ES2285128T3 - Polipeptidos que tienen actividad amida del alfa-h-alfa aminoacido racemasa y los acidos nucleicos que codifican los mismos. - Google Patents
Polipeptidos que tienen actividad amida del alfa-h-alfa aminoacido racemasa y los acidos nucleicos que codifican los mismos. Download PDFInfo
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Abstract
Polipéptido aislado que tiene actividad amida del a-H-a aminoácido racemasa y que tiene un grado de identidad con la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID: NO. 2 de al menos alrededor del 55%, en particular de al menos alrededor del 65%, más en particular de al menos alrededor del 75%, aún más en particular de al menos alrededor del 85%, aún más en particular de al menos alrededor del 90%, aún más en particular de al menos alrededor del 95%, y lo máximo en particular de al menos alrededor del 97%.
Description
Polipéptidos que tienen actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa y los ácidos nucleicos que codifican los mismos.
La invención se relaciona con polipéptidos
aislados que tienen actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa y los ácidos nucleicos que codifican los mismos. La
invención también se relaciona con los vectores y las células
hospederas que comprenden los ácidos nucleicos de acuerdo a la
invención. La invención también se relaciona con los métodos para
producir y usar los polipéptidos de acuerdo a la invención. La
invención también se relaciona con un método para aislar los
polipéptidos que tienen actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa, para aislar los ácidos nucleicos que codifican los mismos
y para aislar los microorganismos que comprenden los polipéptidos
que tienen actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa. La invención también se relaciona con nuevos
microorganismos que comprenden los polipéptidos que tienen actividad
amida del \alpha-H-\alpha
aminoácido racemasa.
Las amidas de los
\alpha-H-\alpha aminoácidos son
compuestos fácilmente disponibles y son precursores importantes en
la producción de productos farmacéuticos y de
\alpha-H-\alpha aminoácidos. Por
ejemplo, los \alpha-H-\alpha
aminoácidos enantioméricamente enriquecidos pueden ser obtenidos a
partir de mezclas de amidas del D y
L-\alpha-H-\alpha
aminoácido con un exceso enantiomérico (ee) seleccionado de manera
aleatoria por hidrólisis enzimática enantioselectiva de uno o más
enantiómeros de la amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido. Por
ejemplo, el Ochrobactrum anthropi NCIMB 40321 es capaz de
hidrolizar de manera L-selectiva las amidas del
ácido
N-hidroxi-\alpha-amino,
\alpha-H-\alpha-amino,
\alpha-alquil-\alpha-amino,
N-hidroxi-\alpha-amino
a amidas de ácido \alpha-hidroxi (van den Tweel,
W.J.J. y otros, Appl. Microbiol. Biotechnol. (1993)
39:296-300). La EP 0494716-A2
describe la preparación catalizada por enzimas de un ácido
carboxílico \alpha-sustituido ópticamente activo,
usando hidrólisis enantioselectiva de una mezcla de enantiómeros de
la amida correspondiente, siendo usada un Ochrobactrum
anthropi o Klebsiella sp. como la enzima. En tal proceso
para la preparación de
\alpha-H-\alpha aminoácidos
enantioméricamente enriquecidos, la racemización simultánea de las
amidas de los \alpha-H-\alpha
aminoácidos sería de una gran ventaja porque la conversión completa
de la amida del \alpha-H-\alpha
aminoácido en el \alpha-H-\alpha
aminoácido ópticamente activo deseado es posible. También, en otros
procesos la racemización de las amidas de los
\alpha-H-\alpha aminoácidos es
frecuentemente deseada. Como la racemización enzimática es
preferible por encima de la racemización química (condiciones de
reacción moderadas, beneficios medioambientales, etc.), muchos
intentos han sido hechos para identificar microorganismos con
actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa y para aislar polipéptidos con actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa y genes que codifican esa actividad.
Para el propósito de la presente invención, la
actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa es definida como la capacidad para catalizar la
racemización de una amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
enantioméricamente enriquecido de acuerdo a la fórmula 1,
donde R^{1} representa un alquilo
opcionalmente sustituido de 1-20 átomos de C o un
(hetero)arilo opcionalmente sustituido de
3-20 átomos de C (los átomos de C de los
sustituyentes incluidos) y donde R^{2}, R^{3} y R^{4} cada
uno independientemente representa H o un alquilo opcionalmente
sustituido de 1-20 átomos de C o un
(hetero)arilo opcionalmente sustituido de
3-20 átomos de C (los átomos de C de los
sustituyentes incluidos) y donde R^{1} puede formar un anillo con
R^{2} y/o R^{3} puede formar un anillo con R^{4} junto con
los átomos de carbono y/o nitrógeno a los cuales ellos están unidos.
Cada anillo tiene preferiblemente 5-8 miembros.
Preferiblemente, R^{1}, R^{2}, R^{3} o R^{4} cada uno
independientemente representa un alquilo de 1-10
átomos de C o un (hetero)arilo de 3-10 átomos
de C (los átomos de C de los sustituyentes incluidos). Los
sustituyentes en el alquilo o el (hetero) arilo pueden ser
seleccionados del grupo de: hidroxi, alkoxi, mercapto, tioalquil,
alquil, carboxi, amino, imino, nitro, halógeno, carbamoil, ciano,
acil, peroxi, sulfo o fosfo. Ejemplos de amidas de los
\alpha-H-\alpha aminoácidos de
acuerdo a la fórmula 1 son: la amida de la prolina, la amida de la
leucina, la amida del ácido glutámico, la amida de la fenilalanina,
la amida de la t-leucina, la amida de la metionina,
la amida del triptofano, la leucil-glicina, la
valil-alanina, la valil-glicina, la
leucil-alanina.
Por amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa se entiende un polipéptido que tiene actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa.
La actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa puede ser detectada con métodos similares a los métodos
empleados para determinar la actividad recemizadora de las racemasas
que actúan en compuestos diferentes a las amidas de los
\alpha-H-\alpha aminoácidos.
Tales métodos son conocidos para la persona experta en el arte. Por
ejemplo, midiendo el decrecimiento en el exceso enantiomérico de una
amida del
L-\alpha-H-\alpha
aminoácido o de una amida del
D-\alpha-H-\alpha
aminoácido, la actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa puede ser determinada.
En Fukumura y otros, 1977, Agric. Biol.,
Chem., vol. 41, p 1509-1510, una
\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
racemasa aislada a partir de Achromobacter obae es descrita;
la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para esta enzima y la
secuencia de aminoácidos de esta enzima fueron publicadas en Naoko
y otros, 1987, Biochemistry of vitamin B6, p
449-452. Para esta actividad enzimática, la
\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
racemasa aislada a partir de Achromobacter obae requiere
piridoxal-5-fosfato como un cofactor
(Ahmed y otros, 1983, Agric. Biol. Chem., vol 47. p
1887-
1893).
1893).
La
\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
racemasa aislada a partir de Achromobacter obae es conocido
por catalizar de manera exclusiva la racemización de la
\alpha-amino-\epsilon-caprolactama.
Aunque la
\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
racemasa a partir de Achromobacter obae fue analizada para
la actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa con los siguientes sustratos, los cuales son amidas de los
\alpha-H-\alpha aminoácidos de
acuerdo a la fórmula 1: amida del L-triptofano,
amida de la L-leucina,
L-leucil-glicina,
L-valil-glicina,
L-valil-L-alanina,
L-leucil-L-alanina,
no se encontró ninguna actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa incluso cuando una cantidad en exceso de enzima fue usada
(Ahmed y otros, 1983, Agric. Biol., Chem., vol 47, p
1887-1893).
La EP-A-383403
describe la actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa en el género Klebsiella y géneros relacionados y la
EP-B1-378592 describe la actividad
amida del \alpha-H-\alpha
aminoácido racemasa en Anthrobacter sp, ATCC 31652 (DSM
4639) y en Corynebacterium sp. ATCC 31662 (DSM 4640). Sin
embargo, usando los microorganismos descritos en estas
publicaciones, no pudo ser detectada ninguna racemización. Por lo
tanto, los documentos EP-A-383403 y
EP-B1-378592 no deben ser
considerados como arte anterior.
Por lo tanto, aunque se ha realizado mucho
trabajo para encontrar una amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa, hasta ahora, no se ha descrito ninguna amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa.
La invención ahora proporciona amidas del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasas.
Los solicitantes sorprendentemente también
descubrieron un método apropiado para aislar los microorganismos
que despliegan actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa, en el cual una muestra que contiene un microorganismo es
enriquecida usando
D-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
o una mezcla de D- y
L-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
como una o como la única fuente de nitrógeno y en el cual los
cultivos encontrados de esta forma son analizados para la actividad
amida del \alpha-H-\alpha
aminoácido racemasa.
Una forma apropiada de de llevar a cabo tal
método es por ejemplo como sigue: este método será posteriormente
referido como el método de enriquecimiento Para encontrar los
polipéptidos de acuerdo a la invención una muestra que contiene un
microorganismo, por ejemplo una muestra biológica, por ejemplo una
muestra de suelo o una muestra de aguas residuales es cultivada en
o sobre un medio de cultivo apropiado que contiene
D-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
o una mezcla de D- y
L-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
como una o como la única fuente de nitrógeno hasta que el
crecimiento pueda ser detectado.
La muestra puede ser directamente añadida
sobre/en el medio de cultivo apropiado con
D-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
o una mezcla de D- y
L-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
como una o como la única fuente de nitrógeno. Existen también otras
formas de aplicar la muestra al medio, por ejemplo añadiendo el
filtrado de una solución de lavado usada para lavar la muestra.
El cultivo de la muestra biológica en o sobre un
medio de cultivo apropiado que contiene
D-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
o una mezcla de D- y
L-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
como la única fuente de nitrógeno es un así llamado enriquecimiento
y fue descrito por Fukumura y otros, 1977, Agric. Biol.
Chem., vol 41, p 1321-1325, quienes usaron este
enriquecimiento en un método para aislar las
\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
racemasas. Preferiblemente, el enriquecimiento es continuado por
una o más transferencias del (los) microorganismo(s)
cultivado(s) en o sobre un medio de cultivo "fresco"
apropiado que contiene
D-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
o una mezcla de D- y
L-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
como la única fuente de nitrógeno hasta que un monocultivo (por el
contrario de un cultivo mixto) es logrado. Típicamente, esto será
después de 4 o 5 transferencias.
Puede ser ventajoso añadir otras fuentes de
nitrógeno distintas de D- o una mezcla de D- y
L-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama,
por ejemplo para ayudar a los cultivos a iniciar el crecimiento.
Para un buen enriquecimiento, sin embargo, la
D-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
o una mezcla de D- y
L-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
están presentes en cantidades tales que los microorganismos que
tienen la capacidad para convertir la D- y/o
L-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama,
puedan continuar creciendo, mientras otros microorganismos no.
La persona experta en el arte conoce como
seleccionar las condiciones del cultivo, por ejemplo las condiciones
del cultivo pueden depender de la fuente de la muestra biológica
y/o de las condiciones deseadas de los procesos deseados.
Los microorganismos obtenidos por
enriquecimiento son analizados para la actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa. Este análisis para la actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa puede ser hecho directamente en todas las células o en
células permeabilizadas de las colonias obtenidas después de
depositar en placas los microorganismos cultivados.
Alternativamente, las colonias obtenidas son cultivadas de manera
separada en un medio de cultivo apropiado que contienen
D-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
o una mezcla de D- y
L-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
como una o como la única fuente de nitrógeno, después de lo cual el
extracto libre de células es preparado a partir del mismo, el cual
es subsiguientemente analizado para la actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa.
El extracto libre de células puede ser preparado
de acuerdo a los métodos estándares conocidos por la persona
experta en el arte, por ejemplo por sonificación, prensa de French,
etc. La permeabilización de las células puede ser obtenida de
acuerdo a métodos estándares conocidos para la persona experta en el
arte, por ejemplo por la adición de pequeñas cantidades de tolueno.
Medios apropiados de cultivo son de hecho todos los medios, que
contengan como una o como la única fuente de nitrógeno
D-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
o una mezcla de D- y
L-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama.
Medios de cultivo apropiados son bien conocidos en el arte. Ellos
pueden por ejemplo ser creados por la persona experta en el arte con
la guía de Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular
Cloning: A Laboratory Manual. 2da, ed., Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY,
1989.
1989.
El análisis para la actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa es preferiblemente realizado en un monocultivo, pero
también puede ser realizado en un cultivo mixto.
En una realización preferida de la invención,
los monocultivos y/o cultivos mixtos obtenidos después del método
de enriquecimiento, son analizados para detectar la capacidad de
usar
L-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
y para la capacidad de usar
D-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
como una o como la única fuente de nitrógeno.
Por lo tanto, la invención también se relaciona
con un método para aislar los microorganismos que despliegan
actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa, que comprende los pasos de:
a) Cultivar, en uno o más pasos de
transferencia, una muestra que contiene microorganismos en o sobre
un medio de cultivo apropiado que contiene
D-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
o una mezcla de D- y
L-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
como una o como la única fuente de nitrógeno,
b) Analizar los microorganismos así obtenidos
para la actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa.
Sorprendentemente, se encontró que el método de
enriquecimiento es apropiado para el aislamiento de microorganismos
que despliegan actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa. Esto es lo más sorprendente ya que este enriquecimiento
se selecciona para la actividad
\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
racemasa y no para la actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa. Por lo tanto, la invención también se relaciona con
nuevos microorganismos (que comprenden polipéptidos) que tienen
actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa obtenible con dicho método.
Varios microorganismos pudieran ser aislados de
esta manera, por ejemplo puede ser posible aislar los
microorganismos a partir de los siguientes géneros:
Agrobacterium, Ochrobactrum, Arthrobacter, Micrococcus,
Aureobacterium, Corynebacterium, Rhodococcus, Brevibacterium,
Rubrobacter, Nocardioides, Terrabacter.
Varios monocultivos o cepas de microorganismos
que despliegan actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa fueron aislados con el método de enriquecimiento y estos
microorganismos fueron depositados bajo el Tratado de Budapest en
The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited
(NCIMB), Aberdeen, Escocia, el 8 de Mayo del 2002: el
Agrobacterium rhizogenes Na fue depositado bajo el número
NCIMB 41127, el Agrobacterium rhizogenes Bi fue depositado
bajo el número NCIMB 41128, el Arthrobacter nicotianae fue
depositado bajo el número NCIMB 41126, el Ochrobactrum
anthropi IA fue depositado bajo el número NCIMB 41129.
A partir de los microorganismos aislados
obtenidos con el método de enriquecimiento es posible aislar una
secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que tiene
actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa y clonar y expresar este ácido nucleico para producir un
polipéptido de acuerdo a la invención. Este aislamiento de una
secuencia de ácidos nucleicos y la subsiguiente reclonación y
expresión de la misma puede ser hecho de acuerdo a los métodos
estándares, los cuales son conocidos para la persona experta en el
arte.
Por lo tanto, la invención también se relaciona
con un método para aislar una secuencia de ácidos nucleicos que
codifica un polipéptido con actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa, que comprende los pasos de:
a) Cultivar en uno o más pasos de transferencia,
una muestra que contiene microorganismos en o sobre un medio de
cultivo apropiado que contiene
D-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
o una mezcla de D- y
L-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
como una o como la única fuente de nitrógeno,
b) Analizar el (los) microorganismo(s)
así obtenido(s) para la actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa.
c) Aislar una secuencia de ácidos nucleicos que
codifica una amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa a partir del (los) microorganismo(s)
obtenido(s) de una manera per se conocida.
El aislamiento de una secuencia de ácidos
nucleicos que codifica un polipéptido que tiene actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa a partir de un microorganismo que tiene actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa puede por ejemplo ser hecho preparando una biblioteca de
ADN, una biblioteca de ADNc o una biblioteca de expresión a partir
del (los) microorganismo(s) que tiene(n) actividad
amida del \alpha-H-\alpha
aminoácido racemasa, mediante purificación (parcial) del polipéptido
que tiene actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa seguido por genética inversa o usando series de ácidos
nucleicos. Estas técnicas son todas conocidas para la persona
experta en el arte. Por ejemplo, después de la preparación de la
biblioteca de ADN o ADNc, el ácido nucleico que codifica el
polipéptido que tiene actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa puede ser seleccionado usando una sonda o un cebador PCR
basado en la información de la secuencia de un gen homólogo o la
información de la secuencia de un polipéptido que tiene actividad
amida del \alpha-H-\alpha
aminoácido racemasa. Por ejemplo, después de la preparación de una
biblioteca de expresión, el clon de la biblioteca que tiene
actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa puede ser seleccionado usando un ensayo de la actividad
amida del \alpha-H-\alpha
aminoácido racemasa, usando el método de enriquecimiento de la
invención o usando anticuerpos generados contra un polipéptido que
tiene actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa. Por ejemplo, la genética inversa puede ser realizada
mediante la purificación y la secuenciación del (parte del)
polipéptido que tiene actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa y aislar la secuencia de ácidos nucleicos deseada basado
en la información de la secuencia del polipéptido que tiene
actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa, por ejemplo con una sonda de un cebador PCR. Por ejemplo,
las series de ADN pueden ser usadas para derivar la secuencia de
ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que tiene actividad
amida del \alpha-H-\alpha
aminoácido racemasa, si la secuencia genómica del microorganismo
que tiene actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa es conocida comparando el modelo de expresión de los
microorganismos en condiciones bajo las cuales el microorganismo no
despliega la actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa hasta las condiciones bajo las cuales el microorganismo si
despliega la actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa.
En una realización de la invención, la secuencia
de ácidos nucleicos que codifica una amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa es aislada como sigue.
En un primer paso el ADN total es aislado y una
biblioteca de genes es preparada a partir de los microorganismos
obtenidos por el método de enriquecimiento y expresado en un vector
apropiado en un hospedero apropiado (por ejemplo como es descrito
en los ejemplos). En segundo paso, los clones de la biblioteca de
genes que contienen un vector con la inserción (la inserción es un
pedazo del ADN aislado a partir de los microorganismos) son
analizados sobre la capacidad de catalizar la racemización de una
amida del \alpha-H-\alpha
aminoácido. Por ejemplo, el análisis de los clones para la
actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa puede ser realizado de acuerdo a los métodos descritos en
los ejemplos.
En pasos subsiguientes, la secuencia de ácidos
nucleicos de la inserción del vector en un clon que tiene la
capacidad de catalizar la racemización de una amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido es
determinada y los marcos de lectura abiertos son identificados a
partir de la secuencia de ácidos nucleicos así determinada, después
de lo cual los marcos de lectura abiertos son reclonados y
expresados en un vector apropiado y en un hospedero apropiado y
nuevamente analizado para la actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa. Mediante la expresión del marco de lectura abierto que
codifica la actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa en un vector apropiado en un hospedero apropiado puede ser
producido un polipéptido que tiene actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa de acuerdo a la invención.
Con el método de enriquecimiento y el
aislamiento subsiguiente de la secuencia de ácidos nucleicos, fue
obtenida la secuencia de ácidos nucleicos que codifica una amida
del \alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa a partir de una cepa identificada como Ochrobactrum
anthropi IA depositada bajo el número NCIMB 41129 en la NCIMB.
Esta secuencia de ácidos nucleicos es presentada en SEQ ID: NO. 1.
La secuencia de aminoácidos del polipéptido correspondiente es
presentada en SEQ ID: NO. 2. Se encontró que la amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa, con su secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID: NO.
2, está activa en un rango amplio de pH y temperatura. Con este
método de enriquecimiento, también la secuencia de ácidos nucleicos
que codifica una amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa a partir de una cepa identificada como Arthrobacter
nicotianae depositada bajo el número NCIMB 41126 en la NCIMB
fue identificada (SEQ ID: NO. 8). La secuencia de aminoácidos del
polipéptido correspondiente es presentada en SEQ ID: NO. 9.
La invención también se relaciona con las
secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos con
actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa obtenible por el anterior método.
Una secuencia de ácidos nucleicos de codificar
un polipéptido con actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa de acuerdo a la invención, tal como una secuencia de ácidos
nucleicos con la secuencia de SEQ ID: NO. 1 o de SEQ ID: NO. 8
puede también ser aislada usando técnicas estándares de biología
molecular y la información de la secuencia allí provista. Por
ejemplo, usando toda o una porción de la secuencia de ácidos
nucleicos de SEQ ID: NO. 1 o SEQ ID: NO. 8 como una sonda de
hibridación, una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo a la
invención puede ser aislada usando técnicas estándares de clonación
e hibridación (por ejemplo, como es descrito en Sambrook, J.,
Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. 2da, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Además, una secuencia de ácidos nucleicos que
abarca todo o una porción de SEQ ID: NO. 1 o SEQ ID: NO. 8 puede
ser aislada por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando
cebadores de oligonucleótidos sintéticos diseñados basados en la
información de la secuencia contenida en SEQ ID: NO. 1 o SEQ ID: NO,
2, respectivamente SEQ ID NO. 8 o SEQ ID: NO. 9.
Una secuencia de ácidos nucleicos de la
invención puede ser amplificada usando por ejemplo AND genómico,
ADNc o alternativamente ARNm como un modelo y cebadores de
oligonucleótidos apropiados de acuerdo a las técnicas estándares de
amplificación (RT)-PCR. El ácido nucleico así
amplificado puede ser clonado en un vector apropiado y
caracterizado por el análisis de la secuencia de ADN.
Adicionalmente, los oligonucleótidos que se
corresponden con o que pueden ser hibridados a secuencias de ácidos
nucleicos de acuerdo a la invención pueden ser preparados por
técnicas sintéticas estándares, por ejemplo, usando un sintetizador
de ADN automatizado.
Debe notarse que la invención incluye también
mutantes de los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos que
tienen actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa, los cuales tienen una o más mutaciones en comparación con
el polipéptido correspondiente aislado a partir de un hospedero
natural. Los métodos para hacer las mutaciones son conocidos por la
persona experta en el arte, por ejemplo por mutagénesis aleatoria
(por ejemplo por PCR propensa a error o radiación UV), mutagénesis
sitio dirigida, etc.
La invención también se relaciona con un método
para producir un polipéptido con actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa, que comprende los pasos de:
a) Cultivar en uno o más pasos de transferencia,
una muestra que contiene microorganismos en o sobre un medio de
cultivo apropiado que contiene
D-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
o una mezcla de D- y
L-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
como una o como la única fuente de nitrógeno,
b) Analizar los microorganismos así obtenidos
para la actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa.
c) Aislar una secuencia de ácidos nucleicos que
codifica una amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa a partir del (los) microorganismo(s)
obtenido(s) de una manera per se conocida.
d) Expresar la secuencia de ácidos nucleicos en
un hospedero apropiado para producir un polipéptido con actividad
amida del \alpha-H-\alpha
aminoácido racemasa.
Expresar la secuencia de ácidos nucleicos que
codifica un polipéptido de acuerdo a la invención, puede por
ejemplo ser realizado clonando el ácido nucleico en un vector
apropiado y después de la introducción en un hospedero apropiado,
(sobre)expresar la secuencia de acuerdo a las técnicas
estándares de clonación y expresión, las cuales son conocidas para
la persona experta en el arte (por ejemplo, como es descrito en
Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. 2da, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), para
producir un polipéptido de acuerdo a la invención. Por lo tanto, la
invención también se relaciona con los vectores que comprenden una
secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo a la invención.
Alternativamente, para producir un polipéptido
de acuerdo a la invención, la secuencia de ácidos nucleicos que
codifica un polipéptido de acuerdo a la invención puede estar
integrado en el genoma de una célula hospedera y ser
(sobre)expresada. Esto puede ser hecho de acuerdo a los
métodos conocidos por la persona experta en el arte. Por lo tanto,
la invención también se relaciona con una célula hospedera que
comprende y que expresa una secuencia de ácidos nucleicos de
acuerdo a la invención, preferiblemente una célula hospedera que
comprende un vector que comprende una secuencia de ácidos nucleicos
de acuerdo a la invención.
Alternativamente, un polipéptido de acuerdo a la
invención puede ser sobreexpresado en su hospedero natural, por
ejemplo colocando un promotor apropiada aguas arriba de la secuencia
de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, integrando una o
más copias de la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la
invención en el genoma de su hospedero natural, preferiblemente
expresando un ácido nucleico de acuerdo con la invención en un
vector apropiado en su hospedero natural, los cuales son todos
métodos conocidos por la persona experta en el arte.
Los hospederos apropiados son los hospederos
normalmente usados para la clonación y la expresión y son conocidos
por la persona experta en el arte. Ejemplos de cepas hospederas de
E. coli son: TOP1OF', TOP1O, DH10B, DH5\alpha, HB1O1,
W3110, BL2I(DE3)y BL2I(DE3) y
BL21(DE3)pLysS.
Los vectores apropiados son los vectores
normalmente usados para la clonación y la expresión y son conocidos
por la persona experta en el arte. Ejemplos de vectores apropiados
para la expresión de E. coli son dados por ejemplo en la
tabla 1 en Makrides, S.C., 1996, Microbiological Reviews, p.
512-538. Preferiblemente, el vector contiene un
promotor aguas arriba del sitio de clonación que contiene la
secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido con
actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa, que puede ser encendido después que el hospedero ha sido
cultivado para expresar el polipéptido correspondiente que tiene
actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa. Los promotores, los cuales pueden ser encendidos y
apagados son conocidos por la persona experta en el arte y son por
ejemplo el promotor Iac, el promotor araBAD, el
promotor T7, el promotor trc, el promotor tac, el
promotor trp, y el promotor aroH.
La invención se relaciona por lo tanto con
polipéptidos con actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa obtenibles por el método anterior.
En una realización preferida de la invención, la
invención se relaciona con polipéptidos aislados que tienen
actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa y que tienen un grado de identidad con la secuencia de
aminoácidos presentada en SEQ ID: NO. 2 de al menos alrededor del
55%, en particular de al menos alrededor del 65%, más en particular
de al menos alrededor del 75%, aún más en particular de al menos
alrededor del 85%, aún más en particular de al menos alrededor del
90%, aún más en particular de al menos alrededor del 95%, y lo
máximo en particular de al menos alrededor del 97%.
En otra realización preferida de la invención,
la invención se relaciona con polipéptidos aislados que tienen
actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa y que tienen un grado de identidad con la secuencia de
aminoácidos presentada en SEQ ID: NO. 9 de al menos alrededor del
50%, preferiblemente de al menos alrededor del 60%, más
preferiblemente de al menos alrededor del 70%, aún más
preferiblemente de al menos alrededor del 80%, en particular de al
menos alrededor del 90%, más en particular de al menos alrededor del
95%, y lo máximo en particular de al menos alrededor del 97%.
Para los propósitos de la presente invención, el
grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos es
determinado por el algoritmo de alineación en pares blastp (NCBI)
con una tabla de identidad y los siguientes parámetros de
alineación: mismatch -3, penalty = -3, gap extend = 1, match bonus=
1, Gap x - droff = 50, expect = 10, wordsize = 3.
La presente invención también se relaciona con
los polipéptidos aislados que tienen actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa, los cuales son codificados por las secuencias de ácidos
nucleótidos que hibridan bajo condiciones de baja astringencia,
preferiblemente bajo condiciones de astringencia media, más
preferiblemente bajo condiciones de alta astringencia y lo más
preferido bajo condiciones de astringencia muy alta con la
secuencia codificadora de SEQ ID: NO. 1 o una hebra complementaria
de la misma o con la secuencia codificadora de SEQ ID: NO. 8 o una
hebra complementaria de la misma.
Los experimentos de hibridación pueden ser
realizados por una variedad de métodos, que están bien disponibles
para el experto. Las guías generales para seleccionar de entre estos
varios métodos pueden ser encontradas en por ejemplo el capítulo 9
de Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. 2da, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Por astringencia de las condiciones de
hibridación se entiende, las condiciones bajo las cuales la
hibridación, que consiste de la hibridación real y los pasos de
lavado, es realizada. Los pasos de lavado son usados para lavar los
ácidos nucleicos, los cuales no se hibridan con el ácido nucleico
seleccionado inmovilizado en por ejemplo un filtro de
nitrocelulosa. La astringencia de las condiciones de hibridación
puede por ejemplo ser cambiada cambiando la concentración de la sal
de la solución de lavado y/o cambiando la temperatura bajo la cual
el paso de lavado es realizado (temperatura de lavado). La
astringencia de la hibridación se incrementa disminuyendo la
concentración de la sal en la solución de lavado o incrementando la
temperatura de lavado. Para los propósitos de esta solicitud, la
hibridación es realizada en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC)
6 X a alrededor de 45ºC durante alrededor de 12 horas. Dos pasos
consecutivos de lavado de 30 minutos en SSC 1 X, SDS al 0.1% a 50ºC
es un ejemplo de baja astringencia, a 55ºC un ejemplo de
astringencia media, a 60ºC un ejemplo de alta astringencia, a 65ºC
un ejemplo de astringencia muy alta.
La presente invención también se relaciona con
los polipéptidos aislados que tienen actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa y los cuales despliegan reactividad cruzada inmunológica
con un anticuerpo generado contra un fragmento de la secuencia de
aminoácidos de acuerdo a la SEQ ID: NO. 2 o SEQ ID: NO. 9.
La reactividad cruzada inmunológica puede ser
ensayada usando un anticuerpo generado contra, o reactivo con, al
menos un epítopo del polipéptido aislado de acuerdo a la presente
invención que tiene actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa. El anticuerpo, el cual puede ser monoclonal o policlonal,
puede ser producido por métodos conocidos en el arte, por ejemplo
como es descrito por Hudson y otros, Practical Immunology,
Tercera Edición (1989), Blackwell Scientific Publications. La
reactividad cruzada inmunoquímica puede ser determinada usando los
ensayos conocidos en el arte, un ejemplo de los cuales es el Western
blotting, por ejemplo como se describe en Hudson y otros,
Practical Immunology, Tercera Edición (1989), Blackwell Scientific
Publications.
La invención también se relaciona con los
fragmentos de los polipéptidos de acuerdo a la invención y que
tienen actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa de al menos 100 aminoácidos, preferiblemente de 125 a 350
aminoácidos, más preferiblemente de 200 a 300 aminoácidos.
La invención también se relaciona con las
proteínas de fusión hechas mediante expresión de una secuencia de
ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de acuerdo a la
invención enlazada de manera operativa con una o más secuencias de
ácidos nucleicos, las cuales codifican a (un) polipéptido(s)
marcador(es). Por enlazada de manera operativa se entiende,
que las secuencias de ácidos nucleicos están enlazadas de manera tal
que, si son expresadas, el polipéptido de acuerdo con la invención
con el (los) polipéptido(s) marcador(es) en sus N- y
C-terminales es producido. El polipéptido marcador
puede servir para muchos propósitos, por ejemplo, puede ser
utilizado para incrementar la estabilidad o la solubilidad de la
proteína de fusión, puede ser usado como una señal de secreción, la
cual es una señal que dirige a la proteína de fusión a un cierto
compartimiento en la célula o puede ser usado para facilitar la
purificación de la proteína de fusión. Un ejemplo de un polipéptido
marcador usado para facilitar la purificación de la proteína de
fusión es el péptido hexahistidina. La purificación de una proteína
de fusión con una cola de hexahistidina es descrito por ejemplo en
Gentz y otros, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 86, p.
821-824. Una proteína de fusión con una cola de
hexahistidina puede por ejemplo ser producida en un vector pQE
(Qiagen, Inc.), siguiendo el protocolo del suministrador.
La invención también se relaciona con las
secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos que
tienen actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa de acuerdo a la invención. Estas secuencias de ácidos
nucleicos pueden ser obtenidas con el método de enriquecimiento y el
aislamiento subsiguiente del ácido nucleico deseado como se
describió anteriormente.
Las amidas de los
\alpha-H-\alpha aminoácidos
racemasas y los microorganismos que despliegan actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa de acuerdo a la invención pueden ser usados en un proceso
para la recimización de una amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
enantioméricamente enriquecido. Por lo tanto, la invención se
relaciona con un proceso para la racemización de una amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
enantioméricamente enriquecido, donde la racemización es realizada
en presencia de un polipéptido de acuerdo con la invención o un
microorganismo de acuerdo con la invención.
Las amidas de los
\alpha-H-\alpha aminoácidos
racemasas de acuerdo a la invención pueden ser usadas de manera
apropiada junto con una amidasa enantioselectiva en un proceso para
la preparación de
\alpha-H-\alpha aminoácidos
enantioméricamente enriquecidos a partir de una mezcla de amidas de
los D- y
L-\alpha-H-\alpha
aminoácidos o en un proceso para la preparación de los
L-\alpha-H-\alpha
aminoácidos a partir de las amidas de los
D-\alpha-H-\alpha
aminoácidos correspondientes o en un proceso para la preparación de
los
D-\alpha-H-\alpha
aminoácidos a partir de las amidas de los
L-\alpha-H-\alpha
aminoácidos correspondientes. El uso de las amidas de los
\alpha-H-\alpha aminoácidos
racemasas en tales procesos conducirá (teóricamente) a una
conversión del 100% de la amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido en el
correspondiente \alpha-H-\alpha
aminoácido enantioméricamente enriquecido (100% de rendimiento). La
invención por lo tanto también se relaciona con el uso de una amida
del \alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa de acuerdo con la invención en combinación con una amidasa
enantioselectiva en un proceso para la preparación de
\alpha-H-\alpha aminoácidos
enantioméricamente enriquecidos a partir de una mezcla de amidas de
los D- y
L-\alpha-H-\alpha
aminoácidos o en un proceso para la preparación de los
L-\alpha-H-\alpha
aminoácidos a partir de las amidas de los
D-\alpha-H-\alpha
aminoácidos correspondientes o en un proceso para la preparación de
los
D-\alpha-H-\alpha
aminoácidos a partir de las amidas de los
L-\alpha-H-\alpha
aminoácidos correspondientes. La invención también se relaciona con
un proceso para la preparación de un
\alpha-H-\alpha aminoácido
enantioméricamente enriquecido a partir de una mezcla de las amidas
de los D- y
L-\alpha-H-\alpha
aminoácidos correspondientes o la preparación de un
L-\alpha-H-\alpha
aminoácido a partir de la amida del
D-\alpha-H-\alpha
aminoácido correspondiente o la preparación de un
D-\alpha-H-\alpha
aminoácido a partir de la amida del
L-\alpha-H-\alpha
aminoácido correspondiente, donde el proceso es realizado en
presencia de una amidasa enantioselectiva y un polipéptido con
actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa de acuerdo a la invención o un microorganismo que
despliega actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa de acuerdo a la invención.
Preferiblemente, en los procesos antes
mencionados, la amidasa enantioselectiva es al menos 90%
enantioselectiva, más preferiblemente al menos 95%
enantioselectiva, aún más preferiblemente al menos 98%
enantioselectiva, lo más preferido al menos 99% enantioselectiva.
El 90% de enantioselectividad de la amidasa (por ejemplo una
D-amidasa) es definida para la presente invención
como la capacidad de la amidasa para convertir una mezcla racémica
de amidas de los
DL-\alpha-H-\alpha
aminoácidos en el 90% de un enantiómero del
\alpha-aminoácido (por ejemplo el
D-\alpha-H-\alpha
aminoácido) y en el 10% de otro enantiómero del
\alpha-H-\alpha aminoácido (por
ejemplo el
L-\alpha-H-\alpha
aminoácido) a 50% de la conversión total de la mezcla de las amidas
de los
L-\alpha-H-\alpha
aminoácidos. El 95% de enantioselectividad (por ejemplo 95% de D- y
5% de
L-\alpha-H-\alpha
aminoácido) se corresponde con un E-value de 58.4
(90% de e.e.). El 98% de enantioselectividad (por ejemplo 98% de D-
y 2% de
L-\alpha-H-\alpha
aminoácido) se corresponde con un E-value de 193.6
(96% de e.e.). El 99% de enantioselectividad (por ejemplo 99% de D-
y 1% de
L-\alpha-H-\alpha
aminoácido) se corresponde con un E-value de 458.2
(98% de e.e.).
Para la actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa, es a veces ventajoso añadir un cofactor, por ejemplo
piridoxal-5-fosfato.
Preferiblemente, en dichos procesos, la amida
del \alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa de acuerdo a la invención no despliega actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa, es decir la capacidad para catalizar la racemización de
un
D-\alpha-H-\alpha
aminoácido y un
L-\alpha-H-\alpha
aminoácido.
La invención es ilustrada por medio de los
siguientes ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos no tienen el
propósito de restringir la invención.
Las técnicas estándares de clonación molecular
tales como el aislamiento del AND plásmidico, la electroforesis en
gel, la modificación de restricción enzimática de ácidos nucleicos,
la transformación de E. coli, etc, fueron realizadas como es
descrito por Sambrook y otros, 1989, "Molecular Cloning: a
laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring
Harbor, NY o el manual del suministrador. Las enzimas estándares de
clonación molecular tales como las endonucleasas de restricción, la
T4 ADN ligasa, etc, fueron obtenidas de Invitrogen (Breda, Holanda)
a menos que otra cosa sea establecida. Los oligodeoxinucleótidos
sintéticos fueron obtenidos de Sigma-Genosys
(Cambridge, UK), e Invitrogen (Paisley, Escocia, UK). Los análisis
de las secuencias de AND fueron realizados por BaseClear (Leiden,
Holanda) usando el método de terminación de cadena con terminadores
dideoxi marcados con colorantes.
En este procedimiento de enriquecimiento,
muestras diferentes de suelo y lodo que habían sido almacenadas a
-80ºC, fueron usadas para la inoculación directa de 50 ml de Medio A
líquido (Base de Carbono para Levadura (Difco, 11.7 g/l),
KH_{2}PO_{4} (6.7 g/l), K_{2}HPO_{4} (8.9 g/l), pH 7.0), que
contienen
DL-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
racémica (2 g/l) como única fuente de nitrógeno. Por frasco, una
espátula de inóculo fue usada. Los diferentes frascos fueron
incubados a 28ºC y 200 rpm.
Después de alrededor de dos días un buen
crecimiento fue observado en todos los frascos. Después de la
sedimentación de las partículas de suelo en todos los cultivos,
diluciones 1:1,500 fueron preparadas en el Medio A que contiene 2
g/l de
DL-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama,
y fueron incubadas a 28ºC y 200 rpm. Después de obtener suficiente
crecimiento, fueron tomadas muestras de cada frasco para determinar
la concentración de la L- y
D-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
en los caldos de cultivo. Estas muestras fueron centrifugadas y los
sobrenadantes fueron filtrados a través de un filtro de 0.45 \muM
para remover todas las células. Entonces estas muestras fueron
analizadas por HPLC. En este método HPLC
o-Ftaldehído en combinación con ácido
D-3-mercapto-2-metilpropiónico
fue usado como un reactivo quiral para la separación de ambos
enantiómeros de
\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
(Duchateau y otros, 1992, J. Chromatogr., vol. 623, p
237-245).
Solamente los frascos en los cuales los cultivos
habían crecido que usaron ambos enantiómeros de
\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
fueron seleccionados para los próximos pasos. Las diferentes
diluciones de estos cultivos fueron depositadas en placas con Medio
A que contiene 2 g/l de
DL-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
como única fuente de nitrógeno, y fueron incubadas a 28ºC. Las
colonias fueron seleccionadas de manera aleatoria y reaisladas en
el mismo tipo de placas selectivas para obtener monocultivos. Luego
una colonia de cada monocultivo fue transferida a 5 ml del Medio A
que contiene 2 g/l de
DL-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama.
Después de tres días de incubación a 28ºC y 200 rpm, los cultivos
obtenidos fueron analizados par el uso de D- y
L-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
exactamente como fue descrito anteriormente. Los monocultivos que
pudieron usar ambas la D- y la
L-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
fueron almacenados a -80ºC en glicerol al 20% (v/v).
Las células de estos monocultivos fueron
finalmente analizadas para la actividad
\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
racemasa. Después del cultivo en el Medio A que contiene
DL-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
(2 g/l) a 28ºC y 200 rpm por tres días, las células fueron
recolectadas mediante centrifugación, lavadas con 20 mM de buffer
HEPES-NaOH (pH 7.7) y liofilizadas.
Luego 100 mg de estas células liofilizadas de
cada monocultivo fueron añadidas a una mezcla de reacción que
consiste de 10 mM de buffer HEPES-NaOH (pH 7.7),
tolueno (2,5% v/v),
piridoxal-5-fosfato (20 \muM), y
L-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
(2,5% m). Blancos químicos (con la mezcla del ensayo sin las células
liofilizadas) fueron usados como un control negativo. Todas las
mezclas de reacción (incluyendo los blancos) fueron incubadas
durante aproximadamente 72 horas a 40ºC antes de que la reacción
fuera detenida por la adición de 9 volumenes de H_{3}PO_{4} 1
M. Después de la remoción de las células por filtración a través de
un filtro de 0.45 \muM, estas mezclas de reacción fueron
analizadas por el método HPLC descrito anteriormente para
determinar la concentración de la D- y
L-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama.
Finalmente, los monocultivos que formaron
D-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
a partir del sustrato de la
L-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
fueron enviados a la NCIMB para la determinación de la cepa.
Nota: ninguna
D-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
pudo ser determinada en los blancos químicos.
Uno de los monocultivos así obtenidos que pudo
racemizar la
L-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
fue identificado como una cepa de Ochrobactrum anthropi por
la NCIMB y fue depositada bajo el Tratado de Budapest como
Ochrobactrum anthropi IA en la NCIMB bajo el número NCIMB
41129. Los resultados de la determinación están presentes en la
tabla 1.
Células de O. anthropi IA fueron
cultivadas en el Medio A que contiene
DL-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
(2 g/l) como única fuente de nitrógeno. Después de la incubación a
28ºC y 200 rpm durante tres días (OD_{620 nm} 4.7), las células
fueron recolectadas mediante centrifugación, lavadas en 20 mM de
buffer HEPES-NaOH pH 7.7 y liofilizadas.
Las células liofilizadas fueron usadas para
demostrar la actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa. La mezcla de ensayo consistió de 10 mM de buffer
HEPES-NaOH (pH 7.7) que contiene tolueno (2,5%
v/v), piridoxal-5-fosfato (20
\muM), amida de la D- y L-leucina (2.5% m) y en
algunos casos EDTA (20 mM). Por ensayo 150 mg de células
liofilizadas fueron usados. Los blancos químicos (con la mezcla de
ensayo sin las células de O. anthropi IA) fueron usados como
un control negativo. Todas las mezclas de reacción (incluyendo los
blancos) fueron incubadas por aproximadamente 72 horas a 40ºC antes
de que la reacción fuera detenida por la adición de 9 volumenes de
H_{3}PO_{4} 1 M. Finalmente, las mezclas de reacción fueron
analizadas por HPLC para determinar las concentraciones de la amida
de la D- y la L-leucina y de D- y
L-leucina. o-Ftaldehído en combinación con
el ácido
D-3-mercapto-2-metilpropiónico
fue usado en este método HPLC como un reactivo quiral para la
enantioseparación de estos compuestos aminos (Duchateau y
otros, 1992, J. Chromatogr., vol. 623, p
237-245).
En un número de reacciones EDTA fue añadido para
inhibir la(s) L- y/o D- amidasa(s)
específica(s) presentes en las células de O. anthropi
IA. Inhibiendo esta amidasa, la amida del L- y/o D- aminoácido no es
convertida o solo convertida en parte en el aminoácido
correspondiente permitiendo de esta forma la demostración de la
actividad amida del aminoácido racemasa mediante la detección de
otro enantiómero de la amida del aminoácido. Estas reacciones con
EDTA (No. 3 y 4), mostraron claramente que las células de O.
anthropi IA contienen una actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa, ya que la amida de la D-leucina fue
convertida en amida de la L-leucina y viceversa.
Los blancos químicos no mostraron esta reacción de racemización.
Sin EDTA, las amidasas convierten el sustrato
y/o el producto de las amidas de los
\alpha-H-\alpha aminoácidos en
\alpha-H-\alpha aminoácidos
evitando de esta forma la detección directa del otro enantiómero de
la amida del \alpha-H-\alpha
aminoácido como producto de la racemización. Comenzando a partir de
la amida de la L-leucina, sin embargo, la reacción
sin EDTA también probó claramente la presencia de una actividad
amida del \alpha-H-\alpha
aminoácido racemasa en O. anthropi IA, ya que este sustrato
fue convertido en cantidades significativas de
L-leucina, y un experimento de control excluyó su
formación a través de la D-leucina, ya que O.
anthropi IA no recemizó la leucina. La formación de la
L-leucina a partir de la amida de la
D-leucina no pudo ser detectada en el blanco
químico.
Las concentraciones dadas son las
concentraciones medidas en las mezclas de reacción, las cuales están
10 veces diluidas en comparación con las mezclas de reacción
iniciales.
Aproximadamente 30 g de muestras de suelo
frescas de diferentes localizaciones fueron resuspendidas en 50 ml
del Medio A, suplementadas con 2 g/l de
D-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
como única fuente de nitrógeno, y agitadas durante 30 minutos a 4ºC
y 200 rpm. Las suspensiones fueron filtradas a través de un papel
de filtro para remover las partículas de suelo. Con los filtrados
obtenidos los siguientes dos diferentes enfoques fueron usados para
seleccionar las cepas que podían usar la
L-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
como fuente de nitrógeno:
- \bullet
- 5 ml de los diferentes filtrados fueron transferidos a frascos de 100 ml vacíos. Todos los frascos fueron incubados a 28ºC y 200 rpm hasta que una OD_{600 \ nm} fue lograda de aproximadamente 2.5. Luego los cultivos fueron diluidos 1:100 en el Medio A fresco que contenía 2 g/l de D-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama, nuevamente seguido por un paso de cultivo. Estos pasos de dilución y de recultivo fueron repetidos tres veces más. Luego diferentes diluciones de los cultivos de buen crecimiento fueron depositados sobre placas con el Medio A que contenía 2 g/l de D-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama como la única fuente de nitrógeno, que fueron incubadas a 28ºC. Las colonias fueron seleccionadas de manera aleatoria y reaisladas 5 veces sobre placas selectivas idénticas, produciendo monocultivos puros. Finalmente, estos monocultivos fueron almacenados a -80ºC en glicerol al 20% (v/v).
- \bullet
- Como una estrategia de enriquecimiento alternativa, las diferentes diluciones de todos los filtrados fueron depositadas en placas directamente sobre el Medio A que contiene 2 g/l de D-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama como la única fuente de nitrógeno. Después de dos días de incubación a 28ºC, las primeras colonias aparecieron en casi todas las placas. Después de algunos días más hasta 3 semanas, una gran cantidad de colonias morfológicamente diferentes fueron obtenidas. Las colonias morfológicamente diferentes fueron seleccionadas de manera aleatoria y reaisladas 5 veces sobre placas selectivas idénticas, produciendo monocultivos puros. Finalmente, estos monocultivos fueron almacenados a -80ºC en glicerol al 20% (v/v).
Las células de estos monocultivos fueron
finalmente analizadas para la actividad
\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
racemasa. Después del cultivo en 800 ml del Medio A que contiene 2
g/l de
D-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
a 28ºC y 200 rpm, las células fueron recolectadas mediante
centrifugación (20 min, a 5,000 x g, 4ºC), y resuspendidas en 40 ml
de buffer de sonificación (NaCl, 16 g/l; KCl, 0.74 g/l;
Na_{2}HPO_{4}, 0.27 g/l; glucosa, 2 g/l; HEPES, 10 g/l, pH
7.0). Luego las células fueron desintegradas mediante sonificación
usando un Soniprep 150 de MSE a una amplitud de 20 micrones en
ciclos de 10 min. usando intervalos de tiempo de 10 seg. (es decir
10 seg. de sonificación, 10 seg. de enfriamiento) y enfriamiento en
hielo/acetona. Después de cada ciclo, las células fueron vistas de
manera microscópicas y el procedimiento de sonificación fue detenido
cuando el 50-70% de las células estaban rotas.
Luego
D-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
y piridoxal-5-fosfato fueron
añadidos a las suspensiones de células desintegradas de cada
monocultivo hasta concentraciones de 5 g/l y 0.01 mM
respectivamente. Después de 1.5 h de incubación a 20ºC y 20 rpm, 2
ml de las muestras fueron transferidas a 1 ml de H_{3}PO_{4}
1M. Después de la remoción de todas las partículas mediante
centrifugación seguido por la filtración a través de de un filtro
de 0.22 \muM, las concentraciones de la D- y la
L-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
en las muestras fueron determinadas por HPLC usando el protocolo
descrito en el ejemplo 1. Finalmente, los monocultivos que formaron
la
L-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
a partir del sustrato de la
D-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
fueron enviados a la NCIMB para la determinación de la cepa.
Los monocultivos así obtenidos fueron
identificados por la NCIMB como Agrobacterium rhizogenes
(Agrobacterium rhizogenes Bi y Agrobacterium
rhizogenes Na) y Arthrobacter nicotianae a través de la
determinación de la secuencia del ADNr 16S. Los resultados de esta
determinación del ADNr 16S son presentados a continuación. Los
microorganismos fueron depositados bajo el Tratado de Budapest en la
NCIMB, el Agrobacterium rhizogenes Na fue depositado bajo el
número NCIMB 41127, el Agrobacterium rhizogenes Bi bajo en
número NCIMB 41128 y, el Arthrobacter nicotianae bajo el
número NCIMB 41126.
Extracción de ADN: El ADN fue extraído usando el
kit de purificación Prepman y almacenado en hielo hasta su uso.
Reacción en cadena de la polimerasa: El gen del
ADN ribosómico 16S fue amplificado usando cebadores eubacteriales
universales y analizado por electroforesis sobre un gel de agarosa
al 1%.
Limpieza del ADN: El fragmento de 500 bp fue
purificado mediante centrifugación en columna spin y resuspendido
en agua destilada estéril.
Secuenciación del ADN: El producto del ADN
purificado fue automáticamente secuenciado usando el método del
terminador de cadena dideoxi (Sanger y otros, 1997).
Análisis de secuencia por comparación de base de
datos: La secuencia del gen del ADNr 16S fue comparado con las
bases de datos de secuencias de ácidos nucleicos.
Las secuencias del ADNr 16S de Agrobacterium
rhizogenes Na NCIMB 41127 (SEQ ID: NO. 5), Agrobacterium
rhizogenes Bi NCIMB 41128 (SEQ ID: NO. 4) y Arthrobacter
nicotianae NCIMB 41126 (SEQ ID: NO. 3) son presentadas en la
parte del listado de secuencias.
Después del cultivo de estas tres cepas en el
Medio A que contiene 2 g/l de
D-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama,
las células fueron recolectadas mediante centrifugación a 12,000 x
g. Después de la centrifugación el sobrenadante fue decantado y el
peso húmedo del pellet fue medido. Al pellet se le añadió buffer de
sonificación (NaCl, 16 g/l; KCl, 0.74 g/l; Na_{2}HPO_{4}, 0.27
g/l; glucosa, 2 g/l; HEPES, 10 g/l, pH 7.0) en una proporción 1:2
(pellet de células en peso húmedo: buffer en ml). Durante el
almacenamiento entre la recolección de las células y la
sonificación el pellet fue congelado en el buffer de sonificación a
-86ºC.
La sonificación fue realizada con un Soniprep
150 de MSE a la amplitud máxima de 20 micrones en periodos de 10
min, usando intervalos de tiempo de 10 seg. (es decir 10 seg. de
sonificación, 10 seg. de enfriamiento), enfriando la muestra en
hielo/acetona. Cada 10 min. las células fueron vistas de manera
microscópica. El procedimiento de sonificación fue detenido cuando
>70% de las células estaban rotas.
1 ml de las células desintegradas de cada una de
las tres cepas fue incubado en un buffer HEPES-NaOH
(20 mM) pH 7.7, al cual se le añadió
piridoxal-5-fosfato (0.01 mM) como
un cofactor y amida de la D-leucina (60.8 mM) como
un sustrato en un volumen total de 10 ml (0.79% p/p de amida de la
D-leucina). Después de 0 y 139 horas muestras de 1
ml fueron tomadas (de las cuales el peso exacto fue medido) y la
reacción en estas muestras fue detenida añadiendo 1 ml de metanol
(de las cuales el peso exacto fue también medido; para poder
calcular los factores de dilución). Las mezclas de reacción
detenidas fueron centrifugadas para remover las partículas. Los
sobrenadantes fueron congelados a -86ºC hasta el análisis HPLC de
acuerdo al método dado en el ejemplo 1.
Las mezclas de la reacción blancos fueron
preparadas, muestreadas y detenidas de la misma forma, con la
excepción de no fue añadido ningún sustrato y que en lugar de las
células desintegradas, solamente el buffer
HEPES-NaOH (20 mM, pH 7.7) fue añadido.
Los resultados son mostrados en la tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de la tabla puede ser observado que la
actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa está presente en las células desintegradas de
Agrobacterium rhizogenes Na, Agrobacterium rhizogenes
Bi, Arthrobacter nicotianae cuando la amida de la
D-leucina es convertida en
L-leucina; esta conversión no es detectada en los
blancos químicos. En los blancos químicos ninguna
D-leucina o L-leucina pudo ser
detectada incluso después de 139 horas, la concentración de la
amida de la D-leucina fue constante (0.7% p/p) lo
que significa que la amida de la D-leucina es muy
estable bajo las condiciones de reacción aplicadas.
Para obtener colonias simples, un caldo de
glicerol de O. anthropi IA fue moteado sobre una placa de
base de carbono para levaduras que contiene 0.5% (p/v) de
DL-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
como única fuente de nitrógeno, y cultivado a 28ºC. Una colonia
simple fue transferida a 150 ml de medio líquido LB, y cultivada a
28ºC con agitación vigorosa hasta una OD_{620 \ nm} de 0.9.
Entonces las células fueron recolectadas mediante centrifugación y
congeladas a -20ºC.
Después de descongelar las células, el AND total
fue aislado de acuerdo al Procedimiento de Purificación del ADN
Genómico de Qiagen para bacterias usando tips de Qiagen
Genomic-tip 100/G. El protocolo estándar de Qiagen
fue seguido con las siguientes modificaciones:
- \bullet
- El primer paso de incubación para efectuar la lisis de las células fue realizado sin proteinasa K durante 2 h a 37ºC, donde posteriormente dos veces la cantidad sugerida de proteinasa K fue añadida y la solución fue incubada por otras 2 h a 50ºC,
- \bullet
- Antes de la aplicación del lisado a los tips de Qiagen, un paso de centrifugación (10 min. a 5,000 x g, 4ºC) fue aplicado para aglomerar a las partículas.
- \bullet
- El lisado de las células del cultivo de 150 ml fue aplicado a columnas 3 G/100, 50 \mug del ADN cromosómico obtenido fue entonces parcialmente digerido con Sau3A I a 1/12 U por \mug de ADN durante 30 minutos. La mitad del ADN digerido fue corrido sobre un gel de agarosa al 0.6% y los fragmentos de ADN entre 4 y 10 kb de tamaño fueron aislados y redisueltos en 20 \mul de 10 mM de buffer de Tris-HCl, pH 8.0.
El ADN del vector fue preparado mediante la
digestión de 1 \mug de pZErO-2 (Invitrogen,
Groningen, Holanda) con BamH I de acuerdo con el protocolo de
Invitrogen.
El ADN del vector linealizado (50 ng) y los
fragmentos de ADN cromosómico de O. anthropi IA (10 \mul)
fueron ligados con T4 ADN ligasa (de acuerdo con el protocolo de
Invitrogen). Subsiguientemente, la mezcla de ligadura fue
precipitada con NaAc/etanol y resuspendida en 20 \mul de buffer
TE. 1 \mul de esta solución fue usado para la electroporación de
las células electrocompetentes de DH10B de E. coli (Life
Technologies) usando un pulsador génico BioRad (condiciones: 2.5
kV, 25 \muF, 100 \Omega, cubeta de 0,1 cm, 40 \mul de la
suspensión de células) de acuerdo con el protocolo del
suministrador. Los transformantes fueron depositados en placas
sobre el medio LB con 50 mg/l de kanamicina e incubados a 28ºC
durante 24 h. En total más de 12,000 colonias fueron obtenidas las
cuales formaron la biblioteca primaria de genes. Todas las 12,000
colonias fueron mezcladas en medio LB suplementado con 50 mg/l de
kanamicina. Parte de la suspensión de células obtenidas fue usada
para un aislamiento del plásmido total de acuerdo al procedimiento
QiaPrep (Qiagen). Esta "biblioteca en forma de plásmido" fue
almacenada a -20ºC hasta su uso posterior. A la parte restante de la
suspensión de células, se le añadió glicerol para una concentración
final de 20% (v/v). La suspensión resultante fue almacenada en
alícuotas a -80ºC como la biblioteca primaria de genes.
La solución auxiliar de
L-aminopeptidasa para el procedimiento de detección
de la amida del \alpha-H-\alpha
aminoácido racemasa fue preparada a partir de una cepa recombinante
de E. coli que contiene el plásmido pTrcLAP. El vector de
expresión pTrcLAP de E. coli contiene el gen pepA ATCC
12633 de Pseudomonas putida bajo el control del promotor
trc. Información detallada sobre este gen que codifica la
L-aminopeptidasa de P. putida puede ser
encontrada en T. Sonke, B. Kaptein, W. H. J. Boesten, Q. B.
Broxterman, H. E. Schoemaker, J, Kamphuis, F. Formaggio, C.
Toniolo, E. J. T.Rutjes en Stereoselective Biocatalysis (Ed.:
R. N. Patel). Dekker, Nueva York. 2000, pp.
23-58.
Un cultivo fresco de toda la noche de TOP10 de
E. coli/pTrcLAP fue usado para inocular 200 ml de medio LB
que contiene 0.4 mM de IPTG y 100 mg/l de ampicilina. Después del
cultivo durante toda la noche a 30ºC, las células fueron
aglomeradas mediante centrifugación y resuspendidas en 4 ml de 50 mM
de Tris-HCL pH 7.5. Después de la ruptura de las
células por medio de un paso a través de la prensa de French
(presión de 140 Mpa en una celda de la prensa de French de 4 ml),
fueron recogidas partículas sólidas mediante centrifugación (45 min.
a 40,000 x g, 4ºC). El pellet fue resuspendido en 2 ml de
Tris-HCl, pH 7.5 que contiene 100 mM de MgS0_{4}.
Esta suspensión fue cuidadosamente agitada durante 30 min. a 4ºC.
Después de la remoción de las partículas mediante centrifugación
(45 min. a 40,000 x g, 4ºC), la solución clara fue almacenada en
alícuotas a -20ºC para su uso en el ensayo de detección.
La solución de la "biblioteca en forma de
plásmido" fue diluida 1,000 veces en agua. 1 \mul de esta
solución de plásmidos fue usada para transformar las células TOP10
electrocompetentes de E. coli (Invitrogen), y los
transformantes fueron depositados en placas en medio LB con 50 mg/l
de kanamicina. Después de 2 días de incubación a
28-30ºC las colonias obtenidas eran lo
suficientemente grande para ser transferidas hasta 200 \mul del
medio líquido de detección (triptona 16 g/l; extracto de levadura 3
g/l; NaCl 5 g/l; glicerol 2 g/l; pH 7.3) con 50 mg/l de kanamicina
en placas microtiter. Los cultivos fueron cultivados durante 2 días
a 28-30ºC. A continuación, una réplica de las placas
microtiter fue preparada mediante la transferencia de unos pocos
microlitros de cada cavidad hacia nuevas placas microtiter que
contienen el medio LB sólido (agar al 0.8%) con 50 mg/l de
kanamicina. Estas placas fueron incubadas a 28-30ºC
durante 16-20 h, después de lo cual fueron
almacenadas a 4ºC como placas maestras. Las células de la parte
restante de las suspensiones de células fueron recolectadas
mediante centrifugación (10 min. a 1,500 x g, temperatura ambiente),
lavadas dos veces con 50 mM de buffer Tris-HCl, pH
7.5, y finalmente resuspendidas en 50 \mul de 50 mM de buffer
Tris-HCl, pH 7.5.
La reacción de detección fue iniciada por la
adición de 50 \mul la solución de sustrato que contiene una
mezcla de 140 mM de la amida de la D-valina, la
amida de la D-leucina y la amida de la
D-fenilalanina cada una en 50 mM de
Tris-HCL, pH 7.5 y 2 mM de MnCl_{2}. Después de 20
h de incubación de las placas microtiter en un agitador a 30ºC, 2
\mul de la solución auxiliar de L-aminopeptidasa
(para la preparación ver la sección anterior) fueron añadidos.
Después de
1.5 h adicionales de incubación a 30ºC, todas las reacciones fueron detenidas por la adición de 100 \mul de HCl 0.15 M.
1.5 h adicionales de incubación a 30ºC, todas las reacciones fueron detenidas por la adición de 100 \mul de HCl 0.15 M.
Subsiguientemente, la concentración de amonio en
todas las mezclas de reacción fue determinada mediante la
transferencia de 7 \mul de estas mezclas hacia placas microtiter
nuevas que contienen 93 \mul de reactivo GDH por cavidad. Este
reactivo GDH contenía por 100 ml 43 mg de NADH, 116 mg de de ácido
\alpha-ketoglutárico, 11.8 mg de ADP y 1200 U de
glutamato dehidrogenasa (Sigma) en 150 mM de
Tris-HCl, pH 8.0. Después de 15 min. de incubación
a 37ºC, la OD_{340 \ nm} en cada cavidad fue medida usando un
lector de placas microtiter Spectramax plus (Molecular Devices,
Sunnyvale, California, USA). Los clones que mostraron una OD_{340
\ nm} que era inferior al valor medio de la placa microtiter que
contenía este clon disminuido en tres veces la desviación estándar
de la misma placa microtiter, fueron considerados como clones
positivos potenciales.
De los 11,272 clones detectados, 32 clones
pudieron ser identificados como clones positivos potenciales.
De todos los 32 clones positivos potenciales
identificados en el análisis, fue usado material de las placas
maestras para inocular 3 ml del medio de detección líquido que
contiene 50 mg/l de kanamicina. Después del cultivo durante 2 días
a 30ºC, las células fueron recogidas mediante centrifugación de 2 ml
de estos cultivos de células. Entonces los pellets de células
fueron lavados cuatro veces en 25 mM de buffer
Tris-NCI, pH 7.5. Subsiguientemente, los pellets de
células fueron resuspendidos en 100 \mul de la solución de
sustrato que contiene 70 mM de la amida de la
D-fenilalanina, o la amida de la
D-leucina, o la amida de la D-valina
en 50 mM de Tris-HCl, pH 7.5 y 1 mM de MnCl_{2}.
Después de la incubación durante 20 h a 30ºC, las reacciones fueron
detenidas por la adición de 100 \mul de HCl 0.15 M, después de lo
cual las mezclas de reacción fueron analizadas por el método HPLC
descrito en el ejemplo 1.
De los 32 clones positivos potenciales en el
análisis, uno mostró la formación significativa de la
L-leucina a partir de la amida de la
D-leucina. Este clon contenía el gen de la amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa de O. anthropi IA en su plásmido de 7.7 kb. Esto se
concluyó a partir del hecho de que la transformación de este
plásmido en células de TOP10 de E. coli inevitablemente
conducen a las células recombinantes que convirtieron la amida de
la D-leucina en L-leucina. La
secuenciación de este plásmido, que fue llamado
pOa(1)PLV49B10, reveló la secuencia de nucleótidos
completa del gen de la amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa. La secuencia de este gen está listada como los
oligonucleótidos 98 a 1417 (incluyendo el codón de parada TAA) de
la SEQ ID: NO. 1 que codifica la proteína de la SEQ ID: NO. 2 como
es presentado infra.
Ejemplo
3A
Un caldo de glicerol de Arthrobacter
nicotianae NCIMB 41126 fue depositado sobre una placa de base de
carbono para levadura que contiene 0.2% (p/v) de
D-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama
como única fuente de N y cultivada durante 3-4 días
a 28ºC para obtener colonias aisladas de tamaño deseado. Una colonia
simple fue transferida a 50 ml de medio LB, y cultivada durante
toda la noche a 28ºC con agitación vigorosa. Durante la última
media hora de este periodo de cultivo, carbenicilina (concentración
final de 200 \mug/ml) fue añadida para debilitar la pared
celular. Las células fueron recolectadas mediante centrifugación, y
el pellet obtenido fue resuspendido en 5 ml de 50 mM de
Tris-HCl, pH 8.0 que contiene 50 mM de EDTA. Después
de la adición de 100 \mul of lisozima (100 mg/ml) y 25 \mul de
proteinasa K (20 mg/ml) la suspensión fue incubada durante 30
minutos a 37ºC. Luego 6 ml de Nuclai Lysis Solution (Promega
Corporation, Madison, USA) fueron añadidos seguido por una
incubación durante 15 minutos a 80ºC. Finalmente, la solución fue
incubada a 65ºC hasta la lisis completa. Después del tratamiento
con RNase (concentración final 4 \mug/ml) durante 30 minutos a
37ºC, 2 ml de Protein Precipitation Solution (Promega Corporation,
Madison, USA) fueron añadidos, y la solución fue agitada en forma
de torbellino durante 20 segundos seguido por la incubación en
hielo. Después de la centrifugación (10'; 4,500 x g, 4ºC), el
sobrenadante fue transferido a una mezcla de 0.1 volumenes de NaAc
(3M, pH 5) y 2 volumenes de etanol absoluto. El ADN genómico
precipitado fue enganchado a una pipeta estéril y transferido a un
tubo con 2 ml de 10 mM de Tris-HCl (pH 8). Después
que el ADNg se ha disuelto, la medición de A_{260 \ nm} y A_{280
\ nm} mostró que alrededor de 2.3 mg del ADNg de buena calidad
había sido aislado. La electroforesis en gel de agarosa demostró
que el ADNg aislado no contenía ARNr y que su tamaño era mayor que
15 kb.
50 \mug del ADNg fue parcialmente digerido con
Sau3A I a 1/24 U por \mug de ADN a 37ºC durante 30
minutos. Parte del ADN digerido fue corrido sobre un preparado de
gel de agarosa al 0.6% y los fragmentos de ADN entre 4 y 10 kb de
tamaño fueron aislados del gel usando el kit de extracción QIAquick
(Quiagen), concentrados mediante la precipitación de NaAc/etanol y
redisueltos en 10 \mul de 10 mM de buffer
Tris-HCl, pH 8.0.
El ADN del vector fue preparado mediante la
digestión de 1 \mug de pZErO-2 (Invitrogen, Breda,
Holanda) con BamH I de acuerdo con el protocolo del
suministrador.
El AND del vector linealizado (10 ng) y los
fragmentos de ADNg de A. nicotianae NCIMB 41126 (2.5 \mul)
fueron ligados en un volumen total de 10 \mul con 2,5 U de T4 ADN
ligasa durante 1 hora a 16ºC. Subsiguientemente, la mezcla de
ligadura fue precipitada con NaAc/etanol y resuspendida en 5 \mul
de buffer TE. 2.5 \mul de esta solución (alrededor de 5 ng del
vector) fueron usados para la electroporación de las células
electrocompetentes de DH10B de E. coli (Life Technologies)
usando un pulsador génico BioRad (condiciones: 2.5 kV, 25 \muF,
100 \Omega, cubeta de 0,1 cm, 40 \mul de la suspensión de
células) de acuerdo con el protocolo del suministrador. Los
transformantes fueron depositados en placas sobre el medio LB con 50
mg/l de kanamicina e incubados a 28ºC durante 24 h. En total
alrededor de 100,000 colonias fueron obtenidas las cuales formaron
la biblioteca primaria de genes. Todas las 100,000 colonias fueron
mezcladas en el medio LB suplementado con 50 mg/l de kanamicina.
Parte de esta suspensión de células fue usada para un aislamiento
del plásmido total de acuerdo al procedimiento QiaPrep (Qiagen).
Esta "biblioteca en forma de plásmido" fue almacenada a -20ºC
hasta su uso posterior. A la parte restante de la suspensión de
células, se le añadió glicerol hasta una concentración final de 8%
(v/v). La suspensión resultante fue almacenada en alícuotas a -80ºC
como la biblioteca primaria de genes.
La biblioteca de A. nicotianae NCIMB
41126 fue analizada para la amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa que contiene clones usando el protocolo dado en el ejemplo
3, sin embargo con una solución de sustrato ligeramente modificada.
Además de todos los componentes mencionados en el ejemplo 3, la
solución de sustrato en este análisis también contenía 20 \muM de
piridoxal-5-fosfato.
En total 10,691 clones de la biblioteca de A.
nicotianae NCIMB 41126 fueron detectados. 2 de estos clones
fueron identificados como clones positivos potenciales.
La confirmación de los clones positivos
potenciales fue realizada de acuerdo con el protocolo dado en el
ejemplo 3, con la excepción de que todas las 3 soluciones del
sustrato usadas contenían 10 \muM de
piridoxal-5-fosfato.
Este experimento demostró que ambos clones
convirtieron de manera significativa la amida de la
D-leucina en L-leucina y la amida
de la D-valina en L-valina. Como es
indicado en el ejemplo 1, estas conversiones demostraron la
presencia de la actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa en estos clones. Los experimentos de
re-transformación en los cuales los plásmidos de
ambos clones fueron introducidos en las células de TOP10 de E.
coli, mostraron que esta actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa está codificada por el plásmido, ya que todas las células
recombinantes analizadas convirtieron la amida de la
D-leucina en L-leucina y la amida
de la D-valina en L-valina.
Los plásmidos de ambos clones positivos fueron
entonces sometidos al análisis de enzimas de restricción. Este
análisis claramente mostró que ambos plásmidos recombinantes
contenían una inserción solapadora. Por lo tanto, solo uno de estos
plásmidos, es decir el pAn(1)PLV36D6, fue secuenciado.
El análisis de la secuencia de nucleótidos de este plásmido con un
tamaño total 7.1 kb, reveló la secuencia de nucleótidos completa del
gen de la amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa. La secuencia de este gen está listada como los nucleótidos
80 al 1417 (incluyendo el codón de parada TGA) de la SEQ ID: NO. 8
que codifica la proteína de la SEQ ID: NO. 9 como es presentado
infra. Como es mostrado a continuación, es también posible
expresar la amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa activa comenzando a partir de la posición 41 (GTG) de los
nucleótidos de la SEQ ID: NO. 8.
El gen de la amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa de O. anthropi IA fue subclonado en el vector de
expresión pKECaroP de E. coli usando PCR. El vector de
expresión pKECaroP es similar a la construcción pKECtrp, cuya
construcción ha sido descrita en WO 00/66751, excepto que pKECaroP
contiene la función par derivada de pSC101 y el promotor
aroH de E. coli en lugar del promotor trp. El
marco de lectura abierto de la amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa fue amplificado usando
como cebador directo (con el sitio
de escisión Nde I subrayado),
y
como cebador inverso (con el sitio
de escisión Xma I subrayado), y el plásmido
pOa(1)PLV49B10 como modelo. Esta PCR, que fue
realizada con PCR SuperMix High Fidelity (Life Technologies) de
acuerdo al protocolo del suministrador, produjo un fragmento único.
El tamaño correcto (1.341 bp) del fragmento amplificado fue
confirmado mediante electroforesis en gel de
agarosa.
Después de la purificación del fragmento
amplificado con el QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen), el
fragmento fue clonado en el vector pCR®4Blunt-TOPO
(Invitrogen). La mezcla de clonación fue subsiguientemente usada
para transformar las Células de TOP10 de E. coli Químicamente
Competentes One Shot^{TM} (Invitrogen). Las células recombinantes
fueron seleccionadas depositando la mezcla de transformación total
sobre placas LB que contienen 100 \mug/ml de carbenicilina,
seguido por una incubación toda la noche a 28ºC.
Después del cultivo durante toda la noche del
material de seis colonias en 5 ml de medio LB que contiene 100
\mug/ml de carbenicilina, el ADN plasmídico fue aislado usando el
QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen). La digestión con las enzimas de
restricción Nde I y Xma I demostraron que cinco de
estas seis colonias contenían el vector recombinante deseado.
El AND plasmídico de los cinco clones correctos
fue mezclado y digerido hasta la totalidad con Nde I y
Xma I. La mezcla de digestión total fue aplicada a un
preparado de gel de agarosa al 1% para la separación de de los
diferentes fragmentos. El fragmento correcto (1,322 bp) fue
subsiguientemente aislado del gel mediante QiAquick Gel Extraction
Kit (Qiagen) y almacenado a -20ºC hasta su uso posterior como
fragmento de inserción.
El plásmido pKECaroP fue digerido hasta la
totalidad con Nde I y Xma I, produciendo dos
fragmentos de 2,850 y 3,036 bp como es mostrado por la
electroforesis analítica en gel de agarosa. Después de la
inactivación por calor de las enzimas de restricción Nde I y
Xma I (20 minutos, 65ºC), Bsa I fue añadida a la
mezcla para cortar el fragmento de 2,850 bp no deseado en dos
pedazos más pequeños. La mezcla de digestión completa fue cargada
sobre un preparado de gel de agarosa al 1%, seguido por el
aislamiento del fragmento de 3,036 bp deseado usando QIAquick Gel
Extraction Kit (Qiagen), el cual fue almacenado a -20ºC hasta su
uso posterior como fragmento de vector.
El fragmento de inserción y de vector fueron
ligados usando T4 DNA Ligasa y la mezcla de ligadura resultante fue
usada para la transformación de las Células de TOP10 de E.
coli Químicamente Competentes One Shot^{TM}. La mezcla de
transformación fue depositada sobre placas de LB que contenían 50
\mug/ml de kanamicina, las cuales fueron incubadas a 28ºC hasta
que aparecieron colonias suficientemente grandes.
La PCR de las colonias usando PCR SuperMix (Life
Tachnologies) y los cebadores dados anteriormente ([SEO ID: NO. 6]
y [SEQ ID: NO. 7]) fue realizada para detectar las colonias que
contienen el vector recombinante correcto. El material de doce PCR
positivas fue usado para inocular 12 tubos con 5 ml de medio LB que
contenían 50 \mug/ml de kanamicina. El ADN plasmídico fue aislado
usando el QIAprep Spin Miniprep Kit. La digestión con la enzima de
restricción Hind III produjo dos fragmentos de 1.731 y 2,627
bp con todos los doce plásmidos, demostrando que todas las doce
colonias contenían el vector recombinante deseado.
Cinco de estos doce clones positivos fueron
cultivados en 25 ml de medio LB suplementado con 50 \mug/ml de
kanamicina. Después de la incubación durante toda la noche a 28ºC,
las células fueron recolectadas mediante centrifugación y lavadas
en el mismo buffer de sonificación usado en el ejemplo 2. Después de
resuspender los pellets de células en el buffer de sonificación (la
relación de las células en peso húmedo al buffer de sonificación es
1:10), las células fueron desintegradas mediante la sonificación.
Los extractos de células crudos fueron obtenidos mediante remoción
de las partículas mediante sonificación.
Los cinco extractos de células crudos obtenidos
fueron analizados para la actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa mezclando 0.5 ml de los mismos con 4.5 ml de la solución de
sustrato que consiste de 22.2 mM de un buffer
HEPES-NaOH pH 7.7 que contiene 0.01 mM de
piridoxal-5-fosfato y 66 mM de amida
de la D-leucina. Las reacciones fueron incubadas a
temperatura ambiente. Las muestras fueron tomadas después de 0, 18 y
44 horas de que fueron transferidas a un volumen igual de
H_{3}PO_{4} 1 M para detener la reacción. Estas muestras fueron
analizadas mediante HPLC de acuerdo con el método dado en el ejemplo
1.
Con el extracto crudo de dos de los cinco
clones, llamados E. coli/pKEC_AZAR_3 y E.
coli/pKEC_AZAR_11, fue detectada significativamente más amida
de la D-leucina y L-leucina en las
muestras de 18 y 44 horas que en la muestra de 0 horas. Finalmente,
la secuenciación de los nucleótidos de E. coli/pKEC_AZAR_3 y
E. coli/pKEC_AZAR_11 reveló la secuencia de nucleótidos
correcta del gen de la amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa y las partes del vector de flanqueo en estos dos plásmidos
recombinantes.
Ejemplo
4A
El gen de la amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa de A. nicotianae NCIMB 41126 fue subclonado en el
vector de expresión de E. coli
pBAD/Myc-His-DEST usando PCR y GATEWAY
Cloning Technology (Invitrogen). El marco de lectura abierto de la
amida del \alpha-H-\alpha
aminoácido racemasa fue primero amplificado por PCR usando
como cebador directo (con el sitio
Shine-Delgarno subrayado, el codón de parada ATG en
letra itálica y el sitio attB1 con doble subrayado),
y
como cebador inverso (con el codón
de parada en letra itálica y el sitio attB2 con doble
subrayado), y el plásmido pAn(1)PLV36D6 como modelo.
La identificación del plásmido pAn(1)PLV36D6 ha sido
descrito en el ejemplo 3A. La PCR, la cual fue realizada con
polimerasa Expand High Fidelity (Roche Applied Science, Mannheim,
Alemania) de acuerdo con el protocolo del suministrador, produjo un
fragmento único. El tamaño correcto (1,449 bp) del fragmento
amplificado fue confirmado por electroforesis en gel de
agarosa.
Después de la purificación del fragmento
amplificado a partir de un preparado de gel de agarosa con el
QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen), el fragmento fue usado como
un sustrato para la así llamada reacción de recombinación
in-vitro BP, la cual fue realizada de acuerdo
al manual GATEWAY del suministrador (Invitrogen). La recombinación
entre el fragmento attB-PCR y el Vector Donante pDONR2O7 y la
subsiguiente transformación de la mezcla obtenida en células
competentes de DH5\alpha de E. coli (Invitrogen) resultó
en el clon ENTRY pAn36D6-ENTRY. Las células
recombinantes fueron seleccionadas depositando la mezcla de
transformación completa sobre placas 2*TY que contienen 7 \mug/ml
de gentamicina, seguido por la incubación durante toda la noche a
37ºC. El ADN plasmídico fue aislado de unas pocas colonias simples
usando el QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen), después de haberlas
cultivado en el medio 2*TY que contiene 7 \mug/ml de gentamicina
durante 16 horas. La digestión con las enzimas de restricción
Pvu II, Nsp I (New England Biolabs, Frankfurt,
Alemania) y BssS I (New England Biolabs, Frankfurt,
Alemania), respectivamente, demostraron que todas las colonias
analizadas contenían en vector recombinante deseado. Luego, las
inserciones PCR-attB de cuatro de estos clones correctos
fueron secuenciadas. Todos los cuatro plásmidos
pAn36D6-ENTRY se-
cuenciados demostraron contener la secuencia esperada basada en la SEQ ID: No. 8 y los dos cebadores PCR usados.
cuenciados demostraron contener la secuencia esperada basada en la SEQ ID: No. 8 y los dos cebadores PCR usados.
Subsiguientemente la amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa que contiene el fragmento PCR fue introducido en el vector
de Destino pBAD/Myc-His-DEST (vide
infra) a través de la así llamada reacción de recombinación
in-vitro LR usando uno de los clones
correctos pAn36D6-ENTRY y
pBAD/Myc-His-DEST. También esta reacción fue
realizada de acuerdo con el procedimiento del suministrador. La
mezcla de recombinación fue usada para transformar las Células de
TOP10 de E. coli Químicamente Competentes One Shot^{TM}
(Invitrogen). Las células recombinantes fueron seleccionadas
depositando la mezcla de transformación completa sobre placas 2*TY
que contienen 100 \mug/ml de ampicilina seguido por la incubación
durante toda la noche a 37ºC. Después del cultivo durante toda la
noche de unas pocas colonias en el medio 2*TY que contiene 100
\mug/ml de ampicilina, el ADN plasmídico fue aislado usando el
QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen). La digestión con las enzimas de
restricción Acc I, Rsr II (New England Biolabs,
Frankfurt, Alemania), respectivamente, demostraron que todas las
colonias analizadas contenían el vector recombinante deseado
pBADAn36D6-DEST.
Una colonia simple de la cepa
TOP10/pBADAn36D6-DEST fue usada para inocular 50 ml
del medio TY 2 x suplementado con 100 \mug/ml de carbenicilina.
Después de la incubación durante toda la noche a 28ºC, 500 \mul de
este cultivo fueron usados para inocular 500 ml del medio 2*TY
suplementado con 100 \mug/ml de carbenicilina y arabinosa al
0,005%. Después de la incubación durante toda la noche a 28ºC, las
células fueron recolectadas mediante centrifugación (15 min. a
6,200 x g, 4ºC) y lavadas en una solución que contiene 20 mM de
HEPES-NaOH, pH 7.5, 20 \muM de
piridoxal-5-fosfato, y 1.3 mM de
ditiotreitol. Después de resuspender los pellets de células en la
misma solución buffer (la relación de las células en peso húmedo con
el buffer de sonificación es 1:3) las células fueron desintegradas
mediante 10 min. de sonificación con un Soniprep 150 de MSE operado
a la máxima amplitud usando intervalos de tiempo de 10 seg. (es
decir 10 seg. de sonificación, 10 seg. de enfriamiento) y
enfriamiento en hielo/acetona. Los extractos de células crudos
fueron obtenidos mediante remoción de las partículas mediante
sonificación. Finalmente, fue añadida sucrosa al extracto libre de
células para una concentración final de 0.25 M.
El extracto de células fue analizado para la
actividad racemasa mezclando 0.5 ml del mismo con 9.5 ml de la
solución de sustrato. Las reacciones fueron incubadas a 37ºC. Las
muestras fueron tomadas a intervalos regulares de tiempo, que
fueron transferidas a un volumen igual de H_{3}PO_{4} 1 M para
detener la reacción. Estas muestras fueron analizadas mediante HPLC
de acuerdo con el método dado en el ejemplo 1.
Este experimento mostró que el sustrato fue
completamente racemizado en 20 minutos. Por lo tanto, se concluyó
que la amida del \alpha-H-\alpha
aminoácido racemasa de A. nicotianae NCIMB 41128 es
codificada por el marco de lectura abierto representado en SEQ ID:
No. 8.
Ejemplo
4B
El vector de Destino
pBAD/Myc-His-DEST, que fue usado para la
expresión del gen de la amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa de A. nicotianae NCIMB 41126 en E. coli fue
preparado introduciendo un casete cat/ccdB en el vector de
expresión de E. coli comercialmente disponible
pBAD/Myc-HisC. El casete cat/ccdB fue amplificado
por PCR usando
como cebador directo (con la
secuencia promotora con subrayado doble, el sitio de escisión y
reconocimiento Bpi I subrayado y las secuencias attR
en letra itálica),
y
como cebador inverso (con el sitio
de escisión SnaB I subrayado y las secuencias attR en
letra itálica), y el vector pDEST15 (Invitrogen) como modelo. La
PCR, la cual fue realizada con polimerasa Expand High Fidelity
(Roche Applied Science, Mannheim, Alemania) de acuerdo con el
protocolo del suministrador, produjo un fragmento único. El tamaño
correcto (1792 bp) del fragmento amplificado fue confirmado por
electroforesis en gel de agarosa. Después de la purificación del
fragmento amplificado a partir de un preparado de gel de agarosa con
el QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen), el fragmento fue digerido
hasta la totalidad con Bpi I (MBI Fermentas,
St.Leon-Rot, Alemania) (resultando en un saliente
complementario para BamH I) y SnaB I (New England
Biolabs, Frankfurt, Alemania) y ligado con T4 ADN Ligasa en el
vector de expresión de E. coli pBAD/Myc-HisC
(Invitrogen), el cual había sido digerido con BamH I y
SnaB I. La mezcla de ligadura fue subsiguientemente usada
para la transformación de las células de DB3.1 de E. coli
Químicamente Competentes (Invitrogen). Las células recombinantes
fueron seleccionadas depositando la mezcla de transformación total
sobre placas 2*TY que contienen 35 \mug/ml de cloranfenicol
seguido por la incubación durante toda la noche a 37ºC. Después del
aislamiento del plásmido recombinante a partir de tres colonias
individuales, las inserciones fueron secuenciadas. Uno de estos
clones demostró contener la inserción deseada, y fue llamado
pBAD/Myc-His-DEST. Aunque 7 abreviaciones
fueron observadas entre la secuencia de nucleótidos de la parte
secuenciada del plásmido pBAD/Myc-His-DEST y
la secuencia de referencia (Invitrogen - secuencia de nucleótidos de
pDEST15), todas las características esenciales (resistencia al
cloranfenicol, selección de ccdB y recombinación de attR) del
pBAD/Myc-His-DEST fueron totalmente
funcionales.
Una colonia simple de DH10B de E. coli
que contenía el plásmido pOA(1)PLV49B10 fue
transferida al medio LB con kanamicina (50 mg/l) para preparar un
pre-cultivo. Después de la incubación durante toda
la noche a 28ºC y 200 rpm, este pre-cultivo fue
usado para inocular un frasco con 500 ml del medio 2*TY (10 g/l de
extracto de Levadura, 16 g/l de Triptona, 5 g/l de NaCl) que
contiene kanamicina (50 mg/l). Después del cultivo durante toda la
noche a 28ºC (OD_{620 \ nm}=4.4) y 200 rpm, las células fueron
recolectadas mediante centrifugación (15 min. a 6,200 x g, 4ºC) y
lavadas con 50 mM de buffer HEPES-NaOH de pH
7.7.
Para poder determinar la actividad anterior del
sistema vector-hospedero de E. coli en el
análisis de la actividad, una cepa DH10B de E. coli que
contiene una construcción basada en pZErO-2 con un
gen que codifica la Proteína Fluorescente Verde (GFPuv) mutante
como una inserción en la dirección opuesta del promotor Iac
portado por el vector, fue cultivada a través del mismo
procedimiento (DH10B de E.
coli/pZErO-GFPuv-orientación-incorrecta).
El cultivo de esta cepa de E. coli recombinante resultó en
un cultivo durante toda la noche con una OD_{620 \ nm} de
3.8.
Los pellets de células de ambos cultivos fueron
subsiguientemente lavados y resuspendidos en 25 ml de 50 mM de
buffer HEPES-NaOH, pH 7.7. Alícuotas de 2 ml de
ambas suspensiones de células fueron centrifugadas una vez más y
los pellets fueron almacenados a -20ºC hasta la ejecución de los
análisis de la actividad descritos a continuación. La parte
restante de estas suspensiones de células fueron almacenadas a -20ºC
para su uso en el ejemplo 6.
Para determinar la actividad de la E.
coli/pOA(1)PLV49B10 y de la E. coli
control, los pellets antes mencionados fueron descongelados y
resuspendidos hasta un volumen total de 1 ml con 50 mM de buffer
HEPES-NaOH, pH 7.7. Luego, las mezclas de reacción
de 10 ml cada una fueron preparadas conteniendo 50 mM de buffer
HEPES-NaOH (pH 7.7), 10 \muM de
piridoxal-5-fosfato (PLP), 2.5% en
peso de la amida de la D-leucina, si es aplicable
20 mM de EDTA para suprimir la actividad amidasa de la E.
coli, y 0.5 ml de las suspensiones de células de E.
coli/pOA(1)PLV49B10 y DH10B de E.
coli/pZErO-GFPuv-orientación-incorrecta
o agua (para los blancos químicos). Las reacciones fueron iniciadas
por la adición de las células. Las mezclas de reacción fueron
incubadas a 30ºC y 175 rpm. Directamente después de la adición de
las células (t = 0 horas) y después de 27 y 43 horas fueron tomadas
muestras en las cuales la reacción fue detenida mediante la remoción
de las células mediante la centrifugación seguida por la filtración
de 0.22 \muM. Finalmente, las muestras filtradas fueron
almacenadas a -20ºC hasta el análisis mediante HPLC quiral como es
descrito a continuación:
- columna:
- Sumichiral OA5000 de Sumika (150 x 4.6 mm I.D., 5\mu) + precolumna
- eluente:
- 85% v/v 2mM de CuSO_{4} + 15% v/v de metanol
- flujo:
- 1.0 ml/min.
- temp. de la columna:
- 40ºC
- volumen iny.:
- 5\mul
- detección:
- detección de fluorescencia después de la reacción post-columna con o-ftalaldehído y 2-mercaptoetanol (longitud de onda ex=338 nm y em>420 nm)
Los resultados de este experimento son
presentados en la tabla 4.
Los datos en la tabla 4 muestran claramente que
la DH10B de E.
coli/pZerO-GFPuv-orientación-incorrecta
no pudo convertir la amida de la D-leucina. Incluso
después de 43 horas de reacción, la mezcla de reacción contenía la
misma cantidad de la amida de la D-leucina que al
inicio de la reacción. Esto también fue el caso para todos los
blancos químicos (datos no mostrados).
Con las células de DH10B de E.
coli/pOA(1)PLV49B10 por otra parte, la cantidad de
la amida de la D-leucina claramente decreció en el
tiempo. Sin EDTA adicional, este sustrato fue convertido a una
cantidad relativamente pequeña de la amida de la
L-leucina y una gran cantidad de
L-leucina. Con EDTA adicional, una concentración
mucho más alta de la amida de la L-leucina fue
obtenida, debido a que EDTA, un compuesto quelatante inhibe
parcialmente la actividad amidasa de la E. coli, reduciendo
de esta forma la conversión de la amida de la
L-leucina en L-leucina.
Los resultados obtenidos en este experimento
demostraron que las células de DH10B de E.
coli/pOA(1)PLV49B10 contienen actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa con respecto a la amida de la D-leucina.
Además, ellos muestran que combinando esta amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa con una aminopeptidasa/amidasa L-selectiva
(presente por ejemplo en DH10B de E. coli), las amidas de los
D-\alpha-H-\alpha
aminoácidos pueden ser convertidas
L-\alpha-H-\alpha
aminoácidos.
Las suspensiones de células de DH10B de E.
coli/pOA(1)PLV49B10 y DH10B de E.
coli/pZErO-GFPuv-orientación-incorrecta
del ejemplo 2 (Preparación de las células) fueron usadas. Para
determinar su actividad con respecto a la amida de la
DL-leucina racémica, fueron preparadas mezclas de
reacción idénticas a las del ejemplo 5, excepto que 2.5% en peso de
la amida de la DL-leucina fue usado, EDTA fue
omitido en todas las reacciones, y las reacciones fueron iniciadas
con 2 ml de las suspensiones de células. Las muestras fueron tomadas
directamente después del inicio de las reacciones (t = 0 horas) y
después de 8 y 24 horas.
Los resultados de este experimento son
presentados en la tabla 5.
\global\parskip0.900000\baselineskip
A partir de los datos en la tabla 5 está claro
que las células blanco de E. coli (DH10B de E.
coli/pZerO-GFPuv-orientación-incorrecta)
pueden solamente convertir la amida de la L-leucina
en L-leucina con un exceso enantiomérico de más de
95%. La amida de la D-leucina se deja sin tocar,
resultando de esta forma en un rendimiento máximo de solamente el
50%.
Con las células de DH10B de E.
coli/pOA(1)PLV49B10 que contienen el gen que
codifica la amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa, claramente ambas la amida de la L- y la
D-leucina son convertidas en
L-leucina, conduciendo a un rendimiento de más del
50% y máximo 100%. Nuevamente, el exceso enantiomérico de la
L-leucina obtenida está bien por encima del
95%.
Este experimento demuestra que combinando la
amida del \alpha-H-\alpha
aminoácido racemasa de O. anthropi IA con una
aminopeptidasa/amidasa L-selectiva (presente por
ejemplo en DH10B de E. coli), las amidas de los
DL-\alpha-H-\alpha
aminoácidos pueden ser convertidas a
L-\alpha-H-\alpha
aminoácidos con un rendimiento de más del 50%.
Dos pre-cultivos de TOP10 de
E. coli/pKEC_AZAR_3 (ver el ejemplo 4) fueron preparados
mediante la inoculación de 2 frascos de Erlenmeyer con 100 ml del
medio 2*TY (10 g/l de extracto de Levadura, 16 g/l de Triptona, 5
g/l de NaCl) que contienen 50 mg/l de kanamicina con 10 \mul de un
caldo de glicerol por frasco. Después del cultivo durante toda la
noche a 28ºC y 200 rpm, los pre-cultivos fueron
mezclados, y subsiguientemente usados para inocular 2 frascos de
Erlenmeyer cada uno conteniendo 1 l del mismo medio. También estos
frascos fueron cultivados a 28ºC y 200 rpm durante
16-18 h. Las células fueron recolectadas mediante
centrifugación (15 min. a 6,200 x g, 4ºC), lavadas con 20 mM de
HEPES-NaOH, pH 7.5, mezcladas, pesadas, y
resuspendidas en una solución que contiene 20 mM de
HEPES-NaOH, pH 7.5, 20 \muM de
piridoxal-5-fosfato, y 1.3 mM de
ditiotreitol en una relación de 1:3 de las células en peso húmedo
con respecto a la solución. Luego, las células fueron desintegradas
por medio de 10 min. de sonificación con un Soniprep 150 de MSE
operado a una amplitud máxima usando intervalos de tiempo de 10
seg. (es decir 10 seg. de sonificación, 10 seg. de enfriamiento), y
enfriamiento en hielo/acetona. Las partículas fueron removidas
mediante centrifugación, después de lo cual fue añadida sucrosa al
extracto libre de células hasta una concentración final de 0.25 M.
El extracto libre de células resultante (CFE) fue almacenado en
alícuotas a -20ºC. Las células de TOP10 de E.
coli/pBAD/Myc-HisC (Invitrogen) fueron tratadas
exactamente de la misma forma y sirvieron como control negativo.
La especificidad de sustrato de la amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa de Ochrobactrum anthropi IA fue determinada
midiendo la actividad racemasa del CFE antes mencionado con respecto
a un número de amidas de aminoácidos enantioméricamente puros. Cada
mezcla de reacción de 10 ml (incluyendo el CFE) contenía 50 mM de
HEPES-NaOH, pH 8.0, 20 \muM de
piridoxal-5-fosfato, 0,4 mg/ml de
BSA, 1 mM de ditiotreitol, 20 mM de EDTA y 75 mM de una de las
amidas de los aminoácidos analizadas. Las reacciones fueron
iniciadas por la adición de 1 ml del CFE descongelado de TOP10 de
E. coli/pKEC_AZAR_3 o TOP10 de E.
coli/pBAD/Myc-HIsC (blanco) y fueron incubadas a 37ºC.
En intervalos de tiempo regulares fueron tomadas muestras de 1 ml y
transferidas a frascos que contenían 1 ml de H_{3}PO_{4} 1 M
para detener la reacción. Después de una dilución suficiente de las
muestras en buffer de borato 0.4 M pH 9.4, las mezclas obtenidas
fueron analizadas usando HPLC para determinar las concentraciones
exactas de los dos enantiómeros de las amidas de los aminoácidos y
los dos enantiómeros de los aminoácidos de acuerdo al siguiente
método.
- columna:
- Inertsil ODS-3 150 x 4,6 mm I.D.
- eluente A:
- 50 mM de acetato de sodio, pH 6.0 con ácido acético/acetonitrilo 95/5% v/v
- eluente B:
- 50 mM de acetato de sodio, pH 6.0 con ácido acético/acetonitrilo 30/70% v/v
| gradiente: | Tiempo(min) | Eluente A | Eluente B |
| (% v/v) | (% v/v) | ||
| 0 | 100 | 0 | |
| 28 | 0 | 100 | |
| 33 | 0 | 100 | |
| 33.1 | 100 | 0 | |
| \; 41 (tiempo de parada) |
- flujo:
- 1.0 mil/min.
- temp. de la columna:
- 40ºC
- volumen iny.:
- 20 \mul
- detección:
- detección de fluorescencia después de la reacción de la pre-columna con o-ftalaldehído y ácido D-3-mercapto-2-metilpropiónico. (longitud de onda ex=338 nm y em>420 nm)
\vskip1.000000\baselineskip
Reactivos de la pre-columna:
- Reactivo A:
- 50 mM de Anhídrido Orto Ftálico (170 mg/25 ml de MeOH/agua 50/50
- Reactivo B:
- 113 mg de ácido D-S-benzoil-3-mercapto-2-metilpropiónico en 1 ml de NaOH 1 M y disolver. Añadir 9 ml de MeOH/agua 50/50 y ajustar a pH 7,0 con H_{3}PO_{4} 1 M.
- Reactivo C:
- H_{3}PO_{4} 0.25 M
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento de derivatización:
- \quad
- 35 \mul del Reactivo A
- \quad
- 35 \mul del Reactivo B
- \quad
- 210 \mul de la solución de la muestra (la muestra en buffer de borato 0.4 M pH 9.4)
- \quad
- 140 \mul del Reactivo C
\vskip1.000000\baselineskip
Tiempo de reacción: 5 minutos
\global\parskip1.000000\baselineskip
La actividad inicial para los diferentes
sustratos analizados fue calculada a partir de las partes lineales
de las curvas de progreso, en las cuales la conversión fue trazada
contra el tiempo de reacción. El uso de la parte linear de las
curvas de progreso garantizaron que solamente las muestras tomadas
en puntos de tiempos en los cuales la concentración de los
sustratos era aún suficientemente alta, fueran usadas para los
cálculos. La conversión fue calculada dividiendo la cantidad de
aminoácido y de amida del aminoácido formados a través de la
reacción racemasa (de esta forma con la estereoquímica opuesta
en comparación con la molécula del sustrato) por la cantidad total
de los enantiómeros de los dos aminoácidos y los enantiómeros de las
dos amidas de los aminoácidos. De esta forma, las conversiones
calculadas fueron corregidas para la hidrólisis potencial del
producto y/o el sustrato de la amida mediante
aminopeptidasas/amidasas que no fueron completamente inhibidas por
EDTA en la mezcla de reacción.
Con el CFE de TOP10 de E.
coli/pBAD/Myc-HisC ninguno de los sustratos de la amida
del \alpha-H-\alpha aminoácido
enantiopuro usados fue racemizado. La TOP10 de E. coli
claramente no contenía una amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa. Los resultados de este experimento con el CFE de TOP10 de
E. coli/pKEC_AZAR_3 son dados en la tabla 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados presentados en la tabla 6
muestran claramente que el CFE de TOP10 de E.
coli/pKEC_AZAR_3 puede no solamente racemizar la amida de la
leucina, sino también otras amidas de los
\alpha-H-\alpha aminoácidos.
Debido a que esta cepa recombinante contiene el gen de la amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa de O. anthropi IA, esta amplia especificidad de
sustrato puede solamente ser atribuido a la racemasa codificada por
este gen.
La amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa de Ochrobactrum anthropi IA fue parcialmente
purificada a partir de DH10B de E.
coli/pOa(1)PLV49B10. Para obtener suficiente
material celular para esta purificación, esta cepa recombinante fue
fermentada a escala de 10 litros. Primero, un cultivo de semilla fue
preparado mediante la inoculación de 500 ml del medio 2*TY que
contiene 50 mg/l de kanamicina con 10 \mul de un caldo de
glicerol de esta cepa. Después de 22 horas de incubación a 28ºC y
170 rpm, una OD_{620 \ nm} de 2.2 fue obtenida. El medio completo
de semillas fue entonces transferido a un fermentador (Tipo
ISF-200, Infors, Bottmingen, Suiza) que contiene 9
litros del medio 2*TY que contiene 50 mg/l de kanamicina. El pH fue
controlado en 7.0 por la adición de 5N de H_{3}PO_{4} y/o 5 N
de KOH, y el pO_{2} fue manualmente ajustado cambiando tanto la
aireación (1-2 litros de aire por minuto) como la
velocidad del agitador (250-750 rpm). El fermentador
fue operado a 28ºC durante 19 horas, resultando en una suspensión
de células con una OD_{620 \ nm} de 5.7. Las células fueron
recolectadas mediante centrifugación (15 min. a 12,000 x g, 4ºC),
lavadas una vez en 20 mM de HEPES-NaOH, pH 7 y
almacenadas como pellet de célula húmedo (alrededor de 125 g) a
-20ºC.
Después de descongelar el pellet de células, las
células fueron resuspendidas en el buffer A (20 mM de
HEPES-NaOH, pH 7.5, 1.3 mM de ditiotreitol, 20
\muM de piridoxal-5-fosfato) que
contiene 2.66 mM de MgCl_{2}. Por gramo de células en peso
húmedo, fueron usados 3 gramos del buffer A. Justo antes de la
desintegración, fue añadido benzonasa (30 U/gramo de células en
peso húmedo - Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) a la suspensión de
células. Las células fueron desintegradas por medio de un paso a
través de un homogenizador (Haskel, modelo NJ1600HD15, Wesel,
Alemania) a una presión de operación de 1500 bar. Luego las
partículas fueron removidas mediante centrifugación (30 min. a
34,000 x g, 4ºC) y el extracto libre de células (CFE) fue
almacenado en alícuotas a -20ºC.
Todos los siguientes pasos de la purificación
fueron realizados a 4ºC. El primer paso de la purificación fue una
precipitación en sulfato de amonio a 40% de saturación. Este paso
fue realizado adicionando una solución de
(NH_{4})_{2}SO_{4} saturada al 80% gota a gota hasta un volumen igual que el CFE. La solución turbia fue lentamente agitada durante 1.5 h, después de lo cual la proteína precipitada fue recogida mediante centrifugación (30 min, a 15,000 x g). El pellet de proteínas fue disuelto en el buffer A, y usado en el próximo paso de purificación.
(NH_{4})_{2}SO_{4} saturada al 80% gota a gota hasta un volumen igual que el CFE. La solución turbia fue lentamente agitada durante 1.5 h, después de lo cual la proteína precipitada fue recogida mediante centrifugación (30 min, a 15,000 x g). El pellet de proteínas fue disuelto en el buffer A, y usado en el próximo paso de purificación.
Para permitir la cromatografía de intercambio
aniónico como segundo paso de la purificación, la solución de
proteínas después de la precipitación en sulfato de amonio tuvo que
ser desalinizada. Por lo tanto, fue aplicada en porciones de 2.5 ml
para columnas de desalinización PD-10 (Amersham
Biosciences, Roosendaal, Holanda), que habían sido equilibradas con
20 mM de Tris-HCl, pH 8.0 (buffer B). La elución de
la proteína fue efectuada con 3.5 ml del buffer B por columna
PD-10. La solución de proteínas desalinizada fue
aplicada a una columna Mono Q HR 10/10 (Amersham Biosciences,
Roosendaal, Holanda) que había sido equilibrada con el buffer B.
Esta columna fue operada a una velocidad del flujo de 4 ml/min, y
fracciones de 4 ml fueron recogidas. La amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa fue eluída desde esta columna con buffer B que contiene
NaCl 1 M aplicando un gradiente lineal de NaCl al
0-100% en 100 ml. La amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa eluída a alrededor de NaCL 0.34 M y las fracciones activas
fueron mezcladas.
La amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa que contiene la solución de proteínas fue entonces aplicada
a una columna de filtración en gel HiLoad 26/60 Superdex 200 prep
grade (Amersham Biosciences, Roosendaal, Holanda) que había sido
equilibrada con el buffer B que contiene NaCl 1 M. La amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa fue eluída con el buffer de equilibrio a una velocidad del
flujo de 3 ml/min. Fracciones de 3 ml fueron recogidas. Las
fracciones que contienen la actividad racemasa fueron mezcladas y se
añadió sucrosa hasta una concentración de 0.25 M antes del
almacenamiento en alícuotas a -20ºC.
Usando este protocolo de purificación, la amida
del \alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa de O. anthropi IA fue parcialmente purificada a
partir del CFE de DH10B de E.
coli/pOa(l)PLV49B10 para un rendimiento total de
19%. SDS-PAGE usando el sistema NuPAGE (Invitrogen)
bajo condiciones de reducción con buffer MES mostró que alrededor
del 50% de la proteína en la preparación después de la filtración en
gel consistía en racemasa.
La especificidad de sustrato de la amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa de O. anthropi IA fue determinada usando la
preparación de enzimas parcialmente purificadas obtenida por el
protocolo descrito anteriormente. Las mezclas de reacción de un
volumen total de 1 ml fueron preparadas mezclando 772 \mul de
66.6 mM de HEPES-NAOH, pH 8.0, 10 \mul de
ditiotreitol 0.1 M, 18 \mul de una solución que contiene 20 mg/ml
de BSA y 1 mM de
piridoxal-5-fosfato, y 100 \mul de
una solución de sustrato 0.75 M, pH 8.0. Después del equilibrio
durante 5 minutos a 37ºC, las reacciones fueron iniciadas mediante
la adición de 100 \mul de la solución de enzimas. Las mezclas de
reacción fueron incubadas a 37ºC sin agitación. Después de
intervalos regulares de tiempo, muestras de 50 \mul fueron
tomadas y transferidas a frascos que contenían 950 \mul de
H_{3}PO_{4} 1 M para detener la reacción. Después de una
dilución suficiente de las muestras en buffer de borato 0,4 M pH
9.4, las mezclas obtenidas fueron analizadas usando HPLC para
determinar las concentraciones exactas de los dos enantiómeros de
la amida del aminoácido de acuerdo al método del ejemplo 7.
La actividad inicial para los diferentes
sustratos analizados fue calculada a partir de las partes lineales
de las curvas de progreso, en las cuales la cantidad del enantiómero
de la amida del aminoácido formado (de esta forma con la
estereoquímica opuesta a la molécula del sustrato) fue trazada
contra el tiempo de reacción. Los resultados de este experimento
son dados en la tabla 7.
Los datos en la tabla 7 muestran claramente que
la amida del \alpha-H-\alpha
aminoácido de O. anthropi IA tiene una especificidad de
sustrato relajada, debido a que la actividad fue encontrada con
respecto a las amidas de los aminoácidos con una cadena lateral de
alquilo de cadena larga y corta, que puede ser opcionalmente
sustituida en su átomo C_{\beta}, así como con respecto a las
amidas de los aminoácidos con una cadena lateral de arilo.
La preparación del CEF de DH10B de E.
coli/pAN(1)PLV36D06 fue realizada como se
describió en el ejemplo 7 para la TOP10 de E.
coli/pKEC_AZAR_3.
Antes de aplicar el CFE de DH10B E.
coli/pAN(1)PLV36D06 en las reacciones con
diferentes amidas de los
\alpha-H-\alpha aminoácidos
enantioméricamente puros para determinar la especificidad de
sustrato de la amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa de A nicotianae, las aminopeptidasas/amidasas de
E. coli en este CFE fueron inhibidas mediante un
pre-tratamiento por medio de un cóctel inhibidor.
Una tableta del Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail (Roche
Applied Science, Mannheim, Alemania) fue disuelta en 9 ml del CFE
seguido por una incubación de 1 hora a temperatura ambiente. A
continuación, las mezclas de reacción de 10 ml cada una (incluyendo
el CFE) fueron preparadas conteniendo 50 mM de
HEPES-NaOH, pH 8.0, 20 \muM de
piridoxal-5-fosfato, 0,4 mg/ml de
BSA, 1 mM de ditiotreitol y 75 mM de una de las amidas de los
aminoácidos analizadas. Las reacciones fueron iniciadas por la
adición de 1 ml del CFE pre-tratado de DH10B E.
coli/pAN(1)PLV36D06 o TOP10 de E.
coli/pBAD/Myc-HisC (blanco) y fueron incubadas a 37ºC. En
intervalos de tiempo regulares fueron tomadas muestras de 1 ml y
transferidas a frascos que contienen 1 ml de H_{3}PO_{4} 1 M
para detener la reacción. Después de una dilución suficiente de las
muestras en buffer de borato 0.4 M pH 9.4, las mezclas obtenidas
fueron analizadas usando HPLC para determinar las concentraciones
exactas de los dos enantiómeros de las amidas de los aminoácidos y
los dos enantiómeros de los aminoácidos de acuerdo al método del
ejemplo 7. También el cálculo de la actividad inicial del CFE con
respecto a los diferentes sustratos de las amidas de los
\alpha-H-\alpha aminoácidos fue
realizado como se describió en el ejemplo 7, incluyendo la
corrección para la hidrólisis potencial del producto y/o sustrato de
la amida mediante las aminopeptidasas/amidasas que no fueron
completamente inhibidas por la pre-incubación del
CFE con el cóctel inhibidor.
Como ya fue encontrado en el ejemplo 7, también
el CFE pre-tratado de TOP10 de E.
coli/pBAD/Myc-HIsC no mostró ninguna racemización de los
sustratos de las amidas de los
\alpha-H-\alpha aminoácidos
enantiopuros usados. Los resultados de este experimento con el CFE
de TOP10 de E. coli/pAN(1)PLV36D06 son dados en
la tabla 8.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados presentados en la tabla 8
demuestran claramente que la amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa de A. nicotianae NCIMB 41126 tiene no solamente
actividad con respecto a la amida de la leucina, sino también con
respecto a otras amidas de los
\alpha-H-\alpha aminoácidos.
El cultivo de DH10B de E.
coli/pOa(1)PLV49B10 así como la preparación del
extracto libre de células fueron realizados de una manera
comparable al ejemplo 7. También en este caso, la TOP10 de E.
coli/pBAD/Myc-HisC fue tratada exactamente de la misma
forma para servir como control negativo.
Para determinar la actividad del CFE de DH10B
de E. coli/pOa(1)PLV49B10 y de TOP10 de E.
coli/pBAD/Myc-HisC, las mezclas de reacción de 10 ml cada
una fueron preparadas conteniendo 50 mM de buffer
HEPES-NaOH (pH 8.0), 20 \muM de
piridoxal-5-fosfato, 0.4 mg/ml de
BSA, 1 mM de ditiotreitol, y 75 mM de la amida del ácido
DL-2-aminobutírico. Las reacciones
fueron iniciadas por la adición de 1 ml del CFE descongelado de
DH10B de E. coli/pOa(1)PLV49B10 o de TOP10 de
E. coli/pBAD/Myc-HisC (blanco) y fueron incubadas a
37ºC durante 21.5 h. Las muestras de 1 ml fueron tomadas a
intervalos regulares de tiempo y transferidas a frascos que
contenían 1 ml de MeOH para detener la reacción. El análisis de
estas muestras para determinar las concentraciones del ácido L- y
D-2-aminobutírico y la amida del
ácido L- y D-2-aminobutírico fue
realizado mediante HPLC de acuerdo con el siguiente protocolo:
- columna:
- Sumichiral OA5000 de Sumika (150 x 4.6 mm I.D., 5\mu) + precolumna
- eluente:
- 4 mM de CUSO_{4} en agua
- flujo:
- 1 ml/min.
- temp. de la columna:
- 10ºC
- volumen iny.:
- 6\mul
- detección:
- detección de fluorescencia después de la reacción post-columna con o-ftalaldehído y 2-mercaptoetanol en buffer de borato 0.4 M con adición de EDTA
- \quad
- (longitud de onda ex=338 nm y em>420 nm)
Los resultados de este experimento son
presentados en la tabla 9.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de los datos en la tabla 9 está claro
que la máxima conversión obtenida con el CFE de las células blanco
de E. coli (TOP10 de E. coli/pBAD/Myc-HisC) no
excede el 50%. Debido a que estas células no contienen una
actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa, solo la amida del ácido L-aminobutírico
será convertida, dejando el otro enantiómero del sustrato sin tocar.
Por lo tanto el máximo rendimiento teórico en este caso es
solamente de 50%, como es la norma para las reacciones de resolución
cinéticas (enzimáticas). Los datos de los dos últimos puntos de
tiempo de esta serie muestran que la
L-amidasa/aminopeptidasa de TOP10 de E. coli
también convierten lentamente la amida del ácido
D-aminobutírico cuando la concentración del
L-sustrato se aproxima a cero, resultando en un
ácido L-aminobutírico con un exceso enantiomérico de
91.7% después de 21.5 horas de reacción.
Con el CFE de DH10B de E.
coli/pOA(1)PLV49B10 conteniendo la amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa de O. anthropi IA, claramente también la amida del
ácido D-aminobutírico es convertida, conduciendo a
una conversión total hacia el ácido L-aminobutírico
de 85.4% después de 21.5 horas. El exceso enantiomérico del ácido
L-aminobutírico obtenido en la mezcla de reacción
está todavía bien por encima del 95% durante la reacción. Esto es
provocado por la concentración superior de la amida del ácido
L-aminobutírico al final de la reacción a través de
la acción de la amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa.
Este experimento demuestra que combinando la
amida del \alpha-H-\alpha
aminoácido racemasa de O. anthropi IA con la
aminopeptidasa/amidasa L-selectiva (como esta
presente en por ejemplo el CFE de las células de TOP10 de E.
coli) las amidas de los
DL-\alpha-H-\alpha
aminoácidos pueden ser convertidas en
L-\alpha-H-\alpha
aminoácidos con un rendimiento de más del 50% y excelente exceso
enantiomérico.
En este experimento, el CFE de DH10B de E.
coli/pOA(1)PLV49B10 del ejemplo 11 fue usado. Fue
combinado con una preparación que contiene la
L-aminopeptidasa de P. putida ATCC
12633. Esta es la misma enzima L-enantioselectiva
que fue usada como solución auxiliar de la
L-aminopeptidasa en el análisis de las bibliotecas
de genes de O. anthropi IA y A. nicotianae NCIMB 41126
(ejemplos 3 y 3A).
Una mezcla de reacción de 10 ml (volumen total
que incluye las preparaciones de enzimas) fue preparada conteniendo
50 mM de HEPES-NaOH, pH 8.0, 20 \muM de
piridoxal-5-fosfato, 0.4 mg/ml de
BSA, 1 mM de ditiotreitol, y 75 mM de la amida del ácido
DL-2-aminobutírico. La reacción fue
iniciada por la adición de 0.4 ml del CFE descongelado de DH10B de
E. coli/pOa(1)PLV49B10 y 0.17 ml de una
solución que contenía L-aminopeptidasa de P.
putida ATCC 12633. La mezcla de reacción fue incubada a 37ºC
durante 18 h. Las muestras de 1 ml fueron tomadas en ciertos
intervalos de tiempo y transferidas a frascos que contenían 1 ml de
MeOH para detener la reacción. El análisis de estas muestras para
determinar las concentraciones del ácido L- y
D-2-aminobutírico y la amida del
ácido L- y D-2-aminobutírico fue
realizado mediante HPLC de acuerdo con el protocolo del ejemplo 11.
Los resultados de este experimento son presentados en la tabla
10.
Los datos en la tabla 10 muestran que con la
combinación de la amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa de O. anthropi IA y la
L-aminopeptidasa de Pseudomonas putida
ATCC 12633 puede ser obtenida una extremadamente alta conversión al
ácido L-2-aminobutírico (97.3%).
Esta conversión obtenida es muy cercana al valor teórico máximo que
puede ser obtenido para una resolución cinética dinámica (es decir
100%). Adicionalmente, el exceso enantiomérico del ácido
L-2-aminobutírico está todavía por
encima del 95%.
En un montaje muy similar, la actividad
combinada de la amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa de O. anthropi IA y la
L-aminopeptidasa de P. putida ATCC
12633 fue determinada con respecto a un sustrato más complejo de
amida del ácido
DL-2-amino-5-[1,3]dioxolan-2-il-pentanóico.
La estructura molecular de esta amida puede ser encontrada en la
tabla de sustratos en el ejemplo 8. En este experimento 1 ml de CFE
descongelado de DH10B de E. coli/pOa(1)PLV49B10
fue usado conjuntamente con 1 ml de una solución que contenía
L-aminopeptidasa de P. putida ATCC 12633. La
reacción tuvo lugar durante 120 horas. El análisis de estas
muestras para determinar las concentraciones del ácido L- y
D-2-amino-5-[1,3]dioxolan-2-il-pentanóico
y la amida del ácido L- y
D-2-amino-5-[1,3]dioxolan-2-il-pentanóico
fue realizado mediante HPLC de acuerdo con el siguiente
protocolo,
- columna:
- Crownether Cr(-) (150 mm x 4.0 mm ID)
- eluente:
- Ácido perclorídico en agua, pH = 1.0
- flujo:
- 1.2 ml/min.
- temp. de la columna:
- 18ºC
- volumen iny.:
- 20\mul
- detección:
- detección de fluorescencia después de la reacción post-columna con o-ftalaldehído y 2-mercaptoetanol en buffer de borato 0.4 M
- \quad
- (longitud de onda ex=338 nm y em>420 nm)
Los resultados de este experimento son
presentados en la tabla 11.
Los datos en la tabla 11 muestran que con la
combinación de la amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa de O. anthropi IA y la
L-aminopeptidasa de Pseudomonas putida
ATCC 12633 puede ser obtenida una conversión por encima del 65% de
la amida del ácido L- y
D-2-amino-5-[1,3]dioxolan-2-il-pentanóico
al L-ácido en 120 h de reacción. El exceso enantiomérico del
L-ácido formado es superior al 98%.
Los resultados obtenidos en este experimento
demuestran que una resolución cinética dinámica combinando la amida
del \alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa de O. anthropi IA con una aminopeptidasa/amidasa
L-selectiva (por ejemplo la
L-aminopeptidasa de P. putida ATCC 12633) es
también posible para las amidas de los
\alpha-H-\alpha aminoácidos más
complejas que contienen cadenas laterales funcionalizadas.
\global\parskip0.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> DSM IP Assets B.V.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> POLIPÉPTIDOS QUE TIENEN ACTIVIDAD
AMIDA DEL alfa-H-alfa AMINOÁCIDO
RACEMASA Y LOS ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN LOS MISMOS.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> WC 20595
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> versión PatentIn 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1501
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ochrobactrum anthropi IA
NCIMB 41129
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (98)...(1417)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia que codifica la Amida del
Aminoácido Racemasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 439
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ochrobactrum anthropi IA
NCIMB 41129
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 436
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arthrobacter nicotianae NCIMB
41126
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 400
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Agrobacterium rhizogenes
NCIMB 41128
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 381
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Agrobacterium rhizogenes Na
NCIMB 41127
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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<210> 7
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<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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<210> 8
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<211> 1454
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Arthrobacter nicotianae NCIMB
41126
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (80)...(1417)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia que codifica la Amida del
Aminoácido Racemasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 445
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arthrobacter nicotianae NCIMB
41126
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
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<211> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<223> ADN sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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<210> 11
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<211> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<223> ADN sintético
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 11
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<210> 12
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<211> 100
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<223> ADN sintético
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<400> 12
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<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
Claims (15)
1. Polipéptido aislado que tiene actividad amida
del \alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa y que tiene un grado de identidad con la secuencia de
aminoácidos presentada en SEQ ID: NO. 2 de al menos alrededor del
55%, en particular de al menos alrededor del 65%, más en particular
de al menos alrededor del 75%, aún más en particular de al menos
alrededor del 85%, aún más en particular de al menos alrededor del
90%, aún más en particular de al menos alrededor del 95%, y lo
máximo en particular de al menos alrededor del 97%.
2. Polipéptido aislado que tiene actividad amida
del \alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa y que tiene un grado de identidad con la secuencia de
aminoácidos presentada en SEQ ID: NO. 9 de al menos alrededor del
50%, preferiblemente de al menos alrededor del 60%, más
preferiblemente de al menos alrededor del 70%, aún más
preferiblemente de al menos alrededor del 80%, en particular de al
menos alrededor del 90%, más en particular de al menos alrededor
del 95%, y lo máximo en particular de al menos alrededor del
97%.
3. Polipéptidos aislados que tienen actividad
amida del \alpha-H-\alpha
aminoácido racemasa, los cuales son codificados por secuencia de
ácidos nucleicos que se hibridan con la SEQ ID: NO. 1 o una hebra
complementaria de la misma o con SEQ ID: NO. 8 o una hebra
complementaria de la misma bajo condiciones donde la hibridación es
realizada en cloruro de sodio/citrato de sodio 6 X a alrededor de
45ºC durante alrededor de 12 horas y donde dos pasos consecutivos
de lavado de 30 minutos en cloruro de sodio/citrato de sodio 1 X,
SDS al 0.1% son realizados a 50ºC, preferiblemente a 55ºC, más
preferiblemente a 60ºC, lo más preferido a 65ºC.
4. Polipéptido aislado de acuerdo a la
reivindicación 1 o la reivindicación 2 que tiene actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa el cual despliega reactividad cruzada inmunológica con un
anticuerpo generado contra un fragmento de la secuencia de
aminoácidos de acuerdo a la SEQ ID: NO. 2 o SEQ ID: NO. 9.
5. Polipéptido aislado o un fragmento del mismo
de acuerdo a la reivindicación 1 o la reivindicación 2 de al menos
100 aminoácidos, preferiblemente 125-350
aminoácidos, más preferiblemente 200-300
aminoácidos, con actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa.
6. Proteína de fusión aislada hecha mediante
expresión de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un
polipéptido de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones
1-5 enlazada de manera operativa con una o más
secuencias de ácidos nucleicos, las cuales codifican a (un)
polipéptido(s) marcador(es).
7. Secuencia de ácidos nucleicos que codifica un
polipéptido de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones
1-5 o una proteína de fusión de acuerdo a la
reivindicación 6.
8. Vector que comprende una secuencia de ácidos
nucleicos de acuerdo a la reivindicación 7.
9. Célula hospedera que comprende y expresa una
secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo a la reivindicación 7 o un
vector de acuerdo a la reivindicación 8.
10. Método para aislar un microorganismo que
despliega actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa, que comprende los pasos de:
- a)
- Cultivar, en uno o más pasos de transferencia, una muestra que contiene microorganismos en o sobre un medio de cultivo apropiado que contiene D-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama o una mezcla de D- y L-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama como una o como la única fuente de nitrógeno,
- b)
- Analizar el (los) microorganismo(s) así obtenido(s) para la actividad amida del \alpha-H-\alpha aminoácido racemasa.
11. Agrobacterium rhizogenes Na
depositado bajo el número NCIMB 41127, Agrobacterium
rhizogenes Bi depositado bajo el número NCIMB 41128,
Arthrobacter nicotianae depositado bajo el número NCIMB
41126, Ochrobactrum anthropi IA depositado bajo el número
NCIMB 41129.
12. Método para aislar una secuencia de ácidos
nucleicos que codifica un polipéptido con actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa, que comprende los pasos de:
- a)
- Cultivar en uno o más pasos de transferencia, una muestra que contiene microorganismos en o sobre un medio de cultivo apropiado que contiene D-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama o una mezcla de D- y L-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama como una o como la única fuente de nitrógeno,
- b)
- Analizar el (los) microorganismo(s) así obtenido(s) para la actividad amida del \alpha-H-\alpha aminoácido racemasa.
- c)
- Aislar la secuencia de ácidos nucleicos a partir del (los) microorganismo(s) obtenido(s) de una manera per se conocida.
13. Método para la producción de un polipéptido
con actividad amida del
\alpha-H-\alpha aminoácido
racemasa, que comprende los pasos de:
- a)
- Cultivar en uno o más pasos de transferencia, una muestra que contiene microorganismos en o sobre un medio de cultivo apropiado que contiene D-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama o una mezcla de D- y L-\alpha-amino-\epsilon-caprolactama como una o como la única fuente de nitrógeno,
- b)
- Analizar el (los) microorganismo(s) así obtenido(s) para la actividad amida del \alpha-H-\alpha aminoácido racemasa.
- c)
- Aislar la secuencia de ácidos nucleicos a partir del (los) microorganismo(s) obtenido(s) de una manera per se conocida.
- d)
- Expresar la secuencia de ácidos nucleicos en un hospedero apropiado para producir un polipéptido con actividad amida del \alpha-H-\alpha aminoácido racemasa.
14. Proceso para la racemización de una amida
del \alpha-H-\alpha aminoácido
enantioméricamente enriquecido, donde la racemización es realizada
en presencia de un polipéptido de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, en presencia de una célula
hospedera de acuerdo a la reivindicación 9 o en presencia de un
microorganismo de acuerdo a la reivindicación 11.
15. Proceso para la preparación de un
\alpha-H-\alpha aminoácido
enantioméricamente enriquecido a partir de una mezcla de las amidas
de los D- y
L-\alpha-H-\alpha
aminoácidos correspondientes o para la preparación de un
L-\alpha-H-\alpha
aminoácido a partir de la amida del
D-\alpha-H-\alpha
aminoácido correspondiente o para la preparación de un
D-\alpha-H-\alpha
aminoácido a partir de la amida del
L-\alpha-H-\alpha
aminoácido correspondiente, donde el proceso es realizado en
presencia de una amidasa enantioselectiva y en presencia de un
polipéptido de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones
1-6 o en presencia de una célula hospedera de
acuerdo a la reivindicación 9 o en presencia de un microorganismo de
acuerdo a la reivindicación 11.
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