ES2283973T3 - Cromatografia de afinidad sobre capa superficial. - Google Patents

Abstract

Un sistema de ensayo por cromatografía de afinidad que comprende un componente inmovilizado que contiene un bioreactivo, estando dicho componente inmovilizado soportado por una superficie plana, y un componente fluible que contiene un bioreactivo complementario, caracterizado porque el componente fluible está adaptado para formar una solución más densa que rueda lentamente hacia la parte baja de la superficie.

Description

Cromatografía de afinidad sobre capa superficial.

La inmunocromatografía se lleva a cabo actualmente en dos formatos principales. El primero se lleva a cabo dentro de geles cuando se consigue el desarrollo por difusión pasiva o se induce elecroquímicamente, y el segundo se lleva a cabo en flujo. En el primero, que utiliza geles, la inmunodifusión radial es el sistema más comúnmente utilizado con un gel preformado a menudo situado dentro de una placa circular en la cual existe un pocillo central en el gel junto con pocillos adicionales situados alrededor del borde del gel. El antisuero antígeno se posiciona en el pocillo central y el antígeno o antisuero se posiciona en los pocillos periféricos. La difusión pasiva se produce dentro del gel y se observan una bandas blancas de inmunocomplejo dentro del gel debidas a la formación del complejo anticuerpo-antígeno. En el sistema electroquímico se induce la migración de anticuerpo/antígeno dentro del gel usando una corriente eléctrica.

En el sistema basado en el flujo el anticuerpo o antígeno está a menudo inmovilizado dentro de un cartucho que marca el ritmo con un sistema de flujo líquido tal como un sistema de análisis por inyección. El antígeno o anticuerpo complementario es inyectado y fluye a través del cartucho donde se producen interacciones específicas. A menudo el componente que es inyectado lleva una etiqueta que puede ser detectada corriente abajo, produciendo de este modo una señal. Alternativamente el flujo se produce sobre una superficie plana como en los sistemas de inmunoensayo de difusión de flujo lateral donde el flujo es inducido por humectación/capilaridad de la membrana.

En el nuevo formato la inmunoreacción equivalente se produce en el flujo entre un componente inmovilizado y uno en solución como anteriormente pero esto se produce ahora sobre la superficie de una tira de inmersión que se encuentra dentro de una solución tampón. En este caso se produce el flujo que atraviesa la superficie de la tira debido a la mayor densidad de una solución que contiene uno de los inmunoreactivos que está inicialmente presente en la parte superior de la tira que se encuentra ella misma en posición vertical en la solución tampón. Puesto que la tira está casi en posición vertical esta solución más densa rueda lentamente hacia la parte baja de la superficie de la tira que presenta el reactivo en la fase de flujo al reactivo inmovilizado sobre la superficie de la tira de inmersión.

De este modo, según la invención se proporciona un sistema de ensayo por cromatografía de afinidad que comprende un componente inmovilizado que contiene un bioreactivo y un componente fluible que contiene un bioreactivo complementario caracterizado porque el componente inmovilizado está soportado sobre una tira de inmersión u otra superficie plana y el componente fluible de alta densidad está adaptado para fluir por la tira de inmersión.

Con el fin de que este fenómeno funcione se han de cumplir algunos criterios. En primer lugar, la solución más densa debe ser retenida en un volumen discreto a medida que pasa como una capa sobre la superficie en lugar de ser difundida rápidamente dentro del grueso de la solución tampón. En segundo lugar, la tira de inmersión debe poseer algunas propiedades que producen la atracción de la capa superficial rodante que conduce de nuevo a la retención de la integridad de esta fase móvil. Para conseguir el primer criterio se han de elegir cuidadosamente los constituyentes de la fase rodante para incluir un agente polimérico tal como una proteína y/o un polisacárido, un detergente y un tampón de pH óptimo, y para el segundo se utiliza una membrana que es a la vez hidrófoba y humectable.

El sistema se puede utilizar como un sistema de inmunocromatografía y los ensayos se pueden llevar a cabo bien en formatos de inmunoensayo competitivos o no competitivos. En los primeros, el punto inmovilizado es bien un anticuerpo o un antígeno. Para el anticuerpo inmovilizado, un antígeno marcado es depositado en una banda por encima del punto en un cuadrado de celulosa. Una gota de la muestra que contiene el antígeno es añadida a este cuadrado y después de un intervalo apropiado (1 - 10 mn) toda la tira se sumerge en una solución tampón. La mezcla densa del antígeno marcado y no marcado fluye sobre el punto de anticuerpo se produce la competición para la unión. Si el antígeno está inmovilizado en el punto, un anticuerpo marcado reemplaza el antígeno marcado en el cuadrado de celulosa y el ensayo procede como antes.

El sistema también puede ser realizado en un formato de inmunoensayo no competitivo cuando un punto de anticuerpo de captura está inmovilizado en la tira. El anticuerpo marcado se deposita sobre el cuadrado de celulosa por encima del primer punto. La tira se coloca en la solución de muestra que contiene el antígeno de manera que el cuadrado superior esté sumergido. Ahora se produce la incubación durante la cual es capturado el antígeno en la solución por el anticuerpo inmovilizado en el punto. Al mismo tiempo el anticuerpo marcado es reconstituido en una solución densa que fluye sobre el punto después de aproximadamente 5 - 10 minutos a continuación de la inserción de la tira dentro de la solución de muestra. Este intervalo de tiempo permite que las moléculas de antígeno sean capturadas en el punto antes de la llegada de la capa superficial que contiene el anticuerpo marcado. Este segundo anticuerpo marca el antígeno capturado sobre la superficie del punto.

Además, se puede usar cualquier marca. Si se utiliza un marcaje fluorescente o de color con el anticuerpo o antígeno, entonces se producirá un punto fluorescente o de color después de la primera incubación, convirtiendo al ensayo en un sistema de etapa única.

Si se utiliza una marca enzimática entonces se puede utilizar una secuencia modificada de etapas en el ensayo no competitivo. En este, se añade el anticuerpo marcado con enzima al cuadrado de celulosa fijado a la parte inferior de la tira por debajo del punto del anticuerpo de captura inmovilizado. Un segundo cuadrado de celulosa está también fijado como antes por encima de este punto pero éste contiene una solución deshidratada de sustrato para la enzima más un biopolímero tal como dextrano. La tira se coloca en un volumen limitado de muestra como anteriormente para de este modo no mojar el cuadrado de celulosa superior. La solución densa reconstituida de anticuerpo marcado fluye al fondo del recipiente y permanece ahí en forma de capa separada. Al mismo tiempo el antígeno en solución es capturado por el anticuerpo en el punto. Al final de esta etapa de incubación (5 - 10 minutos), la solución es agitada usando la tira de inmersión. Esto produce que el anticuerpo marcado sea distribuido homogéneamente dentro de la solución y que el anticuerpo pueda ahora unirse al antígeno capturado en el punto. Finalmente el volumen del recipiente aumenta para humectar el cuadrado superior de celulosa. El sustrato está ahora reconstituido en forma de una solución densa que fluye sobre el punto cuando se produce la conversión de sustrato a producto dando como resultado un punto de color.

Según otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para llevar a cabo ensayos de inmunocromatografía que comprenden el uso de un sistema de ensayo como se ha descrito anteriormente.

Este nuevo fenómeno de cromatografía de capa superficial podría, en teoría usarse también como un procedimiento cromatográfico genérico para la separación de mezclas de analitos si los componentes tienen diferentes afinidades de unión para la superficie. Por ejemplo, es bien conocido que los polímeros biológicos tales como las proteínas y el ADN/ARN se unen al nitrato de celulosa cuando se usa en electroforesis de seguimiento de transferencia de ADN y proteínas. Se ha observado que para los anticuerpos, la velocidad de unión a esta superficie es sensible al pH (1). Por lo tanto, debería ser posible introducir una mezcla de los polímeros biológicos sobre una tira de celulosa por encima de un cuadrado de nitrato de celulosa. El pH y la densidad del tampón usado serían tales que permitieran el desarrollo de la cromatografía de capa superficial cuando la tira es sumergida dentro de una segunda solución tampón elegida para optimizar la unión de los biopolímeros a la superficie. En estas condiciones, se producirán diferentes interacciones de unión entre las biomoléculas y la superficie a medida que la capa de fase móvil rueda hacia la parte baja de la superficie. Esto debería conducir a la separación de los componentes durante esta fase de desarrollo. La tira entonces se retiraría y se trataría la membrana para visualizar, usando los procedimientos establecidos, los componentes ahora inmovilizados de la mezcla.

La invención será ahora ilustrada con referencia al ejemplo anexo.

Ejemplo 1

En un ejemplo de este nuevo sistema inmunocromatográfico que se denomina Inmunocromatografía sobre capa superficial (SLIC), un pequeño cuadrado de membrana de nitrato de celulosa es pretratado por procedimientos establecidos con un anticuerpo específico a un antígeno tal como savinasa, para producir un punto de reactivo inmovilizado. Este cuadrado se adhiere sobre la superficie de una tira de plástico prerrevestida con una superficie pegajosa. Por encima de esta se adhiere una segunda tira de celulosa impregnada con una solución deshidratada del mismo anticuerpo marcado con la enzima reportera, fosfatasa alcalina, junto con albúmina de suero bovino (BSA) y Tween 20. La solución usada para esta deposición es Tris (pH 9,3) y se usa un volumen de 10 \mul. La composición de esta solución es 0,1% de BSA en p/v, 0,1% de Tween 20 en p/v, anticuerpo marcado de enzima diluido 1: 1000 en tampón Tris (0,1 M). Los reactivos en este formato cuando se almacenan a temperatura ambiente en un deshidratador son estables sobre la tira durante al menos 14 días.

Para llevar a cabo el ensayo, se coloca una solución de savinasa (0,3 ml) en tampón Tris en un tubo de ensayo tal como una placa de microensayo convencional de 96 pocillos. La tira de inmersión se inserta ahora dentro del pocillo cuando ambos cuadrados están cubiertos por la muestra. Al mojarse, los reactivos de dentro del cuadrado de celulosa pasan a la solución. Debido a su mayor densidad, esta solución fluye ahora como una capa por la superficie de la tira y pasa finalmente sobre el cuadrado inferior que contiene el punto de anticuerpo inmovilizado. En el intervalo de tiempo entre la inmersión de la tira y la llegada de la fase de flujo, las moléculas de savinasa del grueso de la solución habrán sido capturadas por los anticuerpos inmovilizados en el punto inferior. Al llegar la fase de flujo, el anticuerpo marcado se unirá a las moléculas de antígeno capturadas como en un ELISA convencional de tipo sándwich, a medida que la solución fluye sobre el punto. Este primer periodo de incubación es típicamente de 15 minutos.

La tira es retirada del pocillo y se coloca en los pocillos que contienen la mezcla de sustrato comúnmente usada para la fosfatasa alcalina, la bromocloroindolil fosfatasa (BCIP) y sal de tetrazolio nitroazul (NBT). Después de una incubación de 1 minuto se desarrolla un color púrpura/azul, cuya intensidad es directamente proporcional a la cantidad de savinasa capturada sobre el punto durante la primera etapa de incubación, y por lo tanto la concentración de la savinasa en la muestra. El cuadrado superior también es de color púrpura/azul. Un examen de las tiras resultantes se muestra para este analito. Se debería resaltar que se utilizan 12 tiras de este tipo en un formato de tipo peine ya que éste permite el análisis de hasta 96 muestras/patrones (8x12) a realizar con una única placa de microensayo. Se ha de resaltar que se observa claramente la discriminación visual entre el patrón cero y el patrón de 5 ng/ml.

Ejemplo 2

Como en el ejemplo 1, un pequeño cuadrado de membrana de nitrato de celulosa con un punto de anticuerpo específico está fijado a la superficie de una tira de plástico. Por debajo se coloca esta segunda tira de celulosa (cortada en cuadrados de 0,4 x 0,6 cm de papel filtrante de endurecimiento rápido). Este cuadrado se impregna con 5 \mul de solución diluida del mismo anticuerpo marcado con la enzima reportera, fosfatasa alcalina, en una solución de dextrano azul, (3% p/v), dextrano (25 p/v), todo en tampón Tris con azida, pH 9,3 (que contiene 0,1% de Tween 20 y 0,15 (p/v) de albúmina de suero bovino). La solución aplicada se deja secar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Un tercer cuadrado de papel filtrante de endurecimiento rápido se adhiere por encima del primer cuadrado y se impregna con el sustrato para alcalino fosfatasa. Esto se prepara por adición de 15 \mul de una mezcla del 1% (p/v) de dextrano azul, 1% (p/v) de dextrano y una solución de madre de BCIP-NBT Se deja secar durante 60 minutos a temperatura ambiente adhiriéndose en este momento el cuadrado a la tira de inmersión.

Las tiras de inmersión pre-preparadas se añaden entonces a microcubetas que contienen 0,6 ml de patrones o muestras. Después de 10 minutos se observa una capa de solución azul en la base de la cubeta. Las tiras se usan para agitar los contenidos de las cubetas. Esto produce una coloración azul uniforme en toda la solución. Se incuba durante 5 minutos más, a continuación se añaden 500 \mul de solución tampón de sustrato para cubrir ahora el cuadrado superior en la tira de inmersión. Se incuba durante los 10 últimos minutos, a continuación se retiran las tiras y se lavan con agua.

Cuando se usan anticuerpos antisavinasa de conejo como anticuerpos de captura o encapsuladores en presencia de patrones de savinasa, se observan las siguientes tiras cuando se sigue el protocolo anterior.

Las tiras de inmersión resultantes son ilustradas en la figura 1, en la cual

A = patrones cero, B = patrones de 10 ng/ml de savinasa.

Claims (20)

1. Un sistema de ensayo por cromatografía de afinidad que comprende un componente inmovilizado que contiene un bioreactivo, estando dicho componente inmovilizado soportado por una superficie plana, y un componente fluible que contiene un bioreactivo complementario, caracterizado porque el componente fluible está adaptado para formar una solución más densa que rueda lentamente hacia la parte baja de la superficie.

2. Un sistema de ensayo por cromatografía de afinidad según la reivindicación 1, caracterizado porque la superficie plana está en forma de una tira de inmersión, en el cual dicho componente fluible está adaptado para formar una solución más densa que rueda lentamente hacia la parte baja de la superficie de la tira de inmersión.

3. Un sistema de ensayo por cromatografía de afinidad según la reivindicación 1, caracterizado porque la superficie plana está en forma de una membrana fijada a una tira de inmersión.

4. Un sistema de ensayo por cromatografía de afinidad según la reivindicación 1 o la reivindicación 3, que posee propiedades que dan como resultado la atracción del componente fluible hacia la superficie plana.

5. Un sistema de ensayo por cromatografía de afinidad según la reivindicación 4, caracterizado porque la membrana es a la vez hidrófoba y humectable.

6. Un sistema de ensayo por cromatografía de afinidad según la reivindicación 1, caracterizado porque el componente fluible es de una densidad mayor que el grueso de la solución del tampón.

7. Un sistema de ensayo por cromatografía de afinidad según la reivindicación 1, caracterizado porque el bioreactivo es un antígeno o un anticuerpo.

8. Un sistema de ensayo por cromatografía de afinidad según la reivindicación 1, caracterizado porque el componente fluible está retenido en un volumen discreto.

9. Un sistema de ensayo por cromatografía de afinidad según la reivindicación 1, caracterizado porque los constituyentes del componente fluible incluyen un biopolímero, un detergente y un tampón de un pH que garantiza una unión óptima del biopolímero a la superficie plana.

10. Un sistema de ensayo por cromatografía de afinidad según la reivindicación 7, caracterizado porque el ensayo es bien un inmunoensayo competitivo o no competitivo que usa combinaciones de antígeno marcado o anticuerpo marcado con sus equivalentes complementarios no marcados.

11. Un sistema de ensayo por cromatografía de afinidad según la reivindicación 10, caracterizado porque el marcaje es un marcaje fluorescente o de color.

12. Un procedimiento para realizar un ensayo por cromatografía de afinidad que comprende el uso de un sistema de ensayo según la reivindicación 1.

13. Un procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque una tira de inmersión proporciona la superficie plana.

14. Un procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque la tira de inmersión se mantiene sustancialmente en vertical en una solución tampón.

15. Un procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque el componente fluible es dispensado adyacente a la parte superior o inferior de la tira de inmersión.

16. Un procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque el procedimiento comprende la separación de las mezclas de analitos.

17. Un procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque los componentes tienen diferentes afinidades de unión para la superficie.

18. Un procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque el procedimiento comprende un ensayo de etapa única.

19. Un procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque el procedimiento comprende la separación de polímeros biológicos.

20. Un procedimiento según la reivindicación 19, caracterizado porque los polímeros biológicos son seleccionados entre proteínas y ADN/ARN.