ES2283220B1

ES2283220B1 - Uso de agonistas del receptor opioide delta en la elaboracion de composiciones farmaceuticas, composiciones farmaceuticas que las contienen y sus aplicaciones en el tratamiento de tumores.

Info

Publication number: ES2283220B1
Application number: ES200600960A
Authority: ES
Inventors: Beatrice Duthey; Wolf-Henning Boehncke; Jens Gille; Carlos Martinez-A.
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 2006-04-12
Filing date: 2006-04-12
Publication date: 2008-11-01
Anticipated expiration: 2026-04-12
Also published as: WO2007116114A1; ES2283220A1

Abstract

Uso de agonistas del receptor opioide delta en la elaboración de composiciones farmacéuticas, composiciones farmacéuticas que las contienen y sus aplicaciones en el tratamiento de tumores. Esta invención se fundamenta en el efecto bloqueante del agonista DPDPE sobre la cascada de señalización intramolecular, iniciada por el par CXCL12-CXCR4, que induce la progresión tumoral y la formación de metástasis. Así, la invención describe que el tratamiento con DPDPE in vivo reduce las metástasis en modelos animales, mediante un mecanismo que no implica la respuesta inmune.

Description

Uso de agonistas del receptor opioide delta en la elaboración de composiciones farmacéuticas, composiciones farmacéuticas que las contienen y sus aplicaciones en el tratamiento de tumores.

Sector de la técnica

La invención se encuadra en el sector biomédico, concretamente en el campo del desarrollo de composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades tumorales, y más específicamente, en la utilización de agonistas del receptor opioide delta (por ejemplo, el DPDPE, D-Pen-D-Pen-encefalina), como nuevos agentes antitumorales que reducen específicamente la progresión tumoral y la aparición de metástasis por diseminación sanguínea.

Estado de la técnica

El receptor de quimioquina CXCR4 interviene en el establecimiento de metástasis al promover la migración y la adhesión de las células tumorales a los nódulos linfáticos, los pulmones y el hígado, cuando su ligando, CXCL12, es sobreexpresado en esas localizaciones (Benovic, J.L. and Marchese, A. 2004.; Muller, A. et al, 2001; Balkwill, F., 2004). CXCR4 está sobreexpresado en numerosos tipos de células tumorales y su presencia anticipa resultados clínicos poco satisfactorios (Kang H et al. 2005; Salvucci o et al. 2005; Wang N et al. 2005). Además, se ha constatado que el uso de antagonistas de CXCR4, como el AMD 3100, anticuerpos bloqueantes o estrategias de ARN interferente reducen las metástasis en varios modelos murinos (Liang, Z. et al, 2004; Lapteva, N. et al, 2005; Takenaga, M. et al, 2004). CXCL12 es liberado en grandes cantidades a nivel de nódulos linfáticos, pulmones e hígados, órganos donde las metástasis tienden a aparecer. En resumen, hay evidencias suficientes para relacionar el par CXCR4-CLCX12 con el desarrollo de metástasis, y por tanto, para considerarlo una diana en el diseño de potenciales fármacos contra el cáncer.

CXCR4 pertenece a la superfamilia de receptores acoplados a la proteína G (GPCR). Los receptores opioides también forman parte de esta familia. Los opiáceos endógenos (endorfinas) son pequeñas moléculas peptídicas, descubiertas inicialmente en tejidos cerebrales, que reducen la sensación de dolor. Los opiáceos se unen a los GPCRs mu, delta y kappa (Kirk-Othmer, 1996; Kieffer BL, 2000). Si bien se expresan a altos niveles en el cerebro, los opiáceos también han sido detectadas en células del sistema inmune y en algunos tipos de células malignas, como las de los melanoma, tumores de próstata y pulmón (Fichna, J. and Janecka, A. 2004), donde su papel es todavía desconocido. Distintos estudios con leucocitos in vitro han mostrado que los opiáceos pueden bloquear los receptores de quimioquinas mediante desensibilización heteróloga (Rogers, T.J. et al, 2000). La desensibilización heteróloga es un mecanismo bien estudiado en esta superfamilia de receptores: un GPCR resulta activado por un agonista, iniciándose un proceso de señalización que conduce a la inactivación de otro GPCR, produciéndose así una modulación cruzada.

Las metástasis tumorales constituyen la causa de mortalidad determinante en la mayoría de los cánceres malignos. Teniendo en cuenta la interacción cruzada que se puede establecer entre los opiáceos y receptores relacionados con la migración de células tumorales, esta invención descubre que a los opiáceos agonistas del receptor delta pueden actuar como agentes antitumorales eficaces en la reducción de metástasis.

Descripción Descripción breve

Un objeto de la presente invención lo constituye la utilización de agonistas del receptor delta opiáceo, en adelante utilización de un compuesto de la presente invención, en la elaboración de medicamentos o composiciones farmacéuticas para la prevención y/o tratamiento del cáncer.

Un objeto particular de la presente invención lo constituye la utilización de un compuesto de la invención en el que el compuesto agonista pertenece al siguiente grupo, ya sean de estructura peptídica o no: compuestos de diarilmetilpiperazina (U.S. Pat 20060004016, Chang; Kwen-Jen 2006, Enantiomerically pure opioid diarylmethylpiperazine as a cardioprotection agent), TAN-67 (Fryer et al. in 274 J. Biol. Chem. 451-457, 2000), derivados tetracíclicos de piridina y pirazina (WO 99/04795, Toray Industries Inc.), pirrolooctahidroisoquinolonas (Dondio, G. et al. Discovery of a novel class of substituted pyrrolooctahydroisoquinolines as potent and selective.delta. opioid agonists, based on an extension of the message-address concept. J. Med. Chem. 1997, 40: 3192-3198), el compuesto BW373U86 (Chang, KJ. et al. A novel potent and selective nonpeptidic delta opioid receptor agonist, BW373U86. J. Pharm. Exp. Ther. 1993, 267, 852-857), el compuesto SNC 80 (Calderon, SN. et al. Probes for narcotic receptor mediated phenomena 19. Synthesis of (+)-4-[(.alpha.R)-.alpha.-(2S,5R)-4-allyl-2,5-dimethyl-1-piperazinyl)-3-methoxybenzyl]-N,N-diethylbenzamide (SNC 80) A highly selective, nonpeptide.delta. opioid receptor agonist. J. Med. Chem. 1994, 37, 2125-2128), DPDPE y deltorfina I y II (U.S. Pat. 5,389,645 y 5,985,880, DPDPE [D-Pen.sup.2, D-Pen.sup.5]-(enkephalin) y heptapéptidos [deltorfina I y II] respectivamente), bifalina (Crystal structure of biphalin sulfate: a multireceptor opioid peptide. Flippen-Anderson JL et al. J Pept Res 2002, 59: 123-33), el péptido DADLE ([D-Ala2, D-Leu5] enkephalin (DADLE) protects liver against ischemia-reperfusion injury in the rat. Yamanouchi K, et al. J Surg Res. 2003, 114: 72-7) y la metadona.

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Una realización particular de la presente invención lo constituye el uso de un compuesto de la invención en el que el compuesto agonista es el agonista D-Pen-D-Pen-encefalina (DPDPE).

Otro objeto de la presente invención lo constituye una composición farmacéutica, en adelante composición farmacéutica de la presente invención, que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto o agente agonista del receptor opioide delta, junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.

Otro objeto particular de la presente invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención en la que el compuesto agonista pertenece al siguiente grupo, ya sean de estructura peptídica o no: compuestos de diarilmetilpiperazina, TAN-67, derivados tetracíclicos de piridina y pirazina, pirrolooctahidroisoquinolonas, el compuesto BW373U86, el compuesto SNC 80, DPDPE, deltorfina I y II, bifalina, el péptido DADLE y la metadona.

Otro objeto particular de la presente invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención en la que el compuesto es el agonista D-Pen-D-Pen-encefalina (DPDPE).

Otro objeto de la presente invención lo constituye el uso de la composición farmacéutica de la invención en el tratamiento de un mamífero, preferentemente un ser humano, afectado por cáncer, en adelante uso de la composición farmacéutica de la presente invención, consistente en la administración de dicha composición terapéutica que reduce la progresión tumoral, por ejemplo, la migración, extravasación y asentamiento de células tumorales en localizaciones distintas de la original (metástasis).

Descripción detallada

La presenta invención ofrece una nueva estrategia terapéutica para la profilaxis y/o tratamiento de enfermedades tumorales humanas.

La invención se basa en que los inventores han identificado el efecto inactivante del compuesto DPDPE, agonista del receptor opioide delta, sobre la cascada de eventos moleculares inducida por el par, ligando-receptor, CXCL12-CXR4 que induce a la progresión tumoral, por ejemplo al establecimiento de metástasis. Este efecto inactivante se produce tras su unión al receptor opiáceo delta y por un proceso de modulación cruzada entre receptores GPCR (Ejemplo 1).

Los inventores han descubierto que el DPDPE podría ejercer una desensibilización heteróloga sobre CLCX12-CXR4, reduciendo la adhesión celular, la migración celular, la extravasación y el anclaje en órganos distantes de las células tumorales (Ejemplo 2). Así, el tratamiento con DPDPE en animales que habían sido inyectados con células de melanona redujo la aparición de focos de metástasis en el pulmón (Ejemplo 2).

Actualmente se están realizando ensayos clínicos de las propiedades analgésicas de DPDPE (Quock RM et al. 1999). Esta invención muestra que la aplicación del DPDPE podría también extenderse a la eliminación de metástasis.

La utilización del DPDPE en el tratamiento de tumores ofrece las siguientes ventajas: 1) podría ayudar a remitir metástasis de numerosos tumores (de pulmón, hígado, nódulos, mama, próstata) en cuyas células aparecen receptores del agonista DPDPE y CXCR4; además, 2) podría representar una alternativa menos agresiva a los tratamientos de quimioterapia y radioterapia actuales; 3) considerando el efecto analgésico, se ha observado que en ratas el DPDPE causa menos efectos indeseados que la morfina, un opiáceo se administra a enfermos de cáncer en estado crítico (Cheng, et al, 1993); 3) por último, actualmente se buscan opiáceos que no atraviesen la barrera hematoencefálica y permanezcan en periferia.

Así, un objeto de la presente invención lo constituye la utilización de agonistas del receptor delta opiáceo, en adelante utilización de un compuesto de la presente invención, en la elaboración de medicamentos o composiciones farmacéuticas para la prevención y/o tratamiento de enfermedades tumorales humanas y animales.

Tal como se utiliza en la presente invención el término agonista del receptor opiáceo delta es un compuesto que se une o interactúa con el receptor opiáceo delta y cuya interacción induce sus efectos terapéuticos, es decir, analgésicos y/o antitumorales.

Un objeto particular de la presente invención lo constituye la utilización de un compuesto de la invención en el que el compuesto agonista pertenece al siguiente grupo, ya sean de estructura peptídica o no: compuestos de diarilmetilpiperazina (U.S. Pat 20060004016, Chang; Kwen-Jen 2006, Enantiomerically pure opioid diarylmethylpiperazine as a cardioprotection agent), TAN-67 (Fryer et al. in 274 J. Biol. Chem. 451-457, 2000), derivados tetracíclicos de piridina y pirazina (WO 99/04795, Toray Industries Inc.), pirrolooctahidroisoquinolonas (Dondio, G. et al. Discovery of a novel class of substituted pyrrolooctahydroisoquinolines as potent and selective.delta. opioid agonists, based on an extension of the message-address concept. J. Med. Chem. 1997, 40: 3192-3198), el compuesto BW373U86 (Chang, KJ. et al. A novel potent and selective nonpeptidic delta opioid receptor agonist, BW373U86. J. Pharm. Exp. Ther. 1993, 267, 852-857), el compuesto SNC 80 (Calderon, SN. et al. Probes for narcotic receptor mediated phenomena 19. Synthesis of (+)-4-[(.alpha.R)-.alpha.-(2S,5R)-4-allyl-2,5-dimethyl-1-piperazinyl)-3-methoxybenzyl]-N,N-diethylbenzamide (SNC 80) A highly selective, nonpeptide.delta. opioid receptor agonist. J. Med. Chem. 1994, 37, 2125-2128), DPDPE y deltorfina I y II (U.S. Pat. 5,389,645 y 5,985,880, DPDPE [D-Pen.sup.2, D-Pen.sup.5]-(enkephalin) y heptapéptidos [deltorpiin I and II] respectivamente), biphalin (Crystal structure of biphalin sulfate: a multireceptor opioid peptide. Flippen-Anderson JL et al. J Pept Res 2002, 59: 123-33), el péptido DADLE ([D-Ala2, D-Leu5] enkephalin (DADLE) protects liver against ischemia-reperfusion injury in the rat. Yamanouchi K, et al. J Surg Res. 2003, 114: 72- 7) y la metadona.

Tal como se utiliza en la presente invención el término "la utilización de un compuesto agonista" incluye además el uso de sus formas isoméricas, sales farmacéuticamente aceptables, derivados, solvatos, amidas, ésteres y éteres de los compuestos originales. Los compuestos agonistas de la presente invención utilizados pueden ser isómeros, incluyendo isómeros ópticos o enantiómeros. El uso de sus isómeros, enantiómeros o diastereoisómeros individuales y las mezclas de los mismos caen dentro del alcance de la presente invención. Los enantiómeros o diastereoisómeros individuales, así como sus mezclas, pueden separarse mediante técnicas convencionales.

Asimismo, dentro del alcance de esta invención se encuentran la utilización de los profármacos de los compuestos agonistas de la invención. El término "profármaco" tal como aquí se utiliza incluye a cualquier compuesto derivado de un compuesto agonista de la invención, por ejemplo, ésteres, incluyendo ésteres de ácidos carboxílicos, ésteres de aminoácidos, ésteres de fosfato, ésteres de sulfonato de sales metálicas, etc., carbamatos, amidas, etc., que, cuando se administra a un individuo es capaz de proporcionar, directa o indirectamente, dicho compuesto agonista de la invención en dicho individuo. Ventajosamente, dicho derivado es un compuesto que aumenta la biodisponibilidad del compuesto agonista cuando se administra a un individuo o que potencia la liberación del mismo en un compartimento biológico. La preparación de dicho profármaco puede llevarse a cabo mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia.

Tal como se utiliza en la presente invención el término "enfermedades tumorales" se refiere a patologías creadas por el crecimiento de células tumorales humanas o animales, y de forma más concreta nos referimos, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de sistema nervioso central y sarcoma. Así, otro objeto particular de la presente invención lo constituye la utilización de un compuesto de la invención en la elaboración de medicamentos o composiciones farmacéuticas para la prevención y/o tratamiento de enfermedades tumorales humanas pertenecientes, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al siguiente grupo: melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de sistema nervioso central y sarcoma.

Otro objeto de la presente invención lo constituye una composición farmacéutica, en adelante composición farmacéutica de la presente invención, que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto o agente agonista del receptor opioide delta, junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Dicha composición terapéutica es particularmente útil frente a células tumorales humanas y animales.

Otro objeto particular de la presente invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención en la que el compuesto agonista pertenece al siguiente grupo, ya sean de estructura peptídica o no: compuestos de diarilmetilpiperazina, TAN-67, derivados tetracíclicos de piridina y pirazina, pirrolooctahidroisoquinolonas, el compuesto BW373U86, el compuesto SNC 80, DPDPE, deltorfina I y II, biphalin, el péptido DADLE y la metadona.

En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye adyuvantes, sólidos o líquidos, disolventes, tensioactivos, etc.

Si se desea, dicha composición farmacéutica puede contener, además, uno o más agentes terapéuticos que, eventualmente, potencien la acción terapéutica de dicho compuesto agonista o bien que incrementen su espectro de acción.

Dicha composición farmacéutica puede ser utilizada para prevenir y/o tratar enfermedades tumorales humanas o animales.

El compuesto agonista estará presente en la composición farmacéutica en una cantidad terapéuticamente eficaz, es decir, en una cantidad apropiada para ejercer su efecto terapéutico. En una realización particular, la composición farmacéutica proporcionada por esta invención, contiene entre 0,01% y 99,99% en peso de un compuesto agonista y sus mezclas, y puede presentarse en cualquier forma farmacéutica de administración apropiada en función de la vía de administración elegida, por ejemplo, oral, parenteral o tópica. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de fármacos y de sus procedimientos de preparación puede encontrarse, por ejemplo, en el Tratado de Farmacia Galénica, C. Faulí i Trillo, 1ª edición, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones.

Otro objeto de la presente invención lo constituye el uso de la composición farmacéutica de la invención en el tratamiento de un mamífero, preferentemente un ser humano, afectado por una enfermedad tumoral, en adelante uso de la composición farmacéutica de la presente invención, consistente en la administración de dicha composición terapéutica que reduce la progresión tumoral, por ejemplo, la migración, extravasación y asentamiento de células tumorales en localizaciones distintas de la original (metástasis).

El uso de la composición farmacéutica de la invención puede por tanto ser útil para el tratamiento de pacientes con distintos tipos de cáncer, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, el melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de sistema nervioso central y sarcoma.

De esta manera, la invención proporciona un método para prevenir y/o tratar enfermedades tumorales en humanos que comprende la etapa de administrar a un ser humano, con necesidad de tratamiento, una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica proporcionada por esta invención.

En resumen, la presente invención considera la utilización de ciertos fármacos opiáceos no sólo como analgésicos sino también como agentes anti-tumorales, debido a la modulación cruzada por los agonistas del receptor opioide delta sobre la cascada de transducción CXCL12-CXCR4 que está implicada en la progresión tumoral y generación de metástasis.

Descripción de las figuras

Figura 1

Tinción inmunoquímica representativa de CXCR4 y del receptor opiáceo delta en células B16 de melanoma murino

Las células fueron permeabilizadas, fijadas y teñidas como se describe en materiales y métodos con anticuerpos anti-CXCR4 o anti-receptor opiáceo delta. Como control de tinción, las células fueron incubadas con un anticuerpo secundario anti-conejo marcado con FITC o con un anticuerpo secundario anti-ratón marcado con FITC. La expresión de los receptores se puede visualizar en las imágenes B (expresión de CXCR4) y D (expresión del DOR), mientras que A and C representan las células controles.

Figura 2

Desensibilización de CXCR4 por DPDPE

Las células fueron activadas con forscolina y los ligandos como se describe en materiales y métodos. Los niveles de AMPc fueron determinados a continuación. Las barras representan el porcentaje de inhibición del AMPc vs control (células pretratadas con forscolina y no expuestas a ligandos). Como se muestran en el gráfico, dosis de DPDPE del orden de 10^{-7} M reducen significativamente los niveles de AMPc. Los datos fueron recogidos a partir de cuatro experimentos independientes. Los datos se expresan como valores medios más desviación estándar. Se consideraron diferencias significativas para valores de P menores que 0.05.

Figura 3

Efecto de DPDPE en la viabilidad de las células B16

A) Perfil del ciclo celular de la línea B16 tratada con DPDPE durante 24, 48 y 72 horas. B) Las células crecieron bajo las condiciones descritas en ausencia y en presencia de DPDPE (10^{-5} M) de 24 a 72 horas. Las barras representan el número medio células por placa. Los datos son representativos de 4 experimentos independientes.

Figura 4

Unión de CXCL12 a células B16 de melanoma

Las células B16 fueron incubadas con CXCL12 marcado. Después de los tiempos indicados se cuantificó el I^{125}-CXCL12 unido a la superficie. Los datos son expresados como cuentas por minuto (cpm), procedentes de tres ensayos independientes. No se observa ninguna diferencia estadísticamente significativa entre los diferentes grupos.

Figura 5

Efecto de DPDPE en la adhesión y migración de células B16

A) Células B16 marcadas con BCECF fueron sembradas en placas cubiertas tratadas con fibronectina. A una concentración de DPDPE 10^{-3} M se observa un efecto similar al que se observa con una concentración de AMD3100 10^{-6} M. Los datos se expresan como luminiscencia a partir de al menos tres experimentos por grupo. B) Migración polarizada a través de matrigel de células B16 hacia CXCL12 en ausencia o en presencia de las sustancias indicadas. De nuevo, se puede observar una reducción de la movilidad celular, en este caso en la migración, después del tratamiento de las células B16 de melanoma con DPDPE. Los datos proceden de 3 experimentos, cada uno de ellos realizado por triplicado.

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Figura 6

Efecto de DPDPE en el movimiento rodante de células B16 in vivo

Células B16 marcadas con CFDA fueron inyectadas en ratones C57B1/6. Las interacciones de rodamiento de las células con la microvasculatura de la piel fueron observadas después de inyección subcutánea de CXCL12. Se estudiaron las interacciones de rodamiento de células B16 de melanoma pretratadas con DPDPE en el mismo suelo vascular. Cada par de datos conectados (líneas punteadas) representan el rodamiento de células no tratadas con DPDPE (izquierda) y células tratadas (derecha). La línea llena y los puntos de datos corresponden a la media de rodamiento en nueve vasos de cuatro ratones (P = 0.027, prueba t-student pareada).

Figura 7

Efecto de DPDPE sobre metástasis experimentales de pulmón en ratones C57/BL6

A) Células B16 fueron inyectadas por vía intravenosa en ratones singénicos C57/BL6. El gráfico muestra el número de puntos de metástasis presentes en la superficie de los pulmones en ratones C57/BL6 tratados o no con DPDPE 7 días después de la inoculación de células tumorales. En comparación con los controles, se observa una reducción de más del 50% en los animales tratados con DPDPE. El experimento fue repetido 3 veces con de 7 a 10 ratones por grupo. B) Efecto del DPDPE en ensayos de metástasis experimental de melanoma sobre pulmones con ratones SCID. Como el número de focos metastásicos no pudo ser contado en los ratones control, se muestra una estimación de la superficie afectada por la metástasis. De forma similar a los resultados obtenidos usando ratones C57/BL6, hay una gran reducción en la formación de metástasis debido al tratamiento con DPDPE. C) Imágenes representativas de pulmones en ratones C57BL/6 tratados o no tratados con DPDPE, una semana después de la inyección de células de melanoma B16 F10.

Propósitos adicionales, ventajas y características de la invención podrán desarrollarse en el estado de la técnica o ser aprendidos por la práctica del invento. A través de los métodos descritos y demandas no se intenta excluir otros rasgos técnicos, componentes, aditivos o etapas del proceso que surjan como resultado del desarrollo de la técnica. Los siguientes ejemplos e ilustraciones no intentan limitar la presente invención.

Ejemplos de la invención Ejemplo 1 Efecto del agonista opiáceo DPDPE sobre el par receptor-ligando CXCR4-CXCL12

Se realizaron ensayos con melanoma de ratón, tanto in vivo como in vitro. En primer lugar, se buscó si las células B16 de melanoma de ratón expresaban los receptores del agonista DPDPE y CXCR4 (marcaje inumnoquímico). Células de melanoma ratón B16 (colección americana de cultivos tipo ATTC N° CRL-6475; Manassas, VA) fueron crecidas en medio Dulbecco-Eagle modificado (Sigma, St. Louis, MO), suplementado con un 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), penicilina y estreptomicina. Los anticuerpos monoclonales (mAb) anti-CXCR4 habían sido obtenidos con anterioridad por los mismos inventores (Vila-Coro, A.J. et al. 1999); el anticuerpo policlonal de conejo anti-receptor opioide delta se obtuvo de Oncogene Research (San Diego, CA); el anticuerpo marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) y el anticuerpo marcado anti-conejo (FITC) fueron suministrados por BD Biosciences Pharmingen (San Diego, CA). El BCECF "Cell Tracker" de tinción procedía de Molecular Probes (Eugene, OR).

Las células B16 fueron sembradas en pocillos con fibronectina adherida, fijadas con paraformaldehido al 4% (15 minutos a temperatura ambiente), permeabilizadas con 0.01% Triton X100 (5 minutos), lavadas tres veces con PBS-0.01% Tween, y bloqueadas con PBS-BSA (1 hora a temperatura ambiente). Entonces, fueron incubadas con anticuerpo anti-CXCR4 (1:50) o con anticuerpo anti-receptor opioide delta (1:100), junto con el segundo anticuerpo FITC-anti-ratón (1:200) o con FITC-anti-conejo (1:100), respectivamente. Las células fueron lavadas y la expresión del receptor fue evaluada mediante microscopía confocal de fluorescencia. Los resultados obtenidos confirmaron, efectivamente, que ambos receptores se expresan en las células B16 de melanoma (Figura 1).

A continuación, se estudió si el agonista DPDPE podría desensibilizar el receptor CXCR4 en células B16 de melanoma (modulación cruzada) mediante ensayos de AMPc. Para ello, las células B16 fueron incubadas con forscolina 10 mM (3 minutos a 37°C) para incrementar la producción de AMPc; posteriormente fueron estimuladas con los agonistas CXCL12 (50 nM), DPDPE (10^{-5} M), o con ambos (10 minutos a 37°C). Los niveles de AMPc fueron determinados con el paquete comercial AMPc Direct Immunoassay Kit (Calbiochem, Darmstadt, Germany). En presencia de DPDPE los niveles de AMPc fueron similares a los que existían en células sin estimular, de lo que se concluye que el DPDPE desensibiliza CXCR4 (Figura 2).

Seguidamente, se valoró la posible citotoxicidad del DPDPE sobre las células (Figura 3), pero no se observó ningún efecto citotóxico. Para ello, se usó un paquete comercial para determinar la proliferación celular (Beckman Coulter, Hialeah, FL) y analizar los posibles efectos de este agonista opiáceo en el ciclo celular de las células B16. Las células fueron plantadas en una placa de 6 pocillos, incubadas durante entre 24 y 72 horas en medio DMEM completo, solas o con DPDPE a concentraciones de hasta 10^{-5} M. Posteriormente, se recogieron las células, se trataron de acuerdo al protocolo proporcionado, y el ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo.

Seguidamente, para determinar si el efecto observado se debía a la internalización de CXCR4, se llevó a cabo un ensayo de unión a la superficie en células B16, y más concretamente sobre células intactas para marcar sólo los receptores presentes en la superficie celular. Así, las células (500.000 células/pocillo) fueron sembradas en una placa de 24 pocillos y expuestas a DPDPE (10 -5 M) durante 15 a 30 minutos a 37°C. Para el resto del experimento, la temperatura se mantuvo a 4°C. Las células fueron entonces tratadas con ^{125}I CXCL12 0.15 nM (2000 Ci/mmol; Amersham Pharmacia) durante 2 horas a 4°C con una agitación suave. La unión no específica se evaluó mediante la incubación de las células conjuntamente con CXCL12 no marcado (500 nM) en el medio de unión. Las células fueron entonces lavadas 3 veces cuidadosamente con PBS y recogidas en tubos. La cantidad de ^{125}I CXCL12 se cuantificó para cada una de las condiciones con un contador de centelleo \gamma. Como se muestra en la Figura 4, las células pretratadas con DPDPE no presentaron diferencias significativas en las cantidades de ^{125}I CXCL12 unido en la superficie celular, lo que indica que la alteración de la respuesta de CXCR4 por DPDPE no se debe a la internalización del receptor.

Ejemplo 2 Efecto del DPDPE sobre distintos parámetros indicativos de progresión tumoral

Se realizaron ensayos in vitro para determinar el efecto del DPDPE tras la desensibilización de CXCR4 en la adhesión, invasión y migración de las células tumorales. Para el ensayo de adhesión celular se prepararon placas de cultivo celular de 96 pocillos de BD BioScience durante la noche a 4°C con 20 \mug/ml de fibronectina y los ligandos. Las placas fueron lavadas con PBS y bloqueadas con 0.5% BSA durante 1 hora a 37°C. Las células B16, previamente marcadas con BCECF, se sembraron (2 x 10^{5}/pocillo) en 200 \mul de PBS para su adhesión (10 minutos, 37°C). Las células no adheridas se eliminaron mediante un lavado suave con PBS; la adhesión celular se determinó con un luminómetro tal como se describió por otros autores (Chen, C. et al. 2004). La luminiscencia es directamente proporcional al número de células por pocillo. Para el ensayo concreto de la invención las células fueron sembradas en placas recubiertas con CXCL12/fibronectina en presencia o en ausencia de DPDPE, observándose que el nivel de adhesión celular se redujo en presencia de DPDPE y en un nivel dependiente de la dosis (Figura 5a).

Los ensayos de migración se realizaron en cámaras de invasión de matrigel (BD, Biocat, San José, CA) por triplicado. Las células B16 (10^{5} células/100 \mul) se añadieron al compartimiento superior de la cámara y los ligandos fueron añadidos a la cámara inferior para promover la migración celular a través del matrigel. Las placas se incubaron a 37°C durante 22 horas. Las células que no migraron se eliminaron de la parte superior del matrigel con un bastoncillo de algodón. Después del ensayo de migración, el matrigel fue digerido con dispasa 15 minutos a 37°C y las células emigrantes fueron contabilizadas después de la completa digestión del matrigel por citometría de flujo (Bartolome, R.A. et al, 2004). Como se esperaba, el CXCL12 indujo la migración de las células B16. Sin embargo, en presencia de concentraciones de 10^{-5} a 10^{-3} de DPDPE la migración inducida por CXCL12 fue inhibida de una manera dependiente de dosis por DPDPE (Figura 5b).

Los inventores también analizaron el efecto del DPDPE en el rodamiento in vivo de células de melanoma B16, primer paso crítico de la adhesión de las células sanguíneas a las paredes del endotelio vascular. La alta expresión de CXCL12 en órganos como hígado y pulmón podría explicar la alta frecuencia de metástasis en esos órganos (hipótesis semilla-suelo). Mediante microscopía intravital se estudió la interacción de células B16 de melanoma con la microvasculatura de la oreja en presencia o en ausencia del agonista DPDPE (Ludwig, R.J. 2004). El ratón fue anestesiado mediante inyección intraperitoneal de ketamina (Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany) y xilacina (Rompun, Bayer, Leverkusen, Germany), y colocado en una manta homotérmica. Se preparó para microcirugía la arteria carótida común derecha; se insertó un catéter para la inyección retrograda de las células. La oreja izquierda del ratón, que recibió 50 \mul de 1.25 \muM de CXCL12, fue colocada suavemente entre un microscopio y un soporte. La arquitectura vascular y las células marcadas con fluorescencia (10 \muM CFDA-SE, Molecular Probes, Eugene, OR) se visualizaron durante su paso por los vasos bajo una epi-iluminación fluorescente usando un sistema de filtro multibanda (XF 53, Omega Optical, Brattleboro, VT). Se obtuvieron imágenes continuas de la microcirculación con una cámara 1/3'' DSP 3-CCD (DXC-390, Sony, Cologne, Germany), montada en un microscopio 32 Zeiss modificado (Axioteck Vario 100 HD, Zeiss) que estaba equipado con un objetivo de inmersión saltwater 10x (Nikon, Düsseldorf, Germany). Las imágenes fueron almacenadas digitalmente usando MediaStudio Pro7 (Ulead, Kaarst, Germany). Las velocidades de las células en segmentos de vasos individuales fueron determinadas mediante un análisis off-line. Las células fueron consideradas no interactuantes si se movían a la velocidad media del flujo sanguíneo, o rodantes si se movían a velocidades menores.

Después de la inyección subcutánea de CXCL12 se observó un incremento del rodamiento respecto al observado espontáneamente. No obstante, después del tratamiento con DPDPE el rodamiendo se redujo de una manera significativa (3.9+/-5.1%) (Figura 6). Por tanto, el tratamiento con el agonista DPDPE también afecta las interacciones celulares dependientes de CXCL12 in vivo, impidiendo que las células cancerosas interactúen con las paredes vasculares.

Como última etapa, se procedió al estudio del efecto del agonista DPDPE in vivo, observando la aparición de metástasis de pulmón en hembras de ratón inyectadas con células de melanoma B16 con y sin DPDPE. Así, se construyó un modelo experimental, inyectando células B16 de melanoma singénicas en ratones C57BL/6. Se utilizaron hembras de ratón (6 a 8 semanas de edad) C57BL/6 (Charles River); y hembras de ratón con inmunodeficiencias severas combinadas y deficientes en NK más adelante (CB17 SCID beige de Harlan, Chicago, IL). Los animales fueron mantenidos a temperatura constante (23°C) y humedad (50%-60%) con acceso libre a dieta estándar y agua. Todas estas experiencias con animales se realizaron observando la legislación española.

En el primer día, células B16 de melanoma fueron inyectadas en la vena de la cola del ratón (10^{5} células/ratón C57BL/6 y 10^{4} células/ratón CB17 SCID en un volumen de 250 \mul). Desde el día 1 al día 3, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal diaria de DPDPE (10^{-4} M; 500 \mul); los animales control fueron tratados con PBS. La primera inyección de DPDPE fue aplicada justo antes de la inyección de las células. Las dosis de DPDPE utilizadas fueron las establecidas para promover la analgesia en el ratón (Heyman, J.S et al, 1987).

Los animales fueron sacrificados 7 días después de la inoculación de células B16 para analizar la propagación de los tumores. Los pulmones fueron lavados con PBS y fijados con una solución de Bouin durante 24 h. A continuación, se contaron los nódulos metastásicos en C57BL/6 con microscopía. Los experimentos fueron realizados por triplicado, con 10 animales en cada grupo.

Como resultado, en el día 7 después de la inoculación de células tumorales in vivo, se hicieron visibles focos metastásicos en la superficie de los pulmones de todos los ratones. Sin embargo, en el ratón tratado con DPDPE el número de nódulos era significativamente más bajo que en el grupo control (40 \pm 27 nódulos/pulmón vs 150 \pm 40 nódulos/pulmón) (Figura 7).

Como se ha visto que los opiáceos modifican la respuesta inmune y podrían estar implicados en el fenómeno observado, para excluir la participación del sistema inmune, se realizaron experiencias en la cepa inmunocomprometida SCID. En el ratón SCID, debido a la gran masa tumoral, la superficie afectada por la metástasis fue estimada independientemente por dos investigadores. Los experimentos fueron realizados por triplicado, con 10 animales en cada grupo. En los ratones de esta cepa, como cabría esperar, la formación y la propagación de metástasis se desarrolló más rápidamente que en ratones C57BL/6. Los resultados muestran que en un ratón sin tratar el 50\pm18% del pulmón resultó afectado por metástasis. En ratones tratados con DPDPE, sin embargo, aunque los pulmones aparecían también con metástasis, se estimó que sólo el 7\pm4% del pulmón estaba afectado. Estos datos muestran que el DPDPE reduce la progresión de las metástasis sin a intervención de la respuesta inmune.

Referencias

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16. Ludwig, R.J., Boehme, B., Podda, M., Henschler, R., Jager, E., Tandi, C., Boehncke, W.H., Zollner, T.M., Kaufmann, R., and Gille, J. 2004. Endothelial P-selectin as a target of heparin action in experimental melanoma lung metastasis. Cancer Res 64:2743-2750.

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18.- C. Faulí i Trillo. Tratado de Farmacia Galénica, 1ª edición, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones.

Claims

1. Utilización de agonistas del receptor delta opiáceo en la elaboración de medicamentos o composiciones farmacéuticas para la prevención y/o tratamiento de enfermedades tumorales.

2. Utilización de agonistas según la reivindicación 1 caracterizado porque el compuesto agonista, ya sea de estructura peptídica o no, pertenece al siguiente grupo: compuestos de diarilmetilpiperazina, TAN-67, derivados tetracíclicos de piridina y pirazina, pirrolooctahidroisoquinolonas, el compuesto BW373U86, el compuesto SNC 80, DPDPE y deltorfina I y II, bifalina, el péptido DADLE y la metadona.

3. Utilización de agonistas según la reivindicación 1 caracterizado porque el compuesto es el agonista D-Pen-D-Pen-encefalina (DPDPE).

4. Utilización de agonistas según la reivindicación 1 caracterizado porque la enfermedad tumoral pertenece al siguiente grupo: melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de sistema nervioso central y sarcoma.

5. Composición farmacéutica útil para la prevención y/o tratamiento del cáncer caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto o agente agonista del receptor opioide delta, junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.

6. Composición farmacéutica según la reivindicación 5 caracterizada porque el compuesto agonista pertenece al siguiente grupo, ya sean de estructura peptídica o no: compuestos de diarilmetilpiperazina, TAN-67, derivados tetracíclicos de piridina y pirazina, pirrolooctahidroisoquinolonas, el compuesto BW373U86, el compuesto SNC 80, DPDPE, deltorfina I y II, bifalina, el péptido DADLE y la metadona.

7. Composición farmacéutica según la reivindicación 5 caracterizada porque el compuesto agonista es el agonista D-Pen-D-Pen-encefalina (DPDPE).