DE10046647A1

DE10046647A1 - Verfahren zur Bestimmung der Peptidhormon-Aktivitäten oder der Steroidhormon-Aktivitäten eines Materials oder Stoffgemisches

Info

Publication number: DE10046647A1
Application number: DE10046647A
Authority: DE
Inventors: Axel Allera; Ludwig Wildt
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-09-20
Filing date: 2000-09-20
Publication date: 2002-03-28
Also published as: WO2002025278A2; AU2002213808A1; US20040023264A1; EP1325327A2; DE10194024D2; WO2002025278A3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Peptidhormon-Aktivitäten oder der Steroidhormon-Aktivitäten eines Materials oder Stoffgemischs, gekennzeichnet durch Vorlegen mindestens einer Ausgangszelle mit oder ohne endogene Peptidhormom-Rezeptoren oder Steroidhormon-Rezeptoren, Transfektion der Zelle mit einem spezifischen rekombinanten Reportergen-Konstrukt, das die Fähigkeit besitzt, ein durch die Hormon-Aktivität des Materials induziertes meßbares Produkt zu exprimieren, Einbringen eines zu untersuchenden Materials in die transfizierte Zelle und Herstellung eines leicht bestimmbaren Signal-gebenden Reportergen-Translationssprodukts durch die transfizierte Zelle mittels der induktiven Wirkung des Materials auf den dem Reportergen vorgeschalteten Hormon-reaktiven Promotor und Messen des Reportergen-Translationsprodukts der transfizierten Zelle und Bestimmen der Hormon-Aktivität des Materials aus dem Meßergebnis. Die Erfindung betrifft ebenfalls einen Bestimmungs-Assay für die Hormon-Aktivität von Material, dadurch gekennzeichnet, daß es transfizierte Zellen aufweist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Qualifizierung und Quantifizierung von agoni stischen und antagonistischen Hormon-Aktivitäten eines Materials, einen Bioassay, sowie die Verwendung desselben.

Hormone sind bioaktive Signalmoleküle, die in spezialisierten, sog. endokrinen Zellen eines jeden Organismus synthetisiert, i. d. R. in das Blut abgegeben werden und be stimmte biologische Effekte auslösen, indem sie hochaffin und hochspezifisch an Rezeptoren von Zielzellen reversibel binden; dadurch wird das Hormonsignal in die Zelle weitergeleitet. Neben den Peptidhormonen (z. B. Insulin, Schilddrüsenhormone, Adrenalin) sind die Steroidhormone, wozu hauptsächlich die Glucocorticoide, Minera locorticoide, Androgene (incl. androgene Anabolika, "Dopingmittel"), Östrogene und Gestagene gehören, die wichtigsten Hormone für fast alle Lebewesen. Sie regeln Wachstum, körperliche Ausbildung und sind unentbehrlich für Ablauf und Aufrech terhaltung lebenswichtiger physiologischer und biologischer Funktionen, z. B. der Reproduktion.

Die Konzentrationsbestimmung der verschiedenen Peptid- und Steroidhormone - natürlichen und synthetischen -, im Serum und anderen Körperflüssigkeiten von Pati enten ist diagnostisch von großer Bedeutung. Sie gehört zum klinischen Alltag, da sie bei vielen gesundheitlichen Störungen und Krankheiten therapeutisch und auch zur Regulation physiologischer Prozesse (z. B. die "Antibabypille") eingesetzt werden. Auch wird mit gewissen Steroiden erheblicher Mißbrauch getrieben, z. B. mit den zahl reichen synthetischen, als Anabolika wirkenden Androgenabkömmlingen, die von vie len Hochleistungssportlern als Dopingmittel eingenommen werden; daher dient ihr Nachweis im Serum zur Dopingkontrolle.

Schließlich werden Steroide in nicht unerheblichen Mengen bei der Tiermast einge setzt - es ist daher auch wichtig, schnell und problemlos feststellen zu können ob diese meist unerlaubten Mittel eingesetzt wurden und dann in den menschlichen Ver zehr gelangen.

Bezüglich der biologischen Aktivität - sowohl als Agonisten als auch als Antagonisten - von Peptid- oder Steroidhormon-aktiven Material muß berücksichtigt werden, daß nicht nur Peptidhormone und Steroidhormone im eigentlichen Sinne biologisch wirken, also - chemisch definiert - Aminosäuren-Oligo- und Polymer-, bzw. Cyclopentanoperhydro phenanthren-Derivate. Oft sind auch Substanzen wirksam, die nur teilweise oder gar nicht diesen chemischen Stoffklassen entsprechen, aber dennoch offensichtlich an die entsprechenden Hormon-Rezeptoren binden.

Die biologische Wirkung derartiger Materialien ist ebenfalls äußerst wichtig, kann sie doch z. B. zu grundlegenden Problemen in der biologischen Signalkette führen, wie durch verschiedene Weichmacher, Pestizide etc. bekannt. Von besonderer Bedeutung sind hierbei zahlreiche Stoffe aus der natürlichen und technischen Umwelt, die Östro gen-aktiv sind, obwohl sie chemisch nicht zu den Steroiden gehören; einzelne Kompo nenten in Stoffgemischen können sogar, in Kombination, synergistisch wirken. Es ist daher ebenfalls äußerst erwünscht, die hormonelle Aktivität derartiger Materialien bereits im Vorfeld - vor dem Einsatz - oder solcher schon im Einsatz befindlichen Stoffe erkennen zu können.

Obwohl die Erfindung beispielhaft anhand der Bestimmung der biologischen Wirkung von Steroidhormonen, insbesonders von Glucocorticoid-, Androgen- und Östrogen- aktiven Steroiden, nachfolgend näher erläutert wird, ist zu berücksichtigen, daß sie keinesfalls auf Steroidhormone beschränkt ist, sondern allgemein für die Bestimmung der Steroid- und Peptidhormon-typischen Wirkungen von Materialien einsetzbar ist.

Es ist von vielen Stoffen, insbesondere auch Hormonen, bekannt, daß ihre biologische Aktivität mit der absoluten Konzentration derselben nicht unbedingt gleichzusetzen ist. Häufig sind Teilmengen dieser Stoffe durch Komplexe mit Proteinen oder dgl. oder aber durch Annahme einer anderen Konfiguration inaktiviert oder auch stärker aktiv; z. B. ist von den Schilddrüsenhormonen bekannt, daß diese je nach Bindung an Pro teine unterschiedlich wirksam sind. Andere Einflüsse - z. B. der pH-Wert oder Metall ionen können ebenfalls die Wirkung von Materialien im menschlichen oder tierischen Körper stark beeinflussen. Somit muß zwischen "freien" und "gebundenen" Hormonen und ihren Bestandteilen unterschieden werden, die sodann die Aktivität bestimmen.

Entscheidend bei der Ermittlung eines sog. Hormonstatus und ggf. seiner Dynamik sowie der daraus folgenden diagnostischen und therapeutischen Konsequenzen ist also nicht die Menge oder Konzentration der jeweiligen Peptid- oder Steroidhormone, sondern ihre Aktivität, also Art und Ausmaß der biologischen Wirkung, die z. B. durch die Dissoziationskonstanten von Ligand-Rezeptor-Komplex, aber auch durch viele andere Faktoren, etwa das Vorliegen von Transportproteinen etc., beeinflußt wird.

Zum besseren Verständnis der Erfindung und beispielhaft soll zunächst das Wirkprin zip der Steroidhormone erläutert werden. Diese vermitteln ihre Wirkung maßgeblich über für die jeweiligen Steroidhormon-Klassen spezifischen Rezeptoren, die nach herr schender Lehrmeinung sich innerhalb der Zielzellen befinden. (Die Rezeptoren für Peptidhormone sind dagegen auf oder in der Zellmembran, also der Zellaußenhülle lokalisiert). Sie bilden dabei einen sehr bindungsfesten Rezeptor-Steroid Komplex. Diese Komplexbildung ist ein wesentliches Glied in der hormonabhängigen Signal kette, welche zum hormonspezifischen Effekt führt (s. u.). Beispiele für Steroidhormon rezeptoren sind - wobei diese Aufzählung keineswegs einschränkend ist, sondern nur der Erläuterung dienen soll: der Glucocorticoidrezeptor (GR), der das Glucocorticoid Cortisol bindet; der Androgenrezeptor (AR), der das männliche Geschlechtshormon Testosteron sowie diverse synthetische Steroidhormon-Analoga, wie Anabolika, bin det; die Östrogenrezeptoren - ERα und ERβ - die das weibliche Geschlechtshormon Östradiol, aber auch synthetische Östrogene (z. B. Komponenten der "Anti-Babypille") und andere Stoffe mit östrogener Aktivität binden; der Mineralocorticoidrezeptor (MR) und der Progesteronrezeptor (PR), welcher Aldosteron bzw. natürliche sowie synthe tische Gestagene erkennt. Die Bindung des Steroids an den Rezeptor bewirkt, daß dieser zum Zellkern wandert und sich an spezifische DNA-Abschnitte des Zellkerns bindet, die "hormone responsive elements" (HRE) genannt werden. Diese HRE, Bestandteile eines sog. Promoters, aktivieren nun lokal daran anschließende Gene (die als HRE-"downstream"-Gene bezeichnet werden), welche für spezifische Proteine (z. B. Enzyme) codieren und deren Bildung induzieren. So veranlaßt z. B. das Steroid hormon Cortisol in der Leberzelle die Bildung des essentiellen Enzyms Tyrosinami notransferase; das Östradiol die des PR oder die von Transcortin (unentbehrliches Transportprotein für Glucocorticoide im Blut).

Erstaunlicherweise wird allgemein - u. a. in der klinischen Diagnostik und der Doping kontrolle - z. Zt. nur die Konzentration der Steroidhormone bzw. der Anabolika bestimmt; die Bestimmung der Aktivität derartiger Steroidhormone war bisher nicht üblich und entsprechende Bestimmungsmethoden sind unbekannt, obwohl sie biolo gisch/medizinisch viel sinnvoller sind als die o. a. gängige Praxis.

Von Burdge C. B. et al.: "Determination of oestrogen concentrations in bovine plasma by a recombinant oestrogen receptor-reporter gene yeast bioassay", Analyst, 123 (1998), 2585-2588, wurde vorgeschlagen, mittels einer Hefezellinie, stabil transfiziert mit einem Östrogenrezeptor-Galactosidase Reportergenkonstrukt, Östrogenkonzen trationen im Serum von Rindern zu bestimmen ("Recombinant Cell Yeast Bioassay- RCBA"). Auch hier wird, wie in der allgemeinen klinischen Diagnostik üblich, nur die Konzentration eines einzigen Steroidhormons, nämlich von 17β-Östradiol, bestimmt.

Es ist Aufgabe der Erfindung, Mittel zur Bestimmung von Hormon-Aktivitäten eines Materials anzugeben.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruches 1 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen ergeben sich aus den ab hängigen Ansprüchen. Ferner betrifft die Erfindung auch ein Bestimmungs-Assay für die Hormonaktivitäten von Materialien nach Patentanspruch 9.

Es wird also durchgeführt:

1. Auswahl und Vorlegen einer geeigneten Zelle - entweder
- a) mit endogenem Hormon-Rezeptor, die transient oder stabil mono- oder ko-tran fiziert wird mit einem rekombinanten Hormon-sensitiven Reportergen-Konstrukt (Reporter-Expressionsplasmid), bzw. zusätzlich mit einem rekombinanten spezifischen Hormon-Rezeptor Expressionsplasmid, oder
- b) ohne endogenen Hormon-Rezeptor, die transient oder stabil ko-tranfiziert wird mit einem rekombinanten Hormon-sensitiven Reportergen-Konstrukt und einem rekombinanten spezifischen Hormon-Rezeptor Expressionsplasmid, die dann - im Falle a) oder b) - als transfizierte Zelle ein signalgebendes, leicht meßbares Produkt exprimieren kann.
2. Einbringen eines Materials oder Materialgemisches mit bekannter oder vermuteter Hormonaktivität in die transfizierte Zelle, i. d. R durch Zugabe zum Zellkultur- Medium.
3. Durch das Material und mittels des Hormon-Rezeptors bewirkte Induktion des signalgebenden Reportergen-Translationsprodukts der Zelle.
4. Messen des o. a. Produkts, ggfs. nach geeigneter Aufbereitung der transfizierten Zellen in an sich bekannter Weise.
5. Analyse: die Menge des gebildeten ( = induzierten) Translationsprodukts ist direkt proportional zur Stärke der jeweiligen Hormonaktivität des untersuchten Materials.

Im Zusammenhang mit dieser Anmeldung bedeutet transiente Transfektion das Ein bringen von Fremd-DNA in die Zelle, entweder in ihr Cytoplasma und nur für die Dauer eines Zellzyklus, stabile Transfektion bedeutet das dauerhafte Einbringen von Fremd- DNA in ihr Genom. Als Vehikel dienen i. d. R. gentechnisch veränderte (rekombinante) Plasmide ("cloning vectors"), welche die genetische Bauanweisung für das ge wünschte Reporter-Protein oder den spezifischen Hormon-Rezeptor enthalten. Vorge schaltet ist diesen Genen jeweils ein bestimmter Promoter. Dieser kann entweder ein konstitutiver Promoter (z. B. mit SV40 oder Tk (Thymidinkinase) im Rezeptor-Expressi onsplasmid) sein, der permanente Expression, oder ein induzierbarer Promoter sein (z. B. mit HRE im Reporter-Expressionsplasmid), der anregbare (z. B. durch ein Hor mon) Expression des nachgeschalteten (Fremd-)Gens bewirkt.

Da hohe Transfektionseffizienz eine wichtige Bedingung für verläßliche Anwendung der Erfindung bedeutet, ist dem Fachmann offensichtlich, daß ein möglichst effektives Transfektionsverfahren eingesetzt werden sollte. Z. Zt. ist die bevorzugte, sehr effek tive Transfektionsmethode die sog. "Non-Recombinant Adenovirus-Polylysine"- Technik. Sie ist, z. B., veröffentlicht von Sommer B. et al.: "Efficient gene transfer into normal human skeletal cells using recombinant adenovirus and conjugated adenovirus- DNA complexes", Calcif. Tissue Int., 64 (1999), 45-49. Diese Methode ist insbes. an gezeigt bei der Transfektion von ausdifferenzierten eukaryontischen Zelten mit endo genem Hormon-Rezeptor gemäß Punkt 1.a), da diese, im Gegensatz zu den in Punkt 1.b) definierten Zellinien ohne endogenen Hormon-Rezeptor, mit konventionellen Transfektionstechniken nicht hinreichend effektiv transfizierbar sind. Vorteilhafterweise ist dieses Verfahren z. Zt. genrechtlich nur S1-pflichtig, im Gegensatz zur S2-Pflichtigkeit der "Recombinant Adenovirus"-Transfektionstechnik.

Das Prinzip der Erfindung sei beispielhaft, jedoch nicht einschränkend, für Materialien mit Steroidhormon-Aktivität erläutert. Die hormonaktive Komponente(n) des Materials, im folgenden "Ligand" genannt, bildet nach Einbringen in die transfizierte Zelle - (z. B. durch Zugabe des Materials in das Zellkulturmedium) - mit dem endogenen und/oder rekombinanten Steroidrezeptor (z. B. Glucocorticoidrezeptor, Östrogenrezeptor, Andro genrezeptor, Mineralocorticoidrezeptor, Progesteronrezeptor, etc.) einen bindung sfesten Ligand-Rezeptorkomplex. Dieser bindet nicht nur an die HRE-Sequenzen der DNA im Zellkern, sondern auch an die des Promoters im Reporter-Expressio nsplasmid, wodurch das nachgeschaltete Gen das Reporterprotein exprimiert. Wesentlich ist, daß diese Reporterproteine in eukaryontischen Zellen, wie sie hier verwendet werden, natürlicherweise nicht vorkommen, wodurch die gebildete Menge ein direktes quantitatives Maß darstellt für die Hormon-Aktivität des untersuchten Materials. Bewährte Beispiele für solche Reporterproteine sind die Enzyme Luciferase und β-Galactosidase oder Green-, Red-, Yellow-Fluorescent Proteine (GFP, RFP, YFP), die leicht durch bestehende Vorrichtungen, anhand etablierter Protokolle und mit kommerziell erhältlichen Kits, Lumineszenzreaktion im Luminometer bzw. Fluores zenzreaktion im FACS (Fluorescent Activated Cell Sorting), quantifiziert werden kön nen. Als "state of the art" -Protokoll zur Luciferase-Messung wird das "Dual-Lucife rase^TM Reporter Assay System" verwendet (Fa. Promega, Madison, WI, USA; cat. no. E1916), das eine Standardisierung der Enzymbestimmung auf der Basis der Anzahl der erfolgreich transfizierten Zellen (mittels Messung der konstitutiv exprimierten Renilla-Luciferase) ermöglicht. Bei der Bestimmung von GFP, RFP und YFP im FACS- Gerät (z. B. FACSCalibur, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg) geschieht die Standar disierung dadurch, daß das Fluoreszenz-Signal nur von erfolgreich transfizierten Zel len ausgesendet werden kann.

Manche Zellen mit endogenem Hormonrezeptor gemäß Punkt 1.a) enthalten ver schiedene endogene Hormon-Rezeptoren: HepG2 sowie CC-1, HTC und sonstige "hepatoma tissue cells" (Nicht-Hepatoma- bzw. Hepatoma-Linien der Menschen- oder Rattenleber) z. B. enthalten Glucocorticoid-Rezeptor und Östrogenrezeptor; MCF-7 (humane Brustkrebs-Zellinie) sogar Östrogenrezeptor, Glucocorticoid-Rezeptor und Androgenrezeptor. Soli jedoch beim zu untersuchenden Material zwischen verschie denen Qualitäten der Steroidhormon-Aktivitäten diskriminiert werden, z. B. Glucocorti coid-, Östrogen-, Androgen-, Mineralocorticoid- oder Gestagen-Aktivität, etc., so kom men deshalb Zellen ohne endogenen Hormonrezeptor gemäß Punkt 1.b) zum Ein satz; diese werden mit dem jeweiligen Hormon-Rezeptor Expressionsplasmid, also ei nen für den Glucocorticoidrezeptor-, Östrogenrezeptor-, Androgenrezeptor-, Mineralo corticoidrezeptor, Progesteronrezeptor, etc. -codierenden Konstrukt (pGR, etc.), trans fiziert. Das jeweils geeignete hormonsensitive Reportergen-Plasmid für alle aufgeführ ten Aktivitäts-Qualitäten, ausgenommen die östrogenaktiven Materialien, ist, z. B., GRE ("glucocorticoid responsive elements")-Luc mit einem GRE2-TATA Promoter, das für Luciferase codiert; dieses Plasmid (pLCO546A) - auch generell als Vektor bezeich net - reagiert deutlich sensitiver und damit stärker auf induzierende Stoffe mit Hormon- Aktivität als das üblicherweise verwendete Plasmid mit einem MMTV-GRE Promoter.

Für Östrogen-aktive Materialien eignet sich, z. B., ERE-Luc mit einem ERE-TATA Pro moter, das ebenfalls für Luciferase codiert. Geeignete Zellen/Zellinien i. d. S., also ohne jegliche endogene Hormon-Rezeptoren, sind z. B. CV-1 und COS-1, COS-7 (Affen nierenzellen), und vor allem spezielle Hefezellinien, die sich nachweislich zur Expres sion verschiedener Genprodukte, inklusive diverser "steroid-like receptors", sehr be währt haben (McEwan I. J.: "Investigation of steroid receptor function in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae", FEMS Microbiol. Lett. 179 (1999), 183-4). Alle auf geführten und weitere geeignete Zellinien, wie unter Punkt 1.a) und 1.b) definiert, sind bei verschiedenen Zellbanken kommerziell und mit genauer Definition erhältlich; beispielhaft seien einige bedeutende aufgeführt:
ATCC (American Type Culture Collection), 10801 University Boulevard, Manassas (VA), 20110-2209, USA
DSMZ (Human and Animal Cell Cultures), German Collection of Microorganisms & Cell Cultures, Mascheroder Weg 1.b, Braunschweig, D-38124, Germany
ECACC (European Collection of Cell Cultures), CAMR Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire (UK), SP4 0JG, UK

Da Hefezellen im Gegensatz zu eukaryotischen Zellen eine Zellwand besitzen, eignet sich die o. a. Transfektionstechnik nicht. Um diese Zellen zu transfizieren, sind dem Fachmann ebenfalls Verfahren geläufig, z. B. die Lithium-Acetat Methode. (Gietz R. D. et al.: "Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure", Yeast, 11 (1995), 355-60).

Ko-Transfektion von Zellen (s. Punkt 1.a) mit einem Hormon-Rezeptor Expressi onsplasmid verstärkt beträchtlich die Meß-Empfindlichkeit der transfizierten Zelle: es werden nämlich in der Zeile zusätzlich zu den natürlich vorhandenen ("endogenen") Steroidrezeptoren weitere, "rekombinante", d. h. Natur-identische, hergestellt. Dadurch sprechen die Zellen auf noch geringere Konzentrationen von Hormonaktiven Stoffen an und stellen insofern eine besonders empfindliche Meßanordnung dar. Ko-Transfek tion i.d.S. ist daher ein wesentliches Element der Erfindung.

Der erfindungsgemäße Bioassay zur Qualifizierung und Quantifizierung von Stof fen/Molekülen und sonstigen Materialien bzgl., z. B., vermuteter Steroidhormon-Aktivität ist auch noch aus einem weiteren Grund vorteilhaft und dem üblichen zur Stoff mengenbestimmung überlegen: wie schon auf Seite 2 erwähnt, gibt es zahlreiche na türlich vorkommende und aus der technischen Umwelt stammende Substanzen, bzw. chemische Verbindungen und deren oft unbekannte Metaboliten, mit Steroidhormon- Aktivität (z. B. Phyto-Östrogene, Pestizide sowie DDT und dessen immer noch ubi quitär vorkommenden chemischen Abkömmlinge, die wie Östrogene wirken). Zu den wahrscheinlich häufigen und wichtigen Verwendungen der Erfindung gehört die zur Ermittlung von:

1. bekannten und auch unbekannten Androgenabkömmlingen, wie, z. B., die Anabolika, welche von vielen Hochleistungssportlern als Dopingmittel eingenommen werden.
2. Östrogenaktiven Einzelmaterialien und/oder Stoffgemischen physiologischer Her kunft (z. B. im Serum von Menschen und Rindern), in Nahrungsmitteln, Kosmetika und sonstigen pharmazeutischen Produkten sowie in manchen technisch-synthetischen "Permanent Organic Pollutants" (POP).
Für beide Anwendungen böten sich, z. B., COS-1, COS-7, HeLa (undifferenzierte, aneuploide Zellinie aus einem stark wachsendem humanen Zervix-Carcinom), MCF-7, CHO ("Chinese hamster ovary cells") Zellen, insbes. auch Hefezellinien (s. o.) an, die ko-tranfiziert werden mit einem Androgenrezeptor-, bzw. Östrogenrezeptor- codierenden Expressionsplasmid und einem Luciferase-Reportergen-Konstrukt, das einen GRE2-TATA, bzw. ERE-TATA Promoter enthält. Prinzip der Anwendung und Durchführung des Assays wie oben beschrieben.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand einiger spezieller Beispiele sowie der beglei tenden Zeichnung erläutert, die das Verständnis der Erfindung verbessern sollen; sie ist jedoch keineswegs auf diese eingeschränkt. Im Folgenden bedeutet die Beschrif tung der Y-Achse mit "Luc-I" oder "GFP-I" (Fig. 10) stets: x-fache Induktion (gegenüber Kontrolle, d. h. ohne Zugabe des hormonaktiven Materials zu den Zellen) der Lucifer ase, bzw. des Green-Fluorescent Protein.

Darin zeigt:

Fig. 1 Androgen-induzierte Luciferase-Aktivität in humanen Genitalhautfibroblasten (GHF) in Kultur, die mit drei verschiedenen Luciferase-Gen Konstrukten von unter schiedlicher Androgen-Sensitivität ("Luc") transfiziert waren: PRE2-Tk-Luc (blau), MMTV-Luc (rot), GRE2-TATA-Luc (grün)

Fiq. 2 Dosis-Wirkung Beziehung eines Steroidhormones mit bekannter Glucocorti coid (GC)-Aktivität: Corticosteron-induzierte Luciferase-Aktivität in CC1-Zellen ohne (○) und mit (∎) Ko-expression des Glucocorticoid-Rezeptors

Fig. 2a Unterschiedliche Dosis-Wirkung Beziehung eines vermeintlich inaktiven Ster oidhormones: 21-Hemisuccinat-Corticosteron:BSA-induzierte Luciferase-Aktivität in CC1 und MH 3924-Zellen ohne (-Co) und mit Ko-expression (+Co) des Glucocorticoid- Rezeptors

Fig. 3 Induktionszeit-abhängige Dosis-Wirkung Beziehung eines GC-aktiven Steroid hormones: Corticosteron-induzierte Luciferase-Aktivität für verschiedene Induktions zeiten in CC1-Zellen

Fig. 4 Induktionszeit-abhängige Dosis-Wirkung Beziehung eines vermeintlich in aktiven Steroidhormones: 21-Hemisuccinat-Corticosteron:BSA-induzierte Luciferase- Aktivität in CC1-Zellen

Fig. 4a Kurzzeit-Induktion abhängige Dosis-Wirkung Beziehung eines vermeintlich inaktiven Steroidhormones: 21-Hemisuccinat-Corticosteron:BSA-induzierte Luciferase- Aktivität in MH 3924-Zellen

Fig. 5 Induktionszeit-abhängige Wirkung von Steroid-Derivaten mit schwacher und starker GC-Aktivität: Induktion der Luciferase-Aktivität in CC1-Zellen durch 3-CMO- Corticosteron:BSA bzw. 21-Hemisuccinat-Corticosteron:BSA

Fig. 6 Induktionszeit-abhängige Dosis-Wirkung Beziehung eines Steroidhormones mit nicht-bekannter GC-Aktivität: Induktion der Luciferase-Aktivität in CC1-Zellen durch 6α-Methyl-17α-Hydroxy-Progesterons (Medroxyprogesteron)

Fig. 7 Dosis-Wirkung Beziehung diverser Steroidhormone mit unterschiedlich starker GC-Aktivität: Induktion der Luciferase-Aktivität durch Corticosteron (B), Medroxypro gesteron (MP), Östron (E1), Progesteron (P) und 17α-21-Dihydroxy-Progesteron (Cortex) in CC1-Zellen

Fig. 8 Dosis-Wirkung Beziehung diverser Steroidhormone mit unterschiedlich starker GC-Aktivität: Induktion der Luciferase-Aktivität durch Corticosteron (B), Medroxypro gesteron (MP), Östron (E1), Progesteron (P) und 17α-21-Dihydroxy-Progesteron (Cortex) in MH 3924 Zellen

Fig. 9 Antagonistischer Effekt eines synthetischen Steroidhormons auf die GC-Akti vität: Hemmung der durch Corticosteron (B) und 21-Hemisuccinat-Corticosteron:BSA (B:BSA) in CC1-Zellen induzierten Luciferase-Aktivität durch RU 38486 (Mifepri stone™)

Fig. 10 Dosis-Wirkung Beziehung GC-aktiver Steroidhormone: Corticosteron (B) und 21-Hemisuccinat-Corticosteron:BSA (B:BSA)-induzierte Green-Fluorescent-Protein (GFP)-Aktivität in MH 3924-Zellen, stabil mit einem MMTV-GFP-Reportergen-Kon strukt und transient transfiziert mit einem Glucocorticoid-Rezeptor-Expressionsplasmid

Fig. 11 Dosis-Wirkung Beziehung eines synthetischen Androgens mit anaboler Wirk samkeit: Induktion der Luciferase-Aktivität durch R1881 (Methyltrienolon) in HeLa- Zellen, ko-transfiziert mit einem Androgen-Rezeptor-Expressionsplasmid

Als transiente Transfektions-Methode wurde stets die "Non-Recombinant Adenovirus- Polylysine"-Technik eingesetzt.

Beispiel 1 Empfindlichkeit von Assays mit Zellen, transfiziert mit unterschiedlich starken Androgen-sensitiven Reportergen-Konstrukten

Wie in Fig. 1 gezeigt, wurden humane Genitalhautfibroblasten (GHF) in Kultur mit drei verschiedenen Luciferasegen-Konstrukten ("Luc") mit Glucocorticoid-Responsive Ele ment-Promotern von unterschiedlicher Androgen-Sensitivität transient transfiziert. (GRE, Glucocorticoid-Responsive-Elements, sind in ihrer Nukleotidsequenz mit PRE, "Progesterone Responsive Elements", und mit ARE, "Androgen Responsive Ele ments", identisch). GHF enthalten als Steroidhormon-Rezeptoren nur Androgen rezeptoren. Das in diesem Versuch eingesetzte Miboleron ist ein synthetisches ana bol wirkendes Androgen. Ganz offensichtlich wird durch die Zugabe von Miboleron in einer Konzentration von 2 nM 24 h nach erfolgter Transfektion - je nach Herkunft der GHF (Patienten mit Phimose, VHF, oder mit Androgenresistenz, AR und P1), - eine unterschiedlich starke Luciferase-Aktivität gefunden, wobei diese aus den drei Pro motoren unterschiedlicher Androgen-induzierbarer Stärke resultierte. Es wird deutlich, daß bei den hier verwendeten Reportergen-Konstrukten GRE2-TATA-Luc das emp findlichste Reportergen-Konstrukt ist. (s. zum Vergleich auch Beispiel 10, mit einem MMTV-Promoter Reportergen-Konstrukt).

Beispiel 2 Assay zur Bestimmung der Glucocorticoid-Aktivität in CC1- und MH 3924-Zellen ohne und mit Ko-Transfektion

In Fig. 2 ist mittels GRE2-TATA-Luc transient transfizierter CC-1- oder MH 3924- Zel len in Kultur die Bestimmung der Glucocorticoid-Aktivität von Corticosteron sowie von an Rinder-Serumalbumin (BSA: "bovine serum albumin") gekoppeltes Corticosteron derivat (s. Fig. 4) gezeigt; diese Zellinien enthalten endogene Glucocorticoid-Rezep toren. Die Steroidkonzentration bestimmt dabei das Ausmaß der Glucocorticoid-Akti vität. Es wird deutlich, daß Ko-Transfektion mit einem rekombinanten Glucocorticoid- Rezeptor-Expressionsplasmid die Meß-Empfindlichkeit der Zellen beträchtlich erhöht (s. auch Fig. 2a); letztere kann auch verbessert werden durch die Wahl einer empfind licheren Zellinie (Fig. 2a). nM (10^-9) bedeutet nanoMol/Liter. Induktionsdauer: 24 h.

Daher betreffen die nachfolgenden Beispiele stets transient ko-transfizierte Zellen.

Beispiel 3 Assay zur Bestimmung der Glucocorticoid-Aktivität mit CC1-Zellen: Einfluß der Hormonkonzentration und der Induktionszeit

Aus Fig. 3 ist ersichtlich, daß das Meßsystem "ko-transfizierte Zelle" so empfindlich ist, daß Materialien - hier Corticosteron - die ihnen innewohnende Hormonaktivität entweder bei langer Induktionszeit (z. B. 24 h) schon bei sehr niedrigen Konzentra tionen, oder in höheren Konzentrationen bei sehr kurzer Induktionszeit (z. B. 10 min) offenbaren.

Beispiel 4 Assay zur Bestimmung der Glucocorticoid-Aktivität eines Corticosteronderivats mit CC1- und MH 3924-Zellen

In Fig. 4 ist gezeigt, wie ko-transfizierte CC1-Zellen durch ein an Rinder-Serumal bumin (BSA: "bovine serum aibumin") gekoppeltes Corticosteronderivat, das allgemein als Glucocorticoid-inaktiv gilt, Luciferase induzieren. Es ist gesichert, daß für die hier nachgewiesene Glucocorticoid-Aktivität nicht freie Corticosteron-Moleküle innerhalb dieser Formulierung verantwortlich sind. Somit kann durch den erfindungsgemäßen Assay selbst eine geringe Glucocorticoid-artige Aktivität nachgewiesen werden. Dies ergibt sich auch aus Fig. 4a, wo mit transfizierten MH 3924-Zellen bereits nach einer Kurzzeit-Induktion von 10 bis 30 Min. schon mit sehr geringer Konzentration Corticosteron:BSA (≦ 50 nM) eine leicht meßbare Luciferase-lnduktion gemessen werden kann.

Beispiel 5 Assay zur Bestimmung der Glucocorticoid-Aktivität von zwei verschiedenen Corticosteronderivaten mit CC1-Zellen

In Fig. 5 ist gezeigt, wie mit CC1-Zellen gemäß Beispiel 4 ein Vergleich von zwei ver schiedenen, als inaktiv eingestuften Corticosteron:BSA-Derivaten (21:BSA, 3:BSA; je 200 nM) mit starker und schwacher Glucocorticoid-Aktivität möglich ist. Der Unter schied wird besonders deutlich bei langer Induktionszeit. Es ist ersichtlich, daß offen sichtlich bereits geringe Unterschiede in der Aktivität der beiden Steroidderivate mittels des erfindungsgemäßen Assay innerhalb sehr kurzer Induktionszeiten bestimmbar sind, wie es z. B. für "Doping"-Tests oder aber für Schnelltests erwünscht ist.

Beispiel 6 Assay zur Bestimmung der Glucocorticoid-Aktivität eines synthetischen Gesta gens mit CC1-Zellen

Hier wurde das synthetische Gestagen Medroxyprogesteron (6α-Methyl-17α-Hydroxy- Progesteron) mit CC1-Zellen untersucht. Überraschenderweise zeigte sich Glucocorti coid-Aktivität dieser Substanz, von der bisher eine solche Hormon-Aktivität nicht be kannt war. Dieses Gestagen wird vor allem klinisch eingesetzt bei Hormon-abhängi gen Tumoren und bei Endometriose, aber auch in der "Hormonersatztherapie" bei postmenopausalen Frauen, und ist auch Bestandteil in manchen Depotformen oraler Kontrazeptiva. Diese - unerwarteten - Hormonaktivitäten können Nebenwirkungen derartiger synthetischer Hormone vorhersagen bzw. dadurch ermittelt werden, was mit anderen Verfahren nur aufwendig oder unsicher feststellbar sind.

Wie in Beispiel 5, sind auch hier Induktionszeiten von 10 bis 30 Min. hinreichend.

Beispiel 7 Assay zur Bestimmung der Glucocorticoid-Aktivität diverser Steroidhormone mit CC1-Zellen

Fig. 7 zeigt einen Vergleich der Glucocorticoid-Aktivität diverser Steroidhormone bei verschiedenen Konzentrationen (Induktionszeit: 24 h). Erwartete Ergebnisse: Cortico steron (B) und Medroxyprogesteron (MP) - s. Beispiel 6 - sind stark aktiv, während das natürliche Östrogen Östron (E₁) inaktiv ist. Hingegen zeigen die als Glucocorticoid- antagonistisch eingestuften natürlichen Gestagene Progesteron (P) und vor allem Cortexolon (17α-,21-Dihydroxy-Progesteron) signifikante Glucocorticoid-Aktivität.

Beispiel 8 Assay zur Bestimmung der Glucocorticoid-Aktivität diverser Steroidhormone mit MH 3924-Zellen

Die Bestimmung wurde wie bei Beispiel 7 durchgeführt, wobei jedoch MH 3924 Zellen eingesetzt wurden; diese reagieren deutlich sensitiver als CC-1 Zellen auf Glucocorti coid-aktive Hormone. Dies wird besonders deutlich für Progesteron, aber auch für Corticosteron.

Beispiel 9 Assay zur Bestimmung der Glucocorticoid-antagonistischen Aktivität von Mifepristone mit CC1-Zellen

In Fig. 9 ist der Glucocorticoid-Antagonismus von RU 38486, bekannt als Mifepristone, der wesentlichen Komponente der sog. "Abtreibungspille, gezeigt.

Die Luciferase-induzierende Wirkung (Glucocorticoid-Agonismus) von Corticosteron und 21-Hemisuccinat-Corticosteron:BSA wird durch RU 38486 weitgehend blockiert - d. h. die Luciferase-Induktion ist gehemmt.

Beispiel 10 Assay zur Bestimmung der Glucocorticoid-Aktivität mit stabil und transient transfizierten MH-3924-Zellen

Es wurden MH 3924 Zellen transient mit einem Glucocorticoidrezeptor-Expressions plasmid und stabil mit einem GFP-Reportergen-Konstrukt, welches den MMTV-GRE Promoter enthält, ko-transfiziert. (Induktionszeit: 24 h). Die erheblich geringere Sensi tivität dieses Reportergens gegenüber GRE2-TATA-Luc wird deutlich aus dem Ver gleich mit Fig. 3 und Fig. 4. (s. hierzu auch Fig. 1).

Beispiel 11 Assay zur Bestimmung der Androgen-Aktivität eines synthetischen Androgens mit HeLaZellen

In Fig. 11 ist die Bestimmung der Androgen-Aktivität von Methyltrienolon (R1881), einem synthetischen anabolisch wirkenden Androgen, mittels der Luciferase-lnduk tion in kultivierten HeLa Zellen gezeigt. Diese Androgenrezeptor-freie Zellinie wurde transient ko-transfiziert mit GRE2-TATA-Luc und einem rekombinanten Androgen rezeptor-Expressionsplasmid. Die Androgen-Aktivität von R1881, und damit auch des sen anabole Potenz, wird schon bei einer Konzentration von 10 pM erkennbar. pM (10^-12) bedeutet picoMol/Liter. Induktionsdauer: 24 h.

Demzufolge kann - wie die aufgeführten Beispiele demonstrieren - durch die Wahl ei nes hochempfindlichen Reportergen-Konstrukts, hier z. B. GRE2-TATA-Luc, einer sehr sensitiven Zellinie, hier z. B. MH 3924 sowie zusätzliche Transfektion mit einem Hor monrezeptor-Expressionsplasmid, hier z. B. pGR, die Sensitivität des Meßsystems "transfizierte Zelle" dramatisch gesteigert werden. Das wird besonders deutlich er kennbar in Fig. 2a. vgl.: "CC-1, -Co" mit "MH, +Co".

Es sei darauf hingewiesen, daß die Zellinie MH 3924 (Bezugsquelle: PD Dr. Doris Mayer, AG Hormonwirkung und Signaltransduktion, FS Tumorzellregulation, Deut sches Krebsforschungszentrum, Im Neuenheimer Feld 280, 69120 Heidelberg) bzgl. ihrer hohen Sensitivität für Glucocorticoid-Agonisten nur stellvertretend steht für zahl reiche weitere Hepatomazellinien der Ratte und des Menschen (Bezugsquellen s. Adressen Seite 6).

Die beispielhaft aufgeführten Parameter stellen daher Optimierungselemente dar für einen Kit zur Anwendung des erfindungsgemäßen Bioassays zur Qualifizierung und Quantifizierung des Steroidhormon-Agonismus und eventuellen Antagonismus von Stoffen/Molekülen oder Materialgemischen, wobei dem Fachmann die Wahl der ge eigneten Zellinien und der Reportergen-Konstrukte entsprechend den gestellten An forderungen (Haltbarkeit, Empfindlichkeit, Spezifität etc.) aufgrund seines Fachwissens und entsprechend der Lehre der Erfindung möglich ist. Die Erfindung ist daher kei neswegs auf die hier erläuterten Beispiele eingeschränkt. Selbstverständlich ist die obige Erfindung nicht auf die genaue Konstruktion und die beispielhaft angeführten Ausführungsformen beschränkt, sondern es sind unterschiedlichste Abänderungen ohne Abweichungen vom Gedanken und Schutzumfang der Erfindung möglich.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Peptidhormon-Aktivitäten oder der Steroid hormon-Aktivitäten eines Materials oder Stoffgemisches, gekennzeichnet durch:

a) Vorlegen mindestens einer Ausgangszelle mit oder ohne endogene Peptidhormon- Rezeptoren oder Steroidhormon-Rezeptoren.
b) Transfektion der Zelle mit einem spezifischen rekombinanten Reportergen-Konstrukt, das die Fähigkeit besitzt, ein durch die Hormon-Aktivität des Materials induziertes meßbares Produkt zu exprimieren.
c) Einbringen eines zu untersuchenden Materials in die transfizierte Zelle und
d) Herstellung eines leicht bestimmbaren Signal-gebenden Reportergen-Translationspro dukts durch die transfizierte Zelle mittels der induktiven Wirkung des Materials auf den dem Reportergen vorgeschalteten Hormon-reaktiven Promoter und
e) Messen des Reportergen-Translationsprodukts der tranfizierten Zelle und
f) Bestimmen der Hormon-Aktivität des Materials aus dem Meßergebnis.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die transfizierte Zelle hergestellt wird durch:

a) Vorlegen einer Ausgangszelle mit endogenen, die Hormon-Aktivität des Materials vermittelnden Hormonrezeptoren und
b) Transfektion der Ausgangszelle mittels eines Vektors, welcher ein rekombinantes, für die jeweilige Hormonqualität reaktives Reportergenkonstrukt einbringt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine ko-transfizierte Zelle hergestellt wird durch:

a) Vorlegen einer Ausgangszelle gemäß 1. a), und
b) Transfektion der Ausgangszelle mittels eines Vektors, welcher ein rekombinantes, für die jeweilige Hormonqualität reaktives Reportergenkonstrukt und ein für den jeweiligen Hormonrezeptor codierendes Expressionsplasmid in die Zelle einbringt.

4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das zu untersuchende Material ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Peptidhormonen, Steroidhormonen (z. B. natürlichen oder synthetischen Glucocorticoid-, Mineralocorticoid-, Androgen- (eingeschl. androgenen Ana bolika), Östrogen-, Gestagen-Agonisten oder -Antagonisten) und sonstigen Materialien mit agonistischer oder antagonistischer Hormon-Aktivität.

5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangszelle eine nicht-pflanzliche eukaryontische Zelle oder eine Hefezelle ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Reportergen Teil eines östrogenreaktiven Luciferase-Reprotergenkonstrukts ist, herstellbar durch:
Transfektion von Östrogen-Zielzellen (z. B. MC F7, Endometriumzellen - primäre Zellen und Zellinien) - mit einem Luciferase-Reportergenkonstrukt (estrogen-responsive-Luc: Luciferase-Gen mit einem vorgeschalteten "minimal" estrogen-responsive-TATA- Promoter).

7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Reportergen-Konstrukt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus z. B. Luciferase, β-Galactosidase, β-Glucuronidase, Green-, Red-, Yellow- Fluorescent Proteine (GFP, RFP, YFP).

8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Transfektionsverfahren eine "non-recombinant adenovirus"-Polylysin- unterstützte Technik eingesetzt wird.

9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangs-Zelle z. B. eine HeLa-Urzelle (undiffernzierte, aneuploide Zellinie aus einem humanen squamous Epithel-Uterus Cevix-Carcinom), CV1, COS (Affennierenzellen), LnCap (Lymphknoten-Zellen von Prostata-Carcinomen), MC7 eingesetzt wird.

10. Bestimmungs-Assay für die Hormonaktivität von Material, dadurch gekenn zeichnet, daß es transfizierte Zellen nach einem der vorangehenden Ansprüche aufweist.