ES2284220T3 - Utilizacion de un conjugado de fosfatidil/polipetido para inducir autoinmunidad en el tratamiento de canceres. - Google Patents

Abstract

Utilización de una composición que comprende un conjugado de fosfatidilserina/polipéptido para la preparación de un medicamento destinado a inhibir el crecimiento de células cancerosas o destruir células cancerosas provocando una respuesta inmunitaria con una cantidad inmunológicamente eficaz de dicha composición.

Description

Utilización de un conjugado de fosfatidilserina/polipéptido para inducir autoinmunidad en el tratamiento de cánceres.

1.1 Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente al campo de la oncología. Más particularmente, determinadas realizaciones se refieren a los métodos para preparar y utilizar composiciones conjugadas de lípido-proteína portadora tales como los conjugados de fosfatidilserina (PS) para generar respuestas inmunitarias específicas para lípidos en un animal. También se dan a conocer métodos para preparar composiciones de antígeno y anticuerpo con PS y su utilización en una variedad de aplicaciones terapéuticas, incluyendo la formulación de composiciones farmacéuticas para la prevención y tratamiento de cánceres.

1.2 Descripción de la técnica relacionada

Los resultados de muchos estudios han conducido al concepto de que la asimetría de fosfolípidos de la membrana es omnipresente. La hoja externa de las membranas del plasma eucariótico contiene la mayoría de los colinafosfolípidos, mientras que los aminofosfolípidos están principalmente presentes en la hoja interna de la célula (Devaux, 1991; Schroit y Zwaal, 1991). Aunque la asimetría parece ser la norma para las células normales, la pérdida de lateralidad del lípido de la membrana, en particular el afloramiento de fosfatidilserina (PS) en la superficie celular, produce la expresión de las propiedades superficiales alteradas que modula la función celular e influye en la interacción de las células con su entorno (Zwall y Schroit, 1997). Por ejemplo, la exposición de PS favorece la coagulación y la trombosis por las plaquetas (Bevers et al., 1983; Rosing et al., 1985; Thiagarajan y Tait, 1990) y el reconocimiento de células apoptósicas (Fadok et al., 1992; Bennett et al., 1995; Sambrano y Steinberg, 1995; Verhoven et al., 1995) y viejas (Herrmann y Devaux, 1990; Geldwerth et al., 1993; Connor et al., 1994) por el sistema reticuloendotelial.

Para caracterizar estos y otros procesos relacionados con PS, se requieren nuevas herramientas para determinar las alteraciones fisiológicamente dependientes en la distribución de PS en las membranas celulares. Aunque la aplicación de metodologías bioquímicas clásicas (Gordesky et al., 1975; Schick et al., 1976; Etemadi, 1980; Bevers et al., 1982) ha proporcionado importante información sobre la asimetría de PS, la mayoría de estos métodos son invasivos y destructores. Métodos desarrollados recientemente, tales como el análisis de protrombinasa dependiente de PS (Bevers et al., 1983; Rosing et al., 1980; Van Dieijen et al., 1981) y de fijación a anexina V marcada (Thiagarajan y Tait, 1990; Tait y Gibson, 1994; Vermes et al., 1995; Kuypers et al., 1996), no son invasivos y han proporcionado los medios para evaluar la presencia y la configuración de PS en la hoja externa de las células viables. Estos métodos, sin embargo, requieren la inclusión de varios cofactores del plasma y/o cationes divalentes que pueden influir en la distribución lateral de los lípidos en el plano de la membrana.

Aunque los anticuerpos contra diferentes componentes de la membrana han llegado a ser una ayuda indispensable en el estudio de la estructura y función de la membrana, se ha concedido poca atención a la aplicación de anticuerpos específicos para lípidos para estudiar los procesos dependientes de lípidos. Debido a la dificultad inherente de producir anticuerpos contra pequeños lípidos muy conservados, el desarrollo de anticuerpos lípidos ha progresado lentamente. No obstante, varios laboratorios han producido anticuerpos contra determinadas especies de fosfolípido por inmunización con liposomas (Maneta-Peyret et al., 1988; Maneta-Peyret et al., 1989; Banedi y Alving, 1990) o por absorción de fosfolípidos monoméricos a proteínas (Maneta-Peyret et al., 1989; Tamamura et al., 1971), bacterias (Umeda et al., 1989) y acrilamida (Maneta-Peyret et al., 1988; Maneta-Peyret et al., 1989). Los anticuerpos producidos por estos métodos, sin embargo, pueden interreaccionar con diferentes lípidos (Banedi y Alving, 1990; Umeda et al., 1989) y otros grupos que contienen fosfato (Alving, 1986).

1.3 Carencias en la técnica anterior

Aunque se han desarrollado algunos métodos en estas áreas, de lo que está carente la técnica anterior es de metodologías eficaces para generar respuestas inmunitarias que sean útiles en varios regímenes de tratamiento, incluyendo las específicas para la oncología.

Se han publicado varios informes sobre la producción de anticuerpos de PS. Éstos incluyen métodos y metodologías no relacionados que utilizan liposomas que contienen PS (Benerji y Alving, 1990), Salmonella recubierta con PS (Umeda et al., 1989) y PS ocluida en acrilamida (Umeda et al., 1989). Existe un informe que se refiere a PS acoplada al portador (KLH) (Bate et al., 1993). Sin embargo, la química empleada para preparar el conjugado acopla el lípido al portador de la proteína mediante la amina primaria de los lípidos destruyendo de este modo la especificidad antigénica. La inmunización con este conjugado produjo actividad del anticuerpo que inhibía la producción del factor de necrosis tumoral por eritrocitos infectados por malaria. No se investigó si los anticuerpos tenían alguna especificidad para el lípido. Esto es improbable, sin embargo, considerando que la química de conjugación destruyó la amina primaria clave determinante de la fosfatidilserina. Por lo tanto, existe una necesidad inmediata de un método eficaz de producción de anticuerpos contra PS muy específicos y de respuestas de PS mediadas por células para su utilización en el diagnóstico y tratamiento de varios cánceres y enfermedades relacionadas.

2.0 Compendio de la invención

La presente invención supera uno o más de estos y otros inconvenientes inherentes en la técnica anterior proporcionando la utilización de composiciones para la inducción de una respuesta autoinmunitaria a lípidos tales como PS según las reivindicaciones. Se dan a conocer métodos para la preparación y utilización de nuevas composiciones de antígeno lipídico que generan una respuesta inmunitaria en un animal. Asimismo se dan a conocer métodos para la utilización de composiciones de anticuerpo específico para lípido, incluyendo las específicas para PS, en una variedad de regímenes de diagnóstico y terapéuticos, incluyendo el tratamiento del cáncer.

Los métodos y composiciones a modo de ejemplo preferidos dados a conocer, que se describirán con mayor detalle, incluyen:

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Métodos para inhibir el crecimiento de células cancerosas o destruir células cancerosas, que comprenden provocar una respuesta inmunitaria con una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición que comprende un conjugado de fosfatidilserina/polipéptido;

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Métodos para tratar el cáncer, que comprenden provocar una respuesta inmunitaria con una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición que comprende un conjugado de fosfatidilserina/polipéptido;

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Métodos para tratar el cáncer que comprenden el poner en contacto un sujeto con un lípido o conjugado de lípido/polipéptido eficaz para tratar dicho cáncer;

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Métodos de generar una respuesta inmunitaria, que comprenden administrar a un animal una composición farmacéutica que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un conjugado de fosfatidilcolina/polipéptido o de una composición de conjugado fosfatidilserina/polipéptido;

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Métodos para tratar el cáncer en un animal, que comprenden generar en dicho animal una respuesta inmunitaria a una composición que comprende una fosfatidilserina o un conjugado de fosfatidilserina/polipéptido eficaz para tratar dicho cáncer;

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Métodos de preparación de un anticuerpo que se une específicamente a fosfatidilserina o a un conjugado de fosfatidilcolina/polipéptido o de fosfatidilserina/polipéptido comprendiendo dichos métodos el administrar a un animal una composición farmacéutica que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición de conjugado de fosfatidilcolina/polipéptido o de fosfatidilserina/polipéptido. Actualmente los conjugados preferidos para su utilización en dichos métodos son, por ejemplo, los conjugados de fosfatidilserina/BSA, fosfatidilserina/KLH, fosfatidilserina/BGG y fosfatidilserina/\beta_{2}-glucoproteína I;

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Anticuerpos que se unen específicamente a la fosfatidilserina o a un conjugado de fosfatidilcolina/polipép- tido o de fosfatidilserina/polipéptido, dicho anticuerpo se prepara por un procedimiento que comprende administrar a un animal una composición farmacéutica que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición de conjugado de fosfatidilcolina/polipéptido o de fosfatidilserina/polipéptido. Actualmente los conjugados preferidos para su utilización en dichos procedimientos son, por ejemplo, los conjugados de fosfatidilserina/BSA, fosfatidilserina/KLH, fosfatidilserina/BGG y fosfatidilserina/\beta_{2}-glucoproteína I;

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Métodos para detectar una fosfatidilserina, un conjugado de fosfatidilcolina/polipéptido o de fosfatidilserina/polipéptido en una muestra biológica, que comprenden las etapas siguientes:

(a)

obtener una muestra biológica que se supone que contiene un conjugado de fosfatidilcolina/polipéptido o de fosfatidilserina/polipéptido;

(b)

poner en contacto dicha muestra con un primer anticuerpo que se une a un conjugado de fosfatidilcolina/polipéptido o de fosfatidilserina/polipéptido, en condiciones eficaces que permitan la formación de complejos inmunitarios; y

(c)

detectar los complejos inmunitarios formados de este modo; y

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Kits de inmunodetección que comprenden, en un recipiente adecuado, un anticuerpo que se une específicamente a fosfatidilserina o a un conjugado de fosfatidilserina/polipéptido, y un reactivo de inmunodetección.

En una realización importante, el descubrimiento proporciona composiciones de conjugado PS antigénicas y medios para preparar y utilizar estas composiciones. En el contexto de la presente invención, una composición de PS se entiende que comprende una o más composiciones de fosfatidilserina que son capaces de generar una respuesta inmunitaria en un animal. Se entiende que una composición de anticuerpo PS significa un anticuerpo que es específico para PS. Preferentemente, la composición del antígeno comprende un conjugado lípido-proteína portadora. La proteína portadora puede ser maleimida activada, o alternativamente, puede prepararse por introducción de sulfhidrilos reactivos en la proteína portadora. Alternativamente, se pueden preparar proteínas por interacciones electrostáticas no covalentes entre fosfolípidos aniónicos con carga negativa y proteínas que se unen al lípido tal como \beta_{2}-glucoproteína I, conocida también como apolipoproteína H. Ejemplos de proteínas portadoras contempladas que son útiles en los presentes métodos incluyen varias proteínas portadoras utilizadas habitualmente incluyendo BSA (albúmina de suero bovino), KLH (hemocianina de lapa californiana), BGG (gammaglobulina bovina) y la toxina de la difteria. Como tal, la utilización de una composición de PS de la presente invención se entiende asimismo que comprende la utilización de una o más formulaciones que contienen PS u otras con carga negativa que provocan una respuesta inmunitaria en un animal.

2.1 Composiciones de anticuerpo específico para el lípido

En una realización preferida, la administración de una dosis terapéuticamente eficaz de una composición de antígeno conjugado con lípido, tal como un conjugado de PS a un animal induce en el animal anticuerpos que son específicos para el lípido concreto. En una realización, la proteína portadora es una glucoproteína, tal como \beta_{2}-glucoproteína I.

En determinados aspectos, la presente invención se refiere a la utilización de nuevas composiciones de lípido-antígeno portador que provocan una respuesta inmunitaria específica para el lípido. En particular, se han desarrollado composiciones de antígeno con PS las cuales han demostrado notable utilidad tanto in vitro como in vivo. En particular, se han producido composiciones de antígeno con PS para proporcionar vacuna o composiciones terapéuticas útiles en la prevención o el tratamiento de varios cánceres, tales como linfomas y cánceres renales y de vejiga.

2.2 Métodos para generar una respuesta inmunitaria

Un aspecto adicional del descubrimiento es la preparación de composiciones inmunológicas que comprende respuestas inmunitarias mediadas tanto por el anticuerpo como por las células para métodos de diagnóstico y terapéuticos relacionados con la detección y el tratamiento de una variedad de cánceres y de enfermedades relacionadas.

El descubrimiento también abarca composiciones de antígeno PS y de anticuerpo junto con excipientes, portadores, diluyentes, adyuvantes, farmacéuticamente aceptables y otros componentes, tales como péptidos, antígenos o productos farmacéuticos, en la medida en que pueden emplearse en la formulación de vacunas o de composiciones de anticuerpo concretas.

Los anticuerpos pueden ser de varios tipos incluyendo los producidos en animales donantes heterólogos o voluntarios humanos inmunizados con composiciones de PS, anticuerpos monoclonales (mAbs) resultantes de hibridomas obtenidos de fusiones de linfocitos B procedentes de animales o seres humanos inmunizados con PS con estirpes celulares de mieloma compatibles, denominadas mAb "humanizadas" resultantes de la expresión de fusiones génicas de zonas determinantes combinatorias de genes que codifican mAb procedentes de especies heterólogas con genes que codifican anticuerpos humanos, o fracciones que contienen anticuerpo reactivo con PS de plasma procedente de donantes humanos o animales.

Asimismo se da a conocer un método para generar una respuesta inmunitaria en un animal. El método generalmente implica administrar a un animal una composición farmacéutica que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición de PS dada a conocer en la presente memoria. Los animales preferidos incluyen los mamíferos, y particularmente los seres humanos. Otros animales preferidos incluyen los murinos, bovinos, equinos, ovinos, caprinos, opinos, porcinos, caninos, felinos y similares. La composición puede incluir composiciones de antígeno con PS parcial o significativamente purificadas, y particularmente incluirá una o más de las composiciones de conjugado de PS descritas en la presente memoria.

Por "cantidad inmunológicamente eficaz" se entiende una cantidad de una composición de péptido/lípido que es capaz de generar una respuesta inmunitaria en el animal receptor. Esta incluye tanto la generación de una respuesta al anticuerpo (respuesta al linfocito B), como la estimulación de una respuesta inmunocitotóxica (respuesta al linfocito T). La generación de dicha respuesta inmunitaria tendrá utilidad tanto en la producción de biorreactivos útiles, p. ej., CTL y, más específicamente, anticuerpos reactivos, para su utilización en realizaciones de diagnóstico, como también tendrá utilidad en varias realizaciones profilácticas y terapéuticas.

Las inmunoformulaciones de este descubrimiento, si se destinan a vacunación, tratamiento, o para la generación de anticuerpos útiles en la detección de PS o de otros lípidos pueden comprender composiciones antigénicas de PS naturales o sintéticas producidas utilizando los métodos descritos en la presente memoria. Como tales, los equivalentes antigénicos funcionales de las composiciones de PS concretas descritas en la presente memoria también están comprendidos dentro del alcance del presente descubrimiento. Una proteína o péptido "equivalente antigénicamente funcional" es la que incorpora un epítopo que es inmunológicamente interreactivo con uno o más epítopos procedentes de cualquiera de las composiciones de PS concretas dadas a conocer en la presente memoria. Los equivalentes antigénicamente funcionales, o las secuencias epitópicas y las formulaciones lipídicas, en primer lugar pueden ser diseñadas o previstas y a continuación probadas, o simplemente puede probarse directamente su interreactividad. Asimismo están comprendidos por el descubrimiento los conjugados de PS modificados que presentan antigenicidad mejorada u otras características deseables, y que se producen de modo similar a los descritos en la presente memoria.

En realizaciones adicionales todavía, el presente descubrimiento se refiere a métodos de inmunodetección y kits asociados. Se contempla que las composiciones de antígeno con PS, y particularmente los conjugados de PS, pueden emplearse para detectar anticuerpos que presentan reactividad con éstos, o, alternativamente, anticuerpos preparados según la presente invención, pueden emplearse para detectar células, composiciones, tejidos y similares que contienen PS. Uno de los dos tipos de kit puede utilizarse en la inmunodetección de compuestos, presentes en muestras clínicas. Los kits pueden utilizarse también en purificación de antígeno o anticuerpo, según proceda.

En general, los métodos de inmunodetección preferidos incluirán en primer lugar la obtención de una muestra sospechosa de contener un anticuerpo específico para el lípido, tal como una muestra biológica de un paciente, y poner en contacto la muestra con un primer lípido y/o composición de antígeno conjugado con el lípido en condiciones eficaces que permitan la formación de un inmunocomplejo (completo inmunitario primario). Se detecta a continuación la presencia de cualquier inmunocomplejo primario que se forme.

La puesta en contacto de la muestra seleccionada con la composición de antígeno lipídico en condiciones eficaces para permitir la formación de complejos inmunitarios (primarios) es generalmente una cuestión de añadir simplemente la composición de antígeno a la muestra. A continuación se incuba la muestra durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que los antígenos añadidos formen complejos inmunitarios con cualquier anticuerpo presente en la muestra, es decir, que se unan al mismo. Después de este periodo, la composición de la muestra, tal como una sección de tejido, placa ELISA, transferencia de manchas o transferencia Western, generalmente se lavará para eliminar cualquier especie de antígeno no específicamente unida, permitiendo únicamente que se detecten aquellas especies específicamente unidas en los inmunocomplejos.

La detección de la formación del inmunocomplejo es bien conocida en la técnica y puede conseguirse mediante la aplicación de numerosas estrategias conocidas por los especialistas expertos y descritas en varias publicaciones, tal como, p. ej., Nakamura et al. (1987). La detección de inmunocomplejos primarios se basa generalmente en la detección de una etiqueta o marcador, tal como un marcador radioactivo, fluorescente, biológico o enzimático, con marcas enzimáticas tales como fosfatasa alcalina, ureasa, peroxidasa de rábano picante y glucosa oxidasa son adecuadas. El antígeno específico empleado puede unirse a un marcador detectable, en el que se podría detectar a continuación simplemente este marcador, permitiendo de este modo determinar la cantidad de antígeno unido presente en la composición.

Alternativamente, los complejos inmunitarios primarios pueden detectarse por medio de un segundo ligando de unión que esté unido a un marcador detectable y que tenga afinidad de unión para la primera proteína o péptido. El segundo ligando de unión es el mismo y con frecuencia un anticuerpo, que puede así denominarse un anticuerpo "secundario". Los complejos inmunitarios primarios se ponen en contacto con el ligando de unión secundario, marcado, o con el anticuerpo, en condiciones eficaces y durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la formación de complejos inmunitarios secundarios. Los complejos inmunitarios secundarios se lavan generalmente a continuación para eliminar cualquier anticuerpo secundario marcado no unido específicamente y el marcador unido restante se detecta a continuación.

Para diagnóstico, se propone que puede emplearse prácticamente cualquier muestra sospechosa de contener los anticuerpos de interés. Ejemplos de muestras incluyen las muestras clínicas extraídas de un paciente tales como muestras de sangre o suero, de fluido cerebroespinal, sinovial o broncoalveolar, frotis de oído, muestras de esputo, fluido del oído medio o incluso quizás pueden emplearse muestras de orina. Dichos métodos pueden ser útiles para el diagnóstico y el tratamiento de varios trastornos celulares, y en particular, cánceres y enfermedades relacionadas.

Además, se contempla que dichas realizaciones puedan tener aplicación para muestras no clínicas, tal como en la titulación de muestra de anticuerpo, en la selección de hibridomas y similares. Alternativamente, la muestra clínica puede proceder de fuentes veterinarias y puede incluir animales domésticos tales como vacas, ovejas y cabras. Muestras procedentes de fuentes murina, ovina, opina, caprina, felina, canina y equina pueden utilizarse también según los métodos descritos en la presente memoria.

En las realizaciones relacionadas, la presente invención contempla la preparación de kits que pueden emplearse para detectar la presencia de anticuerpos específicos para PS en una muestra. Generalmente hablando, los kits según la presente invención incluirán un lípido, lípido/proteína o péptido adecuados junto con un reactivo de inmunodetección y un medio para contener el lípido, proteína o péptido y el reactivo.

El reactivo de inmunodetección comprenderá típicamente un marcador asociado a una composición de antígeno con PS, o asociado a un ligando de unión secundario. Ejemplos de ligandos pueden incluir un anticuerpo secundario o una proteína que se une al lípido dirigidos contra la primera composición de antígeno con PS o anticuerpo, o un ligando de biotina o avidina (o estreptavidina) que tenga un marcador asociado. Se contemplan asimismo los marcadores detectables unidos a anticuerpos que tienen afinidad de unión para un anticuerpo humano, p. ej., para los protocolos en los que el primer reactivo es una composición del antígeno con PS que se utiliza para unirse a un anticuerpo reactivo de una muestra humana. Desde luego, como se indicó anteriormente, se conocen numerosos marcadores a título de ejemplo en la técnica y tales marcadores pueden emplearse en relación con la presente invención. Los kits pueden contener antígeno, proteína de unión al lípido o conjugados anticuerpo-marcador bien en forma totalmente conjugada, en forma de intermedios, o como grupos separados para ser conjugados por el usuario del kit.

El recipiente generalmente incluye al menos un vial, tubo de ensayo, matraz, botella, jeringuilla u otro recipiente, en el que pueda colocarse el antígeno, y preferentemente se adapte de forma adecuada. Cuando se proporcione un segundo ligando de unión, el kit también contendrá generalmente un segundo vial u otro recipiente en el que pueda colocarse este ligando o anticuerpo. Los kits de la presente invención incluirán típicamente además un medio para contener los viales en estrecho confinamiento para la comercialización, tales como, p. ej., recipientes para inyección o de plástico moldeado por soplado en el que se conserven los viales deseados.

2.3 Kits y métodos de inmunodetección

Otro aspecto de la invención son los kits de inmunodetección que contienen anticuerpos específicos para el antígeno conjugado con lípido o lípido-portador y reactivos de inmunodetección adecuados tales como un marcador detectable unido a una proteína, péptido o al propio anticuerpo. Alternativamente, el marcador detectable puede estar unido a un segundo anticuerpo que se une a un anticuerpo específico para el lípido como se da a conocer en la presente memoria.

Las realizaciones relacionadas incluyen kits de diagnóstico y terapéuticos que incluyen formulaciones farmacéuticamente aceptables de los anticuerpos, lípidos, lípido/péptido o antígenos peptídicos dados a conocer en la presente memoria. Dichos kits son útiles en la detección de lípidos tal como PS en muestras clínicas, y también útiles para estimular una respuesta inmunitaria en un animal, y en la formulación de composiciones de vacuna eficaces en el tratamiento de una variedad de cánceres.

2.4 Formulación y composiciones de la vacuna

En determinadas realizaciones, el inventor contempla la utilización de composiciones de conjugado lípido-portador para la preparación de vacunas contra el cáncer o regímenes de tratamiento para la administración a un animal, y en particular, a un ser humano. Es de esperar que para conseguir una "formulación inmunológicamente eficaz" puede ser deseable administrar una composición de conjugado lípido-portador, tal como una composición de antígeno PS-portador, al ser humano o animal en una composición farmacéuticamente aceptable que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición de antígeno mezclada con otros excipientes, portadores o diluyentes que puede mejorar o si no alterar la estimulación de respuestas al linfocito B y/o linfocito T, o sales, ácidos orgánicos y bases, carbohidratos, y similares, inmunológicamente inertes que favorece la estabilidad de dichas mezclas. Excipientes inmunoestimulantes, denominados con frecuencia adyuvantes, pueden incluir sales de aluminio (denominadas con frecuencia alúminas), ácidos grasos simples o complejos y compuestos de esterol, aceites fisiológicamente aceptables, carbohidratos poliméricos, toxinas de proteína química o genéticamente modificadas y varias de sus combinaciones en partículas o emulsionadas. Las composiciones de antígeno conjugado con lípido en estas mezclas, o cada variante si está presente más de una, es de esperar que comprendan aproximadamente de 0,0001 a 1,0 miligramos, o más preferentemente aproximadamente de 0,001 a 0,1 miligramos, o aun más preferentemente menos de 0,1 miligramos por dosis.

2.5 Kits terapéuticos y de diagnóstico que comprenden antígenos conjugados con lípidos o composiciones de anticuerpo específicas para lípidos

Un kit terapéutico que comprende, en un recipiente adecuado, uno o más antígeno(s) conjugado(s) con lípidos o una composición o composiciones del anticuerpo de la presente invención en una formulación farmacéuticamente aceptable, representa otro importante aspecto de la invención.

El kit puede comprender un solo recipiente que contiene el/los antígeno(s) conjugado(s) con el lípido o la composición o composiciones del anticuerpo. El recipiente puede, si se desea, contener un excipiente esterilizado farmacéuticamente aceptable, que tenga asociado a él, el/los antígeno(s) conjugado(s) con el lípido o la composición o composiciones del anticuerpo y, opcionalmente, un marcador detectable o agente de diagnóstico por la imagen. La formulación puede estar en forma de una composición gelatinosa (p. ej., una composición de colágeno), polvos, solución, matriz, reactivo liofilizado, o cualquier otro de dichos medios adecuados. En determinados casos, el propio recipiente puede ser una jeringuilla, pipeta u otro de dichos aparatos similares, con los que el/los antígeno(s) conjugado(s) con el lípido o la(s) composición o composiciones de anticuerpo pueden aplicarse a un punto del tejido, tumor, lesión cutánea, área de la herida u otro punto de administración. Sin embargo, el único recipiente puede contener una mezcla anhidra, o liofilizada, de uno o más antígeno(s) conjugado(s) con lípidos o composición o composiciones de anticuerpo, que pueden o no requerir prehumectación antes de su utilización.

Alternativamente, los kits de la invención pueden comprender distintos recipientes para cada componente. En tales casos, uno o más recipientes contendrían cada una de la composición o composiciones PS, ya sea en forma de soluciones, polvos, formas liofilizadas esterilizadas, etc., y el/los otro(s) recipiente(s) incluiría(n) una matriz, solución u otro dispositivo de administración adecuado para aplicar la composición al cuerpo, torrente sanguíneo, o a un punto del tejido, lesión cutánea, célula tumoral, área de la herida u otro punto de administración. Dicho dispositivo de administración puede o no contener una solución, diluyente, matriz gelatinosa, portador esterilizado u otros componentes farmacéuticamente aceptables.

Los kits pueden comprender también un segundo o tercer recipiente para contener un tampón, diluyente o disolvente esterilizado, farmacéuticamente aceptable. Dicha solución puede necesitarse para formular el/los antígeno(s) conjugado(s) con lípido o composición o composiciones de anticuerpo en una forma más adecuada para su aplicación al cuerpo, p. ej., en forma de preparación tópica, o alternativamente en formas orales, parenterales o intravenosas. Debe observarse que, sin embargo, todos los componentes de un kit podrían suministrarse en forma anhidra (liofilizada), que permitiría la "humectación" en contacto con los fluidos corporales. Por lo tanto, la presencia de cualquier tipo de tampón o disolvente farmacéuticamente aceptable no es un requerimiento para los kits de la invención. Los kits pueden también comprender un segundo o tercer recipiente para que contengan un agente de diagnóstico por imagen o composición detectables farmacéuticamente aceptables.

El recipiente generalmente será un recipiente tal como un vial, tubo de ensayo, matraz, botella, jeringuilla u otro recipiente, en el que pueden colocarse los componentes del kit. Sería deseable que los componentes pudieran también estar en alícuotas dentro de recipientes más pequeños. Los kits de la presente invención pueden incluir asimismo un medio que contenga los recipientes individuales en estrecho confinamiento para comercialización, tal como, p. ej., inyección o recipientes de plástico moldeados por soplado en los que se guardan los viales o las jeringuillas deseados.

Con independencia del número de recipientes, los kits de la invención pueden comprender también, o estar envasados con, un instrumento para ayudar a la colocación del conjugado lípido-portador, o anticuerpos reactivos con éstos, en el cuerpo de un animal. Dicho instrumento puede ser una jeringuilla, aguja, instrumento quirúrgico, pipeta, fórceps o cualquier vehículo para administración aprobado sanitariamente.

2.6 Composiciones de anticuerpo y sus formulaciones

Como se describió anteriormente, una importante realización de la invención es la formulación de anticuerpos específicos para lípidos que son útiles para detectar y tratar varios cánceres en un animal, y en particular, en un ser humano. Los medios para preparar y caracterizar anticuerpos son bien conocidos en la técnica (véase, p. ej., Harlow y Lane (1988). Los métodos para generar mAb generalmente comienzan a lo largo de las mismas líneas que los que sirven para preparar anticuerpos policlonales. En resumen, se prepara un anticuerpo policlonal inmunizando un animal con una o más composiciones de lípido-proteína portadora, dadas a conocer en la presente memoria y extrayendo antisuero de este animal inmunizado. Puede utilizarse un intervalo amplio de especies animales para la producción de antisueros. Típicamente el animal utilizado para la producción de anti-antisuero es un conejo, un ratón, una rata, un hámster, un cobaya o una cabra. Debido al volumen de sangre relativamente grande de los conejos, una elección preferible es un conejo para la producción de anticuerpos policlonales.

Como es bien conocido en la técnica, una composición dada puede variar en su inmunogenicidad. Con respecto a la preparación de anticuerpos específicos para el lípido, es necesario reforzar el sistema inmunitario del hospedador, y puede conseguirse acoplando el lípido de interés, tal como PS, a un portador. Como se describió anteriormente, los portadores a modo de ejemplo y preferidos incluyen portadores polipeptídicos tales como KLH, BSA y \beta_{2}-glucoproteína I. Pueden también utilizarse como portadores otras albúminas tales como ovoalbúmina, albúmina de suero de ratón o albúmina de suero de conejo, así como gammaglobulina bovina y/o vacuna contra la difteria. Aunque son bien conocidos en la técnica los medios para conjugar lípidos a una proteína portadora, en la presente memoria se dan a conocer dos métodos de síntesis específicos que han sido particularmente útiles en la preparación de formulaciones de anticuerpo covalentes específicas para el lípido.

Los mAb pueden prepararse fácilmente mediante la utilización de técnicas bien conocidas, tales como las ejemplificadas en la patente U.S. nº 4.196.265. Típicamente, esta técnica implica la inmunización de un animal adecuado con una composición inmunógena seleccionada. La composición de inmunización se administra de manera eficaz para estimular las células productoras de anticuerpos. Los roedores tales como ratones y ratas son los animales preferidos, sin embargo, también es posible la utilización de conejos, ovejas o células de rana. La utilización de ratas puede proporcionar determinadas ventajas (Goding, 1986), pero se prefieren ratones, siendo el ratón BALB/c el más preferido ya que éste es el utilizado de forma más rutinaria y generalmente proporciona un porcentaje mayor de fusiones estables.

Tras la inmunización, las células somáticas con potencial para producir anticuerpos, específicamente linfocitos B (células B), se seleccionan para su utilización en el protocolo de generación de mAb. Estas células pueden extraerse de bazos, amígdalas o ganglios linfáticos mediante biopsia o de una muestra de sangre periférica. Las células de bazo y las células de la sangre periférica son las preferidas, las anteriores debido a que son una fuente rica de células productoras de anticuerpos que están en la etapa de plasmablasto en división, y la última debido a que la sangre periférica es fácilmente accesible. Con frecuencia, un panel de animales habrá sido inmunizado y el bazo del animal con el título de anticuerpo mayor se extraerá y los linfocitos del bazo se obtendrán homogeneizando el bazo con una jeringuilla. Típicamente, un bazo de un ratón inmunizado contiene aproximadamente de 5 \times 10^{7} a aproximadamente 2 \times 10^{8} linfocitos.

Los linfocitos B que producen anticuerpos de un animal inmunizado se fusionan a continuación con las células de una célula de mieloma inmortalizada, generalmente una de las mismas especies que el animal que fue inmunizado. Las estirpes celulares de mieloma adecuadas para su utilización en los procedimientos de fusión que producen hibridoma preferentemente no son productoras de anticuerpos, tienen gran eficacia de fusión y carencias de enzimas que las hacen incapaces de desarrollarse en determinados medios selectivos que soportan el crecimiento de solamente las células fusionadas deseadas (hibridomas).

Puede utilizarse cualquiera de las numerosas células de mieloma, tal como son conocidas por los expertos en la materia (Goding, 1986; Campbell, 1984). Por ejemplo, cuando el animal inmunizado es un ratón, se puede utilizar P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XX0 Bul; para ratas, se puede utilizar R210.RCY3, Y2-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210; y U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6 son también útiles junto con las fusiones de células humanas.

Una célula de mieloma murino preferida es la estirpe celular de mieloma NS-1 (denominada también P3-NS-1-Ag4-1), que está fácilmente disponible en la Central de depósito de células mutantes genéticas humanas NIGMS solicitando el número GM3573 de depósito de estirpe celular. Otra estirpe celular de mieloma de ratón que puede utilizarse es la estirpe celular SP2/0 no productora de mieloma murino de ratón resistente a 8-azaguanina.

Los métodos para generar híbridos de células de bazo o de ganglio linfático productoras de anticuerpo y de células de mieloma normalmente comprenden el mezclado de las células somáticas con células de mieloma en una proporción 2:1, aunque la proporción puede variar desde aproximadamente 20:1 hasta aproximadamente 1:1, respectivamente, en presencia de un agente o agentes (químicos o eléctricos) que favorece la fusión de membranas celulares. Se han descrito (Kohler y Milstein, 1975; 1976), métodos de fusión que utilizan virus Sendai y los que utilizan polietilenglicol (PEG), tal como 37% (vol./vol.) de PEG, por Gefter et al. (1977). La utilización de métodos de fusión inducidos eléctricamente es también apropiada (Goding, 1986).

Los procedimientos de fusión normalmente producen híbridos viables a bajas frecuencias, aproximadamente 1 \times 10^{-6} a aproximadamente 1 \times 10^{-8}. Sin embargo, esto no plantea ningún problema, ya que los híbridos fusionados y viables se diferencian de las células no fusionadas y parentales (particularmente las células de mieloma no fusionadas que continuarían normalmente dividiéndose de forma indefinida) cultivando en un medio selectivo. El medio selectivo es generalmente el que contiene un agente que bloquea la síntesis de novo de los nucleótidos en el medio de cultivo tisular. Agentes a modo de ejemplos y preferidos son aminopterina, metotrexato y azaserina. La aminopterina y el metotrexato bloquean de novo la síntesis tanto de purinas como de pirimidinas, mientras que la azaserina bloquea solamente la síntesis de purinas. Cuando se utiliza aminopterina o metotrexato, el medio está enriquecido con hipoxantina y timidina como fuente de nucleótidos (medio HAT). Cuando se utiliza azaserina, el medio está enriquecido con hipoxantina.

El medio de selección preferido es HAT. Únicamente las células capaces de operar las series de reacciones de rescate de nucleótidos son capaces de sobrevivir en un medio HAT. Las células de mieloma carecen de enzimas clave de la serie de reacciones de rescate, p. ej., hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT) y no pueden sobrevivir. Los linfocitos B pueden operar esta serie de reacciones, pero tienen una vida limitada en el cultivo y generalmente mueren al cabo de aproximadamente dos semanas. Por consiguiente, las únicas células que pueden sobrevivir en el medio selectivo son las híbridas formadas a partir de mieloma y de linfocitos B.

Este cultivo proporciona una población de hibridomas a partir de la cual se seleccionan los hibridomas específicos. Típicamente, la selección de hibridomas se realiza cultivando las células por dilución de un solo clon en placas de microvaloración, seguido de experimentación de la reactividad deseada en cada uno de los sobrenadantes clónicos (después de aproximadamente dos a tres semanas). El ensayo debería ser sensible, sencillo y rápido, tales como radioinmunoanálisis, inmunoanálisis enzimático, análisis de citotoxicidad, análisis en placa, análisis de inmunounión de manchas y similares.

Los hibridomas seleccionados se diluirían en serie a continuación y se clonarían en cada una de las estirpes celulares productoras de anticuerpos, cuyos clones pueden propagarse a continuación indefinidamente para proporcionar los mAb. Las estirpes celulares pueden aprovecharse para la producción de mAb de dos formas básicas. Puede inyectarse una muestra de hibridoma (con frecuencia en la cavidad peritoneal) en un animal histocompatible del tipo que se utilizó para proporcionar las células somáticas y de mieloma para la fusión original. El animal inyectado desarrolla tumores que segregan el mAb específico producido por el híbrido celular fusionado. Los fluidos corporales del animal, tales como suero o fluido de ascitis, pueden a continuación golpearse ligeramente para proporcionar los mAb en gran concentración. Cada una de las estirpes celulares puede también cultivarse in vitro, cuando los mAb se segreguen de forma natural en el medio de cultivo a partir del cual pueden obtenerse fácilmente en grandes concentraciones. Los mAb producidos por uno de los dos medios pueden purificarse más, si se desea, utilizando filtración, centrifugación y varios métodos cromatográficos tales como HPLC o cromatografía por afinidad.

3.0 Breve descripción de los dibujos

Los dibujos forman parte de la presente memoria y se incluye para demostrar más determinados aspectos de la presente invención. La invención puede comprenderse mejor con relación a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas presentadas en la presente memoria.

Fig. 1. Método B de síntesis para producir conjugados antigénicos PS-portador. SPDP-PS se "desbloquea" con (tris[2-carboxietil]fosfina HCl) para proporcionar un sulfhidrilo libre que se acopla directamente a continuación a proteínas portadoras activadas por maleimida.

Fig. 2. Método A de síntesis para producir conjugados antigénicos del conjugado PS-portador. Se aciló NH_{2}-PC con SPDP, se transformó en el derivado PS con fosfolipasa D y se acopló por intercambio tiol-disulfuro a la proteína portadora.

Fig. 3A. Reactividad del antisuero PS de conejo con fosfolípidos. Se recubrieron placas de microvaloración con 6 \mug de lípido. Se cuantificó la IgG unida por ELISA con Ig anti-conejo de cabra conjugada con peroxidasa. Unión de referencia, preinmunitario (\medcirc) y antisuero (\medbullet) a placas recubiertas con PS.

Fig. 3B. Reactividad del antisuero PS de conejo con fosfolípidos. Se recubrieron placas de microvaloración con 6 \mug de lípido. Se cuantificó la IgG unida por ELISA con Ig anti-conejo de cabra conjugada con peroxidasa. Unión de antisuero con PS a placas de poliestireno recubiertas con DOPE (\blacksquare), PA (\ding{115}), PG (\ding{116}) y PC (\blacklozenge).

Fig. 3C. Reactividad del antisuero PS de conejo con fosfolípidos. Se recubrieron placas de microvaloración con 6 \mug de lípido. Se cuantificó la IgG unida por ELISA con Ig anti-conejo de cabra conjugada con peroxidasa. Unión de antisuero con PS a placas de poliestireno recubiertas con PS//PC (1/1) (\medbullet) y DOPE/PC (1/1) (\blacksquare).

Fig. 4A. Inhibición de la unión del suero inmunitario con análogos y vesículas solubles del grupo principal. Los ensayos de fijación mostrados en la Fig. 3 se realizaron en placas recubiertas con PS en presencia de glicerofosfoserina (GPS), fosfoserina (PhoS), serina (S), glicerofosfoetanolamina (GPE), fosfoetanolamina (PhoE) y etanolamina (E) a las concentraciones indicadas.

Fig. 4B. Inhibición de la unión del suero inmunitario con análogos y vesículas solubles del grupo principal. Los ensayos de fijación mostrados en la Fig. 3 se realizaron en placas recubiertas con DOPE en presencia de GPE y PhoE a las concentraciones indicadas.

Fig. 4C. Inhibición de la unión del suero inmunitario con análogos y vesículas solubles del grupo principal. Se evaluó la unión del anticuerpo en placas recubiertas con PS y DOPE en presencia de vesículas tratadas con ultrasonidos (0,5 mg/ml) que contenían PS (PS/PC,1/1), DOPE (PE/PC,1/1) y PC.

Fig. 5. Inhibición de la actividad de protrombinasa. Se evaluó la actividad de protrombinasa en presencia de vesículas preincubadas que contenían PS con los sueros indicados. Se interrumpió la reacción en varios puntos de tiempo con EDTA y se evaluó la producción de trombina determinando las cantidades iniciales de escisión del sustrato cromógeno dependiente de la trombina. Estas cantidades se representaron en ordenadas frente al tiempo de incubación. Suero preinmunitario (\medcirc), antisuero (\medbullet).

Fig. 6A. Microscopía de fluorescencia y análisis por citometría de flujo de glóbulos rojos (RBC) tratados con anti-PS. Se incubaron RBC tratados con papaína durante 1 h con A23187 (5 \muM) y Ca^{2+} (1 mM) seguido de marcado con el antisuero e IgG anti-conejo conjugado con fluoresceína. Fotomicrografías de fase de RBC que expresan PS marcado con anticuerpo.

Fig. 6B. Microscopía de fluorescencia y análisis por citometría de flujo de glóbulos rojos tratados con anti-PS. Se incubaron RBC tratados con papaína durante 1 h con A23187 (5 \muM) y Ca^{2+} (1 mM) seguido de marcado con el antisuero e IgG anti-conejo conjugado con fluoresceína. Fotomicrografías de fluorescencia de RBC que expresan PS marcado con anticuerpo.

Fig. 6C. Microscopía de fluorescencia y análisis por citometría de flujo de RBC tratados con anti-PS. Se incubaron RBC tratados con papaína durante 1 h con A23187 (5 \muM) y Ca^{2+} (1 mM) seguido de marcado con el suero de referencia e IgG anti-conejo conjugado con fluoresceína. Análisis de citometría de flujo de RBC que expresan PS con suero de referencia.

Fig. 6D. Microscopía de fluorescencia y análisis por citometría de flujo de RBC tratados con anti-PS. Se incubaron RBC tratados con papaína durante 1 h con A23187 (5 \muM) y Ca^{2+} (1 mM) seguido de marcado con antisuero e IgG anti-conejo conjugado con fluoresceína. Análisis de citometría de flujo de RBC que expresan PS con antisuero.

Fig. 7. Se inocularon por vía subcutánea (s.c.) ratones C57B1/6 con células EG7 de linfoma que expresan a PS (determinada por la capacidad de las células a teñirse con el reactivo específico para PS, anexina V conjugada con fluoresceína). Los ratones se clasificaron en grupos de tratamiento (6 a 8 animales/grupo) cuando los tumores oscilaban en tamaños entre aproximadamente 75 a 100 mm^{3} en cuyo momento se inició la inmunización. Los ratones con tumor se inmunizaron con una sola inyección de Provax el día 8 con 100 \mug de conjugado PS-KLH o PS-BSA. Los retrasos en el desarrollo del tumor oscilaron entre 38 días para el grupo con PS-BSA y 20 días para el grupo con PS-KLH.

4.0 Descripción de realizaciones ilustrativas 4.1 Cromatografía por afinidad

La cromatografía por afinidad se basa generalmente en el reconocimiento de una proteína por una sustancia tal como un ligando o un anticuerpo. El material de la columna puede sintetizarse por acoplamiento con enlace covalente a una molécula de fijación, tal como un colorante activado por ejemplo a una matriz insoluble. El material de la columna se deja que adsorba a continuación la sustancia deseada de la solución. A continuación, se cambian las condiciones a aquellas en las que la fijación no tiene lugar y se eluye el sustrato. Los requisitos para la cromatografía de afinidad con éxito son:

1)

que la matriz debe adsorber específicamente las moléculas de interés;

2)

que otros contaminantes permanezcan sin adsorberse;

3)

que el ligando debe acoplarse sin alterar su actividad de fijación;

4)

que el ligando debe unirse firmemente a la matriz; y

5)

que debe ser posible eluir las moléculas de interés sin destruirlas.

Una realización preferida de la presente invención es un método de cromatografía por afinidad para la purificación de anticuerpos de la solución en el que la matriz contiene un lípido tal como PS, o una composición de antígeno conjugado con el lípido, tal como un conjugado PS-proteína, acoplado con enlace covalente a una matriz tal como Sheparose CL6B o CL4B. Dicha matriz se une a los anticuerpos específicos para PS de la presente invención directamente y permite separación por elución con un gradiente apropiado tal como sal, GuHCl, pH o urea. Otra realización preferida de la presente invención es un método de cromatografía por afinidad para la purificación de composiciones de la solución de antígeno conjugado con el lípido. En tales métodos, la matriz comprendería anticuerpos que se unen específicamente a las composiciones de antígeno conjugado con el lípido de la presente invención directamente, permitiendo de este modo su separación por elución con un tampón adecuado como se describió anteriormente.

4.2 Liposomas y nanocápsulas

En determinadas realizaciones, el inventor contempla la utilización de liposomas y/o nanocápsulas para la introducción de antígenos o anticuerpos específicos en las células huésped. Dichas formulaciones pueden ser preferidas para la introducción de formulaciones farmacéuticamente aceptables de los conjugados de lípido-polipéptido portador y/o anticuerpos dados a conocer en la presente invención. La formación y utilización de liposomas es conocida generalmente por los expertos en la materia (véase por ejemplo, Couvreur et al., 1977 que describe la utilización de liposomas y nanocápsulas en la terapia con antibiótico dirigido de infecciones y enfermedades bacterianas intracelulares). Más recientemente, se desarrollaron liposomas con estabilidad del suero y vidas medias de circulación mejoradas (Gabizon y Papahadjopoulos, 1988; Allen y Choun, 1987).

En otra realización de la invención, la composición PS/polipéptido puede estar ocluída en un liposoma. Los liposomas son estructuras vesiculares caracterizadas por una membrana bicapa de fosfolípido y un medio acuoso interno. Los liposomas multilaminares tienen múltiples capas de lípido separadas por el medio acuoso. Se forman espontáneamente cuando los fosfolípidos se ponen en suspensión en un exceso de solución acuosa. Los componentes del lípido experimentan autorredistribución antes de la formación de las estructuras cerradas y atrapan agua y solutos disueltos entre las bicapas de lípido (Ghosh y Bachhawat, 1991).

Las nanocápsulas pueden atrapar generalmente compuestos de manera estable y reproducible (Henry-Michelland et al., 1987). Para evitar los efectos secundarios debido a la sobrecarga polimérica intracelular, dichas partículas ultrafinas (de tamaño alrededor de 0,1 \mum) deberían diseñarse utilizando polímeros capaces de ser degradados in vivo. Las nanopartículas de polialquil-cianoacrilato biodegradables que reúnen estos requisitos se contemplan para su utilización en la
presente invención, y dichas partículas pueden prepararse fácilmente, como se describe (Couvreur et al., 1977; 1988).

4.3 Métodos para preparar anticuerpos específicos para el lípido

En otro aspecto, la presente invención contempla un anticuerpo que es inmunorreactivo con un lípido tal como PS. Como se indicó anteriormente, una de las utilizaciones para las composiciones del antígeno conjugado lípido-portador según la presente invención consiste en generar anticuerpos. La referencia a los anticuerpos en toda la memoria incluye todos los anticuerpos policlonales y monoclonales (mAb) y partes de los mismos, bien solos o conjugados con otros grupos. Las partes de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab y F(ab)_{2} y anticuerpos con una sola cadena. Los anticuerpos pueden prepararse in vivo en animales de laboratorio adecuados o in vitro utilizando técnicas de ADN recombinante. En una realización preferida, un anticuerpo es un anticuerpo policlonal.

En resumen, se prepara un anticuerpo policlonal inmunizando un animal con un inmunógeno que comprende un lípido-polipéptido de la presente memoria y extrayendo antisuero de este animal inmunizado. Puede utilizarse una amplia gama de especies animales para la producción de antisueros. Típicamente un animal utilizado para la producción de anti-antisuero es un conejo, un ratón, una rata, un hámster o un cobaya. Debido al volumen de sangre relativamente grande de los conejos, un conejo es una elección preferible para la producción de anticuerpos policlonales.

Pueden prepararse anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales, específicos para lípidos tales como PS utilizando técnicas de inmunización convencionales, como son generalmente conocidas por los expertos en la materia. Una composición que contiene composiciones de antígeno de lípido descritas en la presente memoria puede utilizarse para inmunizar uno o más animales experimentales, tal como un conejo o un ratón, que a continuación procederán a producir anticuerpos específicos contra lípidos tal como PS. Pueden obtenerse antisueros policlonales después de dejar tiempo para la generación del anticuerpo, simplemente extrayendo sangre del animal y preparando muestras de suero de sangre completa.

La cantidad de composición de inmunógeno utilizada en la producción de anticuerpos policlonales varía según la naturaleza del inmunógeno, así como del animal utilizado para la inmunización. Pueden utilizarse una variedad de vías para administrar el inmunógeno (subcutánea, intramuscular, intradérmica, intravenosa e intraperitoneal). La producción de anticuerpos policlonales puede controlarse tomando muestras de sangre del animal inmunizado en varios puntos tras la inmunización. Asimismo puede suministrarse una segunda inyección de refuerzo. El procedimiento de refuerzo y titulación se repite hasta que se consigue un título adecuado. Cuando se obtiene un nivel deseado de inmunogenicidad, puede extraerse sangre del animal inmunizado y aislarse y almacenar el suero aislado, y/o puede utilizarse el animal para generar los mAb (a continuación).

Una de las características importantes proporcionadas por la presente invención es un suero policlonal que es relativamente homogéneo con respecto a la especificidad de los anticuerpos en la presente memoria. Típicamente, el antisuero policlonal procede de una variedad de "clones" diferentes, es decir, linfocitos B de estirpe diferente. Los mAb, en cambio, se definen como que proceden de células productoras de anticuerpo con un linfocito B progenitor, de ahí su "mono" clonalidad.

Para obtener los mAb, se inmunizaría también inicialmente un animal experimental, con frecuencia preferentemente un ratón, con una composición que contiene el conjugado lípido-proteína portadora. Se obtendría a continuación, después de un periodo de tiempo suficiente que permita la generación del anticuerpo, una población de esplenocitos o linfocitos del animal. Los esplenocitos o linfocitos pueden fusionarse a continuación con las estirpes celulares, tal como cepas de mieloma humanas o de ratón para producir hibridomas que segregan anticuerpo. Estos hibridomas pueden aislarse para obtener clones individuales que pueden identificarse a continuación para la producción de anticuerpo contra el péptido deseado.

Tras la inmunización, se eliminan y se fusionan los esplenocitos, utilizando un protocolo de fusión normalizado con células de plasmacitoma para producir hibridomas que segregan los mAb contra las composiciones de antígeno. Los hibridomas que producen los mAb contra los antígenos seleccionados se identifican utilizando técnicas normalizadas, tales como ELISA y métodos de transferencia Western. Los clones de hibridoma pueden cultivarse a continuación en medio líquido y los sobrenadantes del cultivo purificarse para proporcionar los mAb específicos para el lípido.

Se propone que los mAb de la presente invención encuentren también aplicación útil en procedimientos inmunoquímicos, tales como los métodos ELISA y transferencia Western, así como otros procedimientos tales como los métodos de inmunoprecipitación, inmunocitológicos, etc. que pueden utilizar anticuerpos específicos para lípidos tal como PS. En particular, pueden utilizarse anticuerpos específicos para el lípido en protocolos inmunoabsorbentes o de afinidad como se describió anteriormente para purificar composiciones que contienen el lípido. La operación de todas las técnicas inmunológicas dichas es conocida por los expertos en la materia a la luz del presente descubrimiento.

4.4 Inmunoanálisis

Como se observa, se propone que las composiciones de conjugado lípido-portador encuentren utilidad como inmunógenos, p. ej., en relación con el desarrollo de la vacuna, o como antígenos en inmunoanálisis para la detección de anticuerpos reactivos. Volviendo en primer lugar al inmunoanálisis, en su más simple y directo sentido, los inmunoanálisis preferidos de la invención incluyen varios tipos de ensayos inmunosorbentes con enzima ligada (ELISA), como son conocidos por los expertos en la materia. Sin embargo, se apreciará fácilmente que la utilidad de las composiciones de conjugado lípido-portador no se limita a dichos ensayos, y que otras realizaciones útiles incluyen las RIA y otros ensayos y procedimientos de fijación del anticuerpo sin enzima ligada.

En los ensayos ELISA preferidos, las proteínas o péptidos que incorporan composiciones de conjugado lípido-portador se inmovilizan en una superficie seleccionada, preferentemente una superficie que presenta una afinidad por la proteína, tal como los pocillos de una placa de microvaloración de poliestireno. Después de lavar para eliminar de manera incompleta el material adsorbido, se desearía generalmente a continuación unir o cubrir el pocillo con una proteína no específica que es conocida por ser antigénicamente neutra con respecto a los antisueros de la prueba, tal como albúmina de suero bovino (BSA) o caseína. Esto permite el bloqueo de puntos de adsorción no específicos sobre la superfi-
cie de inmovilización y de este modo reduce el fondo producido por la unión no específica de antisuero en la superficie.

Después de la unión del material antigénico al pocillo, el recubrimiento con un material no reactivo para reducir el fondo y lavado para eliminar el material no unido, la superficie de inmovilización se pone en contacto con el antisuero o el extracto clínico o biológico para ser analizada de manera conducente a la formación de complejo inmunitario (antígeno/anticuerpo). Dichas condiciones incluyen preferentemente la dilución del antisuero con diluyentes tales como BSA, gammaglobulina bovina (BGG) y solución salina tamponada con fosfato (PBS)/Tween®. Estos agentes añadidos tienden también a ayudar en la reducción del fondo no específico. Los antisueros estratificados se dejan incubar a continuación durante, p. ej. de 2 a 4 horas, a temperaturas preferentemente del orden de aproximadamente 25º a aproximadamente 27ºC. Después de la incubación, la superficie en contacto con el antisuero se lava a fin de eliminar el material no inmunoacomplejado. Un procedimiento de lavado preferido incluye el lavado con una solución tal como PBS/Twenn®, o tampón borato.

Después de la formación de inmunocomplejos específicos entre la muestra de ensayo y la composición de conjugado lípido-portador unido, y ulterior lavado, puede determinarse la aparición y la cantidad de formación de inmunocomplejo sometiendo el complejo a un segundo anticuerpo con especificidad para el primero. Desde luego, en éste la muestra de ensayo será típicamente de origen humano, el segundo anticuerpo será preferentemente un anticuerpo con especificidad para anticuerpos humanos. Para proporcionar un medio de detección, el segundo anticuerpo preferentemente tendrá un marcador detectable asociado, tal como un marcador enzimático, que generará una señal, tal como desarrollo de color en el momento de la incubación con un sustrato cromógeno apropiado. Así, por ejemplo, se deseará poner en contacto e incubar la superficie unida al anticuerpo con una IgG anti-humana conjugada con ureasa o peroxidasa durante un periodo de tiempo y en condiciones que favorezcan el desarrollo de la formulación del inmunocomplejo
(p. ej., incubación durante 2 horas a temperatura ambiente en una solución que contenga PBS tal como PBS-Tween®).

Después de la incubación con el segundo anticuerpo activado por enzima, y después del lavado para eliminar el material no ligado, la cantidad de marcador se cuantifica por incubación con un sustrato cromógeno tal como urea y púrpura de bromocresol o ácido 2,2'-azino-di-(3-etil-benzotiazolina)-6-sulfónico (ABTS) y H_{2}O_{2}, en el caso de peroxidasa como marcador enzimático. La cuantificación se consigue a continuación midiendo el grado de generación de color, p. ej., utilizando un espectrofotómetro de espectro visible.

Pueden utilizarse los ensayos ELISA junto con la invención. En uno de dichos ensayos ELISA, las proteínas o péptidos que incorporan secuencias antigénicas o grupos de la presente invención se inmovilizan sobre una superficie seleccionada, preferentemente una superficie que presenta una afinidad por la proteína, tal como los pocillos de una placa de microvaloración de poliestireno. Después de lavar para eliminar de manera incompleta el material adsorbido, es deseable unir o cubrir los pocillos de la placa de ensayo con una proteína no específica que es conocida por ser antigénicamente neutra con respecto a los antisueros de la prueba, tal como albúmina de suero bovino (BSA), caseína o soluciones de leche en polvo. Esto permite el bloqueo de puntos de adsorción no específicos sobre la superficie de inmovilización y de este modo reduce el fondo producido por la unión no específica de antisuero en la superficie.

4.5 Inmunoprecipitación

Los anticuerpos específicos para el conjugado lípido-portador son particularmente útiles para el aislamiento de las composiciones que contienen lípido por inmunoprecipitación. La inmunoprecipitación implica la separación del componente del antígeno diana de una mezcla compleja, y se utiliza para eliminar o aislar cantidades diminutas de proteína. Para el aislamiento de las composiciones localizadas en la superficie celular, tales como PS, estas composiciones pueden solubilizarse en la célula por tratamiento con enzimas, o alternativamente, en micelas de detergente. Se prefieren las sales no iónicas, ya que otros agentes tales como las sales biliares, precipitan a pH ácido o en presencia de cationes bivalentes.

En una realización alternativa los anticuerpos de la presente invención son útiles para la yuxtaposición próxima de dos antígenos. Esto es particularmente útil para aumentar la concentración localizada de antígenos, p. ej., pares enzima-sustrato.

4.6 Transferencias Western

Las composiciones de antígeno lípido y de anticuerpo específico para el lípido del presente descubrimiento encuentran mucha utilización en una variedad de análisis de inmunotransferencia y transferencia Western. Por ejemplo, pueden utilizarse anticuerpos específicos para PS como reactivos primarios de gran afinidad para la identificación de composiciones que contienen PS inmovilizadas sobre una matriz con soporte sólido, tal como nitrocelulosa, nilón o sus combinaciones. Junto con la inmunoprecipitación, seguida de electroforesis en gel, éstos pueden utilizarse como reactivo de una sola etapa para la detección de antígenos contra los que los reactivos secundarios utilizados en la detección del antígeno producen un fondo desfavorable. Los métodos de detección basados en inmunología junto con transferencia Western (que incluyen anticuerpos secundarios activados por enzimas, radiomarcados o por fluorescencia contra el grupo de la toxina) se considera que son de particular utilización a este respecto.

4.7 Composiciones de PS para el tratamiento del cáncer

El mantenimiento de una distribución concreta del equilibrio de la bicapa de lípido, en particular la conservación de PS en la hoja interna de la célula, es una propiedad característica de las células normales y maduras. Si el sistema de transposición se llega a alterar, tal como en las células tumorales, aparece PS en la superficie de la célula y provoca consecuencias funcionales considerables.

El inventor contempla que las composiciones de PS descritas en la presente memoria pueden utilizarse para la prevención o el tratamiento de esencialmente cualquier trastorno que se caracterice por la presencia de PS sobre la superficie de la célula. Los cánceres que presentan dicha característica pueden incluir los de cerebro, pulmones, hígado, bazo, riñón, vejiga, ganglio linfático, intestino delgado, páncreas, células sanguíneas, colon, estómago, mama, endometrio, próstata, testículos, ovarios, piel, cráneo y cuello, esófago o médula ósea. En las realizaciones preferidas, las células cancerosas proceden de riñón, vejiga, ganglios linfáticos o médula ósea.

4.8 Composiciones farmacéuticas

En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en la presente memoria pueden administrarse por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o con un portador comestible asimilable, o pueden estar contenidas en una cápsula de gelatina con carcasa dura o blanda, o pueden estar comprimidas en comprimidos, o pueden incorporarse directamente con el alimento de la dieta. Para la administración oral terapéutica, los compuestos activos pueden incorporarse con excipientes y utilizarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, tabletas, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Dichas composiciones y preparaciones deberían contener al menos 0,1% de compuesto activo. El porcentaje de las composiciones y preparaciones puede, desde luego, variarse y puede estar convenientemente entre aproximadamente 2 y aproximadamente 60% del peso de la unidad. La cantidad de compuestos activos en dichas composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtenga una dosis adecuada.

Los comprimidos, tabletas, píldoras, cápsulas y similares pueden contener también lo siguiente: un aglutinante, tales como goma de tragacanto, acacia, almidón de maíz o gelatina; excipientes, tal como fosfato dicálcico; un agente disgregador, tales como almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico y similares; un lubricante, tal como estearato de magnesio; y un agente edulcorante, tales como sacarosa, lactosa o sacarina puede añadirse o un agente saborizante, tal como menta, aceite de gualteria o saborizante de cereza. Cuando la forma unitaria de dosificación es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un portador líquido. Varios otros materiales pueden estar presentes como recubrimientos o modificar de otra manera la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, comprimidos, píldoras o cápsulas pueden recubrirse con goma laca, azúcar o ambos. Un jarabe de elixir puede contener los compuestos activos sacarosa como agente edulcorante metil y propil parabenos como conservantes, un colorante y un saborizante, tal como con sabor a cereza o naranja. Desde luego, cualquier material utilizado en la preparación de cualquier forma de unidad de dosificación debe ser farmacéuticamente puro y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, los compuestos activos pueden incorporarse en la preparación y formulaciones de liberación lenta.

Alternativamente, en algunas realizaciones, puede ser deseable administrar las composiciones de antígeno o anticuerpo descubiertas ya sea por vía intravenosa, parenteral o intraperitoneal. Las soluciones de los compuestos activos en forma de base libre o de sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua mezclada de forma adecuada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Pueden prepararse también dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de éstos y en aceites. En las condiciones ordinarias de almacenamiento y utilización, estas preparaciones contienen un conservante para impedir el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para utilización inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación improvisada de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista fácil inyectabilidad. Debe ser estable en condiciones de preparación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de los microorganismos, tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), sus mezclas adecuadas y aceites vegetales. Puede mantenerse la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante la utilización de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante la utilización de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede efectuarse por varios agentes antibacterianos y antimicóticos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede efectuarse mediante la utilización en las composiciones de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios de los demás ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando varios ingredientes activos esterilizados en un vehículo esterilizado que contiene el medio de dispersión básico y los demás ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y las técnicas de liofilización que proporcionan un polvo del
ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución estéril filtrada previamente de éstos.

Tal como se utiliza en la presente memoria "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antimicóticos, agentes isotónicos y de retardo de la absorción y similares. La utilización de dichos medios y agentes para las sustancias farmacéuticas activas es bien conocida en la técnica. A menos que en cuanto a cualquier medio o agente convencional sea compatible con el ingrediente activo, se contempla su utilización en las composiciones terapéuticas. Pueden también incorporarse a las composiciones ingredientes activos complementarios.

Para la profilaxis oral el polipéptido puede incorporarse a excipientes y utilizarse en forma de colutorios y dentífricos no ingeribles. Puede prepararse un colutorio incorporando el ingrediente activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado, tal como solución de borato sódico (solución de Dobell). Alternativamente, el ingrediente activo puede incorporarse en un lavado antiséptico que contiene borato sódico, glicerina y bicarbonato potásico. El ingrediente activo también puede dispersarse en dentífricos, incluyendo: geles, pastas, polvos y suspensiones. El ingrediente activo puede añadirse en una cantidad terapéuticamente eficaz a una pasta dentífrica que puede incluir agua, aglutinantes, abrasivos, agentes saborizantes, agentes espumantes y humectantes.

La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades y composiciones moleculares que no producen una reacción alérgica o desfavorable similar cuando se administran a un ser humano. La preparación de una composición acuosa que contiene una proteína como ingrediente activo es bien comprendida en la materia. Típicamente, dichas composiciones se preparan como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; pueden también prepararse formas sólidas adecuadas para solución, o suspensión, en líquido antes de la inyección. La preparación puede también estar emulsionada.

La composición puede formularse en forma neutra o salina. Las sales farmacéuticamente aceptables, incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y las que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con grupos carboxilo libres pueden también proceder de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. En la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de la dosificación y en tal cantidad que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en varias formas de dosificación tales como soluciones inyectables, cápsulas para la liberación del fármaco y similares.

Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debería estar tamponada de manera adecuada si fuera necesario y el líquido diluyente en primer lugar hacerse isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas concretas son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, el medio acuoso estéril que puede emplearse será conocido por los expertos en la materia a la luz del presente descubrimiento. Por ejemplo, una dosis podría disolverse en 1 ml de solución de NaCl isotónica y añadirse a 1.000 ml de fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el punto propuesto de infusión, (véase por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15ª edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Alguna variación en la dosis se producirá necesariamente dependiendo de la enfermedad del sujeto en tratamiento. La persona responsable de la administración, en cualquier caso, determinará la dosis apropiada para cada sujeto. Además, para la administración humana, las preparaciones deberían cumplir las normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza requeridas por las normas de la FDA Office of Biologics.

4.9 Preparación de la vacuna

Las composiciones descritas en la presente memoria proporcionan partículas inmunógenas que son capaces de provocar una respuesta inmunitaria contra PS. Debido a que generalmente PS se encuentra en la superficie de tipos de células anormales (p. ej., células tumorales y células apoptósicas), el inventor contempla que dichas composiciones son ideales para su utilización como una vacuna potencial contra la tumorigénesis. Así, la presente invención proporciona una composición inmunógena que puede utilizarse como vacuna contra el cáncer.

En determinadas formas de realización, tales vacunas pueden ser soluciones o emulsiones líquidas inyectables. Las composiciones de PS dadas a conocer en la presente memoria pueden mezclarse con excipientes farmacéuticamente aceptables que son compatibles con las composiciones de PS. Compatible significa que los excipientes farmacéuticamente aceptables no alterarán las características de la configuración del inmunógeno. Los excipientes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o combinaciones de éstos. La vacuna puede contener además sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes o adyuvantes para aumentar la eficacia de las vacunas. Los adyuvantes pueden ser sales minerales (p. ej., AlK(SO_{4})_{2}, AlNa(SO_{4})_{2}, AlNH_{4}(SO_{4})_{2}, sílice, alúmina, Al(OH)_{3}, Ca_{3}(PO_{4})_{2}, caolín o carbono), polinucleótidos (p. ej., ácidos poli IC o poli AU), y determinadas sustancias naturales (p. ej., cera D procedente de Mycobacterium tuberculosis, sustancias halladas en Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis, o miembros del género Brucella) (solicitud de patente internacional publicada nº WO 91/09603). Se utilizan normalmente hidróxido o fosfato de aluminio (alúmina) en solución 0,05 a 0,1 por ciento en solución salina tamponada con fosfato. Otros compuestos adyuvantes incluyen QS21 o adyuvante incompleto de Freund. Un adyuvante preferido es Provax (IDEC Pharmaceuticals).

Pueden administrarse vacunas por vía parenteral, por inyección subcutánea o intramuscular, o pueden formularse vacunas y administrarse para provocar una respuesta inmunitaria en las superficies de las mucosas. La composición inmunógena puede administrarse a una superficie de la mucosa por vía nasal, oral, vaginal o anal. Para la administración anal pueden utilizarse supositorios. Los supositorios pueden comprender aglutinantes y vehículos tales como polialquilenglicoles o triglicéridos. Las formulaciones orales pueden estar en forma de píldoras, cápsulas, suspensiones, comprimidos o polvos e incluyen calidades farmacéuticas de sacarina, celulosa o carbonato de magnesio. Estas composiciones pueden contener desde aproximadamente 5% hasta aproximadamente 95% de la composición de PS o más según se necesite.

Preferentemente las vacunas se administran en una manera y cantidad para que sean terapéuticamente eficaces. Es decir que la vacuna debería administrarse de tal manera que produzca una respuesta inmunitaria a PS. Las dosis adecuadas requeridas para ser administradas son fácilmente discernibles por los expertos en la materia. Las metodologías adecuadas para la administración inicial y las dosis de refuerzo, si es necesario, pueden ser también variables. La dosis de la vacuna puede depender de la vía de administración y puede variar según el tamaño del hospedador.

Aunque las composiciones inmunógenas de la presente invención pueden administrarse a individuos que no han sido diagnosticados de cáncer, también pueden administrarse a individuos que han sido diagnosticados de cáncer en un intento de alterar la respuesta inmunitaria al tumor. La alteración puede ser un aumento en la producción de anticuerpo, un estímulo de los linfocitos T CD4^{+} o CD8^{+} antitumorales, o en relación con el tipo de respuesta al virus (es decir, T_{H}1 frente a T_{H}2). No obstante, esta alteración, es eficaz, disminuirá la mortalidad y morbilidad asociadas al cáncer. En otras palabras, el compuesto inmunógeno puede disminuir la gravedad de la enfermedad y prolongar la vida del paciente.

4.10 Terapia del cáncer contemporáneo

La mayoría de los intentos para activar una respuesta inmunitaria terapéutica contra el cáncer han sido dirigidos hacia antígenos de péptido o carbohidrato exclusivos, específicos para el tumor. Sin embargo se ha prestado poca o ninguna atención, a la posibilidad de que las respuestas específicas contra el lípido pueden también aprovecharse con esta finalidad. Aunque los fosfolípidos están omnipresentes, es evidente que la organización y la lateralidad de la membrana de las especies de lípido individuales no son aleatorias sino que están controladas por mecanismos de transporte que mantienen distribuciones de lípido de la transmembrana específicos (Devaux y Zachowski, 1994; Menon, 1995). Datos recientes sugieren que aunque la organización de la membrana está íntimamente regulada durante la vida de la célula, las distribuciones normales del lípido no se mantienen en la adquisición por la célula de varios fenotipos patológicos (Zwaal y Schroit, 1997). Esto es particularmente evidente para las células tumorígenas donde la fosfatidilserina (PS) se redistribuye en la hoja interna de la célula (su posición normal) a la hoja externa en la transformación (Connor et al., 1989; Utsugi et al., 1991). Esta condición sugiere la posibilidad de que PS en la hoja externa de la célula puede servir como diana para la intervención terapéutica.

4.11 Asimetría del lípido de la membrana y reconocimiento de las células que expresan a PS

La hoja externa de las membranas de las células eucarióticas contiene la mayor parte de los colinafosfolípidos, mientras que los aminofosfolípidos están principalmente presentes en la hoja interna de la célula (Verkleij et al., 1973; Zwaal et al., 1975). Aunque la asimetría parece ser la norma para las células normales, la pérdida de lateralidad del lípido de la membrana, en particular el afloramiento de PS en la superficie de la célula, produce la expresión de las propiedades superficiales alteradas que modula la función celular e influye en la interacción de la célula con su entorno (Zwaal y Schroit, 1997). Por ejemplo, la exposición de PS activa la coagulación y la trombosis por plaquetas (Bevers et al., 1982) y está implicada en el reconocimiento y eliminación de las células apoptósicas (Fadok et al., 1992), células senescentes (Connor et al., 1994) y células tumorígenas (Utsugi et al., 1991) por fagocitos.

4.12 Autoinmunidad y cáncer

Se ha evidenciado anticuerpos antifosfolípido (APA) principalmente en sueros de pacientes con enfermedad del tejido conectivo, particularmente lupus eritematoso diseminado (Mackworth-Youn, 1990; Asherson y Cervera, 1993). Aunque menos frecuente, APA se han detectado también en pacientes con enfermedades malignas, incluyendo leucemia, linfoma, cánceres epiteliales y timoma (Becker y Brocker, 1995; Naldi et al., 1992). Recientes estudios demostraron que las concentraciones de APA eran significativamente mayores en pacientes de melanoma que habían recibido inmunoterapia con interferón-\alpha o bacilus Calmette-Guerin (Becker et al., 1994; Herstoff y Bogaars, 1979). Además, los estudios preclínicos en curso que investigan la relación entre autoinmunidad en pacientes de leucemia tratados con interferón-\alpha presentaban una acusada relación entre las remisiones hematológicas/clínicas y las concentraciones de APA. Debido a que los anticuerpos en los pacientes con enfermedades autoinmunitarias son capaces de fijar y destruir las células que presentan los autoantígenos, es posible que la aparición de APA en algunos cánceres, posiblemente como consecuencia de la enfermedad y/o régimen de tratamiento, es responsable de las remisiones observadas normalmente en el tratamiento con interferón-\alpha.

Debido a que PS parece ser un marcador omnipresente para las células de cáncer, puede servir como epítopo específico para las poblaciones de células tumorales y una diana terapéutica para el tratamiento del cáncer. Para determinar la viabilidad de este método, una respuesta similar a la del síndrome de APA autoinmunitaria contra PS se produjo en ratones utilizando inmunógenos exclusivos que conservan el grupo principal crítico para el lípido y presenta a PS como hapteno unido al portador. Los estudios han demostrado que los ratones inmunizados con estos sistemas PS-portador que utilizan adyuvante Provax (IDEC Pharmaceuticals) protegen contra el crecimiento de varios carcinomas isogénicos.

5.0 Ejemplos

Los ejemplos siguientes se incluyen para demostrar las realizaciones preferidas de la invención. Debe apreciarse por los expertos en la materia que las técnicas dadas a conocer en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por el inventor para funcionar bien en la práctica de la invención, y de este modo pueden considerarse que constituyen modos preferidos para su puesta en práctica. Sin embargo, los expertos en la materia deberían apreciar, a la luz del presente descubrimiento, que pueden realizarse muchos cambios en las realizaciones específicas que se dan a conocer y obtener incluso un resultado parecido o similar sin apartarse de la invención.

5.1 Ejemplo 1

Producción y caracterización de anticuerpos policlonales con PS

Debido a que PS puede considerarse que es un hapteno no inmunógeno, el inventor razonó que un conjugado lípido-proteína apropiado puede producir una respuesta inmunitaria potente y específica. Para estudiar esta cuestión y superar los problemas inherentes de la inmunogenicidad e interreactividad del lípido, el inventor sintetizó PS que contenía un grupo de acoplamiento "activado por sulfhidrilo" en el extremo de la cadena lateral en la posición 2 y ligó por enlace covalente el lípido a un portador proteico (Díaz et al., 1998). El inventor demuestra que este antígeno indujo la producción de anticuerpos específicos para PS en primates, conejos y ratones y que estos anticuerpos se unen específicamente a glóbulos rojos (RBC) que expresan a PS. Los resultados del inventor sugieren que los anticuerpos PS podrían ser una herramienta importante para el estudio de los procesos dependientes de PS y su distribución en las membranas de las células vivas.

5.1.1 Materiales y métodos 5.1.1.1 Materiales

PS, ácido dioleilfosfatídico (PA), PC, dioleilfosfatidilglicerol (PG), DOPE se adquirieron en Avanti Biochemicals (Pelham, AL). 1-acil-2-(aminocaproil)fosfatidilcolina (NH_{2}-PC) se sintetizó como se describió anteriormente (Schroit y Madsen, 1983). Propionato de N-succinimidil-3-(2-piridiltio) (SPDP) y 2-iminotiolano se adquirieron en Pierce (Rockford, IL). Albúmina de suero bovino (BSA), hemocianina de lapa californiana (KLH), protrombina, factor X y los reactivos analíticos fueron de Sigma (St. Louis, MO). S2238 se adquirió en Kabi Laboratories (Franklin, OH). RBC humana se extrajo de voluntarios sanos por venipunción en jeringuillas heparinizadas.

5.1.1.2 Síntesis de 1-acil-2-N-succinimidil-3-(2-piridilditio propionil-(aminocaproil)-PS (SPDP-PS)

Se preparó SPDP-PS a partir de SPDP-PC por intercambio de base catalizado por fosfolipasa D en presencia de L-serina (Comfurius et al., 1990). En resumen, se sintetizó en primer lugar SPDP-PC haciendo reaccionar 20 \mumoles de NH_{2}-PC [preparados desbloqueando 1-acil-2-tBOC-aminocaproil-PC (Schroit y Madsen, 1983)] con 40 \mumoles de SPDP en 3 ml de CHCl_{3}/MeOH/trietilamina (1/2/0,015) durante la noche. Se añadieron CHCl_{3} (1 ml) y agua (1,8 ml) y se eliminó la fase orgánica inferior. El análisis del producto, SPDP-PC, por cromatografía en capa fina (TLC) (CHCl_{3}/MeOH/H_{2}O; 65/25/4; Rf=\sim0,4) puso de manifiesto un solo positivo a fosfato, punto negativo a ninhidrina. Se secó a continuación el lípido y se volvió a poner en suspensión en 1 ml de L-serina al 50% en tampón acetato 0,1 M, pH 5,6 que contenía CaCl_{2} 0,1 M. Se añadieron 1 ml de éter y 25 unidades (70 \mul) de fosfolipasa D y se mezcló la suspensión a 45ºC durante 3 h y se interrumpió mediante adición de EDTA (hasta 0,2 M). Se evaporó a continuación el éter y se volvió a poner en suspensión el producto en CHCl_{3}/MeOH/H_{2}O (1/2/0,8). Se eliminó el exceso de L-serina por centrifugación. Se recuperó el producto de la fase orgánica tras la adición de una parte de CHCl_{3} y una parte de agua. La fase orgánica se llevó a sequedad, se disolvió en CHCl_{3} y se aplicó a una columna de 2 \times 30 cm de gel de sílice activado y prelavado. Se lavó la columna con 100 ml de CHCl_{3}, seguido de alícuotas de 100 ml de CHCl_{3} que contenían cantidades crecientes de MeOH. El análisis del producto que eluyó con CHCl_{3}/MeOH (6/4) por TLC puso de manifiesto un solo fosfato y una mancha positiva a ninhidrina (Rf \approx 0,2). El producto purificado se almacenó en CHCl_{3}. El análisis del espectro de masas de electroatomización calculado para SPDP-PS [C_{38}H_{63}N_{3}O_{11}PS_{2}] (M) 833,02, obtenido 832.

5.1.1.3 Acoplamiento de SPDP-PS a portadores de proteína

Se acopló SPDP-PS a BSA o KLH después de introducir más sulfhidrilos en las proteínas con 2-iminotiolano. En resumen, se solubilizaron las proteínas portadoras a razón de 10 mg/ml en tampón Tris 10 mM pH 8,0 que contenían EDTA 0,1 mM. Se añadió 100 veces de moles en exceso de 2-iminotiolano y se dejó continuar la reacción durante 1 h (Jue et al., 1978). Se dializó a continuación la solución durante la noche. Para asegurar la disponibilidad de los sulhidrilos libres máximos para acoplamiento, se redujo la proteína con ditiotreitol (DTT) 5 mM. Se eliminó el DTT inmediatamente antes de acoplarse por cromatografía de exclusión en una columna Biogel P6. Se recogieron las fracciones pico, y los sulfhidrilos disponibles se estimaron con el reactivo de Ellman (DTNB) (Riddles et al., 1983). Se mezcló inmediatamente a continuación la proteína reducida con 1 mol equivalente de SPDP-PS en 1/10 de volumen de EtOH. Se estimó la eficacia de la modificación midiendo la liberación de 2-tiopiridina a 343 nm (Grassetti y Murray, 1967).

5.1.1.4 Protocolo de inmunización

Se inyectaron conejos en múltiples puntos intradérmicos con \sim1 mg de conjugados lípido-proteína en adyuvante completo de Freund seguido de un refuerzo un mes después en adyuvante incompleto de Freund. Se extrajo sangre a los conejos dos semanas después de la última inyección.

5.1.1.5 Ensayo inmunosorbente con enzima ligada (ELISA)

Se recubrieron placas de microvaloración de poliestireno durante la noche a temperatura ambiente con 30 \mul/pocillo de solución de 200 \mug/ml de diferentes fosfolípidos (AVANTI) en CHCl_{3}/MeOH (1/50). Se realizó el bloqueo de las placas secas con suero de cabra al 10% en NaCl al 0,8%/Tris 20 mM, pH 8,0 durante 1 h a temperatura ambiente. Las muestras de antisuero preparadas en la solución de bloqueo se aplicaron a los pocillos a diferentes diluciones (descritas en las figuras) durante 2 h y se evaluó la unión añadiendo conjugado de peroxidasa (molécula completa) anti-conejo (SIGMA) a una dilución 1:10.000 en el mismo tampón durante 2 h. Se utilizó como sustrato TMB-ELISA (3,3',5,5'-tetrametilbencidina base, GIBCO BRL). Se determinó la inhibición de la unión del suero inmunitario a PS con los análogos del grupo principal glicerofosforilserina (GPS), fosforilserina (PhoS), serina, glicerofosforiletanolamina (GPE), fosforiletanolamina (PhoE) y etanolamina a 600 \mug/ml, 150 \mug/ml y 40 \mug/ml. La inhibición con vesículas tratadas con ultrasonidos (0,5 mg/ml) compuestas por PS (50% mol en PC), DOPE (50% mol en PC) y PC se consiguió por adición de volúmenes iguales de liposomas a muestras de antisuero diluidas en suero de cabra al 10%. Después de 1 h de incubación a 37ºC, se realizó el ELISA como se describió anteriormente.

5.1.1.6 Análisis de actividad de protrombinasa

Se realizó el análisis de protrombinasa dependiente de PS como se describió anteriormente (Díaz et al., 1996), excepto que se utilizaron vesículas de PS tratadas con ultrasonidos (SUV) como superficie procoagulante. En resumen, se incubaron 0,05 ml de SUV de PS (1 mg/ml) con 0,05 ml de antisuero o de suero preinmunitario de referencia durante 15 min a 37ºC. La suspensión se añadió a continuación a 0,2 ml de tampón para análisis de protrombinasa que contenía Ca^{2+} y los factores de coagulación necesarios durante el periodo de tiempo indicado. Se transfirieron a continuación alícuotas de la suspensión a una cubeta que contenía 1 ml de tampón EDTA para interrumpir la producción de trombina. Se añadió cromógeno dependiente de trombina, S2238, a las cubetas (hasta 0,2 mmoles/l) y se controló la velocidad de formación de cromóforo a 405 nm con un espectrofotómetro de respuesta Gilford empleando un programa informático cinético apropiado. La velocidad inicial de producción del cromóforo dependiente de trombina se determinó a partir de la pendiente de la curva de absorbancia. Las velocidades se representaron en ordenadas frente al tiempo de incubación.

5.1.1.7 Inmunocitoquímica

Se realizó el mezclado de los lípidos RBC inducido por Ca^{2+} incubando RBC tratado con papaína (0,25 mg/ml de papaína, EDTA 1 mM, cisteína-HCl 2 mM en solución salina tamponada con fosfato durante 1 h a 37ºC con 5 \muM de A23187 en CaCl_{2} 1 mM durante 1 h a 37ºC. Después de eliminar las vesículas de glóbulos rojos por centrifugación, se incubaron las células con anti-PS durante 1 h a 0ºC. Se lavaron a continuación las células y se tiñeron con IgG anti-conejo de cabra conjugada con fluoresceína.

5.1.1.8 Citometría de flujo

La adquisición de datos y el análisis se realizaron en un citómetro de flujo Coulter Epics Profile utilizando el programa informático EPICS elite. Se ajustó la dispersión de la luz y del ángulo lateral para eliminar los glóbulos rojos fantasma. Se ajustaron logarítimicamente los canales de fluorescencia.

5.1.2 Resultados 5.1.2.1 Método A de síntesis para la preparación de conjugados PS-portador

Para mantener la integridad del grupo principal de serina reactivo con lípidos, el inventor generó un grupo disulfuro reactivo independiente del carboxilo y la amina en la cadena lateral de acilo, que se realizó acilando NH_{2}-PC con SPDP. El producto, que contenía una cadena \beta de disulfuro protegida, se convirtió a continuación en un derivado de PS con fosfolipasa D (Fig. 2). Se realizó el acoplamiento lípido-proteína por intercambio del disulfuro de los haptenos del lípido con las proteínas tratadas con 2-iminotiolano (1 mol de SPDP-PS/mol de SH). El acoplamiento fue estequiométrico como se estimó controlando la liberación de 2-tiopiridina. Las proporciones de acoplamiento fueron típicamente 20/1 y 135/1 para BSA y KLH, respectivamente (Tabla 1).

TABLA 1 Acoplamiento de SPDP-PS a puntos reactivos con sulfhidrilo disponibles en proteínas portadoras

1

5.1.2.2 Especificidad de los anticuerpos de PS

Se determinó por ELISA la capacidad de los anticuerpos extraídos de conejos inmunizados contra PS-BSA para unirse a diferentes fosfolípidos. Los datos mostrados en la Fig. 3A, Fig. 3B y Fig. 3C indican que el antisuero reaccionó con PS y DOPE, pero no con PC o con otros fosfolípidos cargados negativamente. Para determinar si la reacción con DOPE era específica para el grupo principal polar o debida a interacciones con otras estructuras que pueden ser adoptadas por DOPE (Rauch et al., 1986; Rauch y Janoff, 1990), se probó la unión frente a lípidos depositados como mezclas 50% mol con PC. La Fig. 3C demuestra que aunque se mantuvo la reactividad a PS, la unión del anticuerpo a mezclas 50% mol de DOPE en PC fue similar a los niveles obtenidos con PC solo.

Para determinar qué epítopo era responsable de la unión de PS, se evaluó la reactividad de los anticuerpos con el grupo principal polar del lípido mediante inhibición competitiva con análogos del lípido y liposomas de diferente composición de lípido (Fig. 4A, Fig. 4B y Fig. 4C). A la mayor concentración probada, GPS y PhoS, inhibieron la unión con las placas recubiertas de PS en el 80% y 60%, respectivamente. Serina, GPE, PhoE y etanolamina quedaron sin efecto (Fig. 4A). De acuerdo con los resultados presentados en la Fig. 3C, GPE y PhoE no inhibieron la unión del anticuerpo a DOPE (Fig. 4B), lo que sugiere que la reactividad del anticuerpo con DOPE era independiente del grupo del lípido con cabeza polar. Esto se verificó por la capacidad de SUV, independiente de la composición del lípido, para inhibir la unión a DOPE, pero no a las placas recubiertas de PS (Fig. 4C).

Debido a que estos anticuerpos se unen a PS, deberían también ser capaces de interferir con los procesos dependientes de PS tal como la coagulación. Para probar esto, se preincubaron vesículas de PS con el antisuero durante 1 h a 37ºC y se evaluó la capacidad de las vesículas para activar la reacción de protrombinasa dependiente de PS. Los resultados presentados en la Fig. 5 demuestran que las velocidades iniciales de escisión de S2238 dependiente de trombina después de los tiempos de reacción indicados se inhibieron en el 60% en las muestras tratadas con antisuero (calculados a partir de las pendientes de la curva ajustada).

5.1.2.3 Generación de anticuerpos de PS en primates

Se inmunizaron macacos de Java con 100 a 250 \mug de PS-KLH cada dos a tres semanas. Se extrajo sangre a los monos cada dos semanas y se analizó la actividad anti-PS en los sueros en diluciones en serie en un ELISA con PS directo. Un mono respondió con un título anti-PS recíproco de \sim2700. Los títulos anti-PS disminuyeron lentamente a lo largo de un periodo de 5 meses. El conjugado PS-BSA (250 \mug) se utilizó a continuación en inmunizaciones ulteriores. Los
títulos anti-PS recíprocos disminuyeron continuamente en ambos conejos después de cada inmunización hasta \sim24.300.

5.1.2.4 Detección de PS en la superficie de la célula por inmunofluorescencia

Se indujeron glóbulos rojos para expresar PS en la superficie de la célula por entrada de Ca^{+2} que produjo el mezclado del lípido de la interhoja (Sims et al., 1989; Baldwin et al., 1990; Bevers et al., 1992; Gaffet et al., 1995). La presencia de PS en las células tratadas con iónoforo se confirmó evaluando su actividad de protrombinasa dependiente de PS. Las células tratadas con ionóforo y Ca^{2+} se incubaron con anticuerpos PS seguido de IgG anti-conejo conjugada con fluoresceína. El microscopio de fluorescencia demostró que estas células eran muy fluorescentes (Fig. 6B). Las células tratadas con suero preinmunitario no eran fluorescentes (Fig. 6A) ni eran RBC de referencia (células tratadas con ionóforo solo o Ca^{+2} solo) incubadas con suero preinmunitario o inmunitario. La tinción de RBC tratado con Ca^{+2}/ionóforo se cuantificó también por citometría de flujo. El análisis de RBC incubado con antisuero seguido de IgG anti-conejo conjugado con fluoresceína demostró que el 44% de la población estaba comprendida dentro del área controlada (Fig. 6D) por encima de la fluorescencia de fondo de las células de referencia (Fig. 6C).

5.1.3 Discusión

Se han utilizado varios métodos para determinar la presencia de PS en las membranas celulares. Éstos incluyen la modificación química directa con reactivos impermeables para la membrana tal como el ácido trinitrobencenosulfónico e hidrólisis con fosfolipasas específicas (Gordesky et al., 1975; Etemadi, 1980), marcado directo con proteínas de unión a PS (Thiagarajan y Tait, 1990; Tait y Gibson, 1994; Vermes et al., 1995; Kuypers et al., 1996), y catálisis dependiente de PS de coagulación (Rosing et al., 1980; Van Dieijen et al., 1981). Varios laboratorios utilizaron los anticuerpos del lípido para detectar PS de la superficie celular (Maneta-Peyret et al., 1993; Rote et al., 1993; Rote et al., 1995; Katsuragawa et al., 1995). Sin embargo, muchos de estos anticuerpos no son específicos y la interreactividad es frecuente. Esto puede ser debido a la presentación antigénica débil de los grupos fosforilados principales que son críticos para la especificidad o para la generación de anticuerpos contra grupos diacilglicerol, fosfodiéster y/o ácido graso que son frecuentes en todos los fosfolípidos. En un intento de producir anticuerpos PS específicos, el inventor inmunizó conejos con PS acoplados covalentemente a albúmina de suero bovino o KLH por su cadena lateral de ácido graso sin modificar el grupo fosfoserina crucial.

Estos datos demuestran que los anticuerpos de conejo reconocen a PS y DOPE 100% mol pero no a PG o PC. La reactividad contra DOPE puro, sin embargo, parece no estar relacionada con el grupo de lípidos polar principal porque la reactividad se suprimió cuando el antígeno contenía PC 50% mol (Fig. 3C). Además, a diferencia de la inhibición específica para la unión a PS obtenida con análogos de PS solubles en agua y vesículas que contienen PS, GPE y PhoE no inhibieron la unión del anticuerpo a placas recubiertas de DOPE (Fig. 4B), mientras que todas las vesículas, independientemente de la composición del lípido, la inhibieron. Aunque estos resultados sugieren que los anticuerpos no se unen específicamente a DOPE, el inventor no puede eliminar la posibilidad de que algunos anticuerpos reconozcan estructuras de fase hexagonal adoptadas por DOPE en determinadas condiciones (Rauch et al., 1986; Rauch y Janoff, 1990). El grupo responsable de la especificidad de unión a PS depende de la presentación tanto del grupo principal serina y del grupo de glicerofosfato. De hecho, se ha demostrado que los grupos fosfato son inmunógenos y algunos anticuerpos de fosfolípido están parcialmente inhibidos por tampones de fosfato y nucleótidos fosforilados (Banedi y Alving, 1990; Alving, 1986). En cualquier caso, es evidente que estos anticuerpos son capaces de reconocer a PS pero no a DOPE en una membrana bicapa debido a la inhibición específica obtenida con liposomas que contienen PS en ELISA (Fig. 4C). Además, los análisis de microscopia de fluorescencia y de citometría de flujo demostraron que estos anticuerpos no se unían a RBC normal aun cuando estas células expresen \sim20% de su fosfatidiletanolamina total en la superficie celular. Por otra parte, RBC se vuelve intensamente fluorescente en la expresión de PS en la superficie celular por mezclado del lípido de la membrana inducido por Ca^{2+} (Sims et al., 1989; Baldwin et al., 1990; Bevers et al., 1992; Gaffet et al., 1995).

5.2 Ejemplo 2

Inducción de autoinmunidad para la prevención del cáncer

Las membranas celulares contienen numerosas especies de fosfolípidos todas las cuales están estructural y organizativamente estrechamente reguladas durante la vida de la célula. Un gran conjunto de pruebas indica que la fosfatidilserina (PS), a diferencia de otras especies de fosfolípido, experimenta una drástica redistribución en la membrana plasmática de la célula y llega a expresarse en la hoja de la membrana externa de la célula en la adquisición de un fenotipo patológico. La redistribución de PS dependiente del fenotipo se ha demostrado que se produce durante la muerte celular programada (apoptosis), la activación de plaquetas, el envejecimiento celular y la tumorigénesis. Debido a que PS parece ser un marcador omnipresente de estas células patológicas, puede servir como epítopo diana específico para las poblaciones de células anormales y una diana terapéutica para el tratamiento del cáncer. Para probar la viabilidad de esta estrategia para el tratamiento del cáncer, se produjo una respuesta autoinmunitaria contra PS en ratones utilizando los inmunógenos descubiertos que conservan el grupo del lípido principal crítico y los presentes PS como hapteno unido al portador.

5.2.1 Método B de síntesis para la preparación de la producción de PS-portador

El método es similar al que se mostró en el Ejemplo 1 excepto, que en lugar de acoplar PS a una proteína portadora que lleva sulfhidrilo por cambio tiol-disulfuro, se "desbloquea" con (tris[2-carboxietil]fosfina HCl) para dar un sulfhidrilo libre que se acopla directamente a continuación a las proteínas portadoras activadas por maleimida (Fig.1).

5.2.2 Inmunización contra PS restringe el crecimiento tumoral y la metástasis

Para probar si una respuesta anti-PS autoinmunitaria es protectora, se determinó el crecimiento de varios tumores en ratón trasplantables en ratones preinmunizados con antígeno lipídico.

5.2.2.1 Carcinoma de vejiga murino MBT-2 de ratón

Se administraron inmunizaciones subcutáneas a ratones C3H con 0,1 ml de solución salina (NaCl al 0,9%) o 0,1 ml de inmunógeno BSA-PS el día 0 con adyuvante Provax (IDEC Pharmaceuticals) y otra vez el día 7 (1 mg/ml de BSA-PS en solución salina:Provax 2:1). El día 14 se inyectaron a los ratones 5 \times 10^{4} células de carcinoma de vejiga MTB-2 murinas isogénicas en la pared de la vejiga. Entre los días 38 a 40, se practicó la autopsia a los ratones y se extrajeron las vejigas, se pesaron, y se confirmaron histológicamente en presencia o ausencia de tumor (Tabla 2).

TABLA 2 Carcinoma de vejiga murino MBT-2 de ratón

2

5.2.2.2 Adenocarcinoma RENCA murino

Se administraron inmunizaciones subcutáneas a ratones BALB/c con 0,1 ml de solución salina o 0,1 ml de inmunógeno KLH-PS el día 0 con adyuvante Provax (IDEC Pharmaceuticals) y otra vez el día 7. Los inmunógenos eran 1 mg/ml en solución salina:Provax 2:1. El día 14 se inyectaron a los ratones 1,2 \times 10^{4} células de adenocarcinoma RENCA isogénicas. Entre los días 38 a 40, se practicó la autopsia a los ratones para la presencia de metástasis pulmonar. Los pulmones se colocaron en solución de Bouin y se enumeraron cada una de las metástasis (Tabla 3).

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TABLA 3 Adenocarcinoma RENCA murino

3

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5.3 Ejemplo 3

Inducción de autoinmunidad para inmunoterapia del cáncer

Se administró a ratones BALB/c una inyección intravenosa de 20.000 células RENCA el día 0 y se comenzó la terapia el día 3, que no comprende ningún tratamiento más (referencias), o inmunización con 0,1 ml de la preparación PS-BSA (1 mg/ml de antígeno en solución salina:Provax 2:1). Se administraron 100 \mug en dos puntos la primera semana, seguido de 2 inyecciones de 50 \mug en dos puntos 7 y 14 días después. Se mantuvieron en observación los ratones y se extrageron los pulmones el día 31 y se enumeró el número de nódulos tumorales individuales (Tabla 4).

TABLA 4 Terapia de metástasis experimental de adenocarcinoma renal murino por inmunidad autorreactiva anti-lípido

4

5.4 Ejemplo 4

Inducción de autoinmunidad para inmunoterapia de leucemia

Se inocularon por vía subcutánea (s.c.) ratones C57B1/6 con células EG7 de linfoma que expresan a PS (determinada por la capacidad de las células a teñirse con el reactivo específico para PS, anexina V conjugada con fluoresceína). Los ratones se clasificaron en grupos de tratamiento (6 a 8 animales/grupo) cuando los tumores oscilaban en tamaños entre aproximadamente 75 a 100 mm^{3} en cuyo momento se inició la inmunización. Los ratones con tumor se inmunizaron con una sola inyección de Provax el día 8 con 100 \mug de conjugado PS-KLH o PS-BSA. Los retrasos en el desarrollo del tumor oscilaron entre 28 días para el grupo con PS-BSA y 20 días para el grupo con PS-KLH (Fig. 7). Dada la rápida velocidad de crecimiento de este tumor (el volumen del tumor se duplica cada 2,4 días) este crecimiento representa una disminución de 11,6 (PS-BSA) y 8,5 (PS-KLH) veces en el tiempo de duplicación del tumor.

5.5 Ejemplo 5

Inducción de autoinmunidad para la terapia de cáncer utilizando complejos \beta_{2}-glucoproteína I/lípido

La \beta_{2}-glucoproteína I es una glucoproteína del suero de 50 kDa (Poltz y Kostner, 1979; Wurm, 1984) que se une a fosfolípidos con carga negativa. Aunque su función no está clara, se ha demostrado recientemente que varias respuestas autoinmunitarias (Galli et al., 1990; McNeil et al., 1990; OoSting et al., 1993; Roubey, 1994) están dirigidas contra complejos \beta_{2}-glucoproteína I-lípido (Schousboe, 1979). Debido a que muchas células cancerosas expresan fosfatidilserina sobre la superficie celular, la generación de una respuesta contra el complejo puede representar avances considerables en el tratamiento de varios cánceres. Para demostrar esto, se formaron dos tipos de complejos \beta_{2}-glucoproteína I/lípido y se probó su eficacia terapéutica en un modelo de terapia de cáncer in vivo.

5.5.1 Generación del complejo

Se purificó la \beta_{2}-glucoproteína I del plasma humano reunido utilizando los procedimientos publicados anteriormente (Poltz y Kostner, 1979; Wurm, 1984).

5.5.1.1 Complejo I

Se cortaron secciones al microscopio con agarosa al 0,9% en Tris-HCl 10 mM pH 7,4 para dar un volumen del orificio del sacabocados de 20 \mul. Los orificios centrales se rellenaron con \beta_{2}GPI (300 \mug/ml) y los pocillos circundantes con pequeñas vesículas de lípido tratadas con ultrasonidos compuestas de fosfatidilserina/fosfatidilcolina (50/50). Las placas se desarrollaron durante 24 h y la proteína y el lípido no ligados se eliminaron por lavado durante 24 h en el mismo tampón. Los precipitados que contenían los complejos proteína/lípido se escindieron, se emulsionaron con adyuvante de Freund y se utilizaron como se describe a continuación.

5.5.1.2 Complejo II

Se volvió a poner en suspensión fosfatidilserina/fosfatidilcolina (7/3) en NaCl 20 mM para dar una concentración de lípido final de 5 mg/ml. Se mezcló la suspensión de lípido con un volumen igual de \beta_{2}-glucoproteína I (450 \mug/ml). Se incubó la suspensión a 4ºC durante 2 h y por último se mezcló con 0,2 volúmenes de adyuvante Provax (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA).

5.5.2 Inducción de autoinmunidad para la prevención del cáncer utilizando PS/\beta_{2}-glucoproteína I

Se inmunizaron ratones BALB/c dos semanas aparte con 100 \mul de antígeno por vía subcutánea e intradérmica. Una semana después los ratones de referencia, los ratones tratados con adyuvante de Freund solamente, y los ratones inmunizados contra el complejo PS/\beta_{2}-glucoproteína I se sometieron a la prueba de provocación mediante una inyección intravenosa de 20.000 células RENCA cultivadas. Se extrajeron los pulmones de todos los ratones 32 días después. Se registró el peso de los pulmones (Tabla 5) y el número de nódulos tumorales individuales (Tabla 6).

TABLA 5 Inhibición de la formación y crecimiento de adenocarcinoma de células renales murino (RENCA) en los pulmones de ratones Balb/c isogénicos después de la inmunización contra el complejo PS-\beta_{2}-glucoproteína I

5

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TABLA 6 Número de nódulos tumorales pulmonares

6

Considerados en conjunto, estos datos demuestran que la generación de una respuesta inmunitaria contra los conjugados de fosfatidilserina descubiertos es eficaz tanto para la prevención como para el tratamiento del cáncer y que dicho tratamiento y prevención es independiente del tipo de tumor y de la localización física del tumor en el hospedador. La potencial aplicación terapéutica y preventiva en seres humanos está muy apoyada en el hecho de que pueden generarse títulos muy altos de anticuerpo en primates.

5.6 Ejemplo 5

Modelos animales 5.6.1 Materiales y métodos 5.6.1.1 Animales

Se adquirieron ratones Balb/c en el National Cancer Institute (Frederick, MD). Se mantuvieron los animales en las instalaciones aprobadas por The American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care, de acuerdo con el United State Department of Agricultura, Department of Health and Human Services, y las reglas y normas del NIH.

5.6.1.2 Cultivos de células tumorales

Se cultivan células tumorales como cultivos monocapas en MEM de Eagle con suero bovino fetal al 5%, vitaminas, piruvato, L-glutamina y aminoácidos no esenciales a 37ºC.

5.6.1.3 Inmunoterapia con conjugado PS-hapteno

Se administran a ratones inmunizaciones subcutáneas con tampón, KLH-PC o KLH-PS 7 días y 14 días después de la administración de las células tumorales isogénicas. Se utiliza adyuvante Provax con todos los inmunógenos.

5.6.1.4 Inyecciones de célula tumoral

Se preparan suspensiones celulares por tripsinización. La inyección intravenosa de aproximadamente 1,2 \times 10^{4} células RENCA produce \sim10 a 30 nódulos tumorales pulmonares en 3 a 4 semanas. La inyección de 5 \times 10^{4} células MTB-2 en la pared de la vejiga produce 100 a 200 mg de tumores en el 100% de los ratones en 40 días.

5.6.1.5 Eficacia terapéutica

Los puntos finales de la terapia son cuantitativos y permiten la comparación estadística de los efectos antitumorales y la medición de la utilidad terapéutica. En el modelo RENCA, se comparan el peso de los pulmones y el número de nódulos tumorales en el pulmón (2 a 4 mm) entre los grupos experimentales. En el modelo MTB-2, se cuantifican los pesos de las vejigas y la presencia de metástasis en los ganglios linfáticos locales.

5.7 Ejemplo 7

Caracterización de inmunidad autorreactiva

Estos estudios fueron diseñados para determinar la naturaleza de la respuesta inmunitaria que es responsable de la destrucción dependiente de PS de modelos tumorales isogénicos. En resumen, se examinó la contribución de los mecanismos tanto mediados por células como inmunitarios humorales.

5.7.1 Ensayo de citotoxicidad celular tumoral mediada por macrófagos

Se extraen macrófagos del peritoneo de grupos de ratones apropiados. Se recogen por tripsinización células tumorales marcadas con ^{125}I-yododesoxiuridina y se colocan en placas de microvaloración a razón de 5 \times 10^{3} células/pocillo (relación macrófago:célula diana=25:1). Como referencias, se colocan en placas células diana marcadas sin macrófago. Después de 72 h, las células diana viables restantes se lisan con detergente. Se mide la radiación y se informatiza el porcentaje de citotoxicidad mediada por macrófagos.

5.7.2 Ensayo de citotoxicidad de células de bazo y de ganglio linfático e inhibición del crecimiento de células tumorales

Se extraen bazos y ganglios linfáticos de ratones con tumor de referencia y ratones con tumor inmunizados. Se preparan suspensiones celulares y se añaden 10^{4} células a placas de microvaloración de fondo plano de 96 pocillos con células tumorales diana isogénicas (2 \times 10^{5} linfocitos/pocillo). Se mide la inhibición del crecimiento tumoral a las 120 h mediante la hidrólisis de hidroetidina. Se determina la citotoxicidad incubando células de bazo y de ganglio linfático con las células diana con ^{125}I descritas anteriormente.

5.7.3 Análisis de los datos

Las diferencias en el número de metástasis entre los grupos se evalúan mediante la prueba Mann-Whitney. El significado de la citotoxicidad se analiza por la prueba de la t de Student.

5.7.4 Ensayo de APA (respuesta humoral)

Se identifica el anticuerpo autorreactivo en ratones inmunizados mediante Ig anti-ratón completo en sandwich estándar. Los órganos ensayados incluían secciones congeladas de estómago, colon, riñón, hígado, pulmones, bazo, ganglios linfáticos y músculo. Se evalúan los títulos de APA mediante el ensayo de anticuerpo contra fosfolípido utilizando la técnica normalizada de laboratorio clínico (ELISA).

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Zwaal, Roelofsen, Comfurius, et al., Biochim. Biophys. Acta, 406:83, 1975.

Todas las composiciones y métodos dados a conocer y reivindicados en la presente memoria pueden prepararse y ejecutarse sin excesiva experimentación a la luz del presente descubrimiento. Aunque las composiciones y los métodos de esta invención se han descrito en términos de formas de realizaciones preferidas, para los expertos en la materia es evidente que pueden aplicarse variaciones a la composición, métodos y en las etapas o en la secuencia de las etapas del método descrito en la presente memoria sin apartarse de la invención.

Claims (29)

1. Utilización de una composición que comprende un conjugado de fosfatidilserina/polipéptido para la preparación de un medicamento destinado a inhibir el crecimiento de células cancerosas o destruir células cancerosas provocando una respuesta inmunitaria con una cantidad inmunológicamente eficaz de dicha composición.

2. La utilización de la reivindicación 1, en la que dicha célula cancerosa es una célula cancerosa linfoide, renal o vesical.

3. La utilización de la reivindicación 1, en la que dicha célula cancerosa está comprendida en un animal.

4. La utilización de la reivindicación 3, en la que dicho animal es un ser humano.

5. La utilización de la reivindicación 1, en la que dicha composición comprende además un excipiente farmacéutico.

6. La utilización de la reivindicación 5, en la que dicha composición se administra a dicho ser humano por vía tópica, parenteral, oral, subcutánea o por inyección directa en un punto del tejido.

7. La utilización de la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido se selecciona de entre el grupo constituido por BSA, KLH, BGG, toxina de la difteria y \beta_{2}-glucoproteína I.

8. La utilización de la reivindicación 7, en la que dicho polipéptido es la \beta_{2}-glucoproteína I.

9. Utilización de una composición que comprende un conjugado de fosfatidilserina/polipéptido para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer que comprende provocar una respuesta inmunitaria con una cantidad inmunológicamente eficaz de dicha composición.

10. Utilización de un lípido o de un conjugado de lípido/polipéptido para la preparación de un medicamento destinado a tratar el cáncer que comprende poner en contacto un sujeto con dicho lípido o conjugado eficaz para tratar dicho cáncer, en la que dicho lípido es fosfatidilcolina o fosfatidilserina.

11. Utilización de una composición farmacéutica que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición de conjugado de fosfatidilcolina/polipéptido o de fosfatidilserina/polipéptido para la preparación de un medicamento destinado a generar una respuesta inmunitaria, que comprende administrar a un animal dicha composición.

12. Un método de preparación de un anticuerpo que se une específicamente a fosfatidilserina, un conjugado de fosfatidilcolina/polipéptido o un conjugado de fosfatidilserina/polipéptido, comprendiendo dicho método administrar a un animal no humano una composición farmacéutica que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición de conjugado de fosfatidilcolina/polipéptido o de fosfatidilserina/polipéptido.

13. El método de la reivindicación 12, en el que se administra al animal una composición que comprende un conjugado de fosfatidilserina/BSA, fosfatidilserina/KLH, fosfatidilserina/BGG o fosfatidilserina/\beta_{2}-glucoproteína I.

14. Un anticuerpo que se une específicamente a fosfatidilserina, la parte lipídica de un conjugado de fosfatidilcolina/polipéptido o la parte lipídica de un conjugado de fosfatidilserina/polipéptido, preparado dicho anticuerpo por un procedimiento que comprende administrar a un animal no humano una composición farmacéutica que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición de conjugado de fosfatidilcolina/polipéptido o de fosfatidilserina/polipéptido.

15. El anticuerpo de la reivindicación 14, en el que se administra al animal una composición que comprende un conjugado de fosfatidilserina/BSA, fosfatidilserina/KLH, fosfatidilserina/BGG o fosfatidilserina/\beta_{2}-glucoproteína I.

16. El anticuerpo de la reivindicación 14, en el que dicho polipéptido es la \beta_{2}-glucoproteína I.

17. El anticuerpo de la reivindicación 14, en el que el anticuerpo está unido a un marcador detectable.

18. El anticuerpo de la reivindicación 17, en el que el anticuerpo está unido a un marcador detectable, un marcador fluorógeno, un marcador de resonancia de spin magnético nuclear, biotina o a una enzima que genera un producto detectable en contacto con un sustrato cromógeno.

19. El anticuerpo de la reivindicación 17, en el que el anticuerpo está unido a una enzima fosfatasa alcalina, hidrógeno peroxidasa o glucosa oxidasa.

20. El anticuerpo de la reivindicación 14, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

21. Utilización de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 20 para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer.

22. Un método para detectar una fosfatidilserina, un conjugado de fosfatidilcolina/polipéptido o de fosfatidilserina/polipéptido en una muestra biológica, que comprenden las etapas siguientes:

(a)

poner en contacto una muestra biológica que se supone que contiene un conjugado de fosfatidilcolina/polipéptido o de fosfatidilserina/ polipéptido con un primer anticuerpo que se une a un conjugado de fosfatidilcolina/polipéptido o de fosfatidilserina/ polipéptido, en condiciones eficaces que permitan la formación de complejos inmunitarios; y

(b)

detectar los complejos inmunitarios formados de este modo.

23. Un kit de inmunodetección que comprende, en un recipiente adecuado, un anticuerpo que se une específicamente a fosfatidilserina o a un conjugado de fosfatidilserina/polipéptido, y un reactivo de inmunodetección.

24. El kit de inmunodetección de la reivindicación 23, en el que el reactivo de inmunodetección es un marcador detectable que está unido a dicho conjugado o a dicho anticuerpo.

25. El kit de inmunodetección de la reivindicación 23, en el que el reactivo de inmunodetección es un marcador detectable que está unido a un segundo anticuerpo que tiene afinidad de unión para dicho conjugado o dicho primer anticuerpo.

26. Utilización de una composición que comprende fosfatidilserina o un conjugado de fosfatidilserina/polipéptido para la preparación de un medicamento destinado a tratar el cáncer en un animal que comprende generar en dicho animal una respuesta inmunitaria a dicha composición.

27. La utilización de la reivindicación 26, en la que la composición comprende un conjugado de fosfatidilserina/polipéptido que comprende un polipéptido seleccionado del grupo consistente en BSA, KLH, BGG, toxina de la difteria y \beta_{2}-glucoproteína I.

28. La utilización de la reivindicación 11, en la que la composición comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición de conjugado de fosfatidilcolina/polipéptido.

29. La utilización de la reivindicación 11, en la que la composición comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición de conjugado de fosfatidilserina/polipéptido.