WO2005075650A1 - アミダーゼ活性を有するポリペプチド及びその遺伝子 - Google Patents

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amidase
dna
microorganism
amino acid
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Satohiro Yanagisawa
Makoto Ueda
Hirokazu Nanba
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Kaneka Corporation
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/06—Arthrobacter

Definitions

  • the present invention relates to a polypeptide having an amidase activity, its gene, a microorganism or a transformant capable of producing the polypeptide, and a method for producing an amidase using the microorganism or the transformant.
  • Amidase (enzyme number [EC3. 5.1.4]) is an enzyme that hydrolyzes carboxylic acid amide into carboxylic acid and ammonia, and for example, stereoselectively hydrolyzes racemic ⁇ -amino acid amide. It is known that it has industrially useful activity such as producing optically active ⁇ -amino acids.
  • the optically active ct-amino acid is a compound useful as a synthetic intermediate or a sweetener for pharmaceuticals.
  • amidase catalyzes a hydrolysis reaction using an ester as a substrate (Non-Patent Document 1).
  • D_a-amino acids such as racemic amino acid amidoca and the like using a transformant having a D_ amino acid amidase gene derived from a microorganism which has been modified by genetic engineering techniques (Patent Reference 6).
  • Patent Document 3 it is generally known that bacteria of the genus Arthrobacter produce Artidase, and in some cases, the enzyme has been purified and isolated, and its properties have been clarified (Patent Document 3). And 4, Non-Patent Documents 2 and 3), the amino acid sequence of the enzyme and the base sequence of the gene encoding the enzyme have been reported.
  • Patent Document 1 JP-A-63-87998
  • Patent Document 2 Japanese Patent Publication No. 7-106149
  • Patent Document 3 US Patent No. 5130240
  • Patent Document 4 US Patent No. 5,252,470
  • Patent Document 5 JP-A-2-234678
  • Patent Document 6 JP 2002-253256
  • Non-Patent Document 1 Eur.J. Biochem., 2000, 267, 2028
  • Non-Patent Document 2 Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 1992, 56, 12, 1980
  • Non-patent Document 3 gricultural and Biological Chemistry, 1982, 46 vol. 5, No. 1, p. 1175 Disclosure of the invention
  • an object of the present invention is to provide a novel D-amidase which can be used for optical resolution of racemic amino acid amide and racemic amino acid ester.
  • Another object of the present invention is to clarify the amino acid sequence IJ of the D-amidase, the base sequence of the gene, and a microorganism or a transformant capable of producing the enzyme, and a method for producing the enzyme using them. Is to provide.
  • the present invention relates to the following polypeptide (a) or (b):
  • polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been substituted, inserted, deleted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and which has amidase activity.
  • the present invention is also a DNA encoding the above polypeptide.
  • the present invention also relates to any one of the following (c) and (e):
  • a DNA having an inserted, deleted and Z- or added base sequence and encoding a polypeptide having amidase activity is provided.
  • the present invention is a recombinant plasmid in which the above DNA has been inserted into a vector.
  • the present invention also relates to a transformant obtained by transforming a host microorganism with the above DNA or recombinant plasmid.
  • the present invention has the ability to produce the above-mentioned polypeptide
  • the present invention is characterized in that a microorganism having the ability to produce the above-mentioned polypeptide or the above-mentioned transformant is cultured, the polypeptide is accumulated in a culture, and collected. This is a method for producing an amidase.
  • the present invention has the above configuration, and can efficiently produce a novel amidase.
  • a D-amino acid can be efficiently produced from an amino acid amide or an amino acid ester by using the amidase or a microorganism that produces the amidase.
  • FIG. 1 is a diagram of a recombinant plasmid pHAOOl containing the amidase gene of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram of a recombinant plasmid pHA002 containing the amidase gene of the present invention.
  • the polypeptide of the present invention is a polypeptide having amidase activity, and is capable of stereoselectively hydrolyzing D-amino acid amides and D-amino acid esters.
  • the amidase activity of the polypeptide is 30 in a trishydroxymethylaminomethane (Tris) _hydrochloric acid buffer (pH 8.5) containing 50 mM D-phenylalaninamide.
  • Tris trishydroxymethylaminomethane
  • the reaction can be performed with C, and the resulting phenylalanine can be detected and measured by quantifying it using high performance liquid chromatography (HPLC).
  • the polypeptide of the present invention can be obtained from a microorganism having amidase activity.
  • the microorganism is not particularly limited as long as it is a microorganism producing the same polypeptide, but includes, for example, microorganisms belonging to Arthrobacter, and among them, Arthrobacter sp. Is more preferable.
  • Arthrobacter sp. KNKl 101J strain newly isolated from soil by the present inventors.
  • the above-mentioned Arthrobacter sp. KNK1101J strain has been deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (Tsukuba-Higashi 1-1, Ibaraki, Japan, 1 Chuo No. 6) (Accession No. FERM BP-10192, original deposit date: Japanese deposit on October 22, 2003 transferred to international deposit under the Budapest Treaty).
  • Coagulation none, liquefaction: none.
  • the microorganism producing the polypeptide of the present invention may be a wild-type strain of the above-described microorganism, or may be a mutant strain in which mutation has been improved. Mutants are obtained by methods known to those skilled in the art such as UV irradiation and treatment with drugs such as N-methylen-N, mono-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG), and ethyl methanesulfonate (EMS). be able to.
  • the medium for culturing the microorganism that produces the polypeptide of the present invention is not particularly limited as long as the microorganism can grow.
  • a carbon source sugars such as gnorecose and sucrose, alcohols such as ethanol and glycerol, fatty acids such as oleic acid and stearic acid and esters thereof, oils such as rapeseed oil and soybean oil, and nitrogen sources
  • Inorganic salts such as ammonium sulfate, sodium nitrate, peptone, casamino acid, corn steep liquor, bran, yeast extract, etc., as inorganic salts such as magnesium sulfate, sodium salt, sodium carbonate, dipotassium hydrogen phosphate, dihydrogen phosphate
  • a common liquid medium containing malt extract, meat extract and the like as other nutrients such as potassium can be used.
  • a small amount of a substance that enhances the production of amidase for example, an amide such as amino acid amide or fatty acid amide, or an ester such as amino acid ester or fatty acid ester can also be added.
  • concentration of these amidase production enhancing substances in the medium is selected from the range of 0.001% to 10% by weight, preferably 0.01% to 1% by weight.
  • Culture is usually performed at a temperature of 10 ° C or higher and 60 ° C or lower, preferably 20 ° C or higher and 50 ° C or lower, and a pH of 3 or higher and 11 or lower, preferably a pH of 5 or higher and 9 or lower. It can be performed aerobically in the range.
  • the cultivation time can be about 1 day or more and about 5 days or less. Further, any of a batch culture method and a continuous culture method may be used.
  • the cells are collected from the culture solution by centrifugation or the like, and then sonicated. To crush the cells to obtain a crude enzyme solution.
  • the polypeptide of the present invention can be obtained by purifying the crude enzyme solution by a salting-out method, a column chromatography method, or the like.
  • the polypeptide of the present invention may be a natural enzyme obtained from a microorganism as described above, or may be a recombinant enzyme produced using a gene recombination technique.
  • the natural enzyme include a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • polypeptide of the present invention comprises an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in which one or several amino acids are substituted, inserted, deleted, Z or added, and And a polypeptide having an amidase activity.
  • System IJ in which one or several amino acids have been deleted, added, added, or substituted with Z or substituted can be obtained by substituting amino acids by a method well-known to those skilled in the art such as a partial-directed mutagenesis method. It can be obtained by deletion, follow-up, insertion and / or substitution. Specifically, it is described in literatures such as Nucleic Acid Res. 10, 6487 (1982) and Methods in Enzymology 100, 448 (1983).
  • polypeptide having an amidase activity refers to 10% or more, preferably 40% or more, when the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is used under the above-mentioned activity measurement conditions. More preferably, the polypeptide exhibits an activity of 60% or more, more preferably 80% or more.
  • the DNA of the present invention is not limited as long as it encodes the above-mentioned polypeptide.
  • a DNA comprising the base sequence IJ represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing can be mentioned.
  • a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing may be used, and is represented by SEQ ID NO: 3.
  • a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing and a DNA hybridizing under stringent conditions refers to colony 1 'hybridisation.
  • a DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing was identified. DNA that can form a hybrid.
  • the stringent conditions are, for example, 75 mM trisodium citrate, 750 mM sodium chloride, 0.5. /.
  • an aqueous solution consisting of sodium dodecyl sulfate, 0.1% serum albumin, 0.1% polybininolepyrrolidone, and 0.1% Ficoll 400 (manufactured by Amersham Biosciences) at 65 ° C
  • washing is performed at 65 ° C.
  • the washing is performed at 65 ° C. using an aqueous solution having a composition of 1.5 mM trisodium citrate, 15 mM sodium chloride, and 0.1% sodium dodecyl sulfate.
  • base sequence in which one or several bases have been deleted, added, inserted and / or substituted refers to the gene amplification PCR method for protein and nucleic acid enzymes 35 (17), 2951-3178 (1990). Or Henry A. Erlich, edited by Ikuyuki Kato, translated by PCR technology (1990), etc., and deleted by a method known to those skilled in the art. , Addition, insertion and / or substitution.
  • the DNA (amidase gene) of the present invention can be obtained from a microorganism having an amidase activity as described above.
  • the desired DNA for example, the following method can be used.
  • the amino acid sequence at the N-terminus of amidase purified from a microorganism having amidase activity is determined using a gas-phase protein sequencer or the like. Further, after a purified amidase is allowed to act on a protease such as lysyl endopeptidase to digest the polypeptide into an appropriately sized polypeptide, the obtained polypeptide is purified using HPLC or the like, and the same method as described above is used. To determine the internal amino acid sequence. A DNA primer designed based on the N-terminal amino acid sequence and the internal amino acid sequence thus obtained is synthesized. Next, chromosomal DNA is isolated from the microorganism that is the source of the amidase.
  • the DNA of the chromosome can be obtained by dissolving the cultured cells with a detergent, cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), black-mouthed form, phenol, etc., treating and extracting the extracted DNA with isopropanol and centrifuging.
  • CTAB cetyltrimethylammonium bromide
  • a part of the target gene can be obtained by performing PCR on the chromosomal DNA using the above-mentioned DNA primers.
  • DNA fragments encoding the N-terminal and C-terminal of the already obtained partial gene can be obtained by inverse PCR (for example, Nucleic Acids
  • a DNA primer is prepared based on the nucleotide sequences of the portion presumed to be upstream from the N-terminus of the enzyme and the portion presumed to be downstream from the C-terminus.
  • a DNA fragment containing the full length of the target amidase gene can be obtained by performing PCR using the DNA primers and the chromosomal DNA obtained above as type III.
  • a recombinant plasmid can be obtained by ligating the obtained DNA fragment containing the amidase gene with vector DNA using T4 DNA ligase or the like.
  • T4 DNA ligase T4 DNA ligase or the like.
  • the base sequence of the DNA fragment containing the amidase gene inserted into the vector was analyzed, and the presence of bases encoding the N-terminal amino acid sequence and internal amino acid sequence of the amidase enzyme was confirmed.
  • the open reading frame is determined by confirming the translation start site and stop codon.
  • a host microorganism By using the DNA thus obtained or a recombinant plasmid obtained by incorporating the DNA into a vector, a host microorganism can be transformed to obtain a transformant.
  • the host-vector system described in "Recombinant DNA Experiment Guideline” (edited by the Science and Technology Agency, Research and Development Bureau, Life Science Division: revised on March 22, 1996) can be used.
  • Escherichia genus Pseudomonas (Pseudomonas)
  • Flavobacterium Flavobacterium
  • Notinoles Bacillus
  • Serratia Corynebacterium
  • Brevibacterium Brevibacterium
  • Agrobacterium Agrobacterium
  • Acetobacter Gunore: ⁇ -Gluconobacter, Lactobacillus, S Economics.
  • a microorganism belonging to the genus Streptomyces can be used for Streptococcus j.
  • a plasmid, phage or derivative thereof derived from a microorganism capable of autonomous replication in the above-mentioned host can be used.
  • Escherichia coli as a host microorganism
  • Escherichia coli a vector capable of autonomously replicating in the microorganism as a vector.
  • vectors include, for example, pUC18, pUC19, pBR322, pACYC184, pSC101, pT7Blue, or pUCNT.
  • a vector modified to have a strong structural promoter to increase the production of the enzyme can also be used.
  • Escherichia coli HB101 was transformed using a recombinant plasmid pHA002 in which the DNA obtained as described above was incorporated into pUCNT (see WO94 / 03613), Transformant Escherichia coli HB101 (pHA002) can be obtained.
  • the recombinant DNA technology used in the present invention is well known in the art, and includes, for example, Molecular Cionmg 2nd Edition (old Spring Harbor Laooratory Press, 1989), urrent Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and
  • the enzyme By culturing a microorganism capable of producing the amidase of the present invention (Arthrobacter sp. KNK1101J or a mutant thereof, the above transformant, etc.), the enzyme can be produced in large quantities, D—Can be used to produce amino acids.
  • the culture of the microorganism may be performed using a normal medium.
  • a medium to be used for culture Ordinary medium containing nutrients such as carbon source, nitrogen source and inorganic salts may be used. Addition of organic micronutrients such as vitamins and amino acids to this often results in favorable results.
  • the carbon source carbohydrates such as gnorecose sucrose, organic acids such as acetic acid, alcohols and the like are appropriately used.
  • the nitrogen source ammonium salt, ammonia water, ammonia gas, urea, yeast extract, peptone, corn 'tip' liquor and the like are used.
  • the inorganic salts phosphates, magnesium salts, potassium salts, sodium salts, calcium salts, iron salts, sulfates, chlorine and the like are used.
  • the cultivation is particularly preferably performed at a temperature of 25 ° C to 37 ° C in a temperature range of 25 ° C to 40 ° C.
  • pH can be cultured at 4 to 8, but 5 to 7.5 is preferable.
  • any of a batch type and a continuous type may be used.
  • IPTG isopropyl-1-l-thio- ⁇ -D-galatatoside
  • ratatose added syrup
  • the culture obtained as described above may be used as it is.
  • the amidase can be isolated and purified from the culture and used.
  • Arthrobacter sp. KNK1101J strain (Accession number FERM BP-10192) was sterilized in a test tube with 6 ml of medium A (meat extract 10 g, yeast extract 5 g, polypeptone 10 g, sodium salt sodium chloride 3 g, The volume was increased to 11 with ionized water, inoculated to pH 6.5) before sterilization, and cultured at 30 ° C for 24 hours under aerobic shaking. 2 ml of this culture was inoculated into 200 ml of sterilized medium A in a flask and cultured at 30 ° C for 48 hours under aerobic shaking.
  • medium A meat extract 10 g, yeast extract 5 g, polypeptone 10 g, sodium salt sodium chloride 3 g
  • the volume was increased to 11 with ionized water, inoculated to pH 6.5) before sterilization, and cultured at 30 ° C for 24 hours under aerobic shaking. 2 ml of this culture was inoculated into 200 ml of steriliz
  • the cells are collected by centrifugation, and the cells are suspended in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing ImM dithiothreitol (DTT). The body was crushed and centrifuged. Add ammonium sulfate to the supernatant to a 45% saturation concentration, The precipitated precipitate was obtained by centrifugation. This fraction was dissolved in 50 mM Tris-hydrochloric acid buffer ( ⁇ 80) containing ImM DTT, dialyzed with the same buffer, applied to DEAE-TOYOPEAL (manufactured by Tosoichi), and subjected to column chromatography.
  • Tris-HCl buffer pH 8.0
  • DTT ImM dithiothreitol
  • the obtained active fraction was applied to MonoQ HR5 / 5 (manufactured by Amersham Fanolemasia Biotech), subjected to column chromatography, and subjected to 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing ImM's DTT. After elution, elution was carried out using the same buffer with a concentration gradient of 0 M to 0.5 M sodium chloride. The obtained active fraction was concentrated using an ultrafiltration membrane (fraction molecular weight 10,000), and then Superdex 200 HR
  • the mixture was applied to 10/30 (Amersham Pharmacia Biotech) and subjected to gel filtration by FPLC.
  • the obtained active fraction was analyzed by SDS-polyacrylamide electrophoresis, amidase was detected as a single band, and the pure enzyme of the purified enzyme was confirmed.
  • Example 2 0.1 ml of the purified amidase active fraction obtained in Example 1 was mixed with 0.1 ml of 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 8.5) containing 0.5% of the compound shown in Table 2, and mixed with 30 ° Shake at C for 15 hours. After completion of the reaction, solids were removed by centrifugation, and the results of analysis of the yield and optical purity of the generated amino acids by high performance liquid chromatography are shown in Table 2.
  • Example 1 0.1 ml of the purified amidase active fraction obtained in Example 1 was mixed with 0.2% M 2_ (N-morpholino) ethanesulfonic acid-Na containing a 0.5% concentration of racemic phenylalanine ethyl ester. ⁇ H buffer solution (pH 6.5) was mixed with 0.1 ml and shaken at 30 ° C for 15 hours. After completion of the reaction, solids were removed by centrifugation, and amino acids produced by the same method as in Example 2 were analyzed.D-isomer phenylalanine yield was 29.7 mol% and optical purity was 72.8% ee Was obtained.
  • M 2_ N-morpholino
  • a polypeptide fragment produced by allowing lysyl endopeptidase to act on the amidase purified in Example 1 in the presence of 4 M urea was purified using reverse-phase HPLC, and then the internal amino acid of the amidase was purified in the same manner as described above. The arrangement was determined.
  • a DNA primer designed based on the N-terminal amino acid sequence (Primer ⁇ 1: SEQ ID NO: 4 in the sequence listing)
  • a DNA primer designed based on the internal amino acid sequence (Primer-2: SEQ ID NO: 5 in the sequence listing)
  • the chromosomal DNA obtained above was subjected to PCR using type III. As a result, part of the target amidase gene (called partial gene) was obtained. It was.
  • a DNA primer (Primer ⁇ 3: SEQ ID No. 6 in the sequence listing) directed outward from the partial gene based on the nucleotide sequence corresponding to each of the N-terminal side and the C-terminal side of the enzyme.
  • Primer ⁇ 4 SEQ ID NO: 7 in the sequence listing were synthesized.
  • the chromosomal DNA obtained above was digested with restriction enzymes SacII, Pvul, Sail, and Xhol, and the resulting fragment was cyclized using T4 DNA ligase. went.
  • a DNA fragment containing a gene portion outside the already obtained partial gene was obtained.
  • a DNA primer (Primer ⁇ 5: base) having a sequence in which the restriction enzyme BamHI cleavage site was linked to the base sequence of the portion presumed to be upstream from the N-terminal of the enzyme.
  • a DNA primer (Primer-1: SEQ ID NO: 9 in the Sequence Listing) having a sequence in which the restriction enzyme Sacl cleavage site is linked to the base sequence of the portion presumed to be downstream from the C-terminus. did.
  • DNA between the sequences was amplified by PCR to obtain a DNA fragment containing the full length of the amidase gene (SEQ ID NO: 2 in the sequence listing).
  • the base sequence of a part of the obtained DNA fragment was analyzed, and it was confirmed that the full length of the amidase gene (SEQ ID NO: 3 in the sequence listing) was included.
  • the DNA fragment containing the full length of the amidase gene obtained in Example 4 was ligated to the vector plasmid pT7Blue cut with the restriction enzyme EcoRV using T4 DNA ligase, whereby the restriction enzyme map shown in FIG.
  • the resulting plasmid pHAOOl was obtained.
  • the base sequence of the DNA fragment obtained in Example 4 was analyzed. As a result, it was confirmed that there were bases encoding the N-terminal amino acid sequence and the internal amino acid sequence determined using the purified amidase. In addition, the translation initiation site and stop codon were confirmed, and the open reading frame was determined.
  • the nucleotide sequence of the DNA fragment containing the full length of the amidase gene thus obtained is deduced from the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and the nucleotide sequence of the open reading frame is represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence is shown as SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • Example 6 Preparation of Recombinant Plasmid Overexpressing Amidase Gene Mass Sequence of Restriction Enzymes Ndel and Sacl Cut to N- and C-Terminal Parts of Amidase Gene Obtained in Example 5
  • the primers (Primer-7: SEQ ID NO: 10 in the Sequence Listing, Primer-8: SEQ ID NO: 11 in the Sequence Listing) are used to amplify the DNA between them by PCR and are represented by SEQ ID NO: 3 An open reading frame DNA fragment was obtained.
  • Transformation was performed by mixing the plasmid pHA002 obtained in Example 6 with Escherichia coli HB101 competent cells, and agar medium B (10 g of tryptone, 5 g of yeast extract, 5 g of salt extract, Namu]; Kumu 10 g, agar 15 g, Rinpicidin 100 mg, water in water, and volume up to 11; before sterilization, ⁇ 7.0, except that ampicillin is added after sterilization.
  • a transformant Escherichia coli HB101 (pHAOO2) containing the recombinant DNA containing the gene was obtained as a colony.
  • Example 7 0.1 ml of the culture solution of Escherichia coli HB101 (pHA002) obtained in Example 7 was mixed with 0.2% 2- (N-) containing a 1% concentration of racemic phenylalanine ethyl ester. The mixture was mixed with 0.1 ml of morpholino) ethanesulfonic acid-NaOH buffer (pH 6.5) and shaken at 30 ° C. for 15 hours. After the completion of the reaction, solids were removed by centrifugation, and the amino acids produced were analyzed in the same manner as in Example 2. The yield of D-form phenylalanine was 34.7 mol% and the optical purity was 53.6% ee. Was obtained.

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Abstract

　本発明は、光学活性アミノ酸、特にＤ−アミノ酸の製造に有用な新規なアミダーゼ、ならびにその製造方法を提供することを目的とする。 　本発明は、アースロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）ＫＮＫ１１０１Ｊ株から単離・精製された新規Ｄ−アミダーゼ。、当該アミダーゼをコードする遺伝子、当該遺伝子を含む組換えプラスミド、及び当該アミダーゼ遺伝子を導入された形質転換体である。また本発明は、アースロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）ＫＮＫ１１０１Ｊ株あるいは上記形質転換体を培養し当該アミダーゼを採取する、アミダーゼの製造方法でもある。                                                                                     

Description

明 細 書
アミダーゼ活性を有するポリペプチド及びその遺伝子
技術分野
[0001] 本発明は、アミダーゼ活性を有するポリペプチド、その遺伝子、当該ポリペプチドを 生産する能力を有する微生物あるいは形質転換体、及び当該微生物又は形質転換 体を用いたアミダーゼの製造方法に関する。
背景技術
[0002] アミダーゼ（酵素番号 [EC3. 5. 1. 4] )はカルボン酸アミドをカルボン酸とアンモニ ァに加水分解する酵素であり、例えばラセミ体 α—アミノ酸アミドを立体選択的に加水 分解して光学活性 α—アミノ酸を生成するなど産業上有用な活性を持つことが知られ ている。なお、光学活性 ct -アミノ酸は医薬品の合成中間体や甘味料として有用な化 合物である。また、アミダーゼがエステルを基質とした加水分解反応を触媒することも 報告されてレ、る (非特許文献 1 )。
[0003] 光学活性 α—アミノ酸の製造方法は数多く知られているが、特に D_ a _アミノ酸は 発酵法による大量生産が困難であることから、安価で効率の良い合成法の開発が望 まれている。例えば、生物学的手法による D—ひ—アミノ酸の合成方法として、アミダー ゼ活性を有する微生物もしくは酵素を用いてラセミ体ひ—アミノ酸アミドから光学分割 により製造する以下のような方法が知られている。
(1)ロドコッカス（Rhodococcus)属に属する微生物が有する D—ひ—アミノ酸アミドを特 異的に加水分解する活性を用いて、ラセミ体ひ—アミノ酸アミドから D_ α—アミノ酸を 製造する方法 (特許文献 1)。
(2)ァクロモバクター (Achromobacter)属、コリネバタテリゥム (Corynebacterium)属、 フラボバタテリゥム（Flavobacterium)属、ノ チノレス（Bacillus)属、ミクロコッカス（
Micrococcus)属、セルロモナス (Cellulomonas)属、シユードモナス (Pseudomonas)属 、プロタミノバクタ一 (Protaminobacter)属、マイコバクテリゥム (Mycobacterium)属、ァ ースロバクタ一 (Arthrobacter)属、又はストレプトマイセス (Streptomyces)属に属する 微生物が生産するアミノぺプチダーゼを用いて、ラセミ体 α—アミノ酸アミドカら D_ a -アミノ酸を製造する方法 (特許文献 2)。
(3)アースロバクタ一（Arthrobacter)属に属する微生物が生産するアミダーゼを用い て、ラセミ体ァラニンアミドから D—ァラニンを製造する方法（特許文献 3及び 4)。
(4)ァクロモパクター（Achromobacter)属に属する微生物が有する D_ a—アミノ酸ァ ミドを特異的に加水分解する活性を用いて、ラセミ体ひ—アミノ酸アミドカ、ら D_ a—ァ ミノ酸を製造する方法 (特許文献 5)。
(5)遺伝子工学的手法を用いて改変をカ卩えた、微生物由来の D_アミノ酸アミダーゼ 遺伝子を有する形質転換体を用いて、ラセミ体ひ—アミノ酸アミドカら D_ a—アミノ酸 を製造する方法 (特許文献 6)。
[0004] し力、しながら、上記（1 )から (4)の方法は用いられている微生物が有する加水分解 活性が低いため、工業的利用に際して十分とは言えない。
[0005] また、 （5)の方法ではオタロバクトラム（Ochrobactrum)属の細菌由来の D—アミノ酸 アミダーゼについてのみ記載されており、アースロバクタ一（Arthrobacter)属細菌に っレヽては全く言及されてレヽなレ、。
[0006] 一方、アースロバクタ一（Arthrobacter)属の細菌がアミダーゼを生産することは一 般に知られており、酵素を精製、単離し、その性質を明らかにした例もあるが（特許文 献 3及び 4、非特許文献 2及び 3)、該酵素のアミノ酸配列、及び該酵素をコードする 遺伝子の塩基配列にっレ、ての報告はなされてレ、なレ、。
特許文献 1 :特開昭 63-87998
特許文献 2：特公平 7 - 106149
特許文献 3：米国特許第 5130240号
特許文献 4：米国特許第 5252470号
特許文献 5：特開平 2—234678
特許文献 6 :特開 2002—253256
非特許文献 1 : Eur. J. Biochem.、 2000年、 267卷、 2028頁
非特許文献 2 : Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 1992年、 56卷、 12号、 1980頁
非特許文献 3 gricultural and Biological Chemistry, 1982年、 46卷、 5号、 1175頁 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 上記に鑑み、本発明の目的はラセミ体アミノ酸アミド及びラセミ体アミノ酸エステル の光学分割に利用可能な新規 D-アミダーゼを提供することにある。また、本発明の 目的は、当該 D—アミダーゼのアミノ酸配歹 IJ、その遺伝子の塩基配列を明らかにし、 当該酵素を生産する能力を有する微生物あるいは形質転換体及びそれらを用いた 当該酵素の製造方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者等は上記に鑑み鋭意検討を行った結果、 D_アミノ酸アミド及び D_アミノ 酸エステルを立体選択的に加水分解する新規 D—アミダーゼを生産するアースロバク ター (Arthrobacter)属細菌を新たに土壌より分離した。そして、本細菌から当該アミ ダーゼを単離、精製し、アミダーゼ遺伝子の単離、及び宿主微生物での発現を達成 し、発明を完成させるに至った。
[0009] すなわち本発明は、以下の（a)又は（b)のポリペプチドである：
(a)配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が 置換、挿入、欠失および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミダーゼ活 性を有するポリペプチド。
[0010] 本発明はまた、上記のポリペプチドをコードする DNAである。
[0011] 本発明はまた、以下の（c)一（e)のいずれかの DNAである：
(c)配列表の配列番号 3に示す塩基配列からなる DNA、
(d)配列表の配列番号 3に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとストリ ンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつアミダーゼ活性を有するポリペプチドをコ ードする DNA、
(e)配列表の配列番号 3に示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が置換
、揷入、欠失および Zまたは付加された塩基配列を有し、アミダーゼ活性を有するポ リペプチドをコードする DNA。
[0012] また、本発明は、上記の DNAがベクターに揷入された組換えプラスミドである。 [0013] また、本発明は上記の DNAまたは組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して 得られる形質転換体である。
[0014] また、本発明は、上記ポリペプチドを生産する能力を有し、アースロバクタ一（
Arthrobacter)属に属する微生物である。
[0015] また、本発明は、上記のポリペプチドを生産する能力を有する微生物、又は上記形 質転換体を培養し、培養物中に当該ポリペプチドを蓄積せしめ、これを採取すること を特徴とするアミダーゼの製造方法である。
発明の効果
[0016] 本発明は上述の構成からなり、新規なアミダーゼを効率よく製造することができる。
また、当該アミダーゼ、又は、当該アミダーゼを生産する微生物を利用して、アミノ酸 アミド又はアミノ酸エステルから効率よく D—アミノ酸を製造することができる。
図面の簡単な説明
[0017] [図 1]本発明のアミダーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド pHAOOlの図。
[図 2]本発明のアミダーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド pHA002の図。
発明を実施するための最良の形態
[0018] 以下、本発明を詳細に説明する。
まず、本発明のポリペプチドについて説明する。本発明のポリペプチドはアミダーゼ 活性を有するポリペプチドであって、 D—アミノ酸アミド及び D—アミノ酸エステルを立 体選択的に加水分解することが可能である。
[0019] 本発明において、ポリペプチドのアミダーゼ活性は、 D-フエ二ルァラニンアミド 50 mMを含むトリスヒドロキシメチルァミノメタン (Tris) _塩酸緩衝液（pH8. 5)中、 30。C で反応を行い、生成するフエ二ルァラニンを高速液体クロマトグラフィー（HPLC)等 を用いて定量することにより検出 ·測定し得る。
[0020] 本発明のポリペプチドは、アミダーゼ活性を有する微生物から取得できる。同ポリぺ プチドを生産する微生物であれば特に限定されなレ、が、例えばアースロバクタ一 ( Arthrobacter)に属する微生物が挙げられ、なかでもアースロバクタ一'エスピー（ Arthrobacter sp.)が好ましぐより好ましくは、本発明者らが土壌より新たに分離した アースロバクタ^ ~ .エスピー（Arthrobacter sp.) KNKl 101J株である。 [0021] 上記のアースロバクタ一'エスピー（Arthrobacter sp.) KNK1101J株は、独立行政 法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば巿東 1丁 目 1番地 1中央第 6)に寄託されている（受託番号 FERM BP - 10192、原寄託日平 成 15年 10月 22日の国内寄託をブダペスト条約に基づく国際寄託に移管）。
[0022] 以下に、アースロバクタ^ ~ ·エスピー（Arthrobacter sp.) KNK1101J株の菌学的性 質を示す。
1.形態
1)直径 0. 7—0. 8 x m、長さ 1. 0 1. 5 μ m程度の桿菌
2)グラム染色：陽性
3)運動性:なし
4)胞子形成:なし
5)細胞の多形性:なし
6)肉汁寒天平板培地上でのコロニー形態：円形、全縁滑らか、低凸状、光沢あり、淡 色
2.培養的性質
1)ニュートリエントァガー（ォキソイド製)培地
色：なし、光沢：なし、色素生産：なし
2)ニュートリエントブロス (ォキソイド製)培地
表面発育：なし、培地の混濁：あり
3)ゼラチン穿刺培養
生育：なし、ゼラチン変化：なし
4)リトマスミノレク
凝固：なし、液化：なし。
3.生理学的試験
1)硝酸塩の還元:一
2)脱窒反応: -
3) MRテスト：—
4) VPテスト：— )インドール産生：一
)硫化水素の産生:一
)デンプンの加水分解： +
)クェン酸の利用 Koser： +、 Christensen： +)無機窒素の利用 硝酸塩： +、アンモニゥム塩： +0)ゥレアーゼ活性:—
1)ォキシダーゼ活性:一
2)カタラーゼ活性： +
3) /3_ガラクトシダーゼ活性： +
4)アルギニンジヒドロラーゼ活性：一
5)リジンデカルボキシラーゼ活性：―
6)トリブトファンデァミナーゼ活性：―
7)ゼラチナーゼ活性:一
8)ピラジナミダーゼ活性： +
9)ピロリドニルァリルアミダーゼ活性： +
0)ァノレカリフォスフオターゼ活 '性： +
1) β一ダルクロニダーゼ活性：一
2) Ν—ァセチルー β—ダルコサミニダーゼ活性：一3) α—ダルコシダーゼ活性： +
4)エスクリン（ β—ダルコシダーゼ）活性： +
5)ゼラチン加水分解活性: -6)生育の範囲
ρΗ5:+、ρΗ9:+、 ρΗ10: +
20。C:+、 25°C:+、40。C:+W、 45。C:—7)生育条件 好気性： +、嫌気性:-8) 0—Fテスト（酸化/発酵）：_/_
9)糖類からの酸及びガス産生（酸/ガス）
L—ァラビノース：一 /一 D—グルコース： +/—
D—フラクトース： +/—
マノレトース：一 Z—
ラタトース:一 /—
D—ソルビトール：一/—
イノシトール:—/一
D—キシロース： +/—
D—マンノース： +/_
D—ガラクトース： +Z—
サークロース： +/—
トレハロース：
D—マンニトール： +Z—
グリセリン： +/—
0)発酵性試験
ブドウ糖:一
リボース：一
キシロース：一
マンニトール：一
マノレトース：一
乳糖:一
白糖:一
グリコーゲン：— 0)主要メナキノン成分： MK_9 (H )
21)菌体脂肪酸組成：
1] 脂肪酸 組成比 （％)
C 1 5 0 AN T E I S O 60. 58
C 1 5 0 I S O 11. 44
C 1 6 0 I s o 10. 63
C 1 7 0 AN T E I S O 7. 06
C 1 6 0 4. 14
C 1 4 0 I S O 3. 13
C 1 4 0 1. 88
C 1 7 0 1. 14
[0024] なお、本発明のポリペプチドを生産する微生物は、上述した微生物の野生株であつ ても良いし、変異改良された変異株であってもよい。変異株は、 UV照射や、 N—メチ ノレ _N，一ニトロ一 N—ニトロソグァ二ジン（NTG)、ェチルメタンスルフォネート（EMS) 等の薬剤による処理といった当業者に周知の方法で取得することができる。
[0025] 本発明のポリペプチドを生産する微生物を培養する培地としては、その微生物が増 殖し得るものである限り特に限定されない。例えば、炭素源として、グノレコース、シュ 一クロース等の糖質、エタノール、グリセロール等のアルコール類、ォレイン酸、ステ アリン酸等の脂肪酸及びそのエステル類、菜種油、大豆油等の油類、窒素源として、 硫酸アンモニゥム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカ一、ふ すま、酵母エキスなど、無機塩類として、硫酸マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、炭酸カル シゥム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウムなど、他の栄養源として、麦芽ェ キス、肉エキス等を含有する通常の液体培地が使用され得る。
[0026] 更に、アミダーゼの生産を増強させるような物質、例えば、アミノ酸アミド、脂肪酸ァ ミド等のアミド類、あるいはアミノ酸エステル、脂肪酸エステル等のエステル類を少量 添加することもできる。これらアミダーゼ生産増強物質の培地中濃度は、 0. 001重量 %以上、 10重量％以下、好ましくは 0. 01重量％以上、 1重量％以下の範囲から選 ばれる。
[0027] 培養は通常、温度として 10°C以上、 60°C以下、好ましくは 20°C以上、 50°C以下の 範囲、 pHとしては 3以上、 11以下、好ましくは pH5以上、 9以下の範囲で好気的に 行い得る。培養時間は 1日以上、 5日間以下程度で行い得る。また、回分式、連続式 のいずれの培養方法でもよい。
[0028] 培養終了後に培養液から遠心分離などにより菌体を集め、超音波破砕などの手段 により菌体を破砕して粗酵素液を得る。この粗酵素液を、塩析法、カラムクロマトダラ フィ一法などにより精製することで、本発明のポリペプチドを得ることができる。
[0029] 本発明のポリペプチドは、上記のように微生物から取得される天然酵素であっても よいし、遺伝子組換え技術を利用して生産される組換え酵素であってもよい。天然酵 素としては、配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをあげ ること力 Sできる。
[0030] また、本発明のポリペプチドは、配列番号 1に示されるアミノ酸配列において 1若しく は数個のアミノ酸が置換、揷入、欠失および Zまたは付加されたアミノ酸配列からな り、かつ、アミダーゼ活性を有するポリペプチドであってもよい。
[0031] 「1若しくは数個のアミノ酸が欠失、追カロ、揷入及び Z又は置換されたアミノ酸配歹 IJ」 は、部分特異的突然変異誘発法など当業者に周知の方法により、アミノ酸を欠失、 追カロ、揷入及び/又は置換することにより取得可能である。具体的には、 Nucleic Acid Res. 10, 6487(1982)、 Methods in Enzymology 100， 448(1983)等の文献に記載 されている。
[0032] また、「アミダーゼ活性を有するポリペプチド」とは、上記の活性測定条件において 、配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いた場合の 10%以上 、好ましくは 40%以上、より好ましくは 60%以上、さらに好ましくは 80%以上の活性 を示すポリペプチドのことをレ、う。
[0033] 次に、本発明の DNAについて説明する。本発明の DNAは上記のようなポリぺプ チドをコードする DNAであればよぐ例えば、配列表の配列番号 3で示される塩基配 歹 IJからなる DNAを挙げることができる。
[0034] また、配列表の配列番号 3に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとス トリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAであっても良レ、し、配列番号 3で示 される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が置換、揷入、欠失および Zまたは 付加された塩基配列を有する DNAであっても良レ、。上記のアミダーゼ活性を有する ポリペプチドをコードする限り、本発明の DNAの範疇に含まれる。
[0035] ここで「配列表の配列番号 3に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAと ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNA」とは、コロニ一'ハイブリダィゼー シヨン法、プラーク 'ハイブリダィゼーシヨン法、あるいはサザンハイブリダィゼーシヨン 法等を実施した際に、配列表の配列番号 3に示す塩基配列と相補的な塩基配列か らなる DNAと、特異的にハイブリッドを形成し得る DNAを言う。
[0036] ここで、ストリンジヱントな条件とは、例えば、 75mMクェン酸三ナトリウム、 750mM 塩化ナトリウム、 0. 5。/。ドデシル硫酸ナトリウム、 0. 1%ゥシ血清アルブミン、 0. 1%ポ リビニノレピロリドン、および、 0. l%Ficoll 400 (アマシャムバイオサイエンス株式会 社製）の組成からなる水溶液中、 65°Cでハイブリダィズさせた後に、 15mMクェン酸 三ナトリウム、 150mM塩ィ匕ナトリウム、および 0. 1 %ドデシル硫酸ナトリウムの組成か らなる水溶液を用いて、 60°Cで洗浄が行われる条件を言う。好ましくは、上記条件で ハイブリダィズさせた後に、 15mMクェン酸三ナトリウム、 150mM塩化ナトリウム、お よび 0. 1%ドデシノレ硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、 65°Cで洗浄が 行われる条件であり、より好ましくは、 1. 5mMクェン酸三ナトリウム、 15mM塩化ナト リウム、および 0· 1 %ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、 65°Cで 洗浄が行われる条件である。
[0037] また、「1若しくは数個の塩基が欠失、追加、挿入及び/又は置換された塩基配列」 とは、蛋白核酸酵素増刊 遺伝子増幅 PCR法 35 (17) , 2951— 3178 (1990)又 は Henry A. Erlich編 加藤郁之進鑑訳 PCRテクノロジー（1990)等に記載の当 業者に周知の方法により欠失、追力 P、挿入及び/又は置換できる程度の数の塩基が 欠失、追加、挿入及び/又は置換されてなる塩基配列を意味する。
[0038] 本発明の DNA (アミダーゼ遺伝子）は、前述したようなアミダーゼ活性を有する微 生物から取得することができる。 目的の DNAを取得するには、例えば以下の方法に よることがでさる。
[0039] まず、アミダーゼ活性を有する微生物より精製されたアミダーゼの N末端のアミノ酸 配列を、気相プロテイン 'シークェンサ一などで決定する。また、精製されたアミダー ゼにリジルエンドぺプチダーゼ等のプロテアーゼを作用させて適当な大きさのポリぺ プチドに消化した後、 HPLC等を用いて得られたポリペプチドを精製し、上記と同様 の方法に従って内部アミノ酸配列を決定する。このようにして得られた N末端アミノ酸 配列及び内部アミノ酸配列にもとづいて設計した DNAプライマーを合成する。 [0040] 次に、アミダーゼの起源となる微生物より、染色体 DNAを単離する。染色体の DN Aは、培養された細胞を界面活性剤、臭化セチルトリメチルアンモニゥム（CTAB)、 クロ口ホルム、フエノール等で溶解、処理後、抽出された DNAをイソプロパノールで 析出し、遠心分離で得られた沈殿をエタノールで洗浄することで得られる（例えば し urrent Protocols m Molecular Biology (Greene Puolishing Associates and
Wiley - Interscience)を参照)。
[0041] この染色体 DNAを錡型に、上記の DNAプライマーを用いて PCRを行うことで、 目 的の遺伝子の一部を取得できる。
[0042] 次に、既に取得した部分遺伝子のさらに N末側と C末側をコードする DNA断片をィ ンバース PCR法により取得することができる（例えば、 Nucleic Acids
Res.16,8186(1988)を参照）。この DNA断片の塩基配列を決定後、酵素の N末端より も上流と推定される部分、及び、 C末端より下流と推定される部分のそれぞれの塩基 配列にもとづき DNAプライマーを作成する。この DNAプライマーを用いて、先に得 た染色体 DNAを铸型とした PCRを行うことで目的アミダーゼ遺伝子の全長を含む D NA断片を取得できる。
[0043] 次いで、得られたアミダーゼ遺伝子を含む DNA断片をベクター DNAと T4 DNA リガーゼなどを用いて結合させることにより組換えプラスミドを得ることができる。このプ ラスミドを用いて、ベクターに挿入したアミダーゼ遺伝子を含む DNA断片部分の塩 基配列を解析、アミダーゼ酵素の N末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列をコード する塩基があることを確認し、また、これより翻訳開始部位と終止コドンを確認すること でオープンリーディングフレームを決定する。
[0044] このようにして取得した DNA、または該 DNAをベクターに組み込んで得られる組 換えプラスミドを用いることにより、宿主微生物を形質転換し形質転換体を得ることが できる。
[0045] 宿主、ベクターとしては、「組換え DNA実験指針」（科学技術庁研究開発局ライフ サイエンス課編：平成 8年 3月 22日改定）に記載の宿主一ベクター系を用いることがで きる。例えば、宿主としては、ェシエリヒア（Escherichia)属、シユードモナス（
Pseudomonas)属、フラボノ クテリゥム (Flavobacterium)属、ノ チノレス (Bacillus)属、セ ラチア（Serratia)属、コリネバタテリゥム（Corynebacterium)属、ブレビバクテリウム（ Brevibacterium)属、ァグロノくクテリウム (Agrobacterium)属、ァセトノくクタ一 (
Acetobacter)属、グノレ: πノノくクタ一 (Gluconobacter)属、ラク卜ノくチノレス (Lactobacillus )属、ストレフ。トコッカス (Streptococcus) j¾ま 7こはストレフトマイセス (Streptomyces)属 に属する微生物を用いることができる。
[0046] ベクターは上記の宿主内で自律複製できる微生物由来のプラスミド、ファージまた はその誘導体が使用できる。なかでも、宿主微生物としてェシエリヒア'コリ（
Escherichia coli)、ベクターとして当該微生物中で自律複製できるベクターを用いる の力 S好ましレヽ。このようなベクターとしては、伊 ijえは、、 pUC18、 pUC19、 pBR322、 p ACYC184、 pSC101、 pT7Blue、又は pUCNTを挙げること力 Sできる。また、酵素 の生産量を上昇させるために強力な構造プロモーターをもつように改質したベクター を使用することもできる。
[0047] 形質転換体の一例として、上記のようにして取得した DNAを pUCNT (WO94/0 3613参照）に組み込んだ組換えプラスミド pHA002を用いてェシエリヒア 'コリ（ Escherichia coli) HB101を形質転換し、形質転換体ェシエリヒア ·コリ（Escherichia coli) HB101 (pHA002)を得ること力 Sできる。
[0048] 本発明で得られた形質転換体ェシエリヒア 'コリ（Escherichia coli) HB101 (pHA0 02)は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されて レ、る（受託番号 FERM BP— 10193、原寄託日平成 16年 1月 22日の国内寄託をブ ダペスト条約に基づく国際寄託に移管)。
[0049] なお、本発明で用いた組換え DNA技術は当該分野において周知であり、例えば、 Molecular Cionmg 2nd Edition (し old Spring Harbor Laooratory Press, 1989)、 し urrent Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and
Wiley-Interscience)に記載されてレ、る。
[0050] 本発明のアミダーゼを生産しうる微生物（アースロバクタ一.エスピー（Arthrobacter sp.) KNK1101J若しくはその変異株、上記形質転換体等）を培養することにより当該 酵素を大量に生産することができ、 D—アミノ酸の製造に利用することができる。
[0051] 微生物の培養は、通常の培地を用いて行えば良い。培養に使用する培地としては 、炭素源、窒素源および無機塩類などの栄養素を含む通常の培地で良い。これに、 ビタミン、アミノ酸などの有機微量栄養素を添加すると、好ましい結果が得られる場合 が多い。炭素源としては、グノレコースゃシユークロースのような炭水化物、酢酸のよう な有機酸、アルコール類などが適宜使用される。窒素源としては、アンモニゥム塩、ァ ンモユア水、アンモニアガス、尿素、酵母エキス、ペプトン、コーンス 'ティープ 'リカー などが用いられる。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム 塩、カルシウム塩、鉄塩、硫酸塩、塩素などが用いられる。
[0052] 培養は温度範囲 25°Cから 40°Cで行える力 25°Cから 37°Cが特に好ましい。また、 pHは 4から 8で培養できるが 5から 7. 5が好ましレ、。また、回分式、連続式のいずれ の培養方法でもよい。
[0053] 必要に応じてイソプロピル一 1_チォー β _D—ガラタトサイド（IPTG)、ラタトース等の 添カ卩等の酵素誘導のための処理を行うこともできる。
[0054] 本発明のアミダーゼをアミノ酸アミドまたはアミノ酸エステルの立体選択的加水分解 に利用するにあたっては、上記のようにして得られた培養物（培養液、微生物菌体） をそのまま作用させても良いし、培養物からアミダーゼを単離 ·精製して使用しても良 レ、。
実施例
[0055] 以下に本発明の具体的な実施例を示す。しかし、本発明はこれらの実施例により限 定されるものではない。
[0056] ( m ι )アミダーゼの ¾離 · mm
アースロバクタ^ ~ ·エスピー（Arthrobacter sp.) KNK1101J株（受託番号 FERM B P—10192)を、試験管内で滅菌した 6mlの培地 A (肉エキス 10g、イーストエキス 5g、 ポリペプトン 10g、塩ィ匕ナトリウム 3g、脱イオン水にて 11にメスアップ、滅菌前 pH6. 5) に植菌して 30°Cで 24時間、好気的に振とう培養した。この培養液 2mlをフラスコ内で 滅菌した 200mlの培地 Aに植菌して 30°Cで 48時間、好気的に振とう培養した。培養 終了後、遠心分離で菌体を集菌して、 ImMのジチオスレィトール（DTT)を含む 50 mM Tris -塩酸緩衝液 (pH8. 0)に菌体を懸濁後、超音波により菌体を破砕し、こ れを遠心分離した。上清に 45%飽和濃度となるよう硫酸アンモニゥムを添加し、生じ た沈殿を遠心分離で取得した。この画分を ImMの DTTを含む 50mM Tris—塩酸 緩衝液（ρΗ8· 0)に溶解し、同緩衝液で透析後、 DEAE— TOYOPEAL (東ソ一社 製）にアプライしてカラムクロマトグラフィーを行い、同緩衝液で洗浄後、同緩衝液で 0 Μから 0. 5Μの塩化ナトリウムの濃度勾配をかけて溶出し、活性のあるフラクションを 集めた。この活性画分に終濃度 0. 8Μとなるように硫酸アンモニゥムを溶解した後、 Phenyl—TOYOPEAL (東ソ一社製）にアプライしてカラムクロマトグラフィーを行レ、、 ImMの DTTを含む 50mM Tris—塩酸緩衝液（pH8. 0)で 0. 8Mから 0Mの硫酸 アンモニゥムの濃度勾配をかけて溶出した。得られた活性画分を、 MonoQ HR5/ 5(アマシャムファノレマシアバイオテック社製）にアプライしてカラムクロマトグラフィーを 行レ、、 ImMの DTTを含む 50mM Tris—塩酸緩衝液（pH8. 0)で洗浄後、同緩衝 液で 0Mから 0. 5Mの塩化ナトリウムの濃度勾配をかけて溶出した。得られた活性画 分を限外濾過膜 (分画分子量 10, 000)を用いて濃縮した後、 Superdex 200 HR
10/30 (アマシャムフアルマシアバイオテック社製）にアプライして FPLCによるゲ ルろ過を行レ、、 ImMの DTT及び 0· 15Mの塩化ナトリウムを含む 50mM Tris—塩 酸緩衝液 (pH8. 0)で溶出した。得られた活性画分を SDS—ポリアクリルアミド電気泳 動によって分析したところ、アミダーゼは単一バンドとして検出され、精製酵素の純粋 十生が確認、できた。
(実施例 2)アミダーゼを用いたアミノ酸アミドの加水分解
実施例 1で得られた精製アミダーゼ活性画分 0. 1mlを、表 2に示す化合物を 0. 5 %含む 0. 2M Tris-塩酸緩衝液（pH8. 5) 0. 1mlと混合し、 30°Cにて 15時間振と うした。反応終了後、遠心分離にて固形物を除去し、高速液体クロマトグラフィーにて 生成したアミノ酸の収率及び光学純度を分析した結果を表 2に示す。
高速液体クロマトグラフィー分析条件
[アミノ酸の収率分析]
カラム： COSMOSIL 5C18-AR (4. 6mm φ X 250mm,ナカライテスタ社製）、溶 離液： 10mM燐酸カリウム緩衝液（pH2) /ァセトニトリル = 19/1、流速： 0. 5ml/ 分、カラム温度： 40°C、測定波長： 210nm
[アミノ酸の光学純度分析] カラム： SUMICHIRAL OA—5000 (4. 6mm φ X I 50mm,住化分析センター社 製）、溶離液： 2mM硫酸銅/ァセトニトリル = 85/15、流速： 0. 8ml/分、カラム温 度： 40°C、測定波長： 254nm
[表 2]
Figure imgf000016_0001
[0059] (実施例 3)精製アミダーゼを用いたアミノ酸エステルの加水分解
実施例 1で得られた精製アミダーゼ活性画分 0. 1mlを、 0. 5%濃度のラセミ体フヱ 二ルァラニンェチルエステルを含む 0. 2M 2_ (N—モルホリノ）エタンスルホン酸— N a〇H緩衝液 (pH6. 5) 0. 1mlと混合し、 30°Cにて 15時間振とうした。反応終了後、 遠心分離にて固形物を除去し、実施例 2と同様の方法で生成したアミノ酸を分析した ところ、 D体フエ二ルァラニンが収率 29. 7mol%、光学純度 72. 8%eeで得られた。
[0060] (実施例 4)アミダーゼ遺伝子の単離
まず、実施例 1と同様の方法でアースロバクタ^ ~ ·エスピー（Arthrobacter sp.) KNK 1101J株を培養して得た菌体を、 CTAB、クロ口ホルム、フエノールを用いて溶解、処 理後、抽出された DNAをイソプロパノールで析出し、遠心分離で得られた沈殿をェ タノールで洗浄することにより染色体 DNAを調製した。 （Current Protocols in Molecular Biology(Lrreene Publishing Associates and Wiley— Interscience)を参照。 ) 次いで、実施例 1で精製したアミダーゼのァミノ末端のアミノ酸配列を気相プロテイン •シークェンサ一を用いて決定した。さらに、実施例 1で精製したアミダーゼにリジル エンドべプチダーゼを 4Mの尿素の存在下作用させて生成したポリペプチド断片を 逆相 HPLCを用いて精製した後、上記と同様の方法でアミダーゼの内部アミノ酸配 列を決定した。 N末端アミノ酸配列にもとづいて設計した DNAプライマー（Primer~ 1：配列表の配列番号 4)と、内部アミノ酸配列にもとづいて設計した DNAプライマー (Primer— 2：配列表の配列番号 5)を用いて、先に得た染色体 DNAを錡型に PCR を行った。この結果、 目的のアミダーゼ遺伝子の一部（部分遺伝子と称す）を取得し た。
[0061] 次に、 目的遺伝子の全長を取得するために以下の操作を行った。上記部分遺伝子 において、酵素の N末端側、 C末端側それぞれの部分に相当する塩基配列にもとづ き、部分遺伝子の外側方向へ向けた DNAプライマー（Primer~3：配列表の配列番 号 6、及び、 Primer~4 :配列表の配列番号 7)を合成した。このプライマーを用レ、、先 に得た染色体 DNAを制限酵素 SacII、 Pvul、 Sail, Xholで分解したもの断片を T4 DNAリガーゼを用いて環化させて得た DNAを錡型に、インバース PCRを行った。 これにより、既に取得した部分遺伝子のさらに外側の遺伝子部分を含む DNA断片を 取得した。この DNA断片の塩基配歹 1Jを決定後、酵素の N末端よりも上流と推定され る部分の塩基配列に制限酵素 BamHIの切断部位を結合させた配列をもつ DNAプ ライマー（Primer~5 :配列表の配列番号 8)と、 C末端より下流と推定される部分の塩 基配列に制限酵素 Sacl切断部位を結合させた配列をもつ DNAプライマー（Primer 一 6 :配列表の配列番号 9)を調製した。この DNAプライマーを用いて、この配列の間 の DNAを PCRにより増幅することでアミダーゼ遺伝子の全長を含む DNA断片（配 列表の配列番号 2)を取得した。得られた DNA断片の一部の塩基配列を解析し、ァ ミダーゼ遺伝子の全長（配列表の配列番号 3)が含まれていることを確認した。
[0062] (実施例 5)アミダーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドの作成と遺伝子の解析
実施例 4で得られたアミダーゼ遺伝子全長を含む DNA断片と、制限酵素 EcoRV で切断したベクタープラスミド pT7Blueを T4 DNAリガーゼを用いて結合することで 、図 1の制限酵素地図で表され、アミダーゼ遺伝子を含むプラスミド pHAOOlを取得 した。
[0063] 取得したプラスミド pHAOOlを用いて、実施例 4で得られた DNA断片の塩基配列 を解析した。この結果、精製したアミダーゼを用いて決定した N末端アミノ酸配列及 び内部アミノ酸配列をコードする塩基があることを確認した。また、翻訳開始部位と終 止コドンを確認し、オープンリーディングフレームを決定した。このようにして得られた 、アミダーゼ遺伝子全長を含む DNA断片の塩基配列を配列表の配列番号 2に、ォ ープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号 3に、塩基配列より推定 されるアミノ酸配列を配列表の配列番号 1に示した。 [0064] (実施例 6)アミダーゼ遺伝子を大量発現する組換えプラスミドの作成 実施例 5で得られたアミダーゼ遺伝子の N末端、 C末端部分にそれぞれ制限酵素 Ndel及び Saclの切断部位を結合させた配列を持つプライマー（Primer— 7：配列表 の配列番号 10、 Primer— 8 :配列表の配列番号 11)を用いて、この間の DNAを PC Rにより増幅することで配列表の配列番号 3に示されるオープンリーディングフレーム の DNA断片を取得した。
[0065] この DNA断片を制限酵素 Ndelと Saclで切断し、同酵素で切断したベクタープラス ミド pUCNT (W〇94Z03613参照）と T4 DNAリガーゼを用いて結合することで、 図 2の制限酵素地図で表され、アミダーゼ遺伝子を pHAOOlよりも多く発現できるよ うに設計された PHA002を取得した。
[0066] 窗列 7)アミダーゼ謝云 む え {本 DNA»用いた开 拿云 本のィ乍成
実施例 6で得られたプラスミド pHA002をェシエリヒア'コリ（Escherichia coli) HB10 1のコンビテントセルと混合することで形質転換を行い、寒天培地 B (トリプトン 10g、ィ ース卜エキス 5g、塩ィ匕ナ卜];クム 10g、寒天 15g、了ンピシジン 100mg、脱ィ才ン水に て 11にメスアップ、滅菌前 ρΗ7· 0、ただしアンピシリンは滅菌後に添カ卩する）にプレ 一ティングして、アミダーゼ遺伝子を含む組換え体 DNAを含有する形質転換体ェシ エリヒア.コリ（Escherichia coli) HB101 (pHAOO 2)をコロニーとして取得した。
[0067] 得られた形質転換体のコロニーを、試験管内にて滅菌した 6mlの培地 C (トリプトン
10g、イーストエキス 5g、塩ィ匕ナトリウム 10g、アンピシリン 100mg、脱イオン水にて 11 にメスアップ、滅菌前 pH7. 0、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）に植菌後、 3 7°Cで 24時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌 体を集菌し、 ImMのジチオスレィトール（DTT)を含む 50mM Tris_塩酸緩衝液（ pH8. 0)に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離により菌体由来の不 溶物を除去して、形質転換体のアミダーゼ酵素液を取得した。得られた酵素液 0. 1 mlを、 50mMの D体フエ二ルァラニンアミド塩酸塩を含む 0. 2M Tris_塩酸緩衝液 (pH8. 5) 0. 1mlと混合し、 30°Cで 15時間反応を行ったところ、 D体フエ二ルァラ二 ンの生成が認められ、形質転換体にアミダーゼ活性があることが確認された。
[0068] なお、得られた形質転換体ェシエリヒア'コリ (Escherichia coli) HB101 (pHA002 )は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されている
(受託番号 FERM BP— 10193、原寄託日平成 16年 1月 22日の国内寄託をブダぺ スト条約に基づく国際寄託に移管）。
(実施例 8)組換え菌を用いたアミノ酸エステルの加水分解
実施例 7で得られたェシエリヒア'コリ（Escherichia coli) HB101 (pHA002)の培養 液 0. 1mlを、 1%濃度のラセミ体フヱ二ルァラニンェチルエステルを含む 0. 2M 2- (N—モルホリノ）エタンスルホン酸— NaOH緩衝液（pH6. 5) 0. 1mlと混合し、 30°C にて 15時間振とうした。反応終了後、遠心分離にて固形物を除去し、実施例 2と同様 の方法で生成したアミノ酸を分析したところ、 D体フエ二ルァラニンが収率 34. 7mol %、光学純度 53. 6%eeで得られた。

Claims

請求の範囲
以下の（a)又は（b)のポリペプチド：
(a)配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が 置換、揷入、欠失および Z又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミダーゼ活 性を有するポリペプチド。
アースロバクタ一 (Arthrobacter)属に属する微生物に由来する請求項 1に記載のポリ ペプチド。
微生物がアースロバクタ一'エスピー（Arthrobacter sp.) KNK1101j (FERM BP—
10192)である請求項 2に記載のポリペプチド。
請求項 1一 3のいずれかに記載のポリペプチドをコードする DNA。
以下の（c)一 (e)のレ、ずれかの DNA:
(c)配列表の配列番号 3に示す塩基配列からなる DNA、
(d)配列表の配列番号 3に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとストリ ンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつアミダーゼ活性を有するポリペプチドをコ ードする DNA、
(e)配列表の配列番号 3に示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が置換
、揷入、欠失および Zまたは付加された塩基配列を有し、かつアミダーゼ活性を有す るポリペプチドをコードする DNA。
請求項 4又は 5に記載のいずれかの DNAがベクターに揷入された組換えプラスミド。 ベクター力 SpUC18、 pUC19、 pBR322、 pACYC184、 pSC101、 pT7Blue、又は pUCNTである請求項 6記載の組換えプラスミド。
組換えプラスミドが図 2の制限酵素地図にて特定される pHA002である請求項 6又は 7に記載の組換えプラスミド。
請求項 6— 8のいずれかに記載の組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得ら れる形質転換体。
宿主微生物がェシエリヒア'コリ（Escherichia coli)である請求項 9に記載の形質転換 体。 [11] 形質転換体がェシエリヒア'コリ (Escherichia coli) HB101 (pHA002) (FERM BP
-10193)である請求項 9に記載の形質転換体。
[12] 請求項 1記載のポリペプチドを生産する能力を有し、かつ、アースロバクタ一（
Arthrobacter)属に属する微生物。
[13] アースロバクタ^ ~ ·エスピー（Arthrobacter sp.) KNK1101J (FERM BP— 10192)、 又は、その変異株である請求項 12記載の微生物。
[14] 請求項 1一 3のいずれかに記載のポリペプチドを生産する能力を有する微生物を培 養し、培養物中に当該ポリペプチドを蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするァ ミダーゼの製造方法。
[15] 微生物が請求項 9一 11のいずれかに記載の形質転換体である、請求項 14記載の 製造方法。
[16] 微生物が、請求項 12又は 13記載の微生物である請求項 14記載の製造方法。
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