ES2275299T3

ES2275299T3 - Proteina con actividad fosfolipasa.

Info

Publication number: ES2275299T3
Application number: ES98904046T
Authority: ES
Inventors: Fridolin Loffler; Gerald Jungschaffer; Quoc Nguyen Khanh; Erwin Schuster; Bruno Sprossler; Sabine Wolf
Original assignee: AB Enzymes GmbH
Current assignee: AB Enzymes GmbH
Priority date: 1997-01-16
Filing date: 1998-01-08
Publication date: 2007-06-01
Anticipated expiration: 2018-01-08
Also published as: HUP9901640A2; AR010099A1; EP0904357A1; CA2243476A1; CN1216061A; DE19701348A1; HU224831B1; MY117580A; CN1152954C; DE59813840D1; TW565610B; EP0904357B1; WO1998031790A1; HUP9901640A3; ATE348151T1; BR9805893A; HK1019074A1; DK0904357T3; US6140094A; AU6208098A

Abstract

LA INVENCION TRATA DE UNA PROTEINA CON ACTIVIDAD DE FOSFOLIPASA QUE SE CARACTERIZA PORQUE POSEE LA SECUENCIA MADURA DE LA ISOFOSFOLIPASA DE ASPERGILLUS O UNA SECUENCIA DERIVADA DE ELLA, Y QUE PUEDE ESTAR ESCINDIDA EN AL MENOS UN PUNTO. EN EL CASO DE QUE HAYA ESCISION, LAS PARTES ESCINDIDAS SE UNEN MEDIANTE AL MENOS UN ENLACE QUE SE PUEDE ESCINDIR EN CONDICIONES REDUCTORAS O AL MENOS UNA DE LAS PARTES NO ESCINDIDAS TIENE UNA ACTIVIDAD DE FOSFOLIPASA. LA INVENCION TAMBIEN TRATA DE UN PROCEDIMIENTO PARA OBTENER ESTA PROTEINA MEDIANTE LA FERMENTACION EN UN MEDIO DE CULTIVO APROPIADO DE UN ORGANISMO HOSPEDADO QUE PRODUCE LISOFOSFOLIPASA TRANSFORMADA DE MANERA APROPIADA. AISLADA LA PROTEINA CON ACTIVIDAD FOSFOLIPASA DEL FILTRADO DEL CULTIVO LIBRE DE CELULAS, LA FERMENTACION SE LLEVA A CABO EN UN MEDIO ACIDO A LIGERAMENTE ALCALINO.

Description

Proteína con actividad fosfolipasa.

La invención se refiere a una proteína con actividad fosfolipasa, que puede obtenerse por escisión de la secuencia madura de lisofosfolipasa de Aspergillus, con la secuencia ID SEC Nº: 2, en dos partes escindidas, estando enlazadas las partes escindidas a través de al menos una unión escindible en condiciones reductoras, o de las partes escindidas no enlazadas, al menos una posee actividad fosfolipasa. Además, la invención se refiere a un procedimiento para la producción de esta proteína, así como al uso de esta proteína para el desmucilaginado de aceites vegetales y como coadyuvante de horneado.

En el desmucilaginado de aceite comestible, los fosfolípidos no hidratables se hacen hidrosolubles mediante la fosfolipasa y así se extraen del aceite comestible de una forma moderada, ahorrando costes y de forma ecológica. En la solicitud de patente europea 0513709 (Röhm/Lurgi) por primera vez se presenta un procedimiento enzimático eficaz para el desmucilaginado. Allí, con una solución acuosa de fosfolipasa, se emulsiona un aceite comestible al que se ha desmucilaginado previamente con agua, formando gotitas menores de 10 \mum. Después de la hidrólisis (a un pH de 3 a 6 y una temperatura de 50 a 70ºC) se separa la fase acuosa. El procedimiento enzimático de desmucilaginado fue introducido en la industria del aceite comestible por la empresa Lurgi como "procedimiento EnzyMax". En el documento DE 4339556, como otra variante de este procedimiento, se describe la reutilización de la enzima, extrayendo la enzima de una fase acuosa, usada, que contiene lodo, mediante la adición de tensioactivos o solubilizantes y volviendo a usarse como solución altamente exenta de lodo que contiene enzima.

Las cantidades necesarias de enzima para llevar a cabo un procedimiento técnico en gran escala sólo pueden proporcionarse con la ayuda de microorganismos. Es decir, existe la necesidad de una fuente microbiana que permita producir la enzima fosfolipasa en cantidades ilimitadas. En el documento DE-OS 19527274.9, del 26 de julio de 1995 (Röhm/Lurgi), se describe que se halló una fuente apropiada de fosfolipasa en Aspergillus niger. Esta fosfolipasa escinde lecitina para obtener lisolecitina, pero también es capaz de seguir escindiendo la lisolecitina para obtener fosfatidilcolina. Las lisofosfolipasas puras de Aspergillus, que sólo son capaces de escindir lisolecitina, son ineficaces en el proceso de desmucilaginado. Esto también vale para las fosfolipasas C y D, que no escinden
acilo.

Además, las fosfolipasas también pueden usarse como coadyuvantes de horneado, para mejorar el procesamiento de las masas.

El documento EP-A-0808903 se refiere a un ácido desoxirribonucleico recombinante que puede aislarse de Aspergillus, y que codifica una lisofosfolipasa y presenta una secuencia definida de nucleótidos.

El documento WO 97/05219 se refiere a un procedimiento enzimático para el desmucilaginado de aceites vegetales con fosfolipasa de Aspergillus.

El documento EP-A-0575133 describe una nueva fosfolipasa que puede hidrolizar un fosfolípido, formando un 2-acilfosfolípido.

El documento WO 95/22615 se refiere a un procedimiento para la producción de una enzima lipolítica, así como variantes de ésta, que poseen una dependencia reducida del calcio y/o una tolerancia mejorada frente a detergentes.

La presente invención se basa en el objetivo de producir una fosfolipasa económica de gran pureza. La fosfolipasa debe poder producirse en grandes cantidades, mediante un organismo hospedador transformado. Con la enzima deben poder producirse preparados que sean particularmente apropiados para la hidrólisis de fosfolípidos y, de esta manera, para la clarificación de hidrolizados de almidón y para la preparación de coadyuvantes de horneado.

Conforme a la invención, se alcanza este objetivo mediante una proteína con actividad fosfolipasa, que puede obtenerse por escisión de la secuencia madura de la lisofosfolipasa de Aspergillus, con la secuencia ID SEC Nº: 2, en dos partes escindidas, en la que las partes escindidas, o bien, están enlazadas a través de al menos una unión escindible en condiciones reductoras o bien, de las partes escindidas no enlazadas, al menos una posee actividad fosfolipasa. Además, este objetivo se alcanza mediante una proteína con actividad fosfolipasa, que está caracterizada porque es reconocida por un anticuerpo contra fosfolipasa purificada de Aspergillus foetidus RH 3046.

Sorprendentemente, se halló que un microorganismo transformado conforme al documento DE-OS 19620649.9 con un ácido desoxirribonucleico (ADN) aislable de Aspergillus, no sólo codifica una lisofosfolipasa, sino en determinadas condiciones de cultivo también se procesa, obteniéndose una fosfolipasa. De esta manera, la fosfolipasa posee igual estructura primaria que la lisofosfolipasa pero otras estructuras secundaria y terciaria y, de esta manera, otras propiedades fisológicas. La secuencia correspondiente está representada por ID SEC Nº. 1 del documento DE-OS 19620649.9. Otra secuencia que codifica la fosfolipasa fue aislada de Aspergillus niger; difiere de la secuencia homóloga de Aspergillus foetidus en sólo el 6% de los aminoácidos. Tanto la fosfolipasa de Aspergillus niger, como la lisofosfolipasa de Aspergillus foetidus están constituidas por 270 aminoácidos y tienen un peso molecular de 36000 Da (véanse las ID SEC Nº. 1 + 2). En cuanto a la obtención de los microorganismos transformados, se hace referencia a lo que da a conocer el documento DE-OS 19620649.9. Hasta ahora, en el estado de la técnica no se ha descrito una fosfolipasa de Aspergillus. El impreso Nakaya y col., Eur. J. Biochem. 1990, 193 (1) 31-38 describe una proteína cuya secuencia es similar a la fosfolipasa A2.

Mediante procedimientos de la química de proteínas, pudo separarse la fosfolipasa de la lisofosfolipasa y obtenerse altamente purificada. En la comparación de la fosfolipasa y la lisofosfolipasa purificadas, resultaron las siguientes diferencias:

-: Determinados mediante electroforesis SDS en gel en condiciones reductoras, los pesos moleculares de la fosfolipasa y de lisofosfolipasa de Aspergillus foetidus ascienden a aproximadamente 30000 Da en el caso de la fosfolipasa, y a aproximadamente 36000 Da en el caso de la lisofosfolipasa, en cambio, en condiciones no reductoras para ambas enzimas por igual ascienden a aproximadamente 36000 Da. En condiciones reductoras, la fosfolipasa se divide en dos cadenas, de las que la mayor (30000 Da) es detectada en el gel de electroforesis. La cadena parcial del tamaño de aproximadamente 6000 Da, por razones metódicas no puede detectarse en el mismo gel de electroforesis, sin embargo, puede deducirse de este resultado, que la fosfolipasa está constituida por dos cadenas peptídicas. Esta suposición se confirma mediante el resultado de la secuenciación proteica.

-: La secuenciación proteica de la fosfolipasa de Aspergillus foetidus dio por resultado una alta coincidencia con la secuencia de la lisofosfolipasa, pero también diferencias. En el caso de la fosfolipasa, se hallaron dos restos NH_{2} en la relación 1:1, en cambio, en el caso de la lisofosfolipasa, sólo se halló uno. Uno de los restos NH_{2} de la fosfolipasa pertenece a un péptido de 6000 Da, mientras que el otro es el resto NH_{2} de la proteína de 30000 Da. Mientras que el péptido menor coincide con los aminoácidos 1 a 44 de la proteína madura de la lisofosfolipasa (véase la secuencia ID No. 1 en el documento DE-OS 19620649.9), la secuencia de la proteína de 30000 Da corresponde a los aminoácidos 45 a 270 de la lisofosfolipasa (véase la secuencia ID No. 1 en el documento DE-OS 19620649.9).

Este resultado indica que la fosfolipasa de Aspergillus foetidus puede formarse mediante el procesamiento de la proteína de la lisofosfolipasa, no quedando claro todavía si el procesamiento tiene lugar en el interior de la célula o fuera de la misma y de qué manera transcurre. Las relaciones entre la fosfolipasa y la lisofosfolipasa están representadas en la figura 1.

Además, la fosfolipasa y la lisofosfolipasa difieren en sus puntos isoeléctricos, en su pH óptimo y en su temperatura óptima, así como muy notablemente en sus estabilidades frente a las temperaturas. En la tabla siguiente se enfrentan estos valores.

TABLA 1 Comparación de las propiedades de la fosfolipasa y de la lisofosfolipasa de Aspergillus foetidus

	Fosfolipasa	Lisofosfolipasa

Peso molecular (SDS-gel, reductor)	30000 Da	36000 Da
Peso molecular (SDS-gel, no reductor)	36000 Da	36000 Da
Punto isoeléctrico	pH 4,3	pH 4,2
Temperatura óptima	50ºC	55ºC
pH óptimo	pH 3 - 4	pH 4,5
Estabilidad a pH (1 h a 60ºC)	pH 3,5	pH 4,5
	> 75% de	10% de
	actividad restante	actividad restante

Para obtener fosfolipasa en lugar de lisofosfolipasa a partir de los respectivos microorganismos, las condiciones de fermentación son esenciales. Para la formación de la fosfolipasa es esencial llevar a cabo el cultivo en un medio ácido a levemente alcalino. El valor del pH aquí en forma apropiada se encuentra en un intervalo de 2 a 9, preferentemente, de 3 a 8. En estas condiciones, preferentemente se forma fosfolipasa. Para esto, se procede de la siguiente manera:

En primer lugar, se selecciona un organismo hospedador apropiado, con la meta de una producción lo más sencilla posible de la fosfolipasa. Aunque muchas especies de mohos entran en consideración como posibles organismos hospedadores, como, por ejemplo, representantes de los géneros termófilos Humicola, Thermomyces y Mucor, de los géneros Rhizopus, Absidia, Chaetomium, Trichoderma, Thielavia, Penicillium y Cephalosporium, preferentemente se usaron especies del género Aspergillus. Después de la transformación con los plásmidos conforme a la invención, pueden aislarse transformantes que, en comparación con los organismos hospedadores, producen fosfolipasa en grandes cantidades. Preferentemente, el organismo hospedador transformado es una cepa de Aspergillus, de las especies Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus ellipticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus carbonarius o Aspergillus phoenicis, o una cepa de Trichoderma, de las especies Trichoderma viride, Trichoderma longibrachiatum o Trichoderma reesei.

Se cultiva un transformante que se produce mediante la cotransformación de una cepa hospedadora con un plásmido de selección, preferentemente, con pAN7 - 1, p3SR2 ó pSTA10, y un plásmido de expresión, preferentemente, con pKC3, pKC9, pKC12 ó pKCN2, en una solución nutriente usual para la cepa hospedadora que contiene al menos una fuente de C utilizable como, por ejemplo, harina gruesa de maíz, almidón, dextrina de almidón, y al menos una fuente orgánica de N utilizable como, por ejemplo, agua de lavado de maíz, autolisado de levadura, harina de soja, proteína de soja o peptona de soja, solos o en combinación con fuentes de N inorgánicas como sales de amonio o nitratos, y después de la esterilización se ajusta a un valor de pH ácido hasta levemente alcalino. La solución nutriente puede completarse por la adición de sustancias que aumenten en particular medida la formación de la fosfolipasa. Los fosfolípidos de soja contienen tales sustancias, pero también existen en otras clases de sustancia como, por ejemplo, los éteres de polioxietileno. Después de inocular la solución nutriente estéril con conidios o micelio vegetativo del transformante, éste crece con ventilación a temperaturas de entre 20ºC y 60ºC, preferentemente, de entre 25ºC y 45ºC y produce la fosfolipasa conforme a la invención. Durante el cultivo, se corrige el valor del pH del cultivo mediante la adición de ácido o de lejía, de manera que se mantenga en el intervalo ácido hasta débilmente alcalino, preferentemente, entre pH 3 y 8. Después de una duración de cultivo de 48 a 120 horas, puede obtenerse la fosfolipasa, separando los restos insolubles de solución nutriente y la biomasa, lo que usualmente se efectúa mediante filtración, y concentrando el filtrado mediante procedimientos usuales como, por ejemplo, por ultrafiltración. El concentrado (retentato) puede usarse para el desmucilaginado de los aceites vegetales o para el tratamiento de fosfolípidos. Además, la fosfolipasa también puede usarse para mejorar las propiedades reológicas de alimentos.

Se depositaron los siguientes microorganismos en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSM), Mascheroder Weg 1B, 38124 Braunschweig, Alemania, conforme a las indicaciones del tratado de Budapest:

A. oryzae RH 3745: Número de depósito en DSM: 11283

(Fecha de depósito: 11.11.1996)

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A. ellipticus RH 3886: Número de depósito en DSM: 11284

(Fecha de depósito: 11.11.1996)

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A. foetidus RH 3046: Número de depósito en DSM: 10652

(Fecha de depósito: 24.04.1996)

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E. coli DH5\alpha pKC3: Número de depósito en DSM: 10653

(Fecha de depósito: 24.04.1996)

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E. coli DH5\alpha pKC9: Número de depósito en DSM: 10654

(Fecha de depósito: 24.04.1996)

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E. coli DH5\alpha pKC12: Número de depósito en DSM: 10655

(Fecha de depósito: 24.04.1996)

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E. coli pKCN2: Número de depósito en DSM: 11352

(Fecha de depósito: 23.12.1996)

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A. niger RH 3909: Número de depósito en DSM: 11353

(Fecha de depósito 23.12.1996)

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La invención se explica más detalladamente mediante los siguientes ejemplos y figuras.

La figura 1 muestra el procesamiento del gen de lisofosfolipasa de Aspergillus y la obtención de la fosfolipasa.

La figura 2 muestra la construcción del plásmido pKCN2.

Ejemplos Ejemplo 1 Construcción del vector de expresión pKCN2 Aislamiento del gen de lisofosfolipasa de A. niger NRRL3

Se aisló el ADN cromosómico de A. niger NRRL3 conforme a una indicación de Hynes. M. J. y col. (1983). Mol. Cell. Biol. 3, 1430-1439.

El ADN obtenido, de alto peso molecular, fue hidrolizado parcialmente con Sau3AI y fue fraccionado según su tamaño, mediante centrifugación en gradiente de densidades de sacarosa. Las moléculas de ADN del tamaño de 9 a 20 kb fueron insertadas en ADN EMBL3 hidrolizado por BamHI/EcoRI y empaquetadas in vitro.

Para la identificación del gen cromosómico de lisofosfolipasa en un banco de genes Lambda EMBL3, se usó el fragmento de ADN complementario HindIII/SalI del plásmido pKC1/36 como sonda de hibridación. El plásmido pKC1/36 contenía el ADN complementario de lisofosfolipasa, aislado de A. foetidus RH 3046.

Después de la hibridación y del aislamiento múltiple, pudieron identificarse dos clones positivos. El ADN de fagos del clon Nº 1 fue preparado e hidrolizado con BamHI. Después de una hibridación tipo Southern, presentaba una señal positiva en aproximadamente 9 kb. Se clonó el fragmento BamHI en pUC18 y el plásmido resultante, que contenía el gen cromosómico completo de la lisofosfolipasa, se denominó pKCN.

Construcción del vector de expresión pKCN2

En el plásmido pKCN2 se insertó el gen de la lisofosfolipasa, bajo el control del promotor de alfa-amilasa de A. oryzae y del terminador trpC de A. nidulans.

El aislamiento del gen de la lisofosfolipasa del plásmido pKCN se llevó a cabo con la ayuda del procedimiento por PCR. Se usaron dos cebadores oligonucleotídicos con las siguientes secuencias:

100

Para la reacción en cadena de la polimerasa, en un volumen de reacción de 0,1 ml, se mezclaron Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, dNTP 0,2 mM (respectivamente, dATP, dCTP, dGTP, dTTP 0,2 mM), por cada 50 pmol de KC29 y KC43, 1 ng de pKCN como matriz y 2,5 U de polimerasa marcada. La preparación se llevó a cabo por 20 ciclos (a 94ºC, durante 40 s; a 40ºC, durante 1 min; a 72ºC, durante 1 min). Después de finalizar la reacción, se purificó el fragmento amplificado, se hidrolizó con BspMI y BamHI y se insertó en el plásmido pKE2, escindido mediante NcoI/BamHI. El plásmido pKE2 contiene el promotor de alfa-amilasa de A. oryzae y el terminador trpC de A. nidulans.

La construcción del plásmido pKCN2 se confirmó mediante un análisis de restricción y la subsiguiente secuenciación.

Ejemplo 2 Procedimiento de transformación para cepas de Aspergillus y Trichoderma reesi

De un cultivo en placa de Petri de aproximadamente 2 semanas de edad de la cepa de hongos que se ha de transformar se produjo una suspensión de esporas en aproximadamente 10 ml de solución al 0,85% de NaCl, mediante enjuague, usando la ayuda de una espátula. Respectivamente, se inocularon cuatro matraces agitadores de 1 l con 100 ml de medio mínimo de Czapek-Dox (Oxoid) con 0,1% de extracto de levadura, respectivamente con 1 ml de suspensión de esporas, y se incubó durante aproximadamente 16 horas a 28ºC en un agitador redondo, a 120 revoluciones por minuto. Se recolectó el micelio de cuatro matraces agitadores sobre un filtro de papel y se enjuagó con aproximadamente 50 ml de tampón MP (MgSO_{4} 1,2 M en tampón de fosfatos 10 mM, pH: 5,8). Después del escurrimiento del tampón, se obtuvo el micelio húmedo. Normalmente, se obtuvieron aproximadamente de 3 a 5 g de micelio húmedo.

Por g de micelio húmedo, se añadieron 5 ml de tampón MP, 120 \mul de solución de Novozym (1 g de Novozym® 234 (Novo Nordisk) en 6 ml de tampón MP) y 25 \mul de \beta-glucuronidasa (Sigma). Se colocó la suspensión de micelio en agua con hielo durante 5 min. A continuación, se añadieron 60 \mul de solución de seroalbúmina bovina (0,2 g de seroalbúmina bovina en 4 ml de tampón MP, esterilizado por filtración) y se incubó la preparación a 30ºC con leve agitación. Con el microscopio, se siguió en forma visual la formación de protoplastos. Cuando ya no se podía constatar un aumento sustancial de la formación de protoplastos, se interrumpió el procesamiento de la preparación, para la recolección de los protoplastos. Esto normalmente ocurría después de aproximadamente 3 a 5 horas.

Se pasó la suspensión de protoplastos a través de un filtro de lana de vidrio embebido con tampón MP, para la separación de componentes gruesos remanentes de micelio, y se transfirió a tubitos de centrífuga. En la mitad superior de los tubitos, se recubrió con una capa de sorbitol 600 mM, Tris/HCl 100 mM, pH: 7,0. Se centrifugaron los tubitos durante 10 min a 2500 g. Se retiraron los protoplastos de la capa intermedia y se recibieron en sorbitol 1 M, Tris/HCl 10 mM, pH: 7,5. A continuación, los protoplastos se lavaron dos veces con tampón STC (sorbitol 1 M, Tris/HCl 10 mM, pH: 7,5, CaCl_{2} 10 mM) mediante centrifugación a 1500 g y finalmente, se recibieron en 1 ml de tampón STC.

Para la transformación de A. oryzae, se reunieron 300 \mul de suspensión de protoplastos, aproximadamente 10 \mug de p3SR2, como plásmido de selección, y 10 \mug del plásmido respectivo para la expresión del LPL en 25 \mul de Tris/HCl 10 mM, pH: 8,0 y se incubó durante 10 min a 0ºC. A continuación, nuevamente se reunieron 25 \mul de la misma mezcla de plásmidos y 400 \mul de solución de PEG (polietilenglicol 6000 (Fluka) al 60% en Tris/HCl 10 mM, pH: 7,5, CaCl_{2} 50 mM), se mezcló muy cuidadosamente y se incubó durante 5 min a temperatura ambiente. Nuevamente, de añadieron 600 \mul de solución de PEG, se mezcló y se incubó la preparación durante otros 20 min más a temperatura ambiente. Se mezcló la preparación con aproximadamente 9 ml de agar blando de acetamida (medio mínimo con acetamida 10 mM como única fuente de N, sacarosa 1 M, agar al 0,6% en peso), a 45ºC, y se distribuyó en cuatro placas de Petri con igual medio, pero con 1,5% en peso de agar (Oxoid) y adicionalmente 15 mM de CsCl. Se incubaron las placas a 28ºC. Después de 6 a 10 días, se inocularon colonias de crecimiento rápido (transformantes) en medio de acetamida sin sacarosa, se purificó dos veces mediante colonias de esporos únicos y finalmente, se transfirió a medio completo, por ejemplo, de patata-dextrosa-agar.

La transformación de cepas de las especies A. niger, A. awamori, A. japonicus o A. foetidus también puede efectuarse con el plásmido p3SR2. Sin embargo, la transformación preferentemente se llevó a cabo con el plásmido pAN7 - 1. La preparación de los protoplastos y la adición del ADN de plásmido se efectúan de forma análoga, como fue descrito anteriormente para el plásmido p3SR2. Sin embargo, en lugar de añadir agar blando de acetamida, se añade la totalidad de la preparación de transformación a 100 ml de medio mínimo de Czapek-Dox (Oxoid) con 100 \mug de higromicina B/ml, agar (Oxoid) al 1,5% en peso y sacarosa 1 M, enfriado hasta aproximadamente 45ºC y se mezcla cuidadosamente. Luego se coloca la preparación en porciones de respectivamente 10 ml en placas de Petri, en las que como capa inferior sólida se habían colocado respectivamente 10 ml de medio mínimo de Czapek-Dox (Oxoid) con agar (Oxoid) al 1,5% en peso, pero sin higromicina y sin sacarosa. Después de la solidificación de la capa superior de agar, se incuban las placas de Petri a 30 hasta 37ºC. De los transformantes resistentes contra la higromicina B, después de aproximadamente 3 a 10 días también pueden retirarse inóculos y transferírselos a medio mínimo de Czapek-Dox (Oxoid) con 50 \mug de higromicina B/ml y agar (Oxoid) al 1,5% en peso, para examinar la resistencia.

Para la transformación de A. sojae o A. phoenicis, se usa un tercer principio de selección, porque las cepas usadas de esta especie tanto usan acetamida como son resistentes contra la higromicina B. Por selección sobre sustrato nutritivo que contiene clorato, se aíslan mutantes cuyo gen de nitratorreductasa (niaD) es defectuoso, es decir, que ya no crecen con nitrato como única fuente de nitrógeno (Cove, D. J. (1976) Heredity 36, 191-203). Por transformación con el plásmido pSTA10 (Unkles, S. E: y col. (1989) Mol. Gen. Genet. 218, 99-104), en el que se encuentra la información intacta para el gen de nitratorreductasa, se compensa el defecto, de manera que los transformantes crezcan con nitrato como única fuente de nitrógeno, mientras que las células no transformadas se retardan en el crecimiento.

Esta metódica para la selección, además de para A. sojae es igualmente apropiada para otras especies de Aspergillus; aunque la producción de las mutantes niaD significa un esfuerzo adicional, en comparación con el uso de la resistencia contra higromicina B o con el uso de acetamida.

Ejemplo 3 Producción de transformantes que escinden PL Transformantes de A. niger, A. awamori, A. foetidus, A. carbonarius y A. ellipticus

Se produjeron protoplastos de estas especies de Aspergillus mediante la metódica descrita en el ejemplo 1 y se cotransformaron usando el plásmido pAN7 - 1 y, respectivamente, uno de las plásmidos pKC3, pKC9, pKC12 ó pKCN2. Para la regeneración de los protoplastos, se siembra la preparación de transformación sobre higromicina como se ha descrito anteriormente, se aíslan los transformantes de las placas de regeneración, se purifican y se examinan en ensayos de agitación, usando la siguiente solución nutriente

Maltodextrina	3,75%
Polvo dilatable de maíz	3,0%
KH_{2}PO_{4}	1,0%
K_{2}HPO_{4}	0,7%
Triton X-100	0,10%

en agua corriente, esterilizado durante 30 min a 121ºC, para determinar la producción de PL. Para esto, se separa por filtración la biomasa de los cultivos con agitacióny se mide la actividad fosfolipasa (PLU) en el filtrado del cultivo. Los transformantes se destacan por una actividad fosfolipasa notablemente aumentada, en comparación con la cepa hospedadora.

Transformantes de A. oryzae y A. aculeatus

Con estas especies también se llevan a cabo la protoplastización y la transformación como está descrito en el ejemplo 2. Los protoplastos se cotransforman usando el plásmido p3SR2 y respectivamente, uno de los plásmidos pKC3, pKC9, pKC12 ó pKCN2. Para la regeneración de los protoplastos, se siembra la preparación de transformación como se describió anteriormente, sobre un sustrato nutritivo con acetamida como única fuente de nitrógeno, se aíslan los transformantes de las placas de regeneración, se purifican y se examinan en ensayos de agitación, usando la siguiente solución nutriente

Maltodextrina	3,75%
Polvo dilatable de maíz	3,0%
(NH_{4})_{2}HPO_{4}	0,5%
Triton X-100	0,10%

en agua corriente, esterilizado durante 30 min a 121ºC, para determinar la producción de PL.

Transformación de A. sojae y A. phoenicis

Las cepas A. sojae RH 3782 niaD22 y A. phoenicis RH 3828 niaD, que respectivamente son mutantes de A. sojae RH 3782 y A. phoenicis RH 3828, producidas según Cove (1976), se cultivan en la siguiente solución nutritiva, a partir de

Glucosa (MERCK)	2%
Extracto de malta (OXOID)	0,5%
Bactopeptona (DIFCO)	0,025%
Agua desionizada

ajustar el valor de pH a 5,0; esterilización: 30 min a 121ºC.

A partir del micelio se obtienen protoplastos mediante la metódica descrita en el ejemplo 1 y se cotransforman los protoplastos con pSTA10 como plásmido de selección y con respectivamente uno de los plásmidos pKC3, pKC9 ó pKC12. Para la regeneración de los protoplastos, se mezcla la preparación de transformación con 9 ml de agar blando (estabilizante osmótico), constituido por

Tampón de fosfato de Na 0,1 M, pH: 6,0	15 ml
Sacarosa 1 M (MERCK)	10,28 g
Agua Millipore hasta	29,1 ml
Agar (OXOID)	0,18 g (=0,6%)

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esterilización durante 30 min a 121ºC, a continuación, adición estéril de:

Solución salina (7.14.2)	0,6 ml
Solución 1 M de NaNO_{3}	0,3 ml

y se distribuye en cuatro placas de agar de igual composición, pero producidas con agar al 1%. Después de aproximadamente 6 a 10 días de incubación a 37ºC, se aíslan los transformantes de las placas de agar, se purifican en nitrato-sacarosa-agar por frotis. Se obtuvieron un gran número de transformantes por selección y subsiguiente purificación en un sustrato nutritivo con nitrato como única fuente de N y se examinó en un matraz agitador, usando la siguiente solución nutritiva:

Maltodextrina	3,75%
Polvo dilatable de maíz	3,0%
KH_{2}PO_{4}	1,0%
K_{2}HPO_{4}	0,7%
Triton X-100	1,0%

Además de transformantes que no producen o sólo producen bajas cantidades de PL, así como las cepas hospedadoras no transformadas, también se hallan tales transformantes que presentan actividad PL notablemente aumentada en el filtrado del cultivo. Estas cepas, denominadas cotransformantes, son apropiadas para la producción de la enzima. En la tabla 2 se comparan resultados típicos de la formación de PL por transformantes y por los organismos hospedadores no transformados.

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TABLA 2 Comparación de la formación de PL por cepas hospedadores y por transformantes

Cepa y/u transformante	Actividad relativa de PL

A. oryzae RH 3745	100
A. oryzae RH 3745 p3SR2 pKC9	3000-4000
A. oryzae RH 3745 p3SR2 pKCN2	2000-2500
A. sojae RH 3782 niaD22	100
A. sojae RH 3782 niaD22 pSTA10 pKC9	500-700
A. foetidus RH 3946	100
A. foetidus RH 3046 pAN7 - 1 pKC9	1000-1500
A. phoenicis RH 3828 niaD	100
A. phoenicis RH 3828 niaD pSTA10 pKC9	400-600
A. ellipticus	100
A. ellipticus pAN7 - 1 pKC12	800-900
A. heteromorphus niaD	100
A. heteromorphus niaD pSTA10 pKC9	900-1000
A. carbonarius	100
A. carbonarius pAN7 - 1 pKC9	400-600
A. aculeatus	100
A. aculeatus p3SR2 pKC9	900-1200
A. niger	100
A. niger pAN7 - 1 pKC12	700-1000
A. awamori	100
A. awamori pAN7 - 1 pKC12	600-800

Ejemplo 4 Purificación de la PL a partir de A. foetidus

Se diluyeron 2080 ml de rechazo del cultivo de A. foetidus RH 3788 con 3520 ml de agua destilada, para bajar la conductividad eléctrica y se ajustó el valor del pH a 7,0 mediante 160 ml de NaOH 1 M. La muestra tenía un volumen de 5760 ml y una conductividad de 7,8 mS/cm.

En otro paso, se efectuó una cromatografía de intercambio iónico en DEAE-Fractogel (MERCK). Para ello, se aplicaron 5760 ml de la solución enzimática en cuatro preparaciones (c/u de 1440 ml) sobre una columna DEAE-Fractogel (altura: 278 mm, diámetro: 100 mm). Se enjuagó la columna con el tampón A (20 mM de tampón de fosfatos a partir de Na_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4}, pH: 7,0 + 15 mM de NaCl). Se realizó la elución con un gradiente continuo del tampón A hacia el tampón B (tampón A + NaCl 1 M). Se eluyó con una velocidad de 70 ml/min y se recolectaron fracciones de 350 ml cada una.

Se examinaron las fracciones para detectar la presencia de PL. Esto se efectuó mediante la medición de la actividad PL. Una unidad de PL se define como la cantidad de enzima que en una solución acuosa de lecitina, a pH: 3,5 y a 40ºC genera una velocidad de hidrólisis de 1 \muM/min.

La medición de la actividad PL se efectuó de la siguiente forma:

Sustrato: Se homogeneizaron 1 g de Epikuron 200 (fosfatidilcolina de la empresa Lucas Meyer) + 100 g de agua destilada + 5 ml de solución de CaCl_{2} 0,32 M en un aparato Ultra Turrax.

Análisis: a 10 ml de sustrato se añadieron 10 ml de solución de Triton X-100 al 1% (empresa Fluka) y 5 ml de solución de monohidrato de ácido cítrico 0,0033 M y se templó durante 10 min a 40ºC; el valor del pH se ajusta a 3,4 hasta 3,5. Se añadió 0,1 ml de solución enzimática y se incubó la mezcla durante 10 min a 40ºC. La concentración de enzima en la preparación para análisis no debería ser mayor de 2,5 U/g. Después del transcurso del tiempo de reacción, se tituló con solución de KOH 0,01 M hasta alcanzar el valor de pH de 10,0, añadiendo los primeros 5 ml rápidamente y reduciendo luego la velocidad de titulación para evitar una sobretitulación.

Para el valor en blanco (BW), se calentó la enzima durante 15 min a aproximadamente 95ºC y se inactivó. Después de enfriar, se diluyó para el valor principal (HW) y se siguió procediendo para el valor principal.

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Cálculo:

= PLU/pH3,5 = \frac{HW(ml) \ BW(ml)* 0,01 \ M * 1000}{10 \ min * 0,1 \ ml * conc. \ de \ enzima \ en \ g/ml}

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En la solicitud de patente 19527274.9, del 26.07.1995, se indica la fosfolipasa en unidades de lecitina, LU/g. 1 unidad de lecitina es aquella cantidad de enzima que a 40ºC, a pH 8 en un minuto libera 1 \muM de ácido graso de la yema de huevo. 1 LU/g, a pH 8 corresponde a 108 PLU/g a pH 3,5.

La elución de la PL comenzó a una concentración aproximada 0,11 M de NaCl. Las fracciones que contenían PL se reunieron a partir de cuatro vías (8950 ml) y se concentraron mediante un concentrador de CH2A de la empresa Amicon, Hollow-Fiber Patrone MG10000, hasta un volumen de 2570 ml. A esta muestra se añadieron 782 ml de solución de sulfato de amonio 3 M, con agitación (la muestra ahora contiene sulfato de amonio 0,7 M).

En el próximo paso se aplicaron 3352 ml de la muestra en una columna de fenilsefarosa 6 Fast Flow, Low Substitution (Pharmacia, altura: 215 mm, diámetro: 100 mm). Se enjuagó la columna con el tampón C (tampón de fosfatos 20 mM, pH: 7,0 + sulfato de amonio 0,5 M) y se eluyó con un gradiente en declive continuo del tampón C hacia el tampón D (tampón de fosfatos 20 mM, pH: 7,0). Se reunieron las fracciones que contenían PL (790 ml) y se concentraron con el concentrador (véase arriba) y se dializaron contra el tampón D; se obtuvieron 150 ml de
muestra.

En otro paso, se aplicaron respectivamente 30 ml de la muestra en 5 preparaciones sobre una columna para cromatografía de intercambio aniónico Mono-Q (Pharmacia, 6,3 ml). Se enjuagó la columna con el tampón D y se efectuó la elución con un gradiente continuo del tampón D hacia el tampón B, y se inició el análisis de PL a una concentración de aproximadamente 200 mM de NaCl.

Se reunieron las fracciones que contenían PL y se dializaron contra el tampón E (tampón de fosfatos 20 mM, pH: 7,1) en columnas PD-10 (Pharmacia). La muestra tenía un volumen de 24 ml.

Purificación final de la PL a través de Mono P HRS/20 (cromatofocalización)

Se aplicaron los 24 ml (véase arriba) sobre la columna MONO P (altura: 200 mm, diámetro: 5 mm). Se enjuagó la columna con el tampón E. Se eluyó la muestra con el tampón F (politampón 74 de Pharmacia, diluido 1:10 con agua destilada y ajustado a un valor de pH 4,0 con HCl 1 M). La PL eluía después de que hubiera pasado por la columna 13 veces el volumen de la columna de tampón F.

La proteína purificada en la electroforesis SDS en gel muestra una banda uniforme con un peso molecular de aproximadamente 31000 daltonios. El punto isoeléctrico se encuentra en el valor de pH de aproximadamente 4,3. La proteína purificada de esta forma fue usada para la secuenciación. La fosfolipasa así aislada fue usada para la obtención de anticuerpos en conejos. La inmunización se efectuó mediante el procedimiento estándar, descrito por Harlowe y Lane (bibliografía: Ed Harlowe y David Lane, Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). El antisuero así obtenido pudo usarse directamente para hibridaciones tipo Western (como también está descrito por Harlowe y Lane), marcándose específicamente la banda de la fosfolipasa.

Ejemplo 5 Desmucilaginado de aceite de soja

En un matraz de fondo redondo, se calientan hasta 40ºC 200 g de aceite de soja desmucilaginado en húmedo, con un contenido de fosfatos remanentes de 160 ppm. A esto se añaden 10 g de agua en la que están contenidos 20 mg de ácido cítrico y 100 unidades de fosfolipasa. La enzima proviene de la fermentación de un transformante de Aspergillus niger que contiene el constructo de fosfolipasa. Se efectúa la determinación de la actividad a pH 3,5. Para ello, a 10 ml de fosfatidilcolina al 1% (Epikuron 200 de Lucas Meyer), que contiene 0,5 ml de CaCl_{2} 0,32 M, se añaden 10 ml de solución de Triton X-100 y 5 ml de monohidrato de ácido cítrico 0,0033 M y se templa durante 10 minutos a 40ºC. Se añade 0,1 ml de solución enzimática diluida en forma correspondiente y se incuba durante 10 minutos a 40ºC. Se titula con solución de KOH 0,01 M hasta alcanzar un valor de pH de 10. Se sustrae el valor en blanco (solución enzimática calentada a 95ºC durante 15 minutos en la preparación) y se efectúa el cálculo conforme al
ejemplo 3.

El contenido del matraz de fondo redondo se dispersa intensivamente mediante una bomba centrífuga externa. El contenido del matraz circula en forma completa aproximadamente una vez por minuto. Aquí la fase acuosa presenta un tamaño de partículas menor de 1 \mum. Se retiran muestras cada dos horas y se examinan para determinar el contenido de fósforo. Resultaron los siguientes valores:

Tiempo en horas	0	2	4	6	8
Contenido de fósforo en ppm	160	24	12	7	3

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En ensayos en los que se procedió como fue descrito, pero en los que en lugar del preparado enzimático se añadió una cantidad correspondiente de proteína de suero de leche, es decir, proteína no enzimática, o lisofosfolipasa del mercado (G-Zyme de Enzyme Biosystems, EE.UU., 1000 unidades de lisofosfolipasa por 200 ml de aceite de soja), no pudo bajarse el contenido de fósforo de 80 ppm.

Ejemplo 6 Mejoramiento de la calidad de la masa

Se efectuó el siguiente ensayo de panificación con la fosfolipasa conforme a la invención. A partir de 100 partes en peso de harina, 2 partes en peso de sal, 3 partes en peso de levadura para hornear, 58 a 60 partes en peso de agua y de 40 a 50 ppm de ácido ascórbico (respecto al peso de la masa) en un amasador en espiral (fabricado por Kemper) se produjo una masa mediante 2 min en la graduación baja 1 y 6 min en una graduación más alta 2. Antes del comienzo del proceso de amasado, se añadieron las enzimas y los otros aditivos al agua. La temperatura de la masa ascendía a 23º hasta 25ºC. Después de hacer reposar la masa durante 20 min, se dividió la masa para la producción de pan blanco horneado libremente en piezas de 350 g, se formaron, se pusieron a punto durante 70 min y/o 90 min a 32ºC y 80% de humedad relativa del aire y se hornearon durante 32 min a 230ºC. En la tabla 3 está indicado el volumen del pan con distintos aditivos de enzima. Los resultados del horneado muestran que por la adición de fosfolipasa se mejoran el volumen del pan horneado y la estructura de la miga. El efecto estabilizante sobre la masa se demuestra por los buenos resultados del horneado con refinado aumentado (90 min).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3 Ensayos de panificación

1

(1) INDICACIONES GENERALES:

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(i): SOLICITANTES

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(A): NOMBRE: ROEHM GMBH

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(B): CALLE: Kirschenallee

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(C): LOCALIDAD: Darmstadt

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(E): PAÍS: Alemania

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(F): CÓDIGO POSTAL: 64293

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(A): NOMBRE: LOEFFLER, Fridolin

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(B): CALLE: Kart-Henkelmann-Weg 4

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(C): LOCALIDAD: Bensheim

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(E): PAÍS: Alemania

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(F): CÓDIGO POSTAL: 64625

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(A): NOMBRE: JUNGSCHAFFER, Gerald

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(B): CALLE: Haehnleiner Stra\betae 1A

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(C): LOCALIDAD: Alsbach-Haehnlein

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(E): PAÍS: Alemania

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(F): CÓDIGO POSTAL: 64665

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(A): NOMBRE: KHANH, Quoc Nguyen

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(B): CALLE: Am Tannenberg 9

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(C): LOCALIDAD: Reichelsheim

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(E): PAÍS: Alemania

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(F): CÓDIGO POSTAL: 64385

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(A): NOMBRE: SCHUSTER, Erwin

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(B): CALLE: Darmstaedter Str. 237

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(C): LOCALIDAD: Bensheim-Auerbach

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(E): PAÍS: Alemania

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(F): CÓDIGO POSTAL: 64625

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(A): NOMBRE: SPROESSLER, Bruno

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(B): CALLE: Auf der Schmelz 93

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(C): LOCALIDAD: Rossdorf

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(E): PAÍS: Alemania

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(F): CÓDIGO POSTAL: 64380

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(A): NOMBRE: WOLF, Sabine

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(B): CALLE: OtzbergstraBe 44

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(C): LOCALIDAD: Otzberg

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(E): PAÍS: Alemania

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(F): CÓDIGO POSTAL: 64853

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(ii): DENOMINACIÓN DE LA INVENCIÓN: Proteína con actividad fosfolipasa

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 4

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(iv): VERSIÓN LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A): SOPORTE INFORMÁTICO: disco Floppy

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(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C): SISTEMA DE TRABAJO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0, Versión # 1.30 (EPA)

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(2) INDICACIONES PARA ID SEC Nº: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 1368 pares de bases

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(B): TIPO: Nucleótido

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(C): TIPO DE CADENA: Doble cadena

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

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(iii): HIPOTÉTICO: NO

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(iv): ANTISENTIDO: NO

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(ix): CARACTERÍSTICA:

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(A): NOMBRE/CLAVE: intrón

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(B): UBICACIÓN: 222..275

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(ix): CARACTERÍSTICA:

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(A): NOMBRE/CLAVE: intrón

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(B): UBICACIÓN: 442..486

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

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(A): NOMBRE/CLAVE: intrón

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(B): UBICACIÓN: 824..874

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(ix): CARACTERÍSTICA:

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(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): UBICACIÓN: juntos (140..221, 276..441, 487..823, 875..1180)

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(ix): CARACTERÍSTICA:

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(A): NOMBRE/CLAVE: mat_peptide

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(B): UBICACIÓN: 221..1180

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(ix): CARACTERÍSTICA:

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(A): NOMBRE/CLAVE: sig_peptide

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(B): UBICACIÓN: 140..220

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 1:

2

3

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(2) INDICACIONES PARA ID SEC Nº: 2:

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(i): CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 297 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:2:

4

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(2) INDICACIONES PARA SEQ IN NO: 3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 42 pares de bases

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(B): TIPO: nucleótido

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(C): TIPO DE CADENA: cadena sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

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(iii): HIPOTÉTICO: NO

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(iv): ANTISENTIDO: NO

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 3:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAATTCACC TGCTAACCAT GTTCTCTGGA CGGTTTGGAG TG

\hfill

42

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(2) INDICACIONES PARA ID SEC Nº: 4:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 34 pares de bases

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(B): TIPO: nucleótido

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(C): TIPO DE CADENA: cadena sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

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(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGGATCCAA GCTATAGCAG ACACTCTGAA ATTG

\hfill

34

Claims

1. Proteína con actividad fosfolipasa, que puede obtenerse por escisión de la secuencia madura de la lisofosfolipasa de Aspergillus, con ID SEC Nº: 2, en dos partes escindidas, estando enlazadas las partes escindidas a través de al menos una unión escindible en condiciones reductoras o de las partes escindidas no enlazadas, al menos una posee actividad fosfolipasa.

2. Proteína según la reivindicación 1, caracterizada porque una de las partes escindidas posee un peso molecular de 30 kDa.

3. Proteína según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque la escisión de la secuencia madura de la lisofosfolipasa de Aspergillus foetidus se efectúa entre las posiciones 44 y 45 de la secuencia de aminoácidos.

4. Proteína según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque se puede aislar a partir de cultivos de Aspergillus.

5. Proteína según la reivindicación 4, caracterizada porque se puede aislar a partir de cultivos de A. foetidus, A. niger o A. oryzae.

6. Proteína con actividad fosfolipasa, según la reivindicación 1, caracterizada porque es reconocida por un anticuerpo contra fosfolipasa purificada de Aspergillus foetidus RH 3046.

7. Procedimiento para la producción de una proteína con actividad fosfolipasa, según la reivindicación 1, mediante la fermentación en un medio de cultivo apropiado de un organismo hospedador transformado de forma apropiada que produce lisofosfolipasa y el aislamiento de la proteína con actividad fosfolipasa del filtrado exento de células, caracterizado porque la fermentación se lleva a cabo en el intervalo ácido hasta levemente alcalino.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque la fermentación se lleva a cabo a un valor de pH de 2 a 9, preferentemente, de 3 a 8.

9. Procedimiento según las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque como organismo hospedador transformado se usa una cepa de Aspergillus o una cepa de Trichoderma.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque como organismo hospedador transformado se usa Aspergillus foetidus o Aspergillus oryzae.

11. Uso de una proteína según una de las reivindicaciones 1 a 6 para desmucilaginar aceite vegetal.

12. Uso de una proteína según una de las reivindicaciones 1 a 6 como coadyuvante de horneado.