ES2284266T3 - Composiciones terapeuticas liposomicas que se pueden obtener mediante el uso de un grandiente de sulfato amonico. - Google Patents

Abstract

Utilización de una composición liposómica que comprende una sustancia terapéutica para la preparación de una composición farmacéutica destinada a la administración prolongada de dicha sustancia terapéutica, en la que dicha composición puede obtenerse (i) incubando una solución que comprende dicha sustancia terapéutica, a un pH que impida la precipitación de dicha sustancia terapéutica en la solución, con una suspensión de liposomas que tiene una concentración de iones amonio mayor dentro de dichos liposomas que fuera de dichos liposomas, y (ii) retirar una sustancia terapéutica no encapsulada, en la que dichos liposomas son liposomas multivesiculares gigantes (GMV) que pueden obtenerse (a) agitando intensamente una película de lípido con una solución acuosa de sulfato amónico, (b) homogeneizando la suspensión resultante para formar una suspensión de pequeñas vesículas unilaminares (SUV), y (c) congelando y descongelando repetidamente dicha suspensión de SUV en nitrógeno líquido seguido de agua.

Description

Composiciones terapéuticas liposómicas que se pueden obtener mediante el uso de un gradiente de sulfato amónico.

La presente invención se refiere a composiciones liposómicas que comprenden una sustancia terapéutica, útiles para la administración prolongada de dicha sustancia terapéutica, que se preparan utilizando un procedimiento de carga con gradiente de sulfato amónico. La invención proporciona también la utilización de dichas composiciones para la preparación de una composición farmacéutica destinada a producir la administración prolongada de dicha sustancia terapéutica. Las suspensiones liposómicas comprenden liposomas (multivesiculares gigantes) "GMV" y también se dan a conocer métodos para su preparación.

Boogaerts. J. G. et al., Can J Anaesth 40(12):1201-1204 (1993).

Grant, G. J. et al., Reg Anesth 19(4):264-269 (1994).

Haran, G. et al., Biochem Biophys Acta 1151(2):201-215 (1993).

Kim, S. et al., Patente U.S. nº 5.723.147 (1998).

Legros, F. et al., Patente U.S. nº 5.244.678 (1993).

Mowat, J. J. et al., Anesthesiology 85(3):635-643 (1996).

Stewart, J. C. M., Anal. Biochem 104, 10 (1959).

Se ha demostrado que la encapsulación liposómica de anestésicos locales aumenta la duración del alivio del dolor. Los factores críticos en la eficacia de las formulaciones liposómicas de bupivacaína incluyen la encapsulación de la máxima cantidad de fármaco, así como una tasa de liberación adecuada tras la inyección. Los inconvenientes principales de las formulaciones liposómicas de bupivacaína descritas anteriormente (p. ej. Boogaerts, Grant, Legros) son la oclusión del fármaco relativamente ineficaz y las proporciones bajas de fármaco/lípido. Esto puede conducir a un depósito indeseable de material lipídico graso en el punto de inyección.

Recientemente, se describió (Mowat) la carga activa de bupivacaína utilizando un gradiente de pH. Se utilizó una solución de citrato sódico para crear un gradiente transmembranario, y se consiguió una relación fármaco/lípido de 0,26, mayor que la obtenida anteriormente por técnicas de carga "pasiva" (p. ej. Legros). Sin embargo, en Mowat, se mantuvo el pH extraliposómico a aproximadamente 7,4, lo que limita potencialmente la cantidad de fármaco disponible para la carga, ya que la bupivacaína es poco soluble a este pH.

El documento EP-A2-0 361 894 da a conocer un sistema para cargar una molécula anfifática en liposomas que comprende la formación de una suspensión de liposomas en presencia del compuesto de amonio o de la sal de amonio en la que dicha suspensión se diluye con tampón o sal para proporcionar un gradiente de amonio de dentro a fuera entre las fases acuosa interna y acuosa externa y un gradiente de pH en el que el pH interno de los liposomas es más ácido que el pH externo. Dicho documento no da a conocer la implicación de los liposomas multivesicuulares gigantes (GMV).

La presente invención incluye, en un aspecto, la utilización de una composición liposómica que comprende una sustancia terapéutica para la preparación de una composición farmacéutica destinada a la administración prolongada de dicha sustancia terapéutica, en la que dicha composición puede obtenerse

(i)

incubando una solución que comprende dicha sustancia terapéutica, a un pH que impida la precipitación de dicha sustancia terapéutica en la solución, con una suspensión de liposomas que tiene una concentración de iones amonio mayor dentro de dichos liposomas que fuera de dichos liposomas, y

(ii)

retirar la sustancia terapéutica no encapsulada,

\quad

en la que dichos liposomas son liposomas multivesiculares gigantes (GMV) que pueden obtenerse

(a)

agitando intensamente una película de lípido con una solución acuosa de sulfato amónico,

(b)

homogeneizando la suspensión resultante para formar una suspensión de pequeñas vesículas unilaminares (SUV), y

(c)

congelando y descongelando repetidamente dicha suspensión de SUV en nitrógeno líquido seguido de agua.

\newpage

Preferentemente, la solución acuosa tiene una concentración en sulfato amónico de aproximadamente 250 mM y, en la etapa de incubación, la solución que comprende la sustancia terapéutica tiene un pH eficaz para impedir la precipitación de la sustancia terapéutica; típicamente alrededor de 6 o menos.

Preferiblemente, el punto de administración de las composiciones liposómicas debe enfriarse. Preferiblemente, la piel del paciente se enfría a una temperatura de aproximadamente 22ºC en el punto de inyección.

La presente invención proporcionar también un método de preparación de liposomas GMV que comprende: (a) agitar intensamente una película de lípido con una solución acuosa de sulfato amónico, (b) homogeneizar la suspensión resultante para formar una suspensión de pequeñas vesículas unilaminares (SUV), y (c) congelar y descongelar repetidamente dicha suspensión de SUV en nitrógeno líquido seguido de agua. Preferentemente, la congelación y descongelación se repite al menos cinco veces, y más preferentemente alrededor de diez veces. El sulfato amónico extraliposómico se retira a continuación, p. ej. por diálisis frente a solución salina normal. Los liposomas GMV, por sí mismos también proporcionan un aspecto adicional de la presente invención. Preferentemente, el método de preparación incluye la encapsulación de una sustancia terapéutica dentro de los liposomas, p. ej. incubando una suspensión de los liposomas con una solución de la sustancia terapéutica. Preferentemente, la sustancia es débilmente básica, y la suspensión de liposomas GMV tiene una concentración mayor de iones amonio en el interior de los liposomas que fuera de los liposomas, como se describió anteriormente. Cuando la sustancia es bupivacaína, en la etapa de incubación, la solución de bupivacaína tiene un pH eficaz para prevenir la precipitación de la bupivacaína; típicamente alrededor de 6 o menos.

Las composiciones liposómicas a base de GMV tienen una proporción molar de fármaco a lípido, después de la eliminación del fármaco no encapsulado, de al menos 0,5. Después de la concentración adicional de la suspensión liposómica resultante por ultrafiltración o centrifugación, la proporción molar de fármaco a lípido es al menos 0,5, preferentemente al menos 1,0 y más preferentemente al menos 1,5.

Estos y otros objetivos y características de la invención serán completamente evidentes cuando al leer la siguiente descripción detallada de la invención junto con los dibujos adjuntos.

La Figura 1 es un dibujo lineal basado en una fotomicrografía de los liposomas GMV descritos en la presente memoria;

La Figura 2 presenta el efecto de pH en la solubilidad de la bupivacaína (BUP) a tres concentraciones en sulfato amónico 250 mM;

La Figura 3 presenta el tamaño y la distribución de tamaños de los liposomas obtenidos durante 15 etapas sucesivas de congelación y descongelación en la preparación de GMV;

La Figura 4 presenta el cambio de volumen ocluido de los liposomas obtenidos durante 15 etapas sucesivas de congelación y descongelación en la preparación de GMV;

Las Figuras 5A-5C presentan la tasa de liberación de BUP de los liposomas GMV compuestos de HPC/Chol (fosfatidilcolina de soja hidrogenada/colesterol) en relaciones molares de 50:50 (3A), 67:33 (3B) y 75:25 (3C), a 4ºC, temperatura ambiente (21ºC) y temperatura corporal (37ºC), durante 24 horas;

Las Figuras 6A-6C presentan los perfiles de liberación de las composiciones de las Figs. 3A-3C durante 7 días;

Las Figuras 7A-7C presentan la tasa de liberación de BUP de los liposomas GMV compuestos de DMPC/colesterol en relaciones molares de 50:50 (3A), 67:33 (3B) y 75:25 (3C), a 4ºC, 21ºC y temperatura corporal (37ºC), durante 24 horas;

La Figura 8 presenta el efecto de BUP en las formas no liposómicas y varias liposómicas, que contienen una proporción de HPC/Chol lípido 67:33, cargada con un gradiente de sulfato amónico, sobre la duración del bloqueo sensorial tras la inyección subcutánea en ratones;

La Figura 9 presenta el efecto de la estructura del liposoma y del contenido en Chol sobre la duración de la analgesia;

La Figura 10 presenta los datos de respuesta a la dosis para 0,5%, 1% y 2% de BUP en MLV que contiene HPC/Chol 67:33 o 50:50;

Las Figuras 11-12 presentan los datos de respuesta a la dosis para 0,5%, 1% y 2% de BUP en GMV que contiene, respectivamente, HPC/Chol 67:33 o 50:50;

La Figura 13 presenta el efecto de BUP en las formas no liposómicas y liposómicas, que contienen una proporción de HPC/Chol lípido 67:33, cargada con un gradiente de sulfato amónico, sobre la duración del bloqueo sensorial tras la inyección subcutánea en ratones, con y sin enfriamiento en el punto de inyección o adyacente al mismo; y

Las Figuras 14A y 14B presentan el cambio en la temperatura corporal durante el tiempo de administración de bupivacaína GMV a ratones (Fig. 14A; duración del enfriamiento 9 horas) o de bupivacaína pura (Fig. 14B; duración del enfriamiento 1 hora) con enfriamiento en el punto de administración (ipsolateral) o adyacente al mismo (contralateral).

I. Preparación de formulaciones liposómicas de BUP

Se prepararon una gama de estructuras y composiciones liposómicas. El lípido de la matriz utilizado para todas las formulaciones fue fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HPC), adquirido en Lipoid, Ludwigshafen, Alemania, constituido por >98% de diestearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DSPC) y que tiene una temperatura de transición de fase de aproximadamente 52,5ºC. Este lípido se utilizó solo o en combinación con colesterol (Chol) 50 ó 33 por ciento molar.

Las estructuras liposómicas preparadas eran vesículas unilaminares pequeñas (SUV), vesículas unilaminares grandes (LUV), vesículas multilaminares (MLV) y una estructura indicada en la presente memoria como GMV (véase la Fig. 1, basada en una microfotografía de estas vesículas). Se prepararon varias estructuras de la forma siguiente. Aunque solamente las GMV están comprendidas en la composición, utilizaciones y métodos de la presente invención, la descripción de las demás vesículas se ha mantenido a título de referencia.

Se formó una película fina de lípido disolviendo el/los componente(s) lipídico(s) en cloroformo y eliminando el disolvente en un evaporador rotativo. Se formaron MLV, según los procedimientos conocidos, hidratando la película con una solución de sulfato amónico (véase la exposición del gradiente de sulfato amónico a continuación) y agitando a 60ºC, dando una composición lipídica final de aproximadamente 4%. Preferiblemente, la concentración de la solución es 250 mM de (NH_{4})_{2}SO_{4}. No se obtuvieron concentraciones mayores (400-500 mM) que fueran más eficaces.

Una parte de la preparación de MLV se utilizó para formar SUV, de nuevo según métodos conocidos, mediante homogeneización a alta presión a 680-1.020 atm (10.000-15.000 psi) (EmulsiFlex-C5, Avestin, Ottawa, ON).

Se prepararon GMV (Fig. 1) congelando y descongelando una parte de la preparación de SUV, en suspensión todavía en la solución de sulfato amónico, en nitrógeno líquido seguido de inmersión en agua a 37ºC. Se repitió el proceso de congelación y descongelación diez veces.

Se formaron LUV por extrusión de una parte de las MLV a través de membranas de policarbonato dimensionadas sucesivamente (0,6, 0,4 y 0,2 \mum; Nucleopore, Pleasanton, CA), utilizando un extrusor de biomembranas Lipex (Vancouver, BC).

Para cada formulación, se lavó a continuación el medio extraliposómico de sulfato amónico por diálisis frente a solución salina normal a 4ºC, cambiando el dializado tres veces. Esto es eficaz para crear un gradiente de ión amonio de dentro a afuera a través de la membrana liposómica (Haran). Las suspensiones liposómicas tienen de este modo una concentración mayor de iones amonio en el interior de los liposomas que fuera de los liposomas; preferiblemente, [(NH_{4})_{2}SO_{4}]_{int}/[(NH_{4})_{2}SO_{4}]_{ext} > 300. El pH interno es inferior al pH externo, aunque puede permanecer lo suficientemente alto para permitir la formación de amoniaco a partir del ión amonio durante el proceso de carga. El gradiente de concentración de ión amonio proporciona motivación para la carga de bases anfífilas débiles tal como la bupivacaína. Durante la incubación con una solución de la base, el compuesto no protonado atraviesa la membrana y se protona en el pH inferior del interior. Esto aumenta el pH dentro de las vesículas, lo que conduce a la liberación de amoniaco a través de la membrana. El proceso continua siempre que exista un gradiente de ión amonio a través de las membranas liposómicas.

En el presente caso, los liposomas se incubaron con una solución de 50 mg/ml de BUP HCl durante 45 minutos a 60ºC. Durante este procedimiento, el pH extraliposómico debería mantenerse a un pH inferior a aproximadamente 6, p. ej. aproximadamente 5,5, para asegurar la solubilidad de la BUP e impedir su precipitación. Véase, por ejemplo, la Fig. 2, que presenta la solubilidad acuosa de BUP dependiente de pH. Los datos se produjeron añadiendo varias concentraciones de BUP, como las indicadas, a sulfato amónico 250 mM a diferentes pH. Las muestras se agitaron intensamente y se centrifugaron, y se determinó la cantidad de BUP disuelta en el sobrenadante. Como se muestra en la Figura, grandes cantidades de BUP precipitaron en las soluciones más concentradas a pH superiores a aproximadamente 6. Además, la Tabla I presenta los coeficientes de reparto de BUP en octanol/sulfato amónico acuoso a varios pH. De nuevo, la solubilidad acuosa disminuye sustancialmente entre pH 6 y 8. (La solubilidad acuosa se reduce también ligeramente a pH 2).

TABLA I

100

La BUP no ocluída se retiró de las suspensiones liposómicas por diálisis frente a solución salina normal. Los liposomas (SUV y LUV) se concentraron por ultrafiltración (Centriprep-10 concentrator, Amicon, Beverly, MA) o por centrifugación a 3.000 G (GMV y MLV). Las características de estas preparaciones se dan en la Tabla II.

Se prepararon también lotes por separado de GMV y MLV en los que se utilizó centrifugación en lugar de diálisis para retirar tanto el sulfato amónico como la BUP del medio extraliposómico. Estas formulaciones se describen en la Tabla III.

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TABLA II

101

TABLA III

102

Como se muestra a continuación, las formulaciones de liposomas de GMV con 33 a 50 por ciento molar de colesterol y de HPC restantes son particularmente eficaces para proporcionar analgesia prolongada (p. ej. Figura 5), como lo eran las formulaciones con 40 por ciento molar de colesterol y las restantes de DMPC, DSPC o DPPC (datos no mostrados). Sin embargo, los liposomas no se limitan a estas formulaciones, y pueden formarse de varias combinaciones de lípidos formadores de vesículas, es decir, lípidos anfipáticos que tienen restos de grupos principales hidrófobos y polares y que pueden formar vesículas bicapa en agua, ejemplificados por fosfolípidos, o que pueden incorporarse de forma estable en bicapas de lípido, tales como los esteroles. Los lípidos incluyen típicamente una o dos cadenas hidrocarbonadas de acilo hidrófobo o un grupo esteroideo, y pueden contener un grupo químicamente reactivo, tal como una amina, ácido, éster, aldehído o alcohol, en el grupo polar principal. En los fosfolípidos, las dos cadenas hidrocarbonadas son típicamente de aproximadamente 14 a 22 átomos de carbono de longitud, y tienen grados variables de insaturación. Ejemplos representativos son varias fosfatidilcolinas (PC), fosfatidiletanolaminas (PE), ácido fosfatídico (PA), fosfatidilinositol (PI), esfingomielina (SM), lípidos con carga negativa tales como dimiristoil fosfatidil glicerol (DMPG) y lípidos con carga positiva tal como 1,2-diestearoil-3-trimetilamonio propano (DSTAP).

II. Caracterización

La distribución de tamaño de los liposomas se determinó por espectroscopia de correlación de fotones (N4Plus, Coulter, Miami, FL). El intervalo de tamaño de las formulaciones de Chol al 33% lavadas por diálisis y concentradas por centrifugación (Tabla 2) fueron, en nm ± S.D.: SUV, 90 ± 150; LUV, 175 ± 70; GMV, 2.440 ± 545; MLV, 6.260 ± 1310. La distribución de tamaños de GMV y MLV preparadas utilizando centrifugación solamente se dan en la Tabla 3; estos tamaños se observaron que variaban considerablemente con la composición del lípido.

El tamaño y la distribución de tamaño de los liposoma se midieron también durante la preparación de GMV después de cada uno de los quince ciclos sucesivos de congelación y descongelación; los resultados se dan en la Figura 3. Como se muestra en la Figura, el tamaño final y la distribución se aproximaron después de aproximadamente cinco ciclos.

El volumen ocluído se determinó también utilizando inulina radiomarcada. El aumento de volumen ocluído es evidente para aproximadamente los siete primeros ciclos, como se muestra en la Fig. 4. La proporción de volumen ocluído a tamaño se observó que permanece constante a lo largo de los quince ciclos (a aproximadamente 5.000 CPM/\mumoles de fosfolípido), lo que demuestra que el aumento de tamaño no conducía a ninguna pérdida significativa de contenidos.

En la Fig. 1 se representa en dibujo lineal una fotomicrografía de los liposomas GMV. El campo de visión de la fotomicrografía abarca el intervalo de aproximadamente 1.300 a 1.400 nm (fotomicrografía original tomada a 45.000\times y ampliada aproximadamente 2\times). Dado el intervalo de tamaño de los liposomas GMV, anteriormente, es probable por consiguiente que las estructuras presentadas estén realmente dentro de una vesícula aún mayor. Las estructuras liposómicas parecen MVV (vesículas multivesiculares) porque las vesículas externas grandes contienen múltiples vesículas más pequeñas, no concéntricas. En comparación con MVV descrito anteriormente, sin embargo, preparadas por un procedimiento diferente (p. ej. Kim et al.), la proporción área/volumen de lípido total dentro de estas estructuras es considerablemente más pequeña.

La concentración de BUP en liposomas se determinó por HPLC como se describe en el Ejemplo 1. Se determinó la concentración de lípido utilizando el análisis de Stewart (Stewart, 1959). Se calculó la proporción molar fármaco/lípido (D/PL) para cada formulación dividiendo los moles de BUP por los moles de fosfolípido.

\newpage

Las Tablas II y III dan las características de los liposomas lavados por diálisis y por centrifugación, respectivamente. Como se muestra en la Tabla II, D/PL disminuyó una vez que se concentraron las formulaciones por ultrafiltración, pero los valores fueron todavía significativamente mayores que los dados a conocer anteriormente (es decir, 0,26 en Mowat, utilizando un gradiente de citrato sódico, y de aproximadamente 0,1 en Legros, utilizando técnicas de carga normales). La concentración total de BUP en las suspensiones liposómicas fue tan alta como 3,9% en peso para los liposomas GMV, de nuevo significativamente mayor que la dada a conocer anteriormente. (Mowat comunicó una concentración de BUP HCl "intravesicular" de aproximadamente 100 mM. Este valor corresponde a aproximadamente 3,25% en peso, pero no tiene en cuenta el volumen del medio en el que están suspendidas las vesículas. Por consiguiente, la concentración total en la suspensión sería significativamente inferior).

Una D/PL alta es especialmente importante para la administración de anestésicos locales en puntos tal como el tejido subcutáneo. En una zona visible, no es deseable que una gran masa de lípido se retenga en el punto de inyección durante un periodo prolongado. La utilización de formulaciones tales como las descritas en la presente memoria permite la analgesia prolongada, como se demuestra a continuación, con una carga mínima de lípido.

D/PL fue inferior en conjunto para las formulaciones lavadas por centrifugación; es de esperar que se produjera alguna pérdida de fármaco como resultado de la distorsión de la membrana en estas condiciones. La pérdida mayor se observó en los liposomas MLV y GMV que tiene un contenido menor en colesterol (Tabla 2, columnas 3 frente a 6 y 5 frente a 8). Sin embargo, no se observó ningún efecto constante del contenido de colesterol sobre las concentraciones de BUP extremas o sobre la proporción D/PL (columnas 6 y 8).

III. Perfiles de liberación in vitro

La tasa de liberación de BUP de los liposomas GMV (HPC/Chol a diferentes proporciones) se evaluó a 4ºC, a temperatura ambiente (21ºC) y a la temperatura corporal (37ºC). Como se muestra en las Figs. 5A-5C, se liberó poco o nada de fármaco en el sobrenadante tras el almacenamiento a 4ºC durante 24 h. A temperatura ambiente, hubo una liberación gradual y estacionaria del fármaco, con aproximadamente el 25% liberado después de 24 h., en los liposomas compuestos de HPC/Chol 50:50, pero poca liberación en aquellos que tienen concentraciones inferiores de colesterol. A 37ºC, una tasa de liberación significativamente mayor se observó inicialmente, en particular para los liposomas con HPC/Chol 50:50, seguido de más liberación gradual. Aproximadamente del 50 al 70% del fármaco estaba presente en el sobrenadante tras 24 h.

Las Figuras 6A-6C presentan la liberación de las mismas composiciones durante un periodo de siete días. La liberación continuó siendo despreciable a 4ºC, asegurando de este modo buena estabilidad al almacenaje, y continuó a una tasa gradual a 21ºC y 37ºC.

Estos resultados demuestran que el fármaco se libera a una tasa adecuada a la temperatura corporal, y que la tasa de liberación del fármaco puede ser controlada alterando la temperatura. Ambos de estos aspectos se añaden a la utilidad clínica de las composiciones.

La tasa de liberación debería ser también adecuada para la manipulación alterando los lípidos constituyentes. En general, es de esperar una tasa de liberación más lenta para los liposomas compuestos de lípidos más "rígidos", que tienen temperaturas más altas en la fase de transición, tales como HPC, DSPC (diestearoil PC) o DPPC (dipalmitoil PC), que un lípido más "fluido", tal como DMPC (dimiristoil PC). Este efecto se demuestra en las Figs. 7A-7C, que presentan la liberación de bupivacaína a las tres mismas temperaturas de liposomas GMV compuestos de colesterol y DMPC del 50 al 75%. La liberación fue significativamente más rápida en los liposomas con DMPC/Chol 67:33 que en los liposomas HPC/Chol 50:50 (Fig. 7B frente a Fig. 5B) y los liposomas DMPC/Chol 75:25 liberados del fármaco incluso en frío (Fig. 7C). Por consiguiente, tanto la temperatura como la composición del lípido pueden manipularse para controlar la tasa de liberación del fármaco. La manipulación de la temperatura en una composición in vivo se expone con más detalle a continuación.

IV. Eficacia analgésica

Se evaluó la analgesia en ratones Swiss-Webster macho, como se describe en el Ejemplo 2, utilizando la respuesta a la estimulación eléctrica cutánea. Antes de la administración analgésica, se determinó el umbral de vocalización de referencia (corriente requerida para producir una respuesta a la vocalización). Los ratones que no pudieron responder a una corriente de admisión (15 mA) se excluyeron del estudio.

Para experimentar, se inyectaron por vía subcutánea 150 \mul de la solución de ensayo en el abdomen, y se evaluó el bloqueo sensorial a intervalos regulares, es decir, 15 min. para las formulaciones de BUP al 0,5% y 30 min. para las formulaciones al 1% y 2%. La incapacidad de vocalizar en respuesta a la corriente umbral se consideró prueba de analgesia. El experimento se terminó cuando dos estímulos sucesivos provocaron una vocalización. La duración de la analgesia se consideró como el tiempo desde la inyección hasta el último estímulo en el que no se producía vocalización.

Para los datos mostrados en las Figs. 8 y 9, se diluyeron todas las formulaciones hasta una concentración final de BUP del 0,5%. (Las concentraciones mayores de BUP no liposómica se demostraron tóxicas). Se obtuvieron las curvas de respuesta a la dosis, presentadas en las Figs. 10-12, para las formulaciones de MLV y GMV que contienen BUP al 1% y 2%.

Los resultados para varias formulaciones que contienen Chol al 33%, como las caracterizadas en la Tabla II, se presentan en la Fig. 8. Como se muestra, todas las formulaciones, excepto para SUV, prolongaron significativamente el efecto analgésico en comparación con la referencia (BUP "pura").

La Fig. 9 presenta el efecto de las formulaciones caracterizadas en la Tabla III. (Los datos mostrados en las Figs. 10 a 12 corresponden también a las formulaciones descritas en la Tabla III). Como se muestra, los liposomas GMV fueron más eficaces que MLV en la prolongación de la analgesia, particularmente para la formulación de Chol al 33%. Las curvas de respuesta a la dosis para MLV que contenía Chol al 33% y 50% se presentan en la Fig. 10. Se observaron diferencias no constantes entre las diferentes composiciones de lípido en este caso. Datos similares para los liposomas GMV, en las Figs. 11 a 12, presentan un efecto prolongado para la composición de Chol al 33%. La comparación de las Figs. 11 a 12 con la Fig. 10 presenta también un efecto (prolongado) significativamente mayor para los liposomas GMV en comparación con la MLV.

La duración prolongada de la acción analgésica para la GMV en comparación con MLV puede estar relacionada con la estructura de GMV, como se presenta en la Fig. 1. Los liposomas de GMV proporcionan un volumen encapsulado mayor con pocas membranas para ser atravesadas por el fármaco. La tasa de liberación puede regularse también alterando la composición del lípido, como se sugiere diferenciando los resultados de las formulaciones de Chol al 33 y 50% mostradas en las Figs. 11 y 12, y por los resultados expuestos para varios lípidos de PC anteriormente.

Se descubrió también que el enfriamiento local de la piel en el punto de administración de las formulaciones liposómicas aumentaba la duración de la analgesia. En un grupo de referencia, se inyectaron ratones con 0,15 ml de bupivacaína no liposómica a una concentración del 0,5%, la máxima tolerada normalmente. Se aplicó enfriamiento sobre el punto de inyección o sobre el abdomen contralateral al punto de inyección. (Se aplicó el enfriamiento aplicando un depósito metálico pequeño, de aproximadamente 15 mm de diámetro, al abdomen del ratón; se bombeó agua con hielo a través del depósito para mantener la piel a una temperatura de aproximadamente 22ºC). No hubo diferencia entre estos dos grupos y un grupo en el que no se aplicó enfriamiento. La analgesia remitió en dos horas (véase la Fig. 13).

La misma prueba se realizó a continuación utilizando una formulación de bupivacaína liposómica al 1,5% (GMV; HPC/Chol 67:33). La analgesia se prolongó de manera significativa en todos los casos, como era de esperar, pero en el grupo que recibió enfriamiento en el punto de inyección, se prolongó más, hasta 19 horas frente a 13 a 14 horas (Fig. 13).

Para determinar el efecto sobre la temperatura general del cuerpo de este tratamiento, se midió la temperatura rectal en todos los animales enfriados en el punto de inyección (ipsolateral) o sobre el abdomen contralateral, utilizando tanto bupivacaína encapsulada en GMV como bupivacaína (pura) no encapsulada. Estos resultados se ilustran en las Figs. 14A y 14B, respectivamente. En la Fig. 14A, se inició el enfrimiento a las cero horas (con administración) y se interrumpió a las nuevo horas; en la Fig. 14B, se inició el enfriamiento a las cero horas y se interrumpió en una hora. No existieron diferencias significativas observadas en función del punto de enfriamiento. Los animales inyectados con bupivacaína pura y enfriados durante una hora (Fig. 14B) presentaron un retorno retardado a la temperatura corporal normal (aproximadamente 25 a 35 minutos), debido más probablemente a un trastorno de termorregulación inducido por la dosis elevada de bupivacaína. Los animales del grupo GMV (Fig. 14A) retornaron a la temperatura corporal de referencia en aproximadamente 10 minutos tras la interrupción del enfriamiento.

Aunque la analgesia utilizando bupivacaína se demuestra en la presente memoria, estos métodos y composiciones pueden utilizarse también para la carga eficaz y la administración prolongada de otras sustancias, particularmente fármacos anfífilos, débilmente básicos. Dichos fármacos incluyen otros compuestos analgésicos, tales como, por ejemplo, lidocaína o ropivacaína.

Ejemplos Materiales y métodos Ejemplo 1 Determinación por HPLC de la concentración de BUP liposómica

Los liposomas lavados se disolvieron en isopropanol (1:1.000) y se inyectaron alícuotas en una columna de 8 mm \times 100 mm (Radial-Pak bNVCN, 4 \mum, Waters, Milford, MA). Se utilizó una fase móvil de tampón de acetonitrilo:fosfato 75:25) 25 mM, pH 4,0, y se midió la absorción a 210 nm. El tiempo de retención de BUP fue aproximadamente de 4,7 minutos. Se expresaron los resultados (véase las Tablas II y III) en mg/ml.

Ejemplo 2 Evaluación de la eficacia analgésica in vivo

El Institutional Animal Care and Use Committee aprobó todos los experimentos. Se utilizaron ratones Swiss-Webster macho que pesaban 28 ± 3 g. Los animales tuvieron libre acceso al pienso y al agua, y se mantuvieron en un ciclo de oscuridad-luz de 12 horas. Antes del ensayo, se rasuró el pelo que cubría al abdomen. Se evaluó la analgesia utilizando la respuesta al estímulo eléctrico cutáneo. Se utilizó un generador de corriente (modelo S48, Grass Instruments, Quincy, MA) acoplado a una unidad de corriente contínua (modelo PSIU6F, Grass Instruments). Se administró corriente a la superficie de la piel aplicando suavemente dos electrodos formados por agujas del calibre nº 25. Se evaluó el umbral de vocalización antes de la prueba, y se realizó la prueba como se describió anteriormente.

Claims (21)

1. Utilización de una composición liposómica que comprende una sustancia terapéutica para la preparación de una composición farmacéutica destinada a la administración prolongada de dicha sustancia terapéutica, en la que dicha composición puede obtenerse

(i)

incubando una solución que comprende dicha sustancia terapéutica, a un pH que impida la precipitación de dicha sustancia terapéutica en la solución, con una suspensión de liposomas que tiene una concentración de iones amonio mayor dentro de dichos liposomas que fuera de dichos liposomas, y

(ii)

retirar una sustancia terapéutica no encapsulada,

\quad

en la que dichos liposomas son liposomas multivesiculares gigantes (GMV) que pueden obtenerse

(a)

agitando intensamente una película de lípido con una solución acuosa de sulfato amónico,

(b)

homogeneizando la suspensión resultante para formar una suspensión de pequeñas vesículas unilaminares (SUV), y

(c)

congelando y descongelando repetidamente dicha suspensión de SUV en nitrógeno líquido seguido de agua.

2. La utilización de la reivindicación 1, en la que dicho pH es 6 o menos.

3. La utilización de la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha congelación-descongelación se repite al menos cinco veces.

4. La utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha preparación de dicha composición liposómica comprende además concentrar la suspensión liposómica por ultrafiltración o centrifugación.

5. La utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la relación molar de sustancia terapéutica encapsulada a lípido en dicha composición liposómica es al menos 1,0.

6. La utilización según la reivindicación 5, en la que la relación molar de sustancia terapéutica encapsulada a lípido en dicha composición liposómica es al menos 1,5.

7. La utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el punto de administración de dicha composición liposómica debe enfriarse.

8. La utilización según la reivindicación 7, en la que dicho punto debe enfriarse de modo que la temperatura local de la piel es aproximadamente de 22ºC.

9. La utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicha sustancia terapéutica es un fármaco analgésico y la asm prolongada de la misma produce analgesia prolongada.

10. La utilización según la reivindicación 9, en la que dicho fármaco analgésico es la bupivacaína.

11. Un método de preparación de liposomas de GMV, que comprende,

(a)

agitar intensamente una película de lípido con una solución acuosa de sulfato amónico,

(b)

homogeneizar la suspensión resultante para formar una suspensión de pequeñas vesículas unilaminares (SUV), y

(c)

congelar y descongelar repetidamente dicha suspensión de SUV en nitrógeno líquido seguido de agua

\quad

en el que dicha GMV debe cargarse con una sustancia terapéutica que tenga una relación molar de sustancia terapéutica encapsulada a lípido que sea al menos 0,5.

12. El método de la reivindicación 11, en el que dicha congelación-descongalación se repite al menos cinco veces.

13. El método según cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12, que comprende además encapsular una sustancia terapéutica dentro de dichos liposomas, incubando dicha suspensión de GMV con una solución de dicha sustancia terapéutica.

\newpage

14. El método de la reivindicación 13, en el que dicha sustancia terapéutica es débilmente básica y dicha suspensión de liposomas de GMV tiene una concentración mayor de iones amonio dentro de dichos liposomas que fuera de dichos liposomas.

15. El método de la reivindicación 14, en el que dicha sustancia es la bupinacaína, y dicha incubación se realiza a un pH que impide la precipitación de la bupinacaína en la solución.

16. Una composición liposómica que comprende liposomas de GMV, GMV que puede obtenerse

(a)

agitando intensamente una película de lípido con una solución acuosa de sulfato amónico,

(b)

homogeneizar la suspensión resultante para formar una suspensión de pequeñas vesículas unilaminares (SUV), y

(c)

congelar y descongelar repetidamente dicha suspensión de SUV en nitrógeno líquido seguido de agua

\quad

en el que dicha GMV esta destinada a encapsular en la misma una sustancia terapéutica con una relación molar de sustancia terapéutica encapsulada a lípido que sea al menos 0,5.

17. La composición según la reivindicación 16, en la que dicha congelación-descongalación se repite al menos cinco veces.

18. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 16 o 17, que comprende además una sustancia terapéutica encapsulada dentro de dichos liposomas.

19. La composición según la reivindicación 18, en la que dicha sustancia es un fármaco analgésico.

20. La composición según la reivindicación 19, en la que dicho fármaco analgésico es la bupivacaína.

21. Composición según la reivindicación 20, con una relación molar de bupivacaína encapsulada a lípido de al menos 1,5.