ES2281105T3 - Factor intermediario de transcripcion-2 tif2. - Google Patents
Factor intermediario de transcripcion-2 tif2. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2281105T3 ES2281105T3 ES97932575T ES97932575T ES2281105T3 ES 2281105 T3 ES2281105 T3 ES 2281105T3 ES 97932575 T ES97932575 T ES 97932575T ES 97932575 T ES97932575 T ES 97932575T ES 2281105 T3 ES2281105 T3 ES 2281105T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- tif2
- polynucleotide
- polypeptide
- baselineskip
- tif
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Inorganic Insulating Materials (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Compositions Of Oxide Ceramics (AREA)
- Heat Treatment Of Steel (AREA)
- Superconductors And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
- Developing Agents For Electrophotography (AREA)
Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN MEDIADOR DE LA TRANSCRIPCION DE LOS RECEPTORES NUCLEARES (NR). MAS ESPECIFICAMENTE, SE PROPORCIONAN MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO AISLADAS QUE CODIFICAN PARA EL FACTOR-2 INTERMEDIARIO DE LA TRANSCRIPCION (TIF2), ASI COMO PROCEDIMIENTOS RECOMBINANTES PARA LA FABRICACION DE POLIPEPTIDOS TIF2, Y ANTICUERPOS TIF2. SE PROPORCIONAN ASIMISMO PROCEDIMIENTOS DE SELECCION PARA IDENTIFICAR AGONISTAS Y ANTAGONISTAS DE LA FUNCION DE ACTIVACION AF-2 DE LOS RECEPTORES NUCLEARES, PARA IDENTIFICAR AGONISTAS Y ANTAGONISTAS DE LA ACTIVIDAD DEL DOMINIO DE ACTIVACION AD1 DE TIF2, Y PARA IDENTIFICAR AGONISTAS Y ANTAGONISTAS DE LA ACTIVIDAD DEL DOMINIO DE ACTIVACION AD2 DE TIF2.
Description
Factor intermediario de
transcripción-2 TIF2.
La presente invención se refiere a un mediador
de la transcripción de un receptor nuclear (RN). Más
específicamente, se proporcionan moléculas de ácido nucleico que
codifican para el factor intermediario de transcripción 2 (TIF2).
También se proporcionan métodos recombinantes para preparar
polipéptidos de TIF2 como también métodos de selección para
identificar agonistas y antagonistas de la función de activación
AF-2 de receptores nucleares, así como anticuerpos
contra TIF2. También se proporcionan métodos de selección para
identificar agonistas y antagonistas de la actividad del dominio de
activación DA1 de TIF2, como también métodos de selección para
identificar agonistas y antagonistas de la actividad del dominio de
activación DA2 de TIF2.
Antecedentes de la invención
Los activadores que potencian la iniciación de
la transcripción por ARN polimerasa B (II) se componen de al menos
dos dominios funcionales: un dominio de unión a ADN y un dominio de
activación (M. Ptashne, Nature
335:683-689(1988); P.J. Mitchell et al.,
Science 245:371-378 (1989)). Estos dos dominios
son generalmente unidades funcionales separables y cada uno puede
intercambiarse realmente con la región complementaria de un
activador no relacionado, creando así activadores quiméricos
funcionales (S. Green et al., Nature
325:75-78 (1987)).
Se han realizado varios análisis de
estructura-función de transcripcionales eucariotas,
centrándose principalmente en las proteínas GAL4 y GCN4 de
levaduras y en miembros de la familia de receptores nucleares. Las
proteínas GAL4 y GCN4 activan la transcripción mediante la unión a
una secuencia de activación en sentido 5' específica, que tiene
muchas de las características de elementos potenciadores de
eucariotas superiores (K. Struhl, Cell
49:295-297 (1987)). El activador de herpes simple
VP16 representa otro tipo de activador, que activa la transcripción
mediante la unión al factor de transcripción octamérico unido a ADN
en lugar de la unión al ADN directamente (T. Gerster et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6347-6351
(1988)).
La familia de receptores nucleares, que incluye
receptores para hormonas esteroideas, hormonas tiroideas, vitamina
D, y el derivado de la vitamina A ácido retinóico, son también
factores potenciadores de la transcripción que se unen directamente
a ADN en presencia de su ligando relacionado mediante reconocimiento
de elementos potenciadores específicos, es decir, elementos que
responden a ligandos u hormonas (R.M. Evans, Cell
240:889-895 (1988)). Estos ligandos relacionados
tienden a ser pequeñas moléculas hidrófobas, incluyendo hormonas
esteroideas tales como estrógeno y progesterona, hormona tiroidea,
vitamina D, y diversos retinoides (S. Halachmi et al.,
Science 264:1455-1458 (1994); Gronemeyer, H. y
Laudet, V., Protein Profile 2:1173-1308
(1995)).
Sin embargo, a pesar de su pequeño tamaño y
estructura aparentemente sencilla, se sabe que los ligandos
relacionados asociados con los RN provocan una amplia gama de
respuestas fisiológicas. Los esteroides suprarrenales por ejemplo,
tales como cortisol y aldosterona, influyen ampliamente en la
homeostasis corporal, controlando el metabolismo del glucógeno y
mineral, tienen efectos generalizados sobre los sistemas inmunitario
y nervioso, e influyen en el crecimiento y la diferenciación de
células cultivadas. Las hormonas sexuales (progesterona, estrógeno
y testosterona) provocan el desarrollo y la determinación del
sistema reproductor embrionario, masculinizan/feminizan el cerebro
en el nacimiento, controlan la reproducción y el comportamiento
relacionado en los adultos y son responsables del desarrollo de los
caracteres sexuales secundarios. La vitamina D es necesaria para el
desarrollo óseo apropiado y desempeña un papel crítico en el
metabolismo del calcio y la diferenciación ósea. De manera
significativa, la producción aberrante de estas hormonas se ha
asociado con un amplio espectro de enfermedad clínica, incluyendo
cáncer y estados patológicos similares.
Todos los RN presentan una estructura modular,
con de cinco a seis regiones definidas, denominadas
A-F. La región N-terminal A/B
contiene la función de activación AF-1, que puede
activar constitutivamente la transcripción. La región C engloba el
dominio de unión a ADN (DUA), que reconoce elementos relacionados de
acción en cis. La región E contiene el dominio de unión a ligandos
(DUL), una superficie de dimerización y la función de activación de
la transcripción dependiente de ligandos AF-2
(revisado en Mangelsdorft, D.J. et al., Cell
83:835-839 (1995a); Mangelsdorft & Evans,
(Cell 83:841-850 (1995b); Beato, M. et
al., Cell 83:851-857 (1995); Gronemeyer &
Laudet, "Transcription Factors 3: Nuclear Receptors", en
Protein Profile, vol. 2, Academic Press (1995); Kastner, P.
et al., EMBO J. 11:629-642 (1992); Chambon,
P., FASEB J 10:940-954 (1996)).
Varias clases de dominios en los activadores
pueden mediar la activación de la transcripción. Los activadores de
levaduras GAL4 y GCN4 y VP16 de herpes simple contienen todos
dominios de activación que se componen de tramos ácidos de
aminoácidos, que pueden actuar formando hélices \alpha anfipáticas
(I.A. Hope et al., Cell 46:885-894 (1986); J.
Ma et al., Cell 48:847-853 (1987); E. Giniger
et al., Nature 330:670-672 (1987); S.J.
Triezenberg et al., Genes Dev. 2:718-729
(1988)). Las funciones de activación de las proteínas humanas Sp1 y
CTF/NFI contienen zonas ricas en glutamina y prolina,
respectivamente (A.J. Courey et al., Cell
55:887-898 (1988); N. Mermod et al., Cell
58:741-753 (1989)). Los estudios con receptores de
las hormonas esteroideas han mostrado que tanto el dominio
N-terminal A/B como el dominio
C-terminal de unión a hormonas (DUH) contienen
funciones de activación de la transcripción (AF) (M.T. Bocquel et
al., Nucl. Acids Res.,
17:2581-2595(1989); L. Tora et al.,
Cell 59:477-487 (1989)). Las AF del receptor de
estrógenos humano (REh) no contienen tramos de aminoácidos ácidos
(S. Halachmi et al., Science 264:1455-1458
(1994)). Sin embargo, por el contrario, el receptor de
glucocorticoides humano (RGh) contiene dos funciones de activación,
\tau-1 (ubicada en el dominio A/B) y
\tau-2 (ubicada en la región
N-terminal del DUH), siendo ambas ácidas (S.M.
Hollenberg et al., Cell 55:899-906
(1988)).
A partir de los resultados de estudios sobre
interferencia/secuestro ("squelching") transcripcional entre
receptores nucleares y sobre la estimulación homo y heterosinérgica
de la iniciación de la transcripción a partir de promotores mínimos
mediante las funciones de activación presentes en REh
(AF-1 y AF-2) y el activador ácido
VP16, se ha propuesto que las AF pueden activar la transcripción
interaccionando con diferentes componentes del complejo de
iniciación básico (Bocquel et al., Nucl. Acid Res.
17:2581-2595 (1989); Meyer et al., Cell
57:433-442 (1989); L. Tora et al., Cell
59:477-487 (1989)). Los estudios de las propiedades
de interferencia/secuestro transcripcional de los DAA (dominios
ácidos de activación), AF-1 de REh y
AF-2 de REh, sin embargo, mostraron que tanto
AF-1 como AF-2 de REh puede
secuestrar activadores ácidos, tales como VP16, pero que lo
contrario no era cierto, es decir, los DAA no secuestran las
AF-1 o AF-2 de REh. Además,
AF-1 y AF-2 de REh, que se
distinguen claramente por sus propiedades sinérgicas, no obstante se
secuestran entre sí (D. Tasset et al., Cell
62:1177-1187 (1990)).
Basándose en estos resultados, se propuso que
existe una cadena de factores intermediarios de transcripción
(TIF), interpuesta entre factores potenciadores y los factores de
transcripción básicos. Por ejemplo, se ha sugerido que
AF-1 y AF-2 entran en contacto con
la cadena de TIF en puntos funcionalmente equivalentes, mientras
que se cree que los DAA interaccionan en un punto anterior en la
serie (D. Tasset et al., Cell 62:1177-1187
(1990)).
Se han caracterizado varios supuestos TIF
coactivadores para las AF-2 de RN (véase Chambon,
P., FASEB J 10:940-954 (1996); Glass, C.K.
et al, Current Opin. Cell Biol. 9:222-232
(1997); Horwitz, K.B. et al., Mol. Endocrinol.
10:1167-1177 (1996) para revisiones recientes). En
particular, LeDouarin, B. et al., EMBO J
15:6701-6715 (1996) han demostrado que es necesario
y suficiente un fragmento de 10 aminoácidos de TIF1\alpha para
mediar en la interacción con RXR de manera dependiente de ligando y
de la integridad de AF-2. Notablemente, dentro de
este fragmento de TIF1\alpha, identificaron un motivo LxxLLL (SEQ
ID NO: 13), denominado caja RN, cuya integridad es necesaria para
la interacción con receptores nucleares, y señalaron que este
motivo se conserva en varios otros supuestos coactivadores
(LeDouarin, B. et al., EMBO J. 15:6701-6715
(1996)) Mientras que TIF1\alpha y varios otros supuestos
coactivadores no, o sólo escasamente, estimulan la transactivación
mediante los RN en células de mamífero transfectadas de manera
transitoria, se ha mostrado inequívocamente que la familia de
TIF2/CRE-1 (Oflate, S.A. et al., Science
270:1354-1357 (1995); Voegel, J.J. et al., EMBO
J. 15:3667-3675 (1996)), la familia de CBP/p300
(Kamei, Y. et al., Cell 85:403-414 (1996);
Chakravarti, D. et al., Nature 5:99-103
(1996); Hanstein, B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA
93:11540-11545 (1996); Smith, C.L. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 93:8884-8888 (1996); para
revisiones recientes véase Eckner, R., Biol. Chem.
377:685-688 (1996); Janknecht & Hunter,
Current Biol. 6:951-954 (1996b); Shikama, N.
et al., Trends in Cell Biol. 7:230-236
(1997)) y el coactivador del receptor de andrógenos ARA70 (Yeh
& Chang, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93:5517-5521 (1996)) potencian la actividad
AF-2.
Además de la unión a los RN, CBP/p300 también
puede interaccionar directamente con CRE-1 (Kamei,
Y. et al., Cell 85:403-414 (1996); Yao, T.P.
et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA
93:10626-10631 (1996)) y se ha mostrado que ambos
ejercen actividad histona acetiltransferasa (Bannister &
Kouzarides, Nature 384:641-643 (1996);
Ogryzko, V.V. et al., Cell 87:953-959
(1996)). Además, CBP/p300 puede reclutar p/CAF que es en sí mismo
una histona acetiltransferasa nuclear (Yang, X.J. et al.,
Nature 382:319-324 (1996)). Sin embargo, aparte
de interaccionar con coactivadores de manera dependiente de ligando,
también se ha mostrado que los RN interaccionan, a menudo de manera
independiente de ligando, directa o indirectamente con componentes
de la maquinaria transcripcional, tal como TFIIB, TBP, TAF, o TFIIH
(Baniahmad et al., (1993)); Jacq, X. et al., Cell
79:107-117 (1994); Schulman, IG. et al., Mol.
Cell. Biol. 16:3807-3813(1996); May, M.
et al., EMBO J. 15:3093-3104 (1996); Mengus,
G. et al., Genes & Dev. 11:1381-1395
(1997)).
Hong, H. et al., Proc. Natl. Acad Sci.
USA 93:4948-4952 (1996) describieron
originalmente un ADNc parcial del homólogo de ratón de de TIF2,
denominado GRIP1, y notificaron recientemente el aislamiento de un
ADNc de longitud completa de GRIP1 (Hong, H. et al., Mol. Cell.
Biol. 17:2735-2744(1997)). Usando la
levadura Saccharomyces cerevisiae como sistema modelo, han
demostrado que la activación de la transcripción mediante TR, RAR y
RXR, podría estimularse también mediante la coexpresión de GRIP1, lo
que sugiere que TIF2/GRIP1 podría ser un coactivador general para
los RN (Hong, H. et al., Mol. Cell. Biol.
17:2735-2744 (1997)).
El panorama global resultante de múltiples
estudios recientes sobre los mecanismos mediante los cuales los
receptores nucleares modulan la transcripción génica diana supone
tres etapas posteriores, (i) la transconformación inducida por
ligando del DUL de RN, que da como resultado (ii) la disociación de
correpresores y la formación de complejos de TIF/coactivador, que
ellos mismos (iii) a través de la interacción con factores
posteriores adicionales (por ejemplo, CBP, p300) modulan el estado
de acetilación de las histonas del núcleo y, por tanto, la
condensación/descondensación de la cromatina. Sin embargo, la
acetilación de histonas por sí misma es insuficiente para la
activación de la transcripción (Wong et al., (1997)), y un
cuarto acontecimiento simultáneo o posterior comprende el
reclutamiento directo y/o indirecto de elementos de la maquinaria
transcripcional (por ejemplo, TFIB, TBP, TAF, TFIIH; Jacq, X. et
al., Cell 79: 107-117 (1994); Schulman, IG.
et al., Mol. Cell. Biol. 16:3807-3813 (1996);
May, M. et al., EMBO J. 15:3093-3104 (1996);
Mengus, G. et al., Genes & Dev.
11:1381-1395 (1997)). Obsérvese que tales
interacciones no necesitan ser dependientes de ligando, si la
función primaria del DUL unido a ligando (AF-2) es
regular la accesibilidad al ADN a través de remodelación de la
cromatina. De hecho, varias de las interacciones notificadas entre
los RN y los factores de transcripción generales se producen de
manera independiente de ligando. En consecuencia, hay una necesidad
en la técnica para el aislamiento y caracterización de factores
intermediarios de transcripción.
Examinando 340.000 clones de una biblioteca de
expresión de ADNc de placenta humana con una sonda de receptor de
estrógenos unida a estradiol, los presentes inventores han
identificado un clon de ADNc que contiene el gen que codifica para
el factor intermediario de transcripción 2 (TIF2). Mediante la
invención, se ha demostrado que TIF2 muestra todas las propiedades
esperadas para un TIF/mediador de AF-2: interacciona
directamente con los DUL de varios RN de una manera dependiente de
agonista y de la integridad de AF-2 in vitro
e in vivo, alberga una AF autónoma, alivia el autosecuestro
de RN, y potencia la actividad de los AF2 de RN cuando están
sobreexpresados en células de mamíferos.
Por tanto, en un aspecto, la presente invención
proporciona moléculas de ácido nucleico que comprenden un
polinucleótido que codifica para TIF2 cuya secuencia de aminoácidos
se muestra en la figura 1 (SEQ ID NO:2) o un fragmento del mismo
que tiene una actividad tal como se describe a continuación en el
presente documento. En otro aspecto, la invención proporciona
moléculas de ácido nucleico que codifican para TIF2, que tienen una
secuencia de aminoácidos según se codifica por el ADNc depositado
como ATCC número de registro 97612.
También se describe una molécula de ácido
nucleico que se hibrida en condiciones restrictivas a las moléculas
de ácido nucleico anteriormente descritas. Además, se describen
variantes de moléculas de ácido nucleico de la presente invención,
que codifican para fragmentos, análogos o derivados de la proteína
TIF2, por ejemplo, polipéptidos que tienen al menos una actividad
biológica que es sustancialmente similar a al menos una actividad
biológica de la proteína TIF2.
La presente invención se refiere además a
moléculas de ácido nucleico que codifican para un polipéptido TIF2
citoplásmico. Métodos para generar moléculas de ácido nucleico que
codifican para un polipéptido TIF2 citoplásmico incluyen mutar o
eliminar la región N-terminal que codifica para los
NLS de la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID
NO:1). Preferiblemente, las moléculas de ácido nucleico que
codifican para un polipéptido TIF2 citoplásmico serán fragmentos
que tienen una eliminación en todo o en parte de la región
N-terminal que codifica para los NLS. Mediante la
invención, los polipéptidos TIF2 citoplásmicos descritos en el
presente documento muestran al menos una actividad biológica que es
sustancialmente similar a al menos una actividad biológica de TIF2
tal como se describe en el presente documento.
Realizaciones adicionales de la invención
incluyen moléculas de ácido nucleico que comprenden un
polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos idéntica en
al menos un 90%, y más preferiblemente idéntica en al menos un 95%,
un 96%, un 97%, un 98%, o un 99% a las moléculas de ácido nucleico
anteriormente descritas.
La presente invención también se refiere a
vectores que contienen las moléculas de ácido nucleico anteriormente
descritas, células huésped transformadas con los vectores y la
producción de polipéptidos TIF2 mediante métodos recombinantes.
La presente invención proporciona además
polipéptidos TIF2 que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada
en la figura 1 (SEQ ID NO: 2). En un aspecto adicional, se
proporcionan polipéptidos TIF que tienen una secuencia de
aminoácidos según se codifica por el ADNc depositado como ATCC
número de registro 97612.
También se proporcionan métodos de selección
para identificar agonistas y antagonistas de la función
AF-2 de receptor nuclear, para identificar
agonistas y antagonistas de la actividad DA1 de TIF2, y para
identificar agonistas y antagonistas de la actividad DA2 de TIF2.
También se proporcionan anticuerpos contra TIF2.
Figura 1(a-b). Las
secuencias de nucleótidos (SEQ ID NO: 1) y aminoácidos (SEQ ID NO:
2) de la proteína del factor intermediario de transcripción (TIF2).
Esta proteína tiene un peso molecular deducido de aproximadamente
160 kDa. Se muestra la secuencia de aminoácidos del fragmento de
proteína TIF2.1 del coactivador funcional desde el residuo de
aminoácido 624 hasta el residuo 1287.
Figura 2(a-c). TIF2 es el
factor de interacción con el receptor nuclear de 160 kDa.
(a) los experimentos pull-down
GST (determinación de interacción física entre dos o más proteínas)
identifican una proteína de 160 kDa que interacciona con dominios de
unión a ligando (DUL) del receptor de ácido retinóico
(RAR)-\alpha y del receptor de estrógenos (RE)
unido a ligandos (RE(DEF) y RAR\alpha(DEF),
respectivamente). Obsérvese que se usa menos material en el carril 5
que en los carriles 1-4.
(b) La immunoreducción seguido de detección por
inmunotransferencia tipo Far-Western demuestra la
identidad de TIF2 con la proteína de 160 kDa bioquímicamente
identificada. Triángulo en blanco, TIF2; punta de flecha, TIF1;
círculo, reacción cruzada de anticuerpo con
GST-RE(DEF). La especie inmunodetectada por
p\alpha-TIF2 menor que TIF2 (carriles 2 y 6) es lo
más probablemente un producto de degradación de TIF2, dado que se
elimina mediante inmunoreducción con m\alpha-TIF2
(carriles 4 y 8).
(c) La inmunotransferencia tipo Northern revela
un transcrito de \approx9 kb de TIF2 en varios tejidos
humanos.
Métodos. (a) Extractos de células
completas MCF7 marcados con ^{35}S-Met in
vivo (Cavaillès, V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:10009-100013 (1994)) preaclarados dos veces con
glutatión sepharose cargada con GST se incubaron (Le Douarin, B.
et al., EMBO J. 14:2020-2033 (1995)) con GST,
GST-REh (DEF) o GST RARh\alpha(DEF), en
presencia o ausencia de E2 o T-AR 10^{-6} M. Se
recuperaron las proteínas unidas con un tampón de muestra SDS y se
revelaron mediante flourografía (Amplify, Amersham) de geles
SDS-poliacrilamida.
(b) Se preaclararon extractos de células
completas HeLa (2 ml en NaCl 500 mM, TrisHCl 250 mM pH 7,5, glicerol
al 20%, DTT 5 mM), con proteína-G sepharose (400
\mul) y se trataron con proteína-G sepharose (3 x
400 \mul) cargada con m\alpha-TIF2 (obtenido
contra un péptido sintético que engloba los aminoácidos
E624-Q643 acoplados a ovalbúmina) o suero IgG de
ratón no específico. Tras aclarados adicionales con
proteína-G sepharose (400 \mul), se incubó el
sobrenadante (Le Douarin, B. et al., EMBO J.
14:2020-2033 (1995)) con
GST-REh(DEF) en presencia o ausencia de
E2(10^{-6} M). Se recuperaron las proteínas retenidas con
tampón de muestra SDS, se separaron mediante
SDS-PAGE y se sometieron a
electroinmunotransferencia sobre membranas de nitrocelulosa. La
inmunotransferencia tipo Far Western fue tal como se describe
(Cavaillès, V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:10009-100013 (1994)). Para la inmunotransferencia
se usó antisuero policlonal de conejo
(p\alpha-TIF2), obtenido contra (Chen,
Z-P. et al., J. Biol. Chem.
269:25770-25776 (1994)) TIF2.1 marcada con His
expresada en E. coli recombinante purificada. Se diluyeron
p\alpha-TIF2 y p\alpha-TIF1
policlonal de conejo 1:2000 para inmunotransferencia tipo Western
basada en ECL (Amersham). Se verificaron todas las construcciones
usados en este estudio mediante secuenciación de ADN.
(c) Se reveló una inmunotransferencia tipo
Northern Humano (Clonetech, No 7760-1; Lote 5x332)
con TIF2.1 marcado conP. Para confirmar una carga proporcionada, se
rehibridó la membrana con ADNc de \beta-actina
marcado con ^{32}P (Clonetech).
Figura 3(a-b). La
secuencia de aminoácidos de TIF2: homología con
CRE-1 indica la existencia de una familia novedosa
de mediadores de RN.
(a) Alineamiento y secuencia de aminoácidos de
TIF-2 (SEQ ID NO:2) y el coactivador del receptor de
esteroides CRE-1 (SEQ ID NO:3) (Onate, S.A. et
al., Science 270:1354-1357 (1995)). Se resaltan
dos agrupaciones cargadas ricas en restos de aminoácidos ácidos y
básicos, tres regiones ricas en serina/treonina (S/T) y una región
rica en glutamina. La agrupación cargada en el extremo
N-terminal contiene señales de localización nuclear
(NLS) bipartitas supuestas (subrayado superior). Se indican las
regiones que codifican para TIF2.1 (aminoácidos 624 a 1287;
fragmento coactivador funcional) y dnCRE-l
(aminoácidos 865 a 1061; fragmento negativo dominante). Un asterisco
identifica el codón de terminación de TIF2. Obsérvese que TIF2.1 y
dnCRE-1 no solapan, lo que indica que
dnCRE-1 puede posiblemente contener una región que
interacciona con RN distinta de la de TIF2.1.
(b) Comparación esquemática de TIF2 y
CRE-1. Se indican las identidades en porcentaje
(similitudes entre paréntesis) de regiones homólogas. La agrupación
cargada en el extremo N-terminal que alberga las NLS
supuestas y la región rica en S/T C-terminal de TIF2
no están, o sólo débilmente, conservadas en
CRE-1.
Métodos. Se examinaron 340.000 clones de
una biblioteca de expresión \lambdaEXIox de ADNc de placenta
humana con una sonda GST-REh(DEF) marcada con
^{32}P en presencia de E2 10^{-6} M usando la técnica de
inmunotransferencia tipo Far-Western (Cavaillès, V.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:10009-100013 (1994)). Se usó un inserto de 1992
pb correspondiente al clon inicial (TIF2.1) para reexaminar la misma
biblioteca. Cinco insertos de ADNc sumamente solapados cubren una
región de 6 kb que contienen un ORF de 1.464 aminoácidos. Se
secuenciaron todos los insertos en ambas cadenas. La expresión
transitoria de los insertos de ADNc ensamblado que engloban el ORF
predicho dio una proteína de 160 kDa.
Figura 4(a-n).
Interacciones in vivo e in vitro de TIF2 con
receptores nucleares.
(a) La proteína TIF2 sobreexpresada se localiza
principalmente en cuerpos nucleares discretos y se excluye de los
nucleolos. Se muestra una imagen superpuesta de tinción Hoechst de
ADN e inmunotinción de TIF2.
(b-i) TIF2.1 citoplásmico
interacciona de una manera dependiente de agonista con receptores
nucleares en células de mamíferos. Una tinción débil indica un
colocalización de TIF2.1-NO.
(k-n) TIF2.1 interacciona
directamente in vitro de una manera dependiente de agonista
con receptores nucleares, y las mutaciones puntuales dentro del
núcleo del dominio de activación (DA) de AF-2
suprimen esta interacción. WT, tipo natural. Concentraciones de
ligando para n: 9C-AR, T-AR y
T3, 10^{-6} M; E2, 5x10^{-8} M; OHT, 5x10^{-6} M. El
polipéptido inmunodetectado menor es un producto de degradación de
TIF2.1. Obsérvese que el suero anti-TIF2 reacciona
de manera cruzada débilmente con
GST-REh(DEF).
Métodos. (a-i) Se
transfectaron transitoriamente células Cos-l con
TIF2.1 (10 \mug) o bien (a) solas o bien (b-i)
junto con los vectores de expresión de RN indicados (10 \mug,
excepto RAR\alpha, 1 \mug) en ausencia o presencia del ligando
relacionado (10^{-6} M, excepto R5020, 10^{-8} M). En
d-f se usó HE0 (Webster, N.J. et al., Cell
54:199-207(1988)). Los ensayos de
inmunocitofluorescencia fueron tal como se describen (Kastner, P.
et al., EMBO J. 11: 629-642 (1992)). Se
grabaron imágenes mediante microscopía láser confocal.
(k-n) Se realizaron ensayos de
interacción de GST con TIF2.1 recombinante que expresa en E.
coli (Figura 2b) tal como se describen (Le Douarin, B. et
al., EMBO J. 14:2020-2033 (1995)). Se revelaron
proteínas unidas mediante inmunotransferencia tipo Western con
antisuero p\alpha-TIF2 (dilución 1:30.000), se
verificó igual carga de matrices de afinidad mediante
SDS-PAGE y tinción Coomassie. Los carriles de
"entrada" contienen un tercio de la entrada de TIF2.1.
Figura 5 (a-e). TIF2 contiene
una AF autónoma, "anti-secuestra", y estimula
la actividad NO-AF2 de una manera dependiente de
célula, promotor y agonista.
(a) Aumentar la cantidad de proteína de fusión
GAL-TIF2.1 (carriles 2-4) activa la
transcripción de un indicador relacionado en células transfectadas.
El número de veces de inducción se da debajo de los ensayos CAT.
(b) TIF2.1 invierte parcialmente la
autointerferencia transcripcional de RE. Se muestra la expresión CAT
normalizada (media \pm e.e. de 4 experimentos independientes).
Círculos blancos, +E2, +TIF2; cuadrados, +E2,
-TIF2; cruces, +OHT, +TIF2.
(c) TIF2 potencia la transactivación mediada por
algunas AF-2 de RN, pero no aquellas mediadas por
otros factores de transcripción. Se dan las estimulaciones de TIF2
medias de 3 experimentos independientes (variación < 13%).
Ligandos: carriles 3-4, E2; carriles
7-8, DHT (dihidrotestosterona); carriles
11-12, R5020; carriles 15-16,
T-AR.
(d) TIF2 potencia la activación de la
transcripción mediada por RP de un promotor tanto mínimo
(GRE-TATA) como complejo (MMTV): esta estimulación
es significativamente mayor en células Cos-1 que en
células HeLa.
(e) TIF2 potencia mucho la activación inducida
de agonista mediante RE en Cos-1 y más débilmente en
células HeLa. Obsérvese que la inducción por TIF2 aparentemente
independiente de ligando, débil, de RE (compárense carriles 1 con 2
y 7 con 8) se debe a estradiol residual en el medio de cultivo. En
d y e, se muestran inducciones por TIF2 de \geq 3
experimentos (variación \leq10%).
Métodos. Con la excepción de
GAL-TIF2.1, TIF2.1 y TIF2, se ha descrito la
construcción de plásmidos indicadores y vectores de expresión
(Meyer, M-E. et al., Cell
57:433-442 (1989); Bocquel, M-T.
et al., Nucl. Acids Res. 17:2581-2595 (1989);
Tasset, D. et al., Cell 62:1177-1187 (1990);
Gronemeyer, H. y Laudet, V., Protein Profile
2:1173-1308 (1995); Webster, N. J. et al.,
Cell 54:199-207(1988); Strahle, U. et
al., EMBO J. 7:3389-3395 (1988); Seipel, K.
et al, EMBO J. 11:49614968 (1992); Nagpal, S. et
al., EMBO J. 12:2349-2360 (1993); Chen,
J-Y. et al., EMBO J.
14:1187-1197(1995)). Se realizaron ensayos
CAT tal como se describe (Bocquel, M-T. et al.,
Nucl. Acids Res. 17:2581-2595 (1989)).
(a) Se cotransfectaron células HeLa con 1 \mug
de (17m)_{5}-\betaG-CAT y
10 \mug de GAL(1-147) o 1,3 y 10 \mug de
GAL(1-147)-T1F2.1,
respectivamente.
(b) Se cotransfectaron células HeLa con 5 \mug
de Vit-tk-CAT y la cantidad indicada
de HEG0, con o sin 5 \mug de TIF2.1 en la presencia de OHT o E2
10^{-6} M. Se da la actividad CAT con respecto a la inducida por
100 ng de HEG0 en presencia de E2.
(c) Se cotransfectaron células HeLa con 1 \mug
de 17m-tk-CAT y 1 \mug de los
vectores de fusión-GAL indicados con o sin la
adición de 3 \mug de vector de expresión de TIF2 en presencia o
ausencia de ligando 10^{-6} M.
(d) Se transfectaron células HeLa (carriles
1-12) o Cos-1 (carriles
13-18) con 5 \mug de
GRE-TATA-CAT (carriles
1-6) o 1 \mug de MMTV-CAT
(carriles 7-18) junto con 1 \mug de RPh con o sin
3 \mug de TIF 2 en presencia o ausencia de 10^{-6} M del ligando
indicado.
(e) Se cotransfectaron células
Cos-1 con 1 \mug de
Vit-tk-CAT y 1 \mug de HEG0 con o
sin 3 \mug de TIF2 en presencia o ausencia de 10^{-6} M de los
ligandos indicados.
Figura 6 (a-b). Representación
esquemática de genes indicadores (A) y vectores de expresión de
receptor (B) (véase la sección de Materiales y Métodos de Nagpal
et al., EMBO J 12(6):2349-2360 (1993)
para una descripción detallada de la construcción). Se indican
secuencias de mCRBPII (SEQ ID NO: 11) y
mCRBPII(17m-ERE)/CAT (SEQ ID NO:11). Los
números positivos y negativos son con respecto al sitio de inicio de
ARN (+1). En (B), se representan esquemáticamente (no en escala) las
distintas regiones (A-F) de RAR y RXR de tipo
natural, así como sus mutantes de truncación, mutantes de
sustitución y construcciones de receptores quiméricos (véase Zelent
et al., Nature 339:714-717 (1989); Leid et
al., Trends Biochem. Sci. 17:427433 (1992); Leid et al.,
Cell 68:377-395 (1992); Nagpal et al.,
Cell 70:1007-1019 (1992); y Allenby et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:30-34 (1993)). Los
números indican las posiciones de los aminoácidos en los receptores
de tipo natural. Las posiciones de las sustituciones de los
aminoácidos están indicadas con una flecha.
Figura 7(a-e). Mapeo de
dominios TIF2.
(a) Representación esquemática de dominios
funcionales identificados en TIF2. Se indican las distintas
construcciones de TIF2; los restos expresados se dan entre
paréntesis. Las líneas en negrita indican las secuencias expresadas.
Las construcciones que puntúan positivo o negativo para la
interacción, transactivación o unión a CBP del RN se identifican en
la derecha mediante signos "+" y "-" respectivamente; nd,
no determinado.
(b) Mapeo del dominio de TIF2 que interacciona
con el receptor nuclear. Se realizan experimentos
pull-down en
glutatión-S-transferasa (GST) con
polipéptidos TIF2 traducidos in vitro marcados con ^{35}S y
GST, GSTREh\alpha(DEF) y GST-RARh\alpha
(DEF) producidos de manera bacteriana, en la presencia o ausencia de
10^{-6} M del ligando relacionado (E2, estradiol para RE; AR,
ácido todo trans-retinóico para RAR).
(c) Análisis de la actividad de transcripción de
las proteínas de fusión GAL-TIF2. Se transfectaron
células Cos-1 y HeLa con 3 \mug de plásmidos que
expresan distintas regiones de TIF2 fusionadas al dominio de unión a
ADN del factor de transcripción GAL4 de levadura con 1 \mug del
plásmido indicador
(17m)_{5}-G-CAT. Se
realizaron ensayos CAT tal como se describe (Bocquel, M.T. et
al., Nucl. Acids Res. 17:2581 2595 (1989)). Se obtuvieron datos
cuantitativos sobre la expresión del indicador CAT o bien mediante
análisis de sistema de detección y cuantificación de la
radiactividad (BAS2000, Fuji) de productos de reacción CAT marcados
con ^{14}C separados mediante cromatografía de capa fina, o usando
el kit CAT ELISA (Boehringer Mannheim). En todos los casos, se
normalizaron las actividades CAT con respecto a las concentraciones
de \beta-galactosidasa resultantes de la
cotransfección de 1 \mug de pCMV\betaGal (regalo de T. Lerouge)
como control interno. Se indica el número de veces de inducciones
por encima del valor de DUA GAL4. Se muestran la media y la
desviación estándar de al menos tres experimentos. Se muestra en la
izquierda una inmunotransferencia tipo Western representativa, que
ilustra los niveles de expresión de las proteínas de fusión
GAL4-TIF2, expresadas a partir de 10 \mug de los
correspondientes vectores de expresión. La inmunotransferencia se
reveló con anticuerpos monoclonales de ratón 2GV3 y 3GV2 específico
para DUA de GAL4 y 2GV4B7 específico para el dominio de activación
VP16.
(d) Mapeo del dominio de TIF2 que interacciona
con GBP. Se realizaron experimentos pull-down con
polipéptidos TIF2 traducidos in vitro marcados con ^{35}S y
GST y GST-CBP (que expresa restos de CBP 1872 a
2165) producidos de manera bacteriana.
(e) Análisis de dos híbridos de la interacción
de CBP-TIF2 en células de mamífero in vivo.
Se transfectaron células HeLa con 0,2 \mug de vectores de
expresión GAL4 o GAL4-CBP (que expresa los restos de
CBP 1872 a 2165) junto con 0,2 \mug de vectores de expresión
VP16-TIF2 o VP16 en presencia de 1 \mug de
plásmido informador
(l7m)_{5}-TATA-CAT. Se
indica el número de veces de inducción con respecto a la actividad
de GAL-CBP. Se muestra la media de tres
experimentos; en cada caso, los valores variaron en menos de un
\pm20%.
Figura 8(a-e). Mapeo del
dominio de interacción con el receptor nuclear (DIN) de TIF2.
(a) Alineamiento del DIN de TIF2 (SEQ ID NO: 2)
con las regiones correspondientes de CRE-1 (SEQ ID
NO: 3) y P/CIP (SEQ ID NO: 5) y descripción de mutaciones del DIN.
Se muestran las tres regiones conservadas con los números de
aminoácidos correspondientes de TIFh2 o CREh-1 de
longitud total (F-CRE-1); se
recuadran las leucinas relativas a los tres motivos de cajas de RN
(I, II, III). Se indican las diversas construcciones de mutaciones
puntuales de leucina a alanina y de eliminación.
(b) Alineamiento de las cajas de RN de TIF2 (SEQ
ID NO: 2) con cajas de RN identificadas en varios cofactores:
TIF1\alpha (SEQ ID NO: 6), RIP140 (SEQ ID NO: 7), y TRIP3 (SEQ ID
NO: 8). Las leucinas conservadas están recuadradas.
(c-d) Interacción de mutantes de
DIN de TIF2 con los RN in vitro. Se llevaron a cabo
experimentos de cromatografía por afinidad en GST con fusiones DUA
de GAL4 traducidas in vitro marcadas con ^{35}S de mutantes
de eliminación de TIF2 (c) o mutantes puntuales de TIF2.1 (d) y
fusiones de GST y GST expresada de manera bacteriana de
RE(DEF) y RAR(DEF) en ausencia o presencia de
estradiol 10^{-6} M o ácido todo
trans-retinoico, respectivamente. Para la
cuantificación de interacciones de mutantes puntuales, véase a
continuación.
(e) Efecto de mutaciones puntuales de DIN de
TIF2 sobre la estimulación de la actividad de AF-2
de RN. Se cotransfectaron células Cos-1 con 1 \mug
del informador
(17m)_{5}-TATA-CAT, 0,2
\mug de GAL-REh\alpha(EF) o
GAL-RXRm\alpha(DE), y 2,5 \mug de TIF2.1
tipo natural o fragmentos mutados, según se indica. Se indica la
activación del gen indicador con respecto a la actividad de tipo
natural de TIF2.1 y en presencia de estradiol (E2) 10^{-6} M o
ácido todo trans-retinoico (AR),
respectivamente, para cada mutante (barras negras); para comparar se
indican mediante barras blancas la unión in vitro de los
mutantes respectivos con respecto a la unión de tipo natural de
TIF2.1 en presencia de ligando. Cada barra representa el valor medio
obtenido a partir de al menos tres (interacción) o al menos cuatro
(transactivación) experimentos, respectivamente; se indican las
desviaciones estándar. Obsérvese que los valores absolutos para la
actividad de tipo natural de TIF2.1 varía en un \pm 16% cuando se
cotransfectan con GAL-REh\alpha(EF) y en un
\pm 34% cuando se cotransfectan con
GAL-RXRm\alpha(DE). En los ensayos de
interacción in vitro, la afinidad del patrón de tipo natural
de TIF2.1 variaba en menos de un \pm 25%. Se verificaron los
niveles de expresión de mutantes de TIF2 en las células mediante
inmunotransferencia tipo Western (no mostrados) con anticuerpo
3Ti3F1 monoclonal de ratón, que se dirige contra un epítopo fuera
del área mutada.
Figura 9(a-c). Mapeo de
la función de activación-1 (AF-1) de
TIF2 e interacción del dominio de AF-1 con CBP.
(a) Alineamiento de la AF-1 de
TIF2 con la región correspondiente de CRE-1 (SEQ ID
NO: 3) y P/CIP (SEQ ID NO: 9). Descripción de los mutantes de
eliminación de AF-1 de TIF2 y sus propiedades. Las
regiones de TIF2 y CREh-1 que se predijo se
doblarían en hélices \alpha se recuadran (programa PHD). Las
construcciones GAL-TIF2 que puntúan positivo o
negativo para la transactivación de un indicador de GAL4 se
identifican a la derecha mediante signos "+" y "-",
respectivamente; nd, no determinado.
(b) Activación de la transcripción de mutantes
de AF-1 de TIF2. Se cotransfectaron células
Cos-1 y HeLa con 3 \mug de plásmidos que expresan
distintos mutantes de AF-1 de TIF2 fusionados al
dominio de unión a ADN del factor de transcripción de la levadura
GAL4 junto con 1 \mug del plásmido indicador
(17m)_{5}-G-CAT. Se indican
las veces de inducción sobre la activación observada con el DUA de
GAL4 sólo. Los valores representan la media de al menos tres
experimentos. Obsérvese que todas las proteínas de fusión
GAL4-TIF2 se expresaron a niveles similares, tal
como se revela mediante inmunotransferencia tipo Western con
anticuerpos dirigidos contra DUA de GAL4 (datos no mostrados).
(c) Interacción de mutantes de
AF-1 de TIF2 con CBP in vitro. Se realizaron
experimentos pull-down en GST con proteínas de
fusión GAL-TIF2 traducidas in vitro marcadas
con ^{35}S y GST y GST-CBP producidas de manera
bacteriana. Obsérvese, que DUA de GAL4 por si mismo no interacciona
con la matriz de afinidad GST-CBP.
Figura 10(a-c).
Identificación de mutantes de AF-1 de TIF2 que están
dañados tanto en la activación trascripcional como en la interacción
CBP.
(a) Activación de la transcripción mediante
TIF2.13 y mutantes de TIF2.13. Se cotransfectaron células
Cos-1 y HeLa con 3 \mug de plásmidos que expresan
la región TIF2.13 y los mutantes de TIF2.13 indicados fusionados al
dominio de unión a ADN del factor de transcripción GAL4 de levadura
junto con 1 \mug de plásmido indicador
(17m)_{5}-
G-CAT. Se indican las veces de inducción sobre el valor de 1 vez de DUA de GAL4. Se muestran la media y la desviación estándar obtenida de al menos cuatro experimentos. Se confirmaron los niveles de expresión de las proteínas de fusión GAL4-TIF2.13 mediante inmunotransferencia tipo Western (datos no mostrados).
G-CAT. Se indican las veces de inducción sobre el valor de 1 vez de DUA de GAL4. Se muestran la media y la desviación estándar obtenida de al menos cuatro experimentos. Se confirmaron los niveles de expresión de las proteínas de fusión GAL4-TIF2.13 mediante inmunotransferencia tipo Western (datos no mostrados).
(b) Interacción de TIF2.13 tipo natural y
mutantes de TIF2.13 con CBP en células de mamíferos revelada
mediante análisis de dos híbridos. Se transfectaron células HeLa con
0,2 \mug de vectores de expresión GAL-CBP o GAL4
junto con 0,2 \mug de vectores de expresión VP16 o
VP16-T1F2.13 en la presencia de 1 \mug de plásmido
indicador (17m)_{5}-
TATA-CAT. Los datos se representan como veces de inducción de la actividad observada con GAL-CBP sólo. Se muestran la media y la desviación estándar obtenidas a partir de diez experimentos. Se confirmaron los niveles de expresión mediante inmunotransferencia tipo Western con anticuerpos dirigidos contra DUA de GAL4 y DAA de VP16 (datos no mostrados).
TATA-CAT. Los datos se representan como veces de inducción de la actividad observada con GAL-CBP sólo. Se muestran la media y la desviación estándar obtenidas a partir de diez experimentos. Se confirmaron los niveles de expresión mediante inmunotransferencia tipo Western con anticuerpos dirigidos contra DUA de GAL4 y DAA de VP16 (datos no mostrados).
(c) Interacción de TIF2.13 de tipo natural y
mutantes de TIF2.13 con CBP in vitro. Se realizaron
experimentos pull-down GST con polipéptidos
VP16-TIF2.13 traducidos in vitro marcados con
^{35}S y GST y GST CBP producidos de manera bacteriana. Obsérvese
que el dominio de activación de VP16 por si mismo no interacciona
con
GST-CBP.
GST-CBP.
Figura 11. El fragmento coactivador de TIF2.1
estimula eficazmente la AF-2 dependiente de ligando
de RE, RAR y RXR en levadura. No es observable ningún efecto
estimulante de TIF2.1 sobre la AF-1 aislada de RE
(HE15). Se introdujeron plásmidos que expresan distintas regiones de
REh\alpha (blanco), RARh\alpha (gris) y RXRm\alpha (negro)
fusionado con el DUA de RE (REh\alpha(C)) dentro de la cepa
indicadora PL3(\alpha) de levadura junto con TIF2.1 tal
como se indica. Las cajas blancas representan las secuencias de
transformantes que se hicieron crecer en presencia o ausencia de
10^{-6} M del ligando relacionado (estradiol para RE, ácido todo
trans-retinoico para RAR, ácido
9-cis-retinoico para RXR). Se
expresan las actividades de OMP descarboxilasa determinadas en cada
extracto libre de células en nmol/min/mg de proteína; se muestran la
media y la desviación estándar de al menos cuatro experimentos.
Figura 12(a-d). El
dominio de interacción con el receptor nuclear aislado (DIN) de TIF2
actúa negativamente como dominante sobre la activación de la
transcripción mediante los DUL de RE, RXR y RAR. Se indica el valor
medio de inducción obtenido a partir de la cuantificación de al
menos tres experimentos (con respecto a la actividad del DUL del
receptor respectivo en ausencia de TIF2 recombinantE) debajo de cada
panel. Se verificaron rutinariamente los niveles de expresión de
TIF2, TIF2.1 y TIF2.5 mediante inmunotransferencia tipo Western con
anticuerpo 3Ti3C11 monoclonal de ratón dirigido contra una región de
TIF2.5 (no mostrada).
(a) La sobreexpresión de fragmento de TIF2.5 que
contiene el DIN aislado invierte el efecto estimulante de un
fragmento coactivador potente de TIF2.1. Se cotransfectaron células
Cos-1 con 1 \mug de indicador
(17m)_{5}-TATA-CAT y 0,2
\mug de vector de expresión
GAL-RE\alpha(EF) en presencia o ausencia de
estradiol 10^{-6} M. Cuando se indica, se cotransfectaron además
0,1 \mug de vectores de expresión TIF2.1 y 2,5 \mug de
TIF2.5.
(b-d) El TIF2 de longitud
completa y fragmento coactivador de TIF2.1 potencian, mientras que
el dominio de interacción con el receptor nuclear TIF2.5 bloquea, la
actividad de los DUL de RE, RXR y RAR. Se cotransfectaron células
Cos-1 y HeLa con 1 \mug del indicador
(17m)_{5}-TATA-CAT y 0,2
\mug de vector de expresión que codifica para la fusión respectiva
de DUA de GAL de REh\alpha(EF), RXRm\alpha(DE) o
RARm\alpha(DEF). En presencia o ausencia de ligando
10^{-6} M (E2, estradiol; 9C-AR, ácido
9-cis-retinoico;
T-AR, ácido todo
trans-retinoico), junto con 0,25 \mug o 2,5
\mug de vectores de expresión de TIF2, TIF2.1 y TIF2.5.
La presente invención proporciona moléculas de
ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que codifica para
el factor intermediario de transcripción 2 (TIF2) cuya secuencia de
aminoácidos se muestra en la figura 1 (SEQ ID NO: 2). La proteína
TIF2 de la presente invención comparte homología de secuencia con el
coactivador de receptor de esteroides humano CRE-1
(SEQ ID NO: 3) (figura 3). La secuencia de nucleótidos mostrada en
la figura 1 (SEQ ID NO: 1) se obtuvo mediante secuenciación de un
clon de ADNc que se había depositado el 14 de Junio, 1996 en el ATCC
y facilitado el número de registro 97612.
En una realización de la presente invención, se
proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican para la
proteína TIF2. Las similitudes de secuencia entre TIF2 y
CRE-I (Onate et al., Science 270:1354
(1995)) indica la existencia de una familia novedosa de genes
mediadores transcripcionales de RN. Usando la información
proporcionada en el presente documento, tales como la secuencia de
nucleótidos en la figura 1 (SEQ ID NO: 1) o el clon depositado
anteriormente descrito, una molécula de ácido nucleico de la
presente invención que codifican para un polipéptido TIF2 puede
obtenerse usando procedimientos de clonación y selección
habituales. Ilustrativa de la invención, la molécula de ácido
nucleico descrita en la figura 1 (SEQ ID NO: 1) se descubrió en una
biblioteca de expresión de ADNc de tejido de placenta humana. El
ADNc de TIF2 de la presente invención codifica para una proteína de
aproximadamente 159 kDa (1,464 aminoácidos), que incluye señales de
localización nuclear (NLS) N-terminales, una región
rica en Gln y tres ricas en Ser/Thr, y dos agrupaciones cargadas
(figura 3). TIF2 se expresa ampliamente, dado que el transcrito
correspondiente se encontró en varios tejidos humanos, incluyendo
páncreas, riñón, músculo, hígado, pulmón, placenta, cerebro y
corazón (figura 2c).
Los ácidos nucleicos de la presente invención
pueden estar en la forma de ARN, tales como ARNm, o en la forma de
ADN, incluyendo, por ejemplo, ADNc y ADN genómico obtenido mediante
clonación o producido sintéticamente. El ADN puede ser de doble
cadena o de cadena sencilla. El ARN o ADN de cadena sencilla puede
ser la cadena codificante, también conocida como la cadena de
sentido, o también puede ser la cadena no codificante, también
referida como la cadena anti-sentido.
Por molécula(s) de ácido nucleico
"aislada(s)" se pretende una molécula de ácido nucleico,
ADN o ARN, que se ha extraído de su entorno nativo. Por ejemplo,
moléculas de ADN recombinante contenidas en un vector se consideran
aisladas para los fines de la presente invención. Ejemplos
ilustrativos adicionales de moléculas de ADN aisladas incluyen
moléculas de ADN recombinante mantenidas en células huésped
heterólogas y moléculas de ADN purificadas (parcial o
sustancialmente) en disolución. Moléculas de ARN aisladas incluyen
transcritos de ARN in vitro de las moléculas de ADN de la
presente invención así como moléculas de ARNm parcial o
sustancialmente purificadas. Las moléculas aisladas de ácido
nucleico según la presente invención incluyen además dichas
moléculas producidas sintéticamente.
Las moléculas de ácido nucleico de la presente
invención incluyen moléculas de ADN que comprenden un marco de
lectura abierto (ORF) con un codón de iniciación en la posición
163-165 de la secuencia de nucleótidos mostrada en
la figura 1 (SEQ ID NO: 1); y moléculas de ADN que comprenden una
secuencia sustancialmente diferente de la descrita anteriormente
pero que, debido a la degeneración del código genético, todavía
codifica para la proteína TIF2. Por supuesto, el código genético se
conoce bien en la técnica. Por tanto, será rutina para un experto en
la técnica generar las variantes degeneradas descritas
anteriormente.
En otro aspecto, la invención proporciona
moléculas de ácido nucleico que codifican para el polipéptido TIF2
que tiene una secuencia de aminoácidos según se codifica por el clon
de ADNc depositado en ATCC con el número de registro 97612 el 14 de
junio, 1996 (American Type Culture Collection (Colección Americana
de Cultivos Tipo), (ATCC) Rockville, MD). La invención también
proporciona una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia
de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1) o la secuencia
de nucleótidos de ADNc de TIF2 contenida en el clon anteriormente
descrito, o una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia
complementaria con respecto a una de las secuencias anteriores.
Dichas moléculas de ácido nucleico, preferiblemente moléculas de
ADN, son útiles como sondas para el mapeo de genes mediante
hibridación in situ con cromosomas y para detectar la
expresión del gen de TIF2 en tejido humano, por ejemplo, mediante
análisis de inmunotransferencia tipo Northern.
En otro aspecto, se describe una molécula de
ácido nucleico que hibrida en condiciones restrictivas a las
moléculas de ácido nucleico anteriormente descritas. Tal como se usa
en el presente documento "condiciones restrictivas" se refiere
a, como un ejemplo no limitante, incubación durante la noche a 42ºC
en una disolución que comprende formamida al 50%, 5xSSC (NaCl 150
mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5x
disolución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y ADN de esperma
de salmón cortado, desnaturalizado 20 \mug/ml, seguido de lavado
de los filtros en 0,1xSSC a aproximadamente 65ºC. Preferiblemente,
dicha "una molécula aislada de ácido nucleico que hibrida en
condiciones restrictivas" será de al menos 15 pb, preferiblemente
de al menos 20 pb, más preferiblemente de al menos 30 pb, y lo más
preferiblemente, de al menos 50 pb de longitud.
Tal como se usa en el presente documento,
"fragmentos" de una molécula de ADN que tiene la secuencia de
nucleótidos de ADNc depositado o la secuencia de nucleótidos tal
como se muestra en la figura 1 (SEQ ID NO: 1) se refiere a
fragmentos de ADN de al menos 15 pb, más preferiblemente de al menos
20 pb, y lo más preferiblemente de al menos 30 pb de longitud, que
son útiles como sondas de diagnóstico y cebadores tal como se trató
anteriormente y con más detalle a continuación. Fragmentos de ADN
mayores, de hasta, por ejemplo, 500 pb de longitud, también son
útiles como sondas según la presente invención. Un fragmento de al
menos 20 pb de longitud, por ejemplo, se refiere a fragmentos que
incluyen 20 o más bases contiguas de la secuencia de nucleótidos del
ADNc depositado o la secuencia de nucleótidos tal como se muestra
en la figura 1 (SEQ ID NO: 1). Tal como se indica, dichos
fragmentos son útiles para diagnosticar o bien como una sonda según
las técnicas convencionales de hibridación de ADN o bien como
cebadores para amplificación de una secuencia objetivo mediante
reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Dado que el gen se ha depositado y se
proporciona la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ
ID NO: 1), generar dichos fragmentos de ADN será rutinario para un
experto en la técnica relevante. Puede usarse fácilmente la
escisión de endonucleasa de restricción o el cizallamiento por
sonicación, por ejemplo, para generar fragmentos de varios tamaños.
Alternativamente, pueden generarse los fragmentos de ADN de la
presente invención sintéticamente según los métodos y técnicas
conocidas y disponibles para aquellos expertos en la técnica. Se
identificaron diez etiquetas de secuencia expresadas con homología
con respecto a parte de la secuencia de nucleótidos de
TIF-2 por los inventores en GenBank: números de
registro de GenBank T77249, R77864, T77464, R77770, R08880, T85560,
R25318, T85561, R08986 y R26517.
Además, se describen variantes de moléculas de
ácido nucleico de la presente invención, que codifican para
fragmentos, análogos o derivados de la proteína TIF2, por ejemplo,
polipéptidos que tienen actividad biológica sustancialmente similar
a la de la proteína TIF2. Las variantes pueden producirse de manera
natural, tales como isoformas y variantes alélicas. Las variantes
que se producen de manera no natural pueden producirse usando
cualquiera de las técnicas de mutagénesis conocidas y disponibles
para los expertos en la técnica.
Tales variantes incluyen aquellas producidas
mediante sustituciones, eliminaciones o adiciones de nucleótidos.
Las sustituciones, eliminaciones o adiciones pueden implicar uno o
más nucleótidos. Las variantes pueden alterarse en regiones
codificantes o no codificantes o en ambas. Las alteraciones en las
regiones codificantes pueden producir sustituciones, eliminaciones
o adiciones de aminoácidos conservativas o no conservativas. Entre
éstas, se prefieren especialmente las sustituciones, adiciones o
eliminaciones silenciosas, que no alteran las propiedades y
actividades de la proteína TIF2 o fragmento de la misma. También se
prefieren especialmente en este aspecto las sustituciones
conservativas.
La presente invención se refiere además a
moléculas de ácido nucleico que codifican para un polipéptido TIF2
citoplásmico. TIF2 de longitud total es una proteína nuclear debido
a la presencia de señales de localización nuclear (NLS)
N-terminales (figura 3). Por un "polipéptido TIF2
citoplásmico", se hace referencia a un polipéptido TIF2 que se
encuentra esencialmente en el citoplasma tras expresarse de manera
recombinante en células de mamíferos. Los métodos para generar
moléculas de ácido nucleico que codifican para un polipéptido TIF2
citoplásmico incluyen mutar o eliminar la región
N-terminal que codifica para las NLS de la secuencia
de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1). Ejemplos de
secuencias de NLS incluyen los aminoácidos 13-20 y
31-39 y los nucleótidos 199-222 y
253-279 de la figura 1 (véase también la figura 3).
Mutaciones adecuadas para la región N-terminal que
codifica para las NLS incluyen sustituciones, eliminaciones e
inserciones que dan como resultado una molécula de ácido nucleico
que codifica para un polipéptido TIF2 que carece de función de
localización nuclear. Los métodos para generar dichas mutaciones
resultarán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica y
se describen, por ejemplo, en Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, 2ª edición, editado por Sambrook, J., Fritsch, E.F. y
Maniatis, T., (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Preferiblemente, las moléculas de ácido nucleico
que codifican para un polipéptido TIF2 citoplásmico serán
fragmentos que tienen una eliminación en todo o parte de la región
N-terminal que codifica para las NLS. Métodos para
generar dichos fragmentos se describen a continuación. Según la
presente invención, tales fragmentos de ácido nucleico incluyen
además eliminaciones N-terminales que se extienden
más allá de la región que codifica para las NLS y también pueden
incluir eliminaciones C-terminales. Por ejemplo, los
presentes inventores han generado una molécula de ácido nucleico
que codifica para el polipéptido TIF2.1 citoplásmico (aminoácidos
624 a 1287 en las figuras 1 y 3 (SEQ ID NO: 2)), que, como el TIF2
de longitud total nuclear, interacciona de una manera dependiente
de agonista con los receptores nucleares y potencia la activación de
la transcripción mediada por receptores nucleares. Los presentes
inventores también han generado una molécula de ácido nucleico que
codifica para el polipéptido TIF2.5 citoplásmico (aminoácidos
624-869 en las figuras 1 y 3 (SEQ ID NO: 2)), que
interacciona con el dominio DIN de receptores nucleares, pero no
potencia la transcripción. También se generaron ácidos nucleicos
que codifican para los polipéptidos TIF2.8 y TIF 2.12 citoplásmicos
(aminoácidos 1010-1179 y aminoácidos
940-1131, respectivamente, en las figuras 1 y 3 (SEQ
ID NO: 2), que potencian la transcripción, pero no se unen a
receptores nucleares. Por tanto, mediante la invención, se
proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican para
polipéptidos TIF2 citoplásmicos que interaccionan de una manera
dependiente de agonista con receptores nucleares y potencian la
activación de la transcripción mediada por receptores nucleares.
También se proporcionan polipéptidos TIF2 citoplásmicos que se unen
a receptores nucleares, pero no potencian la transcripción como se
proporcionan polipéptidos TIF2 citoplásmicos que potencian la
transcripción pero no se unen a receptores nucleares. Tal como
reconocerá un experto en la técnica, la longitud de dichas moléculas
de ácido nucleico puede variar.
Realizaciones adicionales de la invención
incluyen moléculas aisladas de ácido nucleico que comprenden un
polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos idéntica al
menos en un 90%, y mas preferiblemente idéntica en al menos un 95%,
en un 96%, en un 97%, en un 98%, o en un 99% idéntica a: (a) la
secuencia de nucleótidos del ADNc depositado como ATCC 97612; (b)
la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1);
(c) la secuencia de nucleótidos del ADNc depositado como ATCC 97612
que codifica para proteína TIF2 de longitud total; (d) la secuencia
de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), que codifica
para la proteína TIF2 de longitud total; (e) la secuencia de
nucleótidos del ADNc depositado como ATCC 97612, que codifica para
la proteína TIF2.1 del coactivador funcional; (f) la secuencia de
nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), que codifica
para la proteína TIF2.1 del coactivador funcional;(g) la secuencia
de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1) que codifica
para el polipéptido TIF2.0; (h) la secuencia de nucleótidos
mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO:1) que codifica para el
polipéptido TIF2.2; (i) la secuencia de nucleótidos mostrada en la
figura 1 (SEQ ID NO:1) que codifica para el polipéptido TIF2.3; (j)
la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1)
que codifica para el polipéptido TIF2.4; (k) la secuencia de
nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1) que codifica
para el polipéptido TIF2.5; (l) la secuencia de nucleótidos
mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1) que codifica para el
polipéptido TIF2.6; (m) la secuencia de nucleótidos mostrada en la
figura 1 (SEQ ID NO: 1) que codifica para el polipéptido TIF2.7; (n)
la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1)
que codifica para el polipéptido TIF2.8; (o) la secuencia de
nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1) que codifica
para el polipéptido TIF2.9; (p) la secuencia de nucleótidos
mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1) que codifica para el
polipéptido TIF2.10; (q) la secuencia de nucleótidos mostrada en la
figura 1 (SEQ ID NO: 1) que codifica para el polipéptido TIF2.12
polipéptido; y (r) una secuencia de nucleótidos complementaria a
cualquiera de las secuencias en (a-q).
Puede determinarse si dos moléculas cualquiera
de ácido nucleico tienen secuencias de nucleótidos que son
"idénticas" en al menos un 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de
manera convencional usando algoritmos computacionales conocidos
tales como el programa "fastA" usando, por ejemplo, los
parámetros por defecto (Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85:2444 (1998)). La presente solicitud se refiere a dichas
moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia de nucleótidos
idéntica en al menos un 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% a la
secuencia de nucleótidos de las moléculas de ácido nucleico
anteriormente citadas independientemente de si codifican para un
polipéptido que tiene actividad TIF2. Esto es porque, incluso cuando
una molécula de ácido nucleico particular no codifica para un
polipéptido que tiene actividad TIF2, un experto en la técnica aún
sabría como usar la molécula de ácido nucleico como una sonda. Usos
de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que no
codifican para un polipéptido que tiene actividad TIF2 incluyen,
entre otros, (1) aislar el gen de TIF2 o variantes alélicas del
mismo en una biblioteca de ADNc; (2) hibridación in situ
(FISH) a extensiones cromosómicas de metafase para proporcionar una
ubicación cromosómica precisa del gen de TIF2 tal como se describe
en Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic
Techniques, Pergamon Press, New York (1988); y análisis por
inmunotransferencia tipo Northern para detectar expresión de ARNm de
TIF2 en tejidos específicos, tal como tejido de placenta.
Sin embargo, se prefieren moléculas de ácido
nucleico que tienen una secuencia de nucleótidos idéntica en al
menos un 90%, y preferiblemente idéntica al menos en un 95%, 96%,
97%, 98%, o 99% a la secuencia de nucleótidos de las moléculas de
ácido nucleico anteriormente descritas, que de hecho, codifican para
un polipéptido que tiene al menos una actividad de proteína TIF2.
Tal como se usa en el presente documento, "un polipéptido que
tiene una actividad de proteína TIF2" se refiere a polipéptidos
que muestran actividad similar, pero no necesariamente idéntica,
como al menos una actividad biológica de la proteína TIF2 tal como
se mide en un ensayo biológico particular. Por ejemplo, la proteína
TIF2 de la presente invención interacciona directamente de una
manera dependiente de agonista con los dominios de unión a ligandos
de varios receptores nucleares. Es más, cuando se expresa de manera
recombinante en células de mamíferos, la proteína TIF2 de la
presente invención potencia la transcripción por medio de rutas
dependientes de CBP e independientes de CBP.
Por tanto, "un polipéptido que tiene una
actividad de proteína TIF2" incluye polipéptidos que tienen una o
más de las siguientes actividades: interacción con el DUL de uno o
más RN de una manera dependiente de agonista; potenciación de la
activación de la transcripción dependiente de CBP; o potenciación de
la activación de la transcripción independiente de CBP.
Ensayos de selección para determinar si un
polipéptido candidato tiene o no una actividad de proteína TIF2 se
describen en detalle en los ejemplos 1, 3, 4, y 6 a continuación.
Por ejemplo, realizando tales ensayos, los presentes inventores han
descubierto que el fragmento de coactivador funcional TIF2.1
(aminoácidos 624 a 1287 en las figuras 1 y 3 (SEQ ID NO:2)) es
"un polipéptido que tiene una actividad de la proteína TIF2".
Los presentes inventores han descubierto también que el fragmento
TIF2.5 (aminoácidos 624-869) se une al DUL de los
RN sin activar la transcripción, y es "un polipéptido que tiene
una actividad de la proteína TIF2". También se descubrió que el
fragmento TIF2.2 (aminoácidos 1288-1464 tal como se
muestra en la figura 1 (SEQ ID NO: 2)), que potencia la
transcripción independiente de CBP. Por tanto, TIF2.2 es "un
polipéptido que tiene una actividad de la proteína TIF2". Otro
fragmento descubierto por los inventores, TIF 2.8 (aminoácidos
1010-1179 tal como se muestra en la figura 1 (SEQ
ID NO: 2)) es "un polipéptido que tiene una actividad de la
proteína TIF2" ya que activa la transcripción dependiente de
CBP.
Debido a la degeneración del código genético, un
experto habitual en la técnica reconocerá inmediatamente que un
gran número de las moléculas de ácido nucleico que tienen una
secuencia de nucleótidos idéntica en al menos el 90%,
preferiblemente en al menos el 95%, 96%, 97%, 98%, 99% a la
secuencia de nucleótidos de las moléculas de ácido nucleico
descritas anteriormente codificarán para "un polipéptido que tiene
una actividad de la proteína TIF2." De hecho, puesto que las
variantes degeneradas codifican todas para un mismo polipéptido,
esto será evidente para el experto en la técnica incluso sin
realizar los ensayos de selección descritos anteriormente. Los
expertos en la técnica reconocerán además que, para tales moléculas
de ácido nucleico que no son variantes degeneradas, un número
razonable también codificará para un polipéptido que tiene una
actividad de la proteína TIF2. Esto es debido a que el experto es
completamente consciente de posibles sustituciones de aminoácidos
que o bien son menos probables o bien no es probable que afecten
significativamente a la función de la proteína (por ejemplo, la
sustitución de un aminoácido alifático por un segundo aminoácido
alifático).
Se proporciona orientación sobre cómo realizar
sustituciones de aminoácidos silenciosas desde un punto de vista
fenotípico, por ejemplo, en J.U. Bowie et al., "Deciphering
the Message in Proteína Sequences: Tolerance to Amino Acid
Substitutions," Science 247:1306-1310
(1990), en el que los autores indican que existen dos enfoques
principales para estudiar la tolerancia de una secuencia de
aminoácidos al cambio. El primer método se basa en el proceso de
evolución, en el que las mutaciones son o bien aceptadas o bien
rechazadas por la selección natural. El segundo enfoque usa la
ingeniería genética para introducir cambios de aminoácidos en
posiciones específicas de un gen clonado y selecciona o examina para
identificar secuencias que mantienen la funcionalidad. Como
establecen los autores, estos estudios han revelado que las
proteínas son sorprendentemente tolerantes a las sustituciones de
aminoácidos. Los autores indican además qué cambios de aminoácidos
es probable que sean permisivos en ciertas posiciones de la
proteína. Por ejemplo, la mayor parte de los restos de aminoácido
internos ("buried") requieren cadenas laterales apolares,
mientras que generalmente se conservan algunas características de
las cadenas laterales superficiales. Otras sustituciones silenciosas
desde el punto de vista fenotípico se describen en Bowie et
al., anteriormente, y las referencias citadas en ese
documento.
La presente invención también se refiere a
vectores que incluyen las moléculas de ADN de la presente invención,
células huésped que se modifican mediante ingeniería genética con
los vectores recombinantes, y la producción de polipéptidos de TIF2
o fragmentos del mismo, tales como TIF2.1, mediante técnicas
recombinantes.
Se pueden introducir construcciones
recombinantes en células huésped usando técnicas muy conocidas tales
como la infección, transducción, transfección, transvección,
electroporación y transformación. El vector puede ser, por ejemplo,
un fago, plásmido, vector viral o retroviral. Los vectores
retrovirales pueden ser competentes en la replicación o defectuosos
en la replicación. En este último caso, generalmente sólo se
producirá la propagación viral en células huésped de
complementación.
Los polinucleótidos pueden unirse a un vector
que contiene un marcador seleccionable para la propagación en un
huésped. Generalmente, se introduce un vector de plásmido en un
precipitado, tal como un precipitado con fosfato de calcio, o en un
complejo con un lípido cargado. Si el vector es un virus, puede
empaquetarse in vitro usando una línea célula de
empaquetamiento apropiada y luego transducirse en células
huésped.
Se prefieren los vectores que comprenden
regiones de control de acción en cis para el polinucleótido de
interés. Pueden suministrarse factores de acción en trans
apropiadas por el huésped, suministrarse por un vector de
complementación o suministrarse por el propio vector con la
introducción en el huésped.
En ciertas realizaciones preferidas a este
respecto, los vectores proporcionan la expresión específica, que
puede ser inducible y/o específica del tipo de célula. Se prefieren
particularmente entre tales vectores aquellos inducibles mediante
factores ambientales que son fáciles de manipular, tales como la
temperatura y los aditivos de nutrientes.
Vectores de expresión útiles en la presente
invención incluyen vectores derivados de cromosomas, episomas y
virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos,
bacteriófago, episomas de levaduras, elementos cromosómicos de
levaduras, virus tales como baculovirus, virus papova, virus
vaccinia, adenovirus, virus de la viruela de las aves de corral,
virus de la pseudorrabia y retrovirus, y vectores derivados de
combinaciones de los mismos, tales como cósmidos y fagémidos.
El inserto de ADN debe estar unido
operativamente a un promotor apropiado, tal como the el promotor PL
del fago lambda, los promotores lac, trp y tac de E. coli,
los promotores temprano y tardío de SV40 y promotores de LTR
retrovirales, por nombrar unos cuantos. Los expertos en la técnica
conocerán otros promotores adecuados. Las construcciones de
expresión contendrán además sitios para la iniciación de la
transcripción, la terminación y, en la región transcrita, un sitio
de unión a ribosomas para la traducción. La parte codificante de los
transcritos maduros expresados por las construcciones incluirá
preferiblemente un AUG de iniciación de la transcripción al
comienzo y un codón de terminación (UAA, UGA o UAG) situado
apropiadamente al final del polipéptido que va a traducirse.
Tal como se indica, los vectores de expresión
incluirán preferiblemente al menos un marcador seleccionable. Tales
marcadores incluyen genes de dihidrofolato reductasa o resistencia a
la neomicina para un cultivo de células eucariotas y de resistencia
a la tetraciclina o ampicilina para el cultivo en E. coli y
otras bacterias. Ejemplos representativos de huéspedes adecuados
incluyen, pero no se limitan a, células bacterianas, tales como
células de E. coli, Streptomyces y Salmonella
typhimurium; células fúngicas, tales como células de levaduras;
células de insecto tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera
Sf9; células animales tales como células CHO, Cos y de melanoma de
Bowes; y células vegetales. En la técnica se conocen medios de
cultivo y condiciones apropiados para las células huésped descritas
anteriormente.
Ejemplos ilustrativos de vectores preferidos
para su uso en bacterias incluyen, pero no se limitan a, pA2,
pQE70, pQE60 y pQE-9, disponibles de Qiagen;
vectores pBS, vectores Phagescript, vectores Bluescript, pNH8A,
pNH16a, pNRl8A, pNH46A, disponibles de Stratagene; y ptrc99a,
pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5
disponibles de Pharmacia. Los vectores eucariotas preferidos
incluyen, pero no se limitan a, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI y pSG
disponibles de Stratagene; y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles de
Pharmacia. Otros vectores adecuados serán fácilmente evidentes para
el experto.
Entre los promotores bacterianos conocidos
adecuados para su uso en la presente invención se incluyen los
promotores lacI y lacZ de E. coli, los promotores T3 y T7, el
promotor gpt, los promotores PR y PL de lambda y el promotor trp.
Los promotores eucariotas adecuados incluyen el promotor precoz de
CMV, el promotor de timidina cinasa de VHS, los promotores temprano
y tardío de SV40, los promotores de LTR retrovirales, tales como
los del virus del sarcoma de Rous ("VRS"), y promotores de
metalotioneínas, tales como el promotor de metalotioneína I de
ratón.
La introducción de la cosntrucción en la célula
huésped puede efectuarse mediante transfección con fosfato de
calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano,
cationic lipidmediated transfección mediada por lípidos catiónicos,
electroporación, transducción, infección u otros métodos. Tales
métodos se describen en muchos manuales de laboratorio
convencionales, tales como Davis et al., Basic Methods in
Molecular Biology (1986).
La transcripción del ADN que codifica para los
polipéptidos de la presente invención por eucariotas superiores
puede aumentarse insertando una secuencia potenciadora en el vector.
Los potenciadores son elementos de acción en cis de ADN,
generalmente de aproximadamente 10 a 300 pb de tamaño, que actúan
para aumentar la actividad de transcripción de un promotor en un
tipo de célula huésped dado. Ejemplos ilustrativos de potenciadores
incluyen, pero no se limitan a, el potenciador de SV40, que está
ubicado en el lado tardío del origen de replicación en las pb 100 a
270, el potenciador temprano de citomegalovirus, el potenciador de
polioma en el lado tardío del origen de replicación, y potenciadores
de adenovirus.
Para la secreción de la proteína traducida en la
luz del retículo endoplásmico, en el especio periplásmico o en el
entorno extracelular, pueden incorporarse señales de secreción
apropiadas en el polipéptido expresado. Estas señales pueden ser
endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.
El polipéptido puede expresarse en una forma
modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no
sólo señales de secreción, sino también regiones funcionales
heterólogas adicionales. Por tanto, por ejemplo, puede añadirse una
región de aminoácidos adicional, particularmente aminoácidos
cargados, al extremo N-terminal del polipéptido
para mejorar la estabilidad y persistencia en la célula huésped,
durante la purificación, o durante el manejo y almacenamiento
posteriores. También pueden añadirse restos peptídicos al
polipéptido para facilitar la purificación.
La proteína TIF2 o una fracción de la misma
puede recuperarse y purificarse a partir de cultivos celulares
recombinantes mediante métodos muy conocidos incluyendo
precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con
ácidos, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico,
cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía de interacción
hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía con
hidroxiapatita y cromatografía con lectina. Lo más preferiblemente,
se emplea cromatografía líquida de alta resolución ("HPLC")
para la purificación.
Los polipéptidos de la presente invención
incluyen, pero no se limitan a, productos purificados de manera
natural, productos de procedimientos de síntesis química, y
productos producidos mediante técnicas recombinantes a partir de un
huésped procariota o eucariota, incluyendo, por ejemplo, células
bacterianas, de levaduras, de plantas superiores, insectos y
mamíferos. Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de
producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención
pueden modificarse de manera postraduccional (por ejemplo,
glucosilarse, fosforilarse, farnesilarse, etc.). Además, los
polipéptidos de la invención también pueden incluir un residuo de
metionina modificado inicial, en algunos casos como resultado de
procesos mediados por el huésped.
La invención proporciona además un polipéptido
TIF2 aislado que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por
el ADNc depositado, o la secuencia de aminoácidos mostrada en la
figura 1 (SEQ ID NO:2), o un fragmento de la misma. Los fragmentos
de polipéptido preferidos tendrán una actividad de la proteína TIF2.
Con el fin de que un polipéptido TIF2 interaccione de manera
dependiente de agonista con receptores nucleares y para potenciar
la activación de la trancripción mediada por receptores nucleares,
tales fragmentos del polipéptido TIF2 deben incluir al menos los
restos de aminoácido 624 a 1131 tal como se muestra en la figura 1
(SEQ ID NO:2) o sustituciones, adiciones o deleciones de
aminoácidos de los mismos que no son perjudiciales
significativamente para la capacidad de los polipéptidos para
interaccionar de manera dependiente de agonista con receptores
nucleares y para potenciar la activación de la trancripción mediada
por receptores nucleares. Con el fin de que un fragmento del
polipéptido TIF2 interaccione con el DUL de un RN sin activar la
transcripción, los fragmentos del polipéptido TIF2 deben incluir al
menos los aminoácidos 624-869 tal como se muestra en
la figura 1 (SEQ ID NO:2), o sustituciones, adiciones o deleciones
de aminoácidos de los mismos que no son perjudiciales
significativamente para la capacidad de los polipéptidos de
interaccionar con el DUL de un RN. Con el fin de que un fragmento
del polipéptido TIF2 active la transcripción dependiente de CBP, el
polipéptido TIF2 debe incluir al menos los restos de aminoácido
1010-1131 tal como se muestra en la figura 1 (SEQ ID
NO:2) o sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos de los
mismos que no son perjudiciales significativamente para la capacidad
de los polipéptidos de activar la transcripción dependiente de CBP.
Para que un polipéptido TIF2 active la transcripción independiente
de CBP, el polipéptido TIF2 debe incluir al menos los restos de
aminoácido 1288-1464 tal como se muestra en la
figura 1 (SEQ ID NO:2) o sustituciones, adiciones o deleciones de
aminoácidos de los mismos que no son perjudiciales
significativamente para la capacidad de los polipéptidos de activar
la transcripción independiente de CBP.
Fragmentos del polipéptido TIF2 a modo de
ejemplo según la presente invención incluyen polipéptidos
citoplásmicos de TIF2 que tienen al menos mutación o deleción en
una región NSL N-terminal que interfiere con la
función de localización nuclear. A continuación, se describen
métodos para generar polipéptidos citoplásmicos de TIF2.
Tal como se usa en el presente documento, un
polipéptido o proteína "aislado" pretende significar un
polipéptido o proteína extraído de su entorno nativo, tal como
polipéptidos y proteínas producidos de manera recombinante,
expresados en células huésped y polipéptidos nativos o recombinantes
que se han purificado sustancialmente mediante cualquier técnica
adecuada (por ejemplo, el método de purificación de una sola etapa
descrito en Smith y Johnson, Gene 67:31-40
(1988), que se incorpora como referencia al presente documento).
Polipéptidos o proteínas aislados según la presente invención
incluyen además tales compuestos producidos de manera sintética.
Los presentes inventores han descubierto que la
proteína TIF2 de longitud completa es una proteína de
aproximadamente 1464 restos de aminoácido con un peso molecular
deducido de aproximadamente 160 kDa. Los expertos en la técnica
reconocerán que puede variarse parte de la secuencia de aminoácidos
de la proteína TIF2 sin un efecto significativo sobre la estructura
o función de la proteína. Si se contemplan tales diferencias en la
secuencia, debe recordarse que existirán zonas críticas en la
proteína que determinan la actividad, tal como la región descrita
anteriormente que los inventores han determinado como crítica para
la capacidad de la proteína para potenciar la activación de la
trancripción mediada por receptores nucleares. En general, a menudo
es posible sustituir restos que forman la estructura terciaria,
siempre que se usen restos que realicen una función similar. En
otros casos, el tipo de residuo puede no tener importancia en
absoluto si la alteración se produce en una región no crítica de la
proteína.
Por tanto, la presente descripción incluye
además variaciones del polipéptido TIF2 que muestran una sustancial
actividad del polipéptido TIF2 o que incluyen regiones de la
proteína TIF2 tales como los fragmentos de la proteína tratados
anteriormente. Tales mutantes incluyen deleciones, inserciones,
inversiones, repeticiones, y sustituciones tipo (por ejemplo,
sustituir un residuo hidrófilo por otro, pero no uno fuertemente
hidrófilo por uno fuertemente hidrófobo como regla). Pequeños
cambios o tales sustituciones de aminoácidos "neutras" tendrán
generalmente poco efecto sobre la actividad.
Normalmente se consideran como sustituciones
conservativas los reemplazos, de uno por otro, entre los aminoácidos
alifáticos Ala, Val, Leu y Ile; el intercambio de los restos
hidroxílicos Ser y Thr, el intercambio de los restos ácidos Asp y
Glu, la sustitución entre los restos de amida Asn y Gin, el
intercambio de los restos básicos Lys y Arg y los reemplazos entre
los restos aromáticos Phe y Tyr.
Tal como se indica en detalle a continuación,
puede encontrarse una orientación adicional sobre qué cambios de
aminoácidos es probable que sean silenciosos desde un punto de vista
fenotípico (es decir, no es probable que tengan un efecto
perjudicial significativo sobre una función) en Bowie et al.,
"Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino
Acid Substitutions," Science 247:1306-1310
(1990)).
Los polipéptidos de la presente invención
incluyen polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos
codificada por el ADNc depositado, una secuencia de aminoácidos tal
como se muestra en SEQ ID NO:2, así como una secuencia de
aminoácidos idéntica en al menos un 80%, más preferiblemente
idéntica en al menos un 90%, y lo más preferiblemente idéntica en
al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%, a la secuencia de aminoácidos
codificada por el ADNc depositado, a la secuencia de aminoácidos
tal como se muestra en SEQ ID NO:2, o a la secuencia de aminoácidos
de un fragmento de polipéptido descrito anteriormente. Puede
determinarse si dos polipéptidos tienen una secuencia de aminoácidos
que es idéntica en al menos un 80%, 90% o 95% usando un algoritmo
informático tal como se describió anteriormente.
Tal como se describe en detalle a continuación,
las moléculas de ácido nucleico y polipéptidos de la presente
invención son útiles en ensayos de selección para identificar
agonistas y antagonistas de la transactivación mediada por AF2 de
RN. Por ejemplo, en Halachmi, S., et al., Science 264: 1455
(1994), los autores muestran que el tamoxifeno, que tiene efectos
inhibidores del crecimiento en el cáncer de mama, perturba la
formación de un complejo que incluye el receptor de estrógenos y
ERAP160. En consecuencia, las moléculas de ácido nucleico y los
polipéptidos de la presente invención son útiles en ensayos para
identificar fármacos que pueden potenciar o inhibir rutas mediadas
por receptores nucleares.
Las moléculas de ácido nucleico y polipéptidos
de la presente invención son útiles en ensayos de selección para
identificar agonistas y antagonistas de la actividad AD1 de TIF2, y
en ensayos de selección para identificar agonistas y antagonistas
de la actividad AD2 de TIF2, tal como se describe en detalle a
continuación.
Los receptores nucleares (RN) son miembros de
una superfamilia de factores reguladores de la transcripción
inducibles por ligandos que incluyen receptores de hormonas
esteroideas, hormonas tiroideas, vitamina D3 y retinoides (Leid,
M., et al., Trends Biochem. Sci. 17:427-433
(1992); Leid, M., et al., Cell 68:377-395
(1992); y Linney, E. Curr. Top. Dev. Biol.,
27:309-350 (1992)). Los RN muestran una estructura
modular que refleja la existencia de varios dominios funcionales
autónomos. Basado en la similitud de la secuencia de aminoácidos
entre el receptor de estrógenos del pollo, los receptores de
estrógenos y glucocorticoides humanos y el oncogén
v-erb-A, Krust, A., et al., EMBO
J. 5:891-897 (1986), se definieron seis
regiones, A, B, C, D, E y F (véase la figura 6) que muestran
diferentes grados de conservación evolutiva entre diversos miembros
de la superfamilia de receptores nucleares. La región C altamente
conservada contiene dos dedos de zinc y corresponde al núcleo del
dominio de unión a ADN (DUA), que es responsable del reconocimiento
específico de los elementos de respuesta relacionados. La región E
es funcionalmente compleja, puesto que además del dominio de unión
a ligandos (DUL), contiene una función de activación dependiente de
ligando (AF-2) y una interfase de dimerización.
Está presente una función de activación de la trancripción autónoma
(AF- 1) en las regiones A/B N-terminales no
conservadas de los receptores de esteroides. De manera interesante,
ambas AF-1 y AF-2 de los receptores
de esteroides muestran propiedades diferenciales de activación de la
transcripción que parecen ser específicas tanto del contexto del
promotor como del tipo celular (Gronemeyer, H. Annu. Rev.
Genet. 25:89-123 (1991)).
Las señales de ácido retinoico todo-trans
(T-AR) y 9-cis (9C-AR) se
transducen por dos familias de receptores nucleares, RARa,
\alpha, \beta y \gamma (y sus isoformas) se activan tanto por
T-AR como 9C-AR, mientras que RXR
\alpha, \beta y \gamma se activan exclusivamente por
9C-AR (Allenby, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 90:30-34 (1993)). Los tres tipos de RAR
difieren en sus regiones B, y sus principales isoformas (\alpha1
y \alpha2, \beta1-4, y \gamma1 y \gamma2)
tienen diferentes regiones A N-terminales (Leid, M.
et al., Trends Biochem. Sci. 17:427-433
(1992)). De manera similar, los tipos de RXR difieren en sus
regiones A/B (Mangelsdorf, D.J. et al, Genes Dev.
6:329-344 (1992)).
La región E de los RAR y RXR también ha
demostrado que contiene una interfase de dimerización (Yu, V.C.
et al., Curr. Opin. Biotechnol. 3:597-602
(1992)). De manera más interesante, se demostró que los
heterodímeros RAR/RXR se unen de manera mucho más eficaz in
vitro que los homodímeros de cualquier receptor a varios
elementos de respuesta a AR (RARE) (Yu, V.C. et al., Cell
67:1251-1266 (1991); Berrodin, T. J. et al., Mol.
Endocrinol 6:1468-1478 (1992); Bugge, T. H.
et al., EMBO J. 11:1409-1418 (1992); Hall, R.
K. et al., Mol. Cell. Biol. 12: 5527-5535
(1992); Hallenbeck, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:5572-5576 (1992); Husmann, M. et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun. 187:1558-1564 (1992);
Kliewer, S.A. et al., Nature 355:446-449
(1992b); Leid, M. et al., Cell 68:377-395
(1992); Marks, M. S. et al., EMBO J.
11:1419-1435 (1992); Zhang, X. K. et al.,
Nature 355:441-446 (1992)). Los heterodímeros
de RAR y RXR también se forman preferentemente en disolución in
vitro (Yu, V.C. et al., Cell 67:1251-1266
(1991); Leid, M. et al., Cell 68:377-395
(1992); Marks, M. S. et al., EMBO J.
11:1419-1435 (1992)), aunque la adición de
9C-AR parece potenciar la formación de los
homodímeros de RXR in vitro (Lehman, J. M. et al.,
Science 258:1944-1946 (1992); Zhang, X. K. et
al., Nature 358:587-591 (1992b)). Los
experimentos descritos en Durand, B. et al., Cell
71:73-85 (1992) han apoyado fuertemente que los
heterodímeros de RAR-RXR, en lugar de los
correspondientes homodímeros, se unen preferentemente a RARE en
células cultivadas in vivo.
Como se sabe que el ácido retinoico regula las
capacidades proliferativas y diferenciativas de varios tipos de
células de mamíferos (Gudas, L.J. et al. (1994) en Sporn,
M.B., Roberts, A.B. y Goodman, D.S. (eds), The Retinoids. 2ª
edición, Raven Press, Nueva York, págs. 443-520), se
usan retinoides en una variedad de prácticas quimiopreventivas y
quimioterapéuticas. Se ha notificado la prevención de cánceres
bucales, de piel y de cabeza y cuello en pacientes en riesgo de
desarrollar estos tumores (Hong, W. K. et al., N. Engl. J.
Med. 315:1501-1505 (1986); Hong, W. K. et
al., N. Engl. J. Med. 323:795-801 (1990);
Kraemer, K. H. et al., N. Engl. J. Med.
318:1633-1637 (1988); Bollag, W. et al., Ann.
Oncol. 3:513-526 (1992); Chiesa, F. et al.,
Eur. J. Cancer B. Oral Oncol. 28:97-102 (1992);
Costa, A. et al., Cancer Res. 54:Supl. 7,
2032-2037 (1994)), y se usan retinoides en el
tratamiento de leucemia promielocítica aguda (Huang, M.E. et
al., Blood 72:567-572 (1988); Castaigne, S.
et al., Blood 76:1704-1709 (1990);
Chomienne, C. et al., Blood 76:1710-1717
(1990); Chomienne, C. et al., J. Clin. Invest.
88:2150-2154 (1991); Chen Z. et al.,
Leukemia 5:288-292 (1991); Lo Coco, F. et
al., Blood 77:165701659 (1991); Warrell, R. P., Jr. et al.,
N. Engl. J. Med. 324:1385-1393 (1991)),
carcinoma de células escamosas del cuello uterino y la piel (Verma,
A. K., Cancer Res. 47:5097-5101 (1987);
Lippman S. M. et al., J. Natl Cancer Inst.
84:235-241 (1992); Lippman S. M. et al., J. Natl
Cancer Inst. 84:241-245 (1992)) y sarcoma de
Kaposi (Bonhomme, L. et al., Ann. Oncol.
2:234-235 (1991)).
Por ejemplo, en Chen, J-Y et
al., EMBO J. 14 (6):1 187-1197 (1995), se
caracterizan varios retinoides sintéticos de disociación que
inducen selectivamente la función de activación AF-2
presente en el DUL de RAR\beta (\betaAF-2). Los
autores también informan de que estos retinoides sintéticos, como
AR, pueden inhibir el crecimiento independiente de anclaje de las
células 3T3 transformadas con oncogén. Además, el promotor del gen
de la interleucina-6 (IL-6), cuyo
producto participa en la regulación de la hematopoyesis, las
respuestas inmunitarias y la inflamación (Kishimoto, T. et al.,
Science 258:593-597 (1992)), está inducido por
AR pero no por los retinoides "de disociación" que reprimen su
actividad.
Además de los receptores de retinoides, también
se ha informado sobre compuestos con propiedades agonistas y
antagonistas sobre las funciones de los receptores de esteroides.
Por ejemplo, en Meyer, M-E. et al., EMBO J.
9(12): 3923-3932 (1990), se usó un sistema de
retardo en gel/expresión transitoria para estudiar los efectos de
RU486 y R5020 sobre la función del receptor de glucocorticoides y
progesterona. Además, en Halachimi, S., et al., Science
264:1455-1458 (1994), se muestra que el tamoxifeno
inhibe de manera competitiva la unión de ERAP160 inducida por
estradiol al receptor de estrógenos, lo que sugiere un mecanismo
para sus efectos inhibidores del crecimiento en el cáncer de mama.
En consecuencia, debido a su importancia clínica, hay un gran
interés en desarrollar métodos de selección que puedan identificar
agonistas y antagonistas de la transactivación de receptores
nucleares.
Tal como se indicó, los presentes inventores han
clonado un gen que codifica para TIF2 y han demostrado que TIF2 y
un fragmento citoplásmico del mismo se unen, de manera dependiente
de agonista, a todos los receptores nucleares analizados, RAR, RXR,
RE, RT, RVD, GR y RA. Además, los presentes inventores han mostrado
que los polipéptidos de TIF2 son mediadores de la transcripción de
la AF-2 del receptor nuclear. Por tanto, la presente
invención proporciona además un método de selección para
identificar un antagonista del receptor nuclear (RN), que supone:
(a) proporcionar una célula huesped que contiene genes recombinantes
que expresan un polipéptido que comprende un dominio de unión a
ligandos (DUL) de RN y un polipéptido que comprende el factor
intermediario de transcripción 2 (TIF-2) o un
fragmento de TIF-2, en el que, en presencia de un
agonista, dicho TIF-2 y dicho fragmento de
TIF-2 se unen a dicho DUL de RN; (b) administrar un
antagonista candidato a dicha célula; y (c) determinar si dicho
antagonista candidato reduce o bien: (1) la unión de
TIF-2 o fragmento de TIF-2 a la
AF-2 de dicho DUL de RN en comparación con dicha
unión en ausencia de dicho antagonista candidato; o bien (2) la
transactivación mediada por AF-2 de DUL de RN
estimulada por TIF-2 o fragmento de
TIF-2 en comparación con dicha transactivación en
ausencia de dicho antagonista candidato.
En un aspecto adicional, se proporciona un
método de selección para identificar un agonista del receptor
nuclear (RN), que supone: (a) proporcionar una célula huésped que
contiene genes recombinantes que expresan un polipéptido que
comprende un dominio de unión a ligandos (DUL) de RN y un
polipéptido que comprende el factor intermediario de transcripción
2 (TIF-2) o un fragmento de TIF-2,
en el que, en presencia de un agonista, dicho TIF-2
y dicho fragmento de TIF-2 se unen a dicho DUL de
RN; (b) administrar un agonista candidato a dicha célula; y (c)
determinar si dicho agonista candidato potencia o bien: (1) la unión
de TIF-2 o fragmento de TIF-2 a la
AF-2 de dicho DUL de RN en comparación con dicha
unión en ausencia de dicho agonista candidato; o bien (2) la
transactivación mediada por AF-2 de DUL de RN
estimulada por TIF-2 o fragmento de
TIF-2 en comparación con dicha transactivación en
ausencia de dicho agonista candidato.
Por "una célula huésped que contiene genes
recombinantes" se pretenden células huésped en las que se ha
introducido uno o más de las construcciones recombinantes descritas
en el presente documento o una progenie de tales células
huésped.
Los antagonistas y agonistas candidatos según la
presente invención incluyen ligandos "de disociación" para los
receptores nucleares tales como los descritos en Chen et al.,
EMBO J. 14:1187-1197 (1995) y Ostrowski et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1812-1816
(1995). Se describen agonistas y antagonistas del receptor de
progesterona y glucocorticoides en Meyer et al., EMBO J.
9(12): 3923-3932 (1990). Se describe un
antagonista del receptor de estrógenos en Halachmi et al.,
Science 264: 1455-1458 (1994). Por tanto, se
conocen métodos en la técnica para desarrollar agonistas y
antagonistas de receptores nucleares candidatos para la selección
según la presente invención. Por ejemplo, se ha descrito la
estructura cristalina de los dominios de unión a ligandos de
ciertos receptores nucleares. En particular, la estructura
cristalina del DUL de RXR se describe en Bourguet et al.,
Nature 375:377-382 (1995); la estructura
cristalina del DUL de RAR se describe en Renaud et al.,
Nature 378:681-689 (1995); y la estructura
cristalina de un receptor de hormonas tiroideas se describe en
Wagner et al., Nature 378:690-697 (1995).
Usando información procedente de la estructura cristalina de un
receptor nuclear, se dispone de programas informáticos para diseñar
la estructura de agonistas y antagonistas candidatos que se unirían
probablemente al dominio de unión a ligandos. Los paquetes de
programas informáticos adecuados para este fin incluyen WHAT IF
(Vriend, G., J. Mol. Graphics 8:52-56
(1990)), y GRID (Goodford, J. Med. Chem.
28:849-857 (1985)).
Se describieron anteriormente genes
recombinantes que codifican para un polipéptido que comprende TIF2 o
un fragmento de TIF2 que puede unirse a receptores nucleares de
manera dependiente de agonista. Se han descrito con mucho detalle
en la técnica genes recombinantes que codifican para un polipéptido
que comprende un DUL de RN. Se conocen en la técnica métodos para
determinar si un agonista o antagonista candidato potencia o
interfiere en la unión de TIF-2 o un fragmento de
TIF-2 a un RN. Por ejemplo, puede estudiarse el
efecto de un agonista o antagonista candidato sobre la unión de
TIF-2 o un fragmento de TIF-2 a un
DUL de RN usando ensayos de interacción con
glutatión-S-transferasa (GST)
marcando con etiqueta DUL de RN con GST tal como se describe en
detalle en la sección experimental a continuación y en Le Douarin
et al., EMBO J 14:2020-2033 (1995).
Cuando va a someterse a ensayo el efecto de un
agonista o antagonista candidato sobre la transactivación de
AF-2 de RN, preferiblemente, los genes recombinantes
codificarán para un polipéptido quimérico que comprende un DUL de
RN fusionado a un dominio de unión a ADN de una proteína
tranasactivadora. En una realización preferida adicional, las
células huésped que expresan los genes recombinantes también
expresarán un gen indicador. Por ejemplo, en Chen et al., EMBO
J. 14(6) 1187-1197 (1995), se han
establecido tres líneas celulares "indicadoras" en las que
agonistas de RAR\alpha, RAR\beta, o RAR\gamma inducen
actividad luciferasa que puede medirse en las células intactas
usando una cámara de recuento de fotón único. Estas líneas celulares
expresan de manera estable proteínas quiméricas que contienen el
dominio de unión a ADN del transactivador de levaduras GAL4
fusionado a las regiones EF (que contienen ese DUL y la función de
activación AF-2) de RAR\alpha
(GAL-RAR\alpha), RAR\beta
(GAL-RAR\beta) o RAR\gamma
(GAL-RAR\gamma), y un gen indicador de luciferasa
activado por un pentámero de la secuencia de reconocimiento de GAL4
("17m") delante del promotor de \beta-globina
(17mx5-G-Luc). Este sistema
indicador no es sensible a receptores endógenos que no pueden
reconocer el sitio de unión a GAL4. Se proporcionan ejemplos
adicionales de genes indicadores y vectores de expresión indicadores
para su uso según la presente invención para seleccionar agonistas
y antagonistas candidatos de receptores de retinoides en la figura
6.
Los vectores de expresión de RE, HEO, HE19 y
HEl5, los vectores de expresión de RG, HGI y HG3 y de expresión de
RP, cPR1 y cPR3 se describen en Kumar et al., Cell
51:941-951 (1987) y Gronemeyer et al., EMBO
J. 6:3985-3994 (1987). El vector de expresión de
RG, HG8 y el vector de expresión de RP, cPR5A se describen en
Bocquel et al, Nucl. Acids Res. 17:2581-2595
(1989). Los genes indicadores para los vectores de expresión de RE,
RG y RP descritos anteriormente incluyen MMTV-CAT
(en el caso de de RP y RG; Cato et al., EMBO. J.
5:2237-2240 (1986)) y
vit-tk-CAT (en el caso de RE;
Klein-Hitpass et al., Cell
41:1055-1061 (1986)).
El vector de expresión de RT,
LexA-TR se describe en Lee et al., Nature
374:91-94 (1995), que también describe el uso de un
sistema de dos híbridos de levaduras para identificar compuestos que
afectan a la transactivación de RT.
Aún referencias adicionales describen plásmidos
indicadores que contienen un gen indicador y vectores de expresión
que codifican para un DUL de RN incluyen Meyer et al., Cell
57:433-442 (1989); Meyer et al., EMBO. J.
9(12):3923-3932 (1990); Tasset et al.,
Cell 62:1177-1187 (1990); Gronemeyer, H. y
Laudet, V., Protein Profile 2:1173-1308
(1995); Webster et al., Cell 54:199-207
(1988); Strähle et al., EMBO J. 7:3389-3395
(1988); Seipel et al., EMBO J. 11:4961-4968
(1992); y Nagpal et al., EMBO J. 12:2349-2360
(1993). En una realización particularmente preferida, se somete a
ensayo el efecto de un agonista o antagonista candidato sobre la
transactivación mediada por AF-2 de RN según el
método descrito en la leyenda de la figura 5 anterior.
Los presentes inventores han identificado un
dominio de activación de TIF2, DA1 (aminoácidos
1010-1131 tal como se muestra en la figura 1 (SEQ
ID NO:2)), que media la función de activación de la transcripción
dependiente de CBP de TIF2. Además, los presentes inventores han
mostrado que polipéptidos que contienen este dominio de activación,
cuando se fusionan a un dominio de unión a ADN de un activador de la
transcripción, pueden activar la transcripción a través de una ruta
dependiente de CBP. En consecuencia, la presente invención
proporciona además un método de selección de identificación de un
agonista de la actividad del dominio de activación DA1 de TIF2, que
supone: (a) proporcionar una célula huesped que contiene un gen o
genes recombinantes que expresan un polipéptido que comprende un
dominio de unión a ADN (DUA) de un activador de la transcripción y
un dominio de activación DA1 de TIF2; (b) administrar un agonista
candidato a dicha célula; y (c) determinar si dicho agonista
candidato potencia la actividad del dominio de activación DA1 de
TIF2.
La invención proporciona además un método de
selección para identificar un antagonista de la actividad del
dominio de activación DA1 de TIF2, que comprende: (a) proporcionar
una célula huesped que contiene un gen o genes recombinantes que
expresan un polipéptido que comprende un dominio de unión a ADN
(DUA) de un activador de la transcripción y un dominio de
activación DA1 de TIF2; (b) administrar un antagonista candidato a
dicha célula; y (c) determinar si dicho antagonista candidato
potencia la actividad del dominio de activación DA1 de TIF2.
Por "activador de la transcripción" se
quiere decir moléculas que potencian la iniciación de la
transcripción mediante ARN polimerasa B (II). Los activadores de la
transcripción incluyen activadores de la transcripción de
levaduras, tales como GAL4 y GCN4; el activador de herpes simple,
VP16; y los miembros de la familia de receptores nucleares, que
incluye RAR, RXR, RE, RT, RVD, RG y RA.
A continuación se describen genes recombinantes
que codifican para un polipéptido que comprende un dominio de
activación DA1 de TIF2. Se conocen bien en la técnica genes
recombinantes que codifican para un polipéptido que comprende un
DUA de un activador de la transcripción. Se conocen bien en la
técnica métodos para determinar si un agonista o antagonista
candidato potencia o interfiere en la transcripción. Por ejemplo,
puede determinarse el efecto de un agonista o antagonista candidato
de la actividad del dominio de activación DA1 de TIF2 usando
ensayos CAT según se describe a continuación y en Gronemeyer et
al. (1987) y Bocquel et al., Nucl. Acids Res.
(1989).
(1989).
Cuando va a determinarse el efecto de un
agonista o antagonista candidato de la actividad del dominio de
activación DA1 de TIF2, preferiblemente, genes recombinantes
codificarán para un polipéptido quimérico que comprende un DUA de
un activador de la transcripción fusionado a un polipéptido TIF2 que
comprende el dominio de activación DA1. En una realización
adicional, la célula huésped que expresa los genes recombinantes
también expresará un gen indicador. Anteriormente se describieron
ejemplos de genes indicadores. En una realización particularmente
preferida, se determinará el efecto de un agonista o antagonista
candidato de la función del dominio de activación DA1 de TIF2 según
se describe en la leyenda de la figura 7(c).
Los presentes inventores también han
identificado un segundo dominio de activación de TIF2, DA2
(aminoácidos 1288-1464 tal como se muestra en la
figura 1 (SEQ ID NO:2)), que media la activación de la transcripción
independiente de CBP. Además, los presentes inventores han mostrado
que los polipéptidos que contienen este dominio de activación,
cuando se fusionan a un dominio de unión a ADN de un activador de la
transcripción, pueden activar la transcripción a través de una ruta
independiente de CBP. En consecuencia, la presente invención
proporciona además un método de selección para identificar un
agonista de la actividad del dominio de activación DA2 de TIF2, que
comprende: (a) proporcionar una célula huesped que contiene un gen
o genes recombinantes que expresan un polipéptido que comprende un
dominio de unión a ADN (DUA) de un activador de la transcripción y
un dominio de activación DA2 de TIF2; (b) administrar un agonista
candidato a dicha célula; y (c) determinar si dicho agonista
candidato potencia la actividad del dominio de activación DA2 de
TIF2.
La invención proporciona además un método de
selección para identificar un antagonista de la actividad del
dominio de activación DA2 de TIF2, que comprende: a) proporcionar
una célula huesped que contiene un gen o genes recombinantes que
expresan un polipéptido que comprende un dominio de unión a ADN
(DUA) de un activador de la transcripción y un dominio de
activación DA2 de TIF2; (b) administrar un antagonista candidato a
dicha célula; y (c) determinar si dicho antagonista candidato
inhibe la actividad del dominio de activación DA2 de TIF2.
Se describen a continuación genes recombinantes
que codifican para un polipéptido que comprende un dominio de
activación DA2 de TIF2. Se conocen bien en la técnica genes
recombinantes que codifican para un polipéptido que comprende un
DUA de un activador de la transcripción. Se conocen en la técnica
métodos para determinar si un agonista o antagonista candidato
potencia o interfiere en la transcripción.
Cuando va a determinarse el efecto de un
agonista o antagonista candidato de la actividad del dominio de
activación DA2 de TIF2, preferiblemente, genes recombinantes
codificarán para un polipéptido quimérico que comprende un DUA de
un activador de la transcripción fusionado a un polipéptido TIF2 que
comprende el dominio de activación DA2. Anteriormente, se
describieron activadores de la transcripción. En una realización
adicional, la célula huésped que expresa los genes recombinantes
expresará también un gen indicador. Anteriormente se describieron
ejemplos de genes indicadores. En una realización particularmente
preferida, se determinará el efecto de un agonista o antagonista
candidato de la actividad del dominio de activación DA2 de TIF2
según se describe en la leyenda de la figura 7(c).
También se proporcionan anticuerpos contra TIF2
mediante la presente invención, específicos para una proteína TIF2,
un polipéptido TIF2, un fragmento de la proteína TIF2 o un fragmento
del polipéptido TIF2. El término "anticuerpo" pretende incluir
anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (Acm),
anticuerpos quiméricos, anticuerpos
anti-idiotípicos (anti-Id) contra
anticuerpos que pueden marcarse en forma soluble o unida, así como
fragmentos de los mismos proporcionados mediante cualquier técnica
conocida, tal como, pero sin limitarse a escisión enzimática,
síntesis peptídica o técnicas recombinantes. Los anticuerpos
policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de
anticuerpo derivadas de los sueros de animales inmunizados con un
antígeno. Un anticuerpo monoclonal contiene una población
sustancialmente homogénea de anticuerpos específicos para antígenos,
población que contiene sitios de unión a epítopos sustancialmente
similares. Los Acm pueden obtenerse mediante métodos conocidos por
los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Kohler y Milstein,
Nature 256:495-497 (1975); patente de los
EE.UU. número 4.376.110; Ausubel et al, eds., CURRENT
PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Assoc. y
Wiley Interscience, N.Y., (1987-1996); y Harlow y
Lane ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL Cold Spring Harbor
Laboratory (1988); Colligan et al., eds., Current
Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. y Wiley
Interscience, N.Y., (1992-1996), incorporándose el
contenido de tales referencias en su totalidad al presente documento
como referencia.
Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase
de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, GILD y cualquier
subclase de las mismas. Puede cultivarse in vitro, in
situ o in vivo un hibridoma que produce un Acm de la
presente invención. La producción de altos títulos de Acm in
vivo o in situ hacen éste el método de producción
preferido actualmente.
Los anticuerpos quiméricos son partes diferentes
de moléculas que se derivan de diferentes especies animales, tales
como las que tienen la región variable derivada de un Acm murino y
una región constante de inmunoglobulina humana, que se usan
principalmente para reducir la inmunogenicidad en la aplicación y
para aumentar los rendimientos en la producción, por ejemplo,
cuando Acm murinos tienen rendimientos superiores a partir de
hibridomas pero una inmunogenicidad superior en seres humanos, de
tal manera que se usan Acm quiméricos humanos/murinos. Se conocen
en la técnica anticuerpos quiméricos y métodos para su producción
(Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
81:3273-3277 (1984); solicitud de patente europea
125023 (publicada el 14 de noviembre de 1984); Neuberger et al.,
Nature 314:268-270 (1985); Taniguchi et
al., solicitud de patente europea 171496 (1985); Morrison et
al., solicitud de patente europea 173494 (1986); Neuberger et
al., solicitud PCT WO 86/01533,(1986); Kudo et al.,
solicitud de patente europea 184187 (1986); Morrison et al.,
solicitud de patente europea 173494 (1986); Robinson et al.,
Publicación PCT, PCT/US86/02269 (1987); Liu et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84:3439-3443 (1987); Sun et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218
(1987); Better et al., Science 240:1041-1043
(1988); y Harlow y Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL
Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). Estas referencias se
incorporan en su totalidad como referencia al presente
documento.
Un anticuerpo anti-idiotípico
(anti-Id) es un anticuerpo que reconoce
determinantes únicos asociados generalmente con el sitio de unión a
antígenos de un anticuerpo. Un anticuerpo Id puede prepararse
inmunizando un animal de la misma especie y tipo genético (por
ejemplo, raza de ratón) como la fuente del Acm con el Acm con el
que se está preparando un anti-Id. El animal
inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos
del anticuerpo de inmunización produciendo un anticuerpo contra
estos determinantes idiotípicos (el anticuerpo
anti-Id). Véase, por ejemplo, la patente de los
EE.UU. número 4.699.880, que se incorpora en su totalidad como
referencia al presente documento.
El anticuerpo anti-Id también
puede usarse como "inmunógeno" para inducir una respuesta
inmunitaria en otro animal más, produciendo un denominado
anticuerpo anti-anti-Id. El
anti-anti-Id puede ser idéntico con
respecto a los epítopos al Acm original que indujo el
anti-Id. Por tanto, usando anticuerpos contra los
determinantes idiotípicos de un Acm, es posible identificar otros
clones que expresan anticuerpos de especificidad idéntica. Por
tanto, los Acm anti-Id tienen sus propios epítopos
idiotípicos, o "idiótopos" similares estructuralmente al
epítopo que se está evaluando, tal como la proteína \alpha de
GRB.
El término "anticuerpo" también pretende
incluir tanto moléculas de inmunoglobulina intactas, así como
fragmentos de las mismas, tales como, por ejemplo, Fab y
F(ab')_{2}, que pueden unirse al antígeno. Los fragmentos
Fab y F(ab')_{2} carecen del fragmento Fc del anticuerpo
intacto, se elimina más rápidamente de la circulación, y puede
tener menos unión a tejido no específica que un anticuerpo intacto
(Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325
(1983)). Se apreciará que Fab y F(ab')_{2} y otros
fragmentos de los anticuerpos útiles en la presente invención
pueden usarse para la detección y cuantificación de un TIF2 según
los métodos descritos en el presente documento para moléculas de
anticuerpo intactas. Tales fragmentes se producen normalmente
mediante escisión proteolítica, utilizando enzimas tales como
papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir
fragmentos F(ab')_{2}).
Se dice que un anticuerpo "puede unirse a"
una molécula si puede reaccionar específicamente con la molécula
para unirse así a la molécula al anticuerpo. El término
"epítopo" pretende referirse a esa parte de cualquier molécula
que puede unirse por un anticuerpo que puede también reconocerse por
ese anticuerpo. Los epítopos o "determinantes antigénicos"
consisten normalmente en agrupamientos superficiales químicamente
activos de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de
azúcares y tienen características estructurales tridimensionales
específicas así como características de carga específicas.
Un "antígeno" es una molécula o una parte
de una molécula que puede unirse por un anticuerpo que puede
adicionalmente inducir a un animal a producir un anticuerpo que
puede unirse a un epítopo de ese antígeno. Un antígeno puede tener
uno, o más de un epítopo. La reacción especifica a la que se hace
referencia anteriormente pretende indicar que le antígeno
reaccionará, de manera altamente selectiva, con su correspondiente
anticuerpo y no con los otros innumerables anticuerpos que pueden
provocarse mediante otros antígenos.
Los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos,
útiles en la presente invención pueden utilizarse cuantitativa o
cualitativamente para detectar una proteína TIF2, polipéptido o
fragmento, en una muestra o para detectar la presencia de células
que expresan una TIF2 de la presente invención. Esto puede
conseguirse mediante técnicas de inmunofluorescencia empleando un
anticuerpo marcado de forma fluorescente (véase a continuación),
acoplado con detección con microscopía óptica, con citometría de
flujo o fluorométrica.
Los anticuerpos (o fragmentos de los mismos)
útiles en la presente invención pueden emplearse de manera
histológica, como en inmunofluorescencia o microscopía
inmunoelectrónica, para detección in situ de una proteína
TIF2, polipéptido o fragmento, de la presente invención. La
detección in situ puede conseguirse extrayendo una muestra
histológica de un paciente, y proporcionando un anticuerpo marcado
de la presente invención a tal muestra. El anticuerpo (o fragmento)
se proporciona preferiblemente aplicando o superponiendo el
anticuerpo marcado (o fragmento) a una muestra biológica. A través
del uso de tal procedimiento, es posible determinar no solo la
presencia de una proteína TIF2, polipéptido o fragmento, sino
también su distribución en el tejido examinado. Usando la presente
invención, aquellos expertos habituales percibirán fácilmente que
puede modificarse cualquiera de una amplia variedad de métodos
histológicos (tales como procedimientos de tinción) con el fin de
alcanzar tal detección
in situ.
in situ.
Tales ensayos para una proteína TIF2,
polipéptido, o fragmento, de la presente invención comprende
normalmente incubar una muestra biológica, tal como un fluido
biológico, un extracto de tejido, células recién recogidas tales
como linfocitos o leucocitos, o células que se han incubado en un
cultivo de tejido, en presencia de un anticuerpo marcado de manera
que pueda detectarse que puede identificar una proteína TIF2,
polipéptido, o fragmento, y detectar el anticuerpo mediante
cualquiera de las varias técnicas bien conocidas en la técnica.
La muestra biológica puede tratarse con un
portador o soporte en fase sólida tal como nitrocelulosa, u otro
portador o soporte sólido que puede inmovilizar células, partículas
celulares o proteínas solubles. El soporte o portador puede
entonces lavarse con tampones adecuados, seguido de tratamiento con
un anticuerpo específico de TIF-2 marcado de manera
que pueda detectarse. El portador o soporte en fase sólida pueden
lavarse entonces con el tampón una segunda vez para eliminar el
anticuerpo no unido. La cantidad de marcador unido en dicho portador
o soporte sólido puede detectarse entonces mediante medios
convencionales.
Por "soporte en fase sólida", "portador
en fase sólida", "soporte sólido", "portador sólido",
"soporte" o "portador" se entiende cualquier soporte o
portador que puede unirse a antígeno o anticuerpos. Soportes o
portadores muy conocidos, incluyen vidrio, poliestireno,
polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, celulosas
naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabros, y magnetita. La
naturaleza del portador puede ser o bien soluble hasta cierto punto
o bien insoluble para los fines de la presente invención. El
material de soporte puede tener prácticamente cualquier
configuración estructural posible siempre que la molécula acoplada
pueda unirse a un antígeno o anticuerpo. Por tanto, la configuración
de soporte o portador puede ser esférica, tal como en una perla, o
cilíndrica, tal como en la superficie interior de un tubo de ensayo,
o la superficie exterior de una varilla. Alternativamente, la
superficie puede ser plana tal como una lámina, tira reactiva, etc.
Los portadores o soportes preferidos incluyen perlas de
poliestireno. Aquellos expertos en la técnica conocerán muchos
otros portadores adecuados para la unión de anticuerpos o antígenos,
o podrán determinar los mismos mediante el uso de experimentación
rutinaria.
La actividad de unión de un lote dado de
anticuerpo anti-TIF2 puede determinarse según
métodos bien conocidos. Aquellos expertos en la técnica podrán
determinar las condiciones de ensayo óptimas y operativas para cada
determinación empleando experimentación rutinaria. Otras etapas
tales como lavar, remover, agitar, filtrar y similares pueden
añadirse a los ensayos según sea habitual o necesario para la
situación particular.
Uno de los modos en los que el anticuerpo
específico de TIF2 puede marcarse de manera que pueda detectarse es
uniendo el mismo a una enzima y usando un inmunoensayo enzimático
(EIA). Esta enzima, a su vez, cuando se exponga más tarde a un
sustrato adecuado, reaccionará con el sustrato de tal manera que se
produzca un resto químico que puede detectarse, por ejemplo,
mediante medios espectrofotométricos, fluorométricos o visuales.
Enzimas que pueden usarse para marcar el anticuerpo de manera que
pueda detectarse incluyen, pero no se limitan a, malato
deshidrogenasa, nucleasa de estafilococo,
delta-5-esteroide isomerasa, alcohol
deshidrogenasa de levaduras, alfa-glicerofosfato
deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa del rábano,
fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa,
beta-galactosidasa, ribonuclesasa, ureasa, catalasa,
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
glucoamilasa y acetilcolinesterasa. La detección puede conseguirse
mediante métodos colorimétricos que emplean un sustrato cromogénico
para la enzima. La detección puede conseguirse mediante comparación
visual de la extensión de la reacción enzimática de un sustrato en
comparación con patrones preparados de manera similar.
La detección puede conseguirse usando cualquiera
de una variedad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, marcando por
radioactividad los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, es
posible detectar R-PTPasa a través del uso de un
radioinmunoensayo (RIA). Puede encontrarse una buena descripción de
RIA en Laboratory Techniques and Bio chemistry in Molecular
Biology, por Work, T.S. et al., North Holland Publishing
Company, NY (1978) con particular referencia al capítulo titulado
"An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques"
por Chard, T., incorporado como referencia en el presente
documento. El isótopo radiactivo puede detectarse por medios tales
como el uso de un contador \gamma o un contador de centelleo o
mediante autorradiografía.
También es posible marcar un anticuerpo
anti-TIF2 con un compuesto fluorescente. Cuando el
anticuerpo marcado de forma fluorescente se expone a luz de
longitud de onda apropiada, puede detectarse su presencia debido a
la fluorescencia. Entre los compuestos de marcado fluorescente más
comúnmente usados son isotiocianato de fluoresceína, rodamina,
ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina,
o-ftalaldehído y fluorescamina.
El anticuerpo también puede marcarse de manera
que pueda detectarse utilizando metales que emiten fluorescencia
tales como ^{152}EU, u otros de las series de los lantánidos.
Estos metales pueden unirse al anticuerpo utilizando grupos
quelantes de metales tales como ácido dietilentriaminopentaacético
(EDTA).
El anticuerpo también puede marcarse de manera
que pueda detectase acoplándolo a un compuesto quimioluminiscente.
La presencia de un anticuerpo marcado con etiqueta
quimioluminiscente se determina entonces detectando la presencia de
la luminiscencia que surge durante el transcurso de una reacción
química. Ejemplos de compuestos de marcado quimioluminiscente
particularmente útiles son luminol, isoluminol, éster de acridinio
teromático, imidazol, sal de acridinio y éster de oxalato.
De la misma manera, puede usarse un compuesto
bioluminiscente para marcar el anticuerpo de la presente invención.
La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia que se
encuentra en sistemas biológicos, en los que una proteína
catalítica aumenta la eficacia de la reacción quimioluminiscente. La
presencia de una proteína bioluminiscente se determina detectando
la presencia de luminiscencia. Compuestos bioluminiscentes para
fines de marcado son luciferina, luciferasa y acuorina.
Una molécula de anticuerpo de la presente
invención puede adaptarse para su utilización en un ensayo
inmunométrico, también conocido como un ensayo "de doble
sitio" ("two-site") o de
"intercalación" ("sandwich"). En un ensayo inmunométrico
normal, se une una cantidad de anticuerpo no marcado (o fragmento de
anticuerpo) se une a un portador o soporte sólido y se añade una
cantidad de anticuerpo soluble marcado de manera que puede
detectarse para permitir la detección y/o cuantificación del
complejo ternario formado entre el anticuerpo en fase sólida,
antígeno y anticuerpo marcado.
Ensayos inmunométricos preferidos, y habituales
incluyen ensayos "hacia delante" ("forward") en los que el
anticuerpo unido a la fase sólida se pone en contacto en primer
lugar con la muestra que se está sometiendo a prueba para extraer
el antígeno de la muestra mediante la formación de un complejo
antígeno-anticuerpo en fase sólida binario. Tras un
periodo de incubación adecuado, el portador o soporte sólido se lava
para eliminar el residuo de la muestra de fluido, que incluye el
antígeno que no ha reaccionado, si lo hubiera, y después se pone en
contacto con la disolución que contiene una cantidad desconocida de
anticuerpo marcado (que funciona como una "molécula
indicadora"). Tras un segundo periodo de incubación para permitir
que el anticuerpo marcado forme un complejo con el antígeno unido
al portador o soporte sólido a través del anticuerpo no marcado, el
soporte sólido o portador se lava una segunda vez para eliminar el
anticuerpo marcado que no ha reaccionado.
En otro tipo de ensayo "de intercalación",
que puede ser útil con los antígenos de la presente invención, se
utilizan los ensayos denominados "simultáneo" e "inverso".
Un ensayo simultáneo implica una única etapa de incubación puesto
que el anticuerpo unido al soporte sólido o portador y el anticuerpo
marcado se añaden ambos a la muestra que se está sometiendo a
prueba al mismo tiempo. Después de completarse la incubación, el
soporte sólido o portador se lava para eliminar el residuo de la
muestra de fluido y el anticuerpo marcado no complejado. La
presencia de anticuerpo marcado asociado con el soporte sólido o
portador se determina entonces como si fuese un ensayo de
intercalación "hacia delante" convencional.
En el ensayo "inverso", se utiliza la
adición progresiva, en primer lugar de una disolución de anticuerpo
marcado a la muestra de fluido seguida de adición de anticuerpo no
marcado unido a un portador o soporte sólido tras un periodo de
incubación adecuado. Tras una segunda incubación, la fase sólida se
lava de forma convencional para liberarla del residuo de la muestra
que se está sometiendo a prueba y la disolución de anticuerpo
marcado que no ha reaccionado. La determinación de anticuerpo
marcado asociado con un portador o soporte sólido se determina
entonces como en los ensayos "simultáneo" y "hacia
delante".
Habiendo descrito de manera general la
invención, la misma se entenderá más fácilmente mediante referencia
a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración
y no pretenden ser limitantes.
En sintonía con informes anteriores (Halachmi,
S. et al., Science 264:1455-1458 (1994);
Cavaillès, V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:10009-10013 (1994); Kurokawa, R. et al,
Nature 377:451-454 (1995)), se observó unión
dependiente de agonista in vitro de una proteína de 160 kDa a
partir de extractos de células completas marcadas con ^{35}S
(HeLa, Cos-l, P19.6, MCF-7) a los
DUL marcados con etiqueta de
glutatión-S-transferasa (GST) de
receptores de ácido retinoico (RAR) y estrógenos (RE) (figura 2a).
Un clon de ADNc, identificado examinando 340.000 clones de la
biblioteca de expresión de ADNc de placenta humana con una sonda de
RE(DEF) marcado con ^{32}P unido a estradiol (E2),
codificaba para un fragmento de proteína (TIF2.1) que
interaccionaba en inmunotransferencias de tipo
Far-Western con tres DUL de RN (RE, RAR, RXR)
marcados con ^{32}P de manera dependiente de agonista (no
mostrado), y podría por tanto corresponder a la proteína de 160 kDa
anterior. La secuencia codificante de TIF2 (figura 3a), precedida
por codones de terminación en marco en 5' del iniciador AUG, se
obtuvo tras volver a seleccionar con una sonda de ADNc de TIF2. El
ADNc de TIF2 humano codifica para una proteína de 159.160 Da (1.464
aminoácidos), que incluye supuestas señales de localización nuclear
N-terminales (NLS), una región rica en Gln y tres
ricas en Ser/Thr, y dos agrupaciones cargadas (figura 3). Algunas
regiones de TIF2 muestran similitudes de secuencia significativas
con el coactivador del receptor de esteroides,
CRE-1, descrito recientemente (Onate, S.A. et
al., Science 270:1354-1357 (1995)) (figura 3).
TIF2 aparece expresarse ampliamente, puesto que se encontró el
transcrito correspondiente en varios tejidos humanos, aunque a un
nivel mucho menor en el riñón (figura 2c y no mostrado).
Estudios de inmunoreducción apoyan firmemente
que TIF2 es la especie de proteína de 160 kDa que interacciona de
una manera dependiente de agonista con DUL de RN (véase
anteriormente y Halachmi, S. et al., Science
264:1455-1458 (1994); Cavaillès, V. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 91:10009-10013 (1994); y
Kurokawa, R. et al, Nature 377:451-454
(1995)). La inmunotransferencia de tipo Western con un antisuero de
conejo (p\alpha-TIF2 ), obtenido contra TIF2.1
expresado por bacterias, reveló predominantemente una proteína de
células HeLa de 160 kDa que interaccionaba con
GST-RE(DEF) unido a agonista (figura 2b,
carriles 1 y 2; véase también la leyenda de la figura 2b). La
inmunoreducción con un anticuerpo contra TIF2 monoclonal de ratón
(m\alpha-TIF2) antes de la purificación por
afinidad dio como resultado una disminución específica de las
cantidades TIF2, pero no de TIF1 (Le Douarin, B. et al., EMBO
J. 14:2020-2033 (1995)), retenidas en el
GST-RE(DEF) unido a E2 (figura 2b, compárense
los carriles 2 con 4 y 6 con 8). De manera importante, el posterior
análisis de inmunotransferencia de tipo Far-Western
con una sonda de
^{32}P-GST-RE(DEF) unido a
E2 reveló la especie de 160 kDa sólo en el control, pero no en
extractos con inmunorreducción de TIF2 (figura 2b, compárense los
carriles 10 y 12).
El TIF2 de longitud completa expresado de manera
transitoria fue nuclear y principalmente asociado con corpúsculos
diferenciados (figura 4a). Puesto que el fragmento de TIF2.1
sobreexpresado era esencialmente citoplásmico (apoyando la
asignación anterior de NLS de TIF2 N-terminal), la
interacción de TIF2.1 con RN podría estudiarse en células de
mamíferos utilizando ensayos de cotranslocación nuclear. En ausencia
de ligando, el TIF2.1 siguió siendo citoplásmico y los RN fueron
nucleares (para RAR\alpha, RE y RP, véanse las figuras 4b, d, g).
La exposición a agonista, sin embargo, dio como resultado la
localización nuclear conjunta de TIF2.1 y RN en los tres casos,
indicando la interacción de TIF2-RN in vivo
(figuras 4c, e, h). La interacción dependiente de agonista de
TIF2.1 con los RN se observó para todos los demás receptores
analizados (RXR, RT, RVD, RG y RA; no mostrados). De forma
interesante, no se detectó interacción entre RE y TIF2.1 en
presencia del antagonista de AF-2 de RE
hidroxitamoxifeno (OHT) (figura 4f), y el antagonista de
AF-2 de RP RU 486 invirtió la interacción de
TIF2.1-PR inducida por R5020 (figura 4).
De acuerdo con los experimentos de
inmunotransferencia de tipo Far-Western, los RN y
TIF2 interaccionaban directamente, a medida que la proteína TIF2.1
purificada se unió in vitro en presencia de un agonista a
GST-RE(DEF),
GST-RAR\alpha(DEF),
GST-RXR\alpha(DE) y
GST-RT(DE) (figura 4k, l, m, carriles 3 y 4;
figura 4n, carriles 5 y 6). Tal como se esperaba, la unión de TIF2
a GST-RXR\alpha(DE) se producía con
9-cis-AR (9C-AR) pero no con
todo-trans-AR (T-RA) (figura 4n, carriles 1 y
2), y OHT impidió la unión dependiente de E2 de TIF2 a
GST-RE(DEF) (figura 4n, carriles 7 a 9). La
integridad del núcleo conservado de los dominios de activación de
AF-2 (DA de AF-2) de RE, RAR\alpha
y RXR\alpha que se demostró que era crítico para la actividad de
AF-2 (Le Douarin, B. et al., EMBO J.
11:1025-1033 (1995); Danielian, P.S. et al., EMBO
J. 11:1025-1033 (1992); Durand, B. et al.,
EMBO J. 13:5370-5382 (1994); y Gronemeyer, H. y
Laudet, V., Protein Profile 2:1173-1308
(1995), y en esos documentos), se requirió para la interacción de
TIF2 in vitro. La mayoría de los mutantes de núcleo de DA de
AF-2 que han perdido la actividad de
AF-2 (RE, figura 4k, carriles 5 a 8; RAR\alpha,
figura 4l, carriles 5 a 10; RXR\alpha, figura 4m, carriles 5 a 8)
no se asociaron de manera detectable, o sólo débilmente, con TIF2,
mientras que la fusión de GST-DUL del mutante de
RXR\alpha E461Q, cuya AF-2 está sólo parcialmente
afectada (Le Douarin, B. et al., EMBO J.
14:2020-2033 (1995)), todavía mostraba una
interacción dependiente de RA significativa con TIF2.1 in
vitro (figura 4m, carriles 9 y 10). No se observó interacción
significativa de TIF2 ni con GST-VP16 (dominio ácido
de activación), GST-TBP, GST-TFIIB,
o una serie de GST-TAF (hTAF_{II}18,
hTAF_{II}20, hTAF_{II}28 y hTAF_{II}55; véase Jacq, X. et
al., Cell 79:107-117 (1994); Mengus, G. et
al., EMBO J. 14:1520-1531 (1995)) (no
mostrado).
Desde un punto de vista conceptual, un TIF que
puede mediar la actividad de transcripción de una AF relacionada
con la maquinaria de transcripción, podría ser en sí mismo un
activador cuando se fusiona a un dominio de unión de ADN
heterólogo. De forma interesante, en células HeLa transfectadas de
manera transitoria, TIF2.1 fusionado al dominio de unión de ADN de
GAL4 transactivó fuertemente un indicador de GAL4 (figura 5a). Por
tanto, TIF2 puede corresponder a uno del (de los)
hipotético(s) factor(es) limitante(s) que se
propusieron anteriormente que participan en la
interferencia/secuestro transcripcional de RN (Meyer, M.-E. et
al., Cell 57:433-442 (1989); Bocquel, M.-T.
et al., Nucl. Acids Res. 17:2581-2595 (1989);
Tasset, D. et al., Cell
62:1177-1187(1990)). Apoyando esta
posibilidad, experimentos "anti-secuestro"
demostraron que la expresión de TIF2.1 en células transfectadas con
RE pudieron, al menos de manera parcial, invertir la
autointerferencia transcripcional (Bocquel, M.-T. et al., Nucl.
Acids Res. 17:2581-2595 (1989)) generada al
expresar cantidades aumentadas de RE (figura 5b; obsérvese el
desplazamiento marcado de la cuerva de activación con forma de
campana a concentraciones superiores de RE en presencia de TIF2.1).
A niveles de expresión de RE elevados, la transactivación
estimulada por TIF2.1 disminuyó, posiblemente debido a secuestro de
otros supuestos mediadores (Jacq, X. et al., Cell
79:107-117 (1994); Lee, J.W. et al., Nature
374:91-94 (1995); Le Douarin, B. et al., EMBO
J. 14:2020-2033 (1995); vom Baur, E. et al.,
EMBO J. 15:110-124 (1996); Lee, J.W. et al.,
Endocrinology 9:243-254 (1995); Cavaillès, V.
et al., EMBO J. 14:3741-3751 (1995); Onate,
S.A. et al., Science 270:1354-1357 (1995))
y/u otros factores de transcripción.
Tal como se esperaba, la coexpresión de TIF2.1
con RN unido a antagonista no condujo a ninguna estimulación de la
transactivación provocada por AF-1 en presencia de
antagonistas de AF-2 puros (Berry, M. et al.,
EMBO J. 9:2811-2818 (1990); Meyer, M.E. et
al., EMBO J. 9:3923-3932 (1990)), apoyando
además que TIF2 es específico de AF-2 (figura 5b y
5e para RE, OHT; figura 5d para PR, RU486). La expresión de TIF2
también aumentó la transactivación mediada por
agonista/AF-2 mediante los receptores de andrógenos
(RA) y progesterona (RP), pero no la transactivación mediante
GAL-VP16 y GAL-AP2 (figura 5c). En
condiciones similares, la transactivación mediante
GAL-RAR, GAL-RXR,
GAL-RVD, GAL-RT y
GAL-RG no se vieron afectadas por TIF2 (figura 5c, y
no mostrado), lo que sugiere que para estos RN ni TIF2 está
implicado de manera crítica en la mediación de sus actividades de
AF-2 ni las cantidades de TIF2 endógeno son
suficientes para apoyar óptimamente la transactivación, por
ejemplo, porque TIF2 tiene una afinidad superior por estos
receptores. La estimulación de TIF2 se ve afectada hasta cierto
punto por el entorno del promotor del gen que responde, ya que el
efecto de TIF2 sobre la transactivación inducida por RP/5020 fue
mayor para un complejo (MMTV) que para un promotor mínimo
(GRE-TATA), aunque este último también se estimuló
de forma reproducible (figura 5d). Tal como se esperaba a partir de
los niveles definidos de transcritos de TIF2 en diferentes tejidos
(figura 2c), el efecto de TIF2 era dependiente del tipo de célula,
puesto que TIF2 tenía un efecto mucho más fuerte sobre las
transactivaciones inducidas por RE o RP en células
Cos-1 que en células HeLa (figuras 5d, e).
Los estudios de secuestro (Meyer, M.-E. et
al., Cell 57:433-442(1989); Bocquel,
M.-T. et al., Nucl. Acids Res. 17:2581-2595
(1989); Tasset, D. et al., Cell 62:1177-1187
(1990)) y estructurales (Bourguet, M. et al., Nature
375:377-382 (1995); Benaud, J.-P. et al.,
Nature 378:681-689 (1995); Wagner, R.L. et
al., Nature 378:690-697 (1995); Wurtz, J.-M.
et al., Nature Struct. Biol. 3:87-94 (1996))
han apoyado un modelo en el que la unión del ligando al DUL de los
RN da como resultado cambios conformacionales que generan
la(s) superficie(s) requerida(s) para la
interacción con factores intermediarios de transcripción
(TIF/mediadores) que transducen la actividad de
AF-2 a la maquinaria de transcripción. Desde un
punto de vista conceptual, tales mediadores deben mostrar las
siguientes propiedades: (i) deben unirse a DUL de RN unidos a
agonista, pero no a agonista, (ii) debe impedirse su unión mediante
mutaciones que supriman la actividad de AF-2, (iii)
deben mostrar colectivamente una(s) función(ones) de
transactivación, (iv) su expresión debe mitigar el autosecuestro de
AF-2, y (v) su sobreexpresión debe estimular la
actividad de AF-2, siempre que estén presentes en
cantidades limitantes. El presente estudio es el primer informe de
un mediador auténtico de AF-2 de RN que muestra
todas estas propiedades.
Los siguientes anticuerpos contra TIF2 se
prepararon utilizando técnicas conocidas, a menos que se especifique
a continuación. Véase, por ejemplo, Ausubel et al, eds.,
CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing
Assoc. y Wiley Interscience, N.Y., (1987-1996);
Harlow y Lane ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL Cold Spring Harbor
Laboratory (1988); y Colligan et al., eds., Current
Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. y Wiley
Interscience, N.Y., (1992-1996), incorporándose en
su totalidad el contenido de tales referencias al presente documento
como referencia.
Anticuerpos policlonales. La secuencia
codificante de TIF2.1 (aminoácidos 624-1287) se
clonó en pET15b y el plásmido resultante se transformó en una cepa
BL21 (DE3) de E. Coli. Tras la sobreexpresión de la proteína
(His)_{6}-TIF2.2, se lisaron las bacterias
y se purificó la proteína a partir del extracto bruto mediante
cromatografía de afinidad en una columna de quelación HiTrap
(Pharmacia) tal como se describe (véase Bourguet et al., Prot.
Expr. Purif. 6:604-608 (1995) para detalles
técnicos). Se inyectaron alícuotas de la proteína purificada (50
\mug) en emulsión (adyuvante de Freund) (sólo una vez) en un
conejo de Nueva Zelanda utilizando un protocolo de inyección
intradérmica en múltiples sitios. El antisuero obtenido a partir de
extracciones de sangre en serie revelaron un única banda de
aproximadamente 160 kDa en inmunotransferencias de tipo Western de
extractos a partir de células Cos-1 transformadas
con un vector de expresión de TIF2 de longitud completa.
Anticuerpos monoclonales. Se seleccionó
un péptido de aminoácidos 20-mérico de TIF2 (con una
cisteína C-terminal añadida) basándose en sus
características inmunogénicas potenciales en cuanto a
hidrofobicidad, flexibilidad, probabilidad superficial e "índice
antigénico" según los programas de software Plot y
Peptidestructure del paquete GCG.
El péptido elegido corresponde al fragmento
N-terminal codificado por el ADNc parcial de TIF2
aislado inicialmente (que codifica para los aminoácidos 624 a 1287)
y corresponde a los aminoácidos 624 a 643 de la proteína total (SEQ
ID NO:2):
Se acopló el péptido a ovoalbúmina mediante la
cisteína adicional utilizando el agente de reticulación
heterobifuncional MBS. Se llevaron a cabo las inyecciones en
ratones Balb/c por vía intraperitoneal y por vía intravenosa.
Se fusionaron células de bazo de los ratones
inmunizados al mieloma Sp2/0-Ag14. Los hibridomas en
crecimiento se seleccionaron en primer lugar mediante ELISA
utilizando la proteína TIF2.1 recombinante y el péptido libre.
Entonces, se sometieron a prueba los cultivos positivos mediante
inmunocitofluorescencia en células Cos transfectadas con TIF2.1 (en
el vector pSG5) así como mediante inmunotransferencia de tipo
Western usando los extractos de células Cos transfectadas y un
extracto nuclear de HeLa. También se sometieron a prueba los
cultivos positivos para determinar su capacidad para
inmunoprecipitar la proteína TIF2.1 a partir de células Cos
transfectadas.
Los cultivos se clonaron dos veces en agar
blando. Se han establecido 5 hibridomas, 4 que secretan anticuerpos
IgG_{1}, \kappa y 1 IgG_{2a}, \kappa, tal como se muestra en
la tabla:
Todo el trabajo de ADN recombinante se llevo a
cabo según procedimientos habituales (Ausubel, F.M. et al.,
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,
Nueva York (1993)). Se expresaron fusiones con GST de receptores
nucleares de los siguientes plásmidos descritos anteriormente: GST
(pGEX2T; Pharmacia), GST-RE
(pGEX2T-REh\alpha(DEF), también denominado
pGEX2THE14G, aminoácidos 282-595),
GST-RXR
(pGEX2T-RXRm\alpha(DE), aminoácidos
205-467), y GST-RAR
(pGEX2T-RARh\alpha (DEF), aminoácidos
153-462) (todos LeDouarin, B. et al., EMBO J.
14:2020-2033 (1995a)).
Para definir además el dominio de interacción
con RN (DIN) de TIF2, se estudió la interacción entre una serie de
mutantes de deleción de TIF2 y los DUL de RE o RAR\alpha,
utilizando ensayos in vitro basados en proteínas de fusión
con GST. En ambos casos, se mapeó un DIN en la región central de
TIF2 (aminoácidos 624-869 en el mutante TIF2.5;
véanse las figuras 7a y b). No se pudo identificar ningún DIN
adicional en los extremos N o C-terminales de TIF2
(figuras 7a y b; mutantes TIF2.0, TIF2.2 y TIF2.7). Obsérvese que,
al contrario, CRE-1, un paralogo de TIF2,
aparentemente alberga dos DIN no contiguos distintivos ubicados en
las regiones central y C-terminal (Onate, S.A.
et al., Science 270:1354-1357 (1995); Yao,
T.P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93:10626-10631 (1996); Zhu, Y. et al., Gene
Expression 6:185-195(1996)).
Para delimitar más el DIN de TIF2, se truncó
TIF2.5 en el extremo C-terminal a Pro775,
produciendo TIF2.34 que también interaccionó con los DUL de RE y
RAR\alpha de manera dependiente de ligando (figuras 8a y 8c). En
el truncamiento adicional a Ser697, el mutante resultante todavía
interaccionó tanto con los DUL de RE como de RAR\alpha pero,
sorprendentemente, se encontró también una interacción dependiente
de ligando con TIF2.36 (figuras 8a y 8c), indicando así que el DIN
de TIF2 se compone de al menos dos módulos autónomos de interacción
con NO.
Una alineación de la secuencia de aminoácidos
del DIN de TIF2 presente en TIF2.34 con la correspondiente región
de CRE-1 (Oñate, S.A. et al., Science
270:1354-1357 (1995)) reveló 3 regiones altamente
conservadas (figura 8a). De forma interesante, las tres contienen
el motivo LxxLL (SEQ ID NO:12) (figura 8b), identificado
originalmente en la denominada "caja de receptor nuclear" (caja
RN) de TIF1\alpha como el motivo LxxLLL (SEQ ID NO:13), que
también estaba presente en RIP140 (Cavaillès, V. et al., EMBO
J. 14:3741-3751 (1995)) y TRIP3 (Lee, J.W.
et al., (1995)) (véase LeDouarin, B. et al., EMBO J.
15:6701-6715 (1996) y la figura 8b). De forma
interesante, secuencias de 10 aminoácidos que comprenden las cajas
RN de TIF1\alpha o RP140 fueron suficientes para la interacción
funcional con RXR de manera dependiente de ligando e integridad de
DA de AF-2, y la mutación de las leucinas en la
posición 4 y 5 (LL \rightarrow AA) del motivo LxxLLL de
TIF1\alpha (SEQ ID NO: 13) suprimió la interacción
TIF1\alpha-RXR (LeDouarin, B. et al., EMBO
J. 15:6701-6715 (1996)). Se confirmó
recientemente la funcionalidad de la caja RN RIP140 (Heery, D.M.
et al., Nature 387:733-736 (1997)).
Para investigar la importancia funcional de
estos tres motivos en el DIN de TIF2, se introdujo la mutación LL
\rightarrow AA anterior en TIF2.1, o bien en cada motivo solo o en
todas las combinaciones posibles de los tres motivos (m1 a m123 de
TIF2.1 en la figura 8a; los números que siguen a "m" hacen
referencia a los motivos mutados). Se requiere la mutación de las
tres cajas RN para suprimir tanto la unión a RE, RAR\alpha y
RXR\alpha (figura 8d, cuantificación en la figura 8e, barras
blancas) y la estimulación dependiente de TIF2 de la
transactivación inducida por ligando mediante las
AF-2 de RE y RXR\alpha (figura 8e, barras negras,
y datos no mostrados; en el caso de AF-2 de
RAR\alpha, la estimulación fue débil y no se cuantificó). Las
construcciones de TIF2.1 en los que se mutaron dos motivos de cajas
RN todavía mostraron unión a RE y estimulación de la actividad de
AF-2, en particular cuando el motivo II de la caja
RN estaba intacto, sugiriendo que los tres módulos que contienen
cajas RN son al menos en parte, redundantes funcionalmente (figuras
8d y e; m12, m13, y m23 de TIF2.1). Esta redundancia fue obvia
cuando se mutó sólo un motivo de caja RN; al contrario que
TIF1\alpha, que contiene sólo una caja RN (LeDouarin, B. et
al., EMBO J. 15:6701-6715 (1996)), la mutación
de una única caja RN de TIF2 no suprimió la unión de RE y
estimulación de la actividad de AF-2 de RE. Los
tres mutantes (m1 a m3 de TIF2.1) unidos a RE y la transactivación
dependiente de estradiol estimulada, mediante RE con eficiencia
similar que el propio TIF2.1 (figuras 8d y e). Las mutaciones
tuvieron, en el caso de RAR\alpha y RXR\alpha, en general, un
efecto más perjudicial sobre la unión de DUL del receptor y la
estimulación de la actividad de AF-2 que en el caso
de RE (figuras 8d y e). Esto puede reflejar posiblemente una
interacción más débil entre TIF2 y o bien RAR\alpha o bien
RXR\alpha que con RE. Sin embargo, a pesar de mostrar en general
una actividad menor, los patrones de unión de RN y estimulación de
la actividad de AF-2 de los mutantes de la caja RN
fueron similares para RE y para RAR\alpha y RXR\alpha, debido a
que la mutación del motivo II fue siempre más perjudicial en
mutantes dobles que la mutación de motivos I y III (véase figura
8e). De forma importante, tanto para RE como para RXR\alpha, había
una buena correlación entre el efecto de cualquiera de las diversas
mutaciones en la unión TIF2.1-receptor in
vitro y la estimulación mediada por TIF2 de la actividad de
AF-2 (figura 8e), apoyando un mecanismo mediante el
cual la estimulación de la actividad de AF-2
mediante TIF2 implica la interacción TIF2-NO a
través de la(s) interfase(s) de caja RN
holo-DUL-TIF2 de RN.
El presente análisis de
función-estructura revela que TIF2 contiene un único
dominio de interacción con receptor nuclear (DIN). Obsérvese la
diferencia con el otro miembro de la familia de TIF2,
CRE-1, que se notificó que contiene dos DIN (Oñate,
S.A. et al., Science 270:1354-1357 (1995);
Yao, T.P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93:10626-10631(1996); Zhu, Y. et al., Gene
Expression 6:185-195 (1996)). Obsérvese, sin
embargo, que uno de los dos DIN de CRE-1 es más
probablemente homólogo al DIN de TIF2 caracterizado en el presente
documento (véase la figura 8a). El DIN de TIF-2 se
compone de tres módulos, y cada uno puede unirse independientemente
de manera dependiente de ligando a los RN sometidos a prueba en este
estudio. De forma interesante, estos módulos contienen el motivo
LxxLL de la caja RN (SEQ ID NO:12), que fue registrada originalmente
(como el motivo LxxLLL (SEQ ID NO: 13), figura 8b) dentro de un
módulo de unión a RN de 10 aminoácidos de TIF1\alpha que se
encontró que se conservaba en el DIN de RIP140 y que también estaba
presente en TRIP3 (LeDouarin, B. et al, EMBO J.
15:6701-6715 (1996) y referencias en ese documento).
Además, los módulos TIF1\alpha y RIP140 demostraron interaccionar
funcionalmente con los RN (LeDouarin, B. et al, EMBO J.
15:6701-6715 (1996)). La implicación de los motivos
de la caja RN en uniones NO-coactivador y su
presencia en varios coactivadores diferentes se señaló en informes
recientes (Heery, D.M. et al., Nature
387:733-736(1997); Torchia, J. et al.,
Nature 387:677-684 (1987); LeDouarin, B. et
al., EMBO J. 15:6701-6715 (1996)). Obsérvese
que los tres motivos de caja RN de TIF2 descritos en el presente
documento se conservan en el paralogo de TIF2 descubierto
recientemente p/CIP (Torchia, J. et al., Nature
387:677-684 (1987)). Al contrario que TIF1\alpha,
para el que la mutación de leucinas en las posiciones 4 y 5 a
alanina de su único motivo de caja RN (LL \rightarrow AA) suprime
la unión a RN, se requiere la mutación de los tres motivos en el
DIN de TIF2 para suprimir la unión a RN, indicando que cada uno de
estos motivos puede contribuir a una superficie de TIF2 que
interacciona con una superficie relacionada de
holo-DUL de RN. Que las cajas RN de TIF2 muestren
redundancia funcional está apoyado por la observación de que la
mutación LL \rightarrow AA en cualquiera de los tres motivos de
DIN de TIF2 aparentemente no reducen (en el caso de RE) o solo
débilmente (en el caso de RAR\alpha, RXR\alpha) la eficiencia
de la interacción con RN. Además, en el entrono de TIF2.1, cualquier
motivo de una única caja RN intacta por sí mismo (es decir, cuando
se mutaron los otros dos motivos) fue suficiente para la
interacción con el DUL de holo-RE, aunque solamente
el motivo II por sí mismo pudo provocar una eficiencia de unión a
RN casi de tipo natural. Por el contrario, para la interacción con
RAR\alpha y RXR\alpha, los mutantes con cajas RN únicas e
intactas fueron de 5 (caja II) a 20 (caja I o III) veces menos
eficaces que el TIF2 de tipo natural que contiene las tres cajas
RN. Serán necesarios estudios cristalográficos para distinguir
entre dos modelos posibles, en los que los tres motivos de caja RN
(i) contribuyen a la formación de una superficie de DIN tripartita
que reconoce específicamente una superficie de DUL de
holo-NO relacionado, o (ii) pertenece a superficies
independientes que pueden cada una interaccionar, aunque con
eficacias diferentes, con la misma superficie de
holo-NO. Obsérvese, sin embargo, que el segundo
modelo podría permitir que TIF2 interaccionara cooperativamente con
componentes tanto de homo como de heterodímeros de RN, haciendo así
la transactivación por RN sensible a pequeñas variaciones en los
niveles de TIF2. Obsérvese también que, tanto para RE como para
RXR\alpha, los efectos de las mutaciones de caja RN sobre la unión
a RN y la estimulación de la actividad de AF-2 se
correlacionaban, apoyando además la conclusión de que el efecto
transcripcional de TIF2 implica la formación de una interfase de
interacción caja RN - DUL de NO.
Se ha encontrado el motivo LxxLL (SEQ ID NO:12)
en otros varios coactivadores de RN (véase anteriormente),
sugiriendo así cierta similitud en el modo de interacciones
NO-coactivador. Sin embargo, esto no excluye la
modulación específica de NO de estas interacciones, puesto que las
secuencias que rodean la caja RN son altamente variables. Con
respecto a esto, obsérvese también que se prevé que las cajas II y
III de RN de TIF2 formen hélices \alpha, mientras que se prevé
que la caja I de RN se pliegue en una estructura de lámina \beta
(predicciones de estructura según SOPMA; Geourjon y Deleage,
1994).
Ensayos de transfección transitoria con un
plásmido indicador de GAL4 y quimeras que contienen varios
fragmentos de TIF2 unidos al dominio de unión a ADN de GAL4 (DUA)
demostró la presencia de de dos dominios de activación
transcripcionales autónomos en los 460 aminoácidos
C-terminales de TIF2, denominados como DA1 y DA2
(definidos por los mutantes TIF2.8, TIF2.12, y TIF2.2 en las
figuras 7a y c). Se realizaron transfecciones transitorias de
células HeLa y Cos-1 tal como se describe
(Gronemeyer et al., (1987); Bocquel, M.T. et al., Nucl.
Acids Res. 17:2581-2595(1989)).
El DA1 N-terminal (aminoácidos
1010-1131), que está presente en TIF2.1, mostró una
actividad más fuerte que el DA2 C-terminal
(aminoácidos 1288-1464) (compárense TIF2.8 y TIF2.12
con TIF2.2 en las figuras 7a y c). Obsérvese, sin embargo, que la
actividad más débil de DA2 (con respecto a DA1) podría deberse a un
nivel de expresión menor de la proteína de fusión
GAL-TIF2.2 (compárese con GAL-TIF2.8
y GAL-TIF2.12 en la figura 7c). Ambas funciones de
activación de TIF2 estaban activas en células Cos-1
y HeLa (figura 7c). Notablemente, las construcciones de DA1
(TIF2.8) y DA2 (TIF2.2) mínimas mostraron algunas actividades
específicas de células, ya que GAL-TIF2.8 era más
activo en células HeLa que en células Cos, mientras que se observó
lo contrario para GAL-TIF2.2 (figura 7c). De forma
interesante, la región de TIF2 rica en glutamina no pudo ni activar
la transcripción por si misma cuando se fusionó al DUA de GAL4
(figuras 7a y c; mutante TIF2.6), ni se requirió para la activación
de la transcripción por DA1 o DA2. No pudo detectarse ninguna
función de activación en la parte N-terminal de TIF2
(véanse las figuras 7a y c; mutante TIF2.0).
Se concluyó a partir de estos datos que el
dominio de interacción del receptor nuclear (DIN) y las dos
funciones de activación de transcripción de TIF2 corresponden a
dominios modulares distintos, puesto que el TIF2.5 puede unirse a
RN, pero no puede activar la transcripción, mientras que TIF2.2 y
TIF2.8 no pueden unirse a RN pero pueden activar la transcripción
(figura 7a).
Recientemente se mostró que CBP y p300,
identificados originalmente como coactivadores del factor de
transcripción CREB, actúan como integradores generales de múltiples
rutas de señalización, incluyendo la activación mediante RT y
RAR\alpha unido a un agonista (para publicaciones y referencias
véase Eckner, R., Biol. Chem. 377:685-688
(1996); Janknecht & Hunter, (1996); Glass, C.K. et al.,
Current Opin. Cell Biol. 9:222-232 (1997);
Shikama, N. et al., Trends in Cell Biol.
7:230-236 (1997)). Además, se notificó que el
CRE-1, que pertenece a la misma familia de genes
que TIF2, interacciona con CBP y p300 (Kamei, Y. et al., Cell
85:403-414 (1996); Yao, T.P. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 93:10626-10631(1996);
Hanstein, B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA
93:11540-11545 (1996)). Utilizando la interacción
basada en proteína de fusión de GST y ensayos de dos híbridos
basados en células animales, se analizó así si TIF2 también podía
interaccionar con CBP. En el sistema de dos híbridos sólo el
fragmento de TIF2.1 central, pero no los fragmentos de TIF2.0
N-terminal ni TIF2.2 C-terminal
(figura 7a), dieron puntuación positiva para la interacción con
GAL-CPB (que contiene los aminoácidos
1872-2165 de CBP, que abarcan el dominio de
interacción de CRE-1; figura 7e). Se expresó una
proteína de fusión de CBP-GST en E. coli y se
usó para ensayos pull-down con polipéptidos TIF2
traducidos in vitro (figura 7d). El TIF2 interaccionó con CBP
y, de forma interesante, el dominio de interacción con CBP (DIC) se
solapó aparentemente al dominio de activación DA1 de TIF2
(compárense las figuras 7a, c y d; mutantes TIF2.8 y TIF2.12). La
interacción de TIF2 con CBP fue directa, como una proteína TF2.1
expresada en E. Coli purificada también interaccionó con
GST-CBP (datos no mostrados). Solo esta región de
TIF2 interaccionó significativamente con la proteína de fusión GST
CBP, sugiriendo así que la actividad de DA1 de TIF2 podría
originarse de la inclusión de CBP. La purga de regiones
N-terminales (figuras 7a y d; mutantes TIF2.10 y
TIF2.4) del dominio de activación DA2 C-terminal
(figuras 7a y d; mutante TIF2.2) no mostró ninguna unión a
GST-CBP. Obsérvese que el TIF2.2 tampoco
interaccionó con CBP de longitud completa (datos no mostrados),
sugiriendo que la actividad de DA de TIF2 está mediada por (un)
factor(es) distintos de CBP.
Para investigar si el DIC de TIF2 podía
separarse del dominio de activación DA1, se comparó la capacidad de
una serie de mutantes de truncación de GAL-TIF2 para
activar un indicador de GAL4 con su capacidad para interaccionar
con la proteína GST-CBP in vitro (figura 9).
TIF2.13 (que abarca de Pro_{1011} a Ser_{1122}) mostró una
actividad de transcripción potente, comparable a la de fragmentos de
TIF2 más grandes (compárense las figuras 7 y 9). La eliminación de
restos de 26 aminoácidos C-terminales (TIF2.15) o 20
N-terminales (TIF2.18) sólo redujo la actividad de
transcripción débilmente (figuras 9a y b). Obsérvese que el TIF2.13
también interaccionó con CBP in vivo, como se mostró
utilizando un ensayo de dos híbridos en células de mamíferos
transfectadas (figura 10b).
Mientras que la eliminación interna de restos
Asp_{1061} a Ala_{1070} (TIF2.19) solo tuvo un efecto menor
sobre la capacidad del TIF2.13 para transactivar, la eliminación del
segmento Glu_{1071} a Leu_{1080} (mutante TIF2.20) redujo
significativamente la actividad de transcripción del DA1 de TIF2.
Notablemente, estos restos pertenecen a una secuencia que se
predijo que se doblaba en una estructura de hélice \alpha
anfipática que está sumamente conservada entre TIF2 y
CRE-1 (figura 9a). La implicación de esta región en
la transactivación se confirmó mediante el análisis de mutantes de
TIF2.21 a TIF2.32 (figuras 9a y b). Todas las construcciones que
contienen la secuencia natural de TIF2 de Asp_{1075} a
Leu_{1087} estimularon la transcripción, mientras que incluso una
deleción de solo algunos de estos restos redujo significativamente
la activación trascripcional. Sin embargo, por si mismo, este
péptido helicoidal \alpha transactivó muy poco, y tuvo que
incorporarse en secuencias de TIF2 adicionales en sentido 5' y/o en
sentido 3' para generar actividad de transcripción significante
(figuras 9a y b; compárense los mutantes TIF2.13, TIF2.21, TIF2.32).
De forma importante, en todos los casos, la actividad ADD coincidió
con la interacción de CBP, puesto que construcciones
transcipcionalmente inactivas no interaccionaron con CBP (TIF2.24,
TIF2.27, TIF2.29 en las figuras 9a-c), mientras que
los mutantes transcripcionalmente activos también se unieron a CBP.
Además, la fuerza de la interacción in vitro con
GST-CBP se correlacionó aparentemente con la
eficacia de la transactivación (figuras 9a-c; por
ejemplo, compárense TIF2.21 y TIF2.31).
Para investigar si la integridad de la región
helicoidal \alpha anfipática se requiere tanto para la actividad
de transcripción de DA1 como la interacción con CBP, se introdujeron
mutaciones puntuales en TIF2.13; se convirtieron los tres restos
hidrófobos conservados Leu o los hidrófilos Asp-Glu
en alaninas [figura 9a; TIF2.13(LLL) y TIF2.13(DQ)].
De forma interesante, la mutación de los tres restos de leucina
suprimió casi completamente la actividad de DA1, mientras que la
mutación de la secuencia Asp-Glu tuvo muy poco
efecto, si tuvo alguno (figura 10a). Una vez más, la actividad de
DA1 y la interacción con CBP in vitro (figura 10c), así como
in vivo (figura 10b), se correlacionaron rigurosamente,
puesto que GAL-TIF2.13 (DQ), que transactivó tan
eficazmente como GAL-TIF2.13 de tipo natural,
interaccionó fuertemente con CBP, mientras que el
GAL-TIF2.13 (LLL) transcripcionalmente inactivo
interaccionó muy débilmente con CBP. Estos resultados juntos indican
que (i) el CBP media la actividad de DA1 de TIF2, (ii) un motivo de
hélice \alpha anfipático supuesto localizado en el dominio DA1
está críticamente implicado en, pero no es suficiente para, la
unión/transactivación eficaz de CBP y (iii) no se requiere la
anfifilicidad de este motivo para actividad de DA1 y unión a
CBP.
Las dos funciones de activación DA1 y DA2 de
TIF2 operan aparentemente a través de cascadas de activación de
transcripción diferentes. Mientras que el dominio de activación DA1
de TIF2 no pudo separarse mediante análisis mutacional del dominio
de TIF2 que interacciona in vitro e in vivo con una
región de la superficie de CBP que también media la unión a
CRE-1 (Kamei, Y. et al., Cell 85:403414
(1996)), ni esta región, ni CBP de longitud completa,
interaccionaron con el DA2 de TIF2. También se sugiere que las dos
funciones de activación de TIF2 puedan operar a través de rutas
distintas mediante la especificidad de células diferenciales de los
fragmentos mínimos que muestran actividad de DA1 (por ejemplo,
TIF2.8, TIF2.7, TIF2.9, TIF2.12) y actividad de DA2 (TIF2.2).
Mientras que el TIF2.2 es más activo en células
Cos-1 que en células HeLa, todos los fragmentos
mínimos que contienen DA1 son más activos en células HeLa. A lo
largo de las mismas líneas, la eliminación en TIF2.3 de secuencias
N-terminales de TIF2.8 dio como resultado un aumento
de transactivación de 10 veces y 2 veces en células HELa y
Cos-1, respectivamente, y la eliminación en TIF2.1
de secuencias C-terminales de TIF2.3 dio una
transactivación 9 veces y 3 veces superior en células HeLa y
Cos-1, respectivamente. Esto sugiere que las
secuencias eliminadas pueden ejercer o bien represión intramolecular
o bien intermolecular de la actividad de DA1 de TIF2/interacción
con CBP. Además, la actividad de coactivador de TIF2 puede modularse
de manera específica para células mediante la eficacia diferencial
de sus dos DA y factores de interacción con las secuencias N- y
C-terminales de la función de activación DA1.
Merece la pena observar que el núcleo de DA1
(TIF2.32) por si mismo es un transactivador y grupo de unión de CBP
muy malo, y requiere secuencias adicionales alrededor para generar
una superficie totalmente activa (es decir, unión a CBP eficaz).
Sin embargo, el análisis mutacional del núcleo de DA1 en el contexto
de un fragmento activador fuerte (TIF2.13) revela la importancia
crítica para la transactivación y unión de CBP in vivo e
in vitro de tres restos de leucina (figura 10). Estas
leucinas pertenecen al motivo LLxLxxxL (SEQ ID NO: 14) conservado
en los tres miembros de la familia del coactivador de TIF2 (figura
9a; Torchia, J. et al., Nature 387:677-684
(1987)) que es distintivo del motivo de la caja de RN LxxLL (SEQ ID
NO:12). Notablemente, aunque estas leucinas están incrustadas en una
hélice \alpha anfipática prevista, la anfifilicidad no se
requiere para la función, puesto que una mutación de restos
hidrófilos (compárense TIF2.13 con TIF2.13 (DQ)) no afecta la
transactivación/unión de CBP.
El TIF2 puede aparentemente satisfacer al menos
dos funciones mediadoras, (i) como un "factor de puente" entre
la función de AF-2 de receptores nucleares y CBP por
medio del dominio de activación DA1 y (ii) como un mediador
transcripcional a través de ruta(s) independiente(s)
de unión de CBP aún desconocida(s) por medio de su función
DA2. Actualmente, no existen pruebas de que el TIF2 pueda tener una
actividad enzimática intrínseca; ninguno de los fragmentos de TIF2
purificados expresados de manera bacteriana, en particular TIF2.1
que se demostró que era totalmente competente en interacciones de
CBP y RN in vitro, mostraron cualquier actividad histona
acetilasa en condiciones en las que GCN5 de levadura purificada
expresada de manera bacteriana era altamente activa (resultados no
publicados).
La observación de que activadores
transcripcionales animales, tales como el RE humano (Metzger, D.
et al., Nature 334:31-36 (1988)), también son
activos en la levadura Saccharomyces cerevisiae demostró que
los principios básicos de la potenciación transcripcional se han
conservado desde la levadura hasta el hombre. Por tanto se
investigó si TIF2 podía potenciar la activación de transcripción
mediante varias construcciones de RN expresados en S.
cerevisiae. Tanto RN como TIF2.1 se expresaron a partir de
plásmidos de tipo multicopia en la cepa de levadura
PL3(\alpha), que contiene un gen indicador URA3 bajo el
control de tres elementos de respuesta a estrógenos
((ERE)_{3}-URA3; Pierrat, B. et al.,
Gene 119:237-245 (1992)).
En levadura, las construcciones de REh\alpha
se expresaron a partir de los siguientes plásmidos basados en
YEp90: HEGO (REh\alpha, YEp90-HEGO, aminoácidos
1-595), HE15 (YEp90-HE15,
aminoácidos 1-282), y HEG19
(YEp90-HEG19, aminoácidos 179-595)
(todo Pierrat, B. et al., Gene 119:237-245
(1992)), HE179-338; Pierrat, B. et al., Gene
143:193-200 (1994)). A partir del plásmido de tipo
multicopia pBL1 de levadura (LeDouarin, B. et al., Nucleic Acids
Res. 23:876-878 (1995b)), que codifica para
fusiones de RE(C) marcadas con epítopos de RE(F), se
expresaron los siguientes plásmidos
RE(C)-RAR(DEF) (pBL1 -RARh\alpha
(DEF), aminoácidos 154-462) y
RE(C)-RXR(DE)(pBLI-RARh(DE),
aminoácidos 205-467) (ambos vom Baur, E. et al.,
EMBO J. 15:110-124 (1996)). Se expresó TIF2 en
levadura a partir del plásmido de tipo multicopia pAS3 (obsequio de
B. LeDouann), que es un derivado de YEp90 que contiene el marcador
LEU2. Se hicieron crecer exponencialmente transformantes
PL3(\alpha) de levadura (Pierrat, B. et al., Gene
119:237-245 (1992)) en presencia o ausencia de
ligando durante aproximadamente cinco generaciones en un medio
selectivo que contiene uracilo. Se prepararon extractos de levadura
y se sometieron a ensayo para determinar la actividad de OMP
descarboxilasa tal como se describió anteriormente (Pierrat, B.
et al., Gene 119:237-245 (1992)).
Tal como se esperaba a partir de estudios
anteriores (Metzger, Nucl. Acids Res. (1992); Pierrat, B.
et al., Gene 119:237-245 (1992); Pierrat, B.
et al., Gene 143:193-200 (1994)) el RE de
longitud completa (HEG0) indujo la actividad de
5'-monofosfato de orotidina descarboxilasa (OMP
descarboxilasa) en una manera dependiente de ligando (figura 11,
carriles 1 y 3). De forma interesante, se potenció adicionalmente la
actividad de transcripción de RE mediante la coexpresión del
fragmento de TIF2.1 (figura 11, compárense los carriles 3 y 4). En
ausencia de hormona, TIF2.1 no tuvo efecto significativo sobre la
activación de transcripción inducida por RE (figura 11, compárense
los carriles 1 y 2). Se observaron esencialmente los mismos
resultados para HEG19 que carece de la región A/B
N-terminal, indicando que TIF2 ejerce su efecto
sobre AF-2 de RE dependiente de ligando (figura 11,
carriles 5-8). Al contrario, ni la actividad de
AF-1 de HE15, (que abarca las regiones A, B y C de
RE; Kumar & Chambon, Cell 145-156
(1988)), ni la actividad de AF-2a de la construcción
HE179-338 (Pierrat, B. et al., Gene
143:193-200 (1994)) se estimularon mediante
coexpresión de TIF2.1 (figura 11, carriles 9-12).
Esto está de acuerdo con los resultados obtenidos en células de
mamíferos, y con la observación de que se requiere un DUL intacto
para que TIF2.1 interaccione con el RE (Voegel, J.J. et al., EMBO
J. 15:3667-3675 (1996)).
TIF2.1 también estimuló la actividad de
AF-2 de la región RXR\alpha(DEF) unida a
ligando en levadura (figura 11, compárense los carriles 19 y 20).
Esta potenciación fue dependiente de ligando; no se observó
activación mediante la región RXR\alpha(DEF) cuando se
coexpresó la quimera de
RE(C)-RXR\alpha(DEF) con TIF2.1 en
ausencia de ligando (figura 11, compárense los carriles 18 y 20). De
nuevo, estas observaciones son paralelas a aquellas realizadas en
células HeLa y Cos-1 (véase la figura 12c).
Sorprendentemente, incluso en ausencia de
ligando y al contrario que las observaciones realizadas con RE y
RAR\alpha, el TIF2.1 potenció de forma muy eficaz la
transactivación mediante el DUL de RAR\alpha (figura 11, carriles
13 y 14). La adición de ácido retinoico aumentó adicionalmente su
activación de transcripción (figura 11, carriles 14 y 16).
Obsérvese que, tal como se notificó previamente (Heery, D.M. et
al., Nature 387:733736 (1997)), AF-2 tanto de
RAR\alpha como de RXR\alpha activaron poco por sí mismos la
transcripción a partir del indicador URA3.
La potenciación de la actividad de
AF-2 que fue particularmente fuerte en células de
levadura, se ha observado también recientemente para GRIP1, el
homólogo de TIF2 de ratones (Hong, H. et al., Mol. Cell.
Biol. 17:2735-2744 (1997)). Estas observaciones
sugieren que las células de levadura contienen coactivadores que
sólo imitan poco la acción de los coactivadores de RN de mamíferos.
Puesto que las células de levadura no contienen aparentemente un
homólogo de CBP, será interesante investigar qué factor de levadura
media la actividad de TIF2. Obsérvese en este respecto que
GAL-TIF2.1 es un transactivador fuerte en levadura
(resultados no publicados).
De forma interesante, la expresión de TIF2 en
levadura condujo a una estimulación marcada de la transactivación
mediante el RE(C)-RAR\alpha(DEF) no
unido a ligando, que no se observó con DUL no unidos a ligando de RE
o RXR\alpha. Estudios estructurales han revelado que la unión del
ligando da como resultado un cambio conformacional del DUL, que
genera la(s) superficie(s) para la unión del
coactivador (Renaud, J.P. et al., Nature
378:681-689 (1995)). El presente resultado, por
tanto, sugiere que un alto nivel de coactivadores puede, en
ausencia de ligando, conducir el DUL de algunos receptores a una
conformación de tipo holo-DUL, dando lugar así a
actividad de transcripción independiente de ligando. Por analogía,
puede especularse que altos niveles de correpresores pueden
"bloquear" DUL de RN en la conformación
apo-DUL. Por tanto, sería interesante investigar si
niveles de correguladores podrían conducir a actividad constitutiva
(incluso en la presencia de antagonistas) o por el contrario a la
falta de capacidad de inducción de receptores nucleares en algunos
estados patológicos.
La sobreexpresión del fragmento de TIF2.1, que
contiene la función de activación tanto de DIN como de DA1,
estimula la actividad de AF-2 de RE del DUL de RE de
forma transitoria en células Cos-1 (figura 12a,
carriles 2 y 3; Voegel, J.J. et al., EMBO J.
15:3667-3675 (1996)). Se sugirió firmemente que esta
estimulación se debió a la interacción directa entre el DUL de RE y
el DIN de TIF2, mediante la observación de que la sobreexpresión
del mutante de TIF2.5 que contiene el DUL aislado, pero que carece
de DA1 (véase la figura 7a) impidió el efecto estimulante de TIF2.1
(figura 12a, compárense los carriles 3 y 4). Obsérvese que en
ausencia de TIF2.1, la sobreexpresión de TIF2.5 también disminuyó
la transactivación por el AF-2 de RE, que se medió,
presumiblemente, a través de coactivadores endógenos de
Cos-1 (figura 12a, compárense el carril 4 con el
carril 2), sugiriendo así que estos mediadores de
Cos-1 correspondían o bien a TIF2 endógenos, o
interaccionaban con el holo-DUL de RE a través de
superficies que son idénticas a, o en proximidad directa de, la
superficie de interacción de DIN de TIF2.
Se notificó previamente una interacción
dependiente de agonista de TIF2 con DUL de RAR y RXR, que era
dependiente de la integridad del núcleo del DA de
AF-2 de RN, pero no consiguió observarse un efecto
estimulante de TIF2 sobre la activación de transcripición de un
indicador (17m)_{5}-promotor de
globina-CAT mediante proteínas de fusión de DUL de
GAL-RAR o GAL-RXR (Voegel, J.J.
et al., EMBO J. 15:3667-3675 (1996)). Puesto
que este fracaso se debió posiblemente a la presencia de cantidades
suficientes de mediadores endógenos para alcanzar la
transactivación máxima a partir de este gen indicador, se
modificaron las condiciones de transfección y se utilizó una
construcción indicadora que llevaba un promotor mínimo. Se observó
una actividad estimulante clara de TIF2 y TIF2.1 para AF2 de
RXR\alpha en células HeLa y Cos-1 cuando se usó el
indicador (17m)_{5}-
TATA-CAT (figura 12c, compárense los carriles 3-6 y 11-14). Este efecto estimulante fue menos marcado con AF-2 de RAR\alpha y pudo observarse reproducibilidad solo con el fragmente de TIF2.1 en células Cos-1 (figura 12d, compárense el carril 10 con los carriles 13 y 14; obsérvese que TIF2.1 se expresa a niveles > 10 veces superiores a TIF2; datos no mostrados). Los plásmidos indicadores (17m)_{5}-TATA-CAT (May, M. et al., EMBO J. 15:3093-3104 (1996)) y 17M5-G/CAT ((17m)_{5}-\beta-globina-CAT; Durand, B. et al., EMBO J.13:5370-5382 (1994)) contienen cada uno cinco copias del elemento de respuesta de GAL4 delante de un motivo sencillo TATA o del promotor de \beta-globina, respectivamente, en sentido 5' del gen indicador CAT.
TATA-CAT (figura 12c, compárense los carriles 3-6 y 11-14). Este efecto estimulante fue menos marcado con AF-2 de RAR\alpha y pudo observarse reproducibilidad solo con el fragmente de TIF2.1 en células Cos-1 (figura 12d, compárense el carril 10 con los carriles 13 y 14; obsérvese que TIF2.1 se expresa a niveles > 10 veces superiores a TIF2; datos no mostrados). Los plásmidos indicadores (17m)_{5}-TATA-CAT (May, M. et al., EMBO J. 15:3093-3104 (1996)) y 17M5-G/CAT ((17m)_{5}-\beta-globina-CAT; Durand, B. et al., EMBO J.13:5370-5382 (1994)) contienen cada uno cinco copias del elemento de respuesta de GAL4 delante de un motivo sencillo TATA o del promotor de \beta-globina, respectivamente, en sentido 5' del gen indicador CAT.
Asumiendo que TIF2 o coactivadores que reconocen
la superficie de interacción de TIF2 en DUL de RN, median
generalmente la función AF2 de RN, el TIF2.5 que contiene DIN debe
ejercer su actividad negativa dominante no sólo sobre RE, sino
también sobre otros RN, independientemente del contexto celular. Se
analizó por tanto el efecto de TIF2.5 sobre la actividad de
AF-2 de RE, RXR\alpha y RAR\alpha en células
HeLa y Cos-1 (figuras 12b-d). En
todos los casos, la expresión de TIF2.5 condujo a una inhibición de
la actividad de AF-2 de RN dependiente de la dosis,
indicando que los mediadores presentes de manera endógena estaban en
competición con DUL de TIF2 sobreexpresado aislado, sugiriendo
firmemente que los factores intermediarios de transcripción o TIF2
que reconocen superficies iguales o de solapamiento median la
actividad de AF-2 de RN en estas células
transfectadas (figuras 12b-d, compárese el carril 2
con los carriles 7 y 8; carril 10 con carriles 15 y 16).
Es importante enfatizar que los presentes datos
demuestran que TFI2 interacciona con RN a través de una superficie
(DIN) que es crítica para la actividad de AF-2 de
RN, ya que la expresión de TIF2.5 que abarca el DIN bloqueó la
actividad inducida por ligandos para todas las AF-2
de RN examinadas. Esta observación que establece claramente que, al
menos en células transfectadas, TIF2 u otros coactivadores que
interaccionan con una superficie holo-DUL de
solapamiento, si no idéntica, son esenciales para mediar la función
de activación de AF-2 de RN. Esto es manteniendo la
presencia de tres motivos de caja RN en el DIN de TIF2, y de al
menos un motivo de caja RN LxxLL conservado (SEQ ID NO:12) en todos
los coactivadores descritos hasta la fecha.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: INSTITUT NATIONAL DE LA SANTÉ ET DE LA RECHERCHE MÉDICALE
\hskip1.5cm101 rue de Tolbiac
\hskip1.5cm75654 Paris Cedex 13
\hskip1.5cmFrancia
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1.5cmCENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
\hskip1.5cm3 rue Michel Ange
\hskip1.5cm75794 Paris Cedex 16
\hskip1.5cmFrancia
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1.5cmUNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR
\hskip1.5cm4 rue Blaise Pascal, BP 1032F
\hskip1.5cm67070 Strasbourg Cedex
\hskip1.5cmFrancia
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1.5cmBRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY
\hskip1.5cmRoute 206 & Provinceline Road
\hskip1.5cmPrinceton, New Jersey 08543-4000
\hskip1.5cmEstados Unidos de América
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1.5cmINVENTORES: Chambon, Pierre
\hskip3.9cmGronemeyer, Hinrich
\hskip3.9cmVoegel, Johannes
\hskip3.9cmLutz, Yves
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Factor intermediario de transcripción 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 14
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Sterne, Kessler, Goldstein & Fox P.L.L.C.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1100 New York Avenue, NW, Suite 200
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Washington
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: DC
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- Código postal: 20005-3934
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM Compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.3
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: Por asignar
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: Adjunta
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/021.247
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 12-JUL-1996
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Steffe, Eric K.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 36.688
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 1383.01PC01/EKS
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN SOBRE COMUNICACIONES TELEFÓNICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 202-371-2600
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 202-371-2540
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6156 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 163..4554
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1464 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1036 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Arg Ala Asp Gly Gln Ser Arg Leu His Asp
Ser Lys Gly Gln Thr}
\sac{Lys Leu Leu Gln Cys}
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly His Lys Lys Leu Leu Gln Leu Leu Thr Cys
Ser Ser His Gly Ser}
\sac{Leu Leu Gln Glu Lys His Arg Ile Leu His
Lys Leu Leu Gln Asn Gly}
\sac{Asn Asn Ala Leu Leu Arg Tyr Leu Leu Asp
Arg Asp Asp Pro Ser Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ser Ile Leu Thr Ser Leu Leu Leu Asn Ser
Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Asn Val Leu Lys Gln Leu Leu Leu Ser Glu
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ala Thr Leu Arg Ser Leu Leu Leu Asn Pro
His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 58 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 64 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGAGGACAG TCCTCCGGCG GCCGCGGTCA CAGTGACC
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Xaa Xaa Leu Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Xaa Xaa Leu Leu Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Leu Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Leu}
Claims (16)
1. Un Polinucleótido seleccionado del grupo que
consisten en:
(a) un polinucleótido que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica para los aminoácidos 1 a 1464
de SEQ ID NO:2;
(b) un polinucleótido que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de
aminoácidos según codificada por el ADNc que codifica para un
polipéptido TIF2 que tiene actividad de TIF2 que es la unión al
dominio de unión a ligando de un receptor nuclear contenido en el
número de registro 97612 de la ATCC;
(c) un polinucleótido que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica para un fragmento citoplásmico
de un polipéptido codificado por un polinucleótido de uno cualquiera
de (a) a (b), en el que dicho fragmento citoplásmico tiene la
actividad que es la unión al dominio de unión a ligando de un
receptor nuclear;
(d) un polinucleótido que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica para los aminoácidos 624 a
1287 de SEQ ID NO:2;
(e) un polinucleótido que comprende una
secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 163 a 4554
ó 2032 a 4023 de SEQ ID NO:1;
(f) un polinucleótido que comprende una
secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos un 90%
con la secuencia de nucleótidos de uno cualquiera de los
polinucleótidos de (a) a (e), en el que dicho polinucleótido
codifica para un polipéptido que tiene actividad de TIF2 que es la
unión al dominio de unión a ligando de un receptor nuclear;
(g) un polinucleótido que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de
aminoácidos idéntica en al menos un 90% a la secuencia de
aminoácidos de un polipéptido codificado por un polinucleótido de
uno cualquiera de (a) a (e), en el que dicho polinucleótido codifica
para un polipéptido TIF2 que tiene actividad de TIF2 que es la unión
al dominio de unión a ligandos de un receptor nuclear;
(h) un polinucleótido que consisten en una
secuencia de nucleótidos que codifica para los restos de aminoácidos
624 a 1287 de SEQ ID NO:2;
(i) un polinucleótido que consiste en una
secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos un 90%
con la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de (h), en el que
dicho polinucleótido codifica para un polipéptido TIF2 que tiene
actividad de TIF2 que es la unión al dominio de unión a ligando de
un receptor nuclear;
(j) un polinucleótido que consiste en una
secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de
aminoácidos idéntica en al menos un 90% a la secuencia de
aminoácidos de un polipéptido codificado por un polinucleótido de
(h), en el que dicho polinucleótido codifica para un polipéptido
TIF2 que tiene actividad de TIF2 que es la unión al dominio de unión
a ligando de un receptor nuclear;
(k) un polinucleótido que consiste en una
secuencia de nucleótidos que tiene 500 nucleótidos de SEQ ID NO:1;
y
(l) un polinucleótido que tiene una secuencia de
nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de
cualquiera de los polinucleótidos de (a) a (k).
2. El polinucleótido de la reivindicación 1 que
es ADN o ARN.
3. El ADN de la reivindicación 2 que es ADN
genómico.
4. Un método para preparar un vector
recombinante que comprende insertar un polinucleótido de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en un vector.
5. Un vector que contiene el polinucleótido de
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o producido mediante el
método de la reivindicación 4.
6. El vector de la reivindicación 5 en el que el
polinucleótido está operativamente unido a las secuencias de control
de la expresión permitiendo la expresión en células huésped
procariotas o eucariotas.
7. Un método para preparar una célula huésped
recombinante que comprende introducir el vector de la reivindicación
5 ó 6 en una célula huésped.
8. Una Célula huésped modificada genéticamente
con el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
3 o el vector de la reivindicación 5 ó 6 o producida mediante el
método de la reivindicación 7.
9. Un procedimiento para producir un polipéptido
de TIF2 que comprende: cultivar la célula huésped de la
reivindicación 8 y recuperar el polipéptido codificado por dicho
polinucleótido a partir del cultivo.
10. Un polipéptido que tiene la secuencia de
aminoácidos codificada por un polinucleótido de una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3 u obtenible mediante el procedimiento de
la reivindicación 9.
11. Un anticuerpo que se une específicamente al
polipéptido de la reivindicación 10.
12. Un método de selección para identificar un
antagonista del receptor nuclear (RN), que comprende:
(a) proporcionar una célula huésped que contiene
genes recombinantes que expresan un polipéptido que comprende un
dominio de unión a ligandos (DUL) de RN y un polipéptido que
comprende el factor intermediario de transcripción-2
(TIF-2) de SEQ ID NO:2 o un fragmento de TIF2, en el
que, en presencia de un agonista, dicho TIF-2 y
dicho fragmento de TIF-2 se unen a dicho DUL de
RN;
(b) administrar un antagonista candidato a dicha
célula; y
(c) determinar si dicho antagonista candidato
reduce o bien:
- (1)
- la unión de TIF-2 o del fragmento de TIF-2 a la función de activación 2 (AF-2) de dicho DUL de RN comparado con dicha unión en ausencia de dicho antagonista candidato; o bien
- (2)
- la transactivación mediada por AF-2 de DUL de RN estimulada por TIF-2 o por fragmento de TIF-2 comparado con dicha transactivación en la ausencia de dicho antagonista candidato.
13. Un método de selección para identificar un
agonista de receptor nuclear (RN), que comprende:
(a) proporcionar una célula huésped que contiene
genes recombinantes que expresan un polipéptido que comprende un
dominio de unión a ligandos (DUL) de RN y un polipéptido que
comprende un factor intermediario de transcripción-2
(TIF2) de la SEQ ID NO:2 o un fragmento de TIF-2, en
el que, en presencia de un agonista, dicho TIF-2 y
dicho fragmento de TIF2 se unen a dicho DUL de RN;
(b) administrar un agonista candidato a dicha
célula; y
(c) determinar si dicho agonista candidato
potencia o bien
- (1)
- la unión de TIF-2 o fragmento de TIF-2 a la función de activación 2 (AF-2) de dicho DUL de RN comparado con dicha unión en ausencia de dicho agonista candidato; o bien
- (2)
- la transactivación mediada por AF-2 de DUL de RN estimulada por TIF-2 o por fragmento de TIF-2 comparado con dicha transactivación en ausencia de dicho candidato agonista.
14. El método de la reivindicación 12 ó 13, en
el que dicha célula huésped expresa además un gen indicador.
15. El método de la reivindicación 12 ó 13, en
el que dicha célula huésped expresa un polipéptido que comprende un
DUL de RN y GAL4.
16. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 15, en el que dicha unión de
TIF-2 o de fragmento de TIF-2 a
dicha AF-2 de dicho DUL de RN se determina usando un
ensayo de interacción de
glutatión-S-transferasa (GST).
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US2124796P | 1996-07-12 | 1996-07-12 | |
US21247P | 1996-07-12 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2281105T3 true ES2281105T3 (es) | 2007-09-16 |
Family
ID=21803168
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES07101726T Expired - Lifetime ES2354379T3 (es) | 1996-07-12 | 1997-07-11 | Factor intermediario transcripcional 2. |
ES97932575T Expired - Lifetime ES2281105T3 (es) | 1996-07-12 | 1997-07-11 | Factor intermediario de transcripcion-2 tif2. |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES07101726T Expired - Lifetime ES2354379T3 (es) | 1996-07-12 | 1997-07-11 | Factor intermediario transcripcional 2. |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6268173B1 (es) |
EP (2) | EP0939810B1 (es) |
AT (2) | ATE353364T1 (es) |
DE (2) | DE69740057D1 (es) |
DK (2) | DK0939810T3 (es) |
ES (2) | ES2354379T3 (es) |
WO (1) | WO1998002455A2 (es) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0939810B1 (en) | 1996-07-12 | 2007-02-07 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Transcriptional intermediary factor-2 tif2 |
GB2337329B (en) * | 1997-04-30 | 2001-09-05 | Imp Cancer Res Tech | Inhibitors of nuclear protein/nuclear receptor interaction |
GB9708676D0 (en) * | 1997-04-30 | 1997-06-18 | Imp Cancer Res Tech | Chemical compounds |
AU1801099A (en) * | 1997-12-22 | 1999-07-12 | American Home Products Corporation | Nucleic acid sequences encoding nuclear receptor coactivator proteins and uses thereof |
JP4942904B2 (ja) | 2000-06-20 | 2012-05-30 | 中外製薬株式会社 | zincフィンガードメインを有する新規転写因子 |
DE10046647A1 (de) * | 2000-09-20 | 2002-03-28 | Ludwig Wildt | Verfahren zur Bestimmung der Peptidhormon-Aktivitäten oder der Steroidhormon-Aktivitäten eines Materials oder Stoffgemisches |
US6355483B1 (en) * | 2000-11-27 | 2002-03-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisenses inhibition of SRC-2 expression |
US20050202515A1 (en) * | 2004-02-27 | 2005-09-15 | Wyeth | Functional method for generating or screening for ligands which modulate steroid hormone receptors |
EP2038301A4 (en) * | 2006-07-12 | 2010-01-20 | Oncotx Inc | COMPOSITIONS AND METHODS OF TARGETING CANCER-SPECIFIC TRANSCRIPTION COMPLEXES |
US10106406B2 (en) | 2013-11-06 | 2018-10-23 | Watt Fuel Cell Corp. | Chemical reactor with manifold for management of a flow of gaseous reaction medium thereto |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
JPS6147500A (ja) | 1984-08-15 | 1986-03-07 | Res Dev Corp Of Japan | キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
EP0173494A3 (en) | 1984-08-27 | 1987-11-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Chimeric receptors by dna splicing and expression |
GB8422238D0 (en) | 1984-09-03 | 1984-10-10 | Neuberger M S | Chimeric proteins |
JPS61134325A (ja) | 1984-12-04 | 1986-06-21 | Teijin Ltd | ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法 |
JPH06510363A (ja) * | 1990-10-29 | 1994-11-17 | ディカルブ プラント ジェネティクス | 磁気性粒子を使用する生物学的材料の単離 |
US5840832A (en) | 1994-10-21 | 1998-11-24 | The Johns Hopkins University | Transcription factor regulating MHC expression, CDNA and genomic clones encoding same and retroviral expression constructs thereof |
EP0939810B1 (en) | 1996-07-12 | 2007-02-07 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Transcriptional intermediary factor-2 tif2 |
IT1395574B1 (it) | 2009-09-14 | 2012-10-16 | Guala Dispensing Spa | Dispositivo di erogazione |
-
1997
- 1997-07-11 EP EP97932575A patent/EP0939810B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-11 DE DE69740057T patent/DE69740057D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-11 AT AT97932575T patent/ATE353364T1/de active
- 1997-07-11 ES ES07101726T patent/ES2354379T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-11 US US08/891,640 patent/US6268173B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-11 DE DE69737326T patent/DE69737326T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-11 DK DK97932575T patent/DK0939810T3/da active
- 1997-07-11 DK DK07101726.3T patent/DK1865060T3/da active
- 1997-07-11 AT AT07101726T patent/ATE488589T1/de active
- 1997-07-11 EP EP07101726A patent/EP1865060B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-11 ES ES97932575T patent/ES2281105T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-11 WO PCT/US1997/012100 patent/WO1998002455A2/en active IP Right Grant
-
2001
- 2001-04-26 US US09/842,256 patent/US6861508B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0939810A2 (en) | 1999-09-08 |
ATE488589T1 (de) | 2010-12-15 |
US6861508B2 (en) | 2005-03-01 |
DK0939810T3 (da) | 2007-04-10 |
EP0939810B1 (en) | 2007-02-07 |
ATE353364T1 (de) | 2007-02-15 |
ES2354379T3 (es) | 2011-03-14 |
WO1998002455A3 (en) | 1999-04-08 |
WO1998002455A2 (en) | 1998-01-22 |
DE69737326T2 (de) | 2007-11-22 |
US6268173B1 (en) | 2001-07-31 |
EP1865060A1 (en) | 2007-12-12 |
DE69740057D1 (de) | 2010-12-30 |
US20020106727A1 (en) | 2002-08-08 |
DK1865060T3 (da) | 2011-03-07 |
DE69737326D1 (de) | 2007-03-22 |
EP1865060B1 (en) | 2010-11-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8003347B2 (en) | Nucleic acids encoding ChemerinR ligands | |
US7723501B2 (en) | Bag proteins and nucleic acid molecules encoding them | |
US20060024750A1 (en) | Compositions and methods comprising a ligand of Chemerin R | |
de Bruijn et al. | The cancer‐related protein SSX2 interacts with the human homologue of a Ras‐like GTPase interactor, RAB3IP, and a novel nuclear protein, SSX2IP | |
JP2001517439A (ja) | 53bp2複合体 | |
ES2281105T3 (es) | Factor intermediario de transcripcion-2 tif2. | |
US7982002B2 (en) | Nucleic acid encoding proteins involved in protein degradation, products and methods related thereto | |
ES2240997T3 (es) | Compresor de transcripcion que interactua con los receptores nucleares de las hormonas, y sus utilizaciones. | |
US20080038248A1 (en) | Proteins Ligands For Nkg2d And Ul16 Receptors And Uses Thereof | |
Bogaerts et al. | Nuclear translocation of αN-catenin by the novel zinc finger transcriptional repressor ZASC1 | |
US8030453B2 (en) | Methods of making an antibody that binds a chemerin polypeptide | |
US7312066B2 (en) | Nucleic acid molecules encoding NRC interacting factor-1 (NIF-1) | |
CA2319782A1 (en) | Retinoblastoma protein complexes and retinoblastoma interacting proteins | |
WO2000065052A9 (en) | Bridge-1, a transcription factor | |
EP1371662A1 (en) | Novel variant of the cellular receptor LXR alpha | |
US7041783B2 (en) | Survivin-binding proteins, encoding nucleic acids, and methods of use | |
JP2005160473A (ja) | 絨毛外栄養膜細胞特異的蛋白質 | |
EP1371661A1 (en) | Variants of the Constitutive Activated of Retinoid acid response receptor (CAR) in its ligand binding domain (LBD) | |
Vosatka | c-fos protein: Dynamic interactions with the p39 protein | |
JP2009031307A (ja) | 絨毛外栄養膜細胞特異的蛋白質 | |
WO2002070697A1 (en) | Mammalian nuclear receptor l67 and methods of use |