DE10046647A1 - Verfahren zur Bestimmung der Peptidhormon-Aktivitäten oder der Steroidhormon-Aktivitäten eines Materials oder Stoffgemisches - Google Patents
Verfahren zur Bestimmung der Peptidhormon-Aktivitäten oder der Steroidhormon-Aktivitäten eines Materials oder StoffgemischesInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Peptidhormon-Aktivitäten oder der Steroidhormon-Aktivitäten eines Materials oder Stoffgemischs, gekennzeichnet durch Vorlegen mindestens einer Ausgangszelle mit oder ohne endogene Peptidhormom-Rezeptoren oder Steroidhormon-Rezeptoren, Transfektion der Zelle mit einem spezifischen rekombinanten Reportergen-Konstrukt, das die Fähigkeit besitzt, ein durch die Hormon-Aktivität des Materials induziertes meßbares Produkt zu exprimieren, Einbringen eines zu untersuchenden Materials in die transfizierte Zelle und Herstellung eines leicht bestimmbaren Signal-gebenden Reportergen-Translationssprodukts durch die transfizierte Zelle mittels der induktiven Wirkung des Materials auf den dem Reportergen vorgeschalteten Hormon-reaktiven Promotor und Messen des Reportergen-Translationsprodukts der transfizierten Zelle und Bestimmen der Hormon-Aktivität des Materials aus dem Meßergebnis. Die Erfindung betrifft ebenfalls einen Bestimmungs-Assay für die Hormon-Aktivität von Material, dadurch gekennzeichnet, daß es transfizierte Zellen aufweist.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Qualifizierung und Quantifizierung von agoni
stischen und antagonistischen Hormon-Aktivitäten eines Materials, einen Bioassay,
sowie die Verwendung desselben.
Hormone sind bioaktive Signalmoleküle, die in spezialisierten, sog. endokrinen Zellen
eines jeden Organismus synthetisiert, i. d. R. in das Blut abgegeben werden und be
stimmte biologische Effekte auslösen, indem sie hochaffin und hochspezifisch an
Rezeptoren von Zielzellen reversibel binden; dadurch wird das Hormonsignal in die
Zelle weitergeleitet. Neben den Peptidhormonen (z. B. Insulin, Schilddrüsenhormone,
Adrenalin) sind die Steroidhormone, wozu hauptsächlich die Glucocorticoide, Minera
locorticoide, Androgene (incl. androgene Anabolika, "Dopingmittel"), Östrogene und
Gestagene gehören, die wichtigsten Hormone für fast alle Lebewesen. Sie regeln
Wachstum, körperliche Ausbildung und sind unentbehrlich für Ablauf und Aufrech
terhaltung lebenswichtiger physiologischer und biologischer Funktionen, z. B. der
Reproduktion.
Die Konzentrationsbestimmung der verschiedenen Peptid- und Steroidhormone
- natürlichen und synthetischen -, im Serum und anderen Körperflüssigkeiten von Pati
enten ist diagnostisch von großer Bedeutung. Sie gehört zum klinischen Alltag, da sie
bei vielen gesundheitlichen Störungen und Krankheiten therapeutisch und auch zur
Regulation physiologischer Prozesse (z. B. die "Antibabypille") eingesetzt werden.
Auch wird mit gewissen Steroiden erheblicher Mißbrauch getrieben, z. B. mit den zahl
reichen synthetischen, als Anabolika wirkenden Androgenabkömmlingen, die von vie
len Hochleistungssportlern als Dopingmittel eingenommen werden; daher dient ihr
Nachweis im Serum zur Dopingkontrolle.
Schließlich werden Steroide in nicht unerheblichen Mengen bei der Tiermast einge
setzt - es ist daher auch wichtig, schnell und problemlos feststellen zu können ob
diese meist unerlaubten Mittel eingesetzt wurden und dann in den menschlichen Ver
zehr gelangen.
Bezüglich der biologischen Aktivität - sowohl als Agonisten als auch als Antagonisten -
von Peptid- oder Steroidhormon-aktiven Material muß berücksichtigt werden, daß nicht
nur Peptidhormone und Steroidhormone im eigentlichen Sinne biologisch wirken, also
- chemisch definiert - Aminosäuren-Oligo- und Polymer-, bzw. Cyclopentanoperhydro
phenanthren-Derivate. Oft sind auch Substanzen wirksam, die nur teilweise oder gar
nicht diesen chemischen Stoffklassen entsprechen, aber dennoch offensichtlich an die
entsprechenden Hormon-Rezeptoren binden.
Die biologische Wirkung derartiger Materialien ist ebenfalls äußerst wichtig, kann sie
doch z. B. zu grundlegenden Problemen in der biologischen Signalkette führen, wie
durch verschiedene Weichmacher, Pestizide etc. bekannt. Von besonderer Bedeutung
sind hierbei zahlreiche Stoffe aus der natürlichen und technischen Umwelt, die Östro
gen-aktiv sind, obwohl sie chemisch nicht zu den Steroiden gehören; einzelne Kompo
nenten in Stoffgemischen können sogar, in Kombination, synergistisch wirken. Es ist
daher ebenfalls äußerst erwünscht, die hormonelle Aktivität derartiger Materialien
bereits im Vorfeld - vor dem Einsatz - oder solcher schon im Einsatz befindlichen
Stoffe erkennen zu können.
Obwohl die Erfindung beispielhaft anhand der Bestimmung der biologischen Wirkung
von Steroidhormonen, insbesonders von Glucocorticoid-, Androgen- und Östrogen-
aktiven Steroiden, nachfolgend näher erläutert wird, ist zu berücksichtigen, daß sie
keinesfalls auf Steroidhormone beschränkt ist, sondern allgemein für die Bestimmung
der Steroid- und Peptidhormon-typischen Wirkungen von Materialien einsetzbar ist.
Es ist von vielen Stoffen, insbesondere auch Hormonen, bekannt, daß ihre biologische
Aktivität mit der absoluten Konzentration derselben nicht unbedingt gleichzusetzen ist.
Häufig sind Teilmengen dieser Stoffe durch Komplexe mit Proteinen oder dgl. oder
aber durch Annahme einer anderen Konfiguration inaktiviert oder auch stärker aktiv;
z. B. ist von den Schilddrüsenhormonen bekannt, daß diese je nach Bindung an Pro
teine unterschiedlich wirksam sind. Andere Einflüsse - z. B. der pH-Wert oder Metall
ionen können ebenfalls die Wirkung von Materialien im menschlichen oder tierischen
Körper stark beeinflussen. Somit muß zwischen "freien" und "gebundenen" Hormonen
und ihren Bestandteilen unterschieden werden, die sodann die Aktivität bestimmen.
Entscheidend bei der Ermittlung eines sog. Hormonstatus und ggf. seiner Dynamik
sowie der daraus folgenden diagnostischen und therapeutischen Konsequenzen ist
also nicht die Menge oder Konzentration der jeweiligen Peptid- oder Steroidhormone,
sondern ihre Aktivität, also Art und Ausmaß der biologischen Wirkung, die z. B. durch
die Dissoziationskonstanten von Ligand-Rezeptor-Komplex, aber auch durch viele
andere Faktoren, etwa das Vorliegen von Transportproteinen etc., beeinflußt wird.
Zum besseren Verständnis der Erfindung und beispielhaft soll zunächst das Wirkprin
zip der Steroidhormone erläutert werden. Diese vermitteln ihre Wirkung maßgeblich
über für die jeweiligen Steroidhormon-Klassen spezifischen Rezeptoren, die nach herr
schender Lehrmeinung sich innerhalb der Zielzellen befinden. (Die Rezeptoren für
Peptidhormone sind dagegen auf oder in der Zellmembran, also der Zellaußenhülle
lokalisiert). Sie bilden dabei einen sehr bindungsfesten Rezeptor-Steroid Komplex.
Diese Komplexbildung ist ein wesentliches Glied in der hormonabhängigen Signal
kette, welche zum hormonspezifischen Effekt führt (s. u.). Beispiele für Steroidhormon
rezeptoren sind - wobei diese Aufzählung keineswegs einschränkend ist, sondern nur
der Erläuterung dienen soll: der Glucocorticoidrezeptor (GR), der das Glucocorticoid
Cortisol bindet; der Androgenrezeptor (AR), der das männliche Geschlechtshormon
Testosteron sowie diverse synthetische Steroidhormon-Analoga, wie Anabolika, bin
det; die Östrogenrezeptoren - ERα und ERβ - die das weibliche Geschlechtshormon
Östradiol, aber auch synthetische Östrogene (z. B. Komponenten der "Anti-Babypille")
und andere Stoffe mit östrogener Aktivität binden; der Mineralocorticoidrezeptor (MR)
und der Progesteronrezeptor (PR), welcher Aldosteron bzw. natürliche sowie synthe
tische Gestagene erkennt. Die Bindung des Steroids an den Rezeptor bewirkt, daß
dieser zum Zellkern wandert und sich an spezifische DNA-Abschnitte des Zellkerns
bindet, die "hormone responsive elements" (HRE) genannt werden. Diese HRE,
Bestandteile eines sog. Promoters, aktivieren nun lokal daran anschließende Gene
(die als HRE-"downstream"-Gene bezeichnet werden), welche für spezifische Proteine
(z. B. Enzyme) codieren und deren Bildung induzieren. So veranlaßt z. B. das Steroid
hormon Cortisol in der Leberzelle die Bildung des essentiellen Enzyms Tyrosinami
notransferase; das Östradiol die des PR oder die von Transcortin (unentbehrliches
Transportprotein für Glucocorticoide im Blut).
Erstaunlicherweise wird allgemein - u. a. in der klinischen Diagnostik und der Doping
kontrolle - z. Zt. nur die Konzentration der Steroidhormone bzw. der Anabolika
bestimmt; die Bestimmung der Aktivität derartiger Steroidhormone war bisher nicht
üblich und entsprechende Bestimmungsmethoden sind unbekannt, obwohl sie biolo
gisch/medizinisch viel sinnvoller sind als die o. a. gängige Praxis.
Von Burdge C. B. et al.: "Determination of oestrogen concentrations in bovine plasma
by a recombinant oestrogen receptor-reporter gene yeast bioassay", Analyst, 123
(1998), 2585-2588, wurde vorgeschlagen, mittels einer Hefezellinie, stabil transfiziert
mit einem Östrogenrezeptor-Galactosidase Reportergenkonstrukt, Östrogenkonzen
trationen im Serum von Rindern zu bestimmen ("Recombinant Cell Yeast Bioassay-
RCBA"). Auch hier wird, wie in der allgemeinen klinischen Diagnostik üblich, nur die
Konzentration eines einzigen Steroidhormons, nämlich von 17β-Östradiol, bestimmt.
Es ist Aufgabe der Erfindung, Mittel zur Bestimmung von Hormon-Aktivitäten eines
Materials anzugeben.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren mit den Merkmalen des
Patentanspruches 1 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen ergeben sich aus den ab
hängigen Ansprüchen. Ferner betrifft die Erfindung auch ein Bestimmungs-Assay für
die Hormonaktivitäten von Materialien nach Patentanspruch 9.
Es wird also durchgeführt:
- 1. Auswahl und Vorlegen einer geeigneten Zelle - entweder
- a) mit endogenem Hormon-Rezeptor, die transient oder stabil mono- oder ko-tran fiziert wird mit einem rekombinanten Hormon-sensitiven Reportergen-Konstrukt (Reporter-Expressionsplasmid), bzw. zusätzlich mit einem rekombinanten spezifischen Hormon-Rezeptor Expressionsplasmid, oder
- b) ohne endogenen Hormon-Rezeptor, die transient oder stabil ko-tranfiziert wird mit einem rekombinanten Hormon-sensitiven Reportergen-Konstrukt und einem rekombinanten spezifischen Hormon-Rezeptor Expressionsplasmid, die dann - im Falle a) oder b) - als transfizierte Zelle ein signalgebendes, leicht meßbares Produkt exprimieren kann.
- 2. Einbringen eines Materials oder Materialgemisches mit bekannter oder vermuteter Hormonaktivität in die transfizierte Zelle, i. d. R durch Zugabe zum Zellkultur- Medium.
- 3. Durch das Material und mittels des Hormon-Rezeptors bewirkte Induktion des signalgebenden Reportergen-Translationsprodukts der Zelle.
- 4. Messen des o. a. Produkts, ggfs. nach geeigneter Aufbereitung der transfizierten Zellen in an sich bekannter Weise.
- 5. Analyse: die Menge des gebildeten ( = induzierten) Translationsprodukts ist direkt proportional zur Stärke der jeweiligen Hormonaktivität des untersuchten Materials.
Im Zusammenhang mit dieser Anmeldung bedeutet transiente Transfektion das Ein
bringen von Fremd-DNA in die Zelle, entweder in ihr Cytoplasma und nur für die Dauer
eines Zellzyklus, stabile Transfektion bedeutet das dauerhafte Einbringen von Fremd-
DNA in ihr Genom. Als Vehikel dienen i. d. R. gentechnisch veränderte (rekombinante)
Plasmide ("cloning vectors"), welche die genetische Bauanweisung für das ge
wünschte Reporter-Protein oder den spezifischen Hormon-Rezeptor enthalten. Vorge
schaltet ist diesen Genen jeweils ein bestimmter Promoter. Dieser kann entweder ein
konstitutiver Promoter (z. B. mit SV40 oder Tk (Thymidinkinase) im Rezeptor-Expressi
onsplasmid) sein, der permanente Expression, oder ein induzierbarer Promoter sein
(z. B. mit HRE im Reporter-Expressionsplasmid), der anregbare (z. B. durch ein Hor
mon) Expression des nachgeschalteten (Fremd-)Gens bewirkt.
Da hohe Transfektionseffizienz eine wichtige Bedingung für verläßliche Anwendung der
Erfindung bedeutet, ist dem Fachmann offensichtlich, daß ein möglichst effektives
Transfektionsverfahren eingesetzt werden sollte. Z. Zt. ist die bevorzugte, sehr effek
tive Transfektionsmethode die sog. "Non-Recombinant Adenovirus-Polylysine"-
Technik. Sie ist, z. B., veröffentlicht von Sommer B. et al.: "Efficient gene transfer into
normal human skeletal cells using recombinant adenovirus and conjugated adenovirus-
DNA complexes", Calcif. Tissue Int., 64 (1999), 45-49. Diese Methode ist insbes. an
gezeigt bei der Transfektion von ausdifferenzierten eukaryontischen Zelten mit endo
genem Hormon-Rezeptor gemäß Punkt 1.a), da diese, im Gegensatz zu den in Punkt
1.b) definierten Zellinien ohne endogenen Hormon-Rezeptor, mit konventionellen
Transfektionstechniken nicht hinreichend effektiv transfizierbar sind. Vorteilhafterweise
ist dieses Verfahren z. Zt. genrechtlich nur S1-pflichtig, im Gegensatz zur S2-Pflichtigkeit
der "Recombinant Adenovirus"-Transfektionstechnik.
Das Prinzip der Erfindung sei beispielhaft, jedoch nicht einschränkend, für Materialien
mit Steroidhormon-Aktivität erläutert. Die hormonaktive Komponente(n) des Materials,
im folgenden "Ligand" genannt, bildet nach Einbringen in die transfizierte Zelle - (z. B.
durch Zugabe des Materials in das Zellkulturmedium) - mit dem endogenen und/oder
rekombinanten Steroidrezeptor (z. B. Glucocorticoidrezeptor, Östrogenrezeptor, Andro
genrezeptor, Mineralocorticoidrezeptor, Progesteronrezeptor, etc.) einen bindung
sfesten Ligand-Rezeptorkomplex. Dieser bindet nicht nur an die HRE-Sequenzen der
DNA im Zellkern, sondern auch an die des Promoters im Reporter-Expressio
nsplasmid, wodurch das nachgeschaltete Gen das Reporterprotein exprimiert.
Wesentlich ist, daß diese Reporterproteine in eukaryontischen Zellen, wie sie hier
verwendet werden, natürlicherweise nicht vorkommen, wodurch die gebildete Menge
ein direktes quantitatives Maß darstellt für die Hormon-Aktivität des untersuchten
Materials. Bewährte Beispiele für solche Reporterproteine sind die Enzyme Luciferase
und β-Galactosidase oder Green-, Red-, Yellow-Fluorescent Proteine (GFP, RFP,
YFP), die leicht durch bestehende Vorrichtungen, anhand etablierter Protokolle und
mit kommerziell erhältlichen Kits, Lumineszenzreaktion im Luminometer bzw. Fluores
zenzreaktion im FACS (Fluorescent Activated Cell Sorting), quantifiziert werden kön
nen. Als "state of the art" -Protokoll zur Luciferase-Messung wird das "Dual-Lucife
raseTM Reporter Assay System" verwendet (Fa. Promega, Madison, WI, USA; cat. no.
E1916), das eine Standardisierung der Enzymbestimmung auf der Basis der Anzahl
der erfolgreich transfizierten Zellen (mittels Messung der konstitutiv exprimierten
Renilla-Luciferase) ermöglicht. Bei der Bestimmung von GFP, RFP und YFP im FACS-
Gerät (z. B. FACSCalibur, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg) geschieht die Standar
disierung dadurch, daß das Fluoreszenz-Signal nur von erfolgreich transfizierten Zel
len ausgesendet werden kann.
Manche Zellen mit endogenem Hormonrezeptor gemäß Punkt 1.a) enthalten ver
schiedene endogene Hormon-Rezeptoren: HepG2 sowie CC-1, HTC und sonstige
"hepatoma tissue cells" (Nicht-Hepatoma- bzw. Hepatoma-Linien der Menschen- oder
Rattenleber) z. B. enthalten Glucocorticoid-Rezeptor und Östrogenrezeptor; MCF-7
(humane Brustkrebs-Zellinie) sogar Östrogenrezeptor, Glucocorticoid-Rezeptor und
Androgenrezeptor. Soli jedoch beim zu untersuchenden Material zwischen verschie
denen Qualitäten der Steroidhormon-Aktivitäten diskriminiert werden, z. B. Glucocorti
coid-, Östrogen-, Androgen-, Mineralocorticoid- oder Gestagen-Aktivität, etc., so kom
men deshalb Zellen ohne endogenen Hormonrezeptor gemäß Punkt 1.b) zum Ein
satz; diese werden mit dem jeweiligen Hormon-Rezeptor Expressionsplasmid, also ei
nen für den Glucocorticoidrezeptor-, Östrogenrezeptor-, Androgenrezeptor-, Mineralo
corticoidrezeptor, Progesteronrezeptor, etc. -codierenden Konstrukt (pGR, etc.), trans
fiziert. Das jeweils geeignete hormonsensitive Reportergen-Plasmid für alle aufgeführ
ten Aktivitäts-Qualitäten, ausgenommen die östrogenaktiven Materialien, ist, z. B.,
GRE ("glucocorticoid responsive elements")-Luc mit einem GRE2-TATA Promoter, das
für Luciferase codiert; dieses Plasmid (pLCO546A) - auch generell als Vektor bezeich
net - reagiert deutlich sensitiver und damit stärker auf induzierende Stoffe mit Hormon-
Aktivität als das üblicherweise verwendete Plasmid mit einem MMTV-GRE Promoter.
Für Östrogen-aktive Materialien eignet sich, z. B., ERE-Luc mit einem ERE-TATA Pro
moter, das ebenfalls für Luciferase codiert. Geeignete Zellen/Zellinien i. d. S., also ohne
jegliche endogene Hormon-Rezeptoren, sind z. B. CV-1 und COS-1, COS-7 (Affen
nierenzellen), und vor allem spezielle Hefezellinien, die sich nachweislich zur Expres
sion verschiedener Genprodukte, inklusive diverser "steroid-like receptors", sehr be
währt haben (McEwan I. J.: "Investigation of steroid receptor function in the budding
yeast Saccharomyces cerevisiae", FEMS Microbiol. Lett. 179 (1999), 183-4). Alle auf
geführten und weitere geeignete Zellinien, wie unter Punkt 1.a) und 1.b) definiert,
sind bei verschiedenen Zellbanken kommerziell und mit genauer Definition erhältlich;
beispielhaft seien einige bedeutende aufgeführt:
ATCC (American Type Culture Collection), 10801 University Boulevard, Manassas (VA), 20110-2209, USA
DSMZ (Human and Animal Cell Cultures), German Collection of Microorganisms & Cell Cultures, Mascheroder Weg 1.b, Braunschweig, D-38124, Germany
ECACC (European Collection of Cell Cultures), CAMR Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire (UK), SP4 0JG, UK
ATCC (American Type Culture Collection), 10801 University Boulevard, Manassas (VA), 20110-2209, USA
DSMZ (Human and Animal Cell Cultures), German Collection of Microorganisms & Cell Cultures, Mascheroder Weg 1.b, Braunschweig, D-38124, Germany
ECACC (European Collection of Cell Cultures), CAMR Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire (UK), SP4 0JG, UK
Da Hefezellen im Gegensatz zu eukaryotischen Zellen eine Zellwand besitzen, eignet
sich die o. a. Transfektionstechnik nicht. Um diese Zellen zu transfizieren, sind dem
Fachmann ebenfalls Verfahren geläufig, z. B. die Lithium-Acetat Methode. (Gietz R. D.
et al.: "Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG
procedure", Yeast, 11 (1995), 355-60).
Ko-Transfektion von Zellen (s. Punkt 1.a) mit einem Hormon-Rezeptor Expressi
onsplasmid verstärkt beträchtlich die Meß-Empfindlichkeit der transfizierten Zelle: es
werden nämlich in der Zeile zusätzlich zu den natürlich vorhandenen ("endogenen")
Steroidrezeptoren weitere, "rekombinante", d. h. Natur-identische, hergestellt. Dadurch
sprechen die Zellen auf noch geringere Konzentrationen von Hormonaktiven Stoffen
an und stellen insofern eine besonders empfindliche Meßanordnung dar. Ko-Transfek
tion i.d.S. ist daher ein wesentliches Element der Erfindung.
Der erfindungsgemäße Bioassay zur Qualifizierung und Quantifizierung von Stof
fen/Molekülen und sonstigen Materialien bzgl., z. B., vermuteter Steroidhormon-Aktivität
ist auch noch aus einem weiteren Grund vorteilhaft und dem üblichen zur Stoff
mengenbestimmung überlegen: wie schon auf Seite 2 erwähnt, gibt es zahlreiche na
türlich vorkommende und aus der technischen Umwelt stammende Substanzen, bzw.
chemische Verbindungen und deren oft unbekannte Metaboliten, mit Steroidhormon-
Aktivität (z. B. Phyto-Östrogene, Pestizide sowie DDT und dessen immer noch ubi
quitär vorkommenden chemischen Abkömmlinge, die wie Östrogene wirken). Zu den
wahrscheinlich häufigen und wichtigen Verwendungen der Erfindung gehört die zur
Ermittlung von:
- 1. bekannten und auch unbekannten Androgenabkömmlingen, wie, z. B., die Anabolika, welche von vielen Hochleistungssportlern als Dopingmittel eingenommen werden.
- 2. Östrogenaktiven Einzelmaterialien und/oder Stoffgemischen physiologischer Her
kunft (z. B. im Serum von Menschen und Rindern), in Nahrungsmitteln, Kosmetika und
sonstigen pharmazeutischen Produkten sowie in manchen technisch-synthetischen
"Permanent Organic Pollutants" (POP).
Für beide Anwendungen böten sich, z. B., COS-1, COS-7, HeLa (undifferenzierte, aneuploide Zellinie aus einem stark wachsendem humanen Zervix-Carcinom), MCF-7, CHO ("Chinese hamster ovary cells") Zellen, insbes. auch Hefezellinien (s. o.) an, die ko-tranfiziert werden mit einem Androgenrezeptor-, bzw. Östrogenrezeptor- codierenden Expressionsplasmid und einem Luciferase-Reportergen-Konstrukt, das einen GRE2-TATA, bzw. ERE-TATA Promoter enthält. Prinzip der Anwendung und Durchführung des Assays wie oben beschrieben.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand einiger spezieller Beispiele sowie der beglei
tenden Zeichnung erläutert, die das Verständnis der Erfindung verbessern sollen; sie
ist jedoch keineswegs auf diese eingeschränkt. Im Folgenden bedeutet die Beschrif
tung der Y-Achse mit "Luc-I" oder "GFP-I" (Fig. 10) stets: x-fache Induktion (gegenüber
Kontrolle, d. h. ohne Zugabe des hormonaktiven Materials zu den Zellen) der Lucifer
ase, bzw. des Green-Fluorescent Protein.
Darin zeigt:
Fig. 1 Androgen-induzierte Luciferase-Aktivität in humanen Genitalhautfibroblasten
(GHF) in Kultur, die mit drei verschiedenen Luciferase-Gen Konstrukten von unter
schiedlicher Androgen-Sensitivität ("Luc") transfiziert waren: PRE2-Tk-Luc (blau),
MMTV-Luc (rot), GRE2-TATA-Luc (grün)
Fiq. 2 Dosis-Wirkung Beziehung eines Steroidhormones mit bekannter Glucocorti
coid (GC)-Aktivität: Corticosteron-induzierte Luciferase-Aktivität in CC1-Zellen ohne
(○) und mit (∎) Ko-expression des Glucocorticoid-Rezeptors
Fig. 2a Unterschiedliche Dosis-Wirkung Beziehung eines vermeintlich inaktiven Ster
oidhormones: 21-Hemisuccinat-Corticosteron:BSA-induzierte Luciferase-Aktivität in
CC1 und MH 3924-Zellen ohne (-Co) und mit Ko-expression (+Co) des Glucocorticoid-
Rezeptors
Fig. 3 Induktionszeit-abhängige Dosis-Wirkung Beziehung eines GC-aktiven Steroid
hormones: Corticosteron-induzierte Luciferase-Aktivität für verschiedene Induktions
zeiten in CC1-Zellen
Fig. 4 Induktionszeit-abhängige Dosis-Wirkung Beziehung eines vermeintlich in
aktiven Steroidhormones: 21-Hemisuccinat-Corticosteron:BSA-induzierte Luciferase-
Aktivität in CC1-Zellen
Fig. 4a Kurzzeit-Induktion abhängige Dosis-Wirkung Beziehung eines vermeintlich
inaktiven Steroidhormones: 21-Hemisuccinat-Corticosteron:BSA-induzierte Luciferase-
Aktivität in MH 3924-Zellen
Fig. 5 Induktionszeit-abhängige Wirkung von Steroid-Derivaten mit schwacher und
starker GC-Aktivität: Induktion der Luciferase-Aktivität in CC1-Zellen durch 3-CMO-
Corticosteron:BSA bzw. 21-Hemisuccinat-Corticosteron:BSA
Fig. 6 Induktionszeit-abhängige Dosis-Wirkung Beziehung eines Steroidhormones
mit nicht-bekannter GC-Aktivität: Induktion der Luciferase-Aktivität in CC1-Zellen durch
6α-Methyl-17α-Hydroxy-Progesterons (Medroxyprogesteron)
Fig. 7 Dosis-Wirkung Beziehung diverser Steroidhormone mit unterschiedlich starker
GC-Aktivität: Induktion der Luciferase-Aktivität durch Corticosteron (B), Medroxypro
gesteron (MP), Östron (E1), Progesteron (P) und 17α-21-Dihydroxy-Progesteron
(Cortex) in CC1-Zellen
Fig. 8 Dosis-Wirkung Beziehung diverser Steroidhormone mit unterschiedlich starker
GC-Aktivität: Induktion der Luciferase-Aktivität durch Corticosteron (B), Medroxypro
gesteron (MP), Östron (E1), Progesteron (P) und 17α-21-Dihydroxy-Progesteron
(Cortex) in MH 3924 Zellen
Fig. 9 Antagonistischer Effekt eines synthetischen Steroidhormons auf die GC-Akti
vität: Hemmung der durch Corticosteron (B) und 21-Hemisuccinat-Corticosteron:BSA
(B:BSA) in CC1-Zellen induzierten Luciferase-Aktivität durch RU 38486 (Mifepri
stone™)
Fig. 10 Dosis-Wirkung Beziehung GC-aktiver Steroidhormone: Corticosteron (B) und
21-Hemisuccinat-Corticosteron:BSA (B:BSA)-induzierte Green-Fluorescent-Protein
(GFP)-Aktivität in MH 3924-Zellen, stabil mit einem MMTV-GFP-Reportergen-Kon
strukt und transient transfiziert mit einem Glucocorticoid-Rezeptor-Expressionsplasmid
Fig. 11 Dosis-Wirkung Beziehung eines synthetischen Androgens mit anaboler Wirk
samkeit: Induktion der Luciferase-Aktivität durch R1881 (Methyltrienolon) in HeLa-
Zellen, ko-transfiziert mit einem Androgen-Rezeptor-Expressionsplasmid
Als transiente Transfektions-Methode wurde stets die "Non-Recombinant Adenovirus-
Polylysine"-Technik eingesetzt.
Wie in Fig. 1 gezeigt, wurden humane Genitalhautfibroblasten (GHF) in Kultur mit drei
verschiedenen Luciferasegen-Konstrukten ("Luc") mit Glucocorticoid-Responsive Ele
ment-Promotern von unterschiedlicher Androgen-Sensitivität transient transfiziert.
(GRE, Glucocorticoid-Responsive-Elements, sind in ihrer Nukleotidsequenz mit PRE,
"Progesterone Responsive Elements", und mit ARE, "Androgen Responsive Ele
ments", identisch). GHF enthalten als Steroidhormon-Rezeptoren nur Androgen
rezeptoren. Das in diesem Versuch eingesetzte Miboleron ist ein synthetisches ana
bol wirkendes Androgen. Ganz offensichtlich wird durch die Zugabe von Miboleron in
einer Konzentration von 2 nM 24 h nach erfolgter Transfektion - je nach Herkunft der
GHF (Patienten mit Phimose, VHF, oder mit Androgenresistenz, AR und P1), - eine
unterschiedlich starke Luciferase-Aktivität gefunden, wobei diese aus den drei Pro
motoren unterschiedlicher Androgen-induzierbarer Stärke resultierte. Es wird deutlich,
daß bei den hier verwendeten Reportergen-Konstrukten GRE2-TATA-Luc das emp
findlichste Reportergen-Konstrukt ist. (s. zum Vergleich auch Beispiel 10, mit einem
MMTV-Promoter Reportergen-Konstrukt).
In Fig. 2 ist mittels GRE2-TATA-Luc transient transfizierter CC-1- oder MH 3924- Zel
len in Kultur die Bestimmung der Glucocorticoid-Aktivität von Corticosteron sowie von
an Rinder-Serumalbumin (BSA: "bovine serum albumin") gekoppeltes Corticosteron
derivat (s. Fig. 4) gezeigt; diese Zellinien enthalten endogene Glucocorticoid-Rezep
toren. Die Steroidkonzentration bestimmt dabei das Ausmaß der Glucocorticoid-Akti
vität. Es wird deutlich, daß Ko-Transfektion mit einem rekombinanten Glucocorticoid-
Rezeptor-Expressionsplasmid die Meß-Empfindlichkeit der Zellen beträchtlich erhöht
(s. auch Fig. 2a); letztere kann auch verbessert werden durch die Wahl einer empfind
licheren Zellinie (Fig. 2a). nM (10-9) bedeutet nanoMol/Liter. Induktionsdauer: 24 h.
Daher betreffen die nachfolgenden Beispiele stets transient ko-transfizierte Zellen.
Aus Fig. 3 ist ersichtlich, daß das Meßsystem "ko-transfizierte Zelle" so empfindlich
ist, daß Materialien - hier Corticosteron - die ihnen innewohnende Hormonaktivität
entweder bei langer Induktionszeit (z. B. 24 h) schon bei sehr niedrigen Konzentra
tionen, oder in höheren Konzentrationen bei sehr kurzer Induktionszeit (z. B. 10 min)
offenbaren.
In Fig. 4 ist gezeigt, wie ko-transfizierte CC1-Zellen durch ein an Rinder-Serumal
bumin (BSA: "bovine serum aibumin") gekoppeltes Corticosteronderivat, das allgemein
als Glucocorticoid-inaktiv gilt, Luciferase induzieren. Es ist gesichert, daß für die hier
nachgewiesene Glucocorticoid-Aktivität nicht freie Corticosteron-Moleküle innerhalb
dieser Formulierung verantwortlich sind. Somit kann durch den erfindungsgemäßen
Assay selbst eine geringe Glucocorticoid-artige Aktivität nachgewiesen werden.
Dies ergibt sich auch aus Fig. 4a, wo mit transfizierten MH 3924-Zellen bereits nach
einer Kurzzeit-Induktion von 10 bis 30 Min. schon mit sehr geringer Konzentration
Corticosteron:BSA (≦ 50 nM) eine leicht meßbare Luciferase-lnduktion gemessen
werden kann.
In Fig. 5 ist gezeigt, wie mit CC1-Zellen gemäß Beispiel 4 ein Vergleich von zwei ver
schiedenen, als inaktiv eingestuften Corticosteron:BSA-Derivaten (21:BSA, 3:BSA; je
200 nM) mit starker und schwacher Glucocorticoid-Aktivität möglich ist. Der Unter
schied wird besonders deutlich bei langer Induktionszeit. Es ist ersichtlich, daß offen
sichtlich bereits geringe Unterschiede in der Aktivität der beiden Steroidderivate mittels
des erfindungsgemäßen Assay innerhalb sehr kurzer Induktionszeiten bestimmbar
sind, wie es z. B. für "Doping"-Tests oder aber für Schnelltests erwünscht ist.
Hier wurde das synthetische Gestagen Medroxyprogesteron (6α-Methyl-17α-Hydroxy-
Progesteron) mit CC1-Zellen untersucht. Überraschenderweise zeigte sich Glucocorti
coid-Aktivität dieser Substanz, von der bisher eine solche Hormon-Aktivität nicht be
kannt war. Dieses Gestagen wird vor allem klinisch eingesetzt bei Hormon-abhängi
gen Tumoren und bei Endometriose, aber auch in der "Hormonersatztherapie" bei
postmenopausalen Frauen, und ist auch Bestandteil in manchen Depotformen oraler
Kontrazeptiva. Diese - unerwarteten - Hormonaktivitäten können Nebenwirkungen
derartiger synthetischer Hormone vorhersagen bzw. dadurch ermittelt werden, was mit
anderen Verfahren nur aufwendig oder unsicher feststellbar sind.
Wie in Beispiel 5, sind auch hier Induktionszeiten von 10 bis 30 Min. hinreichend.
Fig. 7 zeigt einen Vergleich der Glucocorticoid-Aktivität diverser Steroidhormone bei
verschiedenen Konzentrationen (Induktionszeit: 24 h). Erwartete Ergebnisse: Cortico
steron (B) und Medroxyprogesteron (MP) - s. Beispiel 6 - sind stark aktiv, während das
natürliche Östrogen Östron (E1) inaktiv ist. Hingegen zeigen die als Glucocorticoid-
antagonistisch eingestuften natürlichen Gestagene Progesteron (P) und vor allem
Cortexolon (17α-,21-Dihydroxy-Progesteron) signifikante Glucocorticoid-Aktivität.
Die Bestimmung wurde wie bei Beispiel 7 durchgeführt, wobei jedoch MH 3924 Zellen
eingesetzt wurden; diese reagieren deutlich sensitiver als CC-1 Zellen auf Glucocorti
coid-aktive Hormone. Dies wird besonders deutlich für Progesteron, aber auch für
Corticosteron.
In Fig. 9 ist der Glucocorticoid-Antagonismus von RU 38486, bekannt als Mifepristone,
der wesentlichen Komponente der sog. "Abtreibungspille, gezeigt.
Die Luciferase-induzierende Wirkung (Glucocorticoid-Agonismus) von Corticosteron
und 21-Hemisuccinat-Corticosteron:BSA wird durch RU 38486 weitgehend blockiert -
d. h. die Luciferase-Induktion ist gehemmt.
Es wurden MH 3924 Zellen transient mit einem Glucocorticoidrezeptor-Expressions
plasmid und stabil mit einem GFP-Reportergen-Konstrukt, welches den MMTV-GRE
Promoter enthält, ko-transfiziert. (Induktionszeit: 24 h). Die erheblich geringere Sensi
tivität dieses Reportergens gegenüber GRE2-TATA-Luc wird deutlich aus dem Ver
gleich mit Fig. 3 und Fig. 4. (s. hierzu auch Fig. 1).
In Fig. 11 ist die Bestimmung der Androgen-Aktivität von Methyltrienolon (R1881),
einem synthetischen anabolisch wirkenden Androgen, mittels der Luciferase-lnduk
tion in kultivierten HeLa Zellen gezeigt. Diese Androgenrezeptor-freie Zellinie wurde
transient ko-transfiziert mit GRE2-TATA-Luc und einem rekombinanten Androgen
rezeptor-Expressionsplasmid. Die Androgen-Aktivität von R1881, und damit auch des
sen anabole Potenz, wird schon bei einer Konzentration von 10 pM erkennbar.
pM (10-12) bedeutet picoMol/Liter. Induktionsdauer: 24 h.
Demzufolge kann - wie die aufgeführten Beispiele demonstrieren - durch die Wahl ei
nes hochempfindlichen Reportergen-Konstrukts, hier z. B. GRE2-TATA-Luc, einer sehr
sensitiven Zellinie, hier z. B. MH 3924 sowie zusätzliche Transfektion mit einem Hor
monrezeptor-Expressionsplasmid, hier z. B. pGR, die Sensitivität des Meßsystems
"transfizierte Zelle" dramatisch gesteigert werden. Das wird besonders deutlich er
kennbar in Fig. 2a. vgl.: "CC-1, -Co" mit "MH, +Co".
Es sei darauf hingewiesen, daß die Zellinie MH 3924 (Bezugsquelle: PD Dr. Doris
Mayer, AG Hormonwirkung und Signaltransduktion, FS Tumorzellregulation, Deut
sches Krebsforschungszentrum, Im Neuenheimer Feld 280, 69120 Heidelberg) bzgl.
ihrer hohen Sensitivität für Glucocorticoid-Agonisten nur stellvertretend steht für zahl
reiche weitere Hepatomazellinien der Ratte und des Menschen (Bezugsquellen s.
Adressen Seite 6).
Die beispielhaft aufgeführten Parameter stellen daher Optimierungselemente dar für
einen Kit zur Anwendung des erfindungsgemäßen Bioassays zur Qualifizierung und
Quantifizierung des Steroidhormon-Agonismus und eventuellen Antagonismus von
Stoffen/Molekülen oder Materialgemischen, wobei dem Fachmann die Wahl der ge
eigneten Zellinien und der Reportergen-Konstrukte entsprechend den gestellten An
forderungen (Haltbarkeit, Empfindlichkeit, Spezifität etc.) aufgrund seines Fachwissens
und entsprechend der Lehre der Erfindung möglich ist. Die Erfindung ist daher kei
neswegs auf die hier erläuterten Beispiele eingeschränkt. Selbstverständlich ist die
obige Erfindung nicht auf die genaue Konstruktion und die beispielhaft angeführten
Ausführungsformen beschränkt, sondern es sind unterschiedlichste Abänderungen
ohne Abweichungen vom Gedanken und Schutzumfang der Erfindung möglich.
Claims (10)
1. Verfahren zur Bestimmung der Peptidhormon-Aktivitäten oder der Steroid
hormon-Aktivitäten eines Materials oder Stoffgemisches, gekennzeichnet durch:
- a) Vorlegen mindestens einer Ausgangszelle mit oder ohne endogene Peptidhormon- Rezeptoren oder Steroidhormon-Rezeptoren.
- b) Transfektion der Zelle mit einem spezifischen rekombinanten Reportergen-Konstrukt, das die Fähigkeit besitzt, ein durch die Hormon-Aktivität des Materials induziertes meßbares Produkt zu exprimieren.
- c) Einbringen eines zu untersuchenden Materials in die transfizierte Zelle und
- d) Herstellung eines leicht bestimmbaren Signal-gebenden Reportergen-Translationspro dukts durch die transfizierte Zelle mittels der induktiven Wirkung des Materials auf den dem Reportergen vorgeschalteten Hormon-reaktiven Promoter und
- e) Messen des Reportergen-Translationsprodukts der tranfizierten Zelle und
- f) Bestimmen der Hormon-Aktivität des Materials aus dem Meßergebnis.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die transfizierte Zelle
hergestellt wird durch:
- a) Vorlegen einer Ausgangszelle mit endogenen, die Hormon-Aktivität des Materials vermittelnden Hormonrezeptoren und
- b) Transfektion der Ausgangszelle mittels eines Vektors, welcher ein rekombinantes, für die jeweilige Hormonqualität reaktives Reportergenkonstrukt einbringt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine ko-transfizierte
Zelle hergestellt wird durch:
- a) Vorlegen einer Ausgangszelle gemäß 1. a), und
- b) Transfektion der Ausgangszelle mittels eines Vektors, welcher ein rekombinantes, für die jeweilige Hormonqualität reaktives Reportergenkonstrukt und ein für den jeweiligen Hormonrezeptor codierendes Expressionsplasmid in die Zelle einbringt.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß das zu untersuchende Material ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend
aus Peptidhormonen, Steroidhormonen (z. B. natürlichen oder synthetischen
Glucocorticoid-, Mineralocorticoid-, Androgen- (eingeschl. androgenen Ana
bolika), Östrogen-, Gestagen-Agonisten oder -Antagonisten) und sonstigen
Materialien mit agonistischer oder antagonistischer Hormon-Aktivität.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß die Ausgangszelle eine nicht-pflanzliche eukaryontische Zelle oder eine
Hefezelle ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Reportergen Teil
eines östrogenreaktiven Luciferase-Reprotergenkonstrukts ist, herstellbar
durch:
Transfektion von Östrogen-Zielzellen (z. B. MC F7, Endometriumzellen - primäre Zellen und Zellinien) - mit einem Luciferase-Reportergenkonstrukt (estrogen-responsive-Luc: Luciferase-Gen mit einem vorgeschalteten "minimal" estrogen-responsive-TATA- Promoter).
Transfektion von Östrogen-Zielzellen (z. B. MC F7, Endometriumzellen - primäre Zellen und Zellinien) - mit einem Luciferase-Reportergenkonstrukt (estrogen-responsive-Luc: Luciferase-Gen mit einem vorgeschalteten "minimal" estrogen-responsive-TATA- Promoter).
7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß das Reportergen-Konstrukt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
z. B. Luciferase, β-Galactosidase, β-Glucuronidase, Green-, Red-, Yellow-
Fluorescent Proteine (GFP, RFP, YFP).
8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß als Transfektionsverfahren eine "non-recombinant adenovirus"-Polylysin-
unterstützte Technik eingesetzt wird.
9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß als Ausgangs-Zelle z. B. eine HeLa-Urzelle (undiffernzierte, aneuploide
Zellinie aus einem humanen squamous Epithel-Uterus Cevix-Carcinom), CV1,
COS (Affennierenzellen), LnCap (Lymphknoten-Zellen von Prostata-Carcinomen),
MC7 eingesetzt wird.
10. Bestimmungs-Assay für die Hormonaktivität von Material, dadurch gekenn
zeichnet, daß es transfizierte Zellen nach einem der vorangehenden Ansprüche
aufweist.
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