ES2280211T3 - Metodo para eliminar residuos de alanina, situados en extremos terminales de n, a partir de polipeptidos, con una aminopeptidasa procedente de aeromonas. - Google Patents
Metodo para eliminar residuos de alanina, situados en extremos terminales de n, a partir de polipeptidos, con una aminopeptidasa procedente de aeromonas. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para eliminar un residuo alanilo situado en extremos terminales de N a partir de una proteína recombinante seleccionada entre el conjunto formado por derivados de Ala en extremos terminales de N de una hormona humana del crecimiento, somatotropina humana, somatotropina porcina, somatotropina bovina y un inhibidor de la ruta del factor tisular humano, que comprende poner en contacto dicha proteína recombinante con una aminopeptidasa inmovilizada procedente de Aeromonas, para disociar el residuo alanilo, y recuperar la resultante proteína recombinante.
Description
Método para eliminar residuos de alanina,
situados en extremos terminales de N, a partir de polipéptidos, con
una aminopeptidasa procedente de Aeromonas.
Este invento describe un método para eliminar
residuos de alanina, situados en extremos terminales de N, a partir
de proteínas recombinantes, usando una aminopeptidasa que se deriva
de la bacteria marina Aeromonas proteolytica. De modo
correspondiente, la aminopeptidasa procedente de Aeromonas
(AAP; E.C. 3.4.11.10) se puede usar para eliminar residuos de
alanilo, situados en extremos terminales de N, a partir de derivados
de somatotropina humana (hST, hormona humana del crecimiento, o
hGH), somatotropina porcina (pST) y somatotropina bovina (bST), por
ejemplo, para proporcionar unas proteínas que tienen sus secuencias
de aminoácidos naturales. Las reacciones enzimáticas se pueden
llevar a cabo en una solución libre, o la AAP se puede inmovilizar
sobre un soporte sólido, para reacciones llevadas a cabo in
vitro. Un método eficiente para convertir una
Ala-hGH en una hGH, por ejemplo, comprende una
expresión de la Ala-hGH en el seno de E.
coli, una recuperación de cuerpos de inclusión, una
solubilización y un repliegue en un detergente, una eliminación del
detergente por ultrafiltración, una precipitación selectiva, una
disociación con enzimas, seguida por dos etapas de cromatografía en
columna.
Las proteínas recombinantes que imitan a, o
tienen la misma estructura que las proteínas naturales, son
altamente deseadas para usarse en aplicaciones terapéuticas, como
componentes en vacunas y estuches para ensayos de diagnóstico, y
como reactivos para estudios de estructura/función. Se usan
corrientemente células de mamíferos, bacterias e insectos para
expresar proteínas recombinantes para tales aplicaciones. Sin
embargo, se usan sistemas de expresión bacterianos con frecuencia
cuando se necesitan grandes cantidades de una proteína para estudios
experimentales o clínicos, y la proteína es capaz de ser replegada
a su apropiada conformación. En particular, los sistemas
bacterianos ofrecen importantes ventajas de costos con respecto a
otros sistemas de vectores de expresión cuando no se requieren, o
no se desean, en el producto proteínico final, modificaciones
eucarióticas posteriores a la traducción (p.ej. una
glicosilación).
Las proteínas recombinantes expresadas en
bacterias, tales como E. coli, son secuestradas con
frecuencia dentro de cuerpos de inclusión insolubles. Las proteínas
heterólogas cosechadas a partir de los cuerpos de inclusión
retienen con frecuencia un residuo de aminoácido adicional, tal como
el de metionina, junto a su extremo terminal de amino. Con
frecuencia, este residuo de metionina (codificado por el codón de
iniciación ATG) no está presente, sin embargo, en proteínas
naturales o recombinantes cosechadas a partir de células
anfitrionas eucarióticas. Los extremos terminales de amino de muchas
proteínas producidas en el citoplasma de E. coli, sin
embargo, son tratados por medio de enzimas, tales como una
aminopeptidasa de metionina (Ben Bassat y colaboradores, J.
Bacteriol. 169: 751-757, 1987), de manera
tal que después de una expresión la metionina es disociada
ordinariamente desde el extremo terminal de N.
Se influye de muchas maneras diferentes sobre la
composición de aminoácidos de los extremos terminales de proteínas
(Berezovsky y colaboradores, Protein Engineering
12(1): 23-30, 1999). Un examen
sistemático de las actividades de N-exopeptidasas
condujo al descubrimiento del "extremo terminal de N" o de la
"regla del extremo de N": El extremo terminal de N,
(f)Met, es disociado si el siguiente aminoácido es Ala, Cys,
Gly, Pro, Ser, Thr o Val. Si este siguiente aminoácido es Arg, Asp,
Asn, Glu, Gln, Ile, Leu, Lys o Met, el (f)Met inicial
permanece como el primer aminoácido de la proteína madura. Los
radios de hidratación de las cadenas laterales de aminoácidos se
propusieron como base física para estas observaciones (Bachman y
colaboradores, Science, 234: 179-186,
1986; Varshavsky, Cell, 69: 725-735,
1992). La semi-vida de una proteína (desde 3 min
hasta 20 horas) es influenciada espectacularmente por la estructura
química del aminoácido situado en extremos terminales de N (Stewart
y colaboradores, J. Biol. Chem., 270:
25-28, 1995; Griegoryev y colaboradores, J.
Biol. Chem., 271: 28521-28532, 1996). Se
usó subsiguientemente una mutagénesis dirigida a un sitio para
confirmar la "regla del extremo de N" por vigilancia del lapso
de vida de proteínas recombinantes que contienen secuencias
alteradas de aminoácidos en extremos terminales de N (Varshavsky,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:
12142-12149, 1996). Un análisis estadístico de las
secuencias de aminoácidos en los extremos terminales de N de
proteínas, sugirió que los residuos Met y Ala están representados en
exceso en la primera posición, mientras que en las posiciones +2 y
+5 se prefiere el residuo Thr (Berezovsky y colaboradores,
Protein Engineering 12(1):
23-30, 1999). Sin embargo, las influencias sobre los
extremos terminales de C muestran una preferencia para aminoácidos
y residuos de Cys cargados (Berezovsky y colaboradores, Protein
Engineering 12(1): 23-30,
1999).
Las proteínas recombinantes que retienen a la
metionina en extremos terminales de N tienen, en algunos casos,
unas características biológicas que difieren de las de la especie
natural en la que falta la metionina en extremos terminales de N.
Una hormona humana del crecimiento, que retiene su metionina en
extremos terminales de N (Met-hHG), por ejemplo,
puede favorecer la inducción de anticuerpos indeseables, en
comparación con una hGH purificada a partir de fuentes naturales o
con una hGH recombinante que se prepara de manera tal que tenga la
misma secuencia primaria que una hGH natural (que carece de una
metionina en extremos terminales de N). Con frecuencia se desean
para aplicaciones terapéuticas unos métodos de bajo costo para
generar proteínas recombinantes que imitan a la estructura de
proteínas naturales (Sandman y colaboradores, Bio/Technology,
13:504(6) (1995)).
Un método para preparar proteínas naturales en
bacterias consiste en expresar la proteína deseada como una parte
de una proteína de fusión de mayor tamaño, que contiene un sitio de
reconocimiento para una endoproteasa que disocia específicamente
secuencia arriba desde el comienzo de las secuencias de aminoácidos
naturales. Los sitios de reconocimiento y de disociación pueden ser
los que han sido reconocidos por peptidasas de señal naturales, que
cortan específicamente al péptido de señal de los extremos
terminales de N de una proteína destinada a su suministro a una
membrana o a su secreción a partir de la célula. En otros casos, se
pueden establecer por ingeniería genética sitios de reconocimiento
y de disociación en el gen que codifica una proteína de fusión, de
manera tal que una proteína recombinante es susceptible a otras
endoproteasas no naturales in vitro o in vivo. El
factor de coagulación de sangre Xa, colagenasa, y la enzima
enterocinasa, por ejemplo, se pueden usar para liberar diferentes
marcas de fusión a partir de una diversidad de proteínas. Sin
embargo, ciertas consideraciones económicas excluyen generalmente
la utilización de endoproteasas a una gran escala para un uso
farmacéutico.
Otro método para preparar proteínas naturales en
bacterias consiste en usar la enzima aminopeptidasa de metionina
(MAP) para tratar y eliminar la metionina de extremos terminales de
N a partir de proteínas recombinantes derivadas de E. coli.
Una Met-hGH, por ejemplo, se puede tratar con MAP
para generar una hGH. Las patentes de los Estados Unidos de América
4.870.017 y 5.013.662 describen la clonación, la expresión y el uso
de una aminopeptidasa de metionina procedente de E. coli
para eliminar la Met a partir de una diversidad de péptidos y de
Met-IL-2. Se analizó la capacidad de
liberar aminoácidos a partir de una diversidad de substratos de
péptidos, revelando que la MAP disocia la metionina de extremos
terminales de N solamente en péptidos que tienen una longitud de
por lo menos tres aminoácidos. La naturaleza de los aminoácidos en
las posiciones segunda y tercera también manifiesta ser importante.
Se liberaba metionina, por ejemplo, a partir de
Met-Ala-Met;
Met-Gly-Met,
Met-Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-Gln-Leu
(SEQ ID NO: 1), y
Met-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Gln-Cys
(SEQ ID NO: 2), pero no a partir de
Met-Phe-Gly,
Met-Leu-Phe,
Met-Met-Met, entre otras. No se
liberaban aminoácidos a partir de
Leu-Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-Gln-Leu
(SEQ ID NO: 3),
Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-Gln-Leu
(SEQ ID NO: 4), o
Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Gln-Cys
(SEQ ID NO: 5).
El documento de solicitud de patente
internacional WO 84/02351 describe un procedimiento para preparar
proteínas (naturales) maduras, tales como una hormona humana del
crecimiento o una proinsulina humana, a partir de proteínas de
fusión que usan una aminopeptidasa de leucina. Una proteína de
fusión, que tiene la secuencia de aminoácidos
(Y_{m}...Y_{2}Y_{1})-
Pro)_{p}-(X_{1}X_{2}...X_{n}) en la que
(Y_{m}...Y_{2}Y_{1})- Pro)_{p} es la
pro-secuencia y el resto es la proteína madura, m es
un número entero mayor que 2, Y es un aminoácido arbitrario, p es
0, si X_{1} o X_{2} es Pro, y es 1, si X_{1} o X_{2} es
diferente de Pro, X es un aminoácido arbitrario, y n es un número
entero mayor o igual que 4, es convertida por disociación escalonada
con una aminopeptidasa que elimina los aminoácidos
Y_{m}...Y_{2} si p es = 1 o X_{1} es = Pro, o los grupos
Y_{m} hasta Y_{2}-Y_{1}, si X_{2} es = Pro,
y luego los dos aminoácidos Y_{1}-Pro, si p es =
1, son disociados enzimáticamente en una o dos etapas de una manera
conocida de por sí, y similarmente es disociado el Y_{1} a solas,
si X_{1} es = Pro.
El documento de solicitud de patente europea EP
0.204.527 A1 describe un método para eliminar la metionina de
extremos terminales de N a partir de proteínas de la fórmula
H-Met-X-Pro-Y-OH,
para proporcionar una proteína representada por la fórmula
H-X-Pro-Y-OH,
en la que X es un aminoácido distinto de prolina e Y es una cadena
de péptido. La aminopeptidasa M era preferida, pero también se
podría usar la aminopeptidasa de leucina, la aminopeptidasa PO o la
aminopeptidasa P. La metionina de extremos terminales de N era
eliminada a partir de derivados de interleucina-2
humana y de una hormona humana del crecimiento.
Una aminopeptidasa procedente de
Aeromonas (AAP), que es una exo-peptidasa
aislada a partir de la bacteria marina Aeromonas
proteolytica, se puede usar también para facilitar la liberación
de aminoácidos en extremos terminales de N a partir de péptidos y
proteínas (Wilkes y colaboradores, Eur. J. Biochem.
34(3), 459-66, 1973). La secuencia
más favorable es X-//-Y- mientras que Y es un residuo hidrófobo,
preferiblemente un aminoácido aromático, tal como fenilalanina. Los
residuos susceptibles a una hidrólisis incluyen todos los
aminoácidos hidrófobos, aromáticos y básicos, más prolina. No se
eliminaban residuos de aspartilo, glutamilo y de ácido cisteico a
partir del extremo terminal de N de ninguno de los substratos
ensayados, ni siquiera en altas concentraciones de la enzima. Sin
embargo, se liberaban asparagina, glutamina y cisteína aminoetilada,
a partir de substratos de oligopéptidos. La glicina era
generalmente resistente a la hidrólisis, pero se liberaba lentamente
a partir de algunos substratos, dependiendo de los residuos
adyacentes. La actividad de AAP sobre substratos de péptidos se
puede intensificar también cambiando los iones metálicos de signo
contrario, tales como Cu^{2+} y Ni^{2+} por la enzima AAP libre
(Prescott y colaboradores, Biochem. Biophys. Res. Comm.
114(2): 646-652, 1983). La AAP es una
metaloenzima de 29,5 kDa que contiene dos enlaces de disulfuro.
La patente europea EP 0191827 B1 y la patente de
los EE.UU. 5.763.215 describen la eliminación secuencial de
aminoácidos situados en extremos terminales de N a partir de
compuestos análogos a proteínas eucarióticas, formadas en un
anfitrión ajeno, por medio del uso de una aminopeptidasa procedente
de Aeromonas. Cuando se mezclaron 8 mg de una
metionil-hormona humana del crecimiento
(Met-hGH) (disueltos en 1 ml de un tampón de borato
de Na 10 mM, de pH 9,5) con una aminopeptidasa procedente de
Aeromonas (disuelta a 0,4725 mg/ml en un tampón Tris de pH
9,5) en una relación de 900 a 19, y se incubaron a 37ºC, la
disociación de la metionina estaba completa en 15 min. La
disociación del nuevo aminoácido leucina situado en extremos
terminales de N era ligera después de 22 h. Las metioninas situadas
en extremos terminales de N de Met-pST,
Met-interferón,
Met-IGF-1,
Met-interleucina-2
(Met-IL-2) y
Met-apoliproproteína E fueron eliminadas mediante
una AAP. Una alanina de extremos terminales de N, sin embargo, no
era eliminada a partir de una superóxido dismutasa madura.
Se pueden usar métodos más complicados con el
fin de generar proteínas recombinantes con un extremo terminal de
amino natural. La patente de los Estados Unidos 5.783.413, por
ejemplo, describe el uso simultáneo o secuencial (a) de una o más
aminopeptidasas, (b) de una ciclotransferasa de glutamina, y (c) de
una aminopeptidasa de piroglutamina para tratar proteínas
prolongadas en extremos terminales de amino de la fórmula
NH_{2}-A-glutamina-proteína-COOH,
para producir una deseada proteína natural. La(s)
primera(s) aminopeptidasa(s) (seleccionada(s)
entre el conjunto que consiste en
dipeptidil-aminopeptidasa I, aminopeptidasa
procedente de Aeromonas, aminopeptidasa P y aminopeptidasa
de prolina), cataliza(n) la eliminación de residuos situados
en extremos terminales de amino con respecto a la glutamina. La
ciclotransferasa de glutamina cataliza la conversión de la glutamina
en piroglutamina y la aminopeptidasa de piroglutamina cataliza la
eliminación de piroglutamina para producir el deseado producto
proteínico.
Las patentes de los Estados Unidos 5.565.330 y
5.573.923 describen unos métodos para eliminar dipéptidos a partir
de los extremos terminales de amino de polipéptidos precursores, que
implican un tratamiento del compuesto precursor con una
dipeptidil-aminopeptidasa (dDAP) procedente del moho
del lodo Dictyostelium discoideum, que tiene una masa de
aproximadamente 225 kDa y un valor óptimo del pH de aproximadamente
3,5. Compuestos precursores de la insulina humana, compuestos
análogos a la insulina humana y una hormona humana del crecimiento,
que contienen prolongaciones de dipéptidos, se trataron mediante una
dDAP cuando la dDAP estaba en una solución libre y cuando ésta
estaba inmovilizada sobre una apropiada superficie de soporte
sólido.
Son deseables unas estrategias más eficientes
para tratar y eliminar aminoácidos desde el extremo terminal de N
de proteínas recombinantes, con el fin de reducir el costo de
generar proteínas terapéuticas que imiten a la estructura de
proteínas naturales. Unos métodos que aumenten los niveles de
expresión o faciliten el tratamiento secuencia abajo de proteínas
recombinantes, también acelerarán la selección y el desarrollo de
pequeñas moléculas químicas y de otras moléculas basadas en
proteínas, destinadas a ensayos clínicos a gran escala.
El invento se refiere a un método para eliminar
un residuo alanilo situado en extremos terminales de N a partir de
una proteína recombinante, seleccionada entre el conjunto de los
derivados de Ala situados en extremos terminales de N de una
hormona humana del crecimiento, somatotropina humana, somatotropina
porcina, somatotropina bovina y un inhibidor de la ruta del factor
tisular humano, que comprende poner en contacto dicha proteína
recombinante con una aminopeptidasa procedente de Aeromonas,
inmovilizada, para disociar el residuo alanilo, y recuperar la
resultante proteína recombinante.
La proteína recombinante se selecciona entre el
conjunto que consiste en una hormona humana del crecimiento (hGH),
somatotropina bovina (bST), somatotropina porcina (pST) y un
inhibidor de la ruta del factor tisular humano (TFPI).
Preferiblemente, la proteína recombinante es la hGH.
Preferiblemente, el proceso de puesta en
contacto se lleva a cabo a un pH de desde aproximadamente pH 7 hasta
aproximadamente pH 11. De manera incluso más preferible, el proceso
de puesta en contacto se lleva a cabo a un pH de desde
aproximadamente pH 8 hasta aproximadamente pH 10. De un modo
sumamente preferible, el proceso de puesta en contacto se lleva a
cabo a un pH de desde aproximadamente pH 8,0 hasta aproximadamente
pH 9,5.
Preferiblemente, el proceso de puesta en
contacto se lleva a cabo en la presencia de un tampón seleccionado
entre el conjunto que consiste en un borato, CHES, bicarbonato de
sodio, fosfato de sodio y Tris-HCl. De manera más
preferible, el tampón es borato, fosfato o
Tris-HCl.
Preferiblemente, el proceso de puesta en
contacto se puede llevar a cabo cuando la aminopeptidasa está
inmovilizada. Preferiblemente, la aminopeptidasa es inmovilizada
sobre una resina de cromatografía, una superficie de cromatografía
o un gel de cromatografía.
Preferiblemente, la proteína recombinante es
hecha pasar a través de una columna que contiene la aminopeptidasa
inmovilizada sobre una resina de cromatografía.
Alternativamente, el proceso de puesta en
contacto se puede llevar a cabo cuando la aminopeptidasa no está
inmovilizada (p.ej., en una solución libre).
Se puede concebir también que una aminopeptidasa
procedente de Aeromonas puede permitir el tratamiento de
proteínas que contienen dos o más residuos de alanilo separados a
corta distancia entre sí, en las regiones terminales de N de
polipéptidos. La aminopeptidasa puede avanzar secuencialmente desde
los extremos terminales de N del polipéptido o posiblemente
reconocer adicionales residuos de alanina dentro de una corta
distancia desde residuos expuestos de extremos terminales de N de
polipéptidos. La elucidación de una secuencia de consenso para el
reconocimiento específico para alanilo, y los sitios de disociación
se pueden evaluar en una diversidad de substratos de proteínas y
péptidos.
Una aminopeptidasa procedente de
Aeromonas puede facilitar también el tratamiento de residuos
que no sean alanilo en las regiones terminales de N de proteínas,
en las condiciones que se describen en esta solicitud. La
elucidación de una secuencia de consenso para el reconocimiento y la
disociación de estos sitios, se puede evaluar en una diversidad de
substratos de proteínas y péptidos.
Otro objeto del invento es el de describir un
método para eliminar aminoácidos situados en extremos terminales de
N a partir de un polipéptido precursor de la fórmula
X-Y-Pro-Z con una
aminopeptidasa procedente de Aeromonas, para proporcionar un
polipéptido de la fórmula Y-Pro-Z,
en la que X es uno o más aminoácidos exceptuando a la prolina, Y es
cualquier aminoácido exceptuando a la prolina y Z es uno o más
aminoácidos.
De manera preferible, X es alanina.
Preferiblemente, Y se selecciona entre el
conjunto que consiste en fenilalanina, metionina, treonina y ácido
aspártico. Más preferiblemente, Y es fenilalanina.
De modo sumamente preferible, X es alanina e Y
es fenilalanina.
Preferiblemente, el polipéptido precursor es
Ala-hGH.
La siguiente es una lista de abreviaturas y de
los correspondientes significados que se usan aquí de una manera
intercambiable:
g | = | gramo(s) |
HPLC | = | cromatografía de fase líquida de alto rendimiento |
kb | = | kilobase(s) |
mb | = | megabase(s) |
mg | = | miligramo(s) |
ml, mL | = | mililitro(s) |
RP-HPLC | = | cromatografía de líquido de alto rendimiento y de fase inversa |
ug, \mug | = | microgramo(s) |
ul, uL, \mul, \muL | = | microlitro(s) |
La siguiente es una lista de definiciones de
diversos términos y de los correspondientes significados que se
usan intercambiablemente en este contexto:
Los términos "aap" y "AAP" significan
una aminopeptidasa procedente de Aeromonas.
Los términos "ap" y "AP" significan
una aminopeptidasa.
El término "aminoácido(s)" significa
todos los L-aminoácidos que se presentan en la
naturaleza, incluyendo a norleucina, norvalina, homocisteína y
ornitina.
El término "molécula de fusión" significa
una molécula que codifica una proteína o un fragmento de la misma
que, después de una expresión, produce una proteína de fusión.
El término "proteína de fusión" significa
una proteína o un fragmento de la misma, que comprende una o más
adicionales regiones del péptido, que no se derivan de esa
proteína.
El término "promotor" se usa en un sentido
expansivo para referirse a las secuencia(s)
reguladora(s) que controla(n)
la producción de un ARNm (ácido ribonucleico mensajero).
la producción de un ARNm (ácido ribonucleico mensajero).
El término "fragmento de proteína"
significa un péptido o una molécula de polipéptido cuya secuencia de
aminoácidos comprende un subconjunto de la secuencia de aminoácidos
de esa proteína.
El término "molécula de proteína/molécula de
péptido" significa cualquier molécula que comprende cinco o más
aminoácidos.
El término "recombinante" significa
cualquier agente (p.ej. un ADN, un péptido, etc.), que es, o
resulta, sin embargo de una manera indirecta, de una manipulación
humana de una molécula de ácido nucleico.
El término "se fija específicamente"
significa que la fijación de un anticuerpo o un péptido no es
inhibida de una manera competitiva por la presencia de moléculas no
relacionadas.
El término "sustancialmente purificado"
significa que una o más moléculas, que están o pueden estar
presentes en una formulación que se presenta en la naturaleza, que
contiene la molécula buscada, habrán sido eliminadas o reducidas en
concentración.
Figura
1
Una hormona humana del crecimiento (a la
derecha) es un polipéptido monocatenario (de 22 kDa) con cuatro
residuos de cisteína implicados en dos uniones por enlaces de
disulfuro. La secuencia correcta en extremos terminales de N se
puede conseguir mediante la disociación enzimática in vitro
de Ala-hGH (a la izquierda) con una aminopeptidasa
procedente de Aeromonas.
\newpage
Figura
2
Un procedimiento general para la purificación de
hGH a partir de una Ala-hGH implica una purificación
de la Ala-hGH con respecto de cuerpos de inclusión
bacterianos, un repliegue de la Ala-hGH en un
detergente, una eliminación del detergente, una precipitación con
ácidos, un tratamiento con una aminopeptidasa y una purificación de
la hGH natural mediante una cromatografía en columna con intercambio
de cationes y de aniones.
Figura
3
Las condiciones cinéticas de una eliminación de
Ala a partir de una Ala-hGH mediante una AAP se
ilustran en la Figura 3. La Ala-hGH estaba presente
a razón de 3 mg/ml y la AAP estaba presente a razón de 0,5, 1,0,
2,0, 3,0 y 4,0 unidades/ml en un volumen total de 6 ml. Las
reacciones se realizaron a la temperatura ambiente y se recogieron
muestras a lo largo de 25 horas y los productos se analizaron
mediante una ES/MS. La mayor parte de las reacciones para las tres
concentraciones más altas de AAP estaban completas en 6 horas.
Figura
4
Se ilustra una comparación esquemática de
modalidades de procedimientos de disociación con flujo constante y
con flujo continuo.
Figura
5
La Figura 5 ilustra una evolución en el tiempo
de una disociación intensificada de una Ala-hGH
mediante una Cu-AAP, en comparación con una
Zn-AAP en una modalidad discontinua.
Figura
6
La Figura 6 ilustra una evolución en el tiempo
de una disociación de una Ala-hGH mediante una
Cu-AAP, en comparación con una
Zn-AAP que se lleva a cabo en una modalidad de
recirculación en columna.
Figura
7
La Figura 7 ilustra unos perfiles de HPLC de una
Ala-hGH antes de una disociación con AAP, de una
disociación incompleta y después de que esté completa la
reacción.
Figura
8
La Figura 8 ilustra el perfil de HPLC de una hGH
preparada tratando una Ala-hGH con una AAP, y de dos
formulaciones comerciales de hGH (Humatrope y Zomacton).
Figura
9
Las Figuras 9-12 ilustran
típicos perfiles de mapas trípticos. La Figura 9 ilustra los
trazados de perfiles que ilustran la diferencia en movilidad del
péptido Ala-T1 en comparación con el péptido T1.
Figura
10
La Figura 10 muestra un trazado de perfil
expandido verticalmente, que ilustra las diferencias entre las áreas
de los picos bajo las posiciones de elución para
Ala-T1 y para T1.
Figura
11
La Figura 11 ilustra los mapas trípticos de una
hGH purificada después de un tratamiento de una
Ala-hGH con una AAP en comparación con los mapas
trípticos de una hGH procedente de fuentes comerciales (Humatrope y
Zomacton).
Figura
12
La Figura 12 muestra un trazado de perfil
expandido verticalmente, que ilustra la presencia o ausencia de
Ala-T1 en una preparación cruda de una hGH, en la
formulación a granel final de hGH, y en una hGH procedente de dos
fuentes comerciales (Humatrope y Zomacton).
Figura
13
La Figura 13 ilustra los perfiles de ES/MS de
una Ala-hGH antes de una disociación con AAP, de una
disociación incompleta y después de que esté completa la reacción.
La Figura 8 ilustra el perfil de HPLC de una hGH preparada
tratando una Ala-hGH con AAP, y de dos formulaciones
comerciales de hGH (Humatrope y Zomacton).
Figura
14
La Figura 14 ilustra un perfil superpuesto de
ES/MS de Ala-hGH y de hGH (panel de fondo)
juntamente con trazados de HPLC del producto final resuelto en
columnas de RP-HPLC y SE-HPLC.
Figura
15
La Figura 15 ilustra trazados de los productos
liberados después del ciclo 1 y del ciclo 2 a partir de un
secuenciador automático de proteínas. La fenilalanina (18,3 min.) es
el único residuo significativo que se detecta después del ciclo 1
(panel de la izquierda). La prolina (14,2 min.) es el único residuo
significativo detectado en el ciclo 2. La cantidad de alanina (*)
es despreciable en ambos ciclos, indicando la falta de residuos de
alanina en extremos terminales de N en el producto purificado
final.
Los siguientes Ejemplos ilustrarán el invento
con mayor detalle, aunque se entenderá que el invento no está
limitado a estos ejemplos específicos.
Métodos generales para clonar, expresar y
caracterizar proteínas se encuentran en la obra de T. Maniatis y
colaboradores, Molecular Cloning, A Laboratory Manual
[Clonación molecular, un manual de laboratorio], Cold Spring Harbor
Laboratory, 1982, y en las referencias allí citadas, que se
incorporan a la presente por su referencia; y en la obra de J.
Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning, A Laboratory
Manual [Clonación molecular, un manual de laboratorio], 2ª
edición, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, y en las referencias
allí citadas, que se incorporan a la presente por su referencia. Las
condiciones y los procedimientos, generales y específicas/os para
la construcción, la manipulación y el aislamiento de anticuerpos se
conocen bien en la especialidad (véase, por ejemplo, la obra de
Harlow y Lane, In Antibodies: A Laboratory Manual [En
anticuerpos: un manual de laboratorio], Cold Spring Harbor Press,
Cold Spring Harbor, Nueva York (1988)).
La aminopeptidasa procedente de Aeromonas
y todos los productos químicos especiales, a menos que se señale
otra cosa distinta, se obtuvieron de la entidad Sigma Chemical
Company (St Louis, MO).
La Humatrope se obtuvo de Eli Lilly. La Zomacton
se obtuvo de Gentechnisch.
La purificación de proteínas se puede conseguir
usando uno cualquiera entre una diversidad de métodos de
cromatografía tales como los de: intercambio de iones, filtración
en gel, cromatografía hidrófoba o HPLC de fase inversa. Estos y
otros métodos de purificación de proteínas se describen con detalle
en la obra Methods in Enzymology [Métodos en enzimología], volumen
182 "Guide to Protein Purification" [Guía para la purificación
de proteínas], compilada por Murray Deutscher, Academic Press, San
Diego, California, 1990. Las proteínas plegadas pueden ser también
purificadas por afinidad usando reactivos con afinidad, tales como
anticuerpos monoclonales o subunidades de receptores, unidas a una
matriz apropiada.
Las proteínas purificadas pueden ser analizadas
por una RP-HPLC, una espectrometría de masas con
proyección de electrones, y una SDS-PAGE. La
cuantificación de las proteínas se consigue mediante la composición
de aminoácidos, mediante una RP-HPLC y mediante las
técnicas de determinación de proteínas de Bradford. Se puede usar
también, para confirmar la identidad de las proteínas, un
cartografiado tríptico de péptidos realizado en conjunción con una
espectrometría de masas con proyección de electrones.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se expresó una Ala-hGH (Figura
1) en el seno de E. coli usando un sistema de expresión
cromosomal basado en mini-Mu (Weinberg y
colaboradores, Gene 126: 25-33, 1993;
patentes de los EE.UU. 5.395.763 y 5.514.483; solicitud de patente
de los EE.UU. 09/044.369, presentada el 19 de Marzo de 1998, cada
una incorporada específicamente aquí por su referencia). Se expresó
la Ala-hGH en unos niveles de aproximadamente 1,5 a
aproximadamente
2,0 g/litro.
2,0 g/litro.
La Ala-hGH se purificó, replegó
y trató hasta llegar a una pureza de >90% basándose en un
análisis de Ala-hGH (por RP-HPLC) y
en la concentración total de proteínas (por absorbencia a
A_{280}). Expresado brevemente, se aislaron cuerpos de inclusión
y la Ala-hGH se purificó y replegó usando métodos
descritos con anterioridad (documento WO 98/29433). El repliegue se
consiguió de la manera más corriente con un rendimiento de >85% a
un pH de 10 usando un acil-glutamato como
detergente. Luego el detergente fue eliminado desde la mezcla de
repliegue por ultrafiltración exhaustiva (10 TOV's) frente a un agua
de pH 10. Esto fue seguido por una etapa de precipitación con
ácidos para eliminar la mayor parte de las proteínas recombinantes
de E. coli. La recuperación media de Ala-hGH
a partir de esta etapa de precipitación fue de
\sim80-85%. Esta Ala-hGh
semipurificada fue diafiltrada frente al tampón de disociación
(fosfato 10 mM, de pH 8,0) antes de ser tratada con la enzima,
preferiblemente en una modalidad inmovilizada. Después de la etapa
de disociación enzimática, la hGH fue purificada adicionalmente
mediante una cromatografía de intercambio de iones en un polvo a
granel. Un bosquejo general del procedimiento se ilustra en
la
Figura 2.
Figura 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Antes de la operación de disociación, una
Ala-hGH se ajustó a una concentración de 3 mg por ml
en un tampón de borato 10 mM, de pH 9,5. Para esto, la
aminopeptidasa procedente de Aeromonas se añadió en 3
unidades por ml y se dejó que la reacción se desarrollase durante
24-36 horas a la temperatura ambiente o durante un
período de tiempo más corto a 37ºC. El progreso de la reacción de
disociación se puede vigilar mediante una RP-HPLC o
mediante un análisis de aminoácidos de la liberación de alanina a
partir de la Ala-hGH. Al final de la reacción, la
solución fue sofocada añadiendo ácido acético al 2% (dilución a
1:1,5 p/p (peso/peso)).
Las condiciones cinéticas de la eliminación de
Ala a partir de la Ala-hGH mediante una AAP se
ilustran en la Figura 3. La Ala-hGH estaba presente
a razón de 3 mg/ml y la AAP estaba presente a razón de 0,5, 1,0,
2,0, 3,0 y 4,0 unidades/ml en un volumen total de 6 ml. Las
reacciones se realizaron a la temperatura ambiente y se recogieron
muestras a lo largo de 25 horas, y los productos se analizaron por
ES/MS. La mayor parte de las reacciones para las tres
concentraciones más altas de AAP estaban completas en 6 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Una aminopeptidasa procedente de
Aeromonas (AAP) fue acoplada sobre resinas tales como una
resina Sepharose 4B por medio de las condiciones químicas del
bromuro de cianógeno (CNBr). Una resina comercial Sepharose 4B,
activada con CNBr, fue lavada exhaustivamente con agua fría y luego
fue suspendida en un tampón de carbonato de sodio 0,1 M, de pH 8,5,
o en un tampón de fosfato 10 mM, de pH 8. Se añadió la AAP (100
unidades por gramo de resina) y la mezcla se agitó suavemente a 4ºC
durante una noche. Después de haber lavado con agua, la resina fue
rematada con etanolamina (0,5-1 M) a la temperatura
ambiente durante 2 horas. Luego la resina fue lavada con agua y
equilibrada con el tampón para disociación con una enzima, tal como
un fosfato 10 mM, de pH 8. La actividad de esta enzima inmovilizada
se midió mediante el análisis normalizado, sugerido por Sigma,
usando
L-leucina-p-nitro-anilida
como substrato. La actividad media era típicamente de
10-20 unidades por ml de lecho de
resina.
resina.
Una aminopeptidasa inmovilizada se suspendió
como una mezcla 1:1 en un tampón de borato o fosfato. A un tubo con
una capacidad de 7 ml, que contenía 5 ml de Ala-hGH
en un tampón de fosfato o borato, se le añadió un ml de resina.
Esto dio un total de 6 ml con una concentración de proteína de 3
mg/ml. La mezcla se agitó por oscilación durante
10-24 horas a 20-40ºC. Al final de
la reacción, la resina fue separada por filtración y la resultante
solución se analizó mediante una RP-HPLC. El resto
de la solución se centrifugó usando un dispositivo para
microfiltración de CentriCon. El material filtrado se analizó
mediante el analizador de aminoácidos en cuanto a la liberación de
alanina. El material retenido fue intercambiado 4-5
veces con ácido acético al 2% antes de ser secado hasta la forma de
un polvo para un análisis de espectrometría de masas.
La Tabla 1 ilustra el efecto de la temperatura
sobre la disociación de una Ala-hGH en una modalidad
discontinua, usando una AAP inmovilizada. La reacción es acelerada
a las temperaturas del medio ambiente, y está esencialmente
completa más allá de las 54 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se hizo circular una Ala-hGH en
un tampón de borato 10 mM, de pH 9,5, o en un tampón de fosfato 10
mM, de pH 8,0 sobre una columna de Sepharose, que previamente había
sido inmovilizada con una aminopeptidasa procedente de
Aeromonas. El volumen del depósito está situado entre 100 ml
y 700 ml, dependiendo de la concentración de la proteína.
Típicamente la Ala-hGH está en una concentración de
5-10 mg por ml. El caudal está entre
2-4 ml por minuto. Esto se realizó a 20ºC durante
aproximadamente 24 horas. La reacción se vigiló mediante una
RP-HPLC. La eficiencia de la disociación se confirmó
por espectrometría de masas y por secuenciación de extremos
terminales de N. Luego el producto acabado se purificó
adicionalmente mediante una cromatografía de intercambio de
iones.
iones.
La Tabla 2 ilustra el efecto del caudal sobre la
disociación de una Ala-hGH usando una AAP
inmovilizada a 28ºC en una modalidad de recirculación. Unos
períodos de tiempo de permanencia más cortos estaban asociados
generalmente con unos niveles más altos de substrato sin
disociar.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ * \begin{minipage}[t]{141mm} El experimento se realizó a 28 ^{o}C en un volumen de columna de 51 ml usando un tampón de fosfato 10 mM de pH 8 como tampón, usando de Ala-hGH: 8 mg/ml (según HPLC). \end{minipage} \cr}
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 3 ilustra el efecto del caudal sobre la
disociación de Ala-hGH usando una AAP inmovilizada a
20ºC en la modalidad de recirculación. Unos tiempos más cortos de
permanencia, están correlacionados directamente con más altos
niveles de substratos sin disociar.
El experimento se realizó a 20ºC con un volumen
de la columna de 51 ml en un tampón de fosfato de 10 mM de pH 8,
usando Ala-hGH:8 mg/ml (HPLC).
* Aproximadamente un 1% está constituido por el
aducto con cisteína que se había eluído concomitantemente con el
Ala-T1 péptido no disociado.
Se introdujo una Ala-hGH (en una
concentración de 8 mg/ml) en un tampón de borato 10 mM, de pH 9,5, o
en un tampón de fosfato 10 mM de pH 8,0, sobre una columna de
Sepharose (el volumen de la columna es de 50 ml) que se ha había
inmovilizado previamente con una aminopeptidasa procedente de
Aeromonas. El caudal se ajustó a 15 ml por hora, por lo que
el período de tiempo de permanencia fue de alrededor de 3 horas. La
eficiencia de la disociación se confirmó por una
RP-HPLC, por una digestión tríptica, por una
espectrometría de masas o por una secuenciación de extremos
terminales de N. El eluyente se recogió y se trató para una
purificación por cromatografía corriente
abajo.
abajo.
La Tabla 4 ilustra el efecto del caudal sobre la
disociación de una Ala-hGH usando una AAP
inmovilizada a 28ºC en una modalidad de flujo de paso. La mayor
parte de la Ala-hGH fue tratada mediante la AAP en
estas condiciones.
\vskip1.000000\baselineskip
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ * \begin{minipage}[t]{141mm} Todos los datos trípticos están basados en la combinación de Ala-hGH sin disociar y de una impureza procedente del proceso. El valor real de Ala-hGH sin disociar es estimado como de aproximadamente un 50% de los valores informados. \end{minipage} \cr}
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
La disociación en la modalidad de columna se
puede realizar en un caudal mucho más bajo en una pasada, siempre
que se cumpla el período de tiempo de permanencia global. La tanda
Nº 1 era una tanda típica en una modalidad de recirculación. La
tanda Nº 2 se hizo trabajar con 1/10 del caudal de la tanda Nº 1.
Sin embargo, la tanda Nº 2 se realizó a 175 min. por pasada, en
comparación con 18 min. por pasada para la tanda Nº 1. El tiempo de
permanencia global para ambas tandas es aproximadamente el mismo,
\sim180 minutos. Las dos modalidades se ilustran en la Figura
4.
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 6 ilustra el efecto del número de
pasadas sobre la disociación de una Ala-hGH usando
una AAP inmovilizada a 28ºC en una modalidad de recirculación. La
mayor parte de la Ala-hGH se trató mediante la AAP
en estas condiciones.
- \text{*}
- [Ala-hGH] = 9,2 mg/ml; carga de 500 ml.
La Tabla 7 ilustra el efecto de la temperatura y
del tiempo de permanencia sobre la disociación de una
Ala-hGH. Se manifiesta que una diferencia de
temperaturas de diez grados afecta a la eficiencia de disociación.
Se puede requerir un tiempo de permanencia de permanencia más largo
si se necesita un % de disociación más alto.
\vskip1.000000\baselineskip
- \text{*}
- Los productos de disociación fueron analizados por el método de cartografiado de péptidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Los efectos de reemplazar por Cu^{2+} o
Ni^{2+} al cofactor catalítico Zn^{2+} natural de la AAP se
examinaron en el sistema inmovilizado para un tratamiento in
vitro de una Ala-hGH. Esta
Cu-AAP se puede preparar ya sea directamente a
partir de la operación de tratamiento de purificación con AAP, o se
puede convertir en la especie con cobre reemplazando los metales de
zinc de signo contrario, que están presentes como en el material
comercial. La conversión se puede realizar ya sea como la enzima
libre o como la forma inmovilizada.
La Cu-AAP se inmovilizó como
arriba se ha descrito. Una suspensión de resina (muestra A, 20 ml
con un volumen de lecho de resina de 10 ml) se colocó dentro de un
embudo de vidrio sinterizado con una capacidad de 250 ml y se llevó
casi hasta sequedad usando un vacío. Para esto, se añadieron 20 ml
de una mezcla de tricina 50 mM/KCl 50 mM, de pH 7,5 y de
1,10-fenantrolina 20 mM, y se mezclaron durante 20
minutos. La solución se retiró y se colocó en un tampón de nueva
aportación que contenía 1,10-fenantrolina, y se
mezcló durante otras 2 horas. El tampón se retiró y la suspensión
de resina se lavó con agua y con un tampón de HEPES. La resina
resultante se dividió en dos tubos, cada uno con un volumen total de
12 ml. A la muestra B se le añadió CuCl_{2} 0,2 mM en HEPES 50
mM, de pH 7,5, y a la muestra C se le añadió ZnCl_{2} 0,2 mM en
HEPES 50 mM, de pH 7,5. Ambos tubos se agitaron por oscilación
durante 3 horas de manera suave. Las suspensiones se lavaron
extensamente con agua y se almacenaron en el deseado tampón, tal
como el de borato, de pH 9,5.
La velocidad de disociación de una
Ala-hGH mediante Cu-AAP y
Zn-AAP se comparó en ambas modalidades de columna
discontinua y con recirculación. En el ensayo de disociación
discontinua, se añadieron 0,5 ml de una suspensión 1:1 de cada una
de las resinas (B o C) a 2,056 ml de un tampón de borato 10 mM, de
pH 9,5, antes de la adición de Ala-hGH hasta una
concentración final de 0,9 mg/ml. Las reacciones fueron vigiladas
durante 24 horas por recogida de muestras, que fueron sofocadas
mediante separación por filtración de la enzima inmovilizada a
través de un filtro de 0,45 \mum. Luego el material filtrado fue
analizado mediante una RP-HPLC para determinar la
fracción de Ala-hGH que había sido disociada.
En el ensayo de disociación en columnas con
recirculación se vertieron sobre columnas de 1 cm x 5 cm que
contenían, ya sea la resina con Cu-AAP (B) o la
resina con AAP testigo (B). Estas columnas fueron equilibradas con
un tampón de fosfato 10 mM y se hicieron recircular 50 ml de
Ala-hGH 4,75 mg/ml a través de cada una de las
columnas, a razón de 2 VC por hora. Se recogieron las partes
alícuotas y se sofocaron a las 3 h, 6 h, 18 h y 28 h para su
análisis, como anteriormente.
La Figura 5 ilustra una evolución en el tiempo
de una disociación de una Ala-hGH intensificada
mediante Cu-AAP en comparación con
Zn-AAP en la modalidad discontinua. La Figura 6
ilustra una evolución en el tiempo de una disociación de una
Ala-hGH mediante Cu-AAP en
comparación con Zn-AAP, llevada a cabo en una
modalidad de recirculación en columna.
En todas las condiciones de reacción examinadas,
una AAP sustituida con Cu^{2+} era la más activa frente a una
Ala-hGH (Figuras 5 y 6), incluso aunque la
Cu-AAP es menos activa en la hidrólisis de los
substratos cromógenos de
Leu-p-nitroanilida (pNA) (Tabla
8).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
La suspensión de cuerpos de inclusión (CI) se
añadió a una solución previamente mezclada que contenía 34,5 gramos
de bicarbonato de sodio, 156 gramos de un detergente basado en
aminoácidos (p.ej., sarcosina y/o ácido glutámico) y 826 ml de
agua. La solución de CI disueltos se mantuvo durante 20 minutos a la
temperatura ambiente y se añadió una solución de cistina (100 mM,
de pH 10,0). La solución se agitó durante 15 horas a la temperatura
ambiente, antes de enfriar a 4ºC. La mezcla de repliegue terminada
se concentró luego hasta 4 litros, antes de ser diafiltrada frente
a agua de pH 10.
La solución diafiltrada se diluyó con un agua de
pH 10,0 hasta una concentración de Ala-hGH de
\sim2,5 mg/ml. Se añadió una solución de ácido acético al 2%
usando una bomba peristáltica hasta que el pH llegó a \sim5,6 a
4-6ºC. La solución acidificada se agitó durante 30
minutos adicionales. Luego, la solución se centrifugó a 6.000 RPM
(revoluciones por minuto) usando una centrífuga de Sorvall RC5C a
4ºC. El material sobrenadante se decantó y luego se diafiltró
frente a fosfato de sodio 10 mM, de pH 8,0. Luego la concentración
de proteínas se ajustó a
8 mg/ml.
8 mg/ml.
Una aminopeptidasa procedente de
Aeromonas se acopló sobre resinas tales como una resina de
Sepharose 4B por medio de las condiciones químicas del bromuro de
cianógeno (Hermanson, 1992). La actividad de esta enzima
inmovilizada se midió mediante el ensayo patrón sugerido por Sigma,
usando
L-leucina-p-nitroanilida
(Leu-pNA) como substrato. Una solución fría de una
Ala-hGH (8 mg/ml) en un tampón de fosfato 10 mM, de
pH 8,0, se hizo pasar a través de una columna con enzima
inmovilizada, que estaba equipada con una camisa de agua y era
mantenida a 25ºC. El caudal se ajustó a \sim8 ml/h para asegurar
un tiempo de contacto suficiente entre la Ala-hGH y
la enzima inmovilizada. La agrupación obtenida de la disociación se
intercambió luego de tampón frente a urea 3 M, ácido acético 0,05 M
de pH 5,0 (tampón A), antes de cargarla sobre la columna de
cationes.
La carga de cationes se introdujo sobre una
columna de Amicon de 2,2 x 20 cm empaquetada con una resina de
Sepharose CM. La carga total de la columna era de 2,0 g de
Ala-hGH. Después de haberla cargado, la columna se
lavó con un 1 VC (volumen de columna) del tampón A, luego se eluyó
con un gradiente de sal de 0-0,2 M de NaCl por un
total de 54 VC's. El caudal era de 4 VC/hora. El eluyente de la
columna se recogió en fracciones de 0,2 VC y el eluyente se vigiló
con un detector holocromo de Gilson a 280 nm. Las fracciones se
analizaron mediante una HPLC con intercambio de cationes, y las
fracciones que tenían una pureza >95% se agruparon.
La agrupación de cationes se cargó sobre una
columna Amicon de 1,6 x 20 cm que estaba empaquetada con una resina
Q-Sepharose de Pharmacia. Después de haberla
cargado, la columna se lavó con un VC del tampón A. Se realizó un
gradiente lineal de 40 VC de 0-0,15 M de NaCl en un
tampón Tris-Cl de 0,05 M, de pH 7,5. El eluyente de
la columna se recogió igual que anteriormente. Las fracciones fueron
analizadas mediante una HPLC con intercambio de aniones y las
fracciones que tenían una pureza de >98% se agruparon.
El método más conveniente para el análisis de
una reacción de disociación es el método de RP-HPLC.
Sin embargo, el único análisis cuantitativo confiable es el método
de digestión de péptidos. En este método, el límite de detección
para Ala-T1 es de 0,25%.
Después de la reacción de disociación, la
solución se centrifugó usando un aparato Centricon con una membrana
de corte de pesos moleculares de 10 kDa. La concentración de alanina
en el material filtrado se puede medir mediante un analizador de
aminoácidos. Luego, el grado de disociación se puede calcular
mediante la cantidad de alanina liberada a partir de la reacción.
Además, cualquier otro aminoácido detectado debería ser una
indicación de una disociación no específica.
Se usó un método isocrático usando una tampón de
N-propanol (NPA)/fosfato 0,25 M de pH 6,5 (26,74)
como la fase móvil para analizar la Ala-hGH y la
hGH en una columna Vydac 214ATP54. La separación se llevó a cabo a
40ºC. Este método se usó principalmente para vigilar la formación de
hGH por medio de una disociación enzimática de
Ala-hGH. Éste sirvió también como una herramienta
secundaria para decidir cuales fracciones había que recoger a
partir de una columna de intercambio de cationes.
Las Figuras 7 y 8 ilustran perfiles típicos de
HPLC. La Figura 7 ilustra perfiles por HPLC de una
Ala-hGH antes de una disociación incompleta con AAP
y después de que la reacción estuviese completa. La Figura 8 ilustra
el perfil de HPLC de una hGH preparada tratando una
Ala-hGH con AAP, y dos formulaciones comerciales de
hGH (Humatrope y Zomacton).
Una solución de una hGH se ajustó a un pH de 7,5
con NaOH 0,5 N. Esta solución se diluyó con la base de Tris (50
mM, pH 7,5) de manera tal que la concentración final fuese de 2
mg/ml. Luego se añadieron 15 ml de una solución de tripsina (1
mg/ml en la base de Tris 50 mM, pH 7,5). La muestra se mezcló e
incubó a 37ºC durante 4 h, luego se sofocó con 50 ml de HCl (0,5
M). Una parte alícuota de la solución digerida se inyectó sobre una
RP-HPLC y los péptidos fueron resueltos mediante un
gradiente de acetonitrilo con 0,1% de TFA.
Este método proporciona información para la
averiguación de las integridades estructurales primaria y secundaria
de la hGH. Lo que es sumamente importante, éste es el mejor método
para analizar el nivel de trazas de Ala-hGH sin
disociar en la reacción de disociación y en el producto final. La
única diferencia entre los materiales digeridos trípticos de la hGH
y la Ala-hGH es el octa-péptido
N-terminal, T1, frente a Ala-T1.
Estos dos péptidos son resueltos en línea de base usando un método
isocrático de RP-HPLC.
\vskip1.000000\baselineskip
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ T1: FPTIPLSR \+ (SEQ ID NO: 6)\cr Ala-T1: AFPTIPLSR \+ (SEQ ID NO: 7)\cr}
\vskip1.000000\baselineskip
Las Figuras 9-12 ilustran
típicos perfiles de mapas trípticos. La Figura 9 ilustra los
trazados de perfiles que ilustran la diferencia en movilidad del
péptido Ala-T1 en comparación con el péptido T1. La
Figura 10 muestra un trazado de perfil expandido verticalmente, que
ilustra las diferencias en las áreas de pico por debajo de las
posiciones de elución para Ala-T1 y para T1. La
Figura 11 ilustra los mapas trípticos de una hGH purificada después
de un tratamiento de una Ala-hGH con una AAP, en
comparación con los mapas trípticos de una hGH procedente de
fuentes comerciales (Humatrope y Zomacton). La Figura 12 muestra un
trazado de perfil expandido verticalmente que ilustra la presencia
o ausencia de Ala-T1 en una formulación cruda de una
hGH, en la formulación a granel final de una hGH y en una hGH
procedente de dos fuentes comerciales (Humatrope y Zomacton).
La medición está basada en la intensidad de pico
para hGH (22,125) y para Ala-hGH (22,195). La
presencia de otros picos es indicativa de una disociación
enzimática no específica.
La Figura 13 ilustra perfiles de ES/MS de una
Ala-hGH antes de una disociación con AAP, de una
disociación incompleta y después de que la reacción esté completa.
La Figura 8 ilustra el perfil de HPLC de una hGH preparada tratando
una Ala-hGH con una AAP, y de dos formulaciones
comerciales de hGH (Humatrope y Zomacton).
La Figura 14 ilustra un perfil de ES/MS
superpuestas de Ala-hGH y de hGH (panel inferior)
juntamente con los trazados por HPLC del producto final resuelto en
columnas de RP-HPLC y SE-HPLC.
La secuenciación de proteínas en extremos
terminales de N se realizó por métodos clásicos. Las cantidades
relativas de Ala (presente en la Ala-hGH) y de Phe
(en la hGH) como el aminoácido situado en extremos terminales de N,
son indicativas del grado de disociación. Una disociación interna se
puede detectar también mediante un análisis de secuencias de
extremos terminales de N.
La Figura 15 ilustra los trazados de los
productos liberados después del ciclo 1 y del ciclo 2 de un
secuenciador automático de proteínas. La fenilalanina (18,3 min.)
es el único residuo importante detectado después del ciclo 1 (panel
de la izquierda). La prolina (14,2 min.) es el único residuo
importante detectado en el ciclo 2. La cantidad de alanina (*) es
despreciable en ambos ciclos, indicando una falta de residuos de
alanina en extremos terminales de N en el producto purificado
final.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Un Ala-TFPI, aislado a partir de
E. coli (documento US 5.212.091) puede ser transformado en un
TFPI usando una AAP en solución. Un Ala-TFPI
apropiadamente replegado es ajustada a una concentración de
0,5-3 mg por ml en un tampón de fosfato 10 mM, de
pH 8,0 o de borato 10 mM, de pH 9,5. Para esto, una aminopeptidasa
procedente de Aeromonas se añade en una concentración de 3
unidades por ml y se deja que la reacción se desarrolle durante
24-36 horas a la temperatura ambiente o durante un
período de tiempo más corto a 37ºC. El progreso de la reacción de
disociación se puede vigilar por un método de HPLC o por un análisis
de aminoácidos de la liberación de alanina a partir de
Ala-TFPI. Al final de la reacción, la solución se
sofoca añadiendo ácido acético al 2% (dilución 1:1,5 p/p). El grado
de disociación se determina mediante un análisis por HPLC de los
fragmentos trípticos de péptidos y por una ES/MS del producto
aislado.
Un Ala-TFPI puede ser
transformado también en TFPI usando una AAP inmovilizada como arriba
se ha descrito. El grado de disociación es determinado por medio de
un análisis por HPLC de los fragmentos trípticos de péptidos y por
una ES/MS del producto aislado.
<110> Tou, Jacob
\hskip1cmTaylor, Douglas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método para eliminar residuos de
alanina situados en extremos terminales de N a partir de
polipéptidos con una aminopeptidasa procedente de
Aeromonas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
S03108-00-US
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<150> 60/132,O62
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<151>
1999-04-30
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<160> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows versión
4,0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT (proteína)
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético para ensayar la
especificidad para substratos de una aminopeptidasa de metionina
procedente de E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr
Gln Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético para ensayar la
especificidad para substratos de una aminopeptidasa de metionina
procedente de E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Gln
Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético para ensayar la
especificidad para substratos de una aminopeptidasa de metionina
procedente de E. coli
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr
Gln Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 4
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético para ensayar la
especificidad para substratos de una aminopeptidasa de metionina
procedente de E. coli
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<400> 4
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\sa{Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln
Leu}
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<210> 5
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<211> 10
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético para ensayar la
especificidad para substratos de una aminopeptidasa de metionina
procedente de E. coli
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<400> 5
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\sa{Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Gln
Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> T1 es el péptido tríptico situado
en extremos terminales de N de una hGH humana natural
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala-T1 es el
péptido tríptico situado en extremos terminales de N de
Ala-hGH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (11)
1. Un método para eliminar un residuo
alanilo situado en extremos terminales de N a partir de una
proteína recombinante seleccionada entre el conjunto formado por
derivados de Ala en extremos terminales de N de una hormona humana
del crecimiento, somatotropina humana, somatotropina porcina,
somatotropina bovina y un inhibidor de la ruta del factor tisular
humano, que comprende poner en contacto dicha proteína recombinante
con una aminopeptidasa inmovilizada procedente de Aeromonas,
para disociar el residuo alanilo, y recuperar la resultante
proteína recombinante.
2. El método de la reivindicación 1, en
el que el residuo alanilo es no natural para la proteína.
3. El método de la reivindicación 1 ó 2,
en el que la puesta en contacto se lleva a cabo a un pH comprendido
desde pH 7 hasta pH 11.
4. El método de una de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la aminopeptidasa es inmovilizada
sobre un soporte sólido seleccionado entre el conjunto que consiste
en una resina de cromatografía, una superficie de cromatografía, o
un gel de cromatografía.
5. El método de una de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la proteína que se pone en
contacto con la aminopeptidasa es recirculada de manera tal que la
proteína se pone en contacto con la aminopeptidasa al menos en un
momento adicional.
6. El método de una de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que la puesta en contacto se realiza a
una temperatura de desde 20ºC hasta aproximadamente 40ºC.
7. El método de una de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que un cofactor catalítico natural
Zn^{2+} de la aminopeptidasa es reemplazado por un catión
seleccionado entre el conjunto que consiste en Cu^{2+} y
Ni^{2+}.
8. Un método para eliminar residuos
alanilo situados en extremos terminales de N a partir de una
proteína precursora de la fórmula
X-Y-Pro-Z con una
aminopeptidasa procedente de Aeromonas para proporcionar una
proteína de la fórmula Y-Pro-Z, en
la que X es alanilo, Y es cualquier aminoácido distinto de prolina y
Z es uno o más aminoácidos.
9. El método de la reivindicación 8, en
el que Y se selecciona entre el conjunto que consiste en
fenilalanina, metionina, treonina y ácido aspártico.
10. El método de la reivindicación 8, en
el que Y es fenilalanina.
11. El método de la reivindicación 9 ó 10,
en el que la proteína precursora es un derivado de Ala situado en
extremos terminales de N de una hormona humana del crecimiento.
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