargo, debido a que ciertas longitudes de onda de la luz (por ejemplo UV de 290-320 nm) tienen efectos nocivos sobre las células, tejidos u órganos normales, es importante que se tenga en cuenta la sensibilidad a la luz del tejido normal. De este modo, si es necesario, se puede usar una protección o blindaje adecuados, para proteger la piel, los tejidos o los órganos de la luz. De forma alternativa, se pueden usar fuentes de luz que apliquen luz de un intervalo estrecho de longitudes de onda (por ejemplo, de 650 a 750 nm) para activar un agente fotosensible (por ejemplo, porficenos), minimizando a la vez los efectos nocivos colaterales producidos por luz de longitudes de onda fuera del intervalo concreto.

De este modo, la longitud de onda, la energía y la cantidad de tiempo que la luz se aplica para activar el agente fotosensible electroporado dependerán, en consecuencia, del agente, del sujeto y de la naturaleza del trastorno de proliferación celular. En general, la energía aplicada estará entre aproximadamente 50 y aproximadamente 1000 J/cm^{2}, preferentemente entre aproximadamente 100 y aproximadamente 500 J/cm^{2}. El tiempo que la luz se aplica variará de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 4 horas, preferentemente de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 2 horas, más preferentemente de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 1 hora, siendo lo más preferible de aproximadamente 10 minutos a 30 minutos. No obstante, la persona conocedora de la técnica se dará cuenta de que la luz se puede aplicar durante períodos de tiempo significativamente más largos, por ejemplo, cuando luz visible activa el agente, tal como cuando se aplica un agente de manera tópica sobre la piel, la mera exposición a la luz solar o a la luz de interiores puede dar como resultado que se aplique luz de una longitud de onda activadora durante mucho más tiempo.

La difusión de agentes fotosensibles en las células que se produce tras electroporación se puede acelerar mediante el calor. Así, en otra realización, se puede aplicar calor antes, simultáneamente o después de aplicar un pulso eléctrico, en lugar de aplicar luz, además de aplicar luz o en cualquier momento entre el pulso eléctrico y la aplicación de la luz de una longitud de onda activable en un método de la invención. El calor se puede proporcionar colocando un elemento de calentamiento eléctrico típico dentro de un electrodo, tal como un electrodo de aguja, y aplicando el electrodo calentado a la célula, antes o después de la electroporación. De manera alternativa, el calor se puede proporcionar mediante un elemento de calentamiento o con energía de microondas, por ejemplo, con una fuente de calor externa. También se puede proporcionar calor con una fuente de luz, como, por ejemplo, una lámpara de wolframio o un láser. El calor aplicado debe producir una temperatura al menos 1ºC mayor que la temperatura ambiente o, cuando se aplica calor en un método de la invención practicado sobre un sujeto, al menos 1ºC mayor que la temperatura de las células, tejido u órgano del sujeto al cual se está aplicando el calor. De este modo, la temperatura de la fuente de calor aplicado variará de aproximadamente 18ºC a aproximadamente 50ºC (por ejemplo, para tratamiento local). Preferentemente, la temperatura de la fuente del calor aplicado será de aproximadamente 25ºC a aproximadamente 45ºC, más preferentemente de aproximadamente 36ºC a aproximadamente 42ºC. La temperatura concreta del sistema calorífico aplicado dependerá de las células o tejidos tratados, de si las células se tratan in vitro o in vivo, del agente fotosensible usado y del efecto terapéutico deseado.

En ausencia de luz o de otro fenómeno activante comparable, los agentes fotosensibles son preferentemente relativamente no tóxicos para las células; su toxicidad depende de la activación o del posterior decaimiento o relajación del estado activado, como se describe en el presente documento. Sin embargo, entre los agentes fotosensibles se incluyen medicamentos, productos químicos y otras sustancias que ya son tóxicas o reactivas, que se pueden hacer más reactivas o reactivas de otra manera o tóxicas cuando se activan o excitan por la luz, el calor, etc. Por ejemplo, determinados agentes quimioterapéuticos, que son inherentemente citotóxicos, como la daunomicina, pueden adquirir mayor citotoxicidad o hacerse más citotóxicos que en su estado no activado o no excitado mediante la exposición a la luz (Ejemplo I y Figura 3).

Según se usa en el presente documento, los términos citotóxico o citotoxicidad se refieren a toxicidad frente a células, tejidos, órganos o un sujeto. La toxicidad se puede cuantificar en células o en animales como la cantidad de un agente que se necesita para inducir la muerte del 50% de las células (esto es, ED_{50}), por ejemplo, o mediante otros métodos bien conocidos en la técnica.

Los agentes fotosensibles utilizados en un método y uso de la invención se pueden administrar mediante cualquier modo apropiado. Entre los modos apropiados de administración se incluyen, por ejemplo, inyección intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intraespinal, intracraneal, intracavidades, etc. Otros modos adicionales de administración son: oral (en píldoras, líquido o polvo), intravaginal, rectal (por ejemplo, supositorios), bucal, intraocular, intranasal, tópico (por ejemplo, extendiendo el producto o mediante un parche impregnado de medicamento), por inhalación (por ejemplo, mediante un aerosol u otro dispositivo productor de gotitas). El término tópico se usa aquí para referirse a la administración de una composición sobre la superficie de la piel o de las mucosas. Las composiciones se puede administrar como una dosis única grande, mediante perfusión gradual a lo largo del tiempo o mediante un dispositivo de suministro del medicamento implantable que puede liberar una cantidad de medicamento que el usuario puede definir, por ejemplo.

Generalmente, los agentes fotosensibles, cuando se usan para la preparación de una composición farmacéutica según la invención, estarán en forma de formulación farmacéuticamente aceptable o fisiológicamente aceptable para su uso terapéutico. Según se usa en este documento, los términos farmacéuticamente aceptable y fisiológicamente aceptable se refieren a vehículos, diluyentes, excipientes y similares que se pueden administrar a un sujeto, preferentemente sin excesivos efectos colaterales adversos (por ejemplo, dolor de cabeza, molestias estomacales, etc). Las formulaciones concretas incluyen disoluciones acuosas o no acuosas, suspensiones, emulsiones, aceites u otras formulaciones líquidas adecuadas para los modos de administración descritos en este documento y conocidos además en la técnica. Tales formulaciones son compatibles con el agente fotosensible o resultan inertes para él y para su capacidad de ser activado, según se describe en este documento. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol (PEG) en sus diversos pesos moleculares (por ejemplo, PEG 400, PEG 400 monoestearato, PEG 4000, etc), glicerina, polivinilpirrolidona (PVP), alcohol polivinílico (PVA, por sus siglas en inglés), manitol, aceites vegetales tales como el aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables como el oleato de etilo. Entre los vehículos acuosos se incluyen agua, disoluciones acuosas de alcoholes, emulsiones y suspensiones, incluyendo medios salinos o tamponados. Los vehículos incluyen disolución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, lactato de Ringer o aceites fijados. Entre los vehículos intravenosos se incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores electrolíticos (tal como los basados en la dextrosa de Ringer) y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, como, por ejemplo, agentes antimicrobianos, agentes quelantes (por ejemplo EDTA, EGTA) y gases inertes y similares. También es posible atrapar o encapsular un agente fotosensible en microcápsulas preparadas mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, utilizando microcápsulas de gelatina o hidroximetilcelulosa o microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, o en sistema de entrega de medicamentos coloidal. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos macromoleculares, nanocápsulas, microesferas y sistemas a base de lípidos que incluyen emulsiones aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. La preparación de una formulación farmacéutica apropiada para uso terapéutico es algo bien establecido dentro del conocimiento general de la técnica (ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences,
supra, 1997).

También puede incluirse con la formulación un mejorador o promotor de la permeación para aumentar la electroporación del agente fotosensible en la célula. Según se usa en este documento, el término "promotor de la permeación" se refiere a cualquier acción (por ejemplo, mecánica, física) o cualquier composición que pueda aumentar la electroporación. El término aumentar, cuando se usa en este documento como un modificador de electroporación, quiere decir que la tasa a lo largo del tiempo o la cantidad de composición electroporada en las células es mayor que la producida en ausencia del promotor de permeación. De este modo, se puede mezclar un promotor de permeación con el agente fotosensible en una formulación farmacéutica, por ejemplo, para aumentar la electroporación del agente fotosensible. Entre las composiciones promotoras de la permeación que aumentan la permeabilidad de las células se incluyen, por ejemplo, alcoholes (por ejemplo metanol), alquilmetilsulfóxidos (por ejemplo DMSO), pirrolidonas (por ejemplo 2-pirrolidona), surfactantes urea, monolaurato de glicerol, monolaurato de polietilenglicol, hidrocloruro de docaína, hidrocortisona, mentol, salicilato de metilo y similares.

Los agentes fotosensibles se electroporarán en una célula en una cantidad tal que cuando se activen o exciten, el agente activado sea suficiente para inhibir el crecimiento celular o aumentar la muerte celular. Tales cantidades se consideran también eficaces para tratar un trastorno de proliferación de células en un sujeto, cuando se produce un efecto terapéutico deseado, por ejemplo, se inhibe la proliferación celular, se inhibe el crecimiento de las células de un tumor, se aumenta la muerte de las células de un tumor, etc. Así, una "cantidad eficaz" significa una cantidad de agente que es suficiente para disminuir la gravedad o mejorar las señales o síntomas de la situación clínica (por ejemplo, se inhibe el crecimiento de un tumor). La cantidad no debería ser tan grande como para provocar efectos colaterales excesivos que resultan de la inhibición del crecimiento celular normal o del aumento de la muerte de las células normales o sanas. La cantidad necesaria variará dependiendo del agente fotosensible que se use, del tipo de células que se traten, del trastorno proliferativo que se trate, de la gravedad del trastorno que se está tratando, de la eficacia de la electroporación de las células, del sujeto tratado, del tipo, edad, condición general del sujeto y del modo de administración del agente, etc. De este modo, aunque no es posible especificar una cantidad eficaz exacta, se puede determinar una cantidad eficaz apropiada en un caso individual utilizando las enseñanzas generales disponibles en la técnica referentes a las dosis de medicamentos fotooxidantes utilizadas para el tratamiento de tumores sólidos, por ejemplo (ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pensylvannia, Estados Unidos de América, 1990; The Merck Index, 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, New Jersey, Estados Unidos de América, 1996).

Los agentes fotosensibles descritos previamente en el texto y otros no específicamente descritos aquí son útiles en diversas situaciones clínicas caracterizadas por la proliferación anormal o indeseable de células y se pueden administrar sólos, combinados con cada uno de los otros, o combinados con otras composiciones y métodos diferentes, para tratar un trastorno de proliferación celular en un método y uso de la invención. Por ejemplo, la electroporación de dos o más agentes fotosensibles puede producir un efecto aditivo o sinérgico en comparación con la electroporación de un único agente. Se pueden utilizar agentes tales como el naranja de acridina (450 nm), tiopironina (560 nm) y azul de metileno (650 nm) en distintas combinaciones. De manera similar, la electroporación de un agente fotosensible en combinación con un medicamento antineoplástico o con radiación puede producir un efecto aditivo o sinérgico en comparación con bien solo la electroporación del agente fotosensible o bien solo el tratamiento con el medicamento antineoplásico o la radiación. Entre los medicamentos concretos que se pueden administrar en dicho método de la invención se incluyen, por ejemplo, bleomicina, neocarcinoestatina, suramina, doxorubicina, carboplatina, taxol, mitomicina C y cisplatino. De manera similar, se puede emplear otros agentes quimioterapéuticos, bien conocidos por las personas preparadas en la técnica (ver, por ejemplo, Bayley et al., documento de Patente de Estados Unidos número 5.777.078 y J. S. Malpas, Chemotherapy en: Introduction to the Cellular and Molecular Biology of Cancer, L. M. Franks y N. Teich (editores), Oxford Science Publications, Oxford University Press, New York, páginas 363-377 (1986)). De manera similar, los métodos de la invención se pueden emplear en combinación con la rescisión quirúrgica de un crecimiento benigno o de un tumor sólido.

El método y los usos de la invención para inhibir el crecimiento celular o para aumentar la muerte celular descritos en este documento, se pueden practicar en un sujeto, preferentemente un sujeto mamífero (por ejemplo, los que se usan típicamente en los laboratorios, tales como simios, conejos, conejillos de indias, ratas, ratones; ganado como cerdos, vacas, ovejas, caballos; animales domesticados como perros, gatos, hurones), más preferentemente un sujeto humano.

De este modo, en otra realización, la invención proporciona usos según se han descrito previamente en el texto para tratar un trastorno de proliferación celular en un sujeto. El tratamiento se practica administrando un agente fotosensible que es directa o indirectamente tóxico para las células a un sujeto que tiene o se sospecha que tenga un trastorno de proliferación de células; aplicando un pulso eléctrico al menos a una célula en el sujeto de una intensidad y duración suficientes para electroporar la célula con el agente fotosensible y aplicando luz de una longitud de onda activadora a la célula activando, de este modo, el agente y tratando el trastorno de proliferación celular.

Se consideran diversos trastornos de proliferación celular para su tratamiento en el método o uso de la invención. Por ejemplo, se pueden tratar así trastornos benignos de proliferación de células, como los trastornos autoinmunes (por ejemplo, lupus, artritis reumatoide, etc), nódulos, crecimientos fibróticos, quistes, oclusiones, soriasis (por ejemplo, 1 mg/kg) y similares. Entre otros trastornos de proliferación de células adicionales adecuados está el cáncer, como cánceres de piel, tumores sólidos, cánceres hematopoyéticos (por ejemplo linfoma histiocítico, mielomas, leucemia), ya seas con metástasis o sin ella. Entre los cánceres concretos (que se pueden tratar) están: tumores de pulmón, cerebro, cabeza y cuello, cánceres de estómago, de vejiga, de hígado, de páncreas, de riñón, de colon, de pecho, uterino, de ovarios, de próstata y testicular.

Un método o uso de la invención para tratar un trastorno de proliferación celular en un sujeto puede utilizar diversos dispositivos. Por ejemplo, para practicar el tratamiento de un desorden de proliferación celular se puede usar un catéter de electroporación, como el que se describe en la solicitud de numero de serie 08/668.725. Adicionalmente, el equipo de la invención se puede usar para practicar los métodos o los usos de la invención. El equipo comprende un agente fotosensible que es directa o indirectamente tóxico para las células cuando se activa; un electrodo capaz de aplicar un pulso eléctrico de suficiente intensidad y duración para electroporar una célula en un sujeto; un conductor de luz para aplicar luz de una longitud de onda activadora a la célula electroporada y una fuente de luz para activar el agente.

Un electrodo del aparato, unido de manera operativa a una fuente de voltaje de corriente continua, aplicará un pulso eléctrico. Un conductor de luz, unido operativamente a la fuente de luz, estará en una posición con respecto al electrodo de la invención que permitirá la aplicación de luz a la célula electroporada. Las células, el tejido o un órgano electroporado con un pulso que procede de un electrodo se exponen a la luz que procede de un conductor de luz, activando así el agente fotosensible. De este modo, se administra una composición tal como un agente fotosensible a un tejido u órgano enfermos o a un tumor, se aplica un pulso con el electrodo en o sobre el tejido, electroporando de este modo las células, el órgano o el tumor. La luz se aplica en algún instante antes de, simultáneamente a o después de aplicar el pulso, activando de este modo el agente fotosensible.

Según se usa en este documento, los términos "unido operativamente o conectado operativamente", o variaciones gramaticales de los mismos, se refieren a la relación entre dos o más elementos que permiten a los mismos funcionar juntos de la manera deseada. Así, dos o más elementos unidos operativamente o conectados operativamente pueden estar conectados físicamente en estrecha asociación, pero no se requiere que estén tan conectados. Por ejemplo, un electrodo unido operativamente a una fuente de voltaje de corriente continua está conectado con ella de tal forma que permiten que el pulso proporcionado por la fuente de tensión de corriente continua se entregue al electrodo para su aplicación en la célula. Un conductor de luz unido operativamente a una fuente de luz está conectado de tal manera que permite que la luz proporcionada por la fuente se entregue al conductor de luz para aplicarla a la célula electroporada.

En este documento se incluyen diversas realizaciones del equipo de la invención. Por ejemplo, puesto que luz de diversas longitudes de onda (esto, es, de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 950 nm) puede activar un agente fotosensible, se cuenta con distintos conductores de luz. En una realización, el conductor de luz aplica luz proporcionada por un láser. En otra realización, el conductor de luz es un láser. En otra realización más, el conductor de luz aplica luz proporcionada por un emisor de longitud de onda visible, tal como la proporcionada por una lámpara de wolframio. Todavía en otra realización más, el conductor de luz es un emisor de luz de longitud de onda visible o una lámpara de xenón de alta presión con un filtro UV o una lámpara de presión de mercurio con filtro UV.

Los conductores de luz se pueden seleccionar o modificar de forma que sean útiles para aplicar la luz internamente. Así, en una realización, el conductor de luz comprende una varilla de fibra óptica. La luz procedente de una fuente de luz se trasmite a la varilla de fibra óptica (por ejemplo, un láser o un emisor de luz visible). Están disponibles comercialmente varillas de fibra óptica adecuadas y otros dispositivos de luz endoscópicos hechos con materiales inertes o biológicamente compatibles, tal como varillas y dispositivos con una amplia variedad de tamaños y configuraciones. Cualquiera de tales varillas se puede emplear en un equipo de la invención siempre y cuando la luz aplicada sea de una longitud de onda activadora. Se pueden modificar las varillas de fibra óptica para que sean flexibles para que permitan un paso suave a través de órganos, tejidos, vasos y similares. También se pueden modificar las varillas para que sean eléctricamente conductoras y funcionen como electrodos. Por ejemplo, en una realización, una varilla de fibra óptica tiene una rejilla metálica sobre la superficie exterior, la cual puede aplicar un pulso eléctrico apropiado, así como permitir el paso de la luz a través del patrón de la rejilla. En otra realización, una varilla de fibra óptica tiene una película metálica delgada depositada sobre la superficie exterior, de nuevo para que funcione como un electrodo, siendo la película metálica preferentemente transparente, de tal modo que permita el paso de la luz a su través.

En otra realización, la varilla de fibra óptica comprende varias fibras ópticas. Según se usa en este documento, el término "varias" se refiere a dos o más.

Se consideran diversas realizaciones del equipo de la invención en lo que se refiere a los tipos de electrodos y configuraciones. En una realización, el equipo incluye al menos dos electrodos de agujas, uno de los cuales opcionalmente es hueco, lo cual puede ser útil para proporcionar una composición a la célula (por ejemplo una agente fotosensible en una formulación farmacéuticamente aceptable). La disposición considerada de un electrodo de aguja hueco y una fuente de luz es similar a una disposición de agujas laparoscópicas en la cual las agujas que funcionan para la inyección de sustancias terapéuticas en los tejidos también funcionan como electrodos para electroporación para partes de células o tejido in vivo y se usa una fuente de luz para el examen endoscópico, como se describe en la solicitud de número de serie 09/177.678, la cual es, en parte, una continuación de la solicitud de número de serie 08/905.240. La aguja que conduce la luz funciona con luz dispersa y difusa de alta intensidad para iluminar el tumor completo, objetivo por el cual el conductor de la luz es más corto que las agujas. El documento de Patente de Estados Unidos número 5.273.525 describe una jeringa para inyectar moléculas y macromoléculas y para electroporación en el cual las agujas para inyección funcionan también como electrodos. Tales dispositivos se pueden modificar, como se describe en este texto, y conectar a un conductor de luz (por ejemplo, un láser) utilizando los conocimientos disponibles generalmente en la técnica.

En otra realización, la invención proporciona un equipo en el cual los electrodos de agujas se amplían además con una o más fibras ópticas que comprenden el conductor de luz. En una realización alternativa, una o más fibras ópticas se sitúan entre dos electrodos de aguja. En otra realización, la configuración de electrodos y fibras ópticas es tal que el tejido que se va a electroporar se puede ver utilizando la iluminación proporcionada por la fibra óptica, mientras que las puntas de las agujas electrodo se insertan en el tejido u órgano para la posterior electroporación. Se pueden emplear fibras ópticas de diferentes tamaños que son compatibles con electrodos de aguja. Por ejemplo, una fibra óptica de 400 micrómetros puede encajar dentro de una aguja de calibre 23. En otra realización preferida, un equipo de la invención tiene al menos un electrodo calentable, modificable opcionalmente como se describe en este documento, en lo que se refiere a las diversas realizaciones de un electrodo. Para la persona conocedora resultarán aparentes modificaciones o variaciones adicionales del equipo de la invención y, en consecuencia, se incluyen también. Además de los electrodos de aguja, también son importantes electrodos flexibles y que puedan curvarse y torcerse para tumores superficiales con dimensiones cuadradas (por ejemplo, necrosis). En este caso se incluyen sensibilizantes en liposomas entre los electrodos planos antes de realizar los pulsos. La irradiación tiene lugar directamente desde la parte posterior a través de la platina sin ningún conductor de luz.

Los siguientes Ejemplos pretenden ilustrar pero no limitar la invención. Si bien son característicos de aquellos que podrían usarse, alternativamente se podrían usar otros procedimientos y aplicaciones de los métodos de la invención conocidos por aquellas personas preparadas en la técnica.

Ejemplo I

Este Ejemplo muestra que electroporar células con un agente fotosensible (tiopironina, protoporfirina y daunomicina) e irradiar posteriormente las mismas produce una mayor muerte celular que tratar células con un agente fotosensible e irradiar posteriormente solo (es decir, sin la electroporación).

Las células se hicieron crecer en un medio RPMI 1649 (Sigma Aldrich) en una concentración fisiológica de NaCl o 0,6 molar de manitol, suplementada con 10% de suero fetal bovino (BIO Whittaker), 100 \mug/ml de estreptomicina (PAA, Marburg) y 100 U/ml de penicilina (PAA, Marburg), a 37ºC en un incubador con 5% de CO_{2} y 90% de humedad.

Los agentes fotosensibles ensayados fueron: tiopironina (TP; Merck, máximo de absorción de 560 nm), que reacciona principalmente según el tipo 1, oxidando guanosina con una constante de velocidad 3,8\cdot10^{6} l/Ms (Gollmick et al, J. Photochem. Photobiol (en alemán), 16:447-453 (1972)); protoporfirina (PP; Sigma, máximo de absorción a 370 nm), un fotosensibilizador importante terapéuticamente (Woodburn et al, Br. J. Cancer 65:321-328 (1992)), que reacciona principalmente según el tipo 2 y daunomicina (DAM, ZIMET, Jena, máximo de absorción a 480 nm), un medicamento antineoplástico que reacciona principalmente según el tipo 1, el cual muestra también una actividad citostática en la oscuridad (Berg et al, Bioelectrochem. Bioenerg. 16: 135-148 (1986)). Los agentes fotosensibles son estables durante la irradiación en disolución acuosa.

Se colocaron aproximadamente 200 \mul o 400 \mul de una suspensión de células U937 (10^{6} - 10^{7} células/ml) en presencia de 20 \mul y 40 \mul del agente fotosensible (1 x 10^{-5} M), respectivamente, en una cubeta de laboratorio desechable con electrodos de aluminio clavados separados 0,2 cm. La mezcla de células U937 y de agente fotosensible se sometió a un pulso individual a 250 V (equivalente a una intensidad de campo de 1,2 kV/cm), 400 \muF, anchura de pulso 11-12 ms, pulso de decaimiento exponencial, aplicado con un BTX ECM-600.

Las cubetas electropulsadas y de control (éstas, sin pulsar) se colocaron a ambos lados de lámparas de wolframio de 650 watios (Narva, Berlín, máximo de emisión a 900 nm o lámpara de punto Osram, 250 watios) a 37 cm de distancia en el área de enfoque de dos lentes idénticas y luego se irradiaron durante 14 minutos. De esta forma, tenemos dos haces de luz idénticos para las cubetas pulsadas y las no pulsadas de control. Hay dos cámaras de agua, de 4 cm de grueso, entre la lámpara y las lentes para absorber el calor. Los estudios se llevaron a cabo a temperatura ambiente (18-22ºC).

Se determinó la viabilidad de las células tras la irradiación (con y sin electroporación) mediante exclusión con azul de tripano; se contaron las células muertas coloreadas en relación a las células no coloreadas, así como en la disolución de control sin tratamiento con pulso. Las células se visualizaron mediante un vídeo microscopio inverso (Olympus, Japón). Los resultados de estos estudios para las células U937 se muestran en la Tabla 1 que va a continuación:

TABLA 1

1

Como se muestra en la Tabla 1, la electroporación de las células con un agente fotosensible y la posterior irradiación con luz produce un aumento significativo de la muerte celular respecto de la irradiación sola.

Sin el filtro de vidrio y agua para absorber el calor generado por la lámpara de wolframio, la temperatura de la suspensión de células sube desde aproximadamente 22ºC a aproximadamente 37ºC durante los 14 minutos de irradiación y la muerte de las células se incremente en un 14% adicional. Los resultados para células U937 electroporadas irradiadas durante períodos de tiempo más cortos (menos de 14 minutos) fueron más pronunciados, puesto que la proporción experimento/control es superior. La penetración y, según se esperaba, el efecto en la oscuridad de la daunomicina (sin irradiación) aumentan también con el tiempo para las células sin pulsar. Células de cáncer de pecho MCE-7 examinadas en un ensayo de fotosensibilidad similar mostraron el mismo efecto combinado de electroporación e irradiación que las células U937. Observamos datos similares con células MCF7 y K562.

Ejemplo II

Este Ejemplo muestra que electroporar células con un agente fotosensible (tiopironina, protoporfirina y daunomicina) e irradiar posteriormente las mismas, durante períodos de tiempo aumentados produce un aumento de la muerte celular.

Se llevaron a cabo estudios adicionales de electroporación y muerte celular como se han descrito anteriormente, excepto por el hecho de que se utilizó para la electroporación un pulso de mayor amplitud de 400 V con una capacitancia de 800 \muF (equivalente a una intensidad de campo de 2 kV/cm). Se irradiaron células pulsadas o no pulsadas; después, cada 2-4 minutos se extrajo una parte alícuota de células irradiadas de 20 \mul y se mezcló con 20 \mul de azul1 tripano para determinar su viabilidad, como en el caso anterior. Como se muestra en las figuras 1 a 3, de aproximadamente 90 a 98% de las células resultaron muertas mediante la electroporación con tiopironina, protoporfirina y daunomicina, respectivamente, y la posterior irradiación.

Claims (42)

1. Un método in vitro o ex vivo para inhibir el crecimiento celular o aumentar la muerte celular que comprende:

a)

proporcionar a una célula un agente fotosensible, el cual es directa o indirectamente tóxico para las células cuando se activa;

b)

aplicar un pulso eléctrico a la célula de una intensidad y duración suficientes para electroporar la célula con el agente fotosensible y

c)

aplicar luz de una longitud de onda activadora a la célula, activando de este modo el agente e inhibiendo el crecimiento celular o aumentando la muerte celular de la célula electroporada.

2. Uso de un agente fotosensible el cual es directa o indirectamente tóxico para las célula cuando se activa, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar un trastorno de proliferación celular en un sujeto, en el cual dicho agente tiene que (a) ser entregado a las células electroporadas de dicho sujeto y (b) ser activado mediante luz de una longitud de onda activadora.

3. El método de la reivindicación 1, en el que se consigue la electroporación aplicando múltiples pulsos eléctricos.

4. El método de las reivindicaciones 1 o 3, en el que la amplitud del pulso es de aproximadamente 0,1 a 6,0 kV/cm.

5. El método de las reivindicaciones 1, 3 o 4, en el que la anchura del pulso es aproximadamente 0,1 a 10 milisegundos.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 5, en el que el pulso se aplica utilizando al menos dos electrodos.

7. El método de la reivindicación 6, en el que al menos un conductor de luz se combina con el electrodo.

8. El método de la reivindicación 7, en el que el electrodo y el conductor de luz comprenden una configuración de catéter de electroporación.

9. El método de las reivindicaciones 7 u 8, en el que el conductor de la luz comprende una varilla de fibra óptica.

10. El método de la reivindicación 7, en el que los electrodos comprenden al menos dos electrodos de aguja.

11. El método de la reivindicación 10, en el que los electrodos de aguja se pueden calentar.

12. El método de las reivindicaciones 10 u 11, en el que los electrodos de aguja se amplían además con una o más fibras ópticas que comprenden el conductor de luz.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 12, en el que la luz se aplica antes de, simultáneamente a o después del pulso.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 13, en el que la luz se aplica mediante un láser, una lámpara incandescente de wolframio o una lámpara de ultravioleta cercano.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 14, en el que la luz tiene una longitud de onda de aproximadamente 300 a 950 nm.

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 15, en el que la cantidad de luz aplicada es de aproximadamente 50 a 1000 J/cm^{2}.

17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 16, en el que la luz se aplica con una varilla de fibra óptica.

18. El método de las reivindicaciones 9 o 17, en el que la varilla de fibra óptica comprende varias fibras ópticas.

19. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 18, que comprende además aplicar calor a la célula.

20. El método de la reivindicación 19, en el que se aplica calor a una temperatura de aproximadamente 36 a 42ºC.

21. El método o uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que el agente fotosensible es un agente fotooxidante.

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22. El método o uso de la reivindicación 21, en el que el agente fotooxidante se elige en el grupo que consiste en: tiopironina, naranja de acridina, ftalocianina-sulfonato de zinc, benzoporfirina, protoporfirina, hematoporfirina, PHOTOFRIN I, PHOTOFRIN II, ANTRIN y porficeno.

23. El método o uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que el agente fotosensible es un agente citostático.

24. El método o uso de la reivindicación 23, en el que el agente citostático se elige en el grupo que consiste en daunomicina, adriamicina y actinomicina.

25. El método o uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, que comprende además proporcionar un agente sensibilizante.

26. El método o uso de la reivindicación 25, en el que el agente sensibilizante es ácido levulínico o protoporfirina IX.

27. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 26, en el que dicho sujeto es un ser humano.

28. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 27, en el que los electrodos comprenden electrodos quebrados.

29. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 28, en el que dicho trastorno de proliferación celular es benigno o un cáncer.

30. El uso de la reivindicación 29, en el que el cáncer se escoge en el grupo que consiste en cáncer de piel, un tumor sólido, un cáncer con metástasis y un cáncer hematopoyético.

31. El uso de la reivindicación 30, en el que el cáncer hematopoyético es un linfoma histiocítico.

32. Un aparato para tratar un trastorno de proliferación celular en un sujeto que comprende:

a)

un agente fotosensible que es directa o indirectamente tóxico para las células cuando se activa;

b)

un electrodo capaz de aplicar un pulso eléctrico de intensidad y duración suficientes para electroporar una célula en un sujeto;

c)

un conductor de luz para aplicar luz de una longitud de onda activadora a la célula electroporada y

d)

una fuente de luz para activar el agente.

33. El aparato eléctrico de la reivindicación 32, en el que el conductor de luz aplica luz proporcionada por un láser.

34. El aparato eléctrico de las reivindicaciones 32 o 33, en el que el conductor de luz es un láser.

35. El aparato eléctrico de la reivindicación 32, en el que el conductor de luz aplica luz proporcionada por un emisor de longitud de onda visible.

36. El aparato eléctrico de la reivindicación 32, en el que el conductor de luz comprende un emisor de longitud de onda visible.

37. El aparato eléctrico de la reivindicación 32, en el que el conductor de luz comprende una varilla de fibra óptica.

38. El aparato eléctrico de la reivindicación 37, en el que la varilla de fibra óptica tiene una rejilla metálica en la superficie exterior.

39. El aparato eléctrico de la reivindicación 37, en el que se deposita una película metálica sobre la superficie exterior de la varilla de fibra óptica.

40. El aparato eléctrico de la reivindicación 32, en el que el electrodo comprende al menos dos electrodos de aguja.

41. El aparato eléctrico de la reivindicación 40, en el que los electrodos de aguja están, además, ampliados con una o más fibras ópticas que comprenden el conductor de luz.

42. El aparato eléctrico de las reivindicaciones 40 o 41, en el que los electrodos de aguja se pueden calentar.