ES2283133T3 - Composiciones terapeuticas (ii). - Google Patents

Abstract

Uso de un éster cíclico de (R)-3-hidroxibutirato de fórmula (I). En la que n es 1 o un número entero mayor o un complejo del mismo con uno o más cationes o sales de los mismos para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de estados patológicos neurodegenerativos o de diabetes de tipo II en los que el tratamiento no es para controlar las convulsiones.

Description

Composiciones terapéuticas (II).

La presente invención se refiere a composiciones adecuadas para la administración a humanos y a animales que tienen las propiedades de aumentar los niveles de (R)-3-hidroxibutirato (ácido (R)-3-hidroxibutírico o D-\beta-hidroxibutirato) cuando se administran; especialmente cuando se administran por vía oral, tópica, subcutánea o parenteral, pero más ventajosamente por vía oral.

La administración de ácido (R)-3-hidroxibutírico tiene varias acciones beneficiosas para el organismo humano y animal. Estas incluyen, entre otras, el aumento de la eficacia cardíaca, por ejemplo, en la insuficiencia cardíaca, el suministro de una fuente de energía alternativa a la glucosa, por ejemplo, en diabetes y situaciones de resistencia a la insulina, y el tratamiento de trastornos causados por un daño de células neuronales, por ejemplo, células del SNC, retrasando o previniendo especialmente un daño encefálico, como el que se encuentra en la enfermedad de Alzheimer y de Parkinson y en enfermedades y dolencias similares.

Se ha demostrado que el hidroxibutirato sódico aumenta la circulación cerebral y los reflejos vasomotores regionales hasta el 40% (Biull. Eksp. Biol. Med. Vol. 88 11, páginas 555-557). El documento EP 0780123 A 1 además muestra el uso de acetoacetato, \beta-hidroxibutirato, ésteres de alcoholes monovalentes, divalentes y trivalentes de estos u oligómeros lineares de 2 a 10 repeticiones de \beta-hidroxibutirato para suprimir el edema cerebral, proteger la función cerebral, rectificar el metabolismo energético cerebral y reducir la extensión del ictus.

Se ha realizado una infusión intravenosa de sales de sodio del (R)-3-hidroxibutirato en sujetos humanos normales y en pacientes con diversas dolencias, por ejemplo, aquellos que están en tratamiento para una sepsis grave en una unidad de cuidados intensivos, y se encontró que no eran tóxicas y eran capaces de disminuir la concentración de glucosa, ácidos grasos y glicerol, pero ineficaz para disminuir la oxidación de la leucina.

El autor de la presente invención ha determinado además que los compuestos y composiciones que aumentaban los niveles en sangre de ácido (R)-3-hidroxibutírico y/o acetoacetato también eran útiles para reducir los radicales libres in vivo y, por tanto, tienen un lugar como tratamiento de enfermedades asociadas con radicales libres.

El (R)-3-hidroxibutirato y el acetoacetato, normalmente denominados cuerpos cetónicos, proporcionan una alternativa fisiológica normal a los sustratos productores de energía normales, glucosa y ácidos grasos. Durante el ayuno prolongado en el hombre, los ácidos grasos se convierten en el hígado en ácido (R)-3-hidroxibutírico y acetoacetato que puede ser utilizado por la mayoría de los tejidos del organismo, excepto el hígado. En estas condiciones, los cuerpos cetónicos totales en sangre se elevan hasta aproximadamente 7 mm. Cuando estos están ligeramente elevados en la sangre, los tejidos extrahepáticos, tales como el encéfalo, corazón y músculo esquelético utilizan estos cuerpos cetónicos en la mitocondria para proporcionar una potencia reductora en forma de NADH que es el sustrato primario del sistema de transporte de electrones y generador de la energía requerida para la síntesis del ATP. A su vez, la generación de NADH mitocondrial a partir de cetonas, disminuye la proporción de [NAD^{+}]/[NADH] mitocondrial libre y la proporción de [NADP^{+}]/[NADPH] citosólico al cual está ligado el [NAD^{+}]/[NADH] mitocondrial. Mientras que el catabolismo de las cetonas reduce la proporción [NAD+]/[NADH] mitocondrial, oxida la proporción de [ubiquinona]/[ubiquinol] mitocondrial, [Q]/[QH_{2}]. La forma semiquinona del ubiquinol es la fuente principal de la generación por la mitocondria de superóxido, O_{2}^{-}. Disminuyendo la cantidad de la forma reducida QH_{2} y su semiquinona, puede disminuir la generación de radicales libres en la mitocondria mientras que, al mismo tiempo, aumenta el efecto secuestrante de radicales libres unidos al sistema NADP, tal como el glutatión.

Por tanto, el inventor ha determinado que el daño de los radicales libres que resulta del exceso de Q reducido o la inhibición de la NADH deshidrogenasa, tal como ocurre en casos de toxicidad inducida por MPP, puede reducirse administrando agentes que elevan los niveles de cuerpos cetónicos in vivo.

Varios procesos patológicos suponen un daño por radicales libres entre los que se encuentran las enfermedades neurológicas: enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer e isquemia cerebral. Además, se ha implicado un daño excesivo por radicales libres como importante en la reperfusión coronaria, angiopatia diabética, enfermedad inflamatoria intestinal y pancreatitis.

El documento WO 98/41201 del inventor, en trámite junto con la presente, describe la administración de ésteres lineales del ácido (R)-3-hidroxibutírico y/o acetoacetato para producir niveles elevados de los compuestos libres in vivo. La administración oral de soluciones 4 mM del oligómero tetra-(R)-3-hidroxibutirato, o su éster de acetoacetilo, mostró una elevación de los niveles de cuerpos cetónicos, de modo que podría determinarse que los niveles de (R)-3-hidroxibutirato aumentaban de 1 a 2 mM durante periodos superiores a 2 horas.

El inventor ahora ha determinado que se proporcionan ventajas inesperadas cuando el ácido (R)-3-hidroxibutírico componente de dicha composición se administra como un oligómero cíclico. Estas ventajas pueden incluir, entre otras, (a) aumento de la eficacia en la elevación de los niveles del ácido (R)-3-hidroxibutirato en sangre, de modo que estos niveles pueden aumentar en más de 2 mM, incluyendo la consecución de niveles próximos y por debajo a los del ayuno, (b) mantenimiento de los niveles elevados durante períodos de varias horas, (c) capacidad para ser administrado sin contraión, tal como sodio o metilglucamina, cuando es deseable no aumentar la carga de sal de un paciente o cuando es concebible una dosis significativa y (d) fabricación relativamente fácil de compuesto puro a partir de materias primas polimérico disponibles a través de biocultivo.

La presente solicitud se dirige especialmente al problema de las enfermedades neurodegenerativas, especialmente a enfermedades en las que las neuronas están sometidas a efectos neurotóxicos de agentes patogénicos, tales como placas proteicas y daños oxidativos, y además proporciona composiciones para su uso en el tratamiento de estas y de los trastornos mencionados anteriormente.

En realizaciones preferidas, la presente invención proporciona una elevación de las cetonas en sangre necesaria para corregir los defectos descritos anteriormente y puede lograrse mediante administración parenteral o enteral. Esto no requiere especialmente la administración de agentes farmacológicos posiblemente tóxicos. La eficacia mejorada de la presente invención para elevar los niveles de cuerpos cetónicos, especialmente los niveles en sangre, proporciona los efectos terapéuticos de la dieta cetogénica clásica, que no se ha encontrado que sea tóxica en niños por sí misma, sin ninguno de los efectos adversos que produce en adultos no habituados. Además, el inventor ha determinado que con la corrección de los defectos metabólicos y tóxicos mencionados anteriormente, disminuirá las respuestas de citocinas y el aumento de péptidos apoptóticos en células en degeneración debido al aumento del estado energético de la célula neuronal y al aumento de la estimulación trófica como resultado del aumento de neurotransmisores, por ejemplo, síntesis de acetil colina.

El tratamiento que el presente inventor proporciona va más allá de los efectos de los cuerpos cetónicos en circulación, ya que proporciona tratamiento para células que son incapaces de funcionar debido a defectos neurodegenerativos y/o metabólicos, especialmente en el metabolismo de glucosa, por ejemplo, causados por agentes neurotóxicos, tales como péptidos, proteínas, daño por radicales libres y efecto de anomalía genética. El tratamiento implica una acción de los cuerpos cetónicos sobre las células en sí y no el flujo de sangre sobre ellas.

De este modo, en un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un éster de (R)-3-hidroxibutirato cíclico de fórmula (1)

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En la que n es 1 o un número entero mayor

o un complejo de la misma o más cationes o una sal del mismo

para su uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades degenerativas o diabetes de tipo II, en las que el tratamiento no es para el control de las convulsiones.

Para la administración oral puede preferirse un oligómero cíclico libre. Cuando los cationes se presentan en un complejo se prefieren cationes de sodio, potasio, magnesio y calcio y se equilibran mediante contraaniones fisiológicamente aceptables que proporcionan un complejo salino.

Los ejemplos de sales típicas fisiológicamente aceptables se seleccionarán entre sodio, potasio, magnesio, L-lisina y L-arginina o, por ejemplo, más sales complejas como las sales de metilglucamina. Los ésteres serán los descritos previamente para otros aspectos de la invención.

Preferiblemente, n es un número entero de 1 a 200, más preferiblemente de 1 a 20, de la forma más preferible de 1 a 10 y, especialmente es 3, es decir, (R,R,R)-4,8,12-trimetil-l,5,9-trioxadodeca-2,6,10-triona.

Preferiblemente, el uso de ésteres cíclicos de la invención es para la fabricación de medicamentos en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas mediadas por radicales libres, agentes tóxicos tales como péptidos y proteínas, defectos genéticos perjudiciales para el metabolismo de la célula nerviosa, resistencia a la insulina u otros defectos del metabolismo de la glucosa o enfermedades que inducen defectos, isquemia y traumatismo craneal.

El uso incluye aquel uso para la fabricación de un estimulante neuronal, por ejemplo, capaz de estimular el crecimiento axonal y/o dendrítico en células nerviosas, por ejemplo, en células del hipocampo o de la sustancia nigra, in vivo o in vitro, especialmente en condiciones en las que la neurodegeneración tiene graves consecuencias clínicas, a través de su efecto de elevación en plasma y sangre de los niveles de (R)-3-hidroxibutirato y acetoacetato.

Especialmente, la composición del medicamento es adecuada para su administración oral o enteral, especialmente para administración oral. Cuando la composición es para su uso parenteral, esta estéril y sin pirógenos. Para su uso oral, la composición puede incluir una base alimenticia y puede estar en forma de una emulsión o simplemente mezclada con comida sólida.

Especialmente, los oligómeros cíclicos comprenden una cantidad eficaz de la composición total del medicamento, por ejemplo, al menos el % o más, por ejemplo, al menos el 5% en peso de la composición, más preferiblemente el 20% o más y de la forma más preferible del 50% al 100%. La composición puede adaptarse a una forma de administración oral, parenteral o cualquier otra forma convencional de administración.

En formas preferidas de todos los aspectos de la invención, el compuesto de fórmula (I) se administra junto con una proporción fisiológica de acetoacetato o un precursor metabólico del acetoacetato. La expresión precursor metabólico del mismo está relacionada especialmente con compuestos que incorporan restos de acetoacetilo, tales como acetoacetil-1,3-butanodiol, acetoacetilo-D-\beta-hidroxibutirato y acetoacetilglicerol. También son deseables los ésteres de cualquier compuesto con alcoholes monohídricos, dihídridos o trihídicos, superiores, por ejemplo, glucosilo.

En pacientes diabéticos este uso de los oligómeros cíclicos permite el mantenimiento de bajos niveles en sangre de azúcar sin temor a complicaciones hipoglucémicas. En sujetos normales no diabéticos, el azúcar en sangre en ayunas es de 80 a 90 mg % (4,4-5 mM) que se eleva a 130 mg % (7,2 mM) después de una comida. En diabéticos con diabetes "muy controlada" se ha recomendado ampliamente como procedimiento para retrasar complicaciones vasculares pero, en la práctica, los médicos han encontrado que es difícil mantener la concentración de azúcares en sangre muy controlada por debajo de 150 mg % (8,3 mM) después de comer debido a los episodios hipoglucémicos. El coma hipoglucémico tiene lugar con regularidad en sujetos normales cuya sangre en plasma caen a 2 mM. Como se describió anteriormente, (62,63) en presencia de una concentración de cetonas en sangre de 5 mM, no hay síntomas neurológicos cuando los niveles de azúcar en sangre disminuyen por debajo de 1 mM.

El presente inventor ha determinado que suplementando a pacientes diabéticos de tipo II con los oligómeros cíclicos de la invención, se podría controlar mejor el nivel de azúcar en sangre, previniendo de este modo los cambios vasculares en ojos y riñones que tienen lugar después de 20 años de diabetes y que son la causa principal de morbilidad y mortalidad en diabéticos.

Los trastornos especialmente tratables con estos medicamentos son aplicables a todas las dolencias que implican bloqueo de PDH, incluyendo aquellas dolencias que aparecen tras un traumatismo craneal o que implica la reducción o eliminación del aporte de acetil CoA a la mitocondria, tal como un coma insulínico e hipoglucemia, defectos en el transportador de glucosa en el cerebro o de cualquier otro tipo (80) o en las etapas de las enzimas glucolíticas o en el transporte de piruvato.

Cuando el medicamento o alimento medicinal comprende acetoacetato, es preferible no almacenarlo durante un periodo prolongado o exponerlo a temperaturas por encima de 40ºC. El acetoacetato es instable al calor y se descomponen violentamente a 100ºC en acetona y CO_{2}. En estas circunstancias, es preferible que el acetoacetato se genere por la composición en contacto con los procedimientos metabólicos de los cuerpos cetónicos. Preferiblemente, la composición comprende un precursor éster del acetoacetato.

Adicionalmente, el inventor ha determinado además, que los cuerpos cetónicos, proporcionados por la administración de los oligómeros cíclicos de ácido (R)-3-hidroxiburítico en cantidades suficientes para elevar la concentración de cuerpos cetónicos totales en sangre a niveles elevados, da lugar a algo más que el simple mantenimiento de la viabilidad celular, sino que realmente mejora la función celular y el crecimiento por encima de lo normal, es decir, niveles control de modo no relacionado con el flujo sanguíneo o la nutrición. A este respecto, la invención además proporciona el uso de los oligómeros como agentes capaces de producir estimulación neuronal, es decir, actividad similar a un factor de crecimiento nervioso aumenta la tasa metabólica y aumenta la extensión de características funcionales, tales como axones y dendritas. Este aspecto de la presente invención ofrece un mecanismo para mejorar la función neuronal, así como el mero retraso de la degradación.

El reciente trabajo de Hoshi y colaboradores (77,78) sugiere con fuerza que una parte de la proteína amiloide que se acumula es el rasgo característico de la enfermedad de Alzheimer, A\beta_{1-42} actúa como histidin proteín cinasa mitocondrial que fosforila e inactiva el complejo multienzimático de la piruvato deshidrogenasa. El complejo PDH es una enzima mitocondrial responsable de la generación de acetil CoA y NADH a partir del piruvato producido por glucólisis dentro del citoplasma. La acetil CoA mitocondrial formado se condensa con el oxalacetato para iniciar el ciclo del TCA de Krebs, quemando por completo el piruvato en CO_{2} mientras que se proporciona el poder de reducción a la mitocondria que se convierte en el sustrato para el sistema de transporte electrónico, a través del cual se genera la energía necesaria para la síntesis del ATP mitocondrial.

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La utilización de cuerpos cetónicos en el cerebro está limitada por el transporte, teniendo lugar la menor utilización en el ganglio basal a niveles en sangre por debajo de 1 mM (76). Sin embargo, a niveles de 7,5 mM alcanzados en un varón normal por ayuno prolongado, la velocidad de entrada de cuerpos cetónicos en el cerebro es suficiente para sustituir la mayoría de la energía cerebral necesaria y prevenir los síntomas hipoglucémicos, incluso frente a los niveles de azúcar en sangre que normalmente podrían causar convulsiones o coma (63).

En el documento de solicitud en trámite junto con este, WO 98/41201, "Composiciones terapéuticas", el inventor plantea la hipótesis de que en la enfermedad de Alzheimer, en la que hay un bloqueo de la PDH que previene la producción normal de energía a partir de glucosa, si se pueden proporcionar niveles elevados de cetonas, por ejemplo, los niveles normales del ayuno, puede evitarse el bloqueo de la PDH presente en estos pacientes, previniendo de ese modo la muerte celular debida a una supresión energética o a carencia de estimulación colinérgica y, por tanto, reducir la progresión de la pérdida de memoria y la demencia.

Además, utilizando los efectos estimuladores del crecimiento nervioso de los cuerpos cetónicos, especialmente del (R)-3-hidroxibutirato, o una proporción fisiológica de este con acetoacetato, las células que siguen siendo viables pueden dar lugar a una mejora mas allá del estado hasta el cual se ha degenerado y, por consiguiente, se verá alguna mejorar de la función en los pacientes.

En animales alimentados y en el hombre, el contenido hepático de acetoacetato, que es esencialmente el mismo de la sangre, es muy bajo, por ejemplo, 0,09 mM y el de (R)-3-hidroxibutirato es de 0,123 mM, pero después de 48 horas de ayuno se elevan, por ejemplo, a 0,65 mM el acetoacetato y a 1,8 mM el (R)-3-hidroxibutirato (84). Los cuerpos cetónicos se elevan durante el ayuno porque el descenso de la insulina disminuye la reesterificación de los ácidos grasos a triglicéridos en el tejido adiposo, causando la liberación de ácidos grasos libres al torrente circulatorio. A continuación, los ácidos grasos libres liberados pueden ser absorbidos y utilizados como fuente de energía por el músculo, corazón, riñón e hígado en el proceso de la \beta-oxidación. El hígado, sin embargo, tiene la capacidad de convertir los ácidos grasos libres en un combustible metabólico, la cetonas, para su uso en los órganos extrahepáticos, incluyendo el cerebro, como una alternativa a la glucosa durante los periodos de ayuno. La síntesis hepática de los cuerpos cetónicos tiene lugar a partir de la acetil CoA mitocondrial generada durante la \beta-oxidación hepática de los ácidos grasos.

Los cuerpos cetónicos entran en los tejidos extrahepáticas en el mismo portador, en los que otros compuestos monocarboxilados pueden actuar como inhibidores competitivos. Los isómeros no fisiológicos, tal como el D-lactato o el (S)-3-hidroxibutirato, también pueden actuar como inhibidores competitivos del transporte de cuerpos cetónicos. Puesto que el transporte de cuerpos cetónicos a través de la barrera hematoencefálica es un factor limitante para que el encéfalo utilice los cuerpos cetónicos (76), debe hacerse cualquier esfuerzo posible para mantener la concentración en sangre de estos enantiómeros no fisiológicos a niveles inferiores durante la terapia cetogénica. Cuando las concentraciones de los cuerpos cetónicos en sangre se elevan hasta los niveles encontrados en ayunas, el hígado, músculo, riñón y encéfalo utilizan los cuerpos cetónicos como el sustrato energético preferido.

Por tanto, el presente inventor ha determinado que la acetil CoA mitocondrial derivado de cuerpos cetónicos producido usando los oligómeros cíclicos mostrados en la presente invención, puede reemplazar, de este modo, la deficiencia de acetil CoA, lo que ocurre durante la inhibición del complejo multienzimático PDH en tejidos dependientes del metabolismo de la glucosa para su suplemento de energía metabólica. El citrato mitocondrial suministrado también puede ser transportado al citoplasma mediante el transportador de ácidos tri o dicarboxicíclicos donde puede convertirse a acetil CoA citoplasmático, necesario para la síntesis de acetil colina. Las reacciones del ciclo de Krebs se muestran en el Esquema 1 para ayudar a ilustrar adicionalmente estos conceptos.

Al contrario que los ácidos grasos libres, los cuerpos cetónicos no pueden producir acetil CoA en el hígado. Puesto que la acetil CoA es el precursor esencial de ácidos grasos, no pueden dar lugar a un aumento de la síntesis de ácidos grasos o a la síntesis de colesterol en el hígado, lo que normalmente supone más de la mitad de la síntesis orgánica de estos dos materiales potencialmente patogénicos. El hígado es sensible a la proporción de acetoacetato/(R)-3-hidroxibutirato presente en éste y alterará su proporción [NAD^{+}]/[NADH] libre mitocondrial, debido a la situación próxima al equilibrio establecida por la \beta-hidroxibutirato deshidrogenasa (EC 1.1.1.30)(31).

Entre otros casos, lo mencionado anteriormente también indica que se puede proporcionar un procedimiento para aumentar la eficacia de la producción de energía mitocondrial en un humano o en un animal que no padece una enfermedad metabólica crónica o aguda, que comprende la administración al humano o animal una cantidad del oligómero cíclico de la formula (I) suficiente para elevar los niveles en sangre de (R)-3-hidroxibutirato de 0,5 a 20 mM.

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Esquema 1

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La manera más sencilla de aumentar las cetonas en sangre es el ayuno. Durante el ayuno prolongado, los niveles de cetonas en sangre alcanzan valores de 7,5 mM (62,63). Sin embargo, esta opción no está disponible a efectos a largo plazo, ya que la muerte sucede normalmente después de 60 días de ayuno.

La dieta cetogénica, compuestas principalmente por lípidos, se ha utilizado desde 1921 para el tratamiento de la epilepsia en niños, especialmente en convulsiones mioclónicas y acinéticas (109) y se ha demostrado que es eficaz en casos refractarios a medios farmacológicos normales (17). La administración oral o parental de ácidos grasos libres o de triglicéridos puede aumentar la concentración de cetonas en sangre, ya que los hidratos de carbono y la insulina están bajos para prevenir la reesterificación en el tejido adiposo. La dieta de las ratas alimentadas que comprende 70% de aceite de maíz, 20% de caseína hidrolizada, 5% de celulosa, 5% de mezcla de sales de McCollum, desarrolla una concentración de cetonas en la sangre de aproximadamente 2 mM. La sustitución del aceite de maíz por manteca de cerdo eleva la concentración de cetonas en sangre a aproximadamente 5 mM (Veech, no publicado).

En general, los niveles de cuerpos cetónicos alcanzados en estas dietas eran de aproximadamente 2 mM de (R)-3-hidroxibutirato y 1 mM de acetoacetato mientras que los niveles de ácidos grasos libres son de aproximadamente 1 mM. Se han probado otras variaciones de la composición incluyendo triglicéridos de longitud de cadena media. En general, el cumplimiento de estas dietas restrictivas ha sido pobre debido a que son insípidas (56). También se han probado dietas ricas en lípidos y pobres en hidratos de carbono como agentes terapéuticos en pacientes con cáncer para reducir la disponibilidad de glucosa en los tumores (88), como dietas para reducir peso en pacientes con y sin diabetes (74,112) y para mejorar la tolerancia al ejercicio (83).

Son muchas las limitaciones de las dietas que dependen de los lípidos para elevar las cetonas en sangre a niveles neurológicamente eficaces. En primer lugar, los niveles de cuerpos cetónicos en dietas basadas en lípidos tienden a ser inferiores a 3 mM, significativamente menor que el nivel de 7,5 mM alcanzado en humanos con sobrepeso durante un ayuno prolongado. En segundo lugar, la ingestión no autorizada de hidratos de carbono aumenta la secreción de insulina y causa un rápido descenso de la conversión hepática de ácidos grasos libre en cetonas, con la consecuente caía de la concentración de cetonas en sangre y el desvió de los lípidos hacia la esterificación de triglicéridos en el tejido adiposo. Muchos artículos anecdóticos refieren la vuelta de las convulsiones en niños que "rompían su dieta con una tarta de cumpleaños". En tercer lugar, que sean insípidas y la necesidad de evitar los hidratos de carbono para mantener los niveles de cuerpos cetónicos elevados, hace que sea difícil que los adultos sigas dietas ricas en lípidos en un marco ambulatorio, especialmente en sociedades en las que tradicionalmente se da una elevada ingestión de azúcares refinados, pan, pasta, arroz y patatas. En la práctica, exceptuando a los niños de corta edad en los que toda la comida se prepara en casa bajo una supervisión rigurosa, no puede imponerse a los pacientes la tradicional dieta rica en cetona. En cuarto lugar, la ingestión de estas cantidades de lípidos tan grandes en la población adulta podría llevar a una hipertrigliceridemia e hipercolesterolemia importantes con secuelas patológicas de aumento de la enfermedad vascular y las enfermedades hepáticas y pancreáticas esporádicas y, por tanto, no puede prescribirse en campos médicos. La ingestión de dietas ricas en lípidos y pobres en hidratos de carbono se hizo popular en los años 70 para la reducción de peso en oposición a una ingestión calórica elevada, siempre que la ingestión de hidratos de carbono fuera pequeña. Sin embargo, debido al aumento de los conocimientos sobre la relación entre concentraciones elevadas de lípidos en sangre y la aterosclerosis, la popularidad de esta dieta disminuyó rápidamente.

La sustitución de la glucosa en una dieta líquida, en la que la glucosa supone el 47% del contenido calórico, por 1,3 butanodiol racémico, daba lugar a la elevación de la concentración de cetona en sangre en aproximadamente 10 veces, hasta 0,98 mM de (R)-3-hidroxibutirato y 0,33 mM de acetoacetato (107). Estos valores son ligeramente menores que los obtenidos normalmente tras un ayudo de 48 horas y mucho menores que los niveles de 7,5 mM obtenidos en el ayuno humano. El 1,3 butanodiol racémico se convierte en acetoacetato en el hígado y tanto en el L-\beta-hidroxibutirato no natural como en D-\beta-hidroxibutirato natural ((S) 3-hidroxibutanoato y (R)-3-hidroxibutirato, respectivamente). Aunque el 1,3 butanodiol racémico se ha estudiado exhaustivamente como fuente calórica barata en pienso animal y se ha usado experimentalmente en dietas humanas (81,101), es probable que la producción del isómero L no natural produzca toxicidad significativa a largo plazo en humanos, como se ha demostrado para el uso en humanos del D-lactato no natural (64). Una desventaja de la administración del isómero L no natural es que compite por el transporte con el (R)-3-hidroxibutirato natural. De este modo, el suministro del (R) 1,3 butanodiol como precursor de cuerpos cetónicos es una posibilidad para evitar la administración innecesaria o la producción del isómero no natural.

Se han sugerido como fuentes de calorías los ésteres mono y diacetoacetilo del 1,3 butanodiol racémico y se han ensayado en cerdos (67). La administración oral de un bolo de una dieta que contiene el 30% de calorías correspondientes a los ésteres producía una breve elevación de la concentración de cetonas en sangre hasta 5 mM. Sin embargo, no es recomendable el uso del 1,3 butanodiol racémico, con su producción del (S) 3-hidroxibutanoato anómalo, por la razones explicadas anteriormente.

Aunque no se recomienda el uso del butanodiol 1,3 racémico en estas formulaciones, pueden usarse los ésteres de (R) 1,3 butanodiol sólo o como el éster de acetoacetato. Estudios en ratas han mostrado que la alimentación con 1,3 butanodiol racémico causaba una disminución de la proporción [NAD^{+}]/[NADH] citosólico del hígado del 1.500 a aproximadamente 1.000 (87). En comparación, la administración de etanol reduce la proporción [NAD^{+}]/[NADH] hepático en aproximadamente 200 (106).

El acetoacetato, cuando está recién preparado, puede usarse en soluciones para infusión en la que puede administrarse a proporciones fisiológicamente normales con (R)-3-hidroxibutirato para un efecto óptimo (95). Debido a los requisitos de preparación del acetoacetato, que normalmente necesita una fecha de caducidad larga y líquidos esterilizados al calor, fase proporcionada frecuentemente en forma de éster. Esto se ha hecho para prolongar su fecha de caducidad y para aumentar su estabilidad al calor durante la esterilización. En el torrente circulatorio, se ha estimado que la actividad esterasa es de aproximadamente 0,1 mmol/min/ml y de aproximadamente 15 mmol/min/g en el hígado (68). Además de los esteres que combinan 1,3 butanodiol y acetoacetato, se han realizado estudios extensos de ésteres de glicerol de acetoacetato en nutrición parenteral (59) y enteral (82). Se ha informado de que estas preparaciones disminuían la atrofia de la mucosa intestinal, debida a la elevada ingestión de acetoacetato por las células del intestino, y de que eran útiles para tratar las quemaduras (85).

En las realizaciones preferidas de la presente invención, en condiciones óptimas, debería producirse una proporción fisiológica de cetonas mediante la administración de oligómeros cíclicos y de acetoacetato. Si esto no sucede en todo el animal, el hígado ajustará la proporción de cetonas según su propia proporción [NAD^{+}]/[NADH] libre mitocondrial. Si se observa una proporción anómala de cetonas, el hígado ajustará dicha proporción, con cambios coincidentes en la proporción [NAD^{+}]/[NADH] hepática. En el trabajo cardíaco, la perfusión con acetoacetato como único sustrato, induce rápidamente una insuficiencia cardíaca (99) en contraste con los corazones de rata perfundidos con una mezcla de glucosa, acetoacetato y (R)-3-hidroxibutirato, en la que la eficacia cardíaca aumentaba con una proporción fisiológica de cuerpos cetónicos (95).

Los oligómeros cíclicos usados en la presente invención son sintetizados convenientemente a partir de los poliésteres producidos por microorganismos. Los poliésteres naturales de (R)-3-hidroxibutirato se venden como artículos comerciales, por ejemplo, como polímeros de 530.000 de PM obtenidos a partir de Alcaligenes eutrophus (Sigma Chemical Co. St. Louis) o como polímeros de 250.000 de PM de la remolacha azucarera (Fluka, Suiza). La bacteria produce el polímero como fuente de nutriente para almacenamiento. La fermentación de estos polímeros por bacterias se desarrolló en los años 70 por ICI en Inglaterra y Solvay y Cia., en Bélgica, como un plástico potencialmente biodegradable para tapas y otros usos. Ahora, se ha clonado el sistema responsable de la síntesis del poli (R)-3-hidroxibutirato y se han introducido variaciones en la composición del polímero producido en base a los sustratos administrados a la bacteria. Los genes responsables de la síntesis de polialcanoatos se han clonado y expresado en varios microorganismos (93,102,113) lo que ha permitido la producción de este material en diversos organismos en condiciones extremadamente variables.

Las formas preferidas del oligomérico cíclico de (R)-3-hidroxibutirato se digieren fácilmente, al menos en parte, y/o se metabolizan en humanos o en animales. Preferiblemente, estos tienen una longitud de 2 a 200 repeticiones, típicamente de 2 a 20 y, más convenientemente, de 3 a 10 repeticiones, especialmente de 3 repeticiones, es decir, el triólido. Se entenderá que las mezclas de estos oligómeros pueden emplearse con las ventajas que podrían obtenerse de una serie de características de respuesta. De forma similar, pueden proporcionarse mezclas con el monómero u oligómeros lineares o polímeros para modificar el perfil del nivel en sangre producido.

Los oligómeros cíclicos para su uso en la invención puede proporcionarse, entre otros, por los procedimientos descritos por Seebach y col. Helvetia Chimica Acta vol. 71 (1988) páginas 155- 167 y Seebach y col. Helvetia Chimica Acta, vol. 77 (1994) páginas 2.007 a 2.033. En algunas circunstancias pueden preferirse estos oligómeros cíclicos de 5 a 7 o más unidades de (R)-3-hidroxibutirato ya que pueden degradarse más fácilmente in vivo. Los procedimientos de síntesis de los compuestos descritos en este documento se incorporan por referencia.

Una vez que el monómero alcanza el torrente sanguíneo, y puesto que el hígado es incapaz de metabolizar los cuerpos cetónicos y tan sólo puede alterar la proporción (R)-3-hidroxibutirato/acetoacetato, los cuerpos cetónicos se transportan a los tejidos extrahepáticos donde se pueden utilizar. Los niveles de cetonas en sangre alcanzados no están sometidos a la variación causada por la falta de cumplimento en la ingestión de hidratos de carbono, como es el caso de la actual dieta cetogénica. Más bien, podrían simplemente ser un aditivo a la dieta normal, administrado en cantidades suficientes para producir un nivel en sangre mantenido, típicamente de entre 0,3 y 20 mM, más preferiblemente de 2 a 7,5 mM, durante un periodo de 24 horas, dependiendo de la dolencia que se esté tratando. En el caso de epilepsia infantil resistente, normalmente se piensa que son suficientes niveles en sangre de 2 mM. En el caso de la enfermedad de Alzheimer, incluso pueden hacerse intentos para mantener niveles de 7,5 mM o superiores, como los alcanzados en los estudios en varones en ayunas, en un esfuerzo por proporcionar energía alternativa y suministrar acetil CoA al tejido encefálico en pacientes con Alzheimer en los que la capacidad de la PDH está alterada debido a un exceso en las cantidades del péptido amiloide A\beta_{1-42} (77,78).

La determinación por parte del inventor de que (R)-3-hidroxibutirato y sus mezclas con acetoacetato actúan como un estimulante nervioso, por ejemplo, estimulante del crecimiento nervioso y/o estimulante del crecimiento axonal y dendrítico abre la opción de elevar lo niveles de los cuerpos cetónicos a grados menores que los requeridos a nivel nutricional para tratar enfermedades neurodegenerativas.

Preferiblemente, las composiciones de la invención son estériles y sin pirógenos, especialmente sin endotoxinas. En segundo lugar, preferiblemente se formulan de modo que tengan buen sabor, cuando se administran como un aditivo a la dieta normal, para mejorar el cumplimento de los pacientes a la hora de todas los suplementos. Los oligómeros cíclicos normalmente no tienen olor. Las formulaciones de los oligómeros cíclicos de (R)-3-hidroxibutirato y sus mezclas con acetoacetato puede recubrirse con agentes enmascarantes y pueden dirigirse al intestino mediante recubrimiento entérico o encapsulamiento de algún tipo, como se entiende en la técnica de los productos farmacéuticos o los alimentos medicinales.

Puesto que los cuerpos cetónicos contienen de 4 a 6 calorías/g, es preferible un descenso compensatorio en las cantidades de los demás nutrientes tomados para evitar la obesidad.

Las ventajas en especial de usar los oligómeros cíclicos mostrados de la presente invención son:

1) pueden comerse con una carga dietética normal de hidratos de carbono sin disminuir los niveles de cuerpos cetónicos en sangre, cuya disminución podría alterar los efectos del tratamiento,

2) no elevarán los niveles de VLDL y colesterol en sangre, como las actuales dietas que contienen nata y margarina, eliminando así el riesgo de una enfermedad vascular acelerada, hígado graso y pancreatitis.

3) tendrán un rango más amplio de uso en una variedad mayor de pacientes que incluye, pero sin limitaciones: diabetes de tipo II para prevenir convulsiones hipoglucémicas y coma, en la enfermedad de Alzheimer y en otros estados neurodegenerativos para prevenir la muerte de las células nerviosas, por ejemplo, las células del hipocampo.

Los oligómeros cíclicos de la invención pueden usarse en emulsiones para administración oral o parenteral, mientras que se prefiere menos el acetoacetato, en estado no esterificado, ya que es sometido a descarboxilación espontánea en acetona con una semivida a temperatura ambiente de aproximadamente 30 días. Cuando las composiciones de la invención incluyan acetoacetato, este puede estar en forma de precursor. Convenientemente, el acetoacetato puede proporcionarse como ésteres de (R)-3-hidroxibutirato como se proporciona en el documento en trámite junto con este "Composiciones terapéuticas".

El tratamiento puede comprender el suministro de una porción significativa de la ingesta calórica de los pacientes con el oligómero cíclico de (R)-3-hidroxibutirato o de oligómeros formulados para obtener una liberación retardada, de modo que se mantenga la concentración de cetonas en sangre en el intervalo elevado, por ejemplo, de 0,5 a 20 mM, preferiblemente en el intervalo de 2-7,5 mM, durante un periodo de 24 horas. La liberación de los cuerpos cetónicos a la sangre puede restringirse aplicando varias técnicas, tales como la microencapsulación, adsorción y similares, que se utilizan actualmente en la administración oral de varios agentes farmacéuticos. Las formas con recubrimiento entérico que dirigen una liberación postestomacal pueden usarse especialmente cuando el material no requiere, o no es susceptible de sufrirla, una hidrólisis en ambiente ácido. Cuando se desee esta hidrólisis, pueden usarse formas no recubiertas. Algunas formas pueden incluir enzimas capaces de hidrolizar los esteres para liberar cuerpos cetónicos como los referidos en Doi. Microbial Polyesters.

Los oligómeros cíclicos preferidos, por ejemplo, los triólidos, pueden añadirse simplemente como alimentos y/o pueden suplementarse en un régimen de tratamiento mediante otros generadores de cuerpos cetónicos de perfil de liberación diferente, tal como el (R)-3-hidroxibutirato monomérico. Éste último puede proporcionarse como una solución acuosa, por ejemplo, como una sal, por ejemplo, sal de sodio, potasio, magnesio o calcio.

En una dieta de 1.500 calorías, el paciente adulto humano podría consumir 198 g de ésteres cíclicos de la presente invención al día. En una dieta de 2.000 calorías de las mismas proporciones, podrían consumirse 264 g de cetonas al día. En la dieta lipídica cetogénica, la concentración de cetonas en sangre se eleva a aproximadamente 2 mM, lo cual prueba que es eficaz en cierto grado al menos en aproximadamente el 60% de los niños tratados. En la dieta de cetona, los niveles de cetona podrían ser mayores debido a que el equivalente calórico de la grasa se ha sustituido por cetona, que es 1,5 g de cetona/g de grasa. Por consiguiente, la concentración de cetonas en sangre podría ser de aproximadamente 3 mM, un nivel eficaz en niños, pero aun por debajo del nivel de 7,5 mM alcanzado en el hombre en ayunas.

Son varias las ventajas de usar compuestos que elevan directamente los niveles de cuerpos cetónicos, incluyendo los actuales oligómeros cíclicos, los cuales elevan los niveles de cuerpos cetónicos en sangre por sí solos. En primer lugar, el suministro de cuerpos cetónicos en sí no requiere la limitación de los hidratos de carbono aumentando, por tanto, el buen sabor de las formulaciones de dieta, especialmente en culturas en las que son comunes dietes ricas en hidratos de carbono.

En segundo lugar, los cuerpos cetónicos pueden ser metabolizados en el tejido muscular, cardiaco y encefálico, pero no en el hígado. Por lo tanto, se evita el hígado graso, que puede es un efecto adversos de la dieta cetogénica. En tercer lugar, la posibilidad de incluir hidratos de carbono en las formulaciones de dieta aumenta la posibilidad de cumplimiento y abre aproximaciones terapéuticas prácticas para los diabéticos de tipo II, en los que la insulina está elevada, lo que hace imposible trabajar con la dieta cetogénica conocida.

El presente inventor ha determinado que, mientras que cualquier elevación de los cuerpos cetónicos puede ser deseable, será suficiente administrar una cantidad preferida de éster cíclico, con cualquier componente acetoacetilo, para elevar los niveles de cuerpos cetónicos del nivel 0,5 a 20 mM, preferiblemente del nivel 2 mM a 7,5 mM y superior, especialmente cuanto se pretenda detener la muerte de las células encefálicas en enfermedades como en Alzheimer o en Parkinson. Puesto que las células muertas no pueden recuperarse, podemos detener un deterioro adicional y puede anticiparse, al menos, cierta recuperación de la función.

La cantidad total de cuerpos cetónicos usados en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, tal como el Alzheimer o el Parkinson, preferiblemente elevará los niveles en sangre de cuerpos cetónicos de 0,5 mM a 20 mM. El presente inventor estima que serían necesarios de 200 a 300 g (0,5 libras) por paciente del equivalente a cuerpos cetónicos al día para conseguir esto. Cuando el tratamiento está pensado para el mantenimiento de las células frente a los efectos de la neurotoxina, este puede estar a un nivel suficiente para actuar como fuente calórica significativa, por ejemplo, de 2 a 7,5 mM en sangre. Cuando depende del efecto como factor de estimulación nerviosa del (R)-3-hidroxibutirato producido de este modo, la cantidad administrada puede ser menor, por ejemplo, para proporcionar un aumento de 0,2 a 4 mM, pero por supuesto, puede ser mayor para esta u otra enfermedad.

Se entenderá que el tratamiento para enfermedades neurodegenerativas, tales como el Alzheimer o el Parkinson, será más eficaz si se administra tras identificar la predisposición de un paciente a desarrollar la enfermedad. De este modo, el tratamiento para el Alzheimer será más eficaz tras un resultado positivo en una prueba para una o más de las condiciones seleccionadas entre el grupo de (i) mutaciones en el gen de la proteína precursora amiloide del cromosoma 21, (ii) mutaciones en el gen de la presenilina en el cromosoma 14, (iii) presencia de isoformas de la apolipoproteina E. Por supuesto, también se aplicarán otras pruebas que se haya demostrado son indicativas de Alzheimer.

Después de este ensayo de resultado positivo, será apropiado prevenir el desarrollo de pérdida de memoria y/o de otras disfunciones neurológicas debidas a la elevación de la suma total de las concentraciones de los cuerpos cetónicos (R)-3-hidroxibutirato y/o acetoacetato en la sangre o plasma del paciente hasta dicho intervalo entre 1,5 y 10 mM, más preferiblemente de 2 a 8 mM, mediante uno de los diversos procedimientos. Preferiblemente, el paciente se alimento con una dieta con cantidades suficientes del compuesto de fórmula (I), opcionalmente por vía parenteral, pero preferiblemente y de forma ventajosa, por vía entérica.

Se entenderá que la disfunción encefálica hipoglucémica también será tratable usando los tratamientos, composiciones y compuestos de la presente invención. Una propiedad adicional asociada con el presente tratamiento será la mejora general del funcionamiento muscular.

El suministro de alimentos y medicamentos basados en el oligómero cíclico de la invención está facilitado por la fácil disponibilidad de varias materias primas relativamente baratas, o potencialmente baratas, a partir de las cuales puede derivar el ácido (R)-3-hidroxibutírico cíclico (véase Microbial Polyesters Yoshiharu Doi. ISBN 0-89573-746-9 Capítulos 1.1, 3.2 y 8). La disponibilidad de genes capaces de insertarse en organismos que generan alimentos, proporciona un medio de creación de productos, tales como yogures y queso, que están enriquecidos en el oligómero cíclico del ácido (R)-3-hidroxibutírico o, tras la digestión con enzimas capaces de escindir estos polímeros, con la sustancia monomérica en si (véase Doi, Capítulo 8).

No se reivindican de forma específica los procedimientos para preparan poli (R)-3-hidroxibutirato, ya que estos son conocidos en la técnica. Por ejemplo en Shang y col, (1994) Appli. Environ. Microbiol. 60: 1198-1205. Este polímero está disponible en el mercado en Fluka Chemical Co. P1082, nº de catálogo 81329, 1993-94, 980. Second St. Ronkonkoma NY 11779-7238, 800 358 5287.

Ahora, la presente invención se describirá adicionalmente sólo a modo de ilustración, en referencia a las siguientes Figuras y ejemplos experimentales. A la vista de estas, los expertos en la materia descubrirán realizaciones adicionales que entran dentro del alcance de la invención.

Figura

La Figura 1 es una gráfica que muestra el nivel de (R)-3-hidroxibutirato en sangre producido a lo largo del tiempo tras alimentar a las ratas con el triólido de (R)-3-hidroxibutirato, un oligómero cíclico del Ejemplo 1 producido en yogurt y los controles alimentados sólo con yogurt.

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de (R,R,R)-4,8,2-trimetil-5,9-trioxadodeca-2,6,10-triona: Triólido del ácido (R)-3-hidroxibutírico

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La síntesis fue como se describe en Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (1992), 31, 434. Se agitó una mezcla de poli[ácido (R)-3-hidroxibutírico] (50 g) y ácido tolueno-4-sulfónico monohidrato (21,5 g, 0,133 moles) en tolueno (840 ml) y 1,2 dicloroetano (210 ml) y se calentó a reflujo durante 20 horas. Se eliminó el agua en una trampa para destilación Dean-Stark durante 15 horas, tras lo cual la solución se enfrió a temperatura ambiente y se lavó primero con una solución saturada de carbonato sódico y después con cloruro sódico saturado, se seco sobre sulfato de magnesio y se evacuó al vacío. El residuo marrón semisólido se destiló usando un aparato de Kugelrohr para producir un sólido blanco (18,1 g) a 120-130ºC/0,15 mmHg. A aproximadamente 130ºC, la destilación empieza a detenerse en el momento en que empieza a destilar una cera sólida. El material destilado tiene una mp de 100-102ºC (mp en la literatura: 110-110,5ºC). La recristalización a partir de hexano da lugar a cristales sin color con un rendimiento de 15,3 g. Mp=107-108ºC; [\alpha]_{D}-35,1 (c=1,005, CHCl_{3}), (lit. =-33, 9). RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}): \delta=1,30 (d, 9H, CH_{3}); 2,4-2,6 (m, 6H; CH_{2}); 5,31-5,39 (M, 3H; HC-O). RMN ^{13}C(CDCl_{3}) \delta=20,86 (CH_{3}), 42,21 (CH_{2}), 68,92 (CH), 170,12 (CO). Análisis elemental: calculado para Cl_{12}H_{18}O_{6}: C, 55,81; H 7,02; Encontrado: C, 55,67; H 7,15.

Ejemplo comparativo 1

Preparación de oligómeros del acido (R)-3-hidroxibutírico y de (R)-3-hidroxibutirato)

El ácido (R)-3-hidroxibutírico (Fluka, 0,5 g: 0,048 moles), el ácido p-toluensulfónico (0,025 g) y el benceno (100 ml) se agitaron bajo reflujo con una trampa de Dean-Stark dispuesta durante 24 horas. La mezcla de reacción se enfrió y el benceno se evaporó al vacío (0,5 mmHg). Se obtuvieron 4,4 g de un aceite incoloro, del cual una muestra de 20 mg se convirtió en el éster metílico para el análisis del número de monómeros repetidos, usando RMN. Estos estudios muestran que el producto es una mezcla de oligómeros de D-\beta-hidroxibutirato con un número medio de repeticiones de 3,75, siendo principalmente una mezcla de trímeros, tetrámeros y pentámeros, con el tetrámero como el material único más abundante. La mezcla del producto se disolvió en 1 equivalente de hidróxido sódico.

Ejemplo comparativo 2

Preparación de éster acetoacetilo del ácido (R)-3-hidroxibutirato oligomérico

Se calentó un lote adicional del producto oleoso sin color del Ejemplo 1 (4,5 g) durante 1 hora a 60ºC con diceteno (3,8 g) y acetato sódico (0,045 g) bajo atmósfera de nitrógeno. Se añadió de nuevo diceteno (3,8 g) y la reacción se calentó durante una hora más, se enfrió y diluyó con éter, se lavó con agua y, a continuación, se extrajo con bicarbonato sódico saturado (5 x 100 ml). El extracto combinado se lavó con éter y, a continuación, se acidificó con HCl concentrado (añadido gota a gota). La extracción con acetato de etilo (3x50 ml) se siguió del secado sobre sulfato de magnesio y evaporación al vacío. Se obtuvo una mezcla sólido/aceite amarillenta (7,6 g), la cual se sometió a cromatografía en una columna de sílice usando diclorometano/metanol (98:2) para obtener un producto oleoso de color ámbar. Se aislaron las impurezas que se movía más rápido (1,6 g) y, tras volver a pasarlas por la columna en tetracloruro de carbono/metanol (99:1), se recuperaron 0,8 g de aceite que, según se demostró por RMN y espectrometría de masas, era la mezcla deseada de oligómeros acetilados de (R)-3-hidroxibutirato. La mezcla del producto tenía una Rf de 0,44 en diclorometano/metanol (90:10) y era soluble en 1 equivalente de hidróxido sódico.

Ambos productos de los ejemplos comparativos 1 y 2 era susceptibles de separación en sus componentes individuales mediante HPLC preparativa.

Ejemplo 2 Administración oral a ratas del triólido de (R)-3-hidroxibutirato del Ejemplo 1

La capacidad del triólido administrado por vía oral para elevar los niveles de cetona en sangre se investigó como sigue. El día anterior al inicio del experimento, 12 ratas Wistar que pesaban 316\pm10 g, se colocaron el cajas separadas. No tuvieron acceso a la comida durante las 15 horas anteriores a la presentación de las composiciones que contenían el triólido, pero se proporcionó agua a discreción.

La mañana del experimento, se mezclaron 0,64 g del triólido con 5 g de yogurt de cereza negra de la marca Co-op en comederos individuales para 9 de las ratas. Las 3 ratas restantes recibieron 5 g de yogurt sin el triólido como control. Los comederos contenían el yogurt se colocaron en las cajas y se controló el tiempo mientras que las ratas comían. Dos de las tres ratas control se comieron todo el yogurt y cuatro de las seis ratas que comieron el yogurt con triólido lo hicieron hasta aproximadamente la mitad de la cantidad proporcionada. Las otras seis ratas durmieron.

Las ratas control (n=2) se mataron a los 60 y 180 minutos después de la ingestión del yogurt, mientras que las ratas alimentadas con el triólido se mataron a los 80, 140, 150 y 155 minutos. Se tomaron muestras de sangre para el ensayo del (R)-3-hidroxibutirato. Los cerebros se congelaron en N_{2} líquido y después de extrajeron en ácido perclórico y los extractos se neutralizaron y ensayaron. Se midieron los niveles de (R)-3-hidroxibutirato en sangre usando un ensayo de NAD+/EDTA de Anal. Biochem. (1983) 131, páginas 478-482. Se añadió 1,0 ml de una solución compuesta de 2-amino-2-metil-1-propanol (100 mM, pH 9,9, 0,094 g/10 ml), NAD^{+} (30 mM, 0,199 g/10 ml) y EDTA (4 mM, 0,015 g/10 ml) a varias cubetas y 4 \mul de muestra o de control (R)-3-hidroxibutirato.

Las dos ratas control comieron 5,2+0,1 g y sus concentraciones en plasma de (R)-3-hidroxibutirato eran de aproximadamente 0,45 mM a los 60 minutos y a los 180 minutos.

Las cuatro ratas alimentadas con triólido comieron 0,39\pm0,3 g del triólido y 2,6\pm0,2 g de yogurt. Sus concentraciones plasmáticas de (R)-3-hidroxibutirato eran de 0,80 mM después de 80 minutos y de 1,1 mM en el grupo sacrificado aproximadamente a los 150 minutos. Ninguna rata mostraba efectos nocivos tras la ingestión del triólido. Por tanto, se encontró que los niveles de (R)-3-hidroxibutirato se elevaron a 0,65 mM comiendo sólo 0,4 g de triólido. Puede apreciarse que, como las ratas habían ayunado, los niveles iniciales de (R)-3-hidroxibutirato se elevaron de 0,1 mM en el estado alimentado a aproximadamente 0,45 mM.

Por tanto, las ratas ensayadas mostraban un aumento en la concentración plasmática de (R)-3-hidroxibutirato durante aproximadamente 3 horas sin efectos nocivos. Debe apreciarse que otras dos ratas que comieron cada una aproximadamente 1,5 g de triólido en galletas "Hob-Nob" no mostraron efectos nocivos después de dos semanas.

Debe apreciarse que el aumento de los niveles de (R)-3-hidroxibutirato también se reflejará en los niveles de acetoacetato, no medidos en este documento, ya que hay un rápido establecimiento de equilibrio entre los dos in vivo, de modo que los niveles de acetoacetato estarán entre el 40 y el 100% de los niveles de (R)-3-hidroxibutirato.

Ejemplo comparativo 3

Administración oral a ratas de oligómeros de (R)-3-hidroxibutirato y oligómeros de acetoacetil(R)-3-hidroxibutirato

La capacidad del (R)-3-hidroxibutirato y de los oligómeros lineares de los ejemplos comparativos 1 y 2, administrados por vía oral para elevar los niveles en sangre de cuerpos cetónicos, se investigó como sigue. Las ratas se mantuvieron en ayuno durante una noche y, a continuación, fueron alimentados por sonda con 100 \mul/100 g de peso corporal de (R)-3-hidroxibutirato 4 M llevado a pH 7,4 usando metilglucamina. Se determinó que los niveles plasmáticos de (R)-3-hidroxibutirato eran de 0,62 mM después de 30 minutos en comparación con 3 mM, cuando se usada (R)-3-hidroxibutirato 9 M.

Este procedimiento se repitió con soluciones 2M de las mezclas de oligómeros de (R)-3-hidroxibutirato y sus ésteres de acetoacetilo descritos en los ejemplos comparativos 1 y 2. El oligómero (19/1) de (R)-3-hidroxibutirato y el éster de acetoacetilo (20/4) se llevaron ambos a pH 7,6 con metilglucamina y se controló el nivel de (R)-3-hidroxibutirato en sangre usando el procedimiento de ensayo mencionado anteriormente. Se encontró que los aumentos en la concentración de (R)-3-hidroxibutirato en suero eran de 0,2 mM a 0,5 mM, a los 60 y 120 minutos de la alimentación por sonda.

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(Tabla pasa a página siguiente)

Ejemplo 5 TABLA 2 Muestra de la dieta cetogénica de 1.500 calorías usando el oligómero cíclico (I) de la invención. Se asume que el oligómero cíclico contiene 6 kcal/g de grasas, 9 kcal/g de hidratos de carbono y 4 kcal/g de proteína. Se han sustituido los oligómeros para proporcionar calorías equivalentes

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Ejemplo 6 Efecto de (R)-3-hidroxibutirato sobre las células del hipocampo Procedimientos Medio de cultivo y compuestos químicos

El medio sin suero usado del día 0 al día 4 contenía medio Neurobasal con suplemento B27 diluido 50 veces (Life Technology, Gaithersburg, MD) al cual se añadió: L-glutamina 0,5 mM, L-glutamato Na 25 \muM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina a 100 \mug/ml. Tras el día 4, se usó medio DMEM/F12 que contenía insulina 5 \muM, 1-tiroxina 30 mM, progesterona 20 mM, selenita Na 30 mM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina a 100 \mug/ml.

Cultivos de microislas del hipocampo

Los cultivos primarios del hipocampo se obtuvieron de embriones Wistar de 18 días y se dispersaron por agitación suave en una pipeta. La suspensión se centrifugó a 1.500 x g durante 10 minutos y se eliminó el sobrenadante. El sedimento se resuspendió en medio nuevo a un número final de células de 0,4-0,5x10^{6} células/ml. Se pipetearon 10 \mul de esta suspensión en el centro de los pocillos de cultivos recubiertos de poli D-lisina y los pocillos se incubaron a 38ºC durante 4 horas y, a continuación, se añadieron 400 \mul de medio Neurobasal recién preparado.

Después de 2 días de incubación, se cambiaron la mitad de medio por otros frescos y se continuó la incubación durante 2 días más. Después del día 4, el medio se cambió por medio DMEM/F12 que contenía insulina 5 \muM, 1-tiroxina 30 nM, progesterona 20 nM, selenita Na 30 nM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina a 100 \mug/\mul.

Los pocillos se dividieron en 4 grupos: la mitad de los pocillos recibieron (R)-3-hidroxibutirato a una concentración final de 8 mM mientras que la otra mitad de los pocillos recibieron amiloide \beta_{1-42} 5 nM (Sigma). Estos medios se cambiaron 2 días después (día 8) y las células se fijaron el día 10 y se tiñeron con anticuerpo anti MAP2 (Boehringer Manheim, Indianápolis, IN) para visualizar las neuronas, y vimentina y GFAP (Boehringer) para visualizar las células gliales.

Resultados Recuentos celulares

La adición de (R)-3-hidroxibutirato a la incubación daba lugar a un aumento del número de células neuronales por microisla de una media de 30 a una media de 70 células por microisla. La adición del amiloide \beta_{1-42} 5 nM a los cultivos reducía el número de células de 70 a 30 células por microisla, lo que confirma las observaciones previas de Hoshi y col de que el amiloide \beta_{1-42} es tóxica para las neuronas del hipocampo. La adición de (R)-3-hidroxibutirato a los cultivos que contenían amiloide \beta_{1-42} aumentaba el número de células de una media de 30 a 70 células por microisla. A partir de estos datos, concluimos que la adición de cantidades a nivel del sustrato de (R)-3-hidroxibutirato, a los medios cuyos nutrientes principales son glucosa, piruvato y L-glutamina, reduce la tasa de muerte celular en los cultivos. Además se concluye que (R)-3-hidroxibutirato puede disminuir el aumento de la tasa de muerte de células del hipocampo causado por la adición de amiloide \beta_{1-42} al cultivo.

Se observó que tanto las prolongaciones dendríticas como la longitud de los axones habían aumentado con la presencia de (R)-3-hidroxibutirato, tanto en presencia como en ausencia de \beta_{1-12}. Esto es indicativo de su comportamiento similar al de un factor de crecimiento nervioso.

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Claims (5)

1. Uso de un éster cíclico de (R)-3-hidroxibutirato de fórmula (I).

104

En la que n es 1 o un número entero mayor

o un complejo del mismo con uno o más cationes o sales de los mismos

para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de estados patológicos neurodegenerativos o de diabetes de tipo II en los que el tratamiento no es para controlar las convulsiones.

2. Uso según la reivindicación 1 caracterizado porque la enfermedad está mediada por radicales libres o agentes tóxicos, tales como péptidos y proteínas, resistencia a insulina, isquemia, traumatismo craneal, deficiencia o bloqueo de la piruvato deshidrogenasa o incapacidad para realizar la glucolisis en uno o más tipos de células.

3. Uso según la reivindicacion 1 caracterizado porque la enfermedad es enfermedad de Alzheimer, parkinsomisno, esclerosis lateral amilotrófica o diabetes de tipo II.

4. Uso según las reivindicaciones 1, 2 ó 3 caracterizado porque el oligómero cíclico de fórmula (I) actúa como un estimulante neuronal capaz de estimular el crecimiento axonal y/o dendrítico en las células nerviosas in vivo o in vitro.

5. Uso según la reivindicación 4 en el que las células nerviosas son células del hipocampo o de la sustancia nigra.