ES2275005T3 - Tieno (2,3-d) pirimidinas con actividad agonista lh y fsh combinada. - Google Patents
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Abstract
Un derivado de tieno[2, 3-d]pirimidina de acuerdo con la fórmula general I, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, donde R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo que tiene 2-6 átomos de carbono, conteniendo opcionalmente uno o más heteroátomos seleccionados de N, O y/o S.
Description
Tieno[2,3-d]pirimidinas
con actividad agonista LH y FSH combinada.
La invención se refiere a compuestos que tienen
actividad agonista de hormonas glicoproteicas, en particular a
compuestos que tienen actividad agonista de la Hormona Luteinizante
(LH) y de la Hormona Estimulante del Folículo (FSH). La invención
se refiere además a composiciones farmacéuticas que contienen los
mismos así como a la utilización de estos compuestos en terapia
médica, particularmente para utilización como control de la
fertilidad.
Las gonadotropinas desempeñan importantes
funciones en una variedad de funciones corporales incluyendo el
metabolismo, la regulación de la temperatura y el proceso
reproductivo. Las gonadotropinas hipofisarias FSH y LH desempeñan,
por ejemplo, un papel fundamental en la estimulación del desarrollo
y la maduración del folículo, mientras que la LH está implicada en
la inducción del proceso ovulatorio (Sharp, R.M., Clin. Endocrinol.
33, 787-807, 1990; Dorrington y Armstrong,
Recent Prog. Horm. Res. 35, 301-342, 1979;
Levy y col., Human Reproduction 15,
2258-2265, 2000).
Actualmente, la LH es aplicada clínicamente, en
combinación con la FSH, para la estimulación ovárica, esto es para
la hiperestimulación ovárica para fertilización in vitro
(FIV) y para la inducción de ovulación en mujeres anovulatorias
infértiles (Insler, V., Int. J. Fertility 33,
85-97, 1988; Navot y Rosenwaks, J. Vitro Fert.
Embryo Transfer. 5, 3-13, 1988), así como
para el hipogonadismo masculino y la infertilidad masculina.
Las gonadotropinas actúan sobre tipos celulares
específicos de las gónadas para iniciar la diferenciación ovárica y
testicular y la esteroidogénesis. Las acciones de estas hormonas
hipofisarias y placentarias están mediadas por receptores
específicos de la membrana plasmática que son miembros de la gran
familia de receptores acoplados a proteína G. Constan de un único
polipéptido con siete dominios transmembranales y son capaces de
interaccionar con la proteína Gs, dando lugar a la activación de la
adenil ciclasa.
Las gonadotropinas destinadas a fines
terapéuticos pueden ser aisladas de fuentes de orina humana y tienen
baja pureza (Morse y col., Amer. J. Reproduct. Immunol. and
Microbiology 17, 143, 1988). Alternativamente, pueden ser
preparadas como gonadotropinas recombinantes. Además de por estas
proteínas, los receptores de gonadotropinas pueden ser activados o
desactivados por compuestos sintéticos de bajo peso molecular.
Compuestos heteroaromáticos bicíclicos han sido descritos en WO
00/61556. Mediante experimentos in vitro e in vivo
han demostrado ser útiles como agonistas de la LH.
En las mujeres normales, la liberación de la LH
y la FSH hipofisarias se caracteriza por una aparición a mitad del
ciclo que precede a la ovulación. La ovulación se caracteriza por
tres fenómenos fisiológicos distintos, esto es, la maduración del
oocito, la ruptura folicular y la luteinización. Mientras que la
función del aumento de la LH en la inducción in vivo de
estos fenómenos es indiscutible, el papel del aumento de la FSH está
menos claro. Sin embargo, se ha demostrado recientemente que la FSH
induce la maduración del oocito in vitro induciendo la
producción por las células del cúmulo de un factor que resuelve
positivamente la parada meiótica inducida por hipoxantina (Lu y
col., Mol. Cell. Endocrinol. 164, 191-196,
2000). Se cree que este factor es un esterol activador de la meiosis
(MAS).
En la inducción de la ovulación, es deseable
proporcionar como componente principal los efectos de la LH. De
acuerdo con la presente invención, se han encontrado compuestos con
propiedades particulares ventajosas cuando son utilizados en
protocolos para incrementar la fertilidad. En estos compuestos, la
actividad LH está acompañada por una actividad FSH.
Por tanto, la presente invención proporciona
compuestos de bajo peso molecular que además de actividad LH tienen
también inesperadamente actividad FSH. En general, estos compuestos
son tieno[2,3-d]pirimidinas que están
sustituidas en la posición 4 del anillo de pirimidina por un grupo
fenilo que, a su vez, está sustituido en la posición meta.
La presente invención reside en derivados de
tieno[2,3-d]pirimidina de acuerdo con
la fórmula general I,
o una sal de los mismos
farmacéuticamente aceptable, en los que N(R1)R2 están
unidos en un anillo
heterocicloalquilo(2-6C).
Los compuestos más preferidos son
ter-butil
5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(azetidin-1-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida;
ter-butil
5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(morfolin-4-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida;
ter-butil
5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(tiomorfolin-4-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida;
ter-butil
5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(piperidin-1-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida;
ter-butil
5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(pirrolidin-1-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida
y ter-butil
5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(piperazin-1-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida.
El término "unidos en un anillo
heterocicloalquilo(2-6C)" en la definición
de la Fórmula I, significa que R1 y R2 junto con el átomo de
nitrógeno al que están unidos forman un anillo que tiene
2-6 átomos de carbono, que contiene opcionalmente
uno o más heteroátomos seleccionados de N, O y/o S. Ejemplos de
tales anillos son azetidina, pirrolidina, piperidina, piperazina,
morfolina y tiomorfolina.
Se ha demostrado que compuestos con la Fórmula I
anteriormente mencionada presentan actividad agonista de LH y FSH.
En un bioensayo in vitro utilizando células CHO transfectadas
de manera estable con el receptor de la LH o de la FSH humano,
respectivamente, se encontró que la CE_{50} con respecto al
receptor de LH era menor de 5\cdot10^{-8} M, mientras que con
respecto al receptor de FSH la CE_{50} era menor de 10^{-5} M.
Típicamente, la actividad FSH varía desde una actividad del 1%
aproximadamente de la estimulación por el agonista de LH hasta un
10% aproximadamente de la estimulación por el agonista de LH.
La invención reside además en una composición
farmacéutica que comprende un compuesto derivado de
tieno[2,3-d]pirimidina o sales del
mismo que tiene la Fórmula general I.
Por tanto, los compuestos de acuerdo con la
presente invención pueden ser utilizados en terapia. Un aspecto
adicional de la invención reside en la utilización de un compuestos
tieno[2,3-d]pirimidina que tiene la
Fórmula general I para la fabricación de un medicamento para el
control de la fertilidad, más preferiblemente para la inducción de
ovulación. Los presentes compuestos son utilizados para activar los
receptores de LH y FSH. El compuesto de la presente invención puede
ser por tanto utilizado en un método para tratar a mujeres con
problemas de fertili-
dad.
dad.
Para uso terapéutico, las sales de los
compuestos de Fórmula I son aquéllas en las que el contraión es
farmacéuticamente aceptable. Sin embargo, las sales de adición de
ácido de bases de acuerdo con la Fórmula I pueden ser también
útiles, por ejemplo, en la preparación o purificación de un
compuesto farmacéuticamente aceptable. Todas las sales, sean o no
farmacéuticamente aceptables, están incluidas en el ámbito de la
presente invención.
Ejemplos de sales de adición de ácido incluyen
las derivadas de ácidos minerales tales como ácido clorhídrico,
ácido fosfórico, ácido sulfúrico, preferiblemente ácido clorhídrico,
y de ácidos orgánicos tales como ácido cítrico, ácido tartárico,
ácido acético, ácido láctico, ácido maleico, ácido malónico, ácido
fumárico, ácido glicólico, ácido succínico, etcétera.
Las vías de administración adecuadas para los
compuestos de Fórmula I, o para las sales de los mismos
farmacéuticamente aceptables, referidos también en la presente como
el ingrediente activo, son inyecciones intramusculares, inyecciones
subcutáneas, inyecciones intravenosas o inyecciones
intraperitoneales, administración oral e intranasal.
Preferiblemente, los compuestos pueden ser administrados oralmente.
La dosis exacta y el régimen de administración exacto del
ingrediente activo, o de una composición farmacéutica del mismo,
dependerán necesariamente del efecto terapéutico que se quiera
conseguir (tratamiento de la infertilidad; anticoncepción), y pueden
variar con el compuesto particular, la vía de administración y la
edad y condición del sujeto individual al que se vaya a administrar
el medicamento.
En general, la administración parenteral
requiere dosis menores que otros métodos de administración que son
más dependientes de la absorción. Sin embargo, una dosificación para
humanos contiene preferiblemente 0,0001-25 mg por
kg de peso corporal. La dosis deseada puede ser presentada como una
sola dosis o como múltiples subdosis administradas a intervalos
apropiados a lo largo del día. En el caso de receptoras femeninas,
las dosis pueden ser administradas a intervalos diarios apropiados
a lo largo del ciclo menstrual para soporte folicular, o como una
única dosis para la inducción de ovulación. La dosificación, así
como el régimen de administración, pueden diferir entre un receptor
femenino y un receptor masculino.
En el caso de aplicaciones in vitro o
ex vivo, como en aplicaciones para FIV, los compuestos de la
invención han de ser utilizados en el medio de incubación a una
concentración de 0,01-5 \mug/ml
aproximadamente.
La presente invención se refiere también, por
tanto, a composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto
tieno[2,3-d]pirimidina de acuerdo con
la Fórmula I en mezcla con agentes auxiliares farmacéuticamente
aceptables y, opcionalmente, con otros agentes terapéuticos. Los
agentes auxiliares deben ser "aceptables" en el sentido de ser
compatibles con los demás ingredientes de la composición y no ser
nocivos para los receptores de la misma.
Las composiciones farmacéuticas incluyen las que
son adecuadas para administración oral, rectal, nasal, tópica
(incluyendo transdérmica, bucal y sublingual), vaginal o parenteral
(incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica).
Las composiciones pueden ser preparadas mediante cualquier método
bien conocido en la técnica de la farmacia, utilizando por ejemplo
métodos tales como los descritos en Gennaro y col., Remington's
Pharmaceutical Sciences (18ª ed., Mack Publishing Company, 1990; ver
especialmente Parte 8: Pharmaceutical Preparations and Their
Manufacture).
Tales métodos se incluyen la etapa de asociar el
ingrediente activo con cualquier agente auxiliar. El(los)
agen-
te(s) auxiliar(es), denominado(s) también ingrediente(s) accesorio(s), incluye(n) los convencionales en la técnica
(Gennaro, supra), tales como agentes de carga, aglutinantes, diluyentes, desintegrantes, lubricantes, colorantes, agentes aromatizantes y agentes humectantes.
te(s) auxiliar(es), denominado(s) también ingrediente(s) accesorio(s), incluye(n) los convencionales en la técnica
(Gennaro, supra), tales como agentes de carga, aglutinantes, diluyentes, desintegrantes, lubricantes, colorantes, agentes aromatizantes y agentes humectantes.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para
administración oral pueden ser presentadas como unidades de
dosificación discretas tales como píldoras, tabletas o cápsulas, o
como polvo o gránulos, o como una solución o suspensión. El
ingrediente activo puede ser presentado también como un bolus o una
pasta. Las composiciones pueden ser además procesadas para producir
un supositorio o un enema para administración rectal.
Para la administración parenteral, las
composiciones adecuadas incluyen inyecciones estériles acuosas y no
acuosas. Las composiciones pueden ser presentadas en recipientes de
una dosis unidad o multidosis, por ejemplo viales y ampollas
cerrados herméticamente, y pueden ser almacenadas en una condición
de congelación-desecación (liofilizadas) que
requiere únicamente la adición de un vehículo líquido estéril, por
ejemplo agua, antes de su utilización.
Las composiciones, o formulaciones, adecuadas
para administración mediante inhalación nasal incluyen polvos finos
o vapores que pueden ser generados por medio de aerosoles,
nebulizadores o insufladores presurizados de dosis medida.
Los compuestos
tieno[2,3-d]pirimidina de la invención
pueden ser también administrados en forma de dispositivos
farmacéuticos implantables, que constan de un núcleo central de
material activo revestido por una membrana reguladora de la
velocidad de liberación. Tales implantes son para ser aplicados
subcutáneamente o localmente, y liberarán el ingrediente activo a
una velocidad aproximadamente constante durante periodos de tiempo
relativamente grandes, por ejemplo desde semanas a años. Los
métodos para la preparación de dispositivos farmacéuticos
implantables como tales son conocidos en la técnica, por ejemplo
según está descrito en la Patente Europea 0.303.306 (AKZO N.V.).
Por tanto, los compuestos de acuerdo con la
presente invención pueden ser utilizados para los mismos fines
clínicos que la LH nativa, con la ventaja de que poseen actividad
FSH, presentan propiedades de estabilidad alteradas y pueden ser
administrados de forma diferente.
Los compuestos de la presente invención,
representados por la Fórmula I, pueden ser generalmente preparados
mediante sustitución nucleofílica de haluros (II) en los que Q = Cl
o Br con aminas secundarias (cíclicas) de Fórmula (III) en un
solvente apropiado tal como N,N-dimetilformamida o
THF, a temperatura ambiente, en presencia de una base terciaria tal
como N,N-diisopropiletilamina (DIPEA).
Derivados de Fórmula (II) en los que Q = Cl o Br
pueden ser preparados mediante acilación regioselectiva del
derivado de meta anilina (V) con cloruros de acilo de tipo (IV), en
los que Q = Cl o Br, en presencia de una base terciaria tal como
N,N-diisopropiletilamina en un solvente adecuado tal
como diclorometano o THF.
El compuesto (V) es accesible mediante la
reducción conocida en la técnica de la función nitro del derivado
(VI) utilizando un agente reductor apropiado tal como cloruro de
estaño(II) en un solvente prótico tal como etanol, en
presencia de ácido clorhídrico a temperatura elevada (J. Heilbron,
J. Chem. Soc., 1279 (1940)).
La tienopirimidina (VI) puede ser preparada
mediante condensación del ácido carboxílico (VII) con
ter-butil amina bajo la influencia de un agente de
acoplamiento tal como tetrafluoroborato de
O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio
(TBTU) o hexafluorofosfato de bromotripirrolidinfosfonio (PyBrOP) y
una base terciaria, por ejemplo N,N-diisopropiletilamina.
La saponización del éster de etilo (VIII) para
dar el ácido carboxílico correspondiente (VII) tiene lugar en
presencia de una base tal como hidróxido de litio, hidróxido de
potasio o hidróxido de sodio en
dioxano acuoso a temperatura elevada (de 80ºC hasta reflujo).
El biciclo (VIII) es formado mediante
sustitución del cloro (X) por mercaptoacetato de etilo bajo la
mediación de N,N-diisopropiletilamina, seguido por el cierre
del anillo del tioéter intermedio (IX) catalizado por una base.
Este tipo de formaciones de anillos de
tieno[2,3-d]pirimidina ha sido
descrito en: S.A. Abdel-Hady, M.A. Badawy, Y.A.
Ibrahim, Sulfur Lett. 9, 101 (1989) y S. Tumkevicius, Liebigs
Ann., 1703 (1995).
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones adecuadas para la reacción de
ciclación son etóxido de sodio en etanol o
N,N-diisopropiletilamina en tolueno/etanol (1/1, v/v) a
temperatura de reflujo.
La cloroimina (X) requerida puede ser
sintetizada siguiendo procedimientos de la literatura según está
descrito, por ejemplo, por A.A. Santilli, D.H. Kim y S.V. Wanser, J.
Heterocycl. Chem. 8, 445, 1971. De acuerdo con este
procedimiento, la lactama (XI) es tratada con POCl_{3} a
temperatura elevada (80ºC hasta reflujo) para dar cloruro (X). La
adición a la mezcla de reacción de un solvente apropiado, por
ejemplo dioxano, y/o la adición de PCl_{5} o
N,N-dimetilanilina puede tener como resultado tiempos de
reacción más cortos y rendimientos de cloro (X) más elevados.
Una ruta apropiada hacia la lactama (XI)
comprende la condensación de múltiples componentes de cianoacetato
de etilo con 3-nitro-benzaldehído y
S-metil isotiourea en etanol bajo la mediación de
una base tal como carbonato de potasio a temperatura elevada
(60ºC).
Se han descrito procedimientos relacionados en:
S. Kambe, K. Saito y H. Kishi, Synthesis 287 (1979); A.M.
Abd-Elfattah, S.M. Hussain y A.M.
El-Reedy, Tetrahedron 39, 3197 (1983); S.M.
Hussain, A.A. El-Barbary y S.A. Mansour, J.
Heterocycl. Chem. 22, 169 (1985).
Los métodos para determinar la unión a
receptores así como los ensayos in vitro e in vivo
para determinar la actividad biológica de las gonadotropinas son
bien conocidos. En general, el receptor expresado es puesto en
contacto con el compuesto a analizar y se mide la unión o la
estimulación o inhibición de una respuesta funcional.
Para medir una respuesta funcional, ADN aislado
que codifica el gen del receptor de LH o de FSH, preferiblemente el
receptor humano, es expresado en células huésped adecuadas. Tal
célula puede ser la célula de Ovario de Hámster Chino, pero otras
células son también adecuadas. Preferiblemente, las células son de
origen mamífero (Jia y col., Mol. Endocrin. 5,
759-776, 1991).
Los métodos para construir líneas celulares que
expresen LH o FSH recombinante son bien conocidos en la técnica
(Sambrook y col., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, última
edición). La expresión del receptor se obtiene por la expresión del
ADN que codifica la proteína deseada. Las técnicas de mutagénesis
dirigida a un sitio, la ligadura de secuencias adicionales, la PCR y
la construcción de sistemas de expresión adecuados son todas bien
conocidas en la técnica actualmente. Pueden construirse
sintéticamente porciones de ADN o todo el ADN que codifica la
proteína deseada utilizando técnicas estándar de fase sólida,
preferiblemente para incluir sitios de restricción con el fin de
facilitar la ligadura. Pueden proporcionarse a las secuencias de
ADN codificadoras elementos de control adecuados para la
transcripción y la traducción de la secuencia codificadora
incluida. Como es bien conocido, están disponibles actualmente
sistemas de expresión que son compatibles con una amplia variedad de
huéspedes, incluyendo huéspedes procarióticos tales como bacterias
y huéspedes eucarióticos tales como levaduras, células vegetales,
células de insecto, células de mamífero, células de ave,
etcétera.
Las células que expresan el receptor son puestas
en contacto posteriormente con el compuesto de ensayo para observar
la unión o bien la estimulación o la inhibición de una respuesta
funcional.
Alternativamente, pueden utilizarse membranas
celulares aisladas que contengan el receptor expresado para medir la
unión del compuesto.
Para medir la unión pueden utilizarse compuestos
marcados radiactivamente o fluorescentemente. Como compuesto de
referencia puede utilizarse LH o FSH recombinante humana.
Alternativamente, pueden realizarse también ensayos de unión
competitiva.
Otro ensayo implica la selección de compuestos
agonistas de los receptores de LH o FSH mediante la determinación
de la estimulación de la acumulación de cAMP mediada por los
receptores. Así, tal método implica la expresión del receptor en la
superficie celular de una célula huésped y la exposición de la
célula al compuesto de ensayo. Se mide posteriormente la cantidad
de cAMP. El nivel de cAMP estará reducido o incrementado dependiendo
del efecto inhibidor o estimulante del compuesto de ensayo después
de unirse al receptor.
Además de la medida directa de, por ejemplo, los
niveles de cAMP en la célula expuesta, pueden utilizarse células
que además de la transfección con el ADN que codifica el receptor
estén también transfectadas con un segundo ADN que codifique un gen
informador cuya expresión responda al nivel de cAMP. Tales genes
informadores podrían ser inducibles por cAMP o podrían ser
construidos de tal forma que estuvieran conectados con nuevos
elementos sensibles a cAMP. En general, la expresión del gen
informador podría ser controlada por cualquier elemento de
respuesta que reaccione a un cambio de los niveles de cAMP. Genes
informadores adecuados son por ejemplo LacZ, fosfatasa alcalina, la
luciferasa de la luciérnaga y la proteína fluorescente verde. Los
principios de tales ensayos de transactivación son bien conocidos
en la técnica y están descritos en, por ejemplo, Stratowa, Ch.,
Himmler, A. y Czernilofsky, A.P., Curr. Opin. Biotechnol. 6,
574 (1995).
Para seleccionar compuestos activos sobre el
receptor de LH o FSH, el ensayo a una concentración de 10^{-5} M
debe tener como resultado una actividad de más del 20% de la
actividad máxima cuando se utilizan como referencia LH o FSH. Otro
criterio podría ser el valor de la CE_{50}, que debe ser <
10^{-5} M, preferiblemente < 10^{-7} M.
El técnico experto reconocerá que los valores
deseables de la CE_{50} dependen del compuesto analizado. Por
ejemplo, un compuesto con una CE_{50} que sea menor de 10^{-5} M
se considera generalmente un candidato para la selección de
fármacos. Preferiblemente, este valor es menor de 10^{-7} M. Sin
embargo, un compuesto que tenga una CE_{50} mayor, pero que sea
selectivo para el receptor particular, puede ser un candidato
incluso mejor.
La selección de compuestos agonistas de los
receptores de LH puede ser realizada también mediante la utilización
de un bioensayo con células de Leydig de ratón (Van Damme, M.,
Robersen, D. y Diczfalusy, E., Acta Endocrinol. 77,
655-671 (1974); Mannaerts, B., Kloosterboer, H. y
Schuurs, A., Neuroensocrinology of reproduction, R. Rolland y col.
Eds., Elsevier Science Publishers B.V., 49-58
(1987)). En este ensayo, puede medirse la estimulación de la
producción de testosterona mediada por el receptor de LH en células
de Leydig aisladas de ratones macho.
La actividad agonista de FSH de los compuestos
puede ser también determinada en un modelo ex vivo utilizando
folículos de ratón cultivados de acuerdo con Nayudu, P. y Osborn, S.
(J. Reproduction and Fertility 95, 349-362
(1992)). Por tanto, folículos de ovarios de ratón son aislados y
cultivados en presencia de compuestos agonistas de la FSH para
inducir el crecimiento folicular. Las medidas del diámetro folicular
y de estradiol en el medio de cultivo son indicativas del
crecimiento folicular.
Para medir la actividad LH in vivo de los
compuestos, puede estudiarse la inducción de la ovulación en ratones
inmaduros. En este ensayo, ratones hembra inmaduros son estimulados
con FSH de orina y tratados 48 horas después aproximadamente con un
compuesto agonista de LH. Los animales son sacrificados después del
tratamiento con el agonista de LH y se determina microscópicamente
el número de óvulos en el oviducto.
Para medir la actividad FSH in vivo de
los compuestos, ratas hembra inmaduras son tratadas a las 0, 8, 24
y 32 horas con un compuesto agonista de FSH para inducir el
crecimiento folicular. A las 52 horas después del comienzo del
experimento se inyecta a los animales hCG para inducir la ovulación.
Los animales son sacrificados 72 horas después del comienzo del
experimento y se determina microscópicamente el número de óvulos en
el oviducto. Se determina además el peso de los ovarios.
Los compuestos de la presente invención pueden
ser aplicados clínicamente en aquellos regímenes en los que se
utilizan actualmente LH o hCG. Éstos incluyen la sustitución de LH
entre sujetos con hipogonadismo hipogonadal ya sean varones o
mujeres, la administración a mitad del ciclo para inducir la
ovulación (inducción de la ovulación (OI) o hiperestimulación
controlada (COH) o estimulación del cuerpo lúteo).
Los ejemplos siguientes son ilustrativos de la
invención y no deben ser interpretados de ninguna manera como
limitantes del ámbito de la invención.
Una mezcla de sulfato de
S-metilisotiourea (69,0 g),
3-nitrobenzaldehído (75,0 g), cianoacetato de etilo
(56,0 ml) y carbonato de potasio (72,5 g) en EtOH absoluto (1500
ml) fue agitada a 60ºC durante 16 horas. La mezcla de reacción fue
enfriada a 0ºC en un baño de hielo. El precipitado resultante fue
extraído por filtración, lavado con EtOH absoluto y disuelto en
agua caliente (100ºC). La solución fue enfriada a temperatura
ambiente, acidificada con HCl 2 N hasta pH 2 y enfriada a 0ºC en un
baño de hielo. El precipitado resultante fue extraído por
filtración y lavado con agua de hielo. El agua residual del
precipitado fue eliminada por coevaporación con
1,4-dioxano.
- Rendimiento:
- 54,0 mg.
- MS-ESI:
- [M+H]^{+} = 289,0.
- TLC:
- R_{f} = 0,3, gel de sílice, DCM/MeOH = 9/1 (v/v).
Se añadió POCl_{3} (100 ml) a una solución
agitada de
5-ciano-4-(3-nitrofenil)-2-metiltio-6-oxopirimidina
(Ejemplo 1(a), 25,0 g) en 1,4-dioxano seco
(300 ml). Después de 3 horas a 90ºC, la mezcla fue enfriada a
temperatura ambiente y concentrada bajo presión reducida. El
residuo fue disuelto en 1,4-dioxano (100 ml) y la
solución resultante fue enfriada a 0ºC. Se añadió con precaución
agua de hielo fundente. El precipitado resultante fue extraído por
filtración y lavado con agua. El agua residual del precipitado fue
eliminada mediante coevaporación con 1,4-
dioxano.
dioxano.
- Rendimiento:
- 26,0 g.
- MS-ESI:
- [M+H]^{+} = 307,0
- TLC:
- R_{f} = 0,5, gel de sílice, heptano/EtOAc = 3/2 (v/v).
Se añadió DIPEA (15,7 ml) a una solución agitada
de 2-mercaptoacetato de etilo (9,3 ml) y
6-cloro-5-ciano-4-(3-nitrofenil)-2-metiltio-pirimidina
(Ejemplo 1(b), 26,0 g) en una mezcla de EtOH (250 ml) y DCM
(250 ml). Después de 1 hora a temperatura ambiente, se añadió a la
mezcla HCl acuoso 0,1 N (500 ml) que fue luego extraída con DCM
(3*500 ml), secada (MgSO_{4}) y concentrada bajo presión
reducida.
- Rendimiento:
- 28,0 g.
- MS-ESI:
- [M+H]^{+} = 390,4
- TLC:
- R_{f} = 0,5, gel de sílice, heptano/EtOAc = 3/2 (v/v).
Se agitó a temperatura de reflujo (100ºC)
durante 16 horas una mezcla de etil
5-ciano-4-(3-nitrofenil)-2-metiltio-6-(etoxicarbonilmetiltio)-pirimidina
(Ejemplo 1(c), 28,0 g) y DIPEA (30 ml) en una mezcla de
tolueno (150 ml) y EtOH (150 ml). La mezcla fue enfriada
posteriormente hasta temperatura ambiente y concentrada bajo presión
reducida. La DIPEA residual fue eliminada mediante coevaporación con
tolueno.
- Rendimiento:
- 28,0 g.
- MS-ESI:
- [M+H]^{+} = 391,2
- TLC:
- R_{f} = 0,6, gel de sílice, heptano/EtOAc = 3/2 (v/v).
Se añadió EtOH (400 ml) a una mezcla de
5-amino-4-(3-nitrofenil)-2-metiltio-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxilato
de etilo (Ejemplo 1(d), 28,0 g), HCl acuoso concentrado (15
ml) y cloruro de estaño (II) (41,0 g) en 1,4-dioxano
(400 ml). La mezcla fue agitada a 90ºC durante 16 horas. La mezcla
fue luego enfriada hasta temperatura ambiente y concentrada bajo
presión reducida. El residuo fue suspendido en EtOAc (1000 ml). Se
añadió NaOH acuoso 4 N para obtener un pH de 10-11.
La mezcla fue agitada vigorosamente y la capa orgánica fue separada,
secada (MgSO_{4}) y concentrada bajo presión reducida.
- Rendimiento:
- 21,0 g.
- MS-ESI:
- [M+H]^{+} = 361,0
- TLC:
- R_{f} = 0,6, gel de sílice, heptano/EtOAc = 3/2 (v/v).
Se añadió hidróxido de potasio (32,4 g) a una
solución de
5-amino-4-(3-aminofenil)-2-metiltio-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxilato
de etilo (Ejemplo 1(e), 21,0 g) en una mezcla de
1,4-dioxano (300 ml) y agua (100 ml). Después de 16
horas a 90ºC, la mezcla fue enfriada hasta 10ºC y se añadió ácido
cítrico acuoso 2 N (300 ml) bajo agitación vigorosa. El precipitado
resultante fue extraído por filtración, lavado con agua (180 ml) y
secado in vacuo.
- Rendimiento:
- 14,0 g.
- MS-ESI:
- [M+H]^{+} = 333,0
- TLC:
- R_{f} = 0,5, gel de sílice, DCM/MeOH = 9/1 (v/v).
Se añadió TBTU (16,1 g) a una solución de ácido
5-amino-4-(3-aminofenil)-2-metiltio-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxílico
(Ejemplo 1(f), 14,0 g), DIPEA (17,4 ml) y
ter-butilamina (7,3 g) en DCM/DMF (1/1, v/v, 250
ml). Después de 3 horas a temperatura ambiente, la mezcla fue
lavada con NaHCO_{3} acuoso saturado (3*100 ml), HCl acuoso 0,1 N
(100 ml) y agua (100 ml). La capa orgánica fue concentrada bajo
presión reducida. El producto bruto fue purificado mediante
cristalización a partir de EtOH absoluto caliente (300 ml).
- Rendimiento:
- 10,5 mg.
- MS-ESI:
- [M+H]^{+} = 388,2
- HPLC:
- R_{t} = 30,72 minutos, Luna C-18(2), 5 \mum, 250*2,0 mm, detección UV = 210 nm, temperatura de la estufa = 42ºC, flujo = 0,25 ml/minuto, eluyente agua/ACN/MeOH = 90/9,5/0,5 a 0/95/5, tiempo de carrera = 50 minutos.
Se añadió cloruro de bromoacetilo (615 mg) a una
solución de ter-butil
5-amino-4-(3-aminofenil)-2-metiltio-tieno[2,3d]pirimidina-6-carboxamida
(Ejemplo 1 (g), 1,08 g) y DIPEA (2,43 ml) en DCM seco (20 ml).
Después de 3 horas a temperatura ambiente, la mezcla fue diluida con
DCM, lavada con NaHCO_{3} acuoso saturado, secada (MgSO_{4}) y
concentrada bajo presión reducida. El producto bruto fue purificado
mediante cromatografía en gel de sílice utilizando como eluyente
heptano/EtOAc = 3/2 (v/v).
- Rendimiento:
- 910 mg.
- MS-ESI:
- [M+H]^{+} = 510,2
- TLC:
- R_{f} = 0,3, gel de sílice, heptano/EtOAc = 3/2 (v/v).
Se añadió ter-butil
5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-bromoacetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida
(Ejemplo 1(h), 91 mg) a una solución de clorhidrato de azetidina (120 mg) y N,N-diisopropiletilamina (0,25 ml) en DCM (5 ml). Después de 16 horas a temperatura ambiente, la mezcla fue lavada con NaHCO_{3} acuoso saturado, secada (MgSO_{4}) y concentrada bajo presión reducida. El producto bruto fue purificado mediante HPLC utilizando una columna Luna C-18 con el siguiente gradiente: TFA acuoso al 0,1% + ACN acuoso al 10%/ACN = 90/10 a 10/90 en 30 minutos. El compuesto del título fue posteriormente liofilizado a partir de agua con TFA al 0,1%.
(Ejemplo 1(h), 91 mg) a una solución de clorhidrato de azetidina (120 mg) y N,N-diisopropiletilamina (0,25 ml) en DCM (5 ml). Después de 16 horas a temperatura ambiente, la mezcla fue lavada con NaHCO_{3} acuoso saturado, secada (MgSO_{4}) y concentrada bajo presión reducida. El producto bruto fue purificado mediante HPLC utilizando una columna Luna C-18 con el siguiente gradiente: TFA acuoso al 0,1% + ACN acuoso al 10%/ACN = 90/10 a 10/90 en 30 minutos. El compuesto del título fue posteriormente liofilizado a partir de agua con TFA al 0,1%.
- Rendimiento:
- 56 mg (TFA-sal).
- MS-ESI:
- [M+H]^{+} = 485,2
- HPLC:
- R_{t} = 13,45 minutos, columna Luna C-18(2), 3 \mum, 100*2,0 mm, detección UV = 210 nm, temperatura de la estufa = 40ºC, flujo = 0,25 ml/minuto, eluyente tampón fosfato 50 mM pH 2,1/agua/ACN = 10/70/20 a 10/10/80 (v/v), tiempo de carrera = 20 minutos.
Se añadió morfolina (5,0 ml) a una solución de
ter-butil
5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-bromoacetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida
(Ejemplo 1(h), 1,0 g) en THF (50 ml). Después de 16 horas a
temperatura ambiente, la mezcla fue concentrada bajo presión
reducida. El residuo fue purificado mediante cromatografía en
columna de gel de sílice utilizando como eluyente DCM/MeOH = 9/1.
El producto bruto fue purificado adicionalmente mediante HPLC
utilizando una columna Luna C-18 con el siguiente
gradiente: TFA acuoso al 0,1%/agua/ACN = 3/97/0 a 3/7/90 en 30
minutos. El compuesto del título puro fue liofilizado a partir de
una mezcla de TFA acuoso al 0,1% y agua.
- Rendimiento:
- 215 mg (TFA-sal).
- MS-ESI:
- [M+H]^{+} = 515,2
- HPLC:
- R_{t} = 20,62 minutos, Luna C-18(2), 5 \mum, 150*2 mm, detección UV = 210 nm, temperatura de la estufa = 40ºC, flujo = 0,25 ml/minuto, eluyente tampón fosfato 50 mM pH 2,1/agua/ACN/MeOH = 10/72/17/1 a 10/18/68/4 (v/v), tiempo de carrera = 40 minutos.
Se añadió tiomorfolina (2,16 ml) a una solución
de ter-butil
5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-bromoacetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida
(Ejemplo 1(h), 1,09 g) en DCM (50 ml). Después de 16 horas a
temperatura ambiente, la mezcla fue diluida con DCM, lavada con
NaHCO_{3} acuoso saturado, secada (MgSO_{4}) y concentrada bajo
presión reducida. El producto bruto fue purificado mediante HPLC
utilizando una columna Luna C-18 con el gradiente
siguiente: TFA acuoso al 0,1% + ACN acuoso al 10%/ACN = 100/0 a
10/90 en 30 minutos. El compuesto del título puro fue liofilizado a
partir de agua acidificada con HCl acuoso 1 N.
- Rendimiento:
- 816 mg
- MS-ESI:
- [M+H]^{+} = 531,2
- HPLC:
- R_{t} = 14,72 minutos, columna Luna C-18(2), 3 \mum, 100*2 mm, detección UV = 210 nm + 254 nm, temperatura de la estufa = 40ºC, flujo = 0,25 ml/minuto, eluyente tampón fosfato 50 mM pH 2,1/agua/ACN/MeOH = 10/72/17/1 a 10/18/68/4 (v/v), tiempo de carrera = 20 minutos.
Se añadió piperidina (3,0 ml) a una solución de
ter-butil
5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-bromoacetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida
(Ejemplo 1(h), 1,0 g) en CH_{2}Cl_{2} (50 ml). Después
de 16 horas a temperatura ambiente, la mezcla fue concentrada bajo
presión reducida. El residuo fue purificado mediante cromatografía
en columna de gel de sílice utilizando como eluyente DCM/MeOH =
9/1. El producto bruto fue purificado adicionalmente mediante HPLC
utilizando una columna Luna C-18 con el siguiente
gradiente: TFA acuoso al 0,1%/ACN = 100/0 a 10/90 en 30 minutos. El
compuesto del título puro fue liofilizado a partir de una mezcla de
TFA acuoso al 0,1% y agua.
- Rendimiento:
- 851 mg (TFA-sal)
- MS-ESI:
- [M+H]^{+} = 513,2
- HPLC:
- R_{t} = 37,3 minutos, Luna C-18(2), 5 \mum, 150*2 mm, detección UV = 210 nm, temperatura de la estufa = 40ºC, flujo = 0,25 ml/minuto, eluyente tampón fosfato 50 mM pH 2,1/agua/ACN = 20/60/20 a 20/0/80 (v/v), tiempo de carrera = 40 minutos.
Se añadió pirrolidina (3,0 ml) a una solución de
ter-butil
5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-bromoacetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida
(Ejemplo 1(h), 1,0 g) en CH_{2}Cl_{2} (50 ml). Después
de 16 horas a temperatura ambiente, la mezcla fue concentrada bajo
presión reducida. El residuo fue purificado mediante cromatografía
en columna de gel de sílice utilizando como eluyente DCM/MeOH =
9/1. El producto bruto fue purificado adicionalmente mediante HPLC
utilizando una columna Luna C-18 con el siguiente
gradiente: TFA acuoso al 0,1%/ACN = 100/0 a 10/90 en 30 minutos. El
compuesto del título puro fue liofilizado a partir de una mezcla de
TFA acuoso al 0,1% y
agua.
agua.
- Rendimiento:
- 616 mg (TFA-sal)
- MS-ESI:
- [M+H]^{+} = 499,2
- HPLC:
- R_{t} = 37,5 minutos, Luna C-18(2), 5 \mum, 150*2 mm, detección UV = 210 nm, temperatura de la estufa = 40ºC, flujo = 0,25 ml/minuto, eluyente tampón fosfato 50 mM pH 2,1/agua/ACN = 20/60/20 a 20/0/80 (v/v), tiempo de carrera = 40 minutos.
Se añadió piperazina (2,5 g) a una solución de
ter-butil
5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-bromoacetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida
(Ejemplo 1(h), 1,0 g) en CH_{2}Cl_{2} (50 ml). Después
de 16 horas a temperatura ambiente, la mezcla fue concentrada bajo
presión reducida. El residuo fue purificado mediante cromatografía
en columna de gel de sílice utilizando como eluyente DCM/MeOH =
7/1. El producto bruto fue purificado adicionalmente mediante HPLC
utilizando una columna Luna C-18 con el siguiente
gradiente: TFA acuoso al 0,1%/ACN = 100/0 a 10/90 en 30 minutos. El
compuesto del título puro fue liofilizado a partir de una mezcla de
TFA acuoso al 0,1% y
agua.
agua.
- Rendimiento:
- 766 mg (bis TFA-sal)
- MS-ESI:
- [M+H]^{+} = 514,4
- HPLC:
- R_{t} = 33,7 minutos, Luna C-18(2), 5 \mum, 150*2 mm, detección UV = 210 nm, temperatura de la estufa = 40ºC, flujo = 0,25 ml/minuto, eluyente tampón fosfato 50 mM pH 2,1/agua/ACN = 20/60/20 a 20/0/80 (v/v), tiempo de carrera = 40 minutos.
Se analizó la actividad agonista de LH de los
compuestos en células de Ovario de Hámster Chino (CHO) transfectadas
de manera estable con el receptor humano y cotransfectadas con un
elemento sensible a cAMP (CRE)/promotor que dirige la expresión de
un gen informador de la luciferasa de la luciérnaga. La unión del
ligando al receptor de LH acoplado a Gs tendrá como resultado un
incremento de cAMP, que a su vez inducirá una transactivación
incrementada de la construcción con el informador de la luciferasa.
La señal de la luciferasa fue cuantificada utilizando un contador
de luminiscencia. Para los compuestos de ensayo, se calcularon los
valores de la CE_{50} (concentración del compuesto de ensayo que
produce una estimulación semimáxima (50%)). Para ese fin se utilizó
el programa de ordenador GraphPad PRISM, versión 3.0 (GraphPad
Software Inc., San Diego).
De manera similar, se analizó la actividad
agonista de FSH de los compuestos en células CHO transfectadas con
el gen informador de la luciferasa y el receptor de la FSH humana.
Los resultados están mostrados en la Tabla 1.
Para medir la actividad in vivo de los
compuestos agonistas de los receptores de LH/FSH, se estudió la
inducción de la ovulación en ratones inmaduros. En este ensayo,
ratones hembra inmaduros fueron estimulados con FSH de orina
(Humegon, 12,5 UI/animal). Cuarenta y ocho horas después
aproximadamente, los animales fueron tratados con un compuesto
agonista de LH/FSH a una nivel de dosis de 50 mg/kg. Los animales
fueron sacrificados 24 horas después del tratamiento con el
agonista de LH/FSH y se determinó microscópicamente el número de
óvulos en el oviducto. Los resultados están mostrados en la Tabla
1.
Claims (5)
1. Un derivado de
tieno[2,3-d]pirimidina de acuerdo con
la fórmula general I,
o una sal del mismo
farmacéuticamente aceptable, donde R1 y R2 junto con el átomo de
nitrógeno al que están unidos forman un anillo que tiene
2-6 átomos de carbono, conteniendo opcionalmente uno
o más heteroátomos seleccionados de N, O y/o
S.
2. Un compuesto seleccionado del grupo de
ter-butil
5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(azetidin-1-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida;
ter-butil
5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(morfolin-4-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida;
ter-butil
5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(tiomorfolin-4-il)-acetamido)-fenil)-tieno
[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida; ter-butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(piperidin-1-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida; ter-butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(pirrolidin-1-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida o ter-butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(piperazin-1-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida.
[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida; ter-butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(piperidin-1-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida; ter-butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(pirrolidin-1-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida o ter-butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(piperazin-1-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida.
3. Un compuesto de acuerdo con las
reivindicaciones 1-2 para ser utilizado en
terapia.
4. Una composición farmacéutica que comprende un
compuesto tieno[2,3-d]pirimidina de
acuerdo con las reivindicaciones 1-2 o una sal o
solvato del mismo farmacéuticamente aceptable, en mezcla con un
agente auxiliar farmacéuticamente aceptable.
5. Utilización de compuestos
tieno[2,3-d]pirimidina de acuerdo con
las reivindicaciones 1-2 o de una sal o solvato de
los mismos farmacéuticamente aceptable para la fabricación de un
medicamento destinado al control de la fertilidad.
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