ES2278621T3 - Reconstitucion in vitro de virus arn segmentados de polaridad negativa. - Google Patents
Reconstitucion in vitro de virus arn segmentados de polaridad negativa. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2278621T3 ES2278621T3 ES00946097T ES00946097T ES2278621T3 ES 2278621 T3 ES2278621 T3 ES 2278621T3 ES 00946097 T ES00946097 T ES 00946097T ES 00946097 T ES00946097 T ES 00946097T ES 2278621 T3 ES2278621 T3 ES 2278621T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- virus
- cells
- rna
- expression
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 146
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 130
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 62
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 51
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 33
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 claims abstract description 15
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 50
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 39
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 25
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 25
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 17
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 13
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 claims description 13
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 13
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims description 10
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 10
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 9
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 8
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 8
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 6
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 claims description 6
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims description 4
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 claims description 3
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 claims description 3
- 241000713297 Influenza C virus Species 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims 2
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 claims 1
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 claims 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 42
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 18
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 17
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 16
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 13
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 13
- 241000491226 Influenza A virus (A/WSN/1933(H1N1)) Species 0.000 description 11
- 101710102873 Polymerase basic protein 2 Proteins 0.000 description 11
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 102100037516 Protein polybromo-1 Human genes 0.000 description 10
- 101710085035 RNA-directed RNA polymerase catalytic subunit Proteins 0.000 description 10
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 9
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 9
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 9
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 8
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 7
- RSMRWWHFJMENJH-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[[(z)-octadec-9-enoyl]oxy]propyl-trimethylazanium;methyl sulfate Chemical compound COS([O-])(=O)=O.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC RSMRWWHFJMENJH-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 7
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 4
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 4
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 101000909256 Caldicellulosiruptor bescii (strain ATCC BAA-1888 / DSM 6725 / Z-1320) DNA polymerase I Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101000902592 Pyrococcus furiosus (strain ATCC 43587 / DSM 3638 / JCM 8422 / Vc1) DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- -1 and PA) Proteins 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000713112 Orthobunyavirus Species 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 102000017143 RNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010013845 RNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 108091034135 Vault RNA Proteins 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- ZINJLDJMHCUBIP-UHFFFAOYSA-N ethametsulfuron-methyl Chemical compound CCOC1=NC(NC)=NC(NC(=O)NS(=O)(=O)C=2C(=CC=CC=2)C(=O)OC)=N1 ZINJLDJMHCUBIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- PJYYBCXMCWDUAZ-JJJZTNILSA-N 2,3,14,20,22-pentahydroxy-(2β,3β,5β,22R)-Cholest-7-en-6-one Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 PJYYBCXMCWDUAZ-JJJZTNILSA-N 0.000 description 1
- 241000388169 Alphapapillomavirus 7 Species 0.000 description 1
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 1
- 241001493154 Bunyamwera virus Species 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 1
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 208000005331 Hepatitis D Diseases 0.000 description 1
- 208000037262 Hepatitis delta Diseases 0.000 description 1
- 101000635799 Homo sapiens Run domain Beclin-1-interacting and cysteine-rich domain-containing protein Proteins 0.000 description 1
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 1
- 241000712003 Human respirovirus 3 Species 0.000 description 1
- 229940124873 Influenza virus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241001500351 Influenzavirus A Species 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001559185 Mammalian rubulavirus 5 Species 0.000 description 1
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 101150080862 NA gene Proteins 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000712464 Orthomyxoviridae Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- PJYYBCXMCWDUAZ-YKDQUOQBSA-N Ponasterone A Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@@](O)([C@@H](O)CCC(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 PJYYBCXMCWDUAZ-YKDQUOQBSA-N 0.000 description 1
- 101800001494 Protease 2A Proteins 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 101710132594 Protein E6 Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000711897 Rinderpest morbillivirus Species 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 102100030852 Run domain Beclin-1-interacting and cysteine-rich domain-containing protein Human genes 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101000588258 Taenia solium Paramyosin Proteins 0.000 description 1
- 240000001068 Thogoto virus Species 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- BABWHSBPEIVBBZ-UHFFFAOYSA-N diazete Chemical compound C1=CN=N1 BABWHSBPEIVBBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 108010057988 ecdysone receptor Proteins 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 208000029570 hepatitis D virus infection Diseases 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 1
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000005156 neurotropism Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20051—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Método para generar partículas virales infecciosas de un virus ARN segmentado de polaridad negativa que tiene más de 3 segmentos genómicos de ARNv, comprendiendo dicho método: introducir en células cultivadas vectores de expresión que expresan en dichas células los segmentos genómicos de ARNv completo de dicho virus, o los correspondientes ARNc completos de dicho virus, en el que dichas células soportan el crecimiento de dicho virus, proporcionando también dichas células una nucleoproteína y una ARN polimerasa dependiente de ARN mediante lo cual se forman los complejos de RNP que contienen los segmentos genómicos de ARNv de dicho virus y se producen dichas partículas virales infecciosas por dichas células en ausencia de un virus cooperador y en el que dichas células no producen interferón.
Description
Reconstitución in vitro de virus ARN
segmentados de polaridad negativa.
La presente invención se refiere a la
reconstitución (rescate) de virus ARN segmentados de polaridad
negativa en células cultivadas a partir de ADN recombinantes. Más
particularmente, por ejemplo se refiere al rescate de tales virus
que tienen más de 3 segmentos genómicos de ARNv, especialmente, por
ejemplo, los virus influenza que tienen generalmente 8 segmentos
genómicos de ARNv, mediante un sistema dirigido completamente por
vectores, lo que evita la necesidad de un virus cooperador
("helper").
Los últimos cinco años han sido testigos del
rescate de la mayoría de los virus ARN no segmentados de polaridad
negativa importantes a partir de ADN recombinante. En primer lugar,
Schnell et al. tuvieron éxito en la recuperación del virus
de la rabia a partir de ADN recombinante (EMBO J. (1994) 13,
4195-4203). Poco después, se desarrollaron sistemas
de rescate basados en plásmidos para el virus de la estomatitis
vesicular (Lawson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995)
92, 4477-4481; Whelan et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1995) 92, 8388-8392), virus
respiratorio sincitial (Collins et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA (1995) 92, 11563-11567; Jin et al.,
Virology (1998)251, 206-214), virus del
sarampión (Radecke et al., EMBO J. (1995) 14,
5773-5784) y virus Sendai (Garcin et al.,
EMBO J. (1995) 14, 6087-6094; Kato et al.,
Genes Cells (1996) 1, 569-579). Más recientemente,
se han desarrollado sistemas de rescate basados en plásmidos para
el virus parainfluenza humano tipo 3 (Durbin et al.,
Virology (1997) 235, 323-332; Hoffman y Banerjee, J.
Virol. (1997) 71, 4272-4277), virus de la peste
bovina (Baron y Barrett, J. Virol. (1997) 71,
1265-1271), virus de simio 5 (He et al.,
Virology (1997) 237, 249-260), virus respiratorio
sincitial bovino (Buchholz et al., J. Virol. (1999) 73,
251-259) y virus de la enfermedad de Newcastle
(Peeters et al., J. Virol. (1999) 73,
5001-5009).
Bridgen y Elliott (Proc. Natl. Acad. Sci. USA
(1996) 14, 15400-15404) han notificado el rescate
sin virus cooperador de un bunyavirus que tiene sólo 3 segmentos
genómicos de ARNv a partir de ADNc mediante la expresión de ARN
anti-genoma y proteínas virales bajo el control de
un promotor del bacteriófago T7. Sin embargo, hasta ahora no se ha
sabido si una estrategia basada totalmente en plásmidos puede
aplicarse satisfactoriamente para rescatar virus ARN segmentados de
polaridad negativa con un mayor número de segmentos de ARNv, tales
como el virus influenza, sin la ayuda de un virus cooperador.
La gripe sigue siendo una amenaza mundial
constante para la salud en seres humanos y, por tanto, hay una
necesidad particular para un método listo para generar virus
influenza modificados con mutaciones conocidas en cualquiera de los
segmentos genómicos del ARNv. La obtención mediante ingeniería
genética de los segmentos de ARNv del virus influenza para la
expresión de secuencias heterólogas también es de gran interés, por
ejemplo, en el desarrollo de nuevas vacunas eficaces contra el
virus influenza y un segundo agente patógeno. Se conocen tres tipos
de virus influenza designados como los tipos A, B y C. Hasta ahora,
el virus de la influenza A ha sido el principal centro de atención
en lo que se refiere a la manipulación genética. El genoma de un
virus influenza A de tipo natural consiste en 8 segmentos de ARN de
sentido negativo de cadena sencilla que codifica para 10
polipéptidos: las proteínas ARN polimerasas dependientes de ARN (PB
1, PB2, y PA), la nucleoproteína (NP), las proteínas de la matriz
(M1, M2), dos glucoproteínas de superficie que se proyectan desde la
envuelta lipoproteica (hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA)) y
las proteínas no estructurales NS1 y NS2. Las proteínas HA, NA, NP
y polimerasa se codifican por segmentos genómicos
monocistrónicos.
En cuanto a otros virus ARN segmentados de
polaridad negativa, durante el ciclo de replicación de un virus
influenza, el genoma viral se transcribe a ARNm y se replica a ARN
complementario (ARNc). Para esto, es necesario que los segmentos
genómicos de ARNv formen complejos con la nucleoproteína y la ARN
polimerasa dependiente de ARN en complejos de ribonucleoproteína
(RNP) (Huang et al., J. Virol. (1990) 64,
5669-5673; García-Sastre, Trends In
Biotechnology (1998) 16, 230-235). Inicialmente, con
el fin de manipular el genoma de un virus influenza, las RNP se
reconstituyeron in vitro de ARN transcrito a partir de ADN de
plásmido en presencia de las proteínas polimerasas PB1, PB2 y PA y
la nucleoproteína aislada del virus influenza purificado (Enami
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87,
3802-3805; Enami y Palese, J. Virol. (1991) 65,
2711-2713; Muster y García-Sastre,
Genetic manipulation of influenza viruses in Textbook of influenza
(1998), capítulo. 9, eds. Nicholson et al.). Las RNP
reconstituidas in vitro se transfectaron en células
infectadas con un virus influenza cooperador, que proporcionó los
segmentos de ARN y las proteínas virales requeridas restantes, dando
como resultado la generación de virus transfectantes. Esta técnica
ha sido extremadamente útil en el avance de la comprensión de la
biología molecular y la patogenicidad de los virus influenza. Sin
embargo, se basa en métodos de selección altamente especializados
para aislar los virus transfectantes del virus cooperador, lo que
limita su uso a ciertos segmentos de ARN de un número limitado de
cepas virales.
Más recientemente, se ha demostrado que es
posible la reconstitución intracelular de un complejo de RNP a
partir de un segmento de ARNv transcrito intracelularmente
utilizando proteínas polimerasas y NP expresadas en plásmidos
(Neumann et al., Virology (1994) 202,
477-479; Zhang y Air, Biochem. Biophys. Res. Commun.
(1994) 200, 95-101; Pleschka et al., J.
Virol. (1996) 70, 4188-4192). Por ejemplo, Pleschka
et al. demostraron que PB 1, PB2, PA y NP del virus
influenza A expresadas a partir de plásmidos podían encapsidarse,
transcribirse y replicar un ARN similar al ARNv del virus influenza
que contiene un gen indicador ("reporter") de la cloranfenicol
acetiltransferasa (CAT) en células 293 humanas transfectadas. Este
gen indicador similar al ARNv se introdujo en las células huésped
escogidas mediante la transfección de ADN de plásmido
(pPOLI-CAT-RT) que tiene un promotor
truncado de la ARN polimerasa I humana (nucleótidos -250 a -1)
colocado en el sentido de 5' de la región codificante del ARNv. La
secuencia de la ribozima genómica del virus de la hepatitis delta se
colocó en el sentido de 3' de la región codificante del ARNv con el
fin de garantizar el procesamiento del ARN para dar el extremo 3'
correcto del ARNv transcrito. El mismo grupo también notificó que
sustituyendo el plásmido que codifica para el indicador de la CAT
por un plásmido que codifica para un segmento de ARNv del virus
influenza A auténtico, podrían rescatarse complejos de RNP
reconstituidos intracelularmente en virus transfectados con la
infección de las células transfectadas con un virus influenza
cooperador. Pleschka et al. investigaron un sistema de
rescate de este tipo basado en un virus cooperador, empleando
segmentos de ARNv de NA del virus influenza A mutante transcritos
intracelularmente. Sin embargo, volviendo a un sistema de rescate
basado enteramente en plásmidos para el virus influenza, surgen
nuevas consideraciones en lo que se refiere a obtener la expresión
adecuada de todas las secuencias requeridas y la cooperación
correcta de estas secuencias para ensamblar un virus completo.
Brigen y Elliot fueron incapaces de rescatar el
bunyavirus Bunyamwera usando plásmidos que dirigen la
expresión de segmentos genómicos de ARNv más que ARN
anti-genoma. Sin embargo, se ha descubierto que el
rescate sin virus cooperador de un virus influenza A en cultivo
celular es factible mediante contransfección en células cultivadas
de 12 plásmidos que pueden coexpresar 8 segmentos de ARNv y las
proteínas NP y 3 ARN polimerasas necesarias para la formación de
complejos de RNP. Puede extrapolarse esta misma estrategia a una
variedad de otros virus ARN segmentados de polaridad negativa que
tienen un gran número de segmentos genómicos de ARNv, por ejemplo 6
o más, incluyendo, por ejemplo virus influenza de otros tipos y
otros miembros de la familia Orthomyxoviridae tales como los
thogotovirus que contienen 6 segmentos de ARNv. Mientras que los
virus de tipo natural tanto influenza A como influenza B tienen 8
segmentos de ARNv, se ha descrito que los virus influenza A
modificados contienen un segmento de ARNv adicional (Enami et
al., Virology (1993) 185, 765-90) y los virus
influenza C tienen un segmento de ARNv menos.
Así la presente invención proporciona un método
para generar partículas virales infecciosas de un virus ARN
segmentado de polaridad negativa que tienen más de 3 segmentos
genómicos de ARNv, comprendiendo dicho método:
- introducir en células cultivadas vectores de expresión que expresan en dichas células los segmentos genómicos de ARNv completo de dicho virus, o los correspondientes ARNc completos de dicho virus, en el que dichas células soportan el crecimiento de dicho virus, proporcionando también dichas células una nucleoproteína y una ARN polimerasa dependiente de ARN, mediante lo cual se forman los complejos de RNP que contienen los segmentos genómicos de ARNv de dicho virus y se producen dichas partículas virales infecciosas por dichas células en ausencia de un virus cooperador y en el que dichas células no producen interferón.
Adicionalmente, las células huésped escogidas
pueden, por ejemplo, tener introducidos uno o más vectores de
expresión adicionales que pueden dirigir la expresión en las células
de una o más de las proteínas virales necesarias. Por ejemplo,
puede emplearse un segundo conjunto de vectores de expresión para
expresar en las células huésped todas las subunidades de polimerasa
dependiente de ARN y nucleoproteína. Convenientemente, por ejemplo,
puede usarse un vector de expresión diferente para cada una de esas
proteínas. Alternativamente, las células huésped elegidas pueden,
por ejemplo, obtenerse por ingeniería genética para expresar una o
más de las subunidades de ARN polimerasa dependiente de ARN y
nucleoproteína necesarias. Si todas las proteínas esenciales para
la encapsidación, transcripción y replicación de los ARNv se
proporcionan mediante las células huésped de partida, entonces se
apreciará que sólo se necesita el primer conjunto de vectores de
expresión. Es más, las células huésped de partida elegidas pueden
ser células obtenidas por ingeniería genética para expresar uno o
más de los segmentos genómicos de ARNv del virus deseado. Por medio
de un método de la invención, se apreciará que el rescate de un
virus ARN segmentado de polaridad negativa puede lograrse sin
ninguna asistencia viral, por ejemplo mediante un método totalmente
basado en
plásmidos.
plásmidos.
En un aspecto adicional, la invención
proporciona un método para generar en células cultivadas partículas
virales infecciosas de un virus segmentado de polaridad negativa,
comprendiendo dicho método:
- proporcionar una primera población de células que pueden soportar el crecimiento de dicho virus y que se han modificado para proporcionar (a) el ARNv genómico de dicho virus y (b) una nucleoproteína y una ARN polimerasa dependiente de ARN, mediante lo cual se forman los complejos de RNP que contienen dichos ARNv genómicos y se ensamblan dichas partículas virales infecciosas, expresándose directamente dichos ARNv genómicos en dichas células bajo el control del promotor Pol I de mamífero o un derivado funcional del mismo en ausencia de un virus cooperador, y
- en el que dichas células no producen interferón.
Se apreciará que las células huésped modificadas
para el rescate viral, tal como se describió anteriormente,
constituyen un aspecto adicional de la presente invención. Las
partículas virales producidas por dicha primera población de
células pueden amplificarse mediante una o más etapas de infección
celular adicionales, por ejemplo, empleando células cultivadas
iguales o diferentes de dicha primera población de células. Para su
uso, las partículas virales así producidas pueden aislarse.
Cuando las partículas virales inicialmente
producidas por las células huésped no se atenúan, puede llevarse a
cabo posteriormente una etapa de atenuación o inactivación viral
convencional, por ejemplo, antes de la formulación para su uso como
vacuna. Las partículas virales generadas según la invención pueden
ser partículas virales recombinantes que pueden expresar una
secuencia heteróloga. Tales partículas, si fuese necesario tras la
atenuación o inactivación según sea apropiado, también pueden
formularse para su uso como vacuna u otro fin terapéutico.
A diferencia de las técnicas de rescate basadas
en virus cooperador anteriores para el virus influenza, los métodos
de la invención pueden usarse fácilmente para la generación de virus
influenza infecciosos de cualquiera de los tipos A, B y C con
múltiples mutaciones en varios genes diferentes al mismo tiempo. Un
método de este tipo también permite una producción más sencilla y
más directa de un virus segmentado de polaridad negativa
reasortante que contiene segmentos de ARNv derivados de más de un
virus original. Convencionalmente, se obtienen virus reasortantes
mediante la selección de partículas virales de una infección viral
mixta de células. Un método de la invención es particularmente
ventajoso para la producción de un virus segmentado de polaridad
negativa reasortante que es difícil de aislar mediante métodos
clásicos.
La figura 1 es una representación esquemática de
una realización de la invención, tal como se describe adicionalmente
en los ejemplos 1 a 3, en los que se cotransfectan 12 plásmidos
para la expresión directa de los segmentos de ARNv de un virus
influenza A y la expresión de subunidades de ARN polimerasa
dependiente de ARN y nucleoproteína de influenza A en células Vero
cultivadas (células de riñón de mono verde africano). En esta
realización, se emplean células MDBK (de riñón bovino
Madin-Darby) para un ensayo de placas de lisis y la
amplificación de partículas virales rescatadas. Sin embargo, se
apreciará que pueden emplearse igualmente otras células que
soportan el crecimiento del virus influenza A para el ensayo de
placas de lisis y para la amplificación incluyendo células Vero y
MDCK (riñón canino Madin-Darby). En la figura 1, POL
I = promotor de ARN polimerasa I humano trucado, R= ribozima
genómica del virus de la hepatitis, MLP= promotor tardío principal
de adenovirus tipo 2 unido a una secuencia sintética que comprende
la secuencia líder tripartita de corte y empalme del adenovirus
humano tipo 2 y pA= secuencia de poliadenilación de SV40.
Se prefiere emplear vectores de expresión para
expresar directamente segmentos genómicos de ARNv del virus
deseado. Estos pueden ser segmentos de ARNv totalmente de tipo
natural o pueden incluir al menos un segmento de ARNv de tipo no
natural, por ejemplo, un segmento de ARNv mutante con una o más
sustituciones, inserciones o deleciones de nucleótidos.
Por ejemplo, al menos un segmento de ARNv
proporcionado en las células huésped puede ser un segmento de ARNv
quimérico que puede expresar una secuencia heteróloga al genoma
viral en células diana infectadas por el virus rescatado. Dicha
secuencia heteróloga, puede codificar para un péptido o un
polipéptido. Alternativamente, puede codificar para un ácido
nucleico tal como una ribozima o un ácido nucleico antisentido. La
secuencia heteróloga puede proporcionarse en un segmento de ARNv
que adicionalmente codifica para una proteína viral nativa completa
tal como se ilustra mediante el segmento de ARNv quimérico descrito
en el ejemplo 8 o puede insertarse en la secuencia codificante para
una proteína viral. Por ejemplo, se sabe que la proteína HA del
virus influenza A puede tolerar un injerto de epítopos en el sitio
antigénico B. Se revisan métodos para construir tales segmentos de
ARNv quiméricos, por ejemplo en, Muster y
García-Sastre, Cap. 9, Textbook of Influenza (1998)
y Palese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93,
11354-11358. También se han descrito previamente
estrategias para construir segmentos de ARNv de virus influenza
quiméricos en la solicitud de patente internacional publicada WO
91/03552.
Los segmentos de ARNv proporcionados en las
células huésped pueden incorporar adicional o alternativamente una
o más mutaciones atenuantes. Por ejemplo, los segmentos de ARNv
pueden ser los segmentos de ARNv de un virus influenza A con una
sustitución de par de bases atenuante en una región promotora dúplex
"pan-handle" (estructura con forma de mango de
sartén), en particular, por ejemplo, la sustitución de par de bases
atenuante conocida de A por C y U por G en la posición
11-12' en la región dúplex del ARNv específico de NA
(Fodor et al., J. Virol. (1998) 6238-6290).
Usando el sistema de rescate de la invención, pueden identificarse
nuevas mutaciones atenuantes. Tal como se indica anteriormente,
cuando las partículas virales no atenuadas se producen inicialmente
mediante un método de la invención, la atenuación o inactivación de
las partículas virales puede, sin embargo, lograrse
secuencialmente, mediante métodos clásicos.
Los virus atenuados o inactivados producidos
según la invención pueden incorporarse posteriormente a la
composición de vacuna de una manera convencional. Cuando tal virus
tiene un segmento de ARNv quimérico, tal como se trató
anteriormente, que codifica para un antígeno foráneo, puede
formularse para lograr la vacunación frente a más de un patógeno
simultáneamente. Los virus recombinantes atenuados producidos según
la invención, que tienen un segmento de ARNv quimérico también
pueden diseñarse para otros usos terapéuticos, por ejemplo un agente
antitumoral o una herramienta para terapia génica, en cuyo caso la
producción de virus vendrá seguida de su incorporación en una
composición farmacéutica apropiada junto con un vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable.
También, tal como se indicó anteriormente, el
rescate sin virus cooperador según la invención está particularmente
favorecido para la generación de virus reasortantes, especialmente
virus influenza reasortantes deseados para su uso como vacuna. Por
ejemplo, por medio de un rescate viral según la invención, los
segmentos de ARNv de NA y HA de un virus influenza, por ejemplo,
influenza A/PR8/34 que se reconoce como adecuado para la
administración a seres humanos, pueden sustituirse fácilmente por
los segmentos de ARNv de NA y HA de una cepa de virus influenza
asociada con una infección epidémica de gripe. Tales virus influenza
reasortantes pueden, por ejemplo, usarse para la producción de una
vacuna de virus influenza inactivo de la manera convencional (véanse
los ejemplos 4 y 6).
Los vectores de expresión empleados pueden ser
preferiblemente plásmidos que pueden dar la replicación en las
células huésped elegidas. Puede proporcionarse un vector de
expresión diferente para la expresión directa de cada segmento de
ARNv requerido o el ARNc correspondiente. Tal como ya se ha
mencionado anteriormente, puede proporcionarse un segundo conjunto
de vectores de expresión para cada una de las subunidades de ARN
polimerasa dependiente de ARN y la nucleoproteína, por ejemplo, las
subunidades PB1, PB2 y PA de una ARN polimerasa dependiente de ARN
de un virus influenza. Sin embargo, tal como se indicó también
anteriormente, puede usarse alternativamente una línea celular que
puede expresar una o más de estas proteínas, en cuyo caso puede
reducirse o incluso eliminarse el segundo conjunto de vectores de
expresión. El ejemplo 7 ilustra un método de este tipo para el
rescate sin virus cooperador de un virus influenza A empleando una
línea celular que expresa de manera estable la nucleoproteína.
Todos los vectores de expresión necesarios
pueden introducirse preferiblemente en la célula huésped elegida en
una única etapa de cotransfección o cotransducción. Con este fin,
puede emplearse preferiblemente la transfección liposomal, por
ejemplo usando el reactivo de transfección liposomal DOTAP
(Boehinger Mannheim) o LipofectAMINE 2000 (Gibco BRL).
Sin embargo, se apreciará que puede llevarse a
cabo más de una etapa de transferencia de vector, y otros medios
conocidos para la introducción de vectores en las células de
mamíferos empleadas, por ejemplo, electroporación, transfección con
DEAE-dextrano, bombardeo de micropartículas y
transducción viral, por ejemplo, el uso de retrovirus defectuosos
en la replicación. También se prefiere particularmente la
precipitación con fosfato de calcio (véase el ejemplo 5). Puede
elegirse, por ejemplo para introducir en las células huésped
vectores de expresión para la expresión de las proteínas NP y
polimerasa antes de los vectores de expresión para la expresión de
los segmentos de ARNv. Las células huésped en la que los vectores
requeridos se introducen puede estar en una placa de cultivo o
cultivados de otras formas apropiadas para la transfección o
transducción de vectores.
La expresión de los segmentos de ARNv o los
correspondientes ARNc estará preferiblemente bajo el control de una
secuencia promotora derivada de un promotor Pol I de ARN de
mamífero. Particularmente preferido para este fin es el promotor
Pol I de ARN humano truncado que consiste en los nucleótidos -250 a
-1 del promotor nativo correspondiente o un derivado funcional del
mismo (Jones et al., Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU. (1998) 85,
669-673). Sin embargo, alternativamente pueden
usarse otros promotores, incluyendo, por ejemplo, un promotor de ARN
polimerasa T7. Para garantizar el extremo 3' correcto de cada ARNv
o ARNc expresado, cada vector de expresión de ARNv o ARNc
incorporará una secuencia de ribozima o la secuencia de terminación
apropiada en sentido 3' de la secuencia codificante de ARN. Esto
puede ser, por ejemplo, la secuencia de ribozima genómica del virus
de la hepatitis delta o un derivado funcional de la misma.
Alternativamente, por ejemplo, puede emplearse un terminador Pol I
(Neumann et al., Virology (1994) 202,
477-479). Los vectores de expresión de ARN pueden
construirse de la misma manera que los vectores de expresión de ARNv
descritos en Pleschka et al., J. Virol. (1996) 70,
4188-4192.
4188-4192.
Cuando se necesitan uno o más vectores de
expresión de proteínas para expresar proteínas virales para la
formación de complejos de RNP, éstos expresarán preferiblemente las
proteína(s) viral(es) requerida(s)
homóloga(s) al virus deseado. La expresión de las
subunidades de la polimerasa dependiente de ARN y la nucleoproteína
puede estar preferiblemente, por ejemplo, bajo el control de una
secuencia reguladora que comprende el promotor tardío principal del
adenovirus 2 unido a la secuencia líder tripartita de corte y
empalme de adenovirus humano tipo 2, tal como se describe por Berg
et al., BioTechniques, 14, 972-978, o un
derivado funcional de dicha secuencia reguladora. Sin embargo,
pueden sustituirse posiblemente secuencias de promotor alternativas
operativas en células de mamíferos tales como, por ejemplo, otro
promotor viral tal como, por ejemplo, el promotor precoz de
citomegalovirus (CMV) humano o un promotor de polimerasa T7.
Plásmidos apropiados para la expresión de subunidades de polimerasa
y NP pueden construirse, por ejemplo, partiendo del plásmido
pGT-h tal como también se describe en el artículo
anteriormente citado de Berg et al.
La descripción se describirá adicionalmente a
continuación con referencia específica al rescate de virus influenza
A. Con el fin del rescate del virus influenza A mediante la
estrategia de la invención utilizando plásmidos que expresan
directamente los ARNv requeridos, ha resultado favorable, por
ejemplo, usar células Vero (riñón de mono verde africano), aunque
pueden emplearse otras células que soportan el crecimiento de virus
influenza, por ejemplo, preferiblemente células de riñón
embrionario humano 293T. Tales células pueden transfectarse
preferiblemente sobre la superficie de una placa de cultivo
adecuada.
Se sabe las células Vero son deficientes en la
expresión de interferón (Diaz et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1998) 85, 5259-5263), que puede ser un factor
para alcanzar un buen rescate viral. Por tanto, se extrapola que
las células Vero y otras células deficientes en la actividad o
respuesta de interferón que soportarán el crecimiento de virus ARN
segmentados de polaridad negativa son útiles en la práctica de la
invención.
Pueden determinarse cantidades y razones
apropiadas de vectores para llevar a cabo un método de la invención
mediante experimentación rutinaria. Como guía, en el caso de
transfección liposomal o precipitación con calcio de plásmidos en
células huésped, se prevé que cada plásmido puede emplearse con unos
cuantos \mug, por ejemplo de 1 a 10 \mug, por ejemplo diluido
hasta una concentración final de ADN total de aproximadamente 0,1
\mug/ml antes de mezclarlo con el reactivo de transfección de la
manera convencional. Puede preferirse usar vectores que expresan
subunidades de ARN polimerasa dependiente de ARN y/o NP a una
concentración superior que aquellos que expresan segmentos de
ARNv.
Según ciertos aspectos, la presente memoria
descriptiva también proporciona un método para generar en células
cultivadas partículas virales infecciosas de un virus ARN sementado
de polaridad negativa, método que comprende:
- (i)
- proporcionar una población de células que pueden soportar el crecimiento de dicho virus y que se modifican de modo que puedan proporcionar (a) los ARNv genómicos de dicho virus en ausencia de un virus cooperador y (b) una nucleoproteína y ARN polimerasa dependiente de ARN mediante lo cual pueden formarse el complejo o complejos de RNP que contienen dichos ARNv genómicos y pueden ensamblarse dichas partículas virales, expresándose directamente dichos ARN genómicos en dichas células bajo el control de un promotor Pol I de mamífero o un derivado funcional del mismo, por ejemplo, el promotor Pol I humano truncado tal como se indicó anteriormente y
- (ii)
- cultivar dichas células, mediante lo cual se producen dichas partículas virales.
Dichas células productoras de virus pueden, por
ejemplo, ser preferiblemente células Vero u otras células
deficientes en actividad o respuesta de interferón que soportarán el
crecimiento de un virus ARN segmentado de polaridad negativa.
Pueden proporcionarse todas o algunas de las secuencias codificantes
para dichos ARNv genómicos, nucleoproteína y ARN polimerasa
dependiente de ARN, en las células huésped elegidas introduciendo
vectores de expresión en las células.
Los siguientes ejemplos muestran la invención
con referencia al rescate sin virus cooperador de un virus influenza
A. Sin embargo tal como se indicó anteriormente, la invención no
está limitada a dichos virus sino que puede aplicarse a otros virus
ARN segmentados de polaridad negativa, especialmente, por ejemplo
virus influenza de otros tipos.
Ejemplo
1
Se usaron ocho plásmidos cada uno expresando un
segmento de ARNv diferente del virus influenza A/WSN/33
(pPOL1-PB2-RT,
pPOL1-PB1-RT,
pPOL1-PA-RT,
pPOL1-HA-RT,
pPOL1-NP-RT,
pPOL1-NA-RT,
pPOL1-M-RT y
pPOL1-NS-RT). Éstos eran plásmidos
basados en pUC19 o pUC18 análogos en estructura al plásmido que
codifica para el segmento de ARNv modelo,
pPOL-CAT-RT, descrito en Pleschka
et al., (1996) J. Virol., 70, 4183-4192,
aparte de la sustitución del ADNc que codifica para el segmento del
gen indicador CAT del ARNv (un marco de lectura abierto para
cloranfenicol acetiltransferasa en polaridad negativa flanqueado
por las regiones no codificantes del segmento de ARNv que codifica
para NS del virus influenza A/WSN/33) mediante un ADNc que codifica
para un segmento de ARNv nativo del virus influenza A/WSN/33. En
cada uno de estos plásmidos, un promotor Pol I de ARN humano
truncado (posiciones -250 a -1) se fusionó con el extremo del ADNc
que codifica para un segmento de ARNv para garantizar el extremo 5'
correcto del ARNv transcrito. También se proporciona en cada uno de
los plásmidos que codifican para un segmento de ARNv, la secuencia
de la ribozima genómica del virus de la hepatitis delta para
garantizar también el extremo 3' correcto del ARNv transcrito.
Pueden obtenerse muestras del virus influenza
A/WSN/33 para la preparación de los insertos de ADNc de los
plásmidos descritos anteriormente, por ejemplo, a partir de W.H.O.
Collaborating Centre, Division of Virology, National Institute for
Medical Research (Centro colaborador de la OMS, División de
Virología, Instituto Nacional para la Investigación Médica),
Londres, R.U.).
Ejemplo
2
Adicionalmente, se prepararon 4 plásmidos de
expresión (pGT-h-PB1,
pGT-h-PB2,
pGT-h-PA y
p-GT-h-NP) que
pueden expresar cada uno una proteína distinta seleccionada de las
proteínas PB1, PB2, PA y NP requeridas bajo el control del promotor
tardío principal de adenovirus 2 unido a la secuencia sintética que
comprende la secuencia líder tripartita de corte y empalme del
adenovirus humano tipo 2. Se notificó anteriormente que este
promotor daba una expresión de alto nivel de proteínas en células
adaptadas para el cultivo en suspensión sin suero (Berg et
al., (1993) BioTechniques, 14, 972-978). El
conjunto de pGT-h de plásmidos de expresión de
proteínas se construyó insertando los marcos de lectura abiertos
para las proteínas PB1, PB2, PA y NP en el sitio de clonación Bcl I
del plásmido pGT-h (Berg et al. (1993)
ibíd.).
Los plásmidos de expresión que codifican para la
nucleoproteína viral y 3 subunidades de proteína de la ARN
polimerasa dependiente de ARN se cotransfectaron en células 293
humanas o células Vero con el plásmido de expresión
pPOL1-CAT-RT. Tanto en las células
293 humanas como Vero transfectadas, pudo detectarse actividad CAT.
Se eligieron células Vero para la generación sin virus cooperador
del virus influenza A/WSN/33 a partir de segmentos de ARNv
transfectados tal como se describe adicionalmente más adelante dado
que soportan un mejor crecimiento del virus influenza A/WSN/33 que
las células 293 humanas (aproximadamente una diferencia de un log
en el título viral máximo).
Ejemplo
3
Para el rescate viral, se cotransfectaron
células Vero casi confluentes en placas de 8,5 cm de diámetro
(aproximadamente 10^{7} células que cubren aproximadamente el 90%
de la placa) con los cuatro plásmidos de expresión de proteínas y
los ocho plásmidos de transcripción de ARNv descritos anteriormente.
Para esta etapa de cotransfección, se diluyeron 5 \mug de cada
uno de los plásmidos de expresión de proteína polimerasa, 10 \mug
del plásmido de expresión de NP y 3 \mug de cada uno de los 8
plásmidos que codifican para ARNv hasta una concentración de 0,1
\mug/\mul en tampón Hepes 20 mM (pH 7,5). La disolución de ADN
se añadió al reactivo de transfección liposomal DOTAP diluido
(Boehringer Mannheim) que contiene 240 \mul de DOTAP y 720 \mul
de tampón Hepes 20 mM (pH 7,5). Se incubó la mezcla de transfección
a temperatura ambiente durante 15 min. y entonces se mezcló con 6,5
ml de medio esencial mínimo (MEM) que contiene un 0,5% de suero de
ternero fetal (FCS), un 0,3% de albúmina de suero bovino (BSA),
penicilina y estreptomicina. Se añadió esta mezcla a las células
Vero lavadas con PBS. Se eliminó el medio de transfección después
de 24 horas de las células y se sustituyó con 8 ml de medio fresco
(MEM) que contenía un 0,5% de FCS, un 0,3% de BSA, penicilina y
estreptomicina. Las células Vero transfectadas se cultivaron
durante al menos 4 días tras la transfección. Cada día, se recogía
el medio de las células transfectadas y se analizaba para
determinar la presencia de virus influenza mediante un cultivo de
placas de lisis de una alícuota de 0,5 ml sobre células MDBK de la
manera convencional. El resto del medio se transfirió a matraces de
75 cm^{2} de células subconfluentes para la amplificación de
cualquier virus rescatado. Las células transfectadas originales se
incubaron adicionalmente después de añadir 8 ml de medio nuevo.
Este procedimiento dio como resultado la
recuperación del virus influenza infeccioso en el día 4 tras la
transfección. Se obtuvieron aproximadamente de 10 a 20 partículas
virales formadoras de placas de lisis de una placa de 8,5 cm que
contiene aproximadamente 10^{7} células. El virus rescatado mostró
una propiedad específica característica del virus influenza
A/WSN/33, es decir, formó placas de lisis sobre las células MDBK en
ausencia de tripsina. Las placas de lisis formadas por el virus
rescatado son comparables en tamaño con aquellas formadas mediante
la muestra de virus A/WSN/33 auténtico de control que se hizo crecer
sobre las mismas células MDBK.
Para confirmar que las placas de lisis virales
observadas sobre las células MDBK tratadas con virus recogido del
medio de cultivo de células transfectadas se derivaban de los ADNc
clonados, se introdujeron etiquetas genéticas en dos de los 8 ADNc
de segmento de ARNv. Se construyó un ADNc que codifica para un
segmento de ARNv HA con una mutación de 6 nucleótidos cerca del
extremo 3' del segmento. Los nucleótidos 31 a 35 del extremo 3'
(3'-UUUUG-5') se sustituyeron por
3'-AAAAC-5' dando como resultado una
sustitución de aminoácido en el aminoácido 4(K \rightarrow
F) y en el aminoácido 5(L \rightarrow V) cerca del extremo
N-terminal de HA dentro del péptido señal. Además,
se creó una mutación silenciosa C \rightarrow U en el nucleótido
40. Estos cambios introdujeron varios sitios de restricción nuevos,
incluyendo un sitio SpeI único. El ADNc que codifica para el
segmento NA se mutó para codificar para un segmento NA que contiene
dos mutaciones silenciosas en los nucleótidos 1358 y 1360 de modo
que se introduzca un sitio de restricción SacI único nuevo
(Pleschka et al., J. Virol. (1996) 70,
4188-4192).
Se usó medio de células MDBK infectadas con el
virus transfectante rescatado para aislar ARNv. Se trataron 100
\mul de medio con 5 u de ADNasa sin ARNasa para eliminar cualquier
ADN de plásmido residual remanente. Después de 15 min. a 37ºC, se
aisló ARNv usando el kit RNeasy Mini Kit (Qiagen). Se amplificaron
regiones cortas de los ARNv de HA y NA que se esperaba que
contuviesen las etiquetas genéticas mediante RT-PCR
y después se analizaron mediante digestión con las enzimas de
restricción SpeI y SacI, respectivamente. Como control, también se
amplificaron las mismas regiones de los segmentos HA y NA a partir
del ARNv aislado del virus influenza A/WSN/33 auténtico usando los
mismos cebadores de la RT-PCR.
Los productos de la PCR obtenidos a partir del
virus rescatado y del virus de control eran del mismo tamaño.
Aquellos que provenían de los segmentos HA y NA del virus rescatado
pudieron digerirse con SpeI y SacI respectivamente. Sin embargo,
los productos de la PCR correspondientes al virus de control, tal
como se esperaba, no se digirieron por las mismas enzimas. La
omisión de la transcriptasa inversa en las reacciones de
RT-PCR de control no dio como resultado productos
de la PCR visibles.
Los estudios descritos anteriormente muestran
que es posible rescatar un virus influenza A mediante cotransfección
de 8 plásmidos de transcripción para los segmentos ARNv
individuales y 4 plásmidos de expresión que codifican para las
proteínas NP, PB1, PB2 y PA requeridas en células Vero en ausencia
de cualquier virus cooperador.
Se destaca que en los estudios mencionados
anteriormente, el virus influenza se generó expresando segmentos de
ARNv de sentido negativo. Esto parece contradecir algunos estudios
anteriores que enfatizan la importancia de usar ARN de polaridad
positiva para rescatar virus ARN de polaridad negativa, incluyendo
virus Bunyamwera cuyo genoma está en 3 segmentos (Schnell
et al., (1994) EMBO J., 13, 4195-4203;
Roberts y Rose (1998), Virology 247, 1-6; Bridgen y
Elliot (1996) 93, 15400-15404). Sin embargo, se han
notificado recuperaciones exitosas más recientes de virus ARN no
segmentados de polaridad negativa a partir de ARN de sentido
negativo (Kato et al., (1996) Genes Cells 1,
569-579; Durbin et al. (1997) Virology, 235,
323-332).
En un protocolo de la invención, tal como se
ilustró anteriormente, en las fases iniciales tras la transfección,
coexiste ARNm de sentido positivo procedente de los 4 plásmidos de
expresión de proteínas con ARNv genómico desnudo de sentido
negativo transcrito a partir de los plásmidos de transcripción. Por
tanto, puede formarse ARN de doble cadena. La formación de tal ARN
de doble cadena en células humanas podría conducir posiblemente a
la inducción de respuestas antivirales mediadas por interferón y
consecuentemente a la supresión del crecimiento de cualquier virus
rescatado. Sin embargo, tal inducción de interferón se obvia como un
problema en las células Vero dado que tales células son deficientes
en la expresión de interferón.
Ejemplo
4
Con el fin de rescatar A/PR/8/34 completamente
de ADN recombinante, se generaron 12 plásmidos. Los 12 plásmidos
son análogos a los descritos para el rescate del virus A/WSN/33
(véanse los ejemplos 1 y 2 anteriormente), con unas cuantas
modificaciones. Los 8 plásmidos requeridos para la síntesis de los 8
segmentos de ARNv, mediante ARN polimerasa 1 celular, tienen una
secuencia de terminación de ADNr murino (Gen-Bank,
número de registro M12074) en lugar del ribozima del virus de la
hepatitis delta para generar el extremo 3' exacto de los segmentos
de ARNv. Los 4 plásmidos de expresión de proteínas para las
subunidades de polimerasa de A/PR/8/34 (PB1, PB1, PA) y la
nucleoproteína (NP) se basan en el pcDNA3 disponible comercialmente
(Invitrogen, nº de catálogo V790-20), que tiene un
promotor de citomegalovirus (CMV) y un sitio de poli(A) de la
hormona de crecimiento bovina (HCB).
Con el fin de permitir la fácil clonación de los
8 segmentos de ARNv, se construyó un nuevo vector de clonación
básico, pPolISapIT. En este nuevo constructo, la secuencia de
terminación de ADNr murino (posiciones +572 a +715) se sitúa en
sentido 3' del promotor Pol I. El promotor Pol I y las secuencias de
terminación están separadas por una secuencia de ligador de 24 pb
(5'-AGAAGAGCCAGATCTGGCTCTTCC-3'),
que contiene sitios de restricción SapI.
Se derivó el plásmido pPolISapIT de pPolICAT- RT
(descrito originalmente en Pleschka et al., J. Virol. 70,
4188-4192, 1996). Se insertó un fragmento de ADN que
contiene una región de la secuencia de terminación de ADNr murino
(posiciones +335 a +715, número de registro de GenBank M12074) en el
sitio SalI de pPolI-CAT-RT para
generar pPolI-CAT-T. Posteriormente,
usando una técnica de PCR inversa, se eliminaron el gen CAT, la
ribozima y parte de la secuencia de terminación de ADNr murino
(posiciones +335 a +571) de
pPolI-CAT-T. Al mismo tiempo, se
introdujo la secuencia de ligador de 24 pb dada anteriormente a
través de los cebadores de PCR entre el promotor Pol I y la
secuencia de terminación de ADNr murino.
Se generó ADNc mediante RT-PCR a
partir de ARNv aislado del virus influenza A/PR/8/34 (variante
Cambridge) usando los cebadores de PCR con proyecciones SapI. Tras
la digestión con SapI, se clonaron los productos de la PCR en
pPolISapIT digerido con SapI.
La cotransfección de los 12 plásmidos en células
Vero usando el reactivo de transfección DOTAP y siguiendo el
protocolo facilitado en el ejemplo 3 (véase también Fodor et
al., J. Virol. (noviembre de 1999) 73,
9679-9682) dio como resultado el rescate de
partículas infecciosas del virus influenza A/PR/8/34 en el día 4
tras la transfección. Los ensayos de placas de lisis y la
amplificación viral se realizaron sobre células MDCK en presencia
de tripsina
0,5 \mug/ml.
0,5 \mug/ml.
Estos resultados demuestran que el virus
influenza A/PR8/34 puede rescatarse satisfactoriamente mediante el
método sin virus cooperador de la invención. Esto es de particular
interés puesto que se sabe que el virus influenza A/PR8/34 es
avirulento para los seres humanos (Beare et al. (1975) Trials
in man with live recombinants made from A/PR8/34 (HON1) and wild H3
N2 influenza viruses, Lancet (ii) 729-732) mientras
que el virus influenza A/WSN/33 no se considera adecuado para la
administración a seres humanos por su conocido neurotropismo en
ratones. Así, se propone que el virus influenza A/PR8/34, en una
forma atenuada de manera adecuada, sería adecuado como virus
original para el desarrollo de una vacuna viva. Por ejemplo, el
rescate viral sin virus cooperador según la invención podría usarse
para generar un virus reasortante atenuado partiendo de vectores de
expresión para los ARNv del virus influenza A/PR8/34 aparte de la
sustitución de los segmentos genómicos HA y NA del virus A/PR8/34
por los segmentos genómicos HA y NA de una cepa de virus influenza
asociada con una infección epidémica de gripe. A continuación, en
el ejemplo 6 se facilitan ejemplos adicionales del uso del rescate
viral sin virus cooperador según la invención para generar virus
influenza reasortantes.
Ejemplo
5
Los 4 plásmidos de expresión de proteínas
especificados en el ejemplo 2 se sustituyeron por los plásmidos de
expresión de proteínas especificados en el ejemplo 4 derivados de
pcDNA3. Usando estos cuatro plásmidos de expresión de proteínas
junto con los ocho plásmidos de transcripción de ARNv especificados
en el ejemplo 1 (véase también Fodor et al., J. Virol.
(1999) 73, 9679-9682) en los 3 protocolos expuestos
a continuación, se obtuvieron entre 100-10.000
partículas virales formadoras de placas de lisis a partir de
10^{6} células en el día 2 tras la transfección. Esto es al menos
100 veces más virus que el obtenido mediante los estudios de
transfección notificados en el ejemplo 3.
Protocolo
(a)
Se combinaron 1 \mug de cada uno de los 12
plásmidos y se ajustó el volumen a 50 \mul añadiendo medio
OPTIMEM (Gibco BRL). En un tubo de poliestireno, se combinaron 12
\mul de LipofectAMINE 2000 (Gibco BRL, nº de cat. 11
668-027) y 238 \mul de medio OPTIMEM y se incubó
la mezcla durante 5 minutos a temperatura ambiente. Entonces se
añadió gota a gota la mezcla de ADN al reactivo de transfección
LipofectAMINE 2000 diluido. Tras incubar la mezcla de
ADN-Lipofectamine a temperatura ambiente durante
aproximadamente 20 minutos, se añadió gota a gota la mezcla a una
suspensión de células 293T (aproximadamente 10^{6} células en 1 ml
de DMEM que contiene un 10% de FCS sin antibióticos).
Aproximadamente a las 16-24 horas tras la
transfección, se retiró la mezcla de transfección y se sustituyó
por 1 ml de DMEM que contiene un 0,5% de FCS, un 0,3% de BSA,
penicilina y estreptomicina. 24-48 horas después, se
seleccionó el virus rescatado mediante cultivo de placas de lisis
de 100 \mul del medio de las células 293 T transfectadas sobre
células MDBK y haciendo pasar el resto del medio sobre un matraz de
MDBK semiconfluentes de 25 cm^{2}. Se añadió 1 ml de DMEM que
contiene un 0,5% de FCS, un 0,3% de BSA, penicilina y
estreptomicina a las células 293T transfectadas y se continuó la
incubación durante otros de 2 a 3 días antes de repetir el cultivo
de placas de lisis y la amplificación sobre células MDBK.
Protocolo
(b)
Para la transfección usando precipitación con
fosfato de calcio, se combinaron 1 \mug de cada uno de los 12
plásmidos y se añadió la mezcla del plásmido a 250 \mul de tampón
2x HEBS (Hepes 40 mM, NaCl 280 mM, KCl 10 mM, Na_{2}HPO_{4} 2
mM, glucosa 10 mM, pH 7,05). Luego se añadieron 250 \mul de
CaCl_{2} 250 mM y se mezcló vigorosamente el contenido del tubo.
Tras 20-30 min. a temperatura ambiente, se mezcló el
precipitado con 1 ml de DMEM que contiene un 10% de FCS, penicilina
y estreptomicina y se añadió a una suspensión de células 293T
(aproximadamente 10^{6} células en 1 ml de DMEM que contiene un
10% de FCS sin antibióticos). Aproximadamente a las
16-24 horas tras la transfección, se retiró la
mezcla de transfección y se sustituyó por 1 ml de DMEM que contiene
un 0,5% de FCS, un 0,3% de BSA, penicilina y estreptomicina.
24-48 horas después, se seleccionó el virus
rescatado como en el protocolo (a)
anterior.
anterior.
Protocolo
(c)
Se combinaron 1 \mug de cada uno de los 12
plásmidos y se ajustó el volumen a 120 \mul añadiendo Hepes 20 mM
(pH 7,5) para dar una concentración de ADN de aproximadamente 0,1
\mug/\mul. Entonces, se añadió la disolución de ADN a reactivo
de transfección DOTAP diluido (Boehringer) que contiene 60 \mul de
DOTAP y 200 \mul de Hepes 20 mM (pH 7,5) en un tubo de
poliestireno. Tras la incubación de la mezcla de
ADN-DOTAP a temperatura ambiente durante
aproximadamente 15-20 minutos, se añadió gota a gota
la mezcla en una suspensión de células Vero (aproximadamente
10^{6} células en 1 ml de MEM que contiene un 10% de FCS,
penicilina y estreptomicina). Aproximadamente a las
16-24 horas tras la transfección, se retiró la
mezcla de transfección y se sustituyó por 1 ml de MEM que contiene
un 0,5% de FCS, un 0,3% de BSA, penicilina, y estreptomicina.
24-48 horas después, se seleccionó el virus
rescatado mediante cultivo de placas de lisis de 100 \mul del
medio de las células Vero transfectadas sobre células MDBK y
haciendo pasar el resto del medio sobre un matraz de MDBK
semiconfluentes de 25 cm^{2}. Se añadió 1 ml de MEM que contiene
un 0,5% de FCS, un 0,3% de BSA, penicilina y estreptomicina a las
células Vero transfectadas y se continuó la incubación durante otros
de 2 a 3 días antes de repetir el cultivo de placas de lisis y la
amplificación sobre células
MDBK.
MDBK.
\newpage
Ejemplo
6
Se ha usado satisfactoriamente el rescate basado
en plásmidos según la invención para generar virus influenza
reasortantes. Se generaron los siguientes virus reasortantes:
- (i)
- A/WSN/33 con el segmento PA derivado de A/PR/8/34
- (ii)
- A/WSN/33 con el segmento NP derivado de A/PR/8/34
- (iii)
- A/WSN/33 con el segmento M derivado de A/PR/8/34
- (iv)
- A/WSN/33 con el segmento PB2 derivado de A/FPV/Dobson/34
Estos ejemplos demuestran la utilidad del método
sin virus cooperador para aislar virus reasortantes. Se requieren
virus reasortantes basados en A/PR8/34 (u otras cepas adecuadas)
para la producción de vacunas inactivadas convencionales porque
crecen hasta alto título en óvulos de gallina fecundados, usados en
la producción comercial de vacunas inactivadas de gripe. Tal como
se indicó previamente en lo anterior, se observa así que una
importante aplicación del rescate viral sin virus cooperador según
la invención es que es un aislamiento más sencillo y más directo de
virus reasortantes que mediante el método clásico de aislamiento de
virus reasortantes a partir de una infección mixta de células con
dos virus vivos. De manera importante, usando un método de la
invención, se obvia la necesidad de seleccionar muchos posibles
virus reasortantes antes de que se aísle el requerido.
Ejemplo
7
Se ha conseguido el rescate del virus influenza
A/WSN/33 sobre células EcR-293NP, una línea celular
que expresa de manera estable el virus influenza NP, transfectando
11 plásmidos.
Las células EcR-293NP se derivan
de la línea celular disponible comercialmente
EcR-293 (Invitrogen, nº de catálogo
R650-07) que expresa de manera constitutiva las
subunidades VgEcR y RXR del receptor de la ecdisona. La expresión
del virus influenza NP en tales células puede inducirse en respuesta
a ponasterona A. Se usó el mismo protocolo que el especificado en
el ejemplo 5(a) empleando el reactivo de transfección
LipofectAMINE 2000 excepto en que se omitió
pcDNA-NP, puesto que la proteína NP para la
encapsidación inicial de los segmentos de ARNv la proporcionaron
las células EcR-293NP.
Ejemplo
8
Se generó el plásmido
pPOL1-E6N18-2A-NA
que puede expresar un segmento de ARNv quimérico basado en el
segmento de ARNv NA del virus influenza A/WSN/33. Se insertó la
secuencia codificante de ARNv modificada entre secuencias
correspondientes a un promotor Pol I humano truncado y a un ribozima
del virus de la hepatitis delta como para la preparación de los
plásmidos de expresión Pol I descritos en el ejemplo 1. El gen
quimérico resultante contenía un marco de lectura abierto largo
(ORF) que codifica para los primeros 88 aminoácidos de la proteína
E6 de papilomavirus humano 18 (VPH 18), seguido por 17 aminoácidos
correspondientes al motivo de autoescisión de la proteasa 2A del
virus de la fiebre aftosa (VFA), seguido por la secuencia de
aminoácidos del NA del virus influenza A/WSN/33. La región
codificante estaba flanqueada por las regiones no codificantes del
gen NA del virus A/WSN/33. De esta manera, se generó un gen del
virus influenza quimérico que codifica para una poliproteína que
experimenta autoescisión, dando como resultado la generación de un
polipéptido derivado de VPH y la proteína NA. Previamente se ha
descrito una estrategia similar para la expresión de antígenos
foráneos mediante vectores de virus influenza generados mediante la
transfección con RNP clásica (T. Muster y A.
Garcia-Sastre, Genetic manipulation of influenza
viruses, en Textbook of Influenza, K.G. Nicholson, R.G. Webster
& A.J. Hay, eds., págs. 93-106 (1998),
Blackwell Science Ltd, Oxford, RU.)
Se generó el vector del virus influenza
recombinante que expresa el antígeno derivado de VPH18 mediante la
cotransfección en células 293T de
pPOL1-E6N18-2A-NA
junto con 7 vectores de expresión de PolI que codifican para los
ARN virales de tipo natural, es decir, PB2, PB1, PA, HA, NP, M y NS
según se describe en el ejemplo 1 y los 4 vectores de expresión de
PolII que codifican para las proteínas PB2, PB1, PA y NP según se
describe en el ejemplo 5. El virus rescatado tiene la secuencia de
nucleótidos correcta confirmada mediante el análisis de secuencia
de su ARN viral específico de NA.
Claims (34)
1. Método para generar partículas virales
infecciosas de un virus ARN segmentado de polaridad negativa que
tiene más de 3 segmentos genómicos de ARNv, comprendiendo dicho
método:
- introducir en células cultivadas vectores de expresión que expresan en dichas células los segmentos genómicos de ARNv completo de dicho virus, o los correspondientes ARNc completos de dicho virus, en el que dichas células soportan el crecimiento de dicho virus, proporcionando también dichas células una nucleoproteína y una ARN polimerasa dependiente de ARN mediante lo cual se forman los complejos de RNP que contienen los segmentos genómicos de ARNv de dicho virus y se producen dichas partículas virales infecciosas por dichas células en ausencia de un virus cooperador y en el que dichas células no producen interferón.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
se emplean uno o más vectores de expresión adicionales en dichas
células para expresar una o más proteínas seleccionadas de dicha
nucleoproteína y las subunidades de dicha ARN polimerasa
dependiente de ARN.
3. Método según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que se emplea una línea celular que puede
expresar una o más de dicha nucleoproteína y las subunidades de
dicha ARN polimerasa dependiente de ARN.
4. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho virus es un virus influenza
de tipo A, B o C.
5. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho virus es un virus
reasortante que tiene segmentos de ARNv derivados de más de un
virus original.
6. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dichas células son células
Vero.
7. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que dichos vectores de expresión
definidos en la reivindicación 1 expresan segmentos genómicos de
ARNv de dicho virus.
8. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, que comprende además amplificar dichas
partículas virales formadas mediante una o más etapas de infección
celular posteriores empleando el mismo o diferente tipo de
células.
9. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, que comprende además aislar partículas
virales infecciosas.
10. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, que comprende además una etapa de
inactivación o atenuación viral.
11. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que todos los vectores de expresión
requeridos se cotransfectan en dichas células usando un reactivo de
transfección liposomal, precipitación con fosfato de calcio o
electroporación.
12. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que dichos vectores de expresión son
todos plásmidos.
13. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que dichos vectores de expresión
definidos en la reivindicación 1 consisten en vectores de expresión
diferentes para la expresión de cada segmento de ARNv de dicho
virus o los correspondientes ARNc.
14. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que la expresión de cada segmento de
ARNv o ARNc está bajo el control de una secuencia promotora derivada
de un promotor Pol I de mamífero.
15. Método según la reivindicación 14, en el que
dicha secuencia promotora es una secuencia promotora Pol I humana
truncada que consiste en los nucleótidos -250 a -1 del
correspondiente promotor nativo o un derivado funcional del
mismo.
16. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que la secuencia codificante para
cada segmento de ARNv o ARNc en dichos vectores de expresión está
seguida por una secuencia de ribozima o terminador de la
transcripción que produce un extremo 3' correcto de cada uno de
dichos ARN.
17. Método según la reivindicación 2, en el que
la expresión de una o más proteínas virales a partir de dichos
vectores de expresión adicionales está bajo el control de una
secuencia reguladora seleccionada del promotor de expresión tardía
principal de adenovirus 2 unido a la secuencia líder tripartita de
corte y empalme del adenovirus humano de tipo 2 o el promotor de
expresión precoz de citomegalovirus humano, o un derivado funcional
de dicha secuencia reguladora.
18. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, que comprende además incorporar un virus
atenuado o inactivado en una composición de vacuna.
19. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18, en el que dicho virus tiene al menos un
segmento de ARNv que puede dirigir la expresión de una secuencia
heteróloga a dicho virus en células diana infectadas por dicho
virus.
20. Método según la reivindicación 19, en el que
dicha secuencia heteróloga a dicho virus codifica para un péptido
antigénico o polipéptido antigénico y que comprende además
incorporar dicho virus en una composición de vacuna.
21. Células modificadas según se producen en la
reivindicación 1 o la reivindicación 6.
22. Método de producción de partículas virales
infecciosas de un virus segmentado de polaridad negativa que
comprende cultivar células modificadas según la reivindicación
21.
23. Método para generar en células cultivadas
partículas virales infecciosas de un virus segmentado de polaridad
negativa, comprendiendo dicho método:
proporcionar una primera población de células
que pueden soportar el crecimiento de dicho virus y que se han
modificado para proporciona (a) los ARNv genómicos de dicho virus y
(b) una nucleoproteína y ARN polimerasa dependiente de ARN mediante
lo cual se forman complejos de RNP que contienen dichos ARNv
genómicos y se ensamblan dichas partículas virales infecciosas,
expresándose directamente dichos ARNv genómicos en dichas células
bajo el control de un promotor Pol I de mamífero o un derivado
funcional del mismo en ausencia de un virus cooperador, y
en el que dichas células no producen
interferón.
24. Método según la reivindicación 22, que
comprende además amplificar dichas partículas virales ensambladas
mediante una o más etapas de infección celular posteriores empleando
el mismo o diferente tipo de células.
25. Método según la reivindicación 23 o la
reivindicación 24, que comprende además aislar partículas virales
infecciosas.
26. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 25, que comprende además una etapa de
atenuación o de inactivación viral.
27. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 26, que comprende además incorporar partículas
virales atenuadas o inactivadas en una composición de vacuna.
28. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 26, en el que dicho virus tiene al menos un
segmento de ARNv que puede dirigir la expresión de una secuencia
heteróloga a dicho virus en células diana infectadas por dicho
virus y que comprende además incorporar dicho virus, si es apropiado
tras la atenuación o inactivación, en una composición farmacéutica
junto con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
29. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 28, en el que dichas células son células
Vero.
30. Células modificadas según se producen en la
reivindicación 23 o la reivindicación 29.
31. Método de producción de partículas virales
infecciosas de un virus segmentado de polaridad negativa que
comprende cultivar células modificadas según la reivindicación
30.
32. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 16 y 18 a 20, en el que las células usadas para
la amplificación son células MDBK o células MDCK.
33. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 29, en el que las células usadas para la
amplificación son células MDBK o células MDCK.
34. Método según las reivindicaciones 1 a 20, 22
a 29 o 31 a 33, en el que las células son células
EcR-293NP.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US14364599P | 1999-07-14 | 1999-07-14 | |
US143645P | 1999-07-14 | ||
GBGB9916794.2A GB9916794D0 (en) | 1999-07-16 | 1999-07-16 | In vitro virus reconstitution |
GB9916794 | 1999-07-16 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2278621T3 true ES2278621T3 (es) | 2007-08-16 |
ES2278621T5 ES2278621T5 (es) | 2011-02-02 |
Family
ID=26315773
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES00946097T Expired - Lifetime ES2278621T5 (es) | 1999-07-14 | 2000-07-14 | Reconstrucción in vitro de virus arn segmentados de polaridad negativa. |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1194580B2 (es) |
AT (1) | ATE353370T1 (es) |
AU (1) | AU5998400A (es) |
CA (1) | CA2379012C (es) |
CY (2) | CY1106404T1 (es) |
DE (5) | DE122007000070I1 (es) |
DK (1) | DK1194580T4 (es) |
ES (1) | ES2278621T5 (es) |
FR (1) | FR08C0046I2 (es) |
LU (1) | LU91367I2 (es) |
NL (4) | NL300294I2 (es) |
WO (1) | WO2001004333A1 (es) |
Families Citing this family (68)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU771110B2 (en) | 1998-06-12 | 2004-03-11 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York, The | Novel methods and interferon deficient substrates for the propagation of viruses |
AU2002309133A1 (en) * | 2001-04-17 | 2002-10-28 | Institut Pasteur | Recombinant segmented negative strand virus with a duplicated 3' noncoding flanking sequence, and therapeutic compositions containing the same |
US7226774B2 (en) | 2002-02-13 | 2007-06-05 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Signal for packaging of influenza virus vectors |
FR2866031B1 (fr) * | 2004-02-11 | 2012-10-19 | David Francois Joseph Millet | Chimere de virus pathogene emergent, medicament la contenant et utilisation en therapie antivirale |
DE202005022108U1 (de) | 2004-03-09 | 2013-11-12 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Influenza-Virus-Impfstoffe |
CA2610632C (en) | 2004-06-01 | 2022-10-04 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Genetically engineered swine influenza virus and uses thereof |
US7959930B2 (en) | 2004-12-24 | 2011-06-14 | Abbott Biologicals B.V. | Rescue of influenza virus |
EP1855713B1 (en) | 2005-02-15 | 2016-04-27 | Mount Sinai School of Medicine | Genetically engineered equine influenza virus and uses thereof |
US11865172B2 (en) | 2005-04-21 | 2024-01-09 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Materials and methods for respiratory disease control in canines |
US7959929B2 (en) | 2005-04-21 | 2011-06-14 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Materials and methods for respiratory disease control in canines |
BRPI0612268A2 (pt) | 2005-06-21 | 2009-01-27 | Medimmune Vaccines Inc | Ácido nucleico isolado, vetor de expressço, mÉtodos para produzir um rna genâmico da influenza, para produzir um vÍrus da influenza recombinante, para gerar um vÍrus de rna segmentado de filamento negativo recombinante nas cÉlulas caninas cultivadas e para gerar partÍculas virais da influenza infecciosa em cÉlulas caninas cultivadas, cÉlula, e, vÍrus |
US7790434B2 (en) | 2005-06-21 | 2010-09-07 | Medimmune, Llc | Methods and compositions for expressing negative-sense viral RNA in canine cells |
US11707520B2 (en) | 2005-11-03 | 2023-07-25 | Seqirus UK Limited | Adjuvanted vaccines with non-virion antigens prepared from influenza viruses grown in cell culture |
US20090304742A1 (en) | 2005-11-04 | 2009-12-10 | Novartis Vaccines And Diagnostics Srl | Influenza vaccines with reduced amount of emulsion adjuvant |
NZ568211A (en) | 2005-11-04 | 2011-11-25 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Influenza vaccines including combinations of particulate adjuvants and immunopotentiators |
PT2368572T (pt) | 2005-11-04 | 2020-06-16 | Seqirus Uk Ltd | Vacinas com adjuvante dotadas de antigénios não-virião preparados a partir de vírus da gripe cultivado em cultura celular |
CA2628424A1 (en) | 2005-11-04 | 2007-05-10 | Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. | Adjuvanted influenza vaccines including cytokine-inducing agents |
WO2007052061A2 (en) | 2005-11-04 | 2007-05-10 | Novartis Vaccines And Diagnostics Srl | Emulsions with free aqueous-phase surfactant as adjuvants for split influenza vaccines |
AP2911A (en) | 2005-12-02 | 2014-05-31 | Sinai School Medicine | Chimeric Viruses presenting non-native surface proteins and uses thereof |
KR20080089663A (ko) | 2006-01-27 | 2008-10-07 | 노바티스 백신즈 앤드 다이아그노스틱스 게엠베하 운트 콤파니 카게 | 적혈구응집소 및 기질 단백질을 함유한 인플루엔자 백신 |
AU2007231027B2 (en) | 2006-03-24 | 2013-10-03 | Novartis Influenza Vaccines Marburg Gmbh | Storage of influenza vaccines without refrigeration |
WO2007124327A2 (en) * | 2006-04-19 | 2007-11-01 | Medimmune Llc. | Methods and compositions for expressing negative-sense viral rna in canine cells |
GB0614460D0 (en) | 2006-07-20 | 2006-08-30 | Novartis Ag | Vaccines |
AU2007297178B2 (en) | 2006-09-11 | 2014-07-24 | Novartis Ag | Making influenza virus vaccines without using eggs |
WO2008068631A2 (en) | 2006-12-06 | 2008-06-12 | Novartis Ag | Vaccines including antigen from four strains of influenza virus |
US8597661B2 (en) | 2007-05-04 | 2013-12-03 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Neuraminidase-deficient live influenza vaccines |
US8043856B2 (en) | 2007-06-14 | 2011-10-25 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Adenoviral vectors for influenza virus production |
EP2045323A1 (en) * | 2007-10-05 | 2009-04-08 | Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag | Linear expression constructs for production of influenza virus particles |
NZ582595A (en) | 2007-06-27 | 2012-07-27 | Novartis Ag | Low-additive influenza vaccines |
GB0810305D0 (en) | 2008-06-05 | 2008-07-09 | Novartis Ag | Influenza vaccination |
NZ587798A (en) | 2008-03-18 | 2013-06-28 | Novartis Ag | Improvements in the preparation of influenza virus vaccine antigens utilising a phosphate buffer |
EP2233568A1 (en) | 2009-03-19 | 2010-09-29 | Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade AG | Novel method for generation of RNA virus |
EP2987856B1 (en) | 2009-02-05 | 2018-07-25 | Icahn School of Medicine at Mount Sinai | Chimeric newcastle disease viruses and uses thereof |
CN102307590A (zh) | 2009-02-10 | 2012-01-04 | 诺华有限公司 | 具有减少量的角鲨烯的流感疫苗 |
CA2752039A1 (en) | 2009-02-10 | 2010-08-19 | Novartis Ag | Influenza vaccine regimens for pandemic-associated strains |
WO2010092477A1 (en) | 2009-02-10 | 2010-08-19 | Novartis Ag | Influenza vaccines with increased amounts of h3 antigen |
CA2787099A1 (en) | 2009-03-30 | 2010-10-14 | Anice C. Lowen | Influenza virus hemagglutinin polypeptides containing stem domains, vaccines and uses thereof |
DE102010018462A1 (de) | 2009-04-27 | 2011-04-07 | Novartis Ag | Impfstoffe zum Schutz gegen Influenza |
WO2011014504A1 (en) | 2009-07-27 | 2011-02-03 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Recombinant influenza virus vectors and uses thereof |
CA2805505C (en) | 2009-07-30 | 2021-08-03 | Mount Sinai School Of Medecine | Chimeric influenza viruses having reduced ability to reassort with other influenza viruses and uses thereof |
US20120237536A1 (en) | 2009-09-10 | 2012-09-20 | Novartis | Combination vaccines against respiratory tract diseases |
CA2792537A1 (en) | 2010-03-30 | 2011-10-06 | Mount Sinai School Of Medicine | Influenza virus vaccines and uses thereof |
EA201201620A1 (ru) | 2010-06-02 | 2013-07-30 | Авир Грин Хилз Байотекнолоджи Рисерч Дивелопмент Трейд Аг | Способ получения рнк-вируса |
EP2747778B1 (en) | 2011-08-26 | 2017-12-06 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Influenza viruses with mutant pb2 gene segment as live attenuated vaccines |
EP2758075B1 (en) | 2011-09-20 | 2023-05-03 | Icahn School of Medicine at Mount Sinai | Influenza virus vaccines and uses thereof |
US20140248320A1 (en) | 2011-10-20 | 2014-09-04 | Novartis Ag | Adjuvanted influenza b virus vaccines for pediatric priming |
EP2708552A1 (en) | 2012-09-12 | 2014-03-19 | Medizinische Universität Wien | Influenza virus |
GB201218195D0 (en) | 2012-10-10 | 2012-11-21 | Istituto Zooprofilattico Sperimentale Delle Venezie | Composition |
NZ627796A (en) | 2012-12-18 | 2017-07-28 | Icahn School Med Mount Sinai | Influenza virus vaccines and uses thereof |
BR112015017420A2 (pt) * | 2013-01-23 | 2017-07-11 | Novartis Ag | recombinação de vírus influenza |
US20140274806A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Synthetic Genomics Vaccines | Influenza virus reassortment |
WO2014159960A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof |
MX2015011886A (es) | 2013-03-14 | 2016-05-31 | Icahn School Med Mount Sinai | Virus de la enfermedad de newcastle y usos de los mismos. |
JP6857498B2 (ja) | 2014-02-27 | 2021-04-14 | メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションMerck Sharp & Dohme Corp. | 癌を処置するための併用方法 |
WO2015196150A2 (en) | 2014-06-20 | 2015-12-23 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses |
CL2014003146A1 (es) * | 2014-11-20 | 2015-06-12 | Univ Santiago Chile | Método para producir virus arn monocatenario negativo; plásmido recombinante funcional en células animales, que consta de un esqueleto pss-urg; método de obtención de partículas virales; y uso para expresar arn, proteínas autógenas o exógenas al virus. |
JP2018504412A (ja) | 2015-01-23 | 2018-02-15 | アイカーン スクール オブ メディシン アット マウント サイナイ | インフルエンザウイルスワクチン接種レジメン |
EP3261664A1 (en) | 2015-02-26 | 2018-01-03 | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | Bivalent swine influenza virus vaccine |
WO2016207853A2 (en) | 2015-06-26 | 2016-12-29 | Seqirus UK Limited | Antigenically matched influenza vaccines |
WO2017005880A1 (en) | 2015-07-07 | 2017-01-12 | Seqirus UK Limited | Influenza potency assays |
WO2017040203A1 (en) | 2015-08-28 | 2017-03-09 | Yoshihiro Kawaoka | Generation of infectious influenza viruses from virus-like particles |
US11266734B2 (en) | 2016-06-15 | 2022-03-08 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Influenza virus hemagglutinin proteins and uses thereof |
WO2018187706A2 (en) | 2017-04-07 | 2018-10-11 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Anti-influenza b virus neuraminidase antibodies and uses thereof |
JOP20190256A1 (ar) | 2017-05-12 | 2019-10-28 | Icahn School Med Mount Sinai | فيروسات داء نيوكاسل واستخداماتها |
US11851648B2 (en) | 2019-02-08 | 2023-12-26 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Humanized cell line |
EP4022046A2 (en) | 2019-08-27 | 2022-07-06 | Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) | Recombinant influenza viruses with stabilized ha for replication in eggs |
CN111363727B (zh) * | 2020-01-20 | 2021-09-24 | 武汉大学 | 携带幽门螺杆菌的重组流感病毒、宿主细胞及其制备方法与应用 |
EP3896077A1 (en) | 2020-04-16 | 2021-10-20 | Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit GmbH | Influenza virus-like particles (vlps) |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5840520A (en) * | 1989-08-28 | 1998-11-24 | Aviron | Recombinant negative strand RNA virus expression systems |
DK1185615T3 (da) * | 1999-04-06 | 2007-11-05 | Wisconsin Alumni Res Found | Rekombinante influenzavirus til vacciner og genterapi |
-
2000
- 2000-07-14 DE DE200712000070 patent/DE122007000070I1/de active Pending
- 2000-07-14 AT AT00946097T patent/ATE353370T1/de active
- 2000-07-14 DE DE122008000057C patent/DE122008000057I1/de active Pending
- 2000-07-14 DK DK00946097.3T patent/DK1194580T4/da active
- 2000-07-14 EP EP00946097A patent/EP1194580B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-14 DE DE60033284.5T patent/DE60033284T3/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-14 DE DE122008000056C patent/DE122008000056I1/de active Pending
- 2000-07-14 CA CA2379012A patent/CA2379012C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-14 AU AU59984/00A patent/AU5998400A/en not_active Abandoned
- 2000-07-14 WO PCT/GB2000/002710 patent/WO2001004333A1/en active IP Right Grant
- 2000-07-14 DE DE200712000061 patent/DE122007000061I2/de active Active
- 2000-07-14 ES ES00946097T patent/ES2278621T5/es not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-03-20 CY CY20071100397T patent/CY1106404T1/el unknown
- 2007-09-21 LU LU91367C patent/LU91367I2/fr unknown
- 2007-09-21 NL NL300294C patent/NL300294I2/nl unknown
- 2007-09-21 NL NL300301C patent/NL300301I2/nl unknown
- 2007-09-21 CY CY200700023C patent/CY2007023I1/el unknown
-
2008
- 2008-11-13 NL NL300369C patent/NL300369I1/nl unknown
- 2008-11-13 FR FR08C0046C patent/FR08C0046I2/fr active Active
- 2008-11-13 NL NL300368C patent/NL300368I2/nl unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NL300368I2 (nl) | 2017-08-03 |
NL300368I1 (nl) | 2009-01-05 |
NL300294I2 (nl) | 2008-10-01 |
DK1194580T4 (da) | 2011-01-03 |
FR08C0046I2 (fr) | 2011-11-25 |
CY2007023I2 (el) | 2009-11-04 |
DE122007000061I2 (de) | 2011-07-21 |
NL300301I1 (nl) | 2008-01-02 |
NL300369I1 (nl) | 2009-01-05 |
DE60033284T2 (de) | 2007-10-25 |
EP1194580B2 (en) | 2010-08-25 |
DK1194580T3 (da) | 2007-04-10 |
DE122008000057I1 (de) | 2009-04-09 |
NL300294I1 (nl) | 2007-12-03 |
LU91367I2 (fr) | 2007-11-21 |
AU5998400A (en) | 2001-01-30 |
DE122007000061I1 (de) | 2007-12-20 |
CY1106404T1 (el) | 2010-07-28 |
ES2278621T5 (es) | 2011-02-02 |
CA2379012C (en) | 2013-07-02 |
EP1194580A1 (en) | 2002-04-10 |
DE122007000070I1 (de) | 2008-01-31 |
WO2001004333A1 (en) | 2001-01-18 |
ATE353370T1 (de) | 2007-02-15 |
DE60033284T3 (de) | 2014-10-30 |
FR08C0046I1 (fr) | 2009-01-02 |
DE122008000056I1 (de) | 2009-04-09 |
NL300301I2 (nl) | 2008-10-01 |
EP1194580B1 (en) | 2007-02-07 |
DE60033284D1 (de) | 2007-03-22 |
CA2379012A1 (en) | 2001-01-18 |
CY2007023I1 (el) | 2009-11-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2278621T3 (es) | Reconstitucion in vitro de virus arn segmentados de polaridad negativa. | |
ES2290024T3 (es) | Virus de la gripe recombinantes para vacunas y terapia genica. | |
US9580693B2 (en) | Recombinant influenza viruses for vaccines and gene therapy | |
US7723094B2 (en) | Recombinant influenza vectors with a polII promoter and ribozymes for vaccines and gene therapy | |
JP2008520248A (ja) | タンデム転写ユニットを有する組換えインフルエンザベクター | |
US20090017444A1 (en) | Screening method for modulators of viral transcription or replication | |
AU2018278879A1 (en) | Two plasmid mammalian expression system | |
JP4850375B2 (ja) | 分節化した(−)鎖RNAウイルスのinvitro再構築 | |
Murr et al. | Negative-Strand RNA Virus-Vectored Vaccines | |
Kawaoka et al. | Recombinant influenza vectors with a PolII promoter and ribozymes for vaccines and gene therapy | |
MXPA05012700A (es) | Vectores de la influenza recombinantes con un promotor polii y ribozimas |